PT1685763E - Sinergia dos gos e da polifrutose - Google Patents

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Jan Knol
Maria Johanna Adriana Petronella Govers
Tol Eric Alexander Franciscus Van
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Description

DESCRIÇÃO
SINERGIA DOS GOS E DA POLIFRUTOSE
Campo da invenção A presente invenção refere-se ao campo da nutrição e da saúde humana. Ela provê misturas sinergisticas novas de hidratos de carbono prebióticos, especialmente misturas de galacto-oligossacarideos (GOS, por exemplo TOS) e polifrutose (por exemplo, inulina), assim como composições nutritivas que as compreendem. As composições nutritivas têm efeitos benéficos quando são subministradas a bebés alimentados a biberão ou parcialmente alimentados a biberão e têm também efeitos de melhoria na saúde quando são ingeridas pelos adultos com problemas intestinais, tais como a doença inflamatória do intestino (IBD) ou o sindrome do intestino irritável (IBS).
Antecedentes da invenção A microflora do intestino grosso humano (normalmente dividida em intestino cego, cólon e recto) desempenha um papel crucial na nutrição assim como na saúde humana. A composição bacteriana é influenciada e pode ser modulada pela ingestão dietética. Os hidratos de carbono que passam pelo estômago e pelo intestino delgado são metabolizados pelas bactérias e estão formados como um produto final principal do metabolismo dos ácidos gordos de cadeia curta (SCFA), tais como acetato, propionato, butirato e valerato, que são posteriormente libertados no sangue. Outros produtos finais de fermentação bacteriana, incluem, por exemplo o lactato e o succinato. As quantidades e composições totais (quantidades relativas) destes produtos finais têm por seu lado um efeito profundo no crescimento bacteriano, no pH, na exclusão de espécies patogénicas, etc. Um método para influenciar beneficamente a flora microbiana e a saúde humana é a administração de prebióticos. Os "prebióticos" foram definidos 1/51 como "ingredientes alimentares não digeríveis, que afectam beneficamente o hospedeiro estimulando selectivamente o crescimento e/ou a actividade de uma ou de um número limitado de bactérias no cólon e, assim, melhorar a saúde dos hospedeiros (Gibson & Roberfroid 1995, J. Nutr. 12, 1401-1412). Os critérios que um composto deve cumprir para poder ser classificado como prebiótico são: 1) ele não deve ser hidrolisado nem absorvido na parte superior do tracto gastrointestinal (estômago, intestino delgado), 2) ele deve ser fermentado selectivamente por uma ou mais bactérias potencialmente benéficas no cólon, 3) ele deve alterar a microbiota colónica para uma composição mais saudável e 4) ele deve preferencialmente induzir efeitos que sejam benéficos para a saúde do sujeito. Os prebióticos comummente utilizados são os denominados hidratos de carbono não digeríveis (ou "fibras dietéticas solúveis"), que passam sem serem digeridos pela parte superior do tracto gastrointestinal ao intestino grosso. Estes incluem, por exemplo, fruto-oligossacarídeos (FOS), oligofrutose, inulina e transgalacto-oligossacarídeos (TOS). Deverá ser notado que na literatura muitas vezes há inconsistência entre a utilização de vários termos, tais como fruto-oligossacarídeo, inulina, oligofrutose e inulo-oligossacarídeos, e o mesmo termo pode ser utilizado para compostos ou composições diferentes.
As bactérias benéficas conhecidas, que são estimuladas pela absorção de prebióticos, são as bactérias do ácido láctico, tais como Lactobacilli e Bifidobacteria, e os benefícios para a saúde foram atribuídos a este efeito estimulador. Por exemplo, foram descritos os efeitos benéficos da inulina e dos frutanos tipo inulina, tais como a oligofrutose, sobre a função intestinal 2/51 (Jenkins et al., 1999, J. Nutrition 129, 1431S-1433S) e pensa-se que este efeito é devido a um efeito bifidogénico, que se refere a um efeito estimulante do crescimento selectivo no total das bifidobactérias, medido in vivo através da contagem das bifidobactérias fecais ou in vítro (ver por exemplo Roberfroid, Am J Clin Nutr 2001, 73 (suppl), 406S-409S).
Parece que o leite humano também tem um efeito bifidogénico, devido a que as bactérias dominantes nos bebés alimentados ao peito são as bifidobactérias. Pelo contrário, a colonização bacteriana dos bebés alimentados com fórmula láctea não está dominada pelas bifidobactérias e é mais diversa em espécies bacterianas (Harmsen et al., 2000, J. Pediatr. Gastroenterol.
Nutr. 30, 61-67). Pensa-se que os oligossacarideos encontrados no leite humano são os responsáveis do efeito bifidogénico ou prebiótico e têm sido feito esforços para modificar a fórmula para bebés de forma a que esta se pareça o mais possível ao leite humano e especialmente que tenha o mesmo efeito prebiótico ou um efeito prebiótico muito similar ao leite humano. Isto foi feito adicionando prebióticos à fórmula do leite para bebés (Boehm et al., Acta Paediatr. Suppl. 2003, 441, 64-67 and Moro et al., 2002, J Pediatr Gastroenterol Nutr 34, 291-295). Por exemplo, tem sido descrito que o suplemento da fórmula de leite bovino com uma mistura de oligossacarideos que compreende trans-galacto-oligossacarídeos (TOS) e inulinaHP aumenta a contagem fecal das bifidobactérias nos bebés alimentados a biberão (Boehm et al., 2002, Arch Dis Child 86, F178-F181).
Também, tem sido descrito que o suplemento da fórmula de leite para bebés com TOS e inulina tem um efeito bifidogénico, e reduz o pH fecal (Boehm et al., 2003 supra; Moro et al., 2003, Acta
Paediatr. Suppl. 441:77-79; Marini et al., 2003, Acta Paediatr. Suppl. 441:80-81. Boehm et al., 2002, Arch. Dis. Child Fetal.
Neonata. Ed. 86:F178-F181; Moro et al., 2002, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 34:291-295; Schmelzle et al., 2003, J Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 36:343-51). 3/51
Depois da fermentação dos prebióticos pelas bactérias do ácido láctico os ácidos orgânicos são produzidos e o pH é baixado. Os Lactobacilli produzem lactato assim como lactato e acetato (um ácido gordo de cadeia curta; SCFA) . 0 lactato pode estar na forma de L- lactato ou D-lactato. Por outro lado, a
Bifidobacteria, produz L-lactato e acetato, mas não D-lactato. A Bifidobacteria (e outras bactérias do ácido láctico) normalmente não leva à produção de gases, tais como H2 e CH4. Estes também não produzem outros SCFA, tais como propionato, butirato, isobutirato, valerato e isovalerato. A presença do SCFA, tais como isobutirato e isovalerato, são indicativos da fermentação dos hidratos de carbono por outras espécies bacterianas, tais como Clostrídía e Bacteroides ou Enterobacteriaceae, ou são indicativos da fermentação das proteinas (das quais a Bifidobacteria têm pouca capacidade). Também, outras bactérias intestinais são capazes de produzir acetato ou lactato, tais como a Propíoníbactería, Enterococci e Pediococci.
Anteriormente tinha sido descrito que a ingestão de determinados hidratos de carbono prebióticos aumenta as quantidades (relativas) de Bifidobacteria e/ou Lactobacilli. Simultaneamente tem sido observado uma formação aumentada de SCFA e uma diminuição do pH. Mas também tem sido descrito a formação de gases que resultam em sintomas indesejáveis tais como flatulência e dor abdominal com a introdução de prebióticos na dieta, tais como inulina ou GOS. Além disso, não só tem sido descrito o aumento do acetato mas também o aumento de por exemplo, o butirato, que é indesejável. Portanto tem sido descrito uma variedade de efeitos indesejáveis, que resultam do consumo de nutrição suplementada com certos prebióticos.
No cólon e nas fezes dos bebés alimentados ao peito o SCFA predominante encontrado é o acetato. Além disso, foram encontradas concentrações elevadas de lactato. Estas quantidades (relativas) são maiores do que as observadas nos adultos (em que as concentrações de lactato são geralmente insignificantes) ou 4/51 nos bebés alimentados com fórmula láctea Standard.
Subsequentemente, as concentrações de propionato e especialmente butirato são muito mais baixas no cólon e nas fezes dos bebés alimentados ao peito do que nos adultos e mesmo mais baixas do que as dos bebés alimentados com fórmula láctea Standard para bebés. 0 pH das fezes é minimo nos bebés alimentados ao peito. Como o acima mencionado, é desejável prover composições nutritivas, especialmente composições de fórmula láctea, que, quando são consumidas, resultam numa microflora intestinal muito parecida à dos bebés alimentados ao peito.
Muitos efeitos do SCFA e do lactato na saúde e um pH do cólon baixo têm sido descritos. Tem sido descrito que o pH baixado e a presença dos ácidos orgânicos têm um efeito antipatogénico, e que provêm uma vantagem para as bactérias ácido tolerantes, tais como as bactérias do ácido láctico (incluindo a Bifidobacteria) . Também têm sido descritos os efeitos do SCFA na parede intestinal. Os SCFA são uma fonte de energia de colonócitos e portanto ajudam à integridade da barreira intestinal. Os SCFA estão também envolvidos nos efeitos da peristalse, no metabolismo do ácido biliar, na absorção de água e na diferenciação celular (ver por exemplo Pedido de Patente europeia EP1105002). Os SCFA são conhecidos por estimular a produção de muco e estão envolvidos na absorção mineral e na produção de muco. 0 documento não pré-publicado WO 2005/039319 descreve composições que compreendem Bifidobacterium breve e galacto-oligossacarídeos e polifrutose que têm um efeito benéfico nas doenças imunológicas incluindo alergia e eczema ou doenças atópicas. O documento não pré-publicado WO 2005/039597 descreve composições que compreendem oligossacarideos ácidos e possivelmente uma mistura de dois oligossacarideos neutros diferentes, tais como os galacto-oligossacarideos e a 5/51 polifrutose, que têm um efeito benéfico nas doenças relacionadas com o sistema imunitário incluindo alergia, atopia e eczema.
Descrição detalhada da invenção
Surpreendentemente os inventores da presente invenção descobriram que o GOS (especialmente TOS) e a polifrutose (especialmente inulina), quando são administrados juntos, provêm vários efeitos benéficos que não podem ser explicados por um aumento do número das bifidobactérias intestinais e que portanto não são devidos ao efeito bifidogénico descrito para TOS ou inulinaHP na técnica anterior (por exemplo por Boehm et al., 2002, supra). Em particular, foi inesperadamente descoberto que após a administração de GOS e das misturas de polifrutose, houve um aumento das quantidades totais formadas do SCFA, um aumento das quantidades relativas do acetato e do lactato e uma diminuição do pH fecal dos bebés, e estes efeitos não estavam correlacionados com uma quantidade aumentada (relativa) da Bífídobacteria. Além de uma quantidade e perfil benéfico de SCFA e uma quantidade aumentada de lactato, foi observado uma diminuição na formação de gases. Também, foi descoberto que o próprio lactato tem efeitos benéficos até agora desconhecidos no cólon, devido a que foi descoberto que aumenta a secreção da prostaglandina EI e da prostaglandina E2. Este efeito anteriormente só tinha sido descrito para SCFA, especialmente para o acetato (Willemsen et al., 2003, Gut 52, 1442-1447). As composições que compreendem lactato, e as composições que compreendem prebióticos que estimulam a produção de lactato, podem portanto ser utilizadas para estimular a produção de mucina e suportar a integridade da barreira mucosal (muco protecção). Foi também descoberto que o lactato diminui as contracções espontâneas e a tensão nos músculos do cólon, resultando num alivio do espasmo e da dor.
