PT1499738E - Amplificação de polimerase recombinase - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

AMPLIFICAÇÃO DE POLIMERASE RECOMBINASE

ANTECEDENTES A capacidade para amplificar o ADN está no coração da investigação biológica e médica modernas. Isto deve-se ao facto de a maior parte das técnicas de biologia molecular se' basearem em amostras que contêm muitas moléculas idênticas para aumentar a sensibilidade de um ensaio ou para preparar material suficiente para tratamentos posteriores. Entre as várias técnicas de amplificação dos ácidos nucleicos, a reacção em cadeia de polimerase (RCP) é a ruais comum por causa da sua sensibilidade e eficiência na amplificação de sequências curtas de ácidos nucleicos

Embora a RCP seja de grande utilidade, está também muitò limitada no número de vias de realização. A primeira limita-ção da RCP reside no facto de se basear em ciclos múltiplos de fusão, térmica (desnaturação) a temperaturas elevadas se-guidos de hibridação e de elongação a temperatura reduzida.. Para maximizar a eficiência e minimizar o ruído, é necessário um controlo complexo da temperatura das múltiplas reacções. Isto exige a utilização de um equipamento de um bloco de aquecimento/arrefecimento rápido e controlável por termoci-clagem feito de materiais exóticos (por exemplo, blocos de prata revestidos a ouro), ou um mecanismo robótico para mover as amostras entre zonas de temperatura controlada. Por causa1 da alta temperatura necessária para fundir o ADN em condições fisiológicas do sal, a tecnologia da RCP exige quer a adição de polimerase fresca em cada ciclo ou a utilização de polime-rases termoestáveis. A abordagem de adição da polimerase fresca 1 não tem sido automatizada e assim dá muito trabalho e é propensa a erros (por exemplo, contaminação, tubos caldos, erros de etiquetagem}. Além disso, a necessidade de adicionar enzimas e de misturar cada uma delas individualmente em cada, mistura reaccional apresenta sérias desvantagens que têm limitado a adaptação dos processos de RCP com adição de enzi-mas a uma escala pequena.

Comparada com os processos que envolvem a adição de polimerase fresca, a utilização de polimerases termo-estáveis na RCP é a mais amplamente praticada. Es.ta abordagem sofre pelo facto de as polimerases termoestáveis se encontrarem num número limitado de organismos e por os mecanismos de replicação utilizados pelos organismos termofilicos ainda serem muito mal compreendidos. 0 repertório disponível de polimera-es termoestáveis está limitado a enzimas de polimerase de um único polipéptido envolvidas na reparação do ADN e/ou na sín-ese da hélice tardia. A reparação .do ADN e/ou as polimerases da hélice tardia são escolhas pobres para a amplificação do ADN porque exibem uma baixa processividade (síntese distributiva) . Em parte como , consequência da utilização da repara-ção e/ou. as polimerases de hélices tardias (por exemplo, polimerases Taq, Pfu, Vent), e devido à formação de estru-turas inibidoras secundiárias ou terciárias de ácidos nuclei-cos. no seguimento da fusão térmica, os actuais protocolos de RCP não amplificam facilmente sequências com mais do que alguns milhares de pares de bases. As sínteses fiáveis (e a amplificação) de matrizes mais longas baseiam-se em polimerases e complexos enzímáticos auxiliares que. exibem colecti-vamente níveis mais elevados de processividade (medida do n° médio de nucleótidos adicionado por uma enzima polimerase de ADN por associação/dissociação com a matriz), deslocação das 2 assim como de ácidos formar no hélices, e resolução da estrutura secundária, limitam a formação de estruturas inibidoras nuclei-cos de ordem superior que se podem arrefecimen-to/aquecimento do ADN desnaturado.

Uma segunda limitação da RCP reside no facto de se basear na hibridação da solução entre oligonucleótidos (inicia-dores de RCP) e ADN da matriz desnaturado (isto é, o ADN a ser amplificado) num ambiente aquoso. Para serem eficazes, as reacções de RCP realizam-se num curto espaço de tempo porque as polimerases termoestáveís têm uma actividade que declina rapidamente às temperaturas da RCP. Além disso, para uma hibridação eficaz num curto espaço de tempo, uma característica critica para uma transformação rápida, é a necessidade de realizar a RCP num ambiente com concentrações elevadas de oligonucleótidos. A concentração elevada dos oligonucleótidos também assegura uma interacção rápida das sequências alvo com os oligonucleótidos em comparação com as hélices complementares desnaturadas a quente ainda presentes na solução. Concentrações elevadas dos iniciadores dos oligonucleótidos podem causar problemas, particularmente quando o número de cópias da sequência alvo é baixo e estão presentes numa mistura complexa de moléculas de ADN. Será o caso, por exemplo, numa RCP de. um genoma para determinar o polimorfismo genético num local.

Um problema na utilização de concentrações elevadas de oligonucleótidos reside no facto de aumentar o grau de inici-ação falsa em sequências apenas parcialmente emparelhadas na mistura complexa de ADN. A iniciação falsa refere-se à hibri-dação de um iniciador com um ADN matriz numa RCP mesmo quando a sequência de iniciação não é completamente complementar do ácido nucleico matriz, o que 3

I pode levar a uma amplificação não específica do sinal dos ácidos nucleicos, devido a uma falsa iniciação, que aumenta a concentração dos oligonucle-ótidos e a complexidade do ADN total do inicio. Além disso, a possibilidade de uma iniciação falsa aumenta- à medida que diminui o número de cópias das sequências-alvo. Quando as condições são favoráveis para uma iniciação falsa (isto é, concentração elevada de oligonucleótidos, complexidade eleva-da, baixo número de cópias), as sequências ampliadas errantes podem tornar-se um produto dominante da reacção. Consequentemente, pode ser dificiel identificar condições e oligonucleótidos, para uma amplificação limpa das sequências-alvo a partir de uma amostra de ADN sem um excesso de falsa inicia-ção antecedente. Assim, uma outra desvantagem na utilização da RCP é o sucesso limitado na amplificação de uma forma limpa de ADNs-alvo raros a partir de misturas complexas de sequências.

Uma solução para os problemas de especificidade e para o problema de fusão da matriz em que incorre a RCP consiste em utilizar processos que se baseiem nas propriedades biológicas da proteína bacteriana de RecA, ou os seus parentes proca-rióticos e eucarióticos. Estas proteínas revestem ADN de hélice simples (ADNhs) para formar filamentos, que podem rastrear o ADN de hélice dupla (ADNhd) para regiões de homo-logia r.da sequência. Quando se localizam sequências homólogas, a hélice do filamento da nucleoproteína invade o ADNhd crian-do um híbrido curto e uma bolha de filamentos deslocada conhecida como anel D. A extremidade livre 3' da hélice do filamento no anel pode ser alongada pela polimerase do ADN para sintetizar uma nova hélice complementar. A hélice complementar desloca a hélice originalmente emparelhada à medida que se alonga. Utilizando pares de oligonucleótidos de uma forma 4 semelhante à utilizada na RCP deve ser possível amplificar as sequências-alvo de ADN de uma forma análoga mas sem qualquer requisito para a fusão térmica (termociclagem). Isto tem a vantagem de permitir tanto a utilização de polim-rases lábeis pelo calor que antes não se podiam utilizar na RCP, como aumentar a fidelidade e a sensibilidade por rastreio da matriz e invasão das hélices em vez da hibri-dação. .

Embora a utilização de RecA e dos seus homólogos para a amplificação in vitro amplificação de ácidos nucleicos tenha sido previamente descrita (patente U.S. 5.223.414 por Zarling et al., referido aqui como "Zarling"), o processo e os resultados são limitados. 0 processo de Zarling tem falhas criticas, que limitaram a sua capacidade para conseguir uma amplificação exponencial do ADN de hélice dupla. A falha do processo de Zarling em conseguir uma amplificação exponencial pode ser devida à sua especificação para utilizar ATPyS (txifosfato de adenosina) em vez de ATP. No processo de Zarling urge a utilização de ATPyS, em vez de ATP, na junção dos filamentos da nucleoproteína RecA porque resulta numa estrutura mais estável de filamentos de nucleoproteína RecA/ADNhs. Normalmente, os filamentos são unidos numa direcção de 5' para 3' e vão-se dissociando espontaneamente na mesma direcção de 5' para 3'· à medida que RecA hidrolisa ATP. Este processo é dinâmico pelo facto de a união e a dissociação ocorrerem ao mesmo tempo e a quantidade de fila-mentos unidos estar em equilíbrio. Se se usar o análogo de ATP não hidrolisável, ATPyS, fica inibida a hidrólise de ATPyS e a dissociação de 5' para 3' dos filamentos. A grande estabilidade dos filamentos de RecA/ATPyS tanto antes como depois da troca de filamentos, embora seja útil no processo para atingir o alvo (isto é, o 5 processo de Zarling) é prejudicial e não é prático para a amplificação do ADN.

No processo de Zarling, a proteína RecA envolvida na invasão dos filamentos, permanecerá associada à porção de hélice dupla do material permutado depois da troca de filamentos. Esta interacção ocorre por causa do duplex recen-temente formado estar ligado' a um sitio de- elevada afinidade de. A hélice deslocada ocupa um sítio de afinidade diferente, a menos que se ligue a outra proteína de ligação a ADN de hélice simples (LHB) , tal como LHS de E. coli. Se se tiver utilizado ATP para gerar a estrutura de permuta, pode ocorrer uma dissociação espontânea de 5' para 3' , embora o complexo de permuta possa ser bastante estável e possa requerer factores adicionais para estimular a dissociação dependente do ATP Independentemente do facto de ser espontânea ou estimulada na presença de ATPyS, fica inibida a dissociação de 5' para 3' dos filamentos de RecA (Paulus, B.F. e Bryant, F. R. (1977). Biochemistry 36, 7832-8; Rosselli, W. e Stasiak, A. (1990). J Mol Biol 216, 335-52; Shan, Q. et al., (1997). J Mol Biol 265, 519-40; Shan, Q. et al., (1997). Estes complexos de RecA/AhdDN são precisamente os sítios atingidos por complexos iniciadores de RecA/ADNhs utilizados para os subsequentes ciclos de invasão e síntese. Com a ligação RecA, os ADNshd já não podem ser invadidos pelos complexos do iniciador RecA/ADNhs e por isso não sto amplificáveis a partir deste ponto. Pode ainda ocorrer uma síntese posterior destas matrizes se for iniciada na outra extremidade da matriz, que está isenta de RecA, e isto pode eventualmente levar à deslocação da ligação de RecA Contudo, não está claro se muitas polimerases podem deslocar RecA desta maneira. Além disso, em vez disso, o sítio de iniciação para esse ciclo de síntese será, agora "bloqueado". Nessa situação, a amplifi- 6 cação é apenas linear com o tempo, e vai gerar predominantemente produtos de amplificação de ADN de hélice simples. Assim, o processo de Zarling descrito, na melhor das hipó-teses, é provável que gere pouco mais do que pequenas quantidades de cópias de ADNhs a partir de cada matriz. Além disso, a amplificação linear dada pelo processo de Zarling vai ocorrer apenas na presença de LHS, dado que a hélice deslocada continuará a ligar-se ao segundo sitio de inter-acção em RecA, e o ADN de hélice simples não será libertado (Mazin, A, V. e Kowalczykowski, S. C. (1998). Embo J 17, 1161-8). Isto provavelmente explica porque é que no processo de Zarling se observam fragmentos adicionais de migração rápida quando incluem LHS. Estes fragmentos adicionais foram muito provavelmente fragmentos de hélice simples deslocados. A partir disto, no processo de Zarling vai ocorrer apenas uma amplificação linear do ADN de hélice simples. . Há por isso uma necessidade na técnica de um processo melhorado de amplificação de ADN dependente de recombinase.

Descrevem-se duas novas estratégias de amplificação que evitam qualquer requisito para a fusão térmica de ADN ou de 'componentes termoestáveis. Estas estratégias também ultra-passam as ineficiências do processo de Zarling.· Tal como a estratégia de Zarling, estes métodos baseiam-se nas propriedades biológicas da proteína bacteriana RecA, ou os seus parentes procarióticos ou eucarióticos. Cont.udo, ao contrário do processo de Zarling, estes processos são concebidos para atingir a amplificação exponencial do ADNhd. Conseguem-ηο permitindo uma regeneração rápida das sequên-cias-alvo no ácido nucleico-alvo na presença de filamentos dinâmicos de RecA/ADN filaments. Além disso, um dos processos obvia qualquer necessidade de iniciação de replicação faseada a partir de ambas as extremidades do 7 ácido nucleico-alvo por acoplamento a síntese de filamentos líderes e retardados a produtos de hélice dupla gerados simultaneamente.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto um processo de amplificação de ADN, designado por APR, que compreende as etapas seguintes. Primeiro^ faz-se contactar um agente de recombinase com um primeiro e um segundo iniciador de ácido nucleico para formar um primeiro e um segundo iniciador de nucleoproteína na presença de ATP, RecO, RecR, e RecF. Em segundo lugar, faz-se contactar o primeiro e. o segundo iniciadores de nucleoproteína com uma sequência-alvo de hélice dupla para formar uma primeira estrura de hélice dupla numa primeira porção da referida primeira hélice e formar uma estrutura de hélice dupla numa segunda porção da referida segunda hélice de modo a que as extremidades 3' do referido primeiro iniciador de ácido nucleicos e do referido segundo iniciador de ácido nucleicos orientados um para o outro numa dada molécula matriz de ADN. Em terceiro lugar, a extremidade 3' dos referidos primeiro e segundo iniciadores de nucleoproteína são prolongadas pelas polimerases de ADN para gerar o primeiro e o segunda ácidos nucleicos de hélice dupla e a primeira e a segunda hélices deslocadas de ácidos nucleicos. Einalmente, a segunda e terceira etapas repetem-se até se atingir o grau de amplificação desejado. 0 agente de recombinase é a proteína RecA. A presente invenção também tem por objecto um processo de APRs aninhadas. Numa APR aninhada, amplia-se uma primeira região de ácidos nucleicos por meio de APR para formar uma primeira região ampliada. Depois amplifica-se 8 está uma segunda região de ácidos nucleicos que completamente dentro da primeira região, ampliada utilizando APR para formar uma segunda região ampliada. Este processo pode ser repetido quantas vezes forem necessárias. Por exemplo, uma terceira região de ácidos nucleicos, que está completamente dentro da segunda região ampliada, pode ser ampliada a partir da segunda região ampliada por APR. Para além do primeiro, Segundo e terceiro ciclos de APR discutidos antes, a invenção contempla pelo menos 4, e preferencialmente pelo menos também 5 ciclos APRs aninhadas.

