CN111566223B - 用于操纵核酸的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供用于操纵核酸的方法、组合物和试剂盒以及系统，其包含使用预植入的固体载体实施对核酸模板的等温扩增，诸如重组酶‑聚合酶扩增(recombinase‑polymerase amplification；RPA)。提供用于产生与固体载体结合的包括特定核苷酸序列的模板核酸分子的快速且有效的方法。此类方法可用于，例如操纵核酸来为利用单克隆核酸群体的分析方法做准备。

Description

用于操纵核酸的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月7日提交的标题为“用于等温核酸扩增的方法和组合物(METHODS AND COMPOSITIONS FOR ISOTHERMAL NUCLEIC ACID AMPLIFICATION)”的美国临时申请第62/582,597号和2018年8月16日提交的标题为“用于制备测序装置的系统和方法(SYSTEM AND METHOD FOR PREPARING A SEQUENCING DEVICE)”的美国临时申请第62/719,078号的优先权，其中的每一个的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
以引用的方式并入
本文所引用的所有专利、专利申请和公开案的公开内容均以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开大体上涉及用于操纵和分析核酸的方法和用于进行其的组合物和试剂盒。
背景技术
对核酸样本的操纵，例如核酸扩增在分子生物学中极为有用，且实际上在生物学、治疗、诊断、法医学和研究的每一方面中具有广泛的适用性。生物和医疗研究日益转向用于增强生物研究和医学的核酸测序。举例来说，生物学家和动物学家正转向用以研究动物迁移、物种进化和性状来源的测序。医学团体正使用测序来研究疾病的起因、对药品的敏感性和感染的起因。测序的使用可能会受样本中的核酸的数量和/或质量不足限制。另外，测序在历史上一直是一种昂贵的方法，因此限制了其实践。
一般来说，为了增加可用于分析的核酸的量，使用一种或多种引物从核酸分子产生扩增子，其中扩增子与产生其的模板的全部或一部分互补。多重扩增也可简化过程且减少开销。对于一些下游应用，单克隆是合乎期望的，这是因为多克隆群体内的多种多样的核酸分子的不同特征可能会将分析数据的解译变得复杂化。在其中核酸的单克隆群体适用于分析性方法中的例子中，在含有单克隆核酸群体和保持其为分离型且不含或相对不含大量与单克隆群体中的那些核酸不相同的其他核酸杂质方面，也存在挑战。当试图以高通量、自动化、有成本效益的方式对不同核酸的多个样本进行分析(例如测序)时，这尤其是一个问题。在核酸测序应用中，多克隆群体的存在可能会使测序数据的解译变得复杂化；然而，许多测序系统对检测来自单一模板核酸分子的核苷酸序列数据不足够敏感，因此在测序之前对模板核酸分子进行扩增是必需的。
这类扩增的一个实例是重组酶-聚合酶扩增(recombinase-polymeraseamplification；RPA)，其是一种利用酶来将寡核苷酸引物与双螺旋DNA中的其互补伴侣结合，随后进行等温扩增的DNA扩增方法。相对于传统的扩增方法，RPA提供多种优点，包含例如不需要初始热或化学熔解(melting)，能够在低恒定温度下运行而无需绝对温度控制，且可将反应混合物(例如缺乏靶聚核苷酸)存储在干燥条件下。这些优点表明，RPA是一种用于扩增核酸分子的强力且便利的工具。然而，在测序之前使用RPA来制备模板核酸分子的尝试已导致非所需多克隆群体和/或不足的制剂。因此，仍需要产生改进模板核酸分子的制备以用于分子表征，例如测序的改进方法。
发明内容
在一些实施例中，本公开大体上涉及操纵核酸的方法以及用于进行所述方法的系统、组合物、试剂盒和设备。
在一些实施例中，本文提供用于产生包括特定核苷酸序列的核酸分子的快速且有效的方法。可例如在操纵核酸中使用这类方法以用于在使用单克隆核酸群体的方法中进行分析准备。本文中所公开的用于产生单克隆核酸群体的克隆扩增方法的一些实施例以受约束的核酸分子模板开始。约束本文提供的核酸分子的方法包含通过结合待扩增和分析的不同核酸共有的特定核苷酸序列来捕获单一核酸分子。为了产生具有可用于易于约束的共有特定核苷酸的不同核酸分子，本文中所公开的一种方法包含：(a)获得核酸分子群体，例如双链含衔接子的DNA文库，其中就所述分子的一条链来说，各分子含有在所述分子的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述分子的3'端处的第二连续核苷酸序列和位于第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列不同，核酸分子的第一核苷酸序列大体上一致，且核酸分子的第二核苷酸序列大体上一致；(b)使核酸分子群体在正向引物和反向引物存在下经受核酸扩增循环，所述正向引物含有与第一核苷酸序列大体上一致的寡核苷酸序列，所述反向引物含有与第二核苷酸序列的5'端子序列互补的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在子序列的3'端处与不和第二核苷酸序列互补的第四核苷酸序列连接；和(c)使步骤(b)的扩增循环的产物在正向和反向引物存在下经受扩增循环，以产生多种不同核酸产物，其中产物中的仅一种包括与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。在这个方法的一些实施例中，反向引物包含与第二核苷酸序列的5'端互补的核苷酸序列但不含有与第二核苷酸序列的3'端互补的核苷酸序列。
本文所提供的产生具有可用于例如易于约束的共有特定核苷酸的不同核酸分子的方法的其它实施例包含：(a)获得核酸分子群体，例如双链含衔接子的DNA文库，其中就所述分子的一条链来说，各分子含有在所述分子的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述分子的3'端处的第二连续核苷酸序列和位于第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列不同，核酸分子的第一核苷酸序列大体上一致，且核酸分子的第二核苷酸序列大体上一致；(b)使核酸分子群体在一种或多种正向引物和反向引物存在下经受两个或更多个核酸扩增循环，所述正向引物含有与第一核苷酸序列大体上一致的寡核苷酸序列，所述反向引物在3'端处被封端且含有与第二核苷酸序列互补的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在寡核苷酸序列的5'端处与不和第二核苷酸序列互补的第四核苷酸序列连接，以产生核酸产物，其中大体上所有产物均包括与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一些实施例中，本文提供用于产生一种或多种模板化载体，例如固体载体的方法。这类方法包含例如：a)通过将一种或多种预植入的载体、核苷酸、重组酶和聚合酶组合形成模板反应混合物，其中一种或多种预植入的固体载体包含所连接的大体上一致的第一引物群体且具有与其连接的大体上单克隆模板核酸分子，其中一种或多种预植入的固体载体形成于单独的预植入反应中，所述单独的预植入反应在模板反应前进行，其中大体上单克隆模板核酸分子包含含第一引物的近侧区段，在一些实施例中，所述第一引物不包含100或更多个相同核苷酸，其中所述近侧区段将模板核酸区段与预植入的固体载体连接，且其中预植入的固体载体进一步包含与预植入的固体载体连接且未与模板核酸分子结合的所连接的第一引物，其中模板反应混合物进一步包含大体上一致的可溶第二引物群体，且其中模板核酸分子在近侧区段相反的末端处或其附近包含第二引物的引物结合位点；和b)通过向模板反应混合物添加阳离子和在等温条件下培育反应混合物至少10分钟进行模板反应，以在模板反应中扩增模板核酸分子来产生一种或多种模板化固体载体，其中模板化固体载体中的每一个包含至少100,000个大体上单克隆模板核酸分子，且其中当起始模板反应时，模板核酸分子不以溶液形式存在于反应混合物中，从而产生一种或多种模板化固体载体。在一些实施例中，在测序反应中使用一种或多种模板化固体载体，以测定模板核酸分子的序列。在其它实施例中，模板化固体载体是模板化珠粒，且测序包含在进行测序反应之前将珠粒分配在固体载体的孔中。在一些实施例中，一种或多种模板化固体载体包含：第一模板化固体载体，其与具有第一序列的模板核酸分子的大体上单克隆群体连接；和至少一种其他模板化固体载体，其与具有第二序列的模板核酸分子的大体上单克隆群体连接，其中第一连接的模板核酸分子的序列不同于第二连接的模板核酸分子的序列。在其它实施例中，与各预植入的固体载体连接的大体上单克隆模板核酸分子包含至少70％与各预植入的固体载体连接的所有模板核酸分子。在一些实施例中，模板反应混合物包含预植入的固体载体群体。在其它实施例中，固体载体群体的各预植入的固体载体具有在10与50,000个之间的与其连接的大体上单克隆模板核酸分子，且一种或多种固体载体是珠粒。在一些实施例中，预植入的反应混合物和/或模板反应混合物进一步包含重组酶辅助蛋白。在其它实施例中，重组酶辅助蛋白是单链结合蛋白和/或重组酶负载蛋白。在一些实施例中，在35℃与45℃之间的温度下，培育模板反应混合物和/或预植入反应混合物。在一些实施例中，培育模板反应混合物10到60分钟。在一些实施例中，存在于模板化固体载体上的大体上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的大体上单克隆模板核酸分子的至少100倍。