As composições prebióticas são portanto novas já que não aumentam ou não aumentam significativamente o número de 6/51
Bifidobacteria, enquanto que resultam num aumento das quantidades totais de SCFA, mudanças benéficas no perfil de SCFA (aumentos de acetato, redução de butirato e propionato), aumento do ácido láctico (e dando como resultado uma contracção benéfica e efeitos redutores da tensão e efeito muco-estimulante), uma diminuição do pH fecal, uma diminuição da formação de qases, e uma formação mais gradual do SCFA (incluindo a formação na parte distai do cólon), isto é, em conjunto, um modelo óptimo dos produtos de fermentação (mais L-lactato, menos butirato etc...). Todas estas mudanças fazem com que o ambiente do cólon se pareça mais ao dos bebés alimentados ao peito. Numa forma de realização a invenção provê portanto a utilização de misturas de GOS e polifrutose em quantidades eficazes para a preparação de composições que conduzem a um ambiente do cólon essencialmente idêntico ao dos bebés alimentados ao peito.
Os efeitos benéficos encontrados foram significativamente mais pronunciados após a co-administração do que quando o GOS ou a polifrutose foram administrados sozinhos (por exemplo TOS ou inulina), indicando que o GOS e a polifrutose agem sinergisticamente. Na técnica anterior não foram realizados estudos em que os efeitos individuais da administração de TOS e inulina fossem directamente comparados com a co-administração destes dois tipos de compostos e evidentemente estes estudos individuais não podem ser comparados entre si e são inadequados para identificar os efeitos sinergéticos.
Esta interacção sinergistica nova dos GOS e da polifrutose (por exemplo TOS e inulina), e os efeitos in vivo da co-administração dos mesmos conduz a novas utilizações das composições que compreendem GOS assim como polifrutose em quantidades (sinergisticas) adequadas, tais como o tratamento ou a prevenção de cólicas e/ou espasmos abdominais, dilatação abdominal, flatulência, dor abdominal, obstipação, IBS, IBD, alergia e/ou muco protecção aumentada do intestino. Adicionalmente, uma composição que compreende lactato (D-lactato e/ou L-lactato, 7/51 preferencialmente L-lactato) pode ser utilizada para tratar ou para prevenir um ou mais destes sintomas ou doenças.
Assim, inesperadamente, a fermentação das misturas especificas dos prebióticos (GOS e polifrutose) pela flora intestinal resulta numa formação aumentada e cineticamente vantajosa do SCFA e do lactato e num modelo melhorado dos produtos metabólicos finais. Tendo como consequência muitos efeitos benéficos, tais como efeitos na produção de muco, efeitos anti-inflamatórios, efeitos na percepção da dor e efeitos nos espasmos/cólicas abdominais (ambos via relaxação do cólon e redução das contracções espontâneas). As composições nutritivas que compreendem estas misturas de prebióticos podem também ser utilizadas nos adultos que tenham problemas intestinais, tais como IBD ou IBS ou uma integridade da barreira intestinal diminuida devido à desnutrição.
Definições "Polissacarideos" referem-se às cadeias de hidratos de carbono de unidades de monossacarideos com um comprimento de cadeia de pelo menos 10 unidades. Pelo contrário, os "oligossacarideos" têm um comprimento de cadeia inferior a 10 unidades. "Grau de polimerização" ou "DP" refere-se ao número total de unidades de sacarideos numa cadeia de oligo ou de polissacarideos. 0 "DP médio" refere-se ao DP médio de oligossacarideos ou cadeias de polissacarideos numa composição, sem ter em consideração possiveis mono ou dissacarideos (que são preferencialmente removidos se estão presentes). O DP médio de uma composição é utilizado para distinguir as composições. Adicionalmente a percentagem das unidades de sacarideos, tal como a percentagem da glicose e a percentagem das unidades de frutose de uma composição são distinguiveis. 8/51 "Polifrutose" ou "polifrutano" ou "fruto-polissacarídeo" refere-se a um hidrato de carbono polissacarídeo que compreende uma cadeia de unidades de frutose com ligações β com um grau de polimerização de 10 ou mais e compreende, por exemplo, inulina (por exemplo inulina, HP) levano e/ou um "tipo misturado de polifrutano" (ver abaixo). "Inulina" ou "inulina não hidrolisada" ou "inulina HP" é utilizada na presente invenção para referir as cadeias de frutose terminadas em glicose com a maioria das cadeias (pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%) com um grau de polimerização (DP) de 10 ou mais. A inulina pode então ser descrita como GFn, em que G representa uma unidade de glucosil, F representa uma unidade de frutosil e n é o número de unidades de frutosil ligadas entre si, sendo n 9 ou mais. O rácio G/F é aproximadamente de 0.1 a 0. No entanto, pode que uma parte pequena das moléculas de inulina, não tenha unidade glicose terminal. O DP médio é na presente invenção preferencialmente pelo menos 15, mais preferencialmente 20 ou mais, tal como 20, 21, 22, 23, 25, 30, 40, 60, 70, 100, 150 ou mais. Na inulina as unidades de frutose estão ligadas com uma ligação β(2—>1) . Uma inulina adequada é por exemplo a comercialmente disponível como Raftiline®HP (Orafti) com um DP médio> 23.
"Inulina hidrolisada" ou "oligofrutose" refere-se a misturas de cadeias de frutose terminadas em glicose e frutose, com um DP inferior a 10. Então, a inulina hidrolisada pode ser descrita como uma mistura de cadeias GFn e cadeias Fn (em que G é uma unidade de glucosil, F é uma unidade de fructosil e n = 1-8) . A inulina hidrolisada é um produto de hidrólise (enzimática ou acídica) ou um produto de inulina parcialmente hidrolisada, que resulta da clivagem das ligações β(2—>1) de fructosil-frutose. A expressão "inulina hidrolisada" também abrange a inulina feita sinteticamente ou inulina feita recombinantemente que tenha a mesma constituição estrutural. 9/51 "Levano" ou "levulano" ou "levulina" ou "levulosano" refere-se a um polissacarideo que consiste em polifrutose em que as unidades de frutose estão ligadas com ligações β(2—>6). Uma fracção de glicose inicial pode estar presente, mas não é necessária. 0 grau de polimerização é maior que 10.
Nos "polifrutanos do tipo misturado" as unidades de frutose estão ligadas com ligações β (2—>1) e β (2—>6) . Os polifrutanos do tipo misturado estão ramificados e têm um DP > 10. "GOS" ou "galacto-oligossacarideos", ou "trans-galacto-oligossacarídeos" ou "TOS" referem-se a oligossacarideos compostos de unidades de galactose, com um DP de 10 ou menos e um DP médio de 2, 3, 4, 5 ou 6. Uma unidade de glicose pode estar presente na extremidade de redução da cadeia. Preferencialmente os GOS contêm pelo menos 2/3 unidades de galactose. Os mais preferidos são os trans-galacto-oligossacarídeos (TOS) com ligações glicosidicas β(1—>4). Estes GOS são por exemplo os encontrados em Vivinal®GOS (comercialmente disponível por Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Netherlands), que compreendem trans-galacto-oligossacarideos com ligações glicosidicas β (1—>4) e ligações glicosidicas β(1—>6). "SCFA" ou "ácidos gordos de cadeia curta" refere-se a ácidos gordos com uns comprimentos de cadeia de carbono de até C6, produzidos como um produto final de fermentação bacteriana intestinal, tal como o acetato (C2), o propionato (C3), o butirato e o isobutirato (C4), o valerato e o isovalerato (C5) e outros. A expressão "ÍC4-5" refere-se à soma do isobutirato, com o valerato e o isovalerato.
Uma "quantidade sinergisticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de GOS e polifrutose (por exemplo TOS e inulina) que, quando são co-administradas, conferem um (ou mais) efeitos fisiológicos específicos (como o descrito noutro lugar na 10/51 presente invenção), em que o efeito total da co-administração é maior do que a soma do efeito da administração individual de GOS ou da polifrutose. Por exemplo, se o efeito da administração de GOS sozinho é X e o efeito da administração de polifrutose sozinha é Y, então o efeito da co-administração de GOS e polifrutose é maior que X+Y e por exemplo o efeito da co-administração de 1 /2 da concentração de GOS mais a percentaqem da concentração de polifrutose tem um efeito maior que V2 X+V2 Y, etc. "Co-administração" de duas ou mais substâncias refere-se à administração destas substâncias a um indivíduo, tanto numa composição ou em composições separadas (kit de partes; como uma composição combinada) que são administradas ao mesmo tempo (simultaneamente) ou com um pequeno intervalo (utilização separada ou sequencial, por exemplo com um intervalo de minutos ou horas) . "Enteral" na presente invenção refere-se à libertação directa no tracto gastrointestinal de um sujeito (por exemplo oralmente ou via tubo, cateter ou estorna). 0 termo "que compreende" deve ser interpretado como a especificação da presença das partes expressas, fases ou componentes, mas não exclui a presença de uma ou mais partes, fases ou componentes adicionais. "Bebé" na presente invenção refere-se a seres humanos com idades compreendidas entre 0 e 36 meses, preferencialmente entre 0 e 18 meses, ou mais preferencialmente entre 0 e 12 meses. "Bebés alimentados ao peito" refere-se a bebés exclusivamente alimentados ao peito. "Bebés que não estão a ser ou estão a ser parcialmente alimentados ao peito" são bebés que não estão a ser 11/51 exclusivamente alimentados com leite materno. Isto inclui bebés alimentados com pelo menos um biberão (aproximadamente 80ml) de leite diário de fórmula. "Percentagem" ou "média" geralmente refere-se a percentagens médias em peso, a não ser gue seja especificado o contrário ou gue seja evidente gue significa outra base.
Numa forma de realização a presente invenção provê diversas utilizações novas das composições gue compreendem GOS e polifrutose em guantidades adeguadas (sinergisticamente eficazes).
Utilização e métodos de acordo com a invenção
Nas várias utilizações descritas na presente invenção, um sujeito é preferencialmente um sujeito humano, mais preferencialmente um bebé, tal como um bebé recém-nascido até aos 12 meses. Especialmente refere-se a bebés gue estão a ser alimentados a biberão ou gue estão a ser parcialmente alimentados a biberão. Alternativamente, um sujeito pode também ser uma criança, um adolescente ou um adulto. Em particular, os problemas intestinais, tais como mas não limitados à doença inflamatória do intestino (IBD), o sindrome do intestino irritável (IBS), flatulência, espasmos abdominais, cólicas, dilatação abdominal, dor abdominal, etc..., gue podem também supor cansaço, depressão ou mudanças de humor, podem ser prevenidos e/ou tratados utilizando as composições de acordo com a invenção. Também pode ser aumentada a produção de mucosa e podem ser prevenidas ou tratadas as alergias gue resultam de um funcionamento subóptimo do intestino. Também a função da barreira intestinal pode ser melhorada nos pacientes com uma função deteriorada da barreira como resultado da desnutrição,
cirurgia, guimioterapia etc. As composições gue compreendem GOS e polifrutose, tais como as composições gue compreendem TOS e inulina, podem numa forma de realizar a invenção ser utilizadas 12/51 para induzir a produção do SCFA no intestino grosso de um sujeito e para aumentar significativamente a quantidade total (intestinal e/ou fecal) dos SCFA produzidos após a administração e/ou para modificar significativamente as quantidades relativas do SCFA (intestinais e/ou fecais) produzidos, em particular para aumentar a quantidade relativa (intestinal e/ou fecal) de acetato do total do SCFA, e/ou para aumentar significativamente a quantidade (absoluta e relativa) do lactato intestinal produzido, e/ou para reduzir ou prevenir significativamente a formação de gases intestinais, e/ou para estender a produção do SCFA à parte distai do cólon, e/ou para reduzir significativamente o pH no intestino grosso e o pH fecal. Também, pode ser diminuida a soma intestinal e/ou fecal, do butirato, isobutirato, valerato e/ou isovalerato em relação aos SCFA totais. Estes efeitos são obtidos após a administração, sem que tenham um efeito significativo no número total e/ou relativo de bifidobactérias intestinais. As composições para o tratamento ou para a profilaxia de qualquer doença ou distúrbio ou mal-estar associados ou provocados por um ou mais destes efeitos intestinais são providos pela presente invenção. A presente invenção provê a utilização dos galacto- oligossacarídeos e da polifrutose para a fabricação de uma composição para o tratamento ou para a prevenção da dilatação abdominal, formação de gases, dor abdominal e/ou flatulência.