Também tem por objecto processos de detecção de um genó-tipo utilizando APR. Este processo é útil para a genotipagem, para a detecção de um estado clínico normal ou de doença, uma pré-disposiçãò ou a falta de uma disposição para um dado. estado clínico. Além disso, a APR pode ser utilizada para a detecção da presença de um genoma, tal como, por exemplo, um genoma de um agente patogénico. Nesta utilização, o processo é útil para o diagnóstico e a detecção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 descreve uma representação esquemática de carga de RecA/iniciador.

Figura 2 descreve uma representação esquemática de etapas sucessivas, ilustradas nos painéis (a) e (b) de Amplificação dominante da hélice de polimerase-recombinase (APRhd).

Figura 3 descreve uma representação esquemática de etapas sucessivas, ilustradas nos painéis (a) e (b) de Amplificação dominante e da retardada da hélice de polimerase-recombinase. 9

Figura 4 descreve um exemplo de iniciadores alojados escolhidos para APR alojados.

Figura 5 descreve exemplos de ácido nucleicos matrizes apropriados de hélice dupla.

Figura 6 descreve nos painéis. (a) e (b) as várias orientações dos pares de iniciadores de APR iniciador na hibridação com o ácido nucleico-alvo.

Figura 7 painéis (a) , (b) e (c) descrevem uma representação esquemática de uma reacção de APR reaction em progresso.

Figura 8 descreve (a) exemplos de iniciadores de hélice dupla (b) iniciadores de hélice dupla depois da elongação e depois de enrolamento do segundo elemento de um par de iniciadores (c) depois da elongação do segundo elemento de um par de iniciadores com a hélice não invasiva deslocada.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção tem por objecto um processo de Amplificação de Polimerase-Recombinase (APR) — um processo para a amplificação dos polimeros-alvo de ácidos nucleicos. Um dos benefícios da APR consiste no facto de poder ser realizada sem necessidade de. fusão térmica das suas matrizes de hélice dupla, sendo também eliminada a necessidade de equipamento de termociclagem que é caro. Também tem por objecto duas estratégias por meio das quais se pode confi-gurar APR para permitir a amplificação exponencial dos polimeros-alvo de ácidos nucleicos. 10

Amplificação de polimerase-recombinase da hélice líder (APRhd)

Na amplificação da hélice lider de polimerase-recombinase (APRhd) de hélice simples ou de hélice parcialmente simples, os iniciadores de ácidos nucleicos sãò direccionados para sequências homólogas de hélice duplas ou parcialmente dupla utilizando agentes de recombinase, que formarão estruturas de anel D. Os iniciadores de hélice sim-ples que invadem, que fazem parte dos anéis D, são utilizados para iniciar as reacções de síntese de polimerase. Uma espécie de iniciador simples irá amplificar uma sequência-alvo de ácidos mucleicos através de, vários cicios de invasão da hélice dupla seguida de síntese. Se se utilizam dois iniciadores em oposição, a amplificação de um fragmento - a sequência-alvo pode ser conseguida. APRhd está descrito resumidamente nas figuras 1 e 2. A sequência-alvo a ser ampliada, é qualquer uma das dos processos da presente invenção, é preferencialmente um ADN de hélice dupla. Contudo, os processos da presente invenção não se limitam ao ADN de hélice dupla porque outras moléculas de ácidos nucleicos', tal como ADN ou ARN de hélice simples podem ser transformadas en ADN de cadeia dupla, por um especialista nas técnicas utilizando processos conhecidos. 0 ADN-alvo de hélice dupla apropriado póde se rum AND genómico ou um ADNc. Uma APR da presente invenção pode amplificar um ácido nucleico-alvo pelo menos 10 vezes, preferencialmente pelo menos 100 vezes, mais preferencialmente pelo menos 1.000 vezes, even more preferencialmente at least 10.000 vezes, e o mais preferencialmente pelo menos 1.000.000 vezes. 11 A sequência-alvo é ampliada com a ajuda de agentes de recombinase. Um agente de recombinase é uma enzyme que pode revestir o ADN de hélice simples (ADNhs) para formar filamentos, que podem então rastrear ADN de hélice dupla (ADNhd') para regiões com homologia das sequências. Quando se localizam sequências homólogas, a hélice do filamento de nucleoproteina (compreendendo o agente de recombinase) invade o ADNhd criando um híbrido curto e uma bolha de filamentos deslocados conhecida como anel D. Os agentes de recombinase apropriados incluem a proteína RecA de E. coli ou qualquer proteína homóloga ou qualquer complexo dê proteína de qualquer grupo. Estes homólogos de RecA são geralmente designados por Rad51 de acordo com o primeiro elemento deste grupo a ser identificado. Outros agentes de recombinase podem ser utilizados no lugar de RecA, por exemplo como RecT ou RecO. Os agentes de recombinase geralmente requerem a presença de ATP, ATPyS, ou outros trifosfatos de nucleósidos e os seus análogos. Prefere-se que os agentes de recombinase sejam utilizados num ambiente readcional em que a regeneração dos sítios-alvo podem ocorrer logo a seguir de um ciclo de síntese estimulada pelo anel D. Isto evitará a paragem da amplificação ou uma amplificação linear ineficiente do ADNhs causada pela oscilação da síntese de um único lado de uma extremidade para a outra.

Naturalmente, quaisquer derivados e análogos funcionais do agente de recombinase podem também funcionar por si próprios como agentes de recombinase e estão contemplados como enquadramentos da presente invenção. Por exemplo, pode-se utilizar um pequeno péptido de recA que tem mostrado que retém alguns aspectos das propriedades de recombinação de recA. Este péptido compreende os, resíduos 193 a 212 de E. coli recA e pode mediar o emparelhamento de 12 oligoshs (Oleg N. Voloshin, Lijang Wang, R. Daniel Camerini-Otero, Homologous ADN pairing Promoted by a 20-amino Acid Peptid Derived from RecA. Science Vol.272 10 Maio 1996).

Dado que a utilização de ATPyS resulta na formação de complexos de complexos estáveis de agente de recombinase-/ADNhd que são provavelmente ^incompatíveis com uma amplificação eficiente, é preferível utilizar ΑΓΡ e enzimas auxiliares para carregar e manter os complexos de iniciadores de agente de recombinase/ADNhd. Alternativamente, as limi-tações da utilização de ATPyS podem ser ultrapassadas pela utilização de componentes reaccionais adicionais capazes de cortar. a ligação de recA a ATPyS a partir de complexos de permuta. Este papel pode ser desempenhado por helicases tal como ò complexo de RuvA/RuvB.

As expressões 'polímero de ácido nucleico1 ou 'ácidos nucleicos' tal como se utilizam na presente descrição podem ser amplamente interpretadas e incluem ADN e ARN assim como outras moléculas de hibridação semelhantes a ácidos nucleicos tal como as que têm estruturas substituídas, por exemplo, ácidos nucleicos de péptidos (ANPs), ácidos nucleicos que estruturam morfolino ou bases modificadas e açúcares.

Num enquadramento preferido, a APR realiza-se com várias enzimas auxiliares que podem promover uma dissociação eficiente de complexos de agente de recom-.binase/ADNhd depois do início da síntese do ADN. Estas enzimas auxiliares incluem as que são capzes de estimular a dissociação de 3' .para 5' e as capazes de suportar a dissociação de 5' para 3'. 13

As enzimas auxiliares incluem várias polimerases que podem deslocar RecA na direcção de 3' para 5' e podem estimular a dissociação de 3' para 5' dos complexos de agente de recombinase/ADNhd (Pham et al., 2001). Estas polimerases de ADN incluem PolV de E. coli e polimerase homóloga de outras espécies. Normalmente na vida da E. coli, o deslocamento de RecA na direcção de 3T para 5" ocorre como parte da sintese de SOS-lesão-atingída em combinação com LHS, antigénio nuclear de proliferação celular e polimerase de ADN. A polimerase essencial para esta actividade na E coli é PolV, um membro da super-família recentemtente descoberta de polimerases incluindo UmuC, DinB, Rad30 e Revi, cuja função in vivo é- copiar matrizes de lesões de ADN. Crítica para APR, a -dissociação in vitro de 3’ para 5' dos filamentos de RecA não pode ser catalisada apenas por Poli, PoIIII or PolIIV. Apebas PolV, em conjunto com LHS, tem actividade mensurável de dissociação de RecA/ADNhd de 3' parã 5', independente· de ATP. Com efeito, PolV empurra . e elimina RecA de ADN numa direcção de 3T para 5' para a frente da polimerase {Pham et al., 2001; Tang et al.., 2000). A inclusão de PolV ou de um seu homólogo funional pode melhorar a eficiência da amplificação.

Outras enzimas auxiliares incluem uma classe de enzimas designada por helicases que podem ser utilizadas para promover a dissociação de RecA de ADNhd. Isto promove a dissociação em ambas as direcções de 5' para 3' e de 3' para 5'. As helicases são componentes essenciais do processo de recombinação in vivo e funcionam para movi-, mentar os pontos de ramificação intermédios de um lugar para outro, para separar hélices 'e para dissociar e reciclar componentes ligados ao ADN. Depois de um primeiro ciclo de invasão/sínntese têm ocorrido na APR, "marcam-se" 14 dois novos duples de ADN pela presença da ligação de RecA em sitios cujos iniciadores devem ligar-se para outros cilcos de síntese. Nessa situação, o ADNhd tende a ocupar um sítio de elevada afinidade em RecA até ser activamente deslocado, quer por dissociação na direcção de 5' para 3T dependente de ATP, que pode ser limitativo, ou de 3' para 5' por algum outro processo activo. Um complexo ideal de helicase para estimular a dissociação de RecA dos produtos intermédios consiste nas proteínas RuvA e de E. colí. RuvB consiste em proteínas de.É, coli. 0 complexo de The RuvAB promove a migração dos ramos, e dissocia a proteína RecA, permitindo que RecA seja reciclada (Adams et al., 1994). Normalmente, o complexo de RuvAB é dirigido para produtos ' intermédios de recombinação, particu-larmente estruturas Holliday semelhantes a juntas. Tal como ele funciona o complexo de RuvAB rodeia o ADN e forcça RecA do ADN numa trans-localização conduzida pelo .ATP (Cromie e Leach, 2000; Eggleston e West, 2000). Esta activídad de dissociação de RecA tem sido demonstrada utilizando ADNhd enrolado com RecA,'que nem sequer tem as juntas de Holliday (Adams et al, .PNAS 1994). O complexo de RuvAB pode reconhecer estruturas ramificadas dentro do AND recobertas com RECA. A incorporação de RuvAB numa mistura de APR irá promover a dissociação de RecA de ADNhd seguido da permuta das hélices e deslocamento, permitindo a síntese renovada da matriz duplicada do mesmo sítio. ; Adicionalmente, o complexo de RuvAB pode actuar concertadamente com RuvC, que finalmente corta e resolve as juntas de Holliday.. Com RuvC adicionado à mistura reaccional de APR, formam-se estruturas complicadas, tal como as juntas de Holliday formadas nos sítios de invasão, podem ser resolvidas. A actividade da resolvase, tal como a fornecida por RuvC, é particularmente importante quando os oligonucleótidos-alvo são parcialmente de hélice dupla. Nessas situações a 15 migração inversa das ramificações pode gerar junções de Holliday, qu epodem então sere resolvidas pelo complexo RuvABC, para gerar produtos de amplificação separados de uma forma limpa.

Ainda outras enzimas auxiliares incluem a proteína RecG de E. coli. RecG pode estimular a dissociação das estruras ramificadas. In vivo esta proteína funciona para os garfos de replicação inversa nos sítios do ADN danificado por libertação tanto das hélicees- líders como das retardadas dirigindo para trás o garfo de replicação para gerar uma junção de 4 vias (Cox et al., 2000; Dillingham e Kowalczykowski, 2001; Singleton et al., 2001). In vivo essas junções funcionam como substratos para a ligação da hélice para permitir o bypass de lesões. RecG in vitro vai ligar-se aos anéis em D, e vai levar a um decréscimo das estruturas em anel D por meio da migração inversa. A RécG prefere uma junção com elementos de hélice dupla de cada lado, e. por isso o ideal serão oligonucleótidos-alvo parcialmente com hélice dupla, homólogo do sítio-alvo tanto nas regiões de hélice simples como nas de, hélice dupla. Isto irá estimular, a migração inversa das ramificações e a formação de uma junção de Holliday, que pode ser resolvida pelo complexo de RuvABC. RecG. e , RuvAB in vivo podem competir para originar diferentes possibilidades de recombinação dado' que a migração das ramificações será feita em ambas as direcções (McGlynn e Lloyd, 1999;. McGlynn et al., 2000). Em ambos os casos as proteínas atingem o ADN da junção revestido com RecA, e dissociam-no de uma forma activa.

Outras enzimas auxiliares úteis numa mistura reaccional de APR são as que permitem a geração contínua de filamentos da nucleoproteína RecA na presença de ATP e de 16 LHS. Para permitir a eliminação dô RecA nos momentos apropriados, é preferível utilizar ATP em vez de ATPyS numa reacção de APR. Infelizmente os filamentos de RecA/ADNhs formados com ATP despolimerizam espontaneamente na direcção de 5' para 3' e na presença de LHS, conforme é exigido aqui, a repolimerizaçâo não ocorrerá em taxas significativas. A solução para estes problema é a utilização das proteínas.RecO, RecR e possivelmente RecF. Na presença de LHS e de ATP, os filamentos de RecA/ADNhs disso.ciam-se (Bork et al., 2001; Webb et al., 1995; Webb et al, 1997; Webb et al., 1999). Se RecA/ADNhs for incubada na presença das proteínas RecO e RecR esta dissociação não ocorre. Na verdade, a proteína RecR proteína permanece associada ao filamento e astabiliza a estrutura indefinidamente. Mesmo se o ADNhs estiver ligado por LHS, na presença de RecR e RecO, os. filamenos de RecA podem voltar a unir-se deslocando LHS. Assim é possível obviar a utilização de ATPyS, se necessário, utilizando ATP pa presença de RecO e RecA para manter a integridade do filamento de RecA/ADNhs. A proteína RecF interage com o sistema de RecO e de RecR numa forma aprentemente, oposta. RecF compete com RecR tendendo a provocar a dissociação do filamento in vitro. É provável que os três componentes in vivo funcionem, em conjunto para controlar a geração de estruturas invasoras, ao mesmo tempo que limita a extensão do revestimento de ADN hs com RecA. Num outro enquadramento preferido, RecF está incluída nas reacções de APR numa Concentração apropriada para recapitular a dinâmica dos processos in vivo. Além disso, RecF pode facilitar a dissociação dos produtos intermédios revestidos com RecA depois da invasão ter ocorrido.