在一些实施例中，本公开大体上涉及方法、以及用于进行所述方法的系统、组合物、试剂盒和设备，其中所述方法是用于测定模板核酸分子的序列，且包含：进行预植入反应和随后模板反应。在一些实施例中，预植入反应产生多个预植入的固体载体，其中多个预植入的固体载体中的个别预植入的载体包含与固体载体连接的多个第一引物，其中多个第一引物具有大体上一致序列，且其中多个第一引物中的一些与模板核酸分子接合且多个第一引物中的一些不与模板核酸分子接合。在一些实施例中，本公开大体上涉及用于测定模板核酸分子的序列的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，其包含：a)产生包含所连接的一致的第一引物群体的预植入的固体载体群体，其中在预植入条件下产生预植入的固体载体，且其中预植入的固体载体中的每一个具有在10与100,000个之间的包含与其连接的第一引物的大体上单克隆模板核酸分子且包含所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与预植入的固体载体连接且不与模板核酸分子结合；b)通过将预植入的固体载体群体、核苷酸、重组酶、聚合酶和呈溶液形式的未与任何底物连接的一致的第二引物群体组合来形成模板反应混合物，其中模板核酸分子在包含第一引物的近侧区段相反的末端处或其附近包含第二引物的引物结合位点；c)通过向模板反应混合物添加阳离子起始模板反应，其中当起始模板反应时，模板核酸分子不以溶液形式存在于反应混合物中；d)在等温条件下培育已起始的模板反应混合物至少10分钟，以在模板反应中扩增模板分子来产生一种或多种模板化固体载体，所述模板化固体载体上包含的所连接的大体上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的至少10倍；和e)对于一种或多种模板化固体载体上的模板核酸分子进行测序，从而测定模板核酸分子的序列。在一些实施例中，模板核酸分子包含具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在一些实施例中，与预植入的固体载体连接和/或与模板化固体载体连接的大体上单克隆模板核酸分子包含具有两种或更多种不同序列的模板核酸分子。在其它实施例中，与各预植入的固体载体连接的大体上单克隆模板核酸分子包含至少70％与各预植入的固体载体连接的所有模板核酸分子。在一些实施例中，模板化固体载体是模板化珠粒，且测序包含在进行测序反应之前将珠粒分配在固体载体的孔中。在一些实施例中，固体载体群体的各预植入的固体载体具有在10与50,000个之间的与其连接的大体上单克隆模板核酸分子，且一种或多种固体载体是珠粒。在一些实施例中，预植入的反应混合物和/或模板反应混合物进一步包含重组酶辅助蛋白。在其它实施例中，重组酶辅助蛋白是单链结合蛋白和/或重组酶负载蛋白。在一些实施例中，在35℃与45℃之间的温度下，培育模板反应混合物和/或预植入反应混合物。在一些实施例中，培育模板反应混合物10到60分钟。在一些实施例中，使用第一重组酶-聚合酶扩增(RPA)反应产生预植入的固体载体，且模板反应是第二RPA反应。在其它实施例中，通过在35℃与45℃之间的温度下，培育RPA反应混合物2到5分钟，来进行第一RPA反应。在一些实施例中，存在于模板化固体载体上的大体上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的大体上单克隆模板核酸分子的至少100倍。
在一些实施例中，本公开大体上涉及方法、以及用于进行所述方法的系统、组合物、试剂盒和设备，其中所述方法是用于测定模板核酸分子的序列，且包含：a)通过在预植入反应条件下，培育第一重组酶-聚合酶扩增(RPA)反应混合物进行预植入反应，以产生一种或多种预植入的固体载体，所述第一重组酶-聚合酶扩增反应混合物包含模板核酸分子群体和含所连接的一致的第一引物群体的固体载体群体，其中预植入反应条件包含在等温条件下培育RPA反应混合物，且其中预植入的固体载体各自具有在10与100,000个之间的与其连接的大体上单克隆核酸分子，和/或预植入反应条件包含在等温条件下培育RPA反应混合物2到5分钟，其中预植入的固体载体包含：(i.)通过第一引物与固体载体连接的模板核酸分子的大体上单克隆群体，和(ii.)所连接的第一引物，其与预植入的固体载体连接且不与模板核酸分子结合；b)通过使第二RPA反应混合物中包含一种或多种预植入的固体载体形成模板反应混合物，其中模板核酸分子不与不包含在模板反应混合物中的预植入的固体载体结合，其中模板反应混合物进一步包含呈溶液形式的不与任何底物连接的一致的第二引物群体，且其中模板核酸分子在包括第一引物的近侧区段相反的末端处或其附近包含第二引物的引物结合位点；c)通过向模板反应混合物添加阳离子起始模板反应；d)在等温条件下培育已起始的模板反应混合物至少10分钟，以在模板反应中扩增模板核酸分子来产生一种或多种模板化固体载体，所述模板化固体载体上包含的大体上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的至少10倍；和e)对于一种或多种模板化固体载体上的模板核酸分子进行测序，从而测定模板核酸分子的序列。在一些实施例中，模板核酸分子包含具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在一些实施例中，与预植入的固体载体连接和/或与模板化固体载体连接的大体上单克隆模板核酸分子包含具有两种或更多种不同序列的模板核酸分子。在其它实施例中，与各预植入的固体载体连接的大体上单克隆模板核酸分子包含至少70％与各预植入的固体载体连接的所有模板核酸分子。在一些实施例中，模板化固体载体是模板化珠粒，且测序包含在进行测序反应之前将珠粒分配在固体载体的孔中。在一些实施例中，固体载体群体的各预植入的固体载体具有在10与50,000个之间的与其连接的大体上单克隆模板核酸分子，且一种或多种固体载体是珠粒。在一些实施例中，预植入的反应混合物和/或模板反应混合物进一步包含重组酶辅助蛋白。在其它实施例中，重组酶辅助蛋白是单链结合蛋白和/或重组酶负载蛋白。在一些实施例中，在35℃与45℃之间的温度下，培育模板反应混合物和/或预植入反应混合物。在一些实施例中，培育模板反应混合物10到60分钟。在一些实施例中，存在于模板化固体载体上的大体上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的大体上单克隆模板核酸分子的至少100倍。
在一些实施例中，本公开大体上涉及组合物、以及关于组合物的系统、方法、试剂盒和设备，其中组合物包含含预植入的固体载体群体、核苷酸、重组酶和聚合酶的模板反应混合物，其中预植入的固体载体群体具有在10与50,000个之间的包含与其连接的第一引物的大体上单克隆模板核酸分子，且进一步包含所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与预植入的固体载体连接且不与模板核酸分子结合，其中反应混合物不包含能够起始重组酶-聚合酶扩增反应的阳离子，且其中反应混合物中的至少95％的模板核酸分子与一种或多种固体载体连接。在一些实施例中，模板核酸分子包含具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在一些实施例中，与预植入的固体载体连接和/或与模板化固体载体连接的大体上单克隆模板核酸分子包含具有两种或更多种不同序列的模板核酸分子。在一些实施例中，预植入的固体载体是预植入的珠粒。在一些实施例中，模板反应混合物包含重组酶辅助蛋白。在其它实施例中，重组酶辅助蛋白是单链结合蛋白和/或重组酶负载蛋白。在一些实施例中，使用第一重组酶-聚合酶扩增(RPA)反应，来产生预植入的固体载体。在其它实施例中，通过在35℃与45℃之间的温度下，培育RPA反应混合物2到5分钟，来进行第一RPA反应。在一些实施例中，预植入反应混合物进一步包含呈溶液形式的一致的第二引物群体，且模板核酸分子在第一末端处或附近包含第一引物的引物结合位点。在一些实施例中，模板反应混合物进一步包含能够起始重组酶-聚合酶扩增反应的阳离子。
在用于产生一种或多种模板化载体，例如本文提供的固体载体的方法的一些实施例中，与方法中所产生的模板化载体或载体连接的至少一些、大部分或所有核酸含有至少一个修饰的核苷酸，所述至少一个修饰的核苷酸包含与其连接的连接物，例如第一连接子部分。这类方法可进一步包括将模板化载体与磁性珠粒连接，所述磁性珠粒具有与模板化载体连接的核酸的修饰的核苷酸可通过修饰的核苷酸的连接物或连接子结合、连接(link)或连接(attach)的部分(例如结合伴侣或第二连接子部分)，从而形成模板化载体与磁性珠粒的珠粒组装件。在这些方法的一些实施例中，通过向珠粒组装件施加磁场，将珠粒组装件与不包含磁性珠粒的任何元件分开，从而将珠粒组装件与任何这类元件分开且形成富集的模板化载体群体。在所述方法的一些实施例中，使分开的珠粒组装件进一步置于从磁性珠粒释放模板化载体的条件下，且在其它方法，例如测序方法中进行分析。
本文还提供制备用于分析核酸，例如对核酸进行测序的装置的方法。在一些实施例中，所述方法包含：产生含有捕获序列部分、模板部分和含第一连接子部分的引物部分的核酸；例如通过杂交在具有与核酸的捕获序列部分互补的多个捕获引物的载体上捕获核酸，所述载体例如固体载体，如珠粒；将所捕获的核酸的第一连接子部分与磁性珠粒上所含的第二连接子部分连接，以形成载体上的所捕获核酸与磁性珠粒的珠粒组装件；向珠粒组装件施加磁场，从而将珠粒组装件与不包含磁性珠粒的任何元件分开；从磁性珠粒释放载体上的捕获核酸；将载体上所释放的捕获核酸与磁性珠粒混合，载体上的所捕获的核酸不与所述磁性珠粒连接(attach/link)或结合；和将混合物并入到用于分析所捕获核酸的装置中。在一些实施例中，将载体上的所捕获核酸与磁性珠粒的混合物涂覆于表面，例如芯片，如半导体芯片，且向表面施加磁场。所述表面可含有微孔，通过在向表面施加磁场时在表面上移动磁性珠粒而将载体上的所捕获核酸负载到微孔中。在一些这类实施例中，磁性珠粒的大小使得磁性珠粒不能进入微孔。
在制备用于分析核酸的装置的方法的一些实施例中，所述方法包含：产生含有捕获序列部分、模板部分和含第一连接子部分的引物部分的核酸；在具有与核酸的捕获序列部分互补的多个捕获引物的载体上捕获核酸，所述载体例如固体载体，如珠粒；将所捕获的核酸与具有第二连接子部分的磁性珠粒连接，以形成珠粒组装件，使得连接第一和第二连接子部分；和使用磁场将珠粒组装件负载到装置的孔中。
附图说明
图1A到1D是显示在大批等温扩增之后高通量测序中的读段长度的频率分布图。
图1A显示使用不具有预植入的模板的离子球形粒子(Ion Sphere Particle；ISP)(无模板对照(no template control(NTC))的读段长度。
图1B显示使用预植入有～70个拷贝/ISP的ISP的读段长度。
图1C显示使用预植入有～665个拷贝/ISP的ISP的读段长度。
图1D显示使用预植入有～4,170个拷贝/ISP的ISP的读段长度(图1D)。
图2A-2F是显示使用NTC P1 ISP和预植入有～70、～665和～4,170个拷贝/ISP的ISP，在大批等温扩增之后高通量测序的各种度量的条形图。
图2A显示NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的ISP负载百分比。
图2B显示来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的可使用读段的百分比。
图2C显示来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的的总读段的数量。