Noutra forma de realização a presente invenção provê a utilização dos galacto-oligossacarideos e da polifrutose para a fabricação de uma composição para o tratamento ou para a prevenção de alergia, eczema ou doenças atópicas. Noutra forma de realização a presente invenção provê a utilização dos galacto-oligossacarideos e da polifrutose para a fabricação de uma composição para o tratamento e/ou para a prevenção de cólicas e/ou para a relaxação das contracções do cólon, preferencialmente a contracção tónica e/ou fásica. Noutra forma de realização a presente invenção provê a utilização dos galacto-oligossacarideos e da polifrutose para a fabricação de 13/51 uma composição para o tratamento ou para a prevenção da síndrome do intestino irritável ou para a doença inflamatória do intestino. Ainda, noutra forma de realização a presente invenção provê a utilização dos galacto-oligossacarideos e da polifrutose para a fabricação de uma composição para o aumentar o funcionamento da barreira intestinal e/ou para a produção de muco no intestino grosso. A não ser que seja especificado o contrário, um "aumento significativo" (de por exemplo SCFA, acetato ou lactato) refere-se na presente invenção a um aumento de pelo menos 5%, preferencialmente de pelo menos 10%, mais preferencialmente de pelo menos 20% ou mais, em comparação com a quantidade produzida quando o GOS ou a polifrutose (por exemplo inulina) são administrados sozinhos. De forma similar, a não ser que seja especificado o contrário, uma "redução significativa" (de, por exemplo a formação de gás) refere-se a uma redução de pelo menos 5%, preferencialmente de pelo menos 10%, mais preferencialmente de pelo menos 20%, 25%, 50% ou mais (por exemplo 70%, 80%, 90%, 100%) em comparação com a quantidade produzida quando a polifrutose (por exemplo inulina) é administrada sozinha.
Um aumento na quantidade total dos SCFA produzidos como produto de fermentação dos GOS e das composições de polifrutose pode também ser medida como uma redução significativa do pH das amostras fecais dos sujeitos, reflectindo uma diminuição in vivo do pH no intestino grosso. Foi descoberto que nos bebés o pH fecal diminuiu aproximadamente a um pH de 5.8 ou menos, tal como um pH de 5.6, 5.5 ou 5.4 ou 5.2 após a co-administração de TOS e de polifrutose (por exemplo inulina) , enquanto que o pH dos bebés alimentados pela fórmula Standard foi à volta ou maior que 6, tal como aproximadamente um pH de 5.9, 6.8 ou mesmo 7.0. Uma diminuição significativa do pH refere-se portanto a uma redução do pH em pelo menos 15% ou 0.9 unidades em comparação com os bebés alimentados com fórmula Standard. 14/51
Outro efeito benéfico da co-administração de GOS e da polifrutose em quantidades adequadas é que a composição do SCFA é significativamente diferente do que quando são administrados GOS ou polifrutose. Especialmente a quantidade relativa de butirato é reduzida significativamente, enquanto que a quantidade relativa de acetato é aumentada significativamente. As composições podem, então, ser utilizadas para alterar não só as quantidades totais do SCFA, mas também as proporções de SCFA. Nos bebés a que foi co-administrado TOS e polifrutose (por exemplo inulina), os niveis dos SCFA relativos parecem-se mais aos niveis encontrados nos bebés alimentados ao peito, com rácios de acetatorpropionatorbutirato geralmente de aproximadamente 80-85%:10-15 %:1 — 5 %, enquanto que nos bebés alimentados com fórmula láctea Standard os rácios foram geralmente de cerca de 69-74%:16-19%:5-6% (como o mostrado nos exemplos). Assim, especialmente as quantidades relativas de acetato são aumentadas e as quantidades relativas de propionato e de butirato são diminuídas pelas composições de acordo com a invenção. A co-administração de GOS e da polifrutose resulta em proporções de acetatotpropionato:butirato, que se parecem às dos bebés alimentados ao peito muito mais do que as dos bebés alimentados com fórmula (que produzem niveis elevados de butirato e propionato e níveis relativamente baixos de acetato). O efeito nas proporções relativas de SCFA pode ser medida por métodos conhecidos na técnica, tais como a cromatografia gasosa de amostras fecais em vários momentos após a administração, utilizando estudos in vivo ou sistemas de fermentação in vitro como por exemplo os descritos nos exemplos.
Uma "composição do SCFA significativamente modificado" ou uma "quantidade de acetato aumentada significativamente" refere-se à quantidade de acetato (percentagem dos SCFA totais) sendo de pelo menos aproximadamente 4%, 5%, 10%, 15%, ou mais, quando não são administrados nem GOS nem polifrutose ou quando GOS ou polifrutose são administrados individualmente. Preferencialmente as quantidades relativas de propionato e/ou butirato são menores 15/51 do que quando nem GOS nem polifrutose são administrados ou quando GOS ou polifrutose são administrados individualmente. Numa forma de realização, a composição de acordo com a invenção é adequada para aumentar o acetato intestinal e/ou fecal até aproximadamente mais do que 85%, tal como 86%, 87%, 88%, 90% ou mais, dos SCFA totais.
Ainda outro efeito benéfico observado quando são co-administrados GOS e polifrutose é uma diminuição significativa dos SCFA ramificados, em comparação com a proporção dos SCFA ramificados encontrados quando GOS ou polifrutose são administrados individualmente. Uma "diminuição significativa dos SCFA ramificados", como é utilizada na presente invenção, refere-se a uma diminuição de pelo menos 70% em comparação com a concentração encontrada nos bebés não alimentados com prebióticos ou que resulta numa proporção fecal menor do que 1.5% dos SCFA totais. A proporção dos SCFA ramificados em relação aos SCFA totais pode ser medida dividindo a soma dos SCFA ramificados, isto é, isobutirato, mais isovalerato mais valerato, pela soma total dos SCFA, isto é, acetato, mais propionato, mais butirato, mais isobutirato, mais isovalerato, mais valerato, etc. A redução da proporção dos SCFA ramificados é benéfica para a saúde do sujeito, devido a que os SCFA ramificados são prejudiciais. Isto indica uma degradação proteica menor, que é indesejável porque a fermentação proteica resulta num aumento do pH e na formação de agentes prejudiciais tais como H2S.
Uma diminuição significativa de butirato refere-se a uma redução de pelo menos 50% em comparação com a concentração encontrada nos bebés não alimentados com prebióticos ou que resulta numa proporção fecal menor do que 4% dos SCFA totais. Numa forma de realização a composição de acordo com a invenção é adequada para diminuir a soma de butirato, isobutirato, valerato e isovalerato 16/51 intestinais (e/ou fecais) é inferior a 7% dos SCFA totais, tal como 6,5%, 6%, 5%, 4% ou menos dos SCFA totais.
Noutra forma de realização, as composições que compreendem GOS e polifrutose são adequadas para aumentar o comprimento da fermentação dentro do cólon. Em particular, a fermentação bacteriana estará ainda activa nas partes mais distais do cólon após a co-administração, como o indicado pela produção do SCFA na parte distai do cólon. Não é produzido ou apenas muito pouco SCFA é produzido na parte distai do cólon após a administração das composições que compreendem GOS ou polifrutose sozinhos. Adicionalmente, a fermentação rápida no principio do cólon é observada após a co-administração, que é especialmente importante para efeitos antipatogénicos e que é também observada nos bebés alimentados ao peito. Geralmente, isto indica que as composições são adequadas para estabelecer e/ou manter um modelo de fermentação relativamente uniforme em todo o cólon de um sujeito e para estender a fermentação e a produção do SCFA até à extremidade distai do cólon. Os SCFA, e muito provavelmente também outros produtos de fermentação, especialmente o lactato, são portanto produzidos em todo o cólon, no principio, no meio e na extremidade do cólon.
Noutra forma de realização, a co-administração do GOS e da polifrutose em quantidades sinergisticas pode ser utilizada para aumentar significativamente a produção de lactato, como pode ser determinado analisando uma vez mais as amostras fecais dos sujeitos do teste e dos sujeitos de controlo, que receberam as composições que compreendiam o GOS sozinho ou a polifrutose sozinha ou as composições base equivalentes sem prebióticos. Um "aumento significativo do lactato" refere-se a pelo menos 5%, 10%, 20 % ou até 50 % ou mais de lactato, que é produzido nos sujeitos aos quais foram cc )-administrados composições que compreendem GOS e polifrutose, em comparação com os sujeitos aos que nem GOS nem polifrutose foram administrados. Por exemplo, os bebés alimentados com leite de fórmula Standard suplementada com 17/51 6 g/1 de misturas de TOS/inulina (90%:10%) produziram em 16 semanas aproximadamente 16% de lactato (como percentagem dos ácidos totais), enquanto que os bebés alimentados com fórmula Standard produziram aproximadamente 0.6% e os bebés alimentados ao peito produziram aproximadamente 35% de lactato. Apesar de que não se corresponde à quantidade de lactato produzido pelos bebés alimentados ao peito, a suplementação da fórmula de leite Standard com misturas de TOS e inulina conduziram a um aumento significativo na produção de lactato. Como é mostrado nos exemplos, foi descoberto que o lactato tinha efeitos benéficos inesperados. De forma similar o acetato, aumentou a produção de prostaglandina EI e da prostaglandina E2 e resultou numa expressão de mucina epitelial aumentada. A mucosa intestinal desempenha um papel fundamental na saúde humana, devido a que ela serve como barreira aos patogénicos, alérgenos e carcinogénicos infecciosos. As composições que influenciam positivamente o desenvolvimento e/ou a integridade da mucosa podem portanto ser utilizadas para ajudar a fortalecer uma mucosa saudável nos bebés recém-nascidos e para ajudar a estabelecer uma mucosa saudável nos bebés que estão a ser alimentados a biberão ou que estão a ser parcialmente alimentados a biberão e nos sujeitos que sofrem de sintomas ou doenças que resultem ou estejam associadas a um funcionamento não adequado da mucosa intestinal. Por exemplo, os problemas intestinais, tais como a doença inflamatória do intestino (IBD, por exemplo colite ou doença de Crohn) ou o síndrome do intestino Irritável (IBS) podem ser tratados ou prevenidos, ou o agente patogénico e/ou a introdução através da mucosa pode ser reduzida ou outros problemas imunológicos podem ser prevenidos ou reduzidos, tais como o desenvolvimento de asma. Também pode ser prevenida ou reduzida a perda de integridade da barreira intestinal resultante da desnutrição, cirurgia, quimioterapia etc.
Além disso, as contracções espontâneas e a tensão abdominal foi reduzida significativamente de uma maneira dependente da dose 18/51 após a administração de D- lactato ou L-lactato. As composições de acordo com a invenção podem assim ser utilizadas para aumentar os niveis de lactato intestinal e deste modo tratar ou prevenir sintomas tais como a dor abdominal, cólica, contracções abdominais, tensão abdominal e outras.
Como foi descoberto que o próprio lactato tinha efeitos previamente desconhecidos, é também um objecto da invenção prover composições que compreendam lactato em quantidades adequadas, que podem ser utilizadas para tratar ou prevenir os sintomas e as doenças acima descritos. Numa forma de realização as composições compreendem lactato sozinho em quantidades adequadas, enquanto noutra forma de realização as composições de GOS e polifrutose descritas na presente invenção compreendem também lactato para continuar a aumentar os niveis de lactato intestinal. Uma composição deste tipo de acordo com a invenção compreende TOS e inulina em quantidades sinergisticamente eficazes e também compreende lactato em quantidades adequadas. Numa forma de realização são providas composições que são adequadas para aumentar o lactato intestinal e/ou fecal em aproximadamente 10 mM/kg de fezes. É entendido que quando nos referimos à análise das amostras fecais esta é uma medida indirecta do efeito ín vivo real. Igualmente, podem ser realizados ensaios ín vítro, em que as populações bacterianas são reproduzidas ín vítro e as quantidades adequadas das composições são adicionadas às culturas. Em particular, pode ser utilizado o sistema de fermentação in vítro descrito nos exemplos. A co-administração das composições que compreendem GOS e polifrutose pode portanto ser utilizada para obter um ou mais dos seguintes efeitos fisiológicos: - um aumento significativo dos SCFA totais 19/51
- uma diminuição significativa do pH - uma composição de SCFA significativamente modificada - uma diminuição significativa dos SCFA ramificados - uma diminuição significativa da produção de gás por mole de SCFA produzida - uma fermentação maior e mais uniforme, incluindo a fermentação uniforme nas partes mais distais do cólon, e/ou - uma formação inicial alta dos SCFA e/ou formação do ácido láctico na parte mais proximal do cólon - promover a produção do SCFA no princípio, meio e fim do cólon um aumento significativo do ácido láctico (absoluto e/ou relativo) e/ou - um aumento da quantidade relativa de L-lactato como um rácio do ácido láctico total formado.