Tal como descrito, a utilização de ATP em vez de ATPyS, e/ou a utilização de polimerases e de helicases de 17 deslo-camento (por exemplo, o complexo de RuvA/RuvB), RecO, RecR e RecF devem permitir a amplificação exponencial de ADN de hélice dupla conduzindo uma regenaeração continua dos sítios-alvo. Este processo, contudo, permanece reactivo às diferen-ças na taxa de iniciação que pode ocorrer nos dois sitios-alvo opostos. Essas diferenças podem levar a uma diminuição da eficiência da amplificação e à produção de ADN de hélice supla. 0 processo de RCP evita fortemente estas complicações porque o ciclo da temperatura leva à síntese coordenada de cada lado. Noutro enquadramento, uma situação análoga à condição da RCP cacabada de descrever pode ser induzida utilizando mutantes sensíveis à temperatura (st) de RecA que não funcionam a 42 °C, mas funcionam a temperaturas mais baixas no intervalo de 25 a 37 °C (Alexseyev et al. , 1996; Hickson et al., 1981). Neste caso, a síntese de cada extremí-dade pode ser. sincronizada por meio de um abaixamento perió-dico para uma temperatura permissiva e subindo depois a temperatura da reacção para uma temperatura não permissiva para a função da proteína RecA do mutante, mas permissiva para os outros componentes. Realizando a APR com mutantes de RecAst em combinação com a ciclização das temperaturas de reacção, o número de moléculas de ADN produzidas pode ser controlado. Embora isto requeira algum mecanismo para providenciar a ciclização da temperatura, as temperaturas são bem abaixo das necessárias quando se utilizam proteínas derivadas de termófilos. Na verdade, um dispositivo simples de ciclização da temperatura, de baixa energia portátel à base de química pode ser suficiente para controlar esses ciclos de reacção. A APR, assim como todos os outros processos de amplificação de ácidos nucleicos conhecidos até hoje, utilizam polimerases para gerar cópias de moléculas matrizes de 18 ácidos nucleicos. Constitui uma necessidade da maior parte das polimerases de ácidos nucleicos que a incorporation requer uma parte de hidroxilo livre em 3' no açúcar de uma elongação curta do ácido nucleico de hélice dupla adjacente ao sitio da nova síntese. Esta elongação do ácido nucleico de hélice dupla é normalmente formada numa matriz por uma sequência complementar curta, chamada de iniciador, que serve como um sítio de iniciação para a reacção de síntese de polimerase. Nalguns casos, uma modificação de 3', tal como um sulfidrilo, pose ser utilizada para iniciar a reacção de·síntese. 0 ácido nucleico iniciador, cujas bases estão empa-relhadas com a matriz e elongadas pela polimerase,. pode ser o ARN ou o ADN. Na replicação do ADN. genómíco in vivo, as sequências do iniciador de ARN são sintetizadas de novo no ADN matriz por meio da enzimas primase. Normalmente, para as reacções in vitro o iniciador é fornecido sob a forma de um AND de hélice simples, curto, muitas vezes quimicamente sintetizado (ou ADN ou ARN modificado) e, é normalmente referido como um iniciador de oligonucleótidos. 0 iniciador é muitas vezes' de uma sequência específica, embora também se possam utilizar iniciadores aleatórios. 0 iniciador é dirigido para as sequências complementares em virtude da sua capacidade específica para o emparelhamento dos pares de bases. A formação de híbridos entre o iniciador de oligonucleótidos e o ácido nucleico-alvo acontece normalmente por incubação dos -dois em solução em condições de sal, pH e temperatura que permitam um enovelamente espontâneo.

No caso da RCP o iniciador de oligonucleótidos está normalmente num grande excesso por duas razões principais. Primeiro, a elevada concentração vai conduzir rapidamente à hibridação. Em segundo lugar, dado que a reacção prossegue através de ciclos de fusão, hibridação e extensão o inici- 19 ador é consumido e torna-se limitativo. Os ácidos nucleicos atingidos pela RCP são muitas vezes inicialmente de hélice dupla no seu carácter e, se não forem, tornam-se em hélice dupla no seguimento do primeiro ciclo de síntese. Essas moléculas de hélice dupla não podem hibridar novos oligonucleótidos em condições de temperatura e de dissolvente apropriadas para a actividade catalítica e a estabilidade da maior parte das proteínas procarióticas e eucarióticas. Consequentemente, para permitir ciclos de amplificação, a matriz original e as hélices recentemente sintetizadas podem ser primeiro separadas antes da hibridação ocorrer mais uma vez. Na prática, isto consegue-se por fusão térmica. Para a RCP, são necessárias temperaturas de pelo menos 8 0e C para a fusão térmica da maior parte das moléculas de ácidos mucieicos de hélice dupla de comprimentos maiores do que 100 pares de bases. Na maior parte dos protocolos de RCP aplica-se uma temperatura de 90 a 100 °C para fundir o ADN. Essas temperaturas permitem usar apenas raras enzimas termo-estáveis. Estas polimerases derivam normalmente de proca-riotos termofílicos. A vantagem da APR reside no factò de permitir a formação de elongações curtas de ácidos nucleicos de hélice dupla que comportam um grupo 3'-OH livre para a extensão das matrizes de hélice dupla sem fusão térmica.- Isto consegue-se utilizando a proteína RecA de E. coli (ou uma RecA rela-cionada de outra fileira). Na presença de ATP, dATP, ddATP, UTP, ΑΤΡγΕ e possivelmente de outros tipos de trifosfatos de nucleósido e dos seus análogos, RecA irá formar um filamento de nucleoproteína à volta de um ADN de hélice simples. Este filamento irá rastrear ADN de hélice dupla. Quando as sequências homólogas são localizadas RecA irá catalisar uma reacção de invasão da hélice e de empa- 20 relhamento dos oligonucleótidos com a hélice homóloga do ADN alvo. A hélice de emparelhamento original é deslocada pela invasão da hélice deixando uma bolha de ÀDN de hélice simples na região. A proteína RecA pode ser obtida a partir de fontes comerciais. Alternaticamente pode-se purificar de acordo com protocolos normalizados, por exemplo (Cox et al.,1981; Kuramitsu et al., 1981}. Os homólogos de RecA tinham sido purificados a partir de organismos termofílicos incluindo Thermococcus kodakaraensls (Rashid et al., 2001), Thermotoga marítima (Wetmur et al., 1994), Aquifex pyrophilus (Wetmur et al., 1994), Pyrococcus furíosus (Komori et al., 2000), Thermus aquaticus (Wetmur et al., 1994), Pyrobaculum islandicum (Spies et al., 2000), e Thermos fhermophilus (Kato e Kuramitsu, 1993). RecA também foi purificada a partir de outros procariotos, por exemplo, Salmonella typhimurium (Pierre e Paoletti, 1983), Bacíllus subtilis (Lovett e Roberts, 1985), Streptococcus pneumonia e (Steffen e Bryânt, 2000), Bacteroides fragills (Goodman et al., 1987), Proteus. mirabills (West et. al., 1983), Rhizobium meliloti (Better e Helinski, 1983), Pseudomonas aeruginosa (Kurumizaka et al., 1994),. a partir de eucariotos por exemplo Saccharomyces cerevislae (Heyer e Kolodner, 1989), Ustilago maydis (Bennett e Holleman, 2001}, includindo vertebrados por exemplo Rad51 humano (Baumann et al. , 1997) e Xenopus laevis (Maeshima et al., 1996), assim como planats incluindo bróculos (Tissier et al., 1995).

Para clarificar a descrição, o processo de amplificação de polimerase-recombinase de hélice líder (APRhd) pode ser dividida em quatro fases. 21 1) Orientação da sequência

Inicia-se APR orientando as sequências utilizando oligonucleótidos sintéticos revestidos com RecA ou um homólogo funional. Para permitir a amplificação exponencial poderão utilizar-se dois desses oligonucleótidos sintéticos de uma forma tal que as suas extremidades livres 3'são orientadas uma para a outra. Os filamentos de nucleoproteina compreendem estes oligonucleótidos e a proteína RecA irão Identificar alvos num ADN complexo rapidamente e especi-ficamente. Uma vez atingida, a proteína RecA catalisa a permuta de hélices de tal modo- que se formam as estruturas em anel D. Pode ser necessário utilizar ATP em vez de ATPyS num processo para uma amplificação eficiente. Se se utilizar ATP, Reef, RecR, e/ou RecF, as moléculas provam que são essenciais para uma amplificação eficiente.

2) Iniciação da síntese de ADN

As polimerases de ADN irão detectar e ligar-se ao híbri-do entre os oligonucleótidos que invadem e o ADN da matriz e inicia a síntese do ADN a partir de 3'-hidroxilo livre exposto no híbrido. A exposição deste 3'-hidroxilo, e a subsequente síntese de ADN, provavelmente irão exigir a dissociação da proteína RecA do híbrido .de hélice dupla formado pela permuta de hélices. Para atingir esta dissociação será provavelmente necessário para utilizar ATP, que pode suportar a dissociação espontânea de RecA a partir de complexos de invasão. Adicionalmente a dissociação pode ser estimulada/potenciada pela utilização de outras proteínas contidas dentro da mistura reaccional tal como RuvA, RuvB, RuvC, RecG, outras helicases, ou outros componentes estimu- 22 ladores, que podem actuar para cortar a RecA do produto de permuta da hélice. 3) Síntese do ADN de deslocamento da hélice e separação de replição.

Tal como as polimerases de ADN sintetizam as cópias complementares dos ADNs matrizes utilizando os 3'-hidroxilos livres dos oligonucleótidos invasores, ou os seus produtos parcialmente elongados, as polimerases deslocam os ADNs de hélice simples, que podem ser revestidos com proteínas de ligação de hélice simples (LHS) incluídas na reacção. Numa configuração ideal, a invasão dos oligonucleótidos nas duas extremidades da sequência-alvo de ácidos nucleicos irá ocorrer em momentos semelhantes, de tal modo que as duas polimerases no mesmo ácido nucleico da matriz irão progredir inicalmente em direcção uma da outra. Quando estes complexos elongados se encontram um com o outro, a matriz original deve simplesmente desaparecer e as polimerases continuarão a síntese sem necessidade do deslocamento da hélice, copiando então a matriz de ADNhs ligada à LHS. Em virtude dos obstá-culos estéricos, as polimerases podem dissociar-se tempo-rariamente da matriz quando as polimerases se encontram,; para permitir a separação, das duas hélices da matriz 4) Finalização da síntese e da re-invasão.

Uma vez separadas as hélices da matriz, as polimerases podem completar a extensão até à extremidade da matriz (ou colocar a sequência actuando como o segundo sítio-alvo em frente, se a matriz- inicial for mais comprida do que o produto desejado). Para permitir a amplificação 23 expolnencial, é necessário que os novos produtos sejam atingidos e replicados de uma maneira semelhante à das matrizes originais, isto é a partir das duas extremidades-alvo. 0 sítio-alvo recentemente sintetizado estará livremente disponível para atingir os filamentos de RecA/oli-gonucleótidos. 0 sítio inicialmente utilizado para iniciar a síntese também deve ter sido libertado em consequência da utilização de condições na reaçção- que .favorecem a dissociação de RecA a partir dos produtos de permuta de hélices. Desde que ocorra a, re-invasão neste último sítio em menos tempo. do que a polimerase leva a sintetizar o segundo sítio-alvo, seja iniciada nesse segundo sítio, e volte ao primeiro sítio, então o ADN de hélice simples não será o' produto primário e irá ocorrer a amplificação exponencial. 0 facto de haver complexos sintéticos múltiplos operando na mesma matriz aumenta a possibilidade de. se conseguirem tempos de amplificação muito curtos.

Amplificação de polimerase-recombinase (APR) utilizando a síntese simultânea da hélice líder.e da retardada

Na actual descrição de APRhd (APR da. hélice líder) os requerentes detalham um sistema de componentes múltiplos com a capacidade para regenerar as sequências-alvo permitindo assim a amplificação exponencial de ADN de hélice dupla. Ao contrário do processo de Zarling, a APRhd evita a produção linear de ADN dè hélice dupla. Não há outra abordagem para resolver este problema que evita completamente a possibilidade de produtos de hélice simples e um requisito para a iniciação simultânea das extremidades. Este processo envolve necessariamente uma mistura reaccional mais complexa. Apesar disso todos os componentes requeridos são hoje bem compreendidos e devem ser recepti-vos para a junção num sistema único. Este sistema irá 24 recapitular eventos que ocorrem durante o ciclo normal de replicagão das células para permitir a sintese acoplada das hélices avançada e retardada.. Este processo, APR de hélice avançada e atrasada está descrito resumidamente nas figuras 1 e 3.

Durante a replicação normal in vivo, o ADN de hélice dupla é separado simultaneamente em 2 hélices e ambas são copiadas para originarem 2 novas moléculas de ADN de hélice dupla por meio dè umâ máquina de replicação. Esta 'máquina1.acumula a .síntese convencional da hélice avançada de 5' a 3' com a sintese da hélice atrasada, em que se sintetizam iniciadores curtos de ARN nos ácidos nucleicos da matriz por meio de enzimas primase. Durante a síntese da hélice atrasada, produzem-se fragmentos curtos de, chamados fragmentos Okazaki, que se ligam em conjunto para formar hélices atrasadas contíguas. Esta síntese simultânea de hélice avançada/hélíce atrasada é responsável pela. duplicação de todo o genoma dos organismos semelhantes aos. procarióticos e eucarióticos. Os componentes essenciais deste sistema já .foram identiifcados é caracterizados· bioquimicamente. Os componentes podem ser reunidos in vitro para se conseguir uma amplificação mais eficiente do que a possível quando se utiliza apenas a síntese da hélice líder.