图2D显示来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的读段长度的平均值、中值和众数。
图2E显示NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的空孔百分比。
图2F显示NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的低质量孔百分比。
图3A-3F是显示使用不具有模板对照(NTC)的ISP和预植入有～82、～775和～5,400个拷贝/ISP的ISP，在预植入扩增反应之后，高通量测序的各种度量的条形图。
图3A显示NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的ISP负载百分比。
图3B显示来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的可使用读段的百分比。
图3C显示来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的的总读段的数量。
图3D显示来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的读段长度的平均值、中值和众数。
图3E显示预植入有不同模板拷贝数的ISP的空孔百分比。
图3F显示预植入有不同模板拷贝数的ISP的低质量孔百分比。
图4是显示模板核酸分子的上下链的引物延伸反应的示意图。
图5、图6和图7图示用于将核酸与珠粒连接的实例方案。
图8是用于制备测序装置的实例方法的图示。
图9图示用于将核酸与珠粒连接的实例方案的图示。
图10是使用若干不同方法，对于所产生的核酸模板进行的测序运行的结果的图。
提供以上所标识的图是代表性的且非限制性的。
定义
如本公开中所用，以下术语应理解为具有以下含义：
当提及一种或多种聚核苷酸群体使用时，术语“单克隆”和其变化形式是指聚核苷酸群体，其中在核苷酸序列水准上，约50-99％或至多100％的群体成员共享至少80％一致性。如本文所用，当提及一种或多种聚核苷酸群体使用时，短语“大体上单克隆”和其变化形式是指一种或多种聚核苷酸群体，其中所扩增的模板聚核苷酸分子是群体中单一最普遍的聚核苷酸。因此，单克隆或大体上单克隆群体的所有成员不一定完全一致或彼此互补。举例来说，可扩增或复制聚核苷酸模板的不同部分，以产生所得单克隆群体的成员；类似地，可在初始模板的扩增期间发生一定数量的“差错”和/或不完全延伸，从而产生其个别成员可在其自身中呈现序列可变性的单克隆或大体上单克隆群体。在一些实施例中，可在本发明传授内容的核酸扩增反应期间发生低或非大体上水准的非同源聚核苷酸的混合，且因此大体上单克隆群体可含有少数的一种或多种聚核苷酸(例如小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％或小于0.001％的多种多样的聚核苷酸)。在某些实例中，群体中的至少90％的聚核苷酸与用作扩增基础的初始单一模板至少90％一致，以产生大体上单克隆群体。在某些实施例中，用于扩增的方法产生聚核苷酸群体，其中至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的聚核苷酸群体成员与产生群体的模板核酸共享至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。在某些实施例中，用于扩增的方法产生聚核苷酸群体，其中足够的大部分聚核苷酸共享足够的序列一致性，以允许使用高通量测序系统对扩增模板的至少一部分进行测序。
在一些实施例中，至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％的与模板化载体连接的模板核酸分子的成员将与模板核酸分子共享大于90％、95％、97％、99％或100％一致性。在一些实施例中，使用任一种扩增方法产生的核酸群体的成员在高严格杂交条件下彼此进行杂交。
在一些实施例中，扩增方法产生大体上单克隆核酸分子群体，其包含充分少的多克隆杂质，使得其在高通量测序方法中成功进行测序。举例来说，扩增方法可产生大体上单克隆核酸分子群体，其产生使用特定测序系统检测到的信号(例如测序信号、核苷酸并入信号和其类似物)。任选地，随后可分析信号以正确地确定存在于群体的任何核酸分子内的任何一种或多种核苷酸的序列和/或碱基一致性。用于检测和/或分析这类信号的适合测序系统的实例包含Ion Torrent测序系统，如Ion Torrent PGMTM序列系统，包含314、316和318系统；Ion Torrent ProtonTM测序系统，包含Proton I(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)；和Ion Torrent ProtonTM测序系统，包含Ion S5和S5XL(Thermo FisherScientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)。在一些实施例中，单克隆扩增子准许在Ion Torrent测序系统上对至少5个连续核苷酸残基进行准确测序。
如本文所用，术语“克隆扩增”和其变化形式是指由此通过扩增聚核苷酸模板产生大体上单克隆聚核苷酸群体的任何方法。在克隆扩增的一些实施例中，扩增两种或更多种聚核苷酸模板以产生至少两个大体上单克隆聚核苷酸群体。
如本文所用，术语“包括(comprises/comprising)”、“包含(includes/including)”、“具有(has/having)”或其任何其它变化形式意图涵盖非排它性的包含。举例来说，包括一系列特征的过程、方法、物品或设备不必仅限于那些特征，但可包含未明确列出的或这种过程、方法、物品或设备所固有的其它特征。此外，除非明确相反地陈述，否则“或”是指包含性的或，而非排它性的或。举例来说，以下中的任一个均满足条件A或B：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，以及A和B两个均为真(或存在)。
此外，“一(a/an)”的使用是用来描述本文中所描述的要素和组分。这样做仅是为方便起见且给出本发明范围的一般性意义。除非明显意指其它情况，否则这种描述应被理解为包含一个或至少一个，且单数也包含复数。
从以下实施方式和权利要求书中，本公开的其它特征和优点将显而易见。
具体实施方式
在一些实施例中，本公开大体上涉及操纵核酸的方法以及用于进行所述方法的系统、组合物、试剂盒和设备。在一些实施例中，方法包含核苷酸聚合、核苷酸序列修饰(例如接合衔接子和/或引物序列，例如可裂解引物)、核苷酸修饰(例如向核酸分子中的一个或多个核苷酸添加标记或连接子分子(例如生物素))、核酸扩增、核酸捕获、核酸容纳(containment)和/或核酸转移。可使用本文提供的方法和组合物以例如产生单克隆或大体上单克隆的核酸群体。在一些实施例中，使用所述方法来产生单克隆或大体上单克隆的核酸群体，其中核酸与载体，例如固体载体连接。在一些实施例中，使用所述方法来将核酸与两种或更多种载体连接。在这类实施例中，两种或更多种载体可以相同或不同，包含例如聚合和/或磁性载体。在一些实施例中，使用所述方法来将与一种或多种载体连接的核酸转移到反应室。在一些实施例中，使用所述方法以在反应室或多个反应室内产生单克隆或大体上单克隆的核酸群体。可单独或以任何组合进行本文所提供的方法以用于任何一种或多种用途，且提供核酸分析方面的优点。举例来说，本文中所公开的方法和/或组合物的使用提供改进质量、数量和/或准确性的核酸分析结果，例如核酸测序结果。在另一个实例中，单独和/或以任何组合使用本文中所公开的方法和/或组合物，增强核酸操纵方法，以明显地促进核酸分析，例如核酸测序的工作流程自动化。
在一些实施例中，本公开大体上涉及改进高通量核酸测序结果的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备。所述方法、系统、组合物、试剂盒和设备并入用于产生、含有、分离、转移、复制和/或操纵大体上单克隆核酸群体的方法和组合物，所述方法和组合物是快速、有效且节约成本的同时实现相较于现有方法，显著地增加较长长度的高质量读段的生产与降低重复、非信息和/或库读段的数量和运行时间。在一些实施例中，所述方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备包含载体，例如固体载体，以约束、富集、掩蔽、分离、定位、扩增和/或转移可用于分析方法中的核酸。在一些实施例中，对载体预植入来自较大核酸集合(例如核酸库或样本)的一个或有限数量的主要大体上一致核酸，以提供分离的单一核酸分子或局部大体上单克隆群体。这类预植入的载体容易地被操纵且用作可例如在模板反应中克隆扩增的一致核酸的清洁来源，以产生相对纯的模板集合用于高通量测序工作流程，以改进测序结果。在一些实施例中，可至少部分地产生预植入的载体，且使用等温扩增，尤其重组酶介导的扩增反应，如重组酶-聚合酶扩增(RPA)来进行扩增。因此，在所述方法的说明性方面中，在高通量测序工作流程中的模板反应之前，进行预植入反应。
在典型的高通量测序工作流程中，使用样本中的核酸分子来制备适合于下游测序的模板核酸分子文库。可在文库制备之前、期间或之后，任选地对于核酸分子进行多重扩增。随后，将模板核酸分子文库扩增到用于测序反应的一种或多种载体上。在本公开的一些实施例中，固体载体上的模板的扩增通常是在两种或更多种反应中进行，包含例如一种或多种预植入反应，所述一种或多种预植入反应产生具有连接的大体上单克隆模板核酸分子群体的一种或多种预植入的载体；随后在预植入的载体上进行模板反应，所述模板反应在一种或多种载体上产生所连接的模板核酸分子的更多拷贝(例如至少多10×拷贝)。进行预植入反应和模板反应的优点是，这个工作流程在高通量测序反应中产生更高质量的测序读段。在一些实施例中，用封端的引物进行预植入反应，以防止在预植入反应期间形成引物二聚体扩增子。在先前方法中，在模板期间可产生引物二聚体扩增子，这可产生较低质量的测序读段和降低来自模板核酸分子的测序读段的数量。因此，添加单独预植入反应提供相对于先前方法的这个和大量其它优点。
在一些实施例中，本公开大体上涉及用于扩增模板核酸分子的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，其包含使用预植入的载体的模板反应混合物。在各种方面中，使用模板化载体来进行下游测序方法。模板反应通常使用重组酶来使双链模板核酸分子变性，且是在等温温度下用适合于RPA反应的聚合酶进行。在一些方面中，在单独预植入反应混合物中产生预植入的载体。