Numa forma de realização preferida pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou todos estes efeitos são significativamente modificados quando as composições que compreendem GOS como polifrutose são utilizadas, em comparação com a administração de composições que compreendem GOS ou polifrutose sozinhas, ou nem GOS nem polifrutose. Em particular, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou todos estes efeitos são significativamente maiores após a co-administração de uma (quantidade sinergisticamente eficaz) de GOS e polifrutose do que a soma do(s) efeito(s) da administração de GOS e polifrutose individualmente.
As composições sinergisticas de acordo com a invenção são, portanto, particularmente adequadas para formar e/ou para manter 20/51 uma microflora saudável no intestino grosso do bebé após a administração de uma quantidade sinergisticamente eficaz. Numa forma de realização preferida um bebé é somente alimentado com uma composição de base, tal como uma fórmula láctea, suplementada com uma quantidade sinergisticamente eficaz de GOS e de polifrutose nas primeiras semanas depois do seu nascimento. Uma composição preferida é, portanto, uma composição dietética para bebés. Noutra forma de realização um bebé é só parcialmente alimentado com uma composição de acordo com a invenção. Numa forma de realização a composição é utilizada para tratar ou prevenir os sintomas seleccionados de um ou mais dos seguintes: formação de gases, flatulência, colite, dilatação abdominal, espasmos abdominais, dor abdominal, IBS, IBD, alergia e/ou como um muco protector. 0 GOS e a polifrutose podem, ser então utilizados para a preparação de uma composição ou de uma composição combinada para ser utilizada em simultâneo, separada ou sequencialmente no tratamento da flatulência, excessiva formação de gases, colite, dilatação abdominal, espasmos abdominais, dor abdominal, IBS, IBD, alergia, diminuição do funcionamento da barreira intestinal e/ou como um muco protector. 0 sujeito pode neste caso ser qualquer sujeito, que varia desde bebé, criança, adolescente até adulto. Claramente, as composições de base às que GOS e polifrutose são adicionadas em quantidades sinergisticamente eficazes, variarão dependendo da idade do sujeito, do modo de administração e dos sintomas principais a ser tratados ou prevenidos. Para bebés por exemplo a composição base é preferencialmente uma fórmula liquida ou em pó para bebés ou uma fórmula para a fase seguinte, enquanto que para os adultos pode ser mais adequado uma composição suplementa de nutrientes (liquida, semi-liquida ou sólida) ou alimentação por tubo.
Numa forma de realização preferida o GOS e a polifrutose são co- administrados numa quantidade sinergisticamente eficaz adequada
para aumentar significativamente a quantidade total do SCFA intestinal formada e/ou para melhorar significativamente a 21/51 composição intestinal de SCFA (especialmente para aumentar significativamente a percentagem de acetato em relação com a quantidade total de SCFA) e/ou para aumentar significativamente a produção de lactato e/ou para baixar o pH intestinal e/ou para reduzir significativamente a formação de gases intestinais. É provida a utilização das composições que compreendem uma quantidade sinergisticamente eficaz de GOS e de polifrutose para o tratamento e/ou para a prevenção de cólicas e/ou espasmos abdominais, dilatação abdominal e/ou flatulência, dor abdominal, IBS, IBD e/ou alergia. É também provida a utilização de composições deste tipo para aumentar a muco protecção e reforçar a barreira intestinal. É entendido que não é necessariamente feita referência a uma composição, mas que o GOS e a polifrutose podem estar presentes em composições separadas, que provêm uma quantidade sinergisticamente eficaz quando são co-administrados.
Através destas mudanças nos niveis de SCFA, do perfil e do pH intestinal, as composições são capazes de causar um ou mais dos seguintes efeitos proveitosos abaixo mencionados: a) a permeabilidade intestinal no lugar da produção do SCFA é diminuída. Isto é importante para prevenir a doença e manter a saúde, especialmente para prevenir que se desenvolvam as alergias. 0 descobrimento de que a co-administração de GOS e da polifrutose provoca uma fermentação mais uniforme e que a fermentação se estende até à parte distai do cólon é importante neste aspecto, à medida que a permeabilidade do intestino, incluindo as partes distais do cólon, podem ser uniformemente reduzidas e portanto o intestino pode ser mantido uniformemente num estado saudável. b) a motilidade ou movimento peristáltico do intestino é melhorado, o que reduz ou previne a obstipação, um problema comum observado nos bebés que estão a ser alimentados com fórmula. 22/51 c) a diminuição da quantidade das contracções espontâneas e da tensão dos músculos colónicos que resulta em menos espasmos e menos dores abdominais. d) a absorção do cálcio é aumentada, o que é importante para a mineralização óssea e para o desenvolvimento ósseo do sujeito, especialmente se o sujeito é um bebé. e) podem ser reduzidos os sintomas secundários de saúde reduzida, tais como fadiga, depressão e flutuação de humor. f) a produção de muco da mucosa intestinal é aumentada significativamente, o que provê protecção contra a fixação patogénica e colonização. Em particular, foi descoberto que os niveis de lactato estavam correlacionados positivamente com a produção de muco.
As composições de acordo com a invenção podem assim ser utilizadas para estimular a produção de muco. g) o metabolismo da bilis pode ser modificado a niveis e/ou modelos como os observados nos bebés alimentados ao peito. h) o crescimento dos microrganismos intestinais patogénicos é inibido ao longo de todo o cólon.
Uma composição que compreende uma quantidade sinergisticamente eficaz de GOS e polifrutose pode portanto ser utilizada para manter ou estabelecer (por exemplo num bebé recém-nascido, prematuro ou bebé nascido a termo ou num bebé que não está a ser alimentado ou está parcialmente a ser alimentado ao peito, ou outros sujeitos, tais como adultos, um ou mais dos efeitos fisiológicos acima mencionados e manter ou melhorar a saúde do sujeito para assegurar ou estabelecer umas condições saudáveis para o intestino grosso e uma actividade óptima do intestino grosso. 23/51
Em particular, a incidência, duração e/ou severidade das doenças, perturbações ou sintomas tais como cólicas e/ou espasmos abdominais, dilatação e/ou flatulência abdominal, dor abdominal, IBS, IBD e/ou alergia, infecção patogénica intestinal (por exemplo bactérias, virus, fungos), diarreia, eczema, alergia induzida por asma e outras doenças atópicas, e/ou obstipação podem ser reduzidas, abolidas ou evitadas pela administração de uma composição de acordo com a invenção. As composições de acordo com a invenção podem também ser utilizadas para relaxar as contracções do cólon, preferencialmente as contracções fásicas e/ou tónicas.
Composições de acordo com a invenção
As composições adequadas para as utilizações acima descritas compreendem a polifrutose assim como GOS em quantidades sinergisticamente eficazes. As composições compreendem GOS/polifrutose com rácios que variam desde 3/97 a 97/3, preferencialmente desde 5/95 a 95/5, mais preferencialmente desde 90/10 a 45/55. Todos os rácios individuais entre estes pontos finais estão abrangidos na presente invenção, tais como 10/90, 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 55/45, 60/40, 70/30, 80/20, 85/15, 90/10, etc.
As dosagens requeridas e o rácio de GOS/polifrutose para obter o efeito sinergético (óptimo) pode variar, dependendo do tipo da composição e do método e da frequência de administração. No entanto, alguns exemplos são dados abaixo. Um técnico especializado pode determinar facilmente quais as dosagens requeridas de cada componente para obter o melhor efeito fisiológico e qual é o rácio mais adequado de GOS/polifrutose.
Por exemplo, se o objectivo principal é aumentar o nivel total de SCFA após a administração oral de uma composição que compreende GOS e polifrutose, um técnico especializado fará
várias composições (que compreendam GOS mais polifrutose, GOS sozinho, polifrutose sozinha) e comparará a sua eficácia para 24/51 induzir níveis elevados de SCFA utilizando testes in vivo ou testes in vítro, como as conhecidas na técnica. É entendido que quando é feita referência a "dose diária" ou "dosasagem por dia", isto não implica que a dosagem tenha de ser administrada ao sujeito de uma só vez.
Uma fórmula sinergisticamente eficaz para bebés pode, por exemplo, consistir numa composição de base (por exemplo fórmula para bebés Standard) compreendendo aproximadamente 4 g/1, 5 g/1 ou mais de uma mistura de GOS e de polifrutose, em que o rácio entre GOS e polifrutose pode variar como o descrito noutra parte na presente invenção (por exemplo 90% GOS:10% polifrutose). A polifrutose pode, por exemplo, ser levano e/ou inulina. A polifrutose, tal como levano ou inulina, para ser utilizada nas composições pode ser extraída de fontes naturais (plantas ou bactérias) ou pode ser feita por de nova síntese ou por tecnologias de ADN recombinante como as conhecidas na técnica. Os métodos de extracção, separação por tamanhos e purificação de inulina foram descritos, por exemplo em De Leenheer (1996), Pedidos de Patente norte-americanas US6569488 e US5968365. Os métodos de produção recombinante foram descritos por exemplo no Pedido de Patente norte-americana US6559356. A síntese geralmente envolve a utilização de moléculas de sacarose e enzimas com actividade de fructosil transferase. A inulina adequada para ser utilizada nas composições já está também comercialmente disponível, por exemplo Raftiline®HP, Orafti.
As inulinas vegetais geralmente têm um grau de polimerização mais pequeno do que as inulinas bacterianas (até 150, em comparação com os das batécias até 100.000). As fontes vegetais incluem espécies dicotiledóneas, tais como Compositae.
Exemplos de espécies que produzem quantidades relativamente grandes de inulina, principalmente nas suas raízes, bolbos ou tubérculos, são chicória, espargos, dálias, girassol-batateiro, 25/51 alho, e outros (ver Kaur & Gupta, J. BioSci. 2002, 27, 703-714). Devido a que a inulina preferencialmente não deverá compreender oligofrutose, a hidrólise deverá ser evitada ou a oligofrutose e/ou mono ou dissacarídeos presentes deverão ser removidos antes de a utilizar.
Especialmente preferida é a polifrutose com um PD de pelo menos 10, 15, 20, 50, 70, 100, 120, 130, 150, 200, 300, 500 ou mais. As polifrutoses, tais como levanos, podem ser hidrolisadas para evitar problemas de viscosidade associados a cadeias demasiado compridas, desde que seja retido um PD de 10 ou mais.
Os levanos também podem ser obtidos a partir de fontes naturais tais como plantas (por exemplo monocotiledóneas) levedura, fungos, bactérias, ou feitas quimicamente ou utilizando a tecnologia de ADN recombinante.
Os GOS podem ser obtidos a partir de fontes naturais, tais como plantas (por exemplo chicória, soja) ou bactérias, ou podem ser feitas sinteticamente ou por tecnologia de ADN recombinante como o conhecido na técnica. Os GOS podem ser β-galacto-oligossacarídeos ou α-galacto-oligossacarideos ou uma mistura dos dois. Em particular, os resíduos de galactose estão ligados por ligações glicosídicas (trans GOS ou TOS) β (1—>4) e β (1—>6) . Os GOS adequados para serem utilizados nas composições já estão também comercialmente disponíveis, por exemplo Vivinal®GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, The Netherlands. Os GOS podem também ser derivados da lactose, por tratamento enzimático de lactose com β-galactosidase ou por hidrólise de poliglucano. Numa forma de realização preferida são utilizados TOS. Numa forma de realização a polifrutose preferida é inulina HP, para que a combinação de TOS e inulina HP está também presente na invenção numa forma de realização preferida. 26/51
Outras composições providas são as composições que compreendem lactato em quantidades adequadas, em particular para as utilizações acima descritas. As quantidades adequadas de lactato podem variar, e podem por exemplo ser entre 1 e 30 gramas por dia.