Os componentes essenciais dá "máquina' de replicação estão muito bem caracterizados para a E. coli. Esta máquina compreende a holoenzima PolIII (Glover e McHenry, 2001; Kelman e 0'Donnell, 1995) e o primossoma (Benkovic et al., 2001; Marian, 1999). A holoenzima PolIII é constituída por dez componentes de polipéptido. Cada holoenzima contém duas estruturas nucleares orientadas assimetricamènte, cada uma delas consistindo numa polimerase (sub-unidade a) e dois- 25 componentes nucleares adicionais da sub-unidade z, que possui a actividade da exonuclease 3' a 5', e a sub-unidade Θ. Para além do complexo do núcleo, um outro conjunto de polipéptidos providencia a holoenzima com processividade e acopla a síntese da hélice avançada e da retardada. O "antigénio nuclear de proliferação celular" dímero β envolve o ADN da matriz fixando o complexo à com uma afinidade extremamente eivada. 0 antigénio nuclear de proliferação celular carrgado no ADN por meio do euipamento de carregamento de grampos de ADNX compreende as sub-unidades de polipéptido Χ2ΥΥδδΨΨΧ.

Para clarificar a descrição, o processo de APR pode ser dividido em quatro fases. Na realidade todas as fases irão ocorrer simultaneamente numa reacção única. 1) Orientação da sequência A APR inicia-se pelas sequências-alvo utilizando oligo-nucleótidos sintéticos revestidos com RecA, ou um homólogo funcional. Esses filamentos de nucleoproteína irão rapida-mente: e especificamente identificar alvos no ADN do complexo ADN. Uma vez orientada, a proteína RecA catalisa a permuta de hélices de tal modo que se forma uma estrutura em anel D. Pode ser necessário utilizar ATP em vez de ATPyS no processo, para uma amplificação eficiente. As sínteses de ligação da hélice líder e da hélice tardia contudo podem obviar a necessidade de um corte muitp rápido de RecA.após o início da síntese. Se se utilizar ATP, as moléculas de RecO, RecR, e RecF podem demonstrar ser essenciais para uma amplificação eficiente. 26 2) Junção do primossoma

Os primossomas podem unir-se aos anéis D. Normãlménte, as estruturas do anel D são formadas por RecA como parte do mecanismo para recuperar in vivo o ADN danificado, ou durante outras formas de recombinação. A finalidade da acção combinada da permuta de hélices mediada por RecA e a junção de primossoma consiste em gerar uma forquilha de replicação. Uma forquilha de replicação é a estrutura de nucleoproteína que compreende as hélices separadas do ADN da matriz e o replisoma. 0 replisoma consiste no complexo de jolòenzima-polimerase e outros componentes necessários para replicar simultâneamente tanto ambas as hélices do ADN da matriz. Os primossomas providenciam tanto a libertação do ADN como as funções de iniciação, dos fragmentos de Okazaki requeridos para a. progressão da forquilha de replicação. A junção. do primossoma tem sidó estudada intensivamente através de análises genéticas e bioquímicas na E. colí. 0 conjunto mínimo de polipépt.idos necessário para. este processo é bem conhecido e existe como componentes purificados. As proteínas de junção do primossoma são PriA, PriB, PriC, ADNT, ADNC, ADNB e ADNG. Estas proteínas têm-se mostrado suficientes para unir um complexo de primossoma no ADN bacteríófago ΘΧ174 in vitro (Komberg e Baker, 1992; Marians, 1992). PriA liga-se ao sítio de ligação do primossoma (SLP) no cromossoma ΘΧ174. Depois PriB, ADNT, e PriC liga-se sequenaialmente ao complexo de PriA-ADN. PriB parece estabilizar PriA em SLP e facilita a ligação de ADNT (Liu et al., 1996)·. PriC é apenas parcialmente necessário para a reacção completa de junção. A omissão de PriC da reacção diminuirá a.iniciação de 3 a 4 vezes (Ng e Marians, 1996a; Ng e Marians, 1996b). 27 A função de PriC na bactéria é geneticamente redundante em relação a PriB. 0 ADNC carrega então ADNB no complexo de uma forma dependente de ATP. Este complexo de PriABC-ADNBT é capaz de deslocar consigo o cromossoma. A primase de ADNG pode interagir transientemente com o complexo para sintetizar os iniciadores de ARN.

Durante a replicação em E. coli, ADNB e ADNG funcionam como uma helicase e uma primase respectivamente. Estas duas componentrs são continuamente necessárias em associação com a holoenzima PolIII para sintetizar iniciadores para os fra-gmentos de Okazaki. Portanto, ADNB e ADNG são os componentes nucleares da primossoma móvel associado com a forquilha de replicação. Os. outros componentes do primossoma descritos· são essenciais para a junção do primossoma ao ADN, e para a associação de uma po lime rase. dimérica. As proteínas dé; junção do. primossoma são necessárias para o restabelecimento das. forquilhas de replicação em produtos intermédios de recom-binação formados por RecA e permuta de hélices. PriA pode iniciar a junção de um replisoma, competente para a síntese de ADN, em produtos intermédios de recombinação. É possível atingir os anéis D in vitro com uma mistura de PriA, PriB e ADNT, que são então competentes para incorporar ADNB e ADNC. Uma vez formado o primossoma no anel D, tudo o que falta para iniciar a replicação é para carregar um complexo de holoenzima no sítio. '

3) Junção da forquilha e a iniciação da síntese de ADN

As forquilhas de replicação vai unir-se no sítio de junção do primossoma. A presença de uma extremidade 3' livre na· hélice invasora do anel D estimula o complexo carregador do grampo de ADNX detalhado antes para juntar um 28 dimero β neste sitio para actuar como um antigénio nuclear de proliferação celular. Junta-se a holoenzima e as 2 unidades em conjunto ' por meio da sub-unidade τ da estrutura. A sub-unidade τ também tem superfícies de interacção para o dimero β, para o factor de carga, e para a componente de helicase do ADNB da primossoma. Estas interacções múltiplas são necessá-rias para coordenar ã síntese tanto da hélice líder como a hélice tardia utilizando os 2 complexos da polimera.se nu-clear associadas assimetricamente. A primase primossómica, ADNG, sintetiza um iniciador curto de ARN na matriz de ADN da hélice tardia. Na presença da holoenzima, o factor de carga reconhece o duplex de ARN/ADN e carrega um segundo gancho do dimero β neste sítio. A presença de um primossoma activo e a interacção da sub-unidade com ADNB são críticos para assegurar a síntese simultânea da hélice líder/hélice tardia.' Sem esta interacção a polimerase vai mover-se para for a do sítio do primossoma sem acoplamento.

Depois junta-se a forquilha de replicação. A síntese tanto da hélice líder como da hélice tardia vão .agora então ocorrer simultâneamente, e a helicase de ADNB irá' separar a matriz e as hélices da frente próximas da holoenzima.' 0 núcleo da holoenzima da hélice tardia vai gerar fragmentos de Okazaki de 1 a 2 quilobases de comprimento. Quando a polimerase de hélice tardia encontra o· anterior iniciador de ARN, dissocia-se do gancho 3 e a síntese inicia-se a partir de um- gancho recententemente associado carregado na vizinhança., da. frente da hélice líder. 0 mesmo núcleo da holoenzima da hélice tardia vai. ser usado novamente dado que está fisicamente .ligado ao núcleo da héliçe líder. 29 Há uma interacção dinâmica entre os ganchos do dímero β, as sub-unidades do núcleo e os carregadores dos ganchos. As suas afinidades podem ligar-se consoante as circunstâncias físicas. 0 dímero β que tinha sido 'abandonado' na extre-midade dos fragmentos de Okazaki podem ser reciclados por via de uma eliminação activa pelos carregadores do gancho, ou um excesso de 8 sub-unidades que podem estar presentes.

Os iniciadores de ARN na extremidade dos. fragmentos de Okazaki são eliminados pela actividade da exonuclease de 5' a 3' da polimerase 1' de ADN. A ligase de ADN junta-se então aos fragmentos de Okazaki formando em conjunto uma hélice tardia contínua. 4) Encontro da forquilha e finalização

Na APR, a replicação inicia-se em dois sítios distantes e as forquilhas de replicação orientam-se uma,em frente da outra. As forquilhas de replicação convergem as duas hélices da matriz original e vão dissociar-se uma da outra à medida que se tornam ambas completamente separadas tanto atrás como à frente de cada forquilha. 0 núcleo da hélice líder de cada forquilha completará assim a síntese, os iniciadores, de ARN remanescentes irão ser tratados e os produtos finais serão duas moléculas de hélice dupla. É razoável esperar amplificar os ADN's numa ordem de várias Megabases (Mb) por meio desta abordagem. Nesta descrição, megabase também engloba mega pares de bases. Com base na taxa sintética conhecida da holoenzima de PólIII pode-se esperar que as forquilhas de replicação prossigam a uma taxa de aproximadamente 1 Mb / 1000 segundos, isto. é, aproximadamente 15 a 20 minutos por ciclo para um fragmento de 1 Mb. 30 A consideração final é o mecanismo pelo qual se conse-gue uma amplificação exponencial rápida de ADN. A chave para este processo será permitir a reinvasão eficiente dos sitios de .alvejamento pela utilização de misturas de helicases, resolvases e as proteínas RecO, RecR, e RecF. Em condições apropriadas, serão possíveis a re-invasão e a associação do primossoma pouco depois de uma holoenzima se ter movido para fora do sítio de associação à forquilha. As invasões contí-nuas devem estar presentes sem problemas dado que o ADN se tornará simplesmente ramificado em muitos pontos. Cada ramo ir-se-á resolvendo naturalmente à medida que encontra' a próxima forquilha. Nestas condições pode ser possível conseguir uma enorme amplificação em períodos semelhantes ao' tempo, levado para replicar o ADN apenas uma vez. Contudo, pode ser crítico limitar as concentrações dos oligoriucleótidos-alvo pará evitar a depleção do nucleótido antes da síntese estar completa.

Para além do complexo de holoenzima, a máquina de replicaçâo utiliza outro complexo conhecido como o primossoma, que sintetiza a hélice tardia e move a forquilha de replicaçâo para a frente. 0 complexo de primossoma com-preende uma helicase codificada pelo ADNB e uma primase codificada pelo ADNG. Finalmente, para além das proteínas da holoenzima e do primossoma, a replicaçâo requer a actividade da proteína de ligação do ADN de ligação simples (LHS), da polimerase I do ADN de E.coli e a ligase de ADN. Estas duas últimas duas componentes são necessários para processar os fragmentos de Okazaki. 31 APR aninhada (nested):

Noutro enquadramento, a amplificação APR pode ser realizada num processo referido a partir daqui como "APR aninhada."

Uma dificuldade na detecção de uma sequência rara é que há uma elevada taxa de sequências não-alvo em relação às sequências alvo. A capacidade de uma APR para discriminar entre ADN alvo e não-alvo e amplificar apenas as sequências alvo é um aspecto chave da melhoria da sensibilidade. A discriminação entre a sequência não-alvo e alvo é uma reflexão da especificidade dos iniciadores e das condições da reacção.. Quanto mais especifica for a reacção, maior é a quantidade relativa da sequência-alvo especifica que é produzida e é mais fácil' de detectar o produto. Um aumento da especificidade pode, por isso, também aumentar a sensi-bilidade, A necessidade de aumentar a sensibilidade e a especificidade pode ser conseguida utilizando APR aninhada. A APR aninhada envolve uma primeira APR de uma primeira região de ADN. Depois dilui-se a mistura reaccional, por exemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 75, ou 100 vezes ou mais para reduzir a concentração do primeiro par de iniciadores e introduz-se um segundo par de iniciadores na mistura reaccional e repete-se a APR. De acordo com um enquadramento, o segundo par de iniciadores é produzido para ser interno em relação ao primeiro par de inicadores para amplificar uma sub-sequência do. primeiro produto da APR. O processo aumenta a amplificação especifica, isto é, reduz os produtos de amplificação inici-ais não específicos e por isso aumenta a sensibilidade. Esses produtos de amplificação não específicos, embora apareçam em virtude de uma homologia 32 parcial fortuita com os iniciadores de flanqueio, é improvável que tenham também homologia suficiente com os iniciadores aninhados para continuar a amplificar. A detecção e a especificidade da APR podem ainda ser melhoradas pela marcação de um ou de ambos do segundo par de iniciadores de tal modo que apenas se detectam os iniciadores ampliados com um ou com ambos do segundo par de iniciadores. A APR aninhada não se limita à utilização dos dois conjuntos de iniciadores. Naturalmente, podem usar-se mais conjuntos de iniciadores para aumentar a especificidade ou a sensibilidade. Assim, pode-se utilizar três, quatro ou cinco, pares de iniciadores. Além disso, os diferentes conjuntos de iniciadores, num outro enquadramento, podem partilhar iniciadores comuns conforme ilustrado na figura 4.

Na figura 4, os conjuntos de iniciadores são preparados para serem utilizados sequencialmente. Por exemplo, realiza-se uma primeira APR com o conjunto 1 de iniciadores, uma segunda APR utilizando o produto ampliado da primeira APR é realizada com o conjunto de iniciadores 2, uma terceira APR utilizando o produto ampliado da segunda APR realiza-se com um conjunto de iniciadores 3, realiza-se uma quarta APR utilizando a sequência ampliada da terceira APR com um conjunto de iniciadores 4, e finalmente, realiza-se uma quinta APR utilizando o produto ampliado da quarta APR que se realiza com om conjunto de iniciadores 5. Neste caso, os .conjuntos de iniciadores 1, 2, e 3, partilham um iniciador comum - iniciador (a) . Os iniciadores 3, 4, e 5 partilham um iniciador comum - iniciador {b). 33 A APR aninhada pode ser realizada utilizando qualquer um dos dois processos de APR descritos assim como uma combinação dos dois processos em qualquer ordem particular. Isto é, a APR pode ser realizada apenas pela APR da hélice lider, apenas pela APR da hélice líder e da hélice tardia ou uma combinação da APR da hélice líder e a APR da hélice líder e da hélice tardia em qualuer ordem em particular.