预植入，在本文中也被称作植入，涉及将一或多种核酸分子与载体连接。在一些实施例中，所述连接设计成产生具有与其连接的单一核酸分子的单一载体。在一些实施例中，所述连接设计成将其与核酸分子的多个拷贝连接和/或与多个不同核酸连接。在一些实施例中，所述连接设计成将其与大体上相同核酸的有限数量的多个拷贝连接，以产生核酸的大体上单克隆群体。
在一些实施例中，本文提供的预植入(或植入)方法包含将单链核酸分子与同载体结合且固定于所述载体上的互补核酸，例如寡核苷酸杂交。这类方法在退火条件下进行通常较短时段。在一些实施例中，植入方法涉及在其中固体载体，例如珠粒将仅与一个单链核酸分子连接的条件下杂交。这类条件包含使单链核酸(例如来自核酸文库或样本)群体与大量过量的载体在退火条件下接触。
在一些实施例中，本文提供的预植入(或植入)方法包含通过杂交将核酸与载体连接且在同时扩增所连接的核酸到低水准，例如约20拷贝的组合过程。在这些实施例中，预植入反应混合物通常包含模板核酸分子群体、聚合酶、核苷酸、第一引物群体和如二价阳离子的辅因子。所属领域的技术人员将理解，各种方法可用于用大体上单克隆模板核酸分子预植入固体载体。作为非限制性实例，可使用RPA反应、模板步移反应、PCR、乳化液PCR或桥式PCR来进行预植入反应混合物。可在溶液中大批进行预植入反应和/或模板反应。此外，预植入反应混合物和/或模板反应混合物可包含：与一种或多种载体连接的第一通用引物；呈溶液形式的第二通用引物(可溶性第二通用引物)；和多个模板核酸分子，其中个别模板核酸分子与可在文库制备期间添加的至少一个通用引物结合序列接合，且其中通用引物结合序列结合第一和任选的第二通用引物。在一些实施例中，在孔中进行预植入反应和/或模板反应。在说明性实例中，使用连续RPA反应进行预植入反应和模板反应，其中在预植入反应之后在进行模板反应之前，洗掉模板核酸分子。
将修饰具有核酸分子的载体，例如珠粒负载到受约束的区域或容器(receptacle)，如微孔或凹坑中，以形成呈现若干核酸测序优点的阵列。以有组织的紧密封装方式放置核酸涂覆的珠粒，例如放置到小微孔中，可增加每循环的通量且降低客户成本。随着微孔的密度增加或随着微孔大小减小，珠粒负载变得困难，从而产生许多空的微孔且降低孔中的珠粒计数。太多的空微孔使得碱基读段的数量降低且因此测序性能不佳。在一些实施例中，本文提供将载体，如固体载体，例如珠粒，引入到微孔或反应室中的方法、以及用于所述方法中的系统、组合物、试剂盒和设备。在一些实施例中，所述方法包含将具有修饰具有连接子部分的所捕获模板核酸的珠粒载体与具有互补连接子部分的磁性珠粒连接，以形成珠粒组装件，和使用磁场将珠粒组装件负载到孔中。可使珠粒组装件变性以释放磁性珠粒，使得珠粒载体与孔中的靶核酸连接。可例如在制备用于核酸测序的装置中使用这类方法。在一实施例中，在孔中进行的反应可以是用来鉴定或确定所关注的分析物的特征或特性的分析反应。这类反应可直接或间接产生提供可指示分析物是否以特征方式反应的信号的副产物。如果这类副产物少量产生或快速衰减或与其它成分反应，那么可同时在孔中分析相同分析物的多个拷贝，以便增加所产生的输出信号。在本文所提供的方法的一实施例中，可在置于孔中之前或之后，将分析物，例如核酸的多个拷贝与固相载体连接。举例来说，可在微孔中扩增靶核酸，以提供适用于靶核酸测序的靶核酸的克隆群体。固相载体可以是例如包括凝胶或类似物的微米粒子、纳米粒子、珠粒、固体或多孔。为了简化和便于说明，固相载体在本文中也被称作粒子或珠粒。对于核酸分析物来说，可通过滚环扩增(rolling circle amplification；RCA)、指数RCA或类似技术制备多个相连接的拷贝，以在不需要固体载体的情况下产生扩增子。
在一些实施例中，本公开大体上涉及用于产生一种或多种模板化固体载体的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，其包含：a)通过将一种或多种预植入的固体载体、核苷酸、重组酶和聚合酶组合形成模板反应混合物，其中一种或多种预植入的固体载体包含所连接大体上一致的第一引物群体且具有与其连接的大体上单克隆模板核酸分子，其中大体上单克隆模板核酸分子包含含第一引物的近侧区段，其中近侧区段在第一引物处将模板核酸区段与固体载体连接，且其中预植入的固体载体进一步包含所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与预植入的固体载体连接且不与模板核酸分子结合，其中模板反应混合物进一步包含大体上一致的可溶性第二引物群体，且其中模板核酸分子在近侧区段相反的末端处或其附近包含第二引物的引物结合位点；和b)通过向模板反应混合物添加阳离子进行模板反应，和在等温条件下培育反应混合物至少10分钟，以在模板反应中扩增模板核酸分子来产生一种或多种模板化固体载体。在一些实施例中，所述方法提供模板化固体载体，其中各载体包含至少100,000个大体上单克隆模板核酸分子。通常，模板核酸分子不以溶液形式包含在模板反应混合物中。因此，当起始模板反应时，模板核酸分子通常以溶液形式存在于反应混合物中。通常在与模板反应分开的预植入反应中产生预植入的固体载体。在一些实施例中，通过不包含100或更多个相同核苷酸的近侧区段，模板核酸与固体载体连接。在一些实施例中，近侧区段不包含大于2、3、4、5、6、7、8、9或10个相同核苷酸的连续序列。在以上方面的一些实施例中，在测序反应中使用一种或多种模板化固体载体，以测定模板核酸分子的序列。
在一些实施例中，本公开大体上涉及用于测定模板核酸分子的序列的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，其包含：a)产生包含所连接的大体上一致的第一引物群体的预植入的固体载体群体，其中预植入的固体载体是在预植入条件下产生，且其中预植入的固体载体中的每一个具有在10与100,000个之间的包含与其连接的第一引物的大体上单克隆模板核酸分子，且进一步包含所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与预植入的固体载体连接且不与模板核酸分子结合；b)通过将预植入的固体载体群体、核苷酸、重组酶和聚合酶组合形成模板反应混合物；c)通过向模板反应混合物添加阳离子起始模板反应，其中当起始模板反应时，模板核酸分子不以溶液形式存在于反应混合物中；d)在等温条件下培育已起始的模板反应混合物至少10分钟，以在模板反应中扩增模板分子来产生一种或多种模板化固体载体，所述模板化固体载体上包含的所连接的大体上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的至少10倍；和d)对于一种或多种模板化固体载体上的模板核酸分子进行测序，从而测定模板核酸分子的序列。
在一些实施例中，本公开大体上涉及用于测定模板核酸分子的序列的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，其包含：a)通过在预植入反应条件下，培育包含模板核酸分子群体和含所连接的大体上一致的第一引物群体的固体载体群体的重组酶-聚合酶扩增(RPA)反应混合物来进行预植入反应，以产生一种或多种预植入的固体载体，所述一种或多种预植入的固体载体包含通过第一引物与固体载体连接的模板核酸分子的大体上单克隆群体和所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与预植入的固体载体连接且不与模板核酸分子结合，其中预植入反应条件包含在等温条件下培育RPA反应混合物，其中预植入的固体载体各自具有在10与100,000个之间的与其连接的大体上单克隆核酸分子，和/或预植入反应条件包含在等温条件下培育RPA反应混合物2到5分钟；b)通过使RPA反应混合物中包含一种或多种预植入的固体载体形成模板反应混合物，其中不与预植入的固体载体结合的模板核酸分子不包含在模板反应混合物中；c)通过向模板反应混合物添加阳离子起始模板反应；d)在等温条件下培育已起始的模板反应混合物至少10分钟，以在模板反应中扩增模板核酸分子来产生一种或多种模板化固体载体，所述模板化固体载体上包含的大体上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的至少10倍；和e)对于一种或多种模板化固体载体上的模板核酸分子进行测序，从而测定模板核酸分子的序列。
在一些实施例中，所述多个模板核酸分子包含具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在一些实施例中，与预植入的固体载体连接和/或与模板化固体载体连接的大体上单克隆模板核酸分子包含具有两种或更多种不同序列的模板核酸分子。大体上单克隆模板核酸分子通常通过引物与固体载体连接，所述引物可包含连续相同核苷酸、或无连续相同核苷酸或不大于2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续核苷酸；或通过包含连续非相同核苷酸的引物与固体载体连接。然而，模板核酸的近侧区段包含少于100个相同核苷酸，所述近侧区段是与固体载体连接的区段且通常是引物。在一些实施例中，模板化固体载体是模板化珠粒，且测序包含在进行测序反应之前将珠粒分配在固体载体的孔中。在说明性实例中，固体载体群体中的各预植入的固体载体可具有例如在10与50,000个之间或在100与25,000个之间的与其连接的大体上单克隆模板核酸分子。在说明性实例中，预植入反应混合物和/或模板反应混合物进一步包含呈溶液形式的一致的第二引物群体。在这些实例中，模板核酸分子通常包含在第一末端处或附近的第一引物的引物结合位点和在其它末端处或附近的第二引物的引物结合位点。
在另一方面中，模板反应混合物包含预植入的固体载体群体、核苷酸、重组酶和聚合酶，其中预植入的固体载体群体具有在10与50,000个之间的包含与其连接的第一引物的大体上单克隆模板核酸分子且进一步包含不与模板核酸分子结合的所连接的第一引物，其中反应混合物不包含能够起始重组酶-聚合酶扩增反应的阳离子，且其中反应混合物中至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％的模板核酸分子与一种或多种固体载体连接。
在一些实施例中，使用预植入反应混合物，在预植入反应期间形成一种或多种预植入的载体。在一些实施例中，预植入反应混合物包含以下中的一些或全部：模板核酸分子群体、一种或多种载体、聚合酶、第一引物群体、核苷酸和二价阳离子。在一些实施例中，第一引物群体与一种或多种载体连接。在本发明传授内容中的任一实施例，预植入反应混合物进一步包含第二引物和任选地扩散限制性药剂。在说明性实施例中，第二引物在溶液中。在说明性实施例中，预植入反应混合物包含重组酶和任选地重组酶辅助蛋白。