As composições de acordo com a invenção podem ser composições alimentares, composições suplementares alimentares ou composições farmacêuticas. Além da polifrutose e do GOS (e/ou lactato) estas podem compreender ingredientes adicionais. As composições alimentares ou as composições suplementares alimentares deverão ser aptos para o consumo humano e fisiologicamente aceitáveis. "Alimentos" refere-se a composições dietéticas liquidas, sólidas ou semi-sólidas, especialmente composições alimentares totais (substitutos das refeições), que não requerem a ingestão de nutrientes adicionais ou de composições suplementares alimentares. As composições suplementares alimentares não substituem totalmente a ingestão de nutrientes por outros meios. Os alimentos e as composições suplementares alimentares são numa forma de realização preferida alimentos para bebés ou suplementos alimentares, alimentos ou suplementos alimentares para bebés nascidos prematuramente, alimentos para bebés, alimentos para crianças, etc., que são administrados várias vezes ao dia preferencialmente por via entérica, preferencialmente por via oral. Os alimentos ou as composições suplementares alimentares são particularmente adequadas para bebés que não estão a ser alimentados ao peito ou que estão parcialmente a ser alimentados ao peito. Também, a composição pode ser beneficamente administrada a bebés no seu periodo de adaptação aos alimentos sólidos ou a bebés que estão a passar da alimentação ao peito para a alimentação a biberão. A composição pode também fazer parte de um suplemento enriquecedor do leite humano.
Numa forma de realização a composição é uma fórmula para bebés ou de continuação, como por exemplo é conhecida na técnica, 27/51 especialmente como a descrita na Directiva da Comissão Europeia 91/321/EEC e as suas emendas, mas pode ser modificada para compreender uma quantidade eficaz de polifrutose e de GOS. A fórmula para bebés ou de continuação pode ter como base o leite (leite de vaca, leite de cabra, etc.), fórmula láctea para bebés (IMF) ou soja para bebés intolerantes à lactose ou pode conter aminoácidos como fonte de nitrogénio para bebés com problemas de alergia ou de absorção. As fórmulas comercialmente disponíveis para bebés ou de continuação compreendem, assim, uma base de proteina de leite ou proteína de soja, gordura, vitaminas, hidratos de carbono digeríveis e minerais em quantidades diárias recomendadas e podem ser em pó, concentrados líquidos ou composições prontas a alimentar. A administração da fórmula modificada para bebés ou de continuação resulta num ambiente do intestino grosso que se parece aos dos bebés alimentados ao peito, como pode ser determinada pela análise do pH fecal, da composição bacteriana, da produção e dos perfis do SCFA, da produção de gás, etc. Quando a composição é uma bebida, preferencialmente o volume (que compreende a dose efectiva diária) consumida ou administrada sobre uma base diária está na margem de aproximadamente 100 a 1500ml, mais preferencialmente aproximadamente entre 450 e 1000 ml ao dia. Quando a fórmula é um sólido preferencialmente a quantidade (que compreende a dose diária efectiva) consumida ou administrada sobre uma base diária está na margem de aproximadamente 15 a 220 g/dia, preferencialmente aproximadamente entre 70 e 150 g/dia em pó da fórmula.
Uma dose efectiva diária de GOS e de polifrutose para bebés varia entre aproximadamente 1 e 30 g/dia, preferencialmente entre aproximadamente 2 e 10 g/dia e para adultos preferencialmente entre aproximadamente 5 e 20 g/dia. 28/51
Os alimentos ou composições suplementares alimentares de acordo com a invenção podem compreender adicionalmente outros ingredientes activos, tais como vitaminas (A, Bl, B2, B3, B5, B12, C, D, E, K, etc.) ; probióticos (por exemplo bifidobactéria, lactobacílli, etc.), outros prebióticos, fibras, lactoferrina, imunoglobulinas, nucleotídeos, e outros. Nutrientes, como proteínas, lípidos e outros hidratos de carbono (por exemplo hidratos de carbono digeríveis, hidratos de carbono não digeríveis, hidratos de carbono solúveis ou insolúveis) podem estar presentes em várias quantidades. Os hidratos de carbono típicos insolúveis não digeríveis presentes na nutrição para bebés são os polissacarídeos de soja, amido resistente, celulose e hemicelulose. Os hidratos de carbono típicos solúveis e digeríveis para serem utilizados na nutrição para bebés são por exemplo maltodextrina, lactose, maltose, glicose, frutose, sacarose e outros mono ou dissacarídeos ou misturas destes. A composição pode também compreender outros ingredientes inactivos e portadores, tais como por exemplo glicose, lactose, sacarose, manitol, amido, celulose ou derivados de celulose, estearato de magnésio, ácido esteárico, sacarina de sódio, talco, carboneto magnésio e outros. As composições podem também compreender água, electrólitos, aminoácidos essenciais e não essenciais, elementos traça, minerais, fibra, adoçantes, aromatizantes, corantes, emulsionantes e estabilizadores (tais como lecitina de soja, ácido cítrico, ésteres de mono ou diglicerídeos), conservantes, aglutinantes, fragrâncias, e outros. Os lípidos adequados para as composições, especialmente para alimentos para bebés ou suplementos alimentares, são gorduras lácteas, lípidos vegetais, tais como óleo de canola, óleo de cártamo, óleo de girassol, azeite, óleos marinhos, etc. ou fracções ou misturas derivadas dos mesmos que compreendem ácidos gordos adequados (poliinsaturados e/ou saturados).
As proteínas adequadas para as composições especialmente para os alimentos para bebés ou suplementos alimentares, incluem caseína, soro de leite, leite desnatado condensado, soja, carne 29/51 bovina, colagénio, milho e outras proteínas de planta ou proteínas hidrolisadas, aminoácidos livres, etc.
Preferencialmente, as proteínas compreendidas nos alimentos para bebés ou nas composições suplementares alimentares estão maioritariamente hidrolisadas e/ou parcialmente hidrolisadas para reduzir o risco das alergias. As composições alimentares para bebés de acordo com a invenção preferencialmente compreendem todas as vitaminas e minerais essenciais na dieta diária ou semanal em quantidades nutricionalmente significativas, tais como as quantidades diárias mínimas recomendadas. A composição alimentar ou a composição suplementar alimentar pode também ser feita numa forma de realização com uma base alimentar (isto é começando desde ela ou compreendendo-a) Pode, por exemplo, estar baseada ou compreender um produto lácteo, tal como um produto lácteo fermentado, incluindo mas não limitado a leite, iogurte, uma bebida à base de iogurte ou soro de leite. Estas composições podem em parte ser preparadas de uma forma conhecida per se, por exemplo adicionando uma quantidade eficaz de polifrutose e de GOS ou de TOS a um alimento ou base alimentar adequado. Outras bases alimentares adequadas podem ser bases vegetais, bases animal e outras. A composição alimentar ou a composição suplementar alimentar de acordo com a invenção tanto pode ser utilizada como um tratamento e/ou profilacticamente. Isto quer dizer que tanto podem ser administradas depois de que tenham sido diagnosticados problemas ou doenças gastrointestinais num sujeito ou, de forma alternativa, antes da incidência dos sintomas (por exemplo, nos pacientes com alto risco de desenvolver problemas gastrointestinais). Por exemplo, se são observados os sintomas associados à doença ou ao funcionamento subóptimo no intestino grosso, tais como obstipação, flatulência, alergias, cólicas, dor abdominal, espasmos abdominais, IBD, IBS, a administração da composição ajudará no restabelecimento de umas condições 30/51 saudáveis do intestino grosso ou evitará o desenvolvimento destes sintomas.
Numa forma de realização as composições são administradas profilacticamente, para suportar o desenvolvimento de uma microflora saudável e/ou condições saudáveis do intestino grosso. Umas "condições saudáveis do intestino grosso" refere-se a uma fisiologia e a uma actividade intestinal normal, especialmente a absorção normal de nutrientes, água, resistência da mucosa à fixação patogénica, colonização e infecção, etc. como pode ser determinada pela análise fecal e pela produção de gás. Especialmente, uma fisiologia e uma actividade óptima são referidas. Qualquer funcionamento subóptimo do intestino grosso resulta em sintomas como os descritos e pode ser determinado pela análise fecal e/ou pela produção de gás. As doenças ou doenças intestinais que resultam de um funcionamento subóptimo estão incluídas na presente invenção.
As composições farmacêuticas para o tratamento ou para a profilaxia das doenças intestinais ou dos sintomas do funcionamento intestinal subóptimo, como IBD, colite, IBS e/ou integridade da barreira aumentada podem compreender ingredientes adicionais biologicamente activos, como os medicamentos, as proteínas biologicamente activas ou peptídeos, probióticos, e outros. As formas de realização descritas para os alimentos ou para as composições suplementares de alimentos são também aplicáveis às composições farmacêuticas.
As composições de acordo com a invenção pode estar em qualquer forma de dose, como forma líquida, sólida, semi-sólida, comprimidos, bebidas, pó, etc., dependendo do método de administração. A administração a um sujeito é preferencialmente oral, ainda que nalgumas utilizações possa ser adequada a alimentação rectal ou alimentação por sonda (introduzindo um tubo directamente no estômago, duodeno, ou intestino delgado ou intestino grosso). 31/51 É outra forma de realização da invenção prover um método para a fabricação de uma composição de acordo com a invenção adicionando uma quantidade sinergisticamente eficaz de GOS (ou de TOS) e de polifrutose a uma base de composição adequada, como o acima descrito.
Os seguintes exemplos não limitativos descrevem o efeito sinergético do GOS e da polifrutose. A não ser que seja determinado o contrário, a prática da invenção empregará métodos convencionais standards da biologia molecular, farmacologia, imunologia, virologia, microbiologia ou bioquímica. Estas técnicas foram descritas por Sambrook & Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al., (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA and Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985), Microbiology: a Laboratory Manual (6th Edition) by James Cappuccino, Laboratory Methods in Food Microbiology (3rd Edition) by W. Harrigan (Author) Academic Press.
Legenda das figuras
Figura 1
Formação do acetato, propionato e do butirato após 48 h de fermentação in vítro de TOS, inulina, uma mistura de TOS/inulina 9/1 e uma mistura de oligof rutoste e inulina 1/1 por fezes frescas obtidas dos bebés.
Figura 2
Quantidades relativas de acetato, propionato e de butirato formadas após 48 h de fermentação in vítro de TOS, inulina, uma mistura de TOS/inulina 9/1 e uma mistura de oligofrutose e 32/51 inulina 1/1 por fezes frescas obtidas dos bebés. A soma do acetato mais propionato mais butirato formado foi fixado a 100 % para cada uma das fibras testadas.
Figura 3
Formação de gás após 48 h de fermentação in vitro de TOS, inulina, uma mistura de TOS/inulina 9/1 e uma mistura de oligofrutose e inulina 1/1 por fezes frescas obtidas dos bebés. A quantidade de gás formado (ml foi referido para a quantidade de SCFA totais formados (em mM por g fibra).
Figura 4
Efeitos das misturas de SCFA (acteato/propionato/butirato num rácio de 90/5/5 numa base molar) e de L- lactato.
Figura 4A: efeito de 0, 0.1, 0.5. 1 e 4 mM da mistura do SCFA ou do L-lactato na expressão de muc-2 numa co-cultura CCD18/T84 (n=6) . As barras de erro mostram o SEM. O aumento a 1 e 4 mM da mistura de SCFA e 0.5, 1 e 4 mM de L-lactato é estatisticamente significativo.