Um benefício de qualquer um dos processos de APR descritos é a dimensão do produto ampliado. Embora os actuais processos de amplificação tal como RCP estejam limitados a um limite superior de cerca de 10 Kb, os processos de APR são capazes de amplificar regiões de ácidos nucleicos até centenas de.megabases. Para a APR de hélice líder/tardia, as dimensões de uma sequência alvo a ser ampliada pode ser de centenas de megabases, tais como, por exemplo, inferior a 500 megabases, menos do que 300 megabases, menos do que 100 megabases, menos do que 70 megabases, menos do que 50 megabases, menos do que 25 megabases, menos do que 10 megabases,. menos do que 5 megabases, menos do que 2 megabases, menos do que uma megabase, less than 500 kb, less than 200 kb, less than 100 kb, ménos do que 50 kb, menos do que 25 kb, ou menos, do que 10 kb, menos do que 5 kb, menos do que 2 kb, menos do que 1 kb. Para a APRhd, as dimensões de uma sequência-alvo podem estar no intervalo de megabases tal como, menos do que 5 megabase, menos do que 2 megabass, menos do que uma megabase, menos do que 500 kb, menos do que 200 kb, menos do que 100 kb, menos do que 50 kb, menos do que 25 kb, ou menos do,que 10 kb, menos do que 5 kb, menos do que 2 kb, menos do que 1 kb. 34

Selecção dos reagentes de APR e parâmetros da reacção

Os detalhes da APR da hélice líder, da APR da hélice lider e da tardia, e da APR aninhada foram listados antes. Esta secção vai descrever a selecção de reagentes e os parâmetros para qualquer um dos três processos discutidos antes.

Um beneficio da APR é que o produto ampliado da APR é um ADN de hélice dupla que pode ser utilizado para outros processos da biologia molecular. Assim, a APR pode ser combinada com outros processos na biologia molecular. Por exemplo, o material inicial, para a APR pode ser um fragmento ampliado de RCP. Alternaticamente, o produto de uma APR pode ser utilizado para a RCP.

Se necessário, os produtos da APR em qualquer um dos processos descritos pode ser purificado. Por exemplo, no processo da APR aninhada, o produto ampliado pode ser purificado depois de cada etapa de APR, etapa amterior ou etapa subsequente à etapa da APR. Os processos de purificação dos ácidos nucleicos. são conhecidos na técnica e incluirão, pelo menos a extracção em fenol,' a precipitação dos ácidos nucleicos (por exemplo, com sal e etanol), cromatografia em coluna (por exemplo, exclusão por dimensão, coluna iónica, coluna de afinidade e similares) ou qualquer combinação destas técnicas.

Tal como discutido, os iniciadores utilizados na APR po-dem ser "de hélice dupla" ou "capazes de formarem estruturas de hélice dupla." Estes termos referem-se às moléculas de ADN que existem numa condição de hélice dupla numa solução reaccional tal como uma solução reaccional de APR ou uma solução reaccional de RCP. A composição de uma 35 solução de RCP solução é conhecida. A composição de uma mistura reaccional de APR está listada nesta descrição detalhada, nesta secção e nos exemplos.

Os iniciadores podem ter uma região de hélice simples para a hibridação com o ADN-alvo na presença de um agente de recombinase. A região de hélice simples pode ser, por exemplo, cerca de 10 bases, cerca de 15 bases, cerca de 20 bases, cerca de 25 bases, cerca de 30 bases, cerca de 40 bases, e cerca de 50 bases. Mesmo para regiões mais longas tal como cerca de 75 bases, cerca de 100 bases, cerca de 150 base ou mais pode ser utilizada mas não é necessário. A escolha de regiões de hélice simples dependerá da complexidade do ácido nucleico inicial de tal modo que, por exemplo, um genoma humano pode requerer um iniciador mais longo enquanto um plasmido pode exigir um iniciador- muito mais curto.

As duas hélices do ácido nucleico num ADN de hélice dupla não necessitam de ser completarnente complementares. Por exemplo, a região de hélice dupla de um ADN de hélice dupla pode diferir até 1% na sequência. Isto é, a sequência de duas hélices de ácidos nucleicos pode diferir por uma base numa centena de bases e ainda existiria numa condição de hélice dupla na solução. Os ácidos nucleicos com uma diferença de 1 % na sua sequência complementar são contemplados como ADN de hélice dupla para os fins desta descrição.

Além disso, o ácido nucleico-alvo (isto é,' o ácido nucleico a ser ampliado por processos de APR descritos) podem ser parcialmente de hélice dupla e parcialmente de hélice simples. Por exemplo, o ácido nucleico em qualquer umas das configurações da figura 5 seria apropriado como um 36 ácido nucleico alvo da presente invenção. Tal como discutido, o ácido nucleico pode ser ARN. 0 ARN pode ser convertido com ADNc de hélice dupla utilizando processos conhecidos e o ADNc de hélice dupla pode ser utilizado como o ácido nucleico alvo. Tal como se mostra na Figura 5, a matriz de ácido nucleico pode ter qualquer combinação de extremidades seleccionadas da saliência 3', da saliência 5', ou das extremidades cegas. 0 processo da APRhd descrito compreende pelo menos as etapas seguintes. Primerior, faz-se contactar um agente de recombinase com dois iniciadores de ácidos nucleicos (referidos aqui como um primeiro e um segundo iniciador) para formar dois iniciadores de nucleoproteína (referidos aqui como um primeiro e um segundo iniciadores de nucleoproteína).

Em segundo lugar, faz-se contactar o primeiro e o segundo iniciadores de nucleoproteína com o ácido nucleico da matriz para formar uma estrutura de hélice dupla numa primeira porção da primeira hélice e uma segunda estrutura de hélice dupla numa segunda porção da segunda hélice. Os dois iniciadores são preparados de',, modo a que' quando hibridam, estão apontados um para o outro, conforme se ilustra na figura. 6A. Alternativamente., o iniciador 1 e o iniciador 2 podem hibridar diferentes ácidos nucleicos alvo .conforme ilustrado na figura 6B.

Em terceiro lugar, os iniciadores de nucleoproteína pro-longam-se nas suas extremidades 3' para gerar um primeiro e um segundo ácido nucleico de hélice dupla (figura 7A) . Quando os iniciadores estão hibridados com diferentes ácidos nu-cleicos alvos, a elongação dos iniciadores vai gerar hélices deslocadas (figura 733) . Neste 37 caso, as duas hélices deslocadas que resultam da elongação do iniciador podem hibridar e formar um novo ácido nucleico de matriz de hélice dupla (figura. 7C)-

As etapas dois e três repetem-se até se atingir o grau de amplificação desejado. 0 processo é um processo dinâmico pelo facto de se deixar prosseguir continuamente a hibridação do iniciador com ó ácido nucleico alvo e a elongação. Uma vantagem é que a amplificação se realiza continuamente sem a necessidade de uma ciclização da temperatura ou. a adição de enzima depois da iniciação da reacção.

Num enquadramento, repetem-se as etapas dois e três. pelo menos 5 vezes. Preferencialmente, repete-se pelo menos 10 vezes. Mais' préferencialmente, repete-se pelo menos 20 vezes, tal como pelo menos 30 vezes. Mais' preferencialmente, as duas etapas repetem-se pelo menos 50 vezes. Para repetições múltiplas da etapa de amplificação (por exemplo, etapas 2 e 3) uma APR da presente invenção começa preferencialmente com um iniciador com uma relação com o ácido nucleico alvo de pelo ' menos 100 para 1, .preferencialmente de pelo menos 300 para 1, e o que é mais preferível de pelo menos 1000 para 1. Isto é, há pelo menos 100, 300 ou 1000 cópias do iniciador por cópia de um ácido nucleico alvo. . Numa etapa opcional, depois de um ciclo suficiente de amplificação, podem juntar-se componentes adicionais à reacção depois de um período de tempo para melhora a eficiência global da amplificação. Num enquadramento, os componentes adicionais podem ser um ou mais dos seguintes: agentes de recoitibinase, um ou mais iniciadores, polimerase, 38 (discutidos numa e um ou mais dos agentes adicionais secção separada a seguir).

Num enquadramento preferido, utiliza-se uma pequena fracção de uma primeira reacção de APR como o fornecimento do ADN da matriz ADN para ciclos subsequentes de amplificação por ARP. Neste processo, realiza-se uma primeira ; reacção de amplificação APR num ácido nucleico alvo. Depois da primeira reacção de APR, utiliza-se uma pequena fracção de uma reacção total como um substituto.do ácido nucleico alvo para um ciclo subsequente de reacção APR. A fracção pode ser, por exemplo, inferior a cerca de 10 % da primeira reacção. Preferencial-mente, a fracção pode ser inferior a cerca de 5 % da primeira reacção. Mais preferencialmente, a fracção pode ser inferior a cerca de 2% da primeira' reacção. O que é mais preferencial é que a fracção possa ser inferior a cerca de 1 . % da reacção inicial. 0 iniciador utilizado na APR é preferencialmente ADN embora ANP, e ARN sejam também apropriados para serem utilizados como iniciadores. Deve notar-se que, de facto, na replicação do ADN, as polimerases de ADN elongam o ADN genómico a partir dos iniciadores de ARN. -

Os oligonucleótidos sintéticos podem servir como iniciadores de ADN e podem ser utilizados como’substratos para a formação de filamentos de nucleoproteína com RecA ou os seus homólogos. Sequências tão curtas como 15 nucleótidos são capazes de atingir o ADN de hélice dupla (Hsieh et al., 1992). Esses oligonucleótidos podem ser sintetizados de acordo com a química padronizada de amidato de fósforo ou de uma outra forma. As bases modificadas e/ou as estruturas químicas dos ligantes podem ser desejáveis e 39 funcionais nalgns casos. Adicionalmente os oligonucleótidos podem ser modificados nas susa extremidades, quer 5' ou 3', com grupos que servem várias finalidades, por exemplo grupos fluo-rescentes, agentes para a paragem de reacções, grupos de protecçâo (bloqueio) (reversíveis ou não) , marcadores magnéticos, proteínas etc. Nalguns casos os oligonucleótidos de hélice simples podem ser utilizados para a invasão das hélices, noutros apenas, se podem utilizar ácidos nucleicos parcialmente de hélice simples, sendo a elongação de 5' da sequência de um ácido nucleico invasivo já híbridizável com um oligonucleótido.

Noutro enquadramento, os iniciadores podem compreender uma região de 5' que não é homóloga do ácido niicleico alvo. Deve notar-se que os processos da presente invenção devem ser funcionais mesmo se os iniciadores não forem completamente complementares do ácido nucleico . alvo. Os iniciadores podem não ser complementares por terem sequências adicionais na sua extremidade 5'.' Estas sequências adicionais posem ser, por exemplo, a sequência para um sitio de reconhecimento de uma endonuclease de restrição ou. a sequência que é complementar de iniciador de sequenciação. 0 sitio de uma endonuclease de restrição pode ser útil para a clivagem. subsequente dã sequência ampliada. A utilização da endonuclease de restrição que cliva o ácido-nucleico fora do um sitio de reconhe-cimento de uma endonuclease de restrição está também côntem-plada. A sequência que é complementar para um iniciador de sequenciação pode permitir uma rápida sequenciação de ADN do produto apliado utilizando iniciadores comercialmente disponíveis ou aparelhos de sequenciação comercialmente dis-poníveis. 40 A formação de filamentos de nucleoproteina pode ser realizada por incubação do iniciador (oligonucleótidos) com a proteína RecA ou os seus homólogos na presença of ATP, e proteínas auxiliares tais como RecO, RecR e RecF. Quando incubada a 37 °C num tampão de RecA (Tris-HCl 20 mM a. pH 7,5, MgCl2 10 mM, ATP 2 mM, DTT 2' mM e lOOug/ml de albumina de soro bovino), RecA vai formar filamentos helicoidais no ADNhs com 6 protómeros de cada vez. 0 ADN está localizado dentro da hélice da proteína. Na presença de ADNhd, o filamento da nuceloproteína RecA/ADNhs'pode rastreár o ADN a taxas de pelo menos 107 pb por hora.. O modo de rastreio não é claro mas faz-se a uma velocidade (>103 pb por' segundo) que pode envolver apenas alguns pares de bases in-iciais q que se pode facilmente aceder ao longo de uma, das .· 'faces do entalhe principal. Uma ligação com sucesso pode resultar numa transição para um produto intermédio de hélice tripla, que é.. depois seguido por uma invasão da hélice e o seu deslocamento para formar um anel D. Essas moléculas conjuntas podem ser formadas em. condições similares às descritas antes para a formação dos filamentos helicoidais, e portanto na presença de ADNhs, o homólogo ADNhd, RecA, ATP, proteínas auxiliares e tampões e temperaturas apropriados, as moléculas conjuntas vão formar-se espontaneamente. Se se utiliza ATP a junção é reversível e atingirá um equilíbrio, mas os filamentos de RecA/ADNhs podem ser estabilizados, mesmo na presença de LHS, pelas proteínas auxiliares RecO e RecR·. No caso de proteínas termoestáveis a temperatura de incubação pode ser mais elevada. Se for necessário um fornecimento renovável de ATP, pode-se incluir na reacção um sistema de regeneração padrão de ATP.

As polimerases de ADN podem utilizar o grupo 3T-hidroxilo livre da hélice de invasão para catalisar a 41 síntese de ADN que se faz por incorporação de novos nucleótidos. Um certo número de polimerasés pode utilizar o 3'-hidroxilo da hélice de invasão para catalisar a síntese e dimultaneamente deslocar a outra hélice à medida que ocorre a síntese. Por exemplo podem utilizar-se as. polimerases II ou III de E. coli para prolongar os anéis D invadidos (Morei et al. , 1997). Além disso, pode-se utilizar a polimerase V de E. coli normalmente utilizada nas mutações que visam a lesão SOS na E. coli (Pham et al., 2001).. Todas estas polimerases podem tornar-se altamente processivas. através das suas interacçãos e a cooperação com o gancho do dímero β, assim como a proteína de ligação do ADN de hélice simples (LHS) e outros componentes. .Também se podem utilizar outras polimerases a partir de procariotos, vírus, e eucariotos para. prolongar a hélice de invasão.