在一些实施例中，通过采用核酸扩增，使用以下来进行预植入和/或模板反应：(i)多个核酸分子，其包含靶序列和一种或多种通用衔接子序列；(ii)多个可溶性正向引物；(iii)多个可溶性反向封端的带尾引物；和(iv)其上固定有捕获引物的多个固体载体，所述捕获引物与通用衔接子序列杂交。在一些实施例中，在具有含相同或不同靶序列的多个核酸分子的单一反应混合物中，进行预植入和/或模板反应。在一些实施例中，从样本产生的个别核酸分子包含在末端处与至少一个通用衔接子序列(例如A-衔接子和/或P1-衔接子序列)接合的靶序列。在一些实施例中，核酸分子是具有互补上下链的双链分子。在一些实施例中，使用与衔接子序列杂交的正向和反向可溶性引物，进行预植入反应，以扩增核酸分子且将核酸分子的大体上单克隆拷贝与固体载体连接(参见图4)。尽管图4描绘单一反应混合物内的单一双链核酸分子和单一珠粒的一系列反应，但所属领域的技术人员应了解，相同单一反应混合物含有进行同一系列反应的多个双链核酸分子和多个珠粒，以产生各自与靶序列的大体上单克隆群体连接的至少两种珠粒。另外，所属领域的技术人员应了解，珠粒可连接多个B捕获引物。此外，图4的下侧描绘与B捕获引物结合的生物素标记的引物延伸产物，但所属领域的技术人员应了解，非生物素标记的引物延伸产物可结合B捕获引物。所属领域的技术人员也应了解，生物素标记和非生物素标记的引物延伸产物的混合物可与同珠粒连接的多个B捕获引物连接。在一些实施例中，单一反应混合物含有多个核酸分子，其中具有相同或不同靶序列的个别核酸分子与至少一个通用衔接子序列连接。现参考图4，使具有上下链的核酸分子变性，且在使用可溶性引物(例如可溶性A引物)和可溶性封端的带尾引物(例如可溶性封端的带尾P1/B引物)的引物延伸反应中，使用分开的上下链，以在预植入和/或模板反应期间，产生具有可结合所固定的B引物的衔接子序列的多个引物延伸产物。如图4中所示，归因于上下链的不同序列和取向与所使用引物的差异，引物延伸反应产生两条链的不同产物。
在一些实施例中，在第一引物延伸反应中，使用结合A引物结合位点的可溶性引物，产生下链的互补链。出于说明的目的，在图4(左侧)中，可溶性A'引物与A衔接子序列互补。在一些实施例中，使用具有变化长度的可溶性A'引物的混合物来进行第一引物延伸反应。可溶性A'引物的混合物的其5'端、3'端或5'和3'端两个处的长度可变化。举例来说，引物混合物S(具有或不具有5'生物素加合物(在图4中描述为“Bio”)的A'引物的混合物，所述A'引物可包含各种长度的5'非互补序列的，且可用于引物延伸反应中，以视使用哪种可溶性A'引物来进行第一引物延伸反应而定，产生若干可能的第一延伸产物中的一个(图4左侧)。举例来说，在5'到3'方向上，第一延伸产物含有互补A-衔接子序列(在图4左侧中显示为A')、互补下序列(在图4左侧中显示为下'(bottom'))和互补P1序列(在图4左侧中显示为P1')。在一些实施例中，在第二引物延伸反应中，第一延伸产物中的新合成的P1'序列可与可溶性P1引物结合，以允许从第一引物延伸产物的P1'序列的3'端进行引物延伸。可溶性P1引物可以是带尾引物。可溶性P1引物可在其3'端处携带封端部分，其中所述封端部分可抑制从引物的3'端进行引物延伸。可溶性P1引物可以是反向带尾P1引物，其包含所连接的5'B衔接子序列，使得使用带尾引物P1作为模板，第一延伸产物的引物延伸引起向3'端添加B序列的互补序列(在图4左侧中描述为B')。在说明性实施例中，可溶性P1引物可具有3'封端端(在图4左侧中，显示为带圈的“X”)，以防止从可溶性P1引物的3'端延伸(图4左侧)。视在第一延伸反应中使用哪种可溶性A'引物而定，第二引物延伸反应可产生具有各种长度的多个第二延伸产物。在5'到3'方向上，多个第二延伸产物含有互补A-衔接子序列(在图4左侧中显示为A')、互补下链序列(在图4左侧中显示为下')、互补P1序列(在图4左侧中显示为P1')和互补B衔接子序列(在图4左侧中显示为B')。第二引物延伸产物可包含或缺乏5'生物素加合物(图4左侧)。第二延伸反应可产生多个第二延伸产物，所述多个第二延伸产物具有不同长度，且可包含或缺乏生物素加合物，且包含B'衔接子序列。这些第二延伸产物中的任一个可与固定于固体表面(珠粒)的B捕获序列结合/杂交。所固定的B引物可进行第三引物延伸反应，从而产生固定于珠粒且与第二延伸产物互补的第三延伸产物(图4下侧)。
现参考图4(右侧)，其描绘双链核酸进行变性和上链的一系列反应。在一些实施例中，上链的P1'衔接子序列可结合可溶性P1引物，且进行第一引物延伸反应，以产生第一延伸产物(图4右侧)。在一些实施例中，可溶性P1引物是带尾引物。可溶性P1引物可在其3'端处携带封端部分，其中所述封端部分可抑制从引物的3'端进行引物延伸(图4右侧)。可溶性P1引物可以是带尾P1引物，其包含所连接的5'B衔接子序列，使得使用带尾引物P1作为模板，引物延伸引起向第一延伸产物的3'端添加B序列的互补序列(B')(图4右侧)。在说明性实施例中，可溶性P1引物可具有3'封端端(在图4右侧中，显示为带圈的“X”)，以防止从P1引物的3'端延伸(图4右侧)。第一引物延伸反应产生多个第一延伸产物，所述多个第一延伸产物在5'到3'方向上含有A'衔接子序列、上链序列、P1'衔接子序列和B'衔接子序列(图4右侧)。包含B'衔接子序列的第一延伸产物可与固定于固体表面(珠粒)的B捕获序列结合/杂交。所固定的B引物可进行第二引物延伸反应，从而产生固定于珠粒且与第一延伸产物互补的第二延伸产物(图4下侧)。
在一些实施例中，可如图5所图示进行预植入(或植入)反应。在这个实例中，在具有捕获引物的珠粒载体存在下，扩增靶聚核苷酸B-A'和其互补序列模板聚核苷酸(A-B')。靶聚核苷酸具有与同珠粒载体偶联的捕获引物的序列相同或大体类似的捕获部分(B)。大体上类似序列是其互补序列可与大体上类似序列中的每一个杂交的序列。珠粒载体可具有与靶聚核苷酸的B部分的序列相同的序列或大体类似的序列的捕获引物，以准许靶聚核苷酸的捕获部分(B)的互补序列与同珠粒载体连接的捕获引物杂交。任选地，靶聚核苷酸可包含与靶聚核苷酸的捕获部分(B)相邻的第二引物位置(P1)，且可进一步包含与引物相邻且通过互补序列部分(A')与靶聚核苷酸的测序引物部分(A)结合的靶区域。当在包含捕获引物的珠粒载体存在下扩增时，与靶聚核苷酸互补的模板聚核苷酸可与捕获引物(B)杂交。靶聚核苷酸可残留于溶液中。系统可进行延伸，其中使与模板聚核苷酸互补的捕获引物B延伸，得到与珠粒载体结合的靶序列。可在游离引物(B)、珠粒载体和具有与其连接的连接子部分(L)的游离修饰的测序引物(A)存在下，进行其它扩增。引物(B)和修饰的引物(L-A)可干扰游离浮动靶聚核苷酸和模板聚核苷酸，妨碍其与珠粒载体结合和彼此结合。特定来说，具有与其连接的连接子部分的修饰的测序引物(A)可与同珠粒载体连接的靶聚核苷酸的互补部分(A')杂交。任选地，可使与靶聚核苷酸杂交的连接子修饰的测序引物L-A延伸，形成连接子修饰的模板聚核苷酸。这类连接子修饰的模板聚核苷酸与同珠粒载体连接的靶核酸杂交，所述靶核酸随后可由磁性珠粒捕获且用于测序装置的磁性负载。可使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；PCR)扩增、重组酶聚合酶扩增(RPA)或其它扩增技术，进行扩增或延伸。在特定实例中，使用PCR扩增进行图5中图示的方案的每一步骤。
在一些实施例中，可如图6中所图示进行预植入(或植入)反应。在这个实例中，替代方案包含靶聚核苷酸(P1-A')和其互补序列模板聚核苷酸(A-P1')。在包含连接子修饰的测序引物(L-A)和具有含捕获引物(B)的序列的部分的截短的P1引物(trP1)的溶液中，扩增靶聚核苷酸和模板聚核苷酸。在实例中，截短的P1引物(trP1)包含P1序列的子集或所有序列P1。随后在连接子修饰的测序引物(L-A)和截短的P1引物(trP1-B)存在下扩增期间，单一物种702包含可操作以与具有捕获引物(B)的珠粒载体杂交的连接子修饰的模板聚核苷酸(L-A-B')。因此，连接子修饰的模板聚核苷酸(L-A-B')与珠粒上的捕获引物(B)杂交，且延伸以形成与珠粒载体连接的靶聚核苷酸(B-A')。可使用与连接珠粒的靶聚核苷酸杂交的连接子修饰的模板聚核苷酸来与磁性珠粒连接，其例如可用于实施将珠粒磁性负载到测序装置中和/或用于富集与珠粒连接的核酸。连接子修饰的模板聚核苷酸的连接子部分可采用各种形式，如生物素，其可与同磁性珠粒连接的连接子部分结合，如抗生蛋白链菌素。可使用PCR、RPA或其它扩增技术，来进行扩增反应中的每一个。在图6中示出的实例中，可使用三个聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；PCR)循环来实施方案。这系列的PCR反应产生较高百分比的具有与其连接的单一靶聚核苷酸的珠粒载体。因此，可在测序装置中的孔中产生更多单克隆群体。
在一些实施例中，可如图7中所图示进行预植入(或植入)反应。在这个实例中，所述反应设计成从一系列扩增循环产生所需的珠粒连接的核酸分子，其中仅一种扩增产物(其是所需的靶核酸)将与珠粒连接。所需的靶标含有与核酸的5'端连接的连接子部分，例如生物素(在图7中，用字母“L”标记)；和在3'端处与固定于珠粒上的引物(在图7中，用字母“B”标记)互补的衔接子核苷酸序列(在图7中，用字母“B'”标记)。相比之下，图6所示的方法产生与珠粒杂交的两种核酸扩增产物，其中仅一种具有所需的连接子部分。在产生仅一种将与珠粒连接的扩增产物方面，这种方法避免产生不含有所需靶核酸(例如将不用于下游分析的缺乏连接子部分)的核酸的珠粒。因此，这种方法避免浪费珠粒和核酸，且确保仅单一核酸靶分子将与杂交，所述珠粒是维持高水准单克隆，随后使用仅具有一个与其结合的核酸模板的珠粒进行模板扩增所需的。如图7中所示，双链文库核酸含有在5'端处的A衔接子序列和在3'端处的P1衔接子序列(标准Ion Torrent A和P1文库衔接子；Thermo FisherScientific)。在扩增中所使用的引物是生物素标记的引物A(正向引物)和反向引物，所述反向引物是trP1和B引物的融合物(trP1是Ion P1衔接子的23聚体区段，其具有序列CCTCTC TAT GGG CAG TCG GTG AT；SEQ ID NO:1)。B引物序列与固定于珠粒上的B引物的序列一致。trP1-B融合引物将在接近于文库插入序列的文库核酸分子的P1衔接子序列的内部部分处杂交和引发，且不在文库核酸的极限3'端处与P1衔接子序列的其余部分杂交。这在trP1-B引物序列与文库核酸上的P1衔接子的极限3'端部分之间形成错配端。如图7中所示，在两个扩增(例如PCR)循环之后，尽管产生四个扩增产物，但仅一个产物将能够植入(或杂交)珠粒(例如离子球形粒子)。因此，在扩增产物的随后变性后，仅一个产物的单链将与珠粒上的B引物杂交。这个引物可延伸，以形成双链模板核酸，其中一条链含有可例如用于将珠粒结合的核酸与用于孔的富集和/或磁性负载的磁性珠粒结合的连接子部分。