Figura 4B: efeito de 0.50, 100, 250 e 500 μΜ da mistura de SCFA ou de L-lactato na resposta espontânea de PGE1 e PGE2 nas células CCD18 (n=7) . As barras de erro mostram o SEM. O aumento de PGE1 a 100, 250 e 500 μΜ da mistura de SCFA e 100 μΜ de L- lactato é estatisticamente significativo. O aumento de PGE2 a 100, 250 e 500 μΜ da mistura de SCFA e 250 μΜ de L-lactato é estatisticamente significativo (P<0,05)
Figura 5
Efeitos do acetato de sódio e do L-lactato de sódio na contracção espontânea na parte distai e proximal do cólon. O 33/51 branco (fixado a uma tensão de 1 g) é de 0%. A tensão após a adição de 40 mM de KC1 foi fixada a 100%.
Exemplos
Exemplo 1
Estudos da fermentação in vitro mostram efeitos sinergéticos nos modelos de fermentação 1.1 Materiais e métodos
Microrganismos
Os microrganismos foram obtidos a partir das fezes frescas dos bebés alimentados a biberão. O material fecal fresco dos bebés com idades compreendidas entre 1 e 4 meses foi agrupado e posto durante 2 h num meio de conservação.
Composições/substrato
Como substrato foram utilizados prebióticos (TOS; TOS (de VivinalGOS, Borculo Domo Ingredients, The Netherlands) assim como uma mistura de inulina (raftilinHP de Orafti, Belgium) num rácio de 9/1 (p/p); inulina; mistura de oligofrutose e inulina num rácio de 1/1 (p/p), ou nenhum foi utilizado (branco).
Meios
Meio de McBain & MacFarlane: água de peptona tamponada 3.0 g/1, extracto de levedura 2.5 g/1. mucina (fragmentos de membrana vesiculados) 0.8 g/1, triptona 3.0 g/1, L-cisteina-HCl 0.4 g/1, sais de bilis 0.05 g/1, K2HPO4.3H2O 2.6 g/1, NaHC03 0.2 g/1, NaCl 4.5 g/1, MgS04.7H20 0.5 g/1, CaCl2 0.228 g/1, FeS04.7H20 0.005 g/1. Biberões Scott de 500 ml foram enchidos com o meio e esterilizados durante 15 minutos a 121 °C. 34/51
Meio tamponado: K2HPO4.3H2O 2.6 g/1, NaHC03 0.2 g/1, NaCl 4.5 g/1, MgS04.7H20, 0.5 g/1, CaCl2 0.228 g/1, FeS04.7H20 0.005 g/1. O pH foi ajustado a 6.3 ± 0.1 com K2HP04 ou NaHC03. Biberões Scott de 500ml foram enchidos com o meio e esterilizados durante 15 minutos a 121 °C.
Meio de conservação: 20.0 g/1 de peptona tamponada, 0.5 g/1 de L-cisteina-HCl, 0.5 g/1 de tioglicolato de sódio, 1 pastilha de resazurina por litro. 0 pH foi ajustado a 6.7 ± 0.1 com 1 M de NaOH ou HC1. O meio foi fervido no microondas. Os biberões com 30 ml de soro foram enchidos com um meio de 25 ml e esterilizados durante 15 minutos a 121 °C.
As fezes frescas foram misturadas com o meio de conservação. As fezes frescas podem ser conservadas desta forma durante várias horas a 4 °C.
Suspensão fecal: a solução das fezes conservada foi centrifugada a 13.000 rpm durante 15 minutos. O sobrenadante foi removido e as fezes foram misturadas com o meio de McBain & Mac Farlane num rácio em peso de 1:5.
Fermentação 3.0 ml da suspensão fecal foram combinados com 85 mg de glicose ou de prebiótico ou sem adição (branco) num biberão e misturados cuidadosamente. Uma amostra de t=0 foi retirada (0.5 ml). 2.5 ml da suspensão resultante foram colocados num tubo de diálise num biberão de 60 ml cheio com 60 ml do meio tamponado. O biberão foi bem fechado e incubado a 37 °C. As amostras foram tomadas do tubo de diálise (0.2 ml) ou do tampão de diálise (1.0 ml) com uma seringa hipodérmica após 3, 24, e 48 horas e imediatamente postas sobre gelo para parar a fermentação.
Determinação dos ácidos gordos da cadeia curta e do lactato 35/51
Ver o exemplo 2. Os valores foram corrigidos para o branco.
Determinação do gás A t=3, t=24 e t=48 a pressão do gás no espaço superior do biberão de 60 ml foi medida por um medidor de pressão de gás (Druckmessumformer, Econtronic, Germany) picando com uma seringa hipodérmica de 6 ml o tampão de borracha do biberão e retirando o gás do espaço superior com esta seringa até que a pressão do gás seja de 0 bares. O volume na seringa era o volume de gás formado. Os valores foram corrigidos para o branco. 1.2 Resultados A fermentação ín vítro foi realizada utilizando as seguintes amostras: 1. ) 85 mg de TOS (de VivinalGOS, Borculo Domo Ingredients, The Netherlands) 2. ) 85 mg de inulina (raftilinHP, de Orafti, Belgium) 3. ) 85 mg de TOS/inulina com um rácio de TOS/inulina de 9/1 (p/p) e 4. ) 85 mg de (raftiloseP95, de Orafti, Belgium)/inulina (raftilineHP) num rácio de OF/inulina de 1/1 (p/p).
Quantidade total produzida dos SCFA
Os resultados são mostrados na figura 1. A figura 1 mostra que a mistura de TOSS/inulina resultou numa quantidade significativamente mais elevada de SCFA por g fibra do que os componentes isolados, mas também mais elevada do que a mistura de oligofrutose (OF) e inulina. Também foram testados 85 mg de 36/51 TOS/inulina num rácio de 1/1 (dados não mostrados), que também proveram um efeito sinergético.
Produção de L-lactato e de D-lactato 0 L-lactato e o D-lactato só poderão ser determinados em t=3. 0 quadro 1 mostra os produtos metabólicos finais formados nesse momento.
Quadro 1 - produtos metabólicos finais (mM/g fibra) formados após 3 horas de fermentação in vitro Acetato Propionato L- Butirato lactato D-lactato TOS 0.23 0 0 0.14 0.03 Inulina 0 0 0 0.00 0.00 TOS/inulina 0.40 0 0 0.17 0.04 OF/inulina 0.30 0 0 0.04 0.02
Uma vez mais foi observada uma formação sinergistica mais elevada de lactato para a mistura de TOS/inulina em comparação com os componentes individuais de TOS e de inulina. Em comparação com a mistura de OF e inulina a percentagem do lactato (baseada nos ácidos totais) e do rácio de L-/D-lactato é mais elevada na mistura de TOS/inulina.
Quantidades relativas do SCFA A figura 2 mostra o modelo dos produtos de fermentação após 48 h. A mistura de TOS/inulina mostra uma percentagem significativamente mais elevada de acetato do que os componentes individuais, que é também maior do que a mistura de oligofrutose (OF) e inulina. As fezes dos bebés alimentados ao peito mostram uma percentagem elevada de acetato, de forma que a mistura de TOS/inulina resulta num modelo de produtos de fermentação que se parece muito ao dos bebés alimentados ao peito. 37/51
Formação do gás
Os resultados são mostrados na figura 3. Relativamente à formação do gás, TOS e a mistura de TOS/inulina formam a quantidade minima de gás por SCFA por mM formado. A inulina e a mistura de OF/inulina mostram uma quantidade muito mais elevada da formação de gás. Por mM formado de SCFA a quantidade de gás é minima na mistura de TOS/inulina.
Cinética da formação dos SCFA 0 quadro 2 mostra a cinética da formação do SCFA. A combinação de TOS/inulina mostra ainda uma formação elevada entre 24 e 48 h de SCFA, indicando que na parte distai do cólon ainda são formados SCFA que tem um efeito benéfico na permeabilidade do cólon, formação de muco e efeitos antipatogénicos etc. Também durante as 3 primeiras horas foi formada a quantidade mais elevada de SCFA, como é o caso dos oligossacarideos de leite humano (dados não mostrados). Uma fermentação rápida no principio do cólon é importante devido aos efeitos antipatogénicos.
Quadro 2: cinética da formação de SCFA (mmol) SCFA (branco corrigido)
Intervalo de tempo (horas) Prebióticos 0-3 hrs 3-24 hrs 24-48 hrs TOS 0.23 3.85 0.13 TOS/inulina HP 0.40 4.49 0.24 Inulina HP 0.00 3.05 0.05 OF/inulina HP 0.11 4.26 0.00 OF = oligofrutose
Exemplo 2
Estudo clínico com TOS/inulina: um aumento relativo de acetato e uma diminuição relativa de butirato não estão correlacionados 38/51 com um aumento de bif idobactérias. TOS e inulina têm um efeito sinergético. 2.1 Materiais e métodos 63 mulheres grávidas que tinham decidido alimentar ao peito e 57 que tinham decidido não alimentar ao peito, foram recrutadas durante o seu último trimestre de gravidez. Os bebés com um peso normal ao nascer, sem anomalia congénita, doença congénita nem doença gastrointestinal foram inscritas nos 3 dias depois do parto. 0 estudo foi aprovado pelo comité ético do Medicai Center, St. Radboud, Nijmegen, the Netherlands. Foi obtido o consentimento informado por escrito dos pais antes da inscrição no estudo. Os bebés das mães que tinham decidido não alimentar ao peito foram distribuídos aleatoriamente num estudo duplo cego a um dos dois grupos de fórmula (OSF, SF) . 0 grupo de fórmula
Standard (SF; n=19 recebeu uma fórmula regular para bebés, sem suplemento (Nutrilon I, Nutricia, The Netherlands). Os dados principais da composição da fórmula Standard a diluição Standard de 131 g/1 são dados no quadro 3. 0 grupo da fórmula prebiótica (OSF; n=19) recebeu a mesma fórmula Standard para bebés com um suplemento de uma mistura de 6 g/1 de transgalacto- oligossacarídeos (TOS; Vivinal GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, The Netherlands) e inulina (PF; RaftilineHP, Orafti ative Food ingredient, Tienen, Belgium). A mistura compreendia 90% de TOS e 10% de inulina (polifrutose). as fórmulas do estudo foram administradas ad líbítum durante o período de estudo. As mães que tinham decidido alimentar ao peito e que continuaram a alimentar ao peito durante o curso do estudo e foram assistidas por consultores de lactação quando o necessitaram. Ao terminar a alimentação ao peito os seus bebés receberam uma das duas fórmulas. Foi avaliada a adaptabilidade contando o número de latas de fórmula sem usar durante cada visita e comparando a quantidade de fórmula consumida com a ingestão registada de alimentos. 39/51
Quadro 3: composição da fórmula Standard por litro
Energia kcal 670 Proteína g 14 Rácio caseína/soro de leite 40/60 Gordura g 35 Hidratos de carbono totais g 75 Lactose g 75 Minerais Cálcio mg 540 Fósforo mg 270 Magnésio mg 50 Sódio mg 190 Potássio mg 680 Cloreto mg 430 Ferro mg 5 Zinco mg 5
Questionários
Os dados demográficos, clinicos e antropométricos da mãe foram recolhidos antes do parto. A informação do parto das mães foi obtida ao 5o dia depois do parto. A informação sobre a ingestão de alimentos, tolerância à fórmula, caracteristicas da deposição, saúde e dados antropométricos dos bebés foram obtidos com os questionários no 5o, 10°, 28° dia após o nascimento e depois de 4 em 4 semanas até ao fim do estudo.
Amostras fecais
Foi pedido aos pais que tirassem amostras fecais dos seus bebés, no 5o, 10°, 28° dia depois do nascimento e depois de 4 em 4 semanas. As amostras foram tiradas da fralda, logo que foi possível depois da defecação, recolhidas nos recipientes para fezes (Greiner Labortechnik, the Netherlandas) e armazenadas 40/51 imediatamente a -20 °C pelo progenitor e transportadas num congelador portátil ao laboratório pelos investigadores.