Num outro enquadramento, o iniciador pode ter parcialmente uma hélice dupla, parcialmente uma hélice simples e com pelo menos uma ramificação de hélice simples em 3'. Neste enquadramento, o iniciador pode comprender uma hélice de invasão e uma hélice não invasiva como se mostra na figura 8A. Neste caso, depois da hélice de invasão estar hibridada com o ADN alvo e elongada, serve como um ácido nucleico alvo para um segundo' iniciador como se mostra na figura 8B. A elongação do segundo, iniciador, irá deslocar· a hélice não invasiva como se mostra na figura 8C. Neste enquadramento, como o ácido nucleico alvo está ampliado, a hélice não-invasiva do iniciador 1 está deslocada. Se tanto o iniciador um como o iniciador dois são iniciadores com hélices parcialmente duplas, então as hélices não invasivas tanto do iniciador um como do iniciador dois irão acumular-se na solução dado que o ácido nucleico alvo está amplificado. 42

Num enquadramento, pelo menos dois dos iniciadores numa reacçâo de APR são parcialmente de hélice dupla e parcial-mente de hélice simples sendo cada uma gerada por hibridação de uma hélice de invasão e de uma hélice de oligonucleótidos não invasivos, que possuem sequências com uma comple-mentaridade suficiente para que formem uma· região de hélice dupla. Preferencialmente, as duas'hélices de oligonucleótidos são suficientemente complementares da região relevante que podem formar uma estrutura de hélice dupla em condições de reacção de APR.

Num enquadramento, os iniciadores, incluindo os iniciadores de hélice simples e parcialmente de hélice dupla, são marcados com um marcador detectável. Deve notar-se que um agente fluorescente de paragem de reacção é também consi-derado como um marcador detectável. Por exemplo, o agente fluorescente de paragem de reacção pode contactar com· um corante fluorescente e detecta-se a quantidadé de agente de paragem de reacção. 0 marcador detectável deve ser tal que não interfira com uma reacção de elongação. Quando o iniciador é parcialmente de de hélice dupla com uma hélice de invasão e uma hélice não invasiva, o marcador detectável dè-ve estar ligado de tal forma que não interfira com a reacção de elongação da hélice de invasão. A. hélice não invasiva de um iniciador de de hélice parcialmente dupla não está alongada por isso não. há limitações na marcação da hélice não invasiva com a única excepção de que o marcador sa hélice não invasiva não deve interferir com a reacção de elongação da hélice invasiva. Os iniciadores marcados oferecem a vantagem de uma detecção mais rápida do produto amplificado. Além disso, a detecção de um marcador não incorporado, isto é, oligonucleótidos marcados que não foram prolongados, vai permitir . a monitorização do estado da reacção. 43 A monitorização de uma reacção de APR pode envolver, por exemplo, a eliminação de uma fra.cção de uma reacção de APR, isolando a fracçâo não incorporada e a detecção do iniciador não incorporado. Dado que a dimensão de um iniciador não incorporado pode ser inferior a 50 pb, inferior a 40 pb, inferior a 30 pb ou inferior a 25 pb, e a dimensão do produto ampliada pode ser maior do que 1Kb, maior do que 2 Kb, maior do que 5 Kb, ou maior do . que 10 Kb, há uma grande diferença de dimensão entre o iniciador incorporado e o não incorporado. O isolamento do iniciador não incorporado pode ser realizado utilizando a cromato-grafia de exclusão por dimensão tal como, por exemplo, uma coluna de centrifugação. Se um iniciador for marcado, pode-se realizar, em menos de um minuto, um processo de monitorização que compreende uma coluna de centrifugação e uma medição (por exemplo, fluorescência ou radioactivi-dade). Uma outra alternativa para a separação de iniciadores alongados a partir de iniciadores não alongados envolve a utilização de EGPA (electrof orese em gel de poliacrilamida, PAGE na terminologia inglesa). Por exemplo, o iniciador alongado pode ser separado a partir de um iniciador não alongado por meio de electroforese em gel em menos de 5 minutos. Ainda uma outra alternativa para a separação de iniciadores alongados envolve a utilização de oligonucleótidos imobilizados. Por exemplo, oligonucleótidos homólogos de sequências encontrados unicamente dentro da sequência de ADN ampliada podem ser utilizados para capturar ácidos nucleicós produzidos especificamente pela elongação do iniciador. Estes oligonucleótidos de captura imobilizados num chip, ou noutro substrato. A captura dos oligonucleótidos alongados ' por meio da. captura de oligonucleótidos pode ser realizada por processos mediados pela proteína RecA proteína ou por hibridações tradicionais da solução, se necessário. 44

Noutro enquadramento, um iniciador de hélice dupla pode ser marcado de tal modo que a separação das duas hélices do iniciador possa ser detectada. Tal como se discutiu antes, depois de vários ciclos de elongação, separam-se a hélice invasiva e as hélices não invasivas de um iniciador de hélice parcialmente dupla. Depois desta separação, a hélice não invasiva não participa na reacção de APR. Esta caracteristica pode ser utilizada para detector e monitorizar uma reacção de APR num certo número dè maneiras.

Neste pedido de patente de invenção, o marcador detectá-vel pode ser um marcador fluorescente ou uma enzima é o repressor do marcador (também referido como o inibidor do marcador) pode ser um repressor de fluorescência ou um inibidor de uma enzima. Nestes casos, o marcador é detectado por fluorescência ou uma inibição da enzima. A capacidade de detectar o marcador será a fluorescência se se utilizar um marcador fluorescente ou a actividade de uma enzima.

No primeiro processo, a hélice invasiva pode ser marcada com um marcador e a hélice não invasiva pode ser marcada com um repressor de um marcador detectável. 0 marcador, na proximidade do repressor do marcador (inibidor do marcador) no iniciador de hélice parcialmente dupla não será altamente detectável. Depois da APR, a hélice invasiva será separada da hélice não invasiva e assim, o marcador é o repressor do marcador será separado. A separação fará com que o marcador seja mais detectável. Assim, as reacções de APR podem ser monitorizadas pela medição dos aumentos na quantidade de marcador detectável. 45 0 segundo processo é semelhante ao primeiro processo excepto no facto de a hélice invasiva ser modificada com um repressor de um marcador enquanto a hé-lice não invasiva é modificada com um marcador. Depois deixa-se prosseguir a APR com o resultado (o mesmo que no processo 1) do marcador ser. separado do repressor do marcador. Assim, a capacidade, de detecção global aumentaria. 0 terceiro processo envolve a marcação da hélice não invasiva de um iniciador de hélice dupla com um marcador. Além disso, a hélice não invasiva de um segundo iniciador de hélice dupla é marcada com um repressor do marcador. As duas hélices não invasivas são produzidas para ser complementares uma da outra. Nesta configuração, a rea.cção de APR é iniciaimente fluorescente. À medida que a reacção de APR progrides, as duas hélices não invasivas são deslocadas para uma soliição e hibridam uma com a outra porque foram desenhadas para serem complementares. À medida que hibridam, o marcador e o repressor do marcador são colocados na proximidade um do outro.e a fluorescência da reacção diminui.· 0 progresso da reacção dè APR pode ser medida .pela monitorização do decréscimo da capacidade, de detecção do marcador.

Num quarto processo, as- hélices não invasivas de um primeiro e de um segundo iniciadores de hélice dupla são marcadas com ' um. primeiro marcador e com um segundo, marcador. As duas hélices não invasivas são desenhadas para serem complementares uma da outra. Tal como no terceiro processo, depois da APR, as duas hélices não invasivas hibridam uma com a outra e a proximidade dos dois marcadores será umá reflexão do progresso da reacção de APR. A proximidade dos dois marcadores pode ser determinada, por exemplo, por observação directa ou pelo 46 isolamento de hélices não invasivas. Tal como foi discutido antes, o isolamento - . dos iniciadores e outros ácidos nucléicos pequenos pode ser realizado por colunas de exclusão por dimensão (incluindo colunas de centrifugação} ou por electroforese em gel.

Noutro enquadramento, a hélice não invasiva de um ou de ambos os iniciadores é homóloga de uma segunda região de ácidos nucléicos de tal modo que o iniciador pode hibridar com um iniciador da síntese de ADR da segunda região de ácidos nucléicos. Utilizando este processo, pode-se iniciar uma segunda reacção de APR utilizando.a hélice não invasiva do iniciador de uma primeira APR. 0 produto da segunda APR pode ser monitorizado para determinar o progresso da primeira APR. -·

Ainda noutro enquadramento, a hélice ..não invasiva .é detectada por um bio-sensor específico para a sequência da hélice não invasiva. Por exemplo, o bio-sánsor pode ser uma superfície com uma sequência de ácidos . nucléicos complementar da hélice não invasiva. . 0 bio-sensor pode monitorizar uma característica que resulta da ligação da hélice não invasiva. A característica pode ser um marcador detectável.

Os marcadores detectáveis apropriados para qualquer um dos processos ' descritos incluem enzimas, substratos de * enzimas, co-enzimas, inibidores de enzimas, marcadores fluo-rescentes, cromóforos, marcadores luminescentes, radioisóto-pós (incluindo radionucleótidos) e um elemento de um par de ligação. Exemplos mais específicos incluem fluoresceina, ficobiliproteína, tetraetil-rodamina, e beta-gal. Os pares de ligação podem incluir biotina/avidina, 47 biotina/estrepta-vidina, antigénio/anticorpo, ligando/rece-ptor e análogos e mutantes dos pares de ligação. 0 agente de recombinase pode ser RecA, RadA, RadB, Rad ou um análogo funcional ou homólogos destas proteínas. Se desejado, a recombinase pode ser um agente de recombinase sensível à temperatura (referido aqui como "st"). Se se· utilizar uma recombinase, a reacção de APR pode ser iniciada a uma temperatura (a temperatura permissiva) e finalizada a outra temperatura (a temperatura não permissiva) . As combinações de temperaturas permissivas podem ser, por exemplo 25 °C/30 °C, 30 °C/37 °C, 37°C/42 °C e similares. Num enquadramento preferido, a proteína st é reversível. A actividade de uma proteína reversível st é restaurada quando se desloca de uma temperatura não permissiva para a temperatura permissiva.

Num enquadramento preferido, a APR realize-se na presen-ça de ATP, ou um análogo de ATP, ou outro trifosfato de nucelósido.· 0 análogo de ATP pode ser, por exemplo, ATPyS, cLATP, ddATP, ou outro análogo de trifosfato de nucelósido tal como UTP.

Outros reagentes úteis que se podem adicionar a uma reacção de APR reacção incluem trifosfatos de nucelósidos (isto é, dNTPs tais como cLATP, dTTP, dCTP, dGTP e os seus derivados e análogos) e uma polimerase de ADN. Outros reagentes úteis para a APR do líder/tardio incluem NTPs (ATP, GTP, CTP, UTP e os seus derivados e análogos) . Uma vantagem da reacção de APR é que não há limite ao tipo de polimerase utilizada. Por exemplo, pode-se utilizar tanto as polimerases eucarióticas como as procarióticas. As polimerases procarió-ticas incluem, pelo menos, pol I de E. coli, pol II de E. coli, pol III de E. coli, pol IV de E. 48 coli e pol V de E. coli. As polimerases eucarióticas incluem, por exemplo, complexos de multiproteína-polimerase seleccionados no grupo que consiste em pol-a, pol-JS, ροΐ-δ, e ροΐ-ε.

Noutro enquadramento, o processo de APR é realizado na presença de um componente acessório para melhorar a processividade e a fidelidade da polimerase. Os componentes acessórios tanto eucarióticos como procarióticos podem ser utilizados. Preferencialmente, o componente acessório e uma proteína acessória proveniente de E. coli- As proteínas acessórias úteis incluem a proteína de ligação de hélice simples, helicase, topoisomerase e resolvase. Outras proteínas acessórias úteis incluem um antigénio nuclear de proliferação celular seleccionado no grupo que consiste num antigénio nuclear de proliferação celular de um dímero β de E.. coli e um antigénio nuclear de proliferação celular de T4 gp45. Outros componentes acessórios incluem um complexo de uma polimerase III de ADN - holoenzima que consiste em Um gancho β, ADNX carregador de gancho, e o complexo do núcleo de polimerase. Ainda- outro componente acessório inclui RuvA, RuvB, RuvC e RecG. As propriedades favorecidas pela utilização de componentes adicionais irão provávelmente permitir a amplificação de ADNs grandes que não foram previamente atingidos com sucesso por. processos correntes tal como RCP.

Noutro enquadramento, a APR realize-se na presença de agentes utilizados para estabilizar os filamentos da nucleo-proteína de RecA/ADNhs. Por exemplo, o agente pode ser RecR, RecO, RecF ou uma combinação destas proteínas. Outros agentes úteis incluem PriA, PriB, ADNT, ADNB, ADNC e ADNG. 49

Um beneficio dos processos descritos é que a reacção de APR pode ser realizada a temperaturas reduzidas comparadas com uma reacção de RCP. Por exemplo, o processo de APR pode ser realizado entre 20 °C e 50 °C. Preferencialmente, o processo de APR realiza-se abaixo de 45 °C. Mais preferen-cialmente, o processo de APR pode ser realizado a menos do que 40 °C. Ainda mais preferencialmente, o processo de APR pode ser realizado a menos do que 35 °C. O que é mais preferencial é que o processo de e APR possa ser realizado a menos do que 30 °C. Uma das razões pelas quais o processo de APR pode ser realizado a estas temperaturas- reduzidas é porque a APR pode ser realizada sem a fusão induzida pela temperatura do ácido nucleico da matriz. Além disso, ao contrário da RCP, o controlo da temperatura absoluta não é necessário e a temperatura pode flutuar sem que afecte adversamente a APR. Por exemplo, a quantidade de flutuação pode ser qualquer uma dentro das temperaturas especificadas antes. A temperatura necessária para a fusão de um ADN de hélice dupla também contribui para a inactivação prematura da enzima, uma desvantagem ausente nos processos da presente invenção. A APR pode ser realizada para verificar as presenças, ou as ausências de um genótipo. 0 genótipo ensaiado pode estar associado a uma doença ou a uma pré-disposição para a doença. Alternativamente, o genótipo pode estar associado a um fenótipo normal ou a um fenótipo que. confere resistência especial a uma doença. 0 genótipo tal como se descreveu antes, pode ser qualquer variante genética padrão tal como uma mutação de um ponto, uma eliminação, uma inserção, uma inversão, uma mutação com alteração, um evento de cruzamento ou a presença ou a ausência de cópias múltiplas de 50 uma sequência genética (por exemplo, a presença de mini-cromossomas) . .