在一些实施例中，在使用可溶性封端的带尾P1/B引物进行预植入和/或模板反应(例如如图4中所描绘)之后，使用抗生蛋白链菌素珠粒来富集与携带生物素加合物的靶核酸分子连接的珠粒。在一些实施例中，例如在大规模平行测序反应中，对与靶核酸连接且根据图4中所描绘的一系列反应产生的珠粒(已富集或未富集)进行测序。在一些实施例中，将与靶核酸分子连接的珠粒(已富集或未富集)置于耦接到场效应晶体管(field effecttransistor；FET)或离子敏感性场效应传感器(ion-sensitive field effect sensor；ISFE)的反应室阵列上，且对靶核酸分子进行测序。
在一些实施例中，模板核酸分子是来源于来自天然或非天然来源的样本。在一些实施例中，样本中的核酸分子是来源于活生物体或细胞。可使用任何核酸分子，例如样本可包含覆盖来自活生物体或细胞的部分或全部基因组、mRNA或miRNA的基因组DNA。在其它实施例中，模板核酸分子是合成或重组的。在一些实施例中，样本含有具有大体上一致序列或具有不同序列的混合物的核酸分子。通常使用在活细胞内产生且由活细胞产生的核酸分子来进行说明性实施例。这类核酸分子通常是直接从天然来源，如细胞或体液分离，无需任何活体外扩增。因此，样本核酸分子直接用于后续步骤中。在一些实施例中，样本中的核酸分子可包含具有不同序列的两种或更多种核酸分子。
从样本制备模板核酸分子的各种方法是所属领域中已知的，且可用于预植入和/或模板方法、以及系统、组合物、试剂盒和/或设备的任一方面中。在一些实施例中，核酸分子呈片段或未片段化形式存在于样本中。在任一个所公开的实施例中，样本中的核酸分子是片段化的，或在用于预植入反应之前进一步片段化以产生具有任何选择长度的核酸分子。所属领域的技术人员将辨识用于进行这类片段化来获得在所选择长度范围内的片段的方法。举例来说，可使用以下方法将核酸分子片段化：物理方法，如超声处理；酶促方法，如通过DNA酶I或限制性核酸内切酶消化；或化学方法，如在二价金属阳离子存在下加热。在一些实施例中，将样本中的核酸分子片段化，以产生具有任何选择长度的核酸分子。所属领域的技术人员将辨识用于进行这类片段化来实现一系列选择长度的方法。在其它实施例中，使用在所属领域中已知的方法，选择在范围选择长度内的核酸。在一些方面中，使用在所属领域中已知的方法，选择特定大小范围的核酸分子或核酸片段。在一些实施例中，核酸分子或片段的长度在约2与10,000个核苷酸之间，例如长度在约2与5,000个核苷酸之间、在约2与3,000个核苷酸之间或在约2与2,000个核苷酸之间。
在一些实施例中，本公开大体上涉及方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，来自样本的核酸分子用作高通量测序工作流程的一部分，以便产生模板核酸分子文库。在一些实施例中，使用本发明传授内容中的任一种扩增方法扩增的不同模板核酸分子的群体，包含在一个或两个末端具有核酸衔接子序列的模板核酸分子的文库。举例来说，文库中的模板核酸分子可包含第一和第二末端，其中第一末端与第一核酸衔接子接合。文库中的模板核酸分子还可包含与第二核酸衔接子接合的第二末端。可将第一和第二核酸衔接子接合或以其它方式引入到模板核酸分子中。可将衔接子接合或以其它方式引入到直链模板的末端或直链或环状模板核酸分子的主体内。任选地，模板核酸分子可在接合或引入衔接子之后环化。在一些实施例中，将第一衔接子接合或引入到直链模板的第一末端，且将第二衔接子接合或引入到模板的第二末端。第一和第二衔接子可具有相同或不同序列。第一和第二衔接子可具有相同或不同的引物结合序列。在一些实施例中，第一或第二核酸衔接子的至少一部分(即，如文库中的模板核酸分子的一部分)可与第一引物杂交，所述第一引物是通用引物。
核酸分子可具有在进一步文库制备之前可修复的5'和/或3'突出端。在说明性实施例中，使用在所属领域中已知的方法，修复具有5'和3'突出端的模板核酸分子，以产生平端样本核酸分子。举例来说，在适当缓冲液中，Klenow大片段聚合酶的聚合酶和核酸外切酶活性可用于填补5'突出端且去除核酸分子上的3'突出端。在一些实施例中，使用聚核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase；PNK)和所属领域的技术人员将理解的反应条件，在所修复的核酸分子的5'端添加磷酸。在其它说明性实施例中，向双链分子的一条链添加单个核苷酸或多个核苷酸，以产生“粘性末端”。举例来说，可在核酸分子的3'端上连接腺苷(A)(加A尾)。在一些实施例中，可使用除A突出端以外的其它粘性末端。在一些实施例中，添加其它衔接子，例如环形接合衔接子。在一些实施例中，在PCR步骤期间添加衔接子。在本发明传授内容的任一个实施例中，不进行、进行这些修饰的所有或任何组合。用于产生用于后续测序的模板核酸分子群体的许多试剂盒和方法是所属领域中已知的。这类试剂盒将通常进行修饰以包含为本发明传授内容的方法和组合物的扩增和测序步骤所定制的衔接子。也可使用可商购的试剂盒，如Agilent SureSelect试剂盒(Agilent)中存在的接合试剂盒，来进行衔接子接合。
在一些实施例中，扩增方法任选地包含在文库制备之前、期间或之后且在预植入反应之前的靶标富集步骤。可例如通过多重核酸扩增或杂交来富集包含靶基因座或所关注区域的靶核酸分子。进行多重核酸扩增以产生扩增子的各种方法(如多重PCR)是所属领域中已知的，且可用于本发明传授内容的任一个实施例中。在向预植入反应混合物中添加模板核酸分子之前，可通过任何方法进行富集，随后进行通用扩增反应。本发明传授内容的任一实施例包含富集多个至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个靶核酸分子、靶基因座或所关注区域。在任一个所公开的实施例中，靶基因座或所关注区域是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1,000个核苷酸长，且包含模板核酸分子的一部分或全部。在其它实施例中，靶基因座或所关注区域的长度在约1与10,000个核苷酸之间，例如长度在约2与5,000个核苷酸之间、在约2与3,000个核苷酸之间或在约2与2,000个核苷酸之间。在本发明传授内容的任一个实施例中，多重核酸扩增包含产生至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个各靶核酸分子、靶基因座或所关注区域的拷贝。在任一个所公开的实施例中，用于预植入的方法、以及相关组合物、系统、试剂盒和设备包含使用来自预植入反应中的多重核酸扩增的扩增子产生预植入的固体载体群体。
在一些实施例中，在文库制备和任选的富集步骤之后，将模板核酸分子文库模板化到一种或多种载体上。在本公开中，通常在以下两个反应中将一种或多种载体模板化：预植入反应，以产生预植入的固体载体；和使用一种或多种预植入的载体进行模板反应，以进一步扩增所连接的模板核酸分子。预植入反应通常是扩增反应，且可使用所属领域的技术人员将理解的各种方法进行。举例来说，预植入反应可在RPA反应、模板步移反应或PCR中进行。在RPA反应中，在引物和核苷酸存在下，使用重组酶、聚合酶和任选地重组酶辅助蛋白，来扩增模板核酸分子。重组酶和任选地重组酶辅助蛋白可解离至少一部分的双链模板核酸分子，以使得引物杂交，随后聚合酶可结合以起始复制。在一些实施例中，重组酶辅助蛋白是防止解离的模板核酸分子再杂交的单链结合蛋白(single-stranded binding protein；SSB)。通常，在等温温度下进行RPA反应。在模板步移反应中，在允许至少一部分的双链模板核酸分子解离使得引物可杂交和聚合酶可随后结合以起始复制的反应条件中，在引物和核苷酸存在下，使用聚合酶来扩增模板核酸分子。在PCR中，通过热循环，使双链模板核酸分子解离。在冷却之后，引物与互补序列结合，且可用于通过聚合酶进行复制。在本发明传授内容的任一个方面中，在预植入反应混合物中进行预植入反应，所述预植入反应混合物是由扩增模板核酸分子所必需的组分形成。在所公开的任一个方面中，预植入反应混合物包含以下中的一些或全部：模板核酸分子群体、聚合酶、具有所连接的第一引物群体的一种或多种固体载体、核苷酸和辅因子(如二价阳离子)。在一些实施例中，预植入反应混合物进一步包含第二引物和任选地扩散限制性药剂。在一些实施例中，模板核酸分子群体包括与同第一或第二引物杂交的至少一个衔接子序列接合的模板核酸分子。在一些实施例中，如在乳化液RPA或乳化液PCR中，反应混合物形成乳化液。在通过RPA反应进行的预植入反应中，预植入反应混合物包含重组酶和任选地重组酶辅助蛋白。本文中进一步详细论述反应混合物的各种组分。
在一些实施例中，预植入反应混合物包含通常来源于文库制备或靶标富集的模板核酸分子群体。在一些实施例中，模板核酸分子或模板核酸分子群体是模板核酸分子文库的至少一些和通常所有成员。在一些实施例中，预植入反应混合物包含至少一种模板核酸分子。在一些实施例中，预植入反应混合物包含具有不同序列的至少两种模板核酸分子。在说明性实施例中，预植入反应混合物包含具有不同序列的模板核酸分子群体。在一些实施例中，预植入反应混合物包含大体上单克隆模板核酸分子群体。在本发明传授内容的任一个实施例中，当模板核酸分子在本文中替代地提及时，模板核酸分子是聚核苷酸，(模板核酸分子在本文中可互换地称为模板或核酸模板或聚核苷酸模板)。在不同实施例中，模板核酸分子是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物的聚合物。在一些实施例中，聚核苷酸是天然存在的、合成、重组、克隆、扩增、未扩增或存档(例如保藏)形式。在一些实施例中，聚核苷酸是DNA、cDNA、RNA或嵌合RNA/DNA和核酸类似物。
待扩增的模板核酸分子可以是双链，或在预植入反应之前使用适当程序使其是至少部分地双链的。在一些实施例中，模板是直链。替代地，模板可以是环状，或包含直链和环状区域的组合。在一些实施例中，扩增包含形成部分变性的模板。举例来说，扩增可包含使双链模板核酸分子部分地变性。任选地，部分地变性包含使双链模板核酸分子经受部分地变性条件。在一些实施例中，部分变性的模板包含单链部分和双链部分。在一些实施例中，单链部分包含第一引物结合序列。在一些实施例中，单链部分包含第二引物结合序列。在一些实施例中，单链部分包含第一引物结合序列和第二引物结合序列。
任选地，双链模板核酸分子包含正向链。双链模板核酸分子可进一步包含反向链。正向链任选地包含第一引物结合序列。反向链任选地包含第二引物结合序列。如上文所公开，通常在文库制备期间，连接引物结合序列。在一些实施例中，模板核酸分子已经包含第一引物结合序列和任选地第二引物结合序列。替代地，模板核酸分子任选地最初不包含引物结合序列，且文库制备可任选地包含将引物结合序列连接或引入到模板，如上文所公开。