Preparação das amostras fecais:
Para a determinação dos SCFA, 1 grama das amostras foi descongelada em água gelada diluida lOx em MilliQ e homogeneizada durante 10 minutos utilizando um homogeneizador stomacher (IUL Instruments, Barcelona, Spain) . 350 μΐ de fezes homogeneizadas foram misturadas com 200 μΐ a 5% (v/v) de ácido fórmico, 100 μΐ 1.25 g/1 de ácido 2-etilbutirico (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands) e 350 μΐ de MilliQ. As amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 14.000 rpm para remover as partículas grandes e o sobrenadante e foram armazenadas a -20 °C. Para a análise do FISH e para as medições do ácido láctico, as amostras foram descongeladas em água gelada, diluídas lOx (p/v) em tampão de fosfato salino, pH 7.4 (PBS) e foram homogeneizadas durante 10 minutos utilizando um stomacher. As fezes homogeneizadas foram armazenadas a -20 °C.
Hibridação ín sítu fluorescente A análise de FISH foi executada como o descrito (Langendijk et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:3069-3075), com algumas ligeiras modificações. As amostras fixadas em paraformaldeído foram aplicadas a lâminas de vidro revestidas com gelatina (placas com 8 poços revestidos de PTFE [1 cm2/poço] , CBN labsuppliers, Drachten, The Netherlands) e foram deixadas a secar ao ar. As amostras secas foram desidratadas durante 10 minutos em etanol a 96%. As amostras secas foram pré-aquecidas e adicionadas a um tampão de hibridação (20 mM de Tris-HCl, 0.9 M de NaCl, 0.1% de SDS [pH 7.1]) com 10 ng/1 Cy3 de uma sonda especifica de Bifidobacterium marcada com Bifl64mod (5'-CAT CCG GYA TTA CCA CCC) . Bif 164 mod é a versão modificada da sonda S-G-Bif-a-0164-a-A-18 (( Langendijk et al., 1995, Appl. Environ. 41/51
Microbiol. 61:3069-3075). As lâminas foram incubadas a 50 °C durante 24 horas numa câmara escura húmida. Após a hibridação as lâminas foram lavadas durante 30 minutos em 50 ml de tampão de lavagem pré-aquecido (20 mM Tris-HCl, 0.9 M NaCl [pH 7.2]) e brevemente enxaguadas em MilliQ. Para a coloração de todas as bactérias, as amostras foram incubadas à temperatura ambiente com 0.25 ng/1 de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBS durante 5 minutos. Após a coloração com DAPI as lâminas foram enxaguadas brevemente em MilliQ, secas, e montadas com Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, U.S.A.) e foram cobertas com uma lamela. As lâminas foram analisadas automaticamente utilizando um microscópio de epifluorescência Olympus AX70 com software de análise de imagem automatizada (Analysis 3.2, Soft Imaging Systems GmbH, Munster, Germany). A percentagem de bifidobactérias por amostra foi determinada analisando 25 posições microscópicas escolhidas aleatoriamente. Em cada posição foi determinada a percentagem de bifidobactérias contando todas as células com um conjunto de filtros DAPI (SP 100, Chroma Technology Corp., Brattleboro, U.S.A.) e contando todas as bifidobactérias utilizando um conjunto de filtros Cy3 (41007, Chroma Technology, Brattleboro, U.S.A.).
Análise dos ácidos gordos de cadeia curta
Os ácidos gordos de cadeia curta (SCFA), o ácido acético, propiónico, n-butírico, iso-butirico e n-valérico foram determinados quantitativamente por um cromatógrafo de gás (GC) Varian 3800 (Varian Inc., Walnut Creek, U.S.A.) equipado com um detector de ionização de chama. 0.5 μΐ da amostra a 80 °C foi injectada na coluna (Stabilwax, 15 x 0,53 mM, espessura da pelicula 1.00 μιη, Restek Co., U.S.A.) utilizando como gás de suporte o hélio (3.0 psi) . Após a injecção da amostra, o forno foi aquecido a 160 °C a uma velocidade de 16 °C/minuto, seguido do aquecimento a 220 °C a uma velocidade de 20 °C/minuto e finalmente foi mantido a uma temperatura de 220 °C durante 1.5 42/51 minuto. A temperatura do injector e do detector era de 200 °C. O ácido 2-etilbutirico foi utilizado como Standard interno.
Análise do lactato
As fezes homogeneizadas foram descongeladas em gelo e centrifugadas durante 5 minutos a 14,000 rpm. 100 μΐ de sobrenadante foi aquecido durante 10 minutos a 100 °C para inactivar todas as enzimas. O lactato foi determinado enzimaticamente, utilizando um kit de detecção do ácido de L-lactato com D-lactato e L-lactato-desidrogenase (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany). O lactato só foi determinado nas amostras fecais que eram suficientemente grandes.
Análise do pH
Após a armazenagem a -20 °C, as amostras fecais foram descongeladas e o pH foi medido directamente nas fezes à temperatura ambiente utilizando um medidor de pH Handylab (Scott Glas, Mainz, Germany) equipado com um eléctrodo de pH Inlab 423 (Mettler-Toledo, Columbo, U.S.A.)
Análise dos dados
Antes do estudo, os cálculos de energia mostraram que para detectar uma diferença na percentagem das bifidobactérias entre o grupo da fórmula de intervenção e o grupo da fórmula Standard 30% com um SD do 25%, deveriam ser incluídos 13 bebés por grupo. Como era esperado um abandono de 30% nos grupos alimentados com fórmula, no estudo foram incluídos mais bebés do que os calculados. Um pacote estatístico SPSS (versão 11/0) foi utilizado para a análise estatística dos resultados. A normalidade de todos os valores foi controlada por inspecção visual das marcações de probabilidade normal. As diferenças na percentagem das bifidobactérias, do pH, das quantidades 43/51 relativas de SCFA e do lactato entre os grupos foram testadas quanto à sua importância utilizando a análise de variância. No caso de uma diferença significativa (p<0.05), os grupos foram comparados utilizando o teste Bonferroni post hoc. Dado que não é possível atribuir o método duplo cego à alimentação ao peito e com biberão e para assegurar uma aleatoriedade adequada, não foi executada nenhuma análise estatística para comparar a alimentação ao peito com quaisquer outros grupos alimentados com fórmula. Os dados do grupo alimentado ao peito só são dados quando o bebé durante esse tempo tenha sido somente alimentado ao peito. 2.2 Resultados
Em total, 120 (bebés por grupo foram incluídos. 57 bebés iniciarão a alimentação com fórmula directamente logo ao nascer e foram igualmente divididos entre os grupos de fórmula. Dos 63 bebés que foram alimentados ao peito directamente logo ao nascer, 24 passaram à alimentação de fórmula antes das 16 semanas e 5 bebés abandonaram. As características dos sujeitos do estudo estão mostradas no quadro 4. Nos grupos alimentados com fórmula, 9 bebés abandonaram o estudo nas 16 primeiras semanas depois de nascer (4 no grupo SF, 5 no grupo OSF. As razões para o abandono incluíram: cólicas, suspeita de alergia ao leite de vaca, obstipação e problemas práticos. 44/51
Quadro 4 - Características dos objectos do estudo Fórmula Standard, SF N=19 Fórmula prebiótica, OSF N=19 Leite materno, BF N=63 Sexo Masculino 5 12 33 Feminino 14 7 30 Lugar de Em casa 7 8 40 nascimento Hospital 12 11 23 Modo de vaginal 14 16 59 parto Cesariana 5 3 4 Peso ao nascer 3600+501 3318+602 36511601
Bifidobactérias fecais
As percentagens de bifidobactérias nas fezes nos primeiros 5 dias, 10 dias, 4, 8, 12, e 16 semanas dos grupos alimentados estão mostrados no quadro 5 e as quantidades na quadro 5. O grupo OSF tende a ter uma percentagem maior em bifidobactérias do que o grupo SF a partir das contagens bacterianas totais de todas as idades, mas as diferenças não eram estatisticamente diferentes. Inesperadamente, a percentagem de Bifidobacteria nos bebés alimentados ao peito era também relativamente baixa e estava alinhada com os grupos alimentados com fórmula. Os dados preliminares também mostram um aumento de Lactobacilli no grupo BF e OSF, mas as quantidades de Lactobacilli na flora fecal são pelo menos uma ordem de magnitude inferior às da Bifidobacteria, o modelo global muda muito pouco.
Resultados do pH
Os valores do pH medidos nas fezes dos bebés alimentados com fórmula são mostrados no quadro 6. O nivel minimo de pH foi encontrado nos bebés alimentados ao peito. O pH fecal das fezes dos bebés alimentados com fórmula OSF era inferior ao do grupo SF (p <0.045 em todas as idades excepto no 5o dia) . 45/51
Resultados dos SCFA A quantidade total dos SCFA nas fezes é mostrada no quadro 5 abaixo. A percentagem dos diferentes SCFA a partir dos SCFA totais é mostrada no quadro 6. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na concentração total dos SCFA entre os grupos alimentados com fórmula. Também a quantidade dos SCFA é comparável à dos outros grupos de alimentação. No entanto, já depois dos 10 dias, as diferenças nos perfis de SCFA podem ser observadas entre os bebés alimentados com OSF ou os bebés alimentados com leite materno em comparação com os bebés alimentados com fórmula Standard. Os bebés alimentados com fórmula que contém GOS e polifrutose e alimentados com leite materno, têm percentagens maiores de acetato e percentagens menores de propionato, butirato, ÍC4-6 SCFA em comparação com os bebés alimentados com fórmula Standard.
Resultados de lactato
As concentrações de lactato (mmol/kg fezes) de todos grupos estão mostradas no quadro 6. Já a partir do 5o dia, a fórmula OS (não assinalada) e os grupos alimentados ao peito têm quantidades mais elevadas de lactato em comparação com o grupo de fórmula Standard. A quantidade relativa de lactato (como uma percentagem da soma de SCFA e lactato) é máxima nos bebés alimentados ao peito e minima nos bebés alimentados com fórmula Standard. Os bebés alimentados com uma fórmula que contém uma quantidade intermédia relativa de TOS/inulina têm uma quantidade relativa de acetato. A percentagem de lactato nos bebés alimentados com OSF na 16a semana (relativamente aos ácidos totais) difere significativamente da dos bebés alimentados com SF. 46/51
Quadro 5 - Concentração de lactato e quantidade total de SCFA (mmol/kg fezes) e de Bífídobactería (* 1.1013 /kg fezes) pH entre o nascimento e a 16a semana de idade. Média ± SEM. Excepto para o pH, não foram encontradas diferenças estatísticas.
Lactato SCFA PH Bifidobacteria 5 dias SF 13.5+7.7 54.7+12.6 5.93+0.15 0.58+0.49 OSF 10.7+4.3 56.5+7.7 5.49+0.15 1.20+2.24 BF 13.3+2.8 48.7+4.4 5.27+0.07 0.47+0.39 10 dias SF 4.6+3.0 62.0+7.9 6.88+0.15 0.96+0.83 OSF 9.7+3.6 62.3+7.2 5.95+0.20 1.10+0.99 BF 15.1+3.2 54.7+4.9 5.35+0.07 0.48+0.61 4 semanas SF 2.6+1.4 68.3+10.3 6.77+0.21 0.97+0.96 OSF 9.9+3.4 83.1+8.8 5.88+0.18* 1.20+0.55 BF 22.8+4.4 59.8+4.8 5.45+0.12 0.56+0.64 8 semanas SF 7.6+6.8 76.5+13.2 6.80+0.20 0.89+0.56 OSF 24.4+5.3 76.0+8.4 5.68+0.18* 1.00+0.52 BF 30.9+5.3 62.8+5.4 5.27+0.15 0.58+0.59 12 semanas SF 14.1+9.4 73.9+11.9 6.88+0.20 0.91+0.80 OSF 18.4+7.0 76.1+12.1 5.60+0.18* 1.30+0.99 BF 42.1+7.1 60.4+4.9 5.29+0.17 1.40+1.38 16 semanas SF 1.7+1.2 68.6+14.0 7.09+0.15 1.00+0.80 OSF 18.5+5.7 67.7+11.7 5.60+0.20* 1.30+0.76 BF 45.1+9,0 59,2+6, 9 5.68+0.24 0.89+0.78
Quadro 6 - quantidades relativas dos SCFA (% da quantidade total dos SCFA, lactato (% dos ácidos totais), % de Bífídobactería entre o nascimento e a 16a semana de idade.