Um processo de detecção de um genótipo é para detectar a distância entre um par de iniciadores numa reacção de APR. A distância entre um par de iniciadores é reflectida pela dimensão da sequência ampliada. Nesse processo, os dois iniciadores são seleccionados de tal modo que atravessa uma região alvo tal como, por exemplo, um gene. Depois realiza-se a APR utilizando o pare de iniciadores e analisa-se o produto da APR. A análise pode envolver . a determinação da dimensão ou da sequência do produto amplificado. Os processos de determinação da dimensão de uma sequência de ADN, incluindo pelo menos técnicas tais como géis de agarose, . géis de EGPA, espectroscopia de massa, géis de campo de pulsação, chips de genes, sedimentação da sacarose e semelhantes são conhecidos. Há muitos processos de sequenciação do AND e as respectivas variantes, tais como a sequenciação de Sanger utilizando a terminação de didesoxy e a electroforese de gel de desnaturação (Sanger, F., Nichleri, S. . & Coulson, A. R. Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 75, 5463-5467-, (1977)), a sequenciação de Maxam-Gilber utilizando a clivagem química e a desnaturação por electroforese em gel (Maxam, A. M. & Gílbert, W. Proc Natl Acad Sei EUA 74, 560-564 (1977)), pirofosfato de detecção por piro-sequenciação (PPi) libertado durante a reacção de polimeráse de ADN (Ronaghi, M., Uhlen, M. & Nyren, P. Science 281, 363, 365 (1998)), e sequenciação por hibridação (SBH) utilizando oligonucleótidos (Lysov, I., Florenfev, V. L., Khorlin, A.A., Khrapko, K. R. & Shik, V. V. Dokl Akad Nauk SSSR 303, 1508-1511 (1988); Bains W. & Smith G. C. J. Theor. Biel 135, 303-307(1988); Drnanac, R., Labat, I., Brukner, I. &

Crkvenjakov, R. Genomics 4, 114-128 (1989); Khrapko, K. R, 51

Lysov, Y., Khorlyn, A. A,, Shick, V. V., Florentiev, V. L. & Mirzabekov, A. D. FEES Lett 256. 118-122 (1989); Pevzner P. A. J Biomel Struct Dyn 7, 63-73 (1989); Southern, E. M. , Maskos, U. & Elder, J. K. Genomics 13, 1008-1017 (1992)) .

Um processo de detecção de um genótipo consiste em utilizar iniciadores que são específicos para um genótipo em particular. Por exemplo, pode-se desenhar um iniciador para amplificar eficientemente um genótipo mas amplificar inefici-entemente ou mesmo não amplificar de todo outro genótipo. Num enquadramento, o iniciador pode compreender uma sequência de 3' que é complementar de um genótipo (por exemplo, um genótipo de uma doença genética) mas não de outro genótipo (por exemplo, um genótipo normal). 0 genótipo que se vai determinar pode ser indicativo de uma doença tal como, por exemplo, a presença de um oncogene activado; a presença do gene da doença de Huntington ou a ausência de. um anti-oncogene.

As bases 3' . dos iniciadores são especialmente importan-tes na determinação da especificidade e da eficiência, de uma reacção de APR. Um iniciador pode ser desenhado de tal modo que a base 3' é complementar de um genótipo e não é complementar de outro gènótipo. Isto vai permitir uma APR eficiente de um genótipo e uma APR ineficiente (se houver alguma) do segundo genótipo. Notou-se que o processo é efectivo apenas se um iniciador do par de iniciadores puder diferenciar entre fenótipos diferentes (por ter diferentes eficiências de amplificação). Num enquadramento preferido, ambos os iniciadores numa reacção de APR podem diferenciar entre genótipos diferentes. No exemplo anterior, os iniciadores são complementares de um genótipo e não são complementares do segundo genótipo por 52 meio de uma base na sua extremidade 3' . Num enquadramento preferido, o iniciador não é complementar do segundo genótipo por pelo menos uma base na sua extremidade 3’. Preferencialmente, o iniciador não é complementar do segundo genótipo por pelo menos 2, 3, 4,. 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 bases na sua extremidade 3'. Na situação mais preferencial, o iniciador é completamente não complementar ou não pode hibridar com o segundo genótipo, embora possa hibridar com o referido primeiro genótipo.

Nalguns dos processos discutidos, a presença ou a ausência de um produto amplificado dá. a indicação da presença ou da ausência de um genótipo. Nestes casos, a reacção de APR pode ser monitorizada por meio dos processos discutidos ao longo da presente memória descritiva.

Num enquadramento preferido, uma reacção de APR para a genotipagem irá amplificar uma sequência independentemente do genótipo do paciente. Contudo, o genótipo de um paciente irá alterar uma característica da sequência·, ampliada. Por exemplo, a sequência amplificada pode ter uma dimensão dife-rente, ou uma sequência para um genótipo e outra para outro genótipo. Desta forma, a reacção' de APR reacção irá conter um controlo interno para indicar que a reacção de foi realizada com sucesso. Naturalmente, um processo de APR, que inclui um ou mais pares adicionais de iniciadores como controlos para a realização da reacção de APR reacção, é também considerado.

Noutro enquadramento, pode-se utilizar uma reacção de APR para determinar a presença ou a ausências de uma molécula de ácido nucleico. A molécula de ácido nucleico pode ser proveniente de qualquer organismo. Por exemplo, a composição microbiana de uma amostra pode ser determinada 53 utilizando uma bateria de reacções de APR dirigidas ao ácido nucleico de diferentes micróbios. A APR é especialmente útil para a detecção de micróbios. Num enquadramento, os agentes patogénicos seleccionam-se entre virus, bactérias, parasitas, e fungos. Noutros enquadramentos, os agentes patogénicos são virus seleccionados entre virus da gripe, da rubéola, varicela-zoster, hepatite A, hepatite B, outros virus de hepatite, herpes simplex, polio, varíola, vírus da imuho-deficiência humana, vaccinia, raiva, retrovírus de Epstein Barr, e rinovírus. Noutro enquadramento, os agentes pato-génicos são bactérias seleccionadas entre Escherichia colif Mycobacterium tuberculosis, Salmonella, Chlamydia e Streptococcus. Ainda noutro enquadramento, os agentes patogénicos são parasitas seleccionadas entre Plasmodium, Trypanosoma, Toxoplasma gondii, e Õnchocerca. Contudo, não se pretende que o.s processos estejam limitados aos géneros e/ou às espécies específicos listados antes. REFERÊNCIAS:

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EXEMPLOS

Exemplo 1: Amplificação de polimerase-recombinase da hélice líder (APRhl)

As sequências de ADN podem ser ampliadas utilizando a sintese da hélice lider de acordo com o processo de amplificação de polimerase-recombinase (APR) processo descrito na figura 1. A reacção realiza-se com a composição seguinte: COMPONENTES DE FORMAÇÃO/RESOLUÇÃO DO ANEL D:

Componente Concentração RecA 20 μΜ Iniciadores de oligonucleótidos de hélice simples 0,25 μΜ ATP 3 ιαΜ RecF 0, 1 RM RecQ 0,13 μΜ RecR 0,5 μΜ Proteína de ligação de hélice simples (LHS) 1 a 10 μΜ polimerase V de ADN 5 unidades 60 MISTURA DE POLIMERASE/HELICASE/RESOLVASE:

Componente Concentração ADN 5 unidades RuvA 0,5 μΜ RuvB 0,5 μΜ RuvC 0, 5μΜ RecG 10 nM TAMPÃO DA REACÇÃO:

Componente Concentração MgCl2 2 a 10 mM TrisHCl pH 7,2 10 mM DTT 0 a 10 mM KC1 0 a 50 mM Trifosfatos de desoxiribonucleótído 0,2 mM Albumina de soro bovino (ASB) 0 a 10 pg por ml A reacção é montada de modo a que a concentração final satisfaça os componentes de formação/resolução do anel D, a mistura de polimerase/helicase/resolvase, e tampão de reacção com a polimerase do ÃDN e/ou a matriz adicionada no fim, se necessário. Por exemplo, uma solução 2X concentrada dos componentes de formação/resolução do anel D e da mistura de polimerase/helicase/resolvase pode ser preparada em 1 X o tampão de reacção. A reacção pode iniciar-se por meio da mistura de um volume igual de cada um dos dois componentes (cada um deles em 1 x tampão de reacção). Eventualmente, e tal como se disse antes, a polimerase de ADN ou a matriz (ADN alvo) podem ser adicionadas no fim. Faz-se a incubação da mistura reaccional durante um tempo suficiente até que os reagentes se tenham esgotado. Os tempos de incubação normais irão variar entre 1 hora, 2 horas, 3 horas, 5 horas, 10 horas ou durante a noite (cerca de 16 horas) . Ao contrário da RCP, que requer pequenos 61 volumes para uma alteração rápida da temperatura, não há limite para o volume da reacção da APR. Volumes de reacção de 25 ul, 50 ul, 100 ul, 1 ml, 10 ml e 100 ml ou maiores podem ser manipulados num só reactor. A temperatura de incubação pode ser como as temperaturas típicas de laboratório tal como 25 °C, 30 °C ou 37°C.

Antes da adição do ADN matriz e/ou da polimerase, a RecA e a LHS irão competir para a ligação a iniciadores de oligonucleótidos de hélice simples. Na presença de uma RecR e RecO, a RecA é estabilizada selectivamente nos iniciadores de hélice simples formando filamentos de nucleoproteína de RecA num complexo com RecO e RecR. Este complexo é competente para invadir o ADN de hélice dupla para formar um anel D em sítios homólogos dos iniciadores de oligonucleótidos. Alternati-vamente, RecA, RecO e RecR podem ser pré-carregados nos iniciadores de oligonucleótidos antes da introdução de LHS na mistura reaccional (figura 1). As hélices invasoras serão prolongadas pela polimerase numa direcção de 5' para 3'. À medida que se formam os anéis D e que a síntese prossegue, o ADN de hélice simples deslocado vai ficando revestido com a LHS. A libertação da RecA do ADN de hélice dupla pode ocorrer por via da hidrólise de ATP numa direcção de 5' para 3' ou como resultado da actividade de helica-se/resolvase ou da polimerase (figura 2A, B). Ocorrem continuamente novos ciclos de invasão/síntese. O terceiro ciclo de invasão da hélice/síntese vai libertar produtos soltos cujas extremidades correspondem aos dois sítios de iniciadores que estão um em frente do outro. Estes fragmentos rapidamente vão tornar-se o produto líder da reacção e vão acumular-se em níveis elevados. Como cada complexo sintético é tratado até ao fim da matriz, a proteína RecA é deslocada quer pela actividade da polime- 62 rase ou pela actividade das helicases, tal como RuvAB ou resolvases, tal como RuvC. Uma vez esgotados os iniciadores, ΆΤΡ, trifosfatos de desoxinucleósido ou qualquer outro componente limitativo, a reacção vai parar. A inclusão de mutantes de RecA sensíveis à temperatura irá permitir o início controlado da síntese de ADN. Nessa situação, o início da reacção realize-se de 25 a 37 °C permitindo a formação de anéis D. As reacções de elongação realizam-se a 42 °C, que não é uma temperatura permissiva para a invasão da hélice dupla mediada por RecA. 0 número de ciclos irá determinar a quantidade de produto de reacção. As fases de elongação prolongada irão permitir a amplificação de ADNs extremamente longos sem interferência da re-invasão.

Exemplo 2: APR aninhada A reacção de APR realiza-se como se descreveu no Exemplo 1. A fracção de um décimo (1/10) e de um centésimo (1/100) da mistura reaccional é eliminada e utilizada em lugar da matriz de ADN num segundo ciclo de APR. Pode-se utilizar nesta APR aninhada APRhd, APR de líder/tardia APR, e as suas combinações.

Exemplo 3: Amplificação simultânea da polimerase- recombinase da hélice líder e da hélice tardia

As sequências de ADN podem ser ampliadas utilizando' a síntese simultânea da hélice líder ou tardia, de acordo com o processo de amplificação de polimerase-recombinase (APR) descrito na figura 2. A reacção é montada com a seguinte composição: 63 COMPONENTES DE FORMAÇÃO/RESOLUÇÃO DO ANEL D:

Componente Concentração RecA 20 μΜ Iniciadores de oligonucleótidos de hélice simples 0,25 μΜ ATP 3 mM RecF 0,1 μΜ RecO 0,13 μΜ RecR 0,5 μΜ Proteína de ligação de hélice simples (LHS) 1 a 10 μΜ Polimerase V de ADN 5 unidades MISTURA DE HELICASE/RESOLVASE:

Componente .. . Concentração RuvA 0,5 μΜ RuvB 0,5 μΜ RuvC 0,5 μΜ RecG 10 nM

COMPLEXO DE PRIMOSSOMA

Componente Concentração PriA 20 nM PriB 20 nM ADNT 10 0 nM ADNB 100 nM ADNC 2 0 0 nM ADNG 200 nM

COMPLEXO DE POLIMERASE III E HOLOENZIMA

Componente Concentração Gancho β 2 μΜ Factor de carga de ADNX 500 nM Complexo nuclear de polimerase 500 nM 64

I

MISTURA DA HÉLICE TARDIA

Componente Concentração Polimerase I de ADN 5 unidades Ligase de ADN 2 unidades

TAMPAO DE REACÇÃO

Componente Concentração MgCl2 2 a 10 mM TrisHCl pH 7,2 10 a 20 mM DTT O CD Η1 O KC1 0 a 50 mM Trifosfatos de desoxiribonucleótido 0,2 ao 0,4 mM Albumina de soro bovino (ASB) 0 a 10 pg por ml A reacção é montada de modo a que a concentração final de todos os reagentes é a listada antes. Assim, por exemplo, prepara-se uma solução de cada um dos componentes (com-ponentes de formação/resolução do anel D, mistura de heli-case/resolvase, complexo de primossoma, complexo de polime-rase III de ADN e holoenzima, mistura da hélice tardia) concentrada 5 vezes em IX de tampão de reacção. Depois, mis-turam-se as cinco soluções em volumes iguais para iniciar a reacção. Faz-se a incubação da mistura reaccional durante um tempo suficiente até que todos os reagentes se esgotem. Os tempos normais de incubação variarão entre 1 hora, 2 horas, 3 horas, 5 horas, 10 horas ou uma noite (cerca de 16 horas) . Tal como se disse antes, não há limite para o volume da reacção de APR. Os volumes de reacção de 25 ul, 50 ul, 100 ul, 1 ml, 10 ml e 100 ml ou maiores podem ser tratados num único recipiente de reacção. A temperatura de incubação pode estar entre as temperaturas típicas do laboratório tal como 25 °C, 30 °C ou 37°C. 65

Primeiro, carrega-se o primossoma no anel D formado pela invasão de filamentos da nucleoproteina RecA. 0 primossoma sintetiza uma elongação de um iniciador de ARN. Finalmente, o primossoma recruta o factor de carga, que recruta tanto o dímero do antigénio nuclear de proliferação celular como o núcleo assimétrico da polimerase de ADN (figura 3A). A síntese ocorre simultaneamente em ambas as direcções da hélice líder e da tardia. Eventualmente a síntese da héli-ce tardia pára e descarrega-se o gancho da hélice tardia. A síntese da hélice líder continua até que se forme um novo sítio de síntese da hélice tardia (figura 3B).