在一些实施例中，模板核酸分子包含单链或双链聚核苷酸，或两个的混合物。在一些实施例中，模板核酸分子包含具有相同或不同核苷酸序列的聚核苷酸。在一些实施例中，模板核酸分子包含具有相同或不同长度的聚核苷酸。在不同实施例中，预植入反应混合物包含在约2与1012个之间的不同模板核酸分子，例如在约2与1011个之间的不同模板核酸分子、在约2与1010个之间的不同模板核酸分子、在约2与109个之间的不同模板核酸分子、在约2与108个之间的不同模板核酸分子、在约2与107个之间的不同模板核酸分子、在约2与106个之间的不同模板核酸分子或在约2与500,000个之间的不同模板核酸分子。在任一个所公开的实施例中，反应混合物包含在5×106与1010个之间的固体载体。固体载体可具有50微米或更小的最小横截面长度(例如直径)，优选地10微米或更小、3微米或更小、大致1微米或更小、大致0.5微米或更小，例如大致0.1、0.2、0.3或0.4微米或更小(例如小于1纳米，约1-10纳米、约10-100纳米或约100-500纳米)。在本发明传授内容的任一个实施例中，预植入反应混合物和/或模板反应混合物的体积是在约50与2,000μl之间，例如在约50与1,500μl之间、在约50与1,000μl之间、在约50与500μl之间、在约50与250μl之间或在约50与150μl之间。
进行预植入反应，以产生一种或多种预植入的载体。因此，在任一个所公开的方面中，预植入反应混合物可包含与模板核酸分子连接的一种或多种固体或半固体载体。如本文所用，固体或半固体载体还可以指具有可在下游测序方法中清楚地分析的连接位点的一种载体。在说明性实施例中，一种或多种载体包含所连接的大体上一致的第一引物群体。在一些实施例中，反应混合物中的至少一种模板核酸分子包含第一引物结合序列。第一引物结合序列可与第一引物的序列大体上一致或大体上互补。在一些实施例中，载体中的至少一种、一些或所有包含彼此大体上一致的第一引物群体。在一些实施例中，载体上的所有引物彼此大体上一致，或所有均包含大体上一致的第一引物序列。在一些实施例中，载体中的至少一个包含与其连接的两种或更多种不同引物。举例来说，至少一种载体可包含第一引物群体和第二引物群体。载体可与通用引物连接。通用引物与反应混合物内的所有或大体上所有模板核酸分子任选地杂交(或能够杂交)。反应混合物可包含与第一靶标特异性引物共价连接的第一载体和与第二靶标特异性引物共价连接的第二载体，其中第一和第二靶特异性引物彼此不同。任选地，第一靶标特异性引物与第一靶核酸序列大体上互补，且第二靶标特异性引物与第二靶核酸序列大体上互补，且其中第一和第二靶核酸序列不同。
在一些实施例中，预植入反应混合物中包含具有第一引物结合序列的两种或更多种不同模板核酸分子。在一些实施例中，将至少两种不同的模板核酸分子直接扩增到载体上，如包含多个位点的载体上的位点、珠粒或微粒、或阵列的反应室。可将模板核酸分子大批预植入于溶液中，且随后分配到固体载体上的孔阵列或反应位点中。替代地，可将固体载体分配到孔阵列中，可将模板核酸分子预植入在固体载体上同时将其原位保持在孔阵列中。在一些实施例中，用于核酸扩增的方法包含一个或多个表面。
在一些实施例中，表面已连接第一引物群体，群体中的第一引物共享共有第一引物序列。在一些实施例中，表面已连接第一引物群体和第二引物群体，群体中的第一引物共享共有第一引物序列，且第二引物群体中的第二引物共享共有第二引物序列。在一些实施例中，已在表面上固定有第一引物群体。在其它实施例中，已在表面上固定有第一引物群体和第二引物群体。
载体或表面可涂覆有用于连接核酸分子(例如第一引物或第二引物)的丙烯酰胺、羧酸或胺化合物。在一些实施例中，将氨基修饰的核酸分子(例如引物)与涂覆有羧酸的载体连接。在一些实施例中，使氨基修饰的核酸分子与EDC(或EDAC)反应以与羧酸涂覆的表面(具有或不具有NHS)连接。可将第一引物与涂覆在表面上的丙烯酰胺化合物连接。粒子可涂覆有抗生物素蛋白样化合物(例如抗生蛋白链菌素)以结合生物素标记的核酸。
在一些实施例中，反应混合物包含多个不同表面，例如预植入反应混合物包含一种或多种珠粒(如粒子、纳米粒子、微米粒子和其类似物)，且将至少两种不同的模板核酸分子扩增到不同珠粒上，从而形成至少两种不同的珠粒，其中的每一个与不同模板核酸分子连接。在一些实施例中，预植入反应混合物包含单个表面(例如平面样表面、流动池或反应室阵列)，且将至少两种不同的模板核酸分子扩增到表面上的两个不同的区域或位置上，从而形成与两种或更多种模板核酸分子连接单个表面。
在一些实施例中，固体载体的表面是多孔、半多孔或无孔的。在一些实施例中，表面是平面表面，以及凹面、凸面或其任何组合。在一些实施例中，表面是珠粒、粒子、微粒、球体、过滤器、流动池、孔、凹槽、通道储集器、凝胶或毛细管的内壁。在一些实施例中，表面包含纹理(例如蚀刻、形成空洞、孔、三维架构或凸块)。
在一些实施例中，固体载体的表面是磁性或顺磁性珠粒(例如磁性或顺磁性纳米粒子或微米粒子)。在一些实施例中，顺磁性微米粒子是与抗生蛋白链菌素连接的顺磁性珠粒(例如DynabeadsTM M-270，Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。粒子可具有铁芯，或可以是水凝胶或琼脂糖(例如SepharoseTM)。
在一些实施例中，表面包含珠粒的表面。在一些实施例中，珠粒是聚合物材料。举例来说，珠粒可以是凝胶、水凝胶或丙烯酰胺聚合物。珠粒可以是多孔的。粒子可以具有空洞或孔，或可包含三维架构。在一些实施例中，粒子是Ion SphereTM粒子(ThermoFisherScientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)。
通常，聚合物粒子或珠粒载体可进行处理以包含生物分子，包含核苷、核苷酸、核酸(寡核苷酸和聚核苷酸)、多肽、醣、多醣、脂质或其衍生物或类似物。举例来说，聚合物粒子可与生物分子结合或连接。生物分子的末端或任何内部部分可与聚合物粒子结合或连接。使用连接化学方法，聚合物粒子可与生物分子结合或连接。连接化学方法包含共价或非共价键，包括离子键、氢键、亲和力键、偶极-偶极键、范德华键(van der Waals bond)和疏水性键。连接化学方法包含结合伴侣之间的亲和力，例如以下之间的亲和力：抗生物素蛋白部分与生物素部分；抗原表位与抗体或其免疫反应性片段；抗体与半抗原；地高辛部分(digoxigen moiety)与抗地高辛抗体；荧光素部分与抗荧光素抗体；操纵子与抑制子；核酸酶与核苷酸；凝集素与多醣；类固醇与类固醇结合蛋白；活性化合物与活性化合物受体；激素与激素受体；酶与底物；免疫球蛋白与蛋白A；或寡核苷酸或聚核苷酸与其对应互补序列。
特定来说，固相载体，如珠粒载体，可包含聚核苷酸的拷贝。在特定实例中，聚合物粒子在测序技术期间可用作聚核苷酸的载体。举例来说，这类亲水性粒子可固定用于使用荧光测序技术测序的聚核苷酸。在另一实例中，亲水性粒子可固定用于使用离子传感技术测序的聚核苷酸的多个拷贝。替代地，上文所描述的处理可提高聚合物基质与传感器阵列表面的粘合。聚合物基质可捕获分析物，如用于测序的聚核苷酸。
在一些实施例中，将一种或多种核酸模板固定到一种或多种载体上。可通过任何方法，包含但不限于物理吸附，通过离子或共价键形成或其组合，将模板核酸分子固定于载体上。固体载体可包含聚合物、玻璃或金属材料。固体载体的实例包含膜、平面表面、微量滴定板、珠粒、过滤器、测试条、载玻片、盖玻片和管。固体载体意指在其上合成、连接、接合或以其它方式固定寡聚物的任何固相材料。载体可任选地包含“树脂”、“相”、“表面”和“载体”。载体可包括有机聚合物，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基和聚丙烯酰胺以及其共聚物和接枝物。载体也可是无机的，如玻璃、二氧化硅、受控孔玻璃(controlled-pore-glass；CPG)或反相二氧化硅。载体的构形可呈珠粒、球体、粒子、颗粒、凝胶或表面形式。表面可以是平面、大体上平面或非平面的。载体可以是多孔或无孔的，且可具有溶胀或非溶胀特征。载体可塑形成包含一个或多个孔、凹陷或其它容器(container)、容器(vessel)、特征或位置。可将一种或多种载体配置于阵列中的不同位置。载体任选地是可寻址(例如用于机械递送试剂)，或通过检测手段，包含利用激光照射扫描和共焦或偏光聚焦来寻址。可将载体(例如珠粒)放置在另一载体内或上(例如第二载体的孔内)。在一些实施例中，载体是离子球形粒子。
在一些实施例中，固体载体是“微粒”、“珠粒”、“微珠粒”等，(形状任选地但未必是球形)，其具有50微米或更小的最小横截面长度(例如直径)，优选地10微米或更小、3微米或更小、大致1微米或更小、大致0.5微米或更小，例如大致0.1、0.2、0.3或0.4微米或更小(例如小于1纳米、约1-10纳米、约10-100纳米或约100-500纳米)。微米粒子(例如Dynabead，Dynal，挪威奥斯陆)可由各种无机或有机材料制成，所述无机或有机材料包含但不限于玻璃(例如受控孔玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化钛、乳胶、聚苯乙烯等。磁化可促进在扩增之后微粒连接的试剂(例如聚核苷酸或连接酶)聚集和浓缩，且也可促进额外步骤(例如洗涤、试剂去除等)。在某些实施例中，使用具有不同形状尺寸和/或颜色的微米粒子群体。微米粒子可任选地例如用量子点进行编码，使得每一微粒或微米粒子组可分别或独特地识别。
在一些实施例中，使珠粒表面功能化以用于连接第一引物群体。在一些实施例中，珠粒是可以放入反应室中的任何大小。举例来说，一个珠粒可以放入反应室中。在一些实施例中，多于一个珠粒放入反应室中。在一些实施例中，珠粒的最小截面长度(例如，直径)是约50微米或更小、或约10微米或更小、或约3微米或更小、大致1微米或更小、大致0.5微米或更小，例如大致0.1、0.2、0.3或0.4微米或更小(例如小于1纳米、约1-10纳米、约10-100纳米或约100-500纳米)。
在一些实施例中，在预植入反应之前，将两种或更多种不同模板核酸分子定位、放入或置于不同位点。在一些实施例中，将两种或更多种不同模板核酸分子预植入于溶液中，任选地单一预植入反应混合物内，且随后在这类扩增之后，将所得两种或更多种大体上单克隆的模板核酸分子群体定位、放入或置于不同位点。不同位点任选地是阵列位点的成员。阵列可包含表面上(例如流动池、电子装置、电晶体芯片、反应室、通道和其类似物的表面)的二维位点阵列、或基质或其它介质(例如固体、半固体、液体、流体和其类似物)内的三维位点阵列。