Dia/semana Acetato Propionato Butirato Soma ÍC4-C5 % de Bi fi doba cteria Lactato 5 dia SF 84.3+3.4 12.9+3.2 1.7+0.5 1.1+0.4 45+3.6 13.8+18.5 OSF 85.8+5.1 12.0+4.7 0.5+0.5 1.7+0.7 50+8.6 8.7+13.3 BF 89.5+1.8 7.0+1.5 1.6+0.4 2.0+0.4 54+4.1 12.5+14.0 10 dia SF 70.9+2.0 21.3+2.6 4.6+1.1 3.2+0.5 65+6.0 4.3+10.8 OSF 84+2.4* 13.5+2.3 1.4+0.4* 1.1+0.4 61+6.3 8.2+9.8 47/51 BF 89.3+1.9 5.8+1.3 2.3+0.3 2.6+0.4 42+4.1 13.4+13.8 4 semana SF 71.8+2.8 17.8+3.3 5.0+1.1 5.5+2.6 52+5.4 6.9+16.4 OSF 77.7+2.2 15.4+2.0 5.8+2.2 1.1+0.3 71+4.5 8.4+10.7 BF 91.0+1.8 4.3+1.2 2.6+0.6 2.1+0.4 47+5.4 19.6+17.0 8 semana SF 74.6+2.9 16.4+2.0 6.1+1.2 2.9+0.7 50+6.3 3.5+9.9 OSF 83.5+2.7 11.4+2.1 3.7+1.2 1.4+0.4 64+4.1 17.7+15.2 BF 91.2+1.6 5.4+1.4 1.9+0.5 1.6+0.3 41+4.5 21.7+13.4 12 semanas SF 73.9+2.9 17.8+3.3 5.0+1.1 3.2+0.5 56+5.4 5.4+11.9 OSF 86.5+2.1 11.2+1.8 1.2+0.3* 1.0+0.4 60+5.0 13.6+13.2 BF 86.1+3.3 7.5+2.2 3.0+0.7 3.5+0.8 59+4.5 30.2+16.3 16 semanas SF 69.9+3.9 19.6+2.7 5.6+0.9 4.9+0.8 52+6.3 0.6+0.9 OSF 82.2+5.3 14.3+4.9 2.1+0.5* 1.5+0.4* 69+7.7 16.4+12.0* BF 89.7+2.7 6.4+2.1 1.6+0.4 2.2+0.5 47+6.3 35.6+20.4 p<0.05 em comparação com SF; SF= alimentados com fórmula Standard, OSF = SF suplementado com GO+inulina; BF= alimentados ao peito 0 exposto anteriormente demonstra que nas fezes dos bebés alimentados com esta combinação de GOS e polifrutose o pH é baixado, que mais lactato foi formado, e que é formado um modelo de ácido (acetato e lactato) que se parece mais ao dos bebés alimentados ao peito e que este efeito não pode ser atribuído ao aumento quantitativo da Bifidobacteria.
Exemplo 3 - efeitos benéficos do lactato e da mistura do SCFA na expressão de Muc-2, PGE1 e PGE2. 3.1 Material e métodos 0 efeito do lactato e de uma mistura SCFA foi analisada como o descrito por Willemsen, LEM, Koetsier MA, van Deventer SJH, van Tol EAF (2003), Gut 52:1442-1447, com as sequintes modificações: o lactato e uma mistura de acetato/propionato/butirato 90/5/5 foi testado. Para as experiências da produção de muco foi utilizada uma co-cultura de células CCD18 e T84, enquanto que para as experiências de produção de PGEl e PGE2 foi utilizada uma monocultura de células CCD18. 3.2 Resultados 48/51
Os SCFA, numa mistura de 90/5/5 (acetato/propionato/butirato) , e a dose de L-lactato induzem dependentemente a expressão MUC-2 numa co-cultura de células CCD18 e T84, como pode ser observada na figura 4A. Também a concentração de PGEl e PGE2 aumenta nas células CCD18, como pode ser observado na figura 4B. A concentrações maiores de ácidos orgânicos adicionados os aumentos atingem uma significância estatistica.
Exemplo 4: efeito do lactato na contracção de cólon 4.1 Material e métodos
As ratazanas Wistar macho (CKP/Harlan, Wageningen/Horst, Netherlands) foram colocadas sobre condições de temperatura controlada e ciclos de luz e foi-lhes provido o livre acesso a alimentos granulados e água. Os animais foram anestesiados com uma mistura de N2O, O2 e isoflurano, o abdómen foi aberto e o cólon foi imediatamente removido. O tecido foi colocado no tampão de Krebs-Henseleit pH 7.4 (composição em mM: 118.0 NaCl, 4.75 KC1, 1.18 MgS04, 2.5 CaCl2, 10 glicose, 1.17 KH2P04 e 24.9
NaHC03) . O cólon foi cortado numa parte distai e numa proximal e foi enxaguado com um tampão Krebs-Henseleit enquanto que o conteúdo fecal foi cuidadosamente espremido. Para aproximar tanto quanto possivel às condições ín vivo, 1 cm de segmentos totalmente intactos foram fixados longitudinalmente a um transdutor de força isométrica (F30 tipo 372, HSE, Germany) em 20 ml de banhos orgânicos com camisa de água (Schuler, HSE, Germany) (37 °C) contendo um tampão de Krebs-Henseleit gaseificado continuamente com 95% de 02 5% de C02. Os segmentos foram estendidos gradualmente a uma tensão de descanso de 1 g e deixados a equilibrar durante 45 minutos com lavagens intermitentes. As tensões dos segmentos em descanso e em resposta aos diferentes estimulos foram amplificadas por um módulo amplificador transdutor (HSE, Germany) e registadas num gravador multi-pen 49/51 (Rikadenki, HSE, Germany). Os segmentos foram incubados com 40 mM de KC1 durante 5 minutos e as respostas contrácteis foram medidas. O KC1 foi enxaguado com três lavagens consecutivas com intervalos de 5 minutos. Os segmentos foram seguidamente incubados com concentrações cada vez maiores até 100 mM de acetato ou L-lactato de sódio. As soluções ácidas foram preparadas frescas em água destilada. NaOH foi adicionado ao acetato para obter um pH neutro. No fim da incubação com um ácido gordo 40 mM de KC1 foram adicionados, para determinar se a resposta contráctil do KC1 foi influenciada pelo ácido gordo. Antes de uma nova incubação os segmentos foram deixados a equilibrar durante 45 minutos num tampão fresco de Krebs-Henseleit com lavagens intermitentes. O protocolo experimental consistiu em duas secções proximais e distais do cólon. Para a análise dos dados (n=3), o nível de contracção induzida pelos estímulos foi definido como a tensão em g após 5 minutos de incubação. Os dados obtidos a partir dos segmentos idênticos (proximal ou distai) foram utilizados para calcular um valor médio e cada um dos segmentos serviu como a sua própria amostra de controlo. 4.2 Resultados
Como pode ser observado na figura 5, o acetato de sódio e especialmente o L-lactato de sódio reduzem a tensão das contracções tónicas. Os efeitos de relaxação são maiores na parte distai do cólon do que na parte proximal do cólon. Também o número de contracções espontâneas, das contracções fásicas, diminuem na parte proximal do cólon após a adição de acetato de sódio e de L-lactato de sódio, enquanto que não foram observados nenhuns efeitos na parte distai do cólon. Contudo, na parte proximal do cólon as contracções tónicas como uma resposta ao KC1, são comparáveis na presença ou na ausência de 25 mM de acetato de sódio ou L-lactato de sódio. Nas concentrações 50/51 maiores foi observada uma relaxação significativa mesmo depois da adição do KC1.
Lisboa, 51/51

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização dos galacto-oligossacarideos e da polifrutose para a fabricação de uma composição para o tratamento ou para a prevenção de alergia, eczema ou doenças atópicas, caracterizada por o volume da composição administrada numa base diária estar na margem de 100 a 1500 ml.
  2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição ser para o tratamento ou para a prevenção de eczema ou doenças atópicas.
  3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição ser para o tratamento ou para a prevenção de alergias.
  4. 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a quantidade de galacto-oligossacarideos :polifrutose ter um rácio entre 3:97 e 97:3.
  5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o galacto-oligossacarideo ser transgalacto-oligossacarideo e/ou a polifrutose ser inulina.
  6. 6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a polifrutose ser a inulina com um grau médio de polimerização de 20 ou superior.
  7. 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a dose diária de galacto-oligossacarideos e de polifrutose variar aproximadamente entre 1 e 30 g/dia, preferencialmente aproximadamente entre 2 e 10 g/dia.
  8. 8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a composição compreender também 1/4 e hidratos de carbono diferentes dos proteínas, lipídeos, galacto-oligossacarídeos e da polifrutose.
  9. 9. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a composição ser uma composição de alimentos ou uma composição suplementar de alimentos.
  10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a composição ser um alimento para bebés.
  11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por a composição ser uma fórmula para bebés ou uma fórmula de continuação.
  12. 12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a composição compreender pelo menos 4 g/1 de uma mistura de galacto-oligossacarídeos e polifrutose.
  13. 13. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o volume da composição administrada numa base diária estar na margem de aproximadamente 450 e 1000 ml.
  14. 14. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por as proteínas estarem extensivamente hidrolisadas ou parcialmente hidrolisadas. Lisboa, 2/4 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo titular tem como único objectívo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração foi tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a este respeito a EPO declina qualquer responsabilidade. Documentos de Pedidos de Patente citados na descrição • EP 1105002 A [0009] · US 6569488 A [0057] • WO 2005039319 A [0010] · US 5968365 A [0057] • WO 2005039597 A [0011] · US 6559356 A [0057] Literatura citada na descrição que não é Pedido de Patente • GIBSON; ROBERFROID J. Nutr., 1995, vol. 125, 1401-1412 [0002] • JENKINS et al. J. Nutrition, 1999, vol. 129, 1431S-1433S [0003] • ROBERFROID Am J Clin Nutr, 2001, vol. 73, 406S-409S [0003] • HARMSEN et al. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 2000, vol. 30, 61-67 [0004] • BOEHM et al. Acta Paediatr., 2003, vol. 441, 64-67 [0004] • MORO et al. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2002, vol. 34, 291-295 [0004] • BOEHM et al. Arch Dis Child, 2002, vol. 86, F178-F181 [0004] • MORO et al. Acta Paediatr., 2003, vol. 441, 77-79 [0005] • MARINI et al. Acta Paediatr., 2003, vol. 441, 80-81 [0005] • BOEHM et al. Arch. Dis. Child Fetal. Neonata. Ed., 2002, vol. 86, F178-F181 [0005] • MORO et al. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 2002, vol. 34, 291-295 [0005] • SCHMELZLE et al. J Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 2 0 03, vol. 36, 343-51 [0005] 3/4 • WILLEMSEN et al. Gut, 2003, vol. 52, 1442-1447 [0012] • KAUR; GUPTA J. Biosci., 2002, vol. 27, 703-714 [0058] • SAMBROOK; RUSSELL Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001. vol. 1 and 2, [0074] • AUSUBEL et al. Current Protocols in Molecular Bíology, Current Protocols, USA, 1994, [0074] • Remington's Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Companyl985, [0074] • Microbiology: A Laboratory Manual [0074] • W. HARRIGAN Laboratory Methods in Food Microbiology Academic Press [0074] • LANGENDIJK et al. Appl. Envíron. Microbiol., 1995, vol. 61, 3069-3075 [0101] [0101] • WILLEMSEN, LEM; KOETSIER MA; VAN DEVENTER SJH; VAN TOL EAF Gut, 2003, vol. 52, 1442-1447 [0112] 4/4
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