Enquanto a síntese da hélice líder continua, forma-se um novo sítio de síntese da' hélice tardia. A síntese da hélice tardia continua para o fragmento de Okazaki anterior, altura em que se descarrega b factor de carga da hélice tardia (figura 3C). A polimerase I de ADN elimina o iniciador de ARN, e preenche o intervalo enquanto a ligase de ADN se liga aos dois fragmentos· de Okazaki formando uma hélice tardia contínua (figura 3D).

Lisboa, 8 de Outubro de 2008 66

Claims (48)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo de APR de amplificação do ADN de uma sequência-alvo de hélice dupla, compreendendo a referida sequência-alvo uma primeira e uma segunda hélice de ADN, processo caracterizado pelo facto de compreender as etapas de: (a) contacto de um agente de recombinase com um primeiro e ' um. segundo iniciadores de ácidos nucleicos na presença de ATP, RecO, RecR, e RecF para formar um primeiro e um segundo iniciadores de nuclecproteina; (b) contacto do primeiro e do segundo iniciadores de nucleoproteína com a referida sequência-alvo de hélice dupla formando assim uma primeira estrutura de hélice dupla numa primeira porção da referida primeira hélice e formando uma estrutura de hélice dupla numa segunda porção da referida segunda hélice de tal modo que. as extremidades 3' do referido primeiro iniciador de ácidos nucleicos e o referido segundo iniciador de ácidos nucleicos estão, orientados um em direcção ao outro na mesma molécula de ácido nucleico matriz; (c) extensão da extremidade 3' dos referidos primeiro e segundo iniciadores de nucleoproteína com uma ou mais polimerases e dNTPs para gerar um .primeiro e um segundo ácido nucleico de hélice dupla e uma primeira e uma segunda hélice deslocada de ácido nucleico 1 (d} continuação da reacção através da repetição de (b) e (c) até que se atinja o grau de amplificação desejado em que o agente de recombinase é uma proteina RecA, e em que o referido primeiro ou o referido segundo iniciador de ácido nucleico é marcado com uma parte detectável.
2. 2. Processo de' acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, na etapa (c), a hélice deslocada do ácido nucleico ser ampliada por meio de uma reacção concorrente de APR.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo facto de a hélice deslocada do ácido nucleico.ser amplificada .por meio de: (a) o contacto do primeiro ou do segundo iniciador de nucleoproteína com a referida hélice ' deslocada; e (b) a extensão dos referidos primeiro e segundo iniciadores de nucleoproteína com uma polimerase e dNTPs.
4. 4. Processo de acordo coma reivindicação 1 caracterizado pelo facto de uma referida primeira e uma referida segunda hélice deslocada ser pelo menos parcialmente complementar da outra e poder hibridar para formar um ácido nucleico filho de hélice dupla que pode servir como o ácido nucleico matriz de hélice dupla numa etapa subsequente (b) e numa etapa (c) .
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de uma referida primeira e uma referida segunda hélice deslocada ser pelo menos parcialmente complementar do referido primeiro ou do referido 2 segundo iniciador e poderem hibridar com o referido primeiro ou com o referido segundo iniciador.
6. 6. Processo de APR de acordo com a reivindicação 1 caracte- rizado pelo facto de' o referido iniciador de ácido nucleico ser ADN, ARN, . ANP ou uma combinação entre eles.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo.facto de cada referido iniciador de ácido nucleico ter pelo menos uma- região 3' de hélice simples.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de pelo menos um iniciador ser parcialmente de hélice simples e parcialmente de hélice dupla, em que o referido iniciador é constituído por uma hélice invasora mais longa que possui uma sequência especifica do iniciador 3' e uma mais curta; uma hélice não invasora, que é complementar da extremidade 5’ da hélice.invasora mais longa.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido primeiro iniciador de ácido nucleico compreender uma primeira hélice não invasora e o referido segundo iniciador de ácido nucleico compreender uma segunda hélice não invasora e â referida primeira e a referida segunda hélice não invasoras serem complementares uma da outra.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a referida hélice invasora, a referida hélice não invasora ou ambas as referidas hélices invasora e não invasora serem marcadas com uma parte detectável. 3
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a referida parte detectável se seleccionar no grupo que consiste em um fluorocromo, uma enzima, um repressor de fluorescência, um inibidor de enzima, um marcador radioactivo e uma combinação deles.
12. 12. Processo de acordo com. a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de tanto a referida hélice invasora como a referida hélice não invasora serem marcadas e em que a hélice, invasora é marcada com um primeiro fluorocromo ou uma primeira enzima e em que a hélice não invasora é marcada com um segundo fluorocromo, uma segunda enzima, um repressor de fluorescência ou um inibidor de enzima. 1,3. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de . tanto a .referida hélice, invasora como a referida hélice não invasora serem marcadas , e em que a hélice não invasora é . marcada com um primeiro fluorocromo ou uma primeira enzima e em que a hélice invasora é marcada com um segundo fluorocromo, uma segunda enzima, um repressor' dé fluorescência ou um . inibidor de enzima.
13. 14. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo .facto de um ou ambos os iniciadores de ácido nucleico serem um iniciador de hélice simples.
14. 15. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida parte detectável se seleccionar no grupo que consiste em um fluorocromo, uma enzima, um repressor de fluorescência, um inibidor 4 de enzima, um marcador radioactivo e uma combinação deles.
15. 16. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a etapa (d) causar a deslocação da hélice não invasora.
16. 17. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a hélice invasora e a hélice não invasora serem marcadas e de se detectar a separação da hélice invasora e da hélice não invasora.
17. 18. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a hélice libertada de. um oligonucleótido parcialmente invasor de hélice dupla ser a sequência complementar da hélice libertada do outro oligonucleótido invasor de hélice dupla.
18. 19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido libertado ser complementar e hibridar com uma matriz-alvo de hélice simples e iniciar a síntese do ADN a partir da sua extremidade 31.
19. 20. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o agente de recombinase ser sensível à temperatura, em que o referido agente de recombinase sensível à temperatura possui actividade de invasão da hélice a uma temperatura permissiva e não possuir actividade de invasão da hélice a uma temperatura não permissiva.
20. 21. Processo de APR de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de uma ou mais das referidas 5 polimerases ser uma polimerase procariótiça ou uma polimerase eucariótica.
21. 22. Processo de APR de acordo com a reivindicação 21, ca-racterizado pelo facto de a referida polimerase procariótica se seleccionar no grupo que consiste em pol I de È.coli, pol II de E.coli, pol III de E.coli, pol IV de E.coli, pol V de E.coli ou as suas combinações.
22. 23. Processo de APR de acordo com a reivindicação 21 ca-racterizado pelo facto de a referida polimerase eucariótica ser um complexo de polimerase e multi-proteinas eucarióticas seleccionadas no grupo que consiste em ροΐ-α, pol-β, pol-δ, ροΐ-ε, e combinações delas.
23. 24. Processo de APR de acordo, com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido grau de amplificação desejado ser de pelo menos 10 vezes, pelo menos. 100 vezes, pelo menos 1.000 vezes ou pelo menos 1.000.000 de vezes.
24. 25. Processo de APR de acordo, com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida primeira porção e a segunda porção atravessarem uma sequência alvo de intervenção do ADN.
25. 26. Processo de APR de acordo com a reivindicação 25 caracterizado pelo facto de a referida sequência alvo de intervenção do ADN ser de pelo menos 1 megabase. 6
26. 27. Processo de APR de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de se realizar na presença de uma ou mais componentes acessórias.
27. 28. Processo de APR de acordo com a reivindicação 27 caracterizado pelo facto de uma ou mais das referidas componentes acessórias ser proveniente de E. coli.
28. 29. Processo de APR de acordo com a reivindicação 28 caracterizado pelo facto de a referida componente acessória se seleccionar no grupo que consiste numa proteina de ligação de hélice simples, helicase, resolvase e uma combinação delas.
29. 30. Processo de APR de acordo com a reivindicação 28 caracterizado pelo facto de uma ou mais das referidas' componentes acessórias ser uma proteína de ligação de hélice, simples, RuvA, RuvB, RuvC., RecG, PriA, PriB ADNT, ADNB, ADNC,' ADNG, antigénio nuclear de proliferação celular do dímero β de E. coli, factor de carga de ADNX, complexo nuclear de polimerase, ligase de ADN 31. · Processo de APR de acordo com a reivindicação 28 caracterizado pelo facto de a referida componente acessória ser um antigénio nuclear de proliferação celular seleccionado no grupo que consiste num antigénio nuclear de proliferação celular do dímero β de E. coli, um antigénio nuclear de proliferação celular de PCNA eucarístico, um antigénio nuclear de proliferação celular de T4 (gp45) e uma combinação deles. 7
30. 32. Processo de acordo com a reivindicação 28 caracterizado pelo facto de a referida componente acessória ser um complexo de polimerase III de ADN e holoenzima que consiste em factor de carga β, factor de carga de ADNX, e o complexo nuclear de polimerase.
31. 33. Processo de acordo com a reivindicação 28 caracterizado pelo facto de a referida componente acessória se se-leccionar no grupo que consiste numa proteina de ligação de hélice simples (LHS), um antigénio nuclear de proliferação celular, uma helicase, uma resolvase e as respectivas combinações.
32. 34. Processo de acordo com a reivindicação 33 caracterizado pelo facto de a proteína de ligação de hélice simples (LHS) ser proveniente de E. colí.
33. 35. Processo de acordo' corri a reivindicação 34, caracterizado pelo facto de o referido antigénio nuclear de proliferação celular ser o antigénio nuclear de proliferação celular do dímero β de- E. colir ; o . antigénio nuclear de proliferação celular de PCNA-eucariótico, ou o antigénio nuclear de proliferação celular de T4 (gp45).
34. 36. Processo de acordo com a reivindicação 28 caracterizado pelo facto de o componente acessório ser RuvA, RuvB, RuvC e RecG.
35. 37. Processo de acordo com a reivindicação 28 caracterizado pelo facto de o componente acessório ser um complexo de primossoma que consiste em PriA, PriB, ADNT, ADNB, ADNC e ADNG. 8
36. 38. Processo de APR de acordo com a reivindicação 18 caracterizado pelo facto de o referido processo ser realizado entre 20 °C e 50 °C • 39. Processo de APR de acordo com a reivindicação 18 caracterizado pelo facto de o referido processo ser realizado entre 20 °C e 40°C. 40.. Processo de APR de ' acordo com a reivindicação 18 caracterizado pelo facto de o referido processo ser realizado entre 20 °C e 30°C. 41. Processo de APR de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de o referido processo ser realizado sem fusão induzida pela temperatura do ácido nucleico da matriz. <M Processo de APR de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de os dois' iniciadores de núcleoproteína estarem presentes, cada um,' numa relação molar de iniciador : alvo de ácido nucleico de hélice dupla de pelo menos 1000:1.
37. 43. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de as referidas etapas (b) e (c) serem repetidas pelo menos uma vez.
38. 44. Processo dé acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de as referidas etapas (b) e (c) serem repetidas pelo menos cinco vezes.
39. 45. Processo de APR de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de pelo menos um iniciador conter um ou . mais nucleótidos, que não são 9 complementares da sequência especifica a ser amplificada.
40. 46. Processo de APR de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de pelo menos um iniciador conter um ou mais nucleótidos, que não são complementares da sequência alvo na sua extremidade 5' .
41. 47. Processo de APR de acordo com a reivindicação 4 6 caracterizado pelo .facto de pelo menos um nucleótido ser. um oligonucleótido que compreende a sequência de um sitio de reconhecimento da endonuclease de restrição.
42. 48. Processo de APR de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de o ácido nucleico amplificado conter pelo menos uma mutação especifica que está associada a uma doença genética.
43. 49. Processo dè APR de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de a sequência de ácidos nucleicos amplificada estar contida num organismo-patogénico, um oncogene, um oncogene activado ou um oncogene reprimido.
44. 50. Processo de APR de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de pelo menos um iniciador ser complementar de uma sequência associada a uma doença genética.
45. 51.. Processo de APR de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de pelo menos um iniciador ser complementar de uma sequência de ácidos nucleicos num 10 organismo patogénico, um oncogene, um oncogene activado, ou um oncogene reprimido.
46. 52. Processo APR de amplificação aninhada (nested) caracte-rizado pelo facto de compreender as etapas de: (a) amplificação de uma região de ADN utilizando o processo de APR de acordo Com a reivindicação 1 utilizando um primeiro e um segundo iniciador para produzir um primeiro produto amplificado; (b) amplificação do referido produto amplificado utilizando um terceiro e um quarto iniciadores utilizando o processo de APR de acordo com a revindicação 1 para produzir um segundo produto amplificado, em que o referido segundo -! -roduto amplificado é uma sequência mais pequena contida dentro do referido primeiro produto amplificado. -
47. 53. Processo de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo facto de o .referido primeirp iniciador, o referido segundo iniciador, o referido terceiro iniciador e o referido quarto iniciador serem todos diferentes.
48. 54. Processo de acordo com a reivindicação 52 caracterizado pelo facto de um dos referidos primeiro e um dos referidos segundo iniciadores serem idênticos a um dos referidos terceiro e quarto iniciadores. Lisboa, 8 de Outubro de 2008 11