在一些实施例中，用于将模板核酸分子预植入到一种或多种载体上的方法以及模板反应，通常使用一种或多种能够进行聚合的酶。在本发明传授内容的任一个实施例中，能够进行聚合的一种或多种酶包含至少一种聚合酶。在一些实施例中，所述至少一种聚合酶包含热稳定或热不稳定的聚合酶。在一些实施例中，所述至少一种聚合酶包含DNA或RNA聚合酶的保持足够的催化活性以在任何适合条件下聚合或并入至少一种核苷酸的生物活性片段。在不同实施例中，所述至少一种聚合酶包含保持足够催化活性以在任何适合条件下进行核苷酸聚合的突变型DNA或RNA聚合酶。在不同实施例中，所述至少一种聚合酶包含保持足够催化活性以进行聚合的一种或多种氨基酸突变。聚合酶任选地可具有或缺乏核酸外切酶活性。在一些实施例中，聚合酶具有5'到3'核酸外切酶活性、3'到5'核酸外切酶活性或两个。任选地，聚合酶缺乏这类核酸外切酶活性中的任一个或多个。在一些实施例中，聚合酶具有链置换活性。适用的链置换聚合酶的实例包含噬菌体Ф29DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶。
在一些实施例中，聚合酶包含可催化核苷酸和/或核苷酸类似物的聚合的任何酶或其片段或亚基。在一些实施例中，聚合酶需要可延伸的3'末端。举例来说，聚合酶需要核酸引物的末端3'OH以起始核苷酸聚合。聚合酶可以是除热稳定聚合酶以外的。举例来说，聚合酶可在37℃下具有活性，和/或在37℃下比在50℃、60℃、70℃或更高温度下更具活性。在各种实施例中，聚合酶在42℃、45℃、50℃、55℃或60℃下可以是具有活性的，和/或在这些温度下比在37℃下更具活性。
聚合酶可包含可催化核苷酸(包含其类似物)聚合到核酸链中的任何酶。通常但未必，这类核苷酸聚合可以模板依赖性方式进行。在一些实施例中，聚合酶是高保真度聚合酶。这类聚合酶可包含但不限于天然存在的聚合酶和其任何亚基和截短物、突变型聚合酶、变异型聚合酶、重组、融合或以其它方式工程改造的聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子或组装件，以及其保留催化这类聚合的能力的任何类似物、衍生物或片段。任选地，聚合酶是具有一个或多个突变的突变聚合酶，所述一或多个突变涉及用其它氨基酸置换一个或多个氨基酸、来自聚合酶的一个或多个氨基酸的插入或缺失或两个或更多个聚合酶的部分的连接。如本文所用，术语“聚合酶”和其变化形式也是指包含彼此连接的至少两个部分的融合蛋白，其中第一部分可包含可催化核苷酸聚合到核酸链中且与第二部分连接的肽，所述第二部分可包含第二多肽，例如报告酶或增强持续合成能力的结构域。通常，聚合酶包含可进行核苷酸结合和/或核苷酸聚合催化的一个或多个活性位点。在一些实施例中，聚合酶可包含或缺乏其它酶促活性，例如3'到5'核酸外切酶活性或5'到3'核酸外切酶活性。在一些实施例中，聚合酶是从细胞中分离，或使用重组DNA技术或化学合成方法产生。在本发明传授内容的任一个实施例中，在原核生物、真核生物、病毒或噬菌体生物体中表达聚合酶。在各种实施例中，聚合酶是DNA聚合酶且包含但不限于细菌DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶、古细菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶和噬菌体DNA聚合酶。在各种实施例中，使用所属领域中已知的方法来纯化所表达的聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是翻译后修饰的蛋白质或其片段。
在一些实施例中，聚合酶包含如以下中所描述的任何一种或多种聚合酶或聚合酶的生物活性片段：Davidson等人，2011/10/27公开的美国专利公开案第2011/0262903号；和/或Vander Horn等人，2013/2/14公开的国际PCT公开案第WO 2013/023176号，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，聚合酶是复制酶、DNA依赖性聚合酶、引发酶、RNA依赖性聚合酶(包含RNA依赖性DNA聚合酶，例如逆转录酶)、热不稳定聚合酶或热稳定聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是任何A或B家族型聚合酶。许多类型的A(例如大肠杆菌(E.coli)Pol I)、B(例如大肠杆菌Pol II)、C(例如大肠杆菌Pol III)、D(例如广古菌(Euryarchaeotic)Pol II)、X(例如人类Polβ)和Y家族(例如，大肠杆菌UmuC/DinB和真核生物RAD30/着色性干皮病变异体)聚合酶描述于Rothwell和Watsman 2005《蛋白质化学进展(Advances in ProteinChemistry)》71:401-440中。在一些实施例中，聚合酶是T3、T5、T7或SP6 RNA聚合酶。
在一些实施例中，用一种类型的聚合酶和/或连接酶、或聚合酶和/或连接酶的混合物来进行核酸扩增反应。在一些实施例中，用低保真度或高保真度聚合酶进行核酸扩增反应，或不考虑保真度。
示范性聚合酶是Bst DNA聚合酶(Exonuclease Minus)，其是一种登录号2BDP_A中例示的67kDa嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶蛋白(大片段)，其具有5'到3'聚合酶活性和链置换活性但缺乏3'到5'核酸外切酶活性。其它聚合酶包含来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的Taq DNA聚合酶I(由登录号1TAQ例示)、来自大肠杆菌(Escherichia coli)的Eco DNA聚合酶I(登录号P00582)、来自超嗜热菌(Aquifexaeolicus)的Aea DNA聚合酶I(登录号067779)，或其例如在核苷酸水准上具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列一致性的功能片段或变异体。
在说明性实施例中，DNA聚合酶是Bsu DNA聚合酶(大片段(NEB))。Bsu DNA聚合酶I大片段保留枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DNA聚合酶I(1)的5'到3'聚合酶活性但缺乏5'到3'核酸外切酶结构域。在某些实施例中，Bsu DNA聚合酶大片段缺乏3'到5'核酸外切酶活性。在各种实施例中，Bsu DNA聚合酶大片段在37℃下具有最优活性。
在某些说明性实施例中，尤其当预植入反应是RPA反应时，能够进行聚合的一种或多种酶包含T5或T7 DNA聚合酶。在一些实施例中，能够进行聚合的一种或多种酶包含具有降低3'到5'核酸外切酶活性的一种或多种氨基酸突变的T5或T7 DNA聚合酶。在一些实施例中，具有降低3到5'核酸外切酶活性的一种或多种氨基酸突变的T5或T7 DNA聚合酶不含有干扰T5或T7 DNA聚合酶的持续合成能力的氨基酸突变。在一些实施例中，T5或T7 DNA聚合酶包含消除可检测的3'到5'核酸外切酶活性的一种或多种氨基酸突变；且其中所述一种或多种氨基酸突变不干扰T5或T7 DNA聚合酶的持续合成能力。在某些说明性实施例中，预植入反应混合物包含Sau聚合酶、3'到5'核酸外切酶活性降低的T7 DNA聚合酶、Bsu聚合酶或其组合。尤其较适用于RPA反应的这些聚合酶不仅非常适用于预植入反应，而且适用于模板反应。
在一些实施例中，能够进行聚合的一种或多种酶包含任何适合的RNA聚合酶。适合的RNA聚合酶包含但不限于T3、T5、T7和SP6 RNA聚合酶。
在各种实施例中，本发明传授内容的任一种方法(包含预植入反应和模板反应)中使用的模板核酸分子，通常包含第一引物结合序列(“正向”)和任选地第二引物结合序列(“反向”)。因此，预植入反应混合物和模板反应物包含分别结合正向引物结合序列和反向引物结合序列的第一引物群体和任选地第二引物群体。在一些实施例中，第一和第二引物被称作引物对。在一些实施例中，第一引物和/或第二引物通常是通用引物。第一引物可与正向引物结合序列或反向引物结合序列结合，且第二引物可与正向引物结合序列或反向引物结合序列结合。
在任一个所公开的实施例中，反应混合物包含与模板核酸分子内的序列结合的第一引物群体和第二引物群体。第一引物群体可以是一致拷贝或不同序列。第二引物群体可以是一致拷贝或不同序列。然而，第一引物群体和任选的第二引物群体通常是通用引物，且所有拷贝是一致的。因此，在说明性实施例中，第一引物群体和第二引物群体均是结合模板核酸分子上的通用引物结合序列的通用引物。在其它实施例中，第一引物群体和第二引物群体均是靶标特异性引物。第一引物群体和第二引物群体可具有相同或不同序列。在本发明传授内容的任一个实施例中，在与预植入反应混合物一起培育之前，将第一引物群体和/或第二引物群体与一种或多种载体连接。在其它实施例中，在与预植入反应混合物一起培育期间，第一引物群体和/或第二引物群体在溶液中。在说明性实施例中，在与预植入反应混合物一起培育之前，将第一引物群体与一种或多种载体连接；且在与预植入反应混合物一起培育期间，第二引物群体通常在溶液中。
因此，在于溶液中包含所固定的第一引物群体和第二引物群体的这些说明性实施例中，不受理论限制，在预植入反应期间，将模板核酸至少部分地变性，且模板上的第一引物结合位点与同固体载体连接的第一模板结合。聚合酶使用第一引物，以产生模板核酸的一条链的互补链。那条互补链现通过引物与固体载体共价连接。溶液中的第二引物是呈与重组酶的复合物形式，且与互补链上的引物结合位点结合，因此使结合的模板核酸分子部分变性。聚合酶使用引物来合成与初始模板核酸链一致的新链。认为，随后这条链将通过结合重组酶的复合物和同固体载体连接的附近第一引物而部分地变性，且聚合酶合成另一条互补链。通过这个方法的重复步骤，模板核酸分子的大体上单克隆群体在预植入反应期间产生，且在模板反应期间进一步扩增。
在一些实施例中，本公开大体上涉及方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，其中引物通常具有游离3'羟基。在一些实施例中，引物是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物的聚合物。在一些实施例中，引物是天然存在的、合成、重组、克隆、扩增或未扩增形式。在一些实施例中，引物包含在所有核苷酸之间的磷酸二酯键。在本发明传授内容的任一个实施例中，引物的长度在约5与100个核苷酸之间，例如长度在约5与80个核苷酸之间、长度在约5与60个核苷酸之间、长度在约5与40个核苷酸之间、长度在约10与75个核苷酸之间、长度在约15与75个核苷酸之间或长度在约20与50个核苷酸之间。
在一些实施例中，至少一个引物具有修饰。举例来说，核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物可具有与其连接的生物素或叠氮化物。在一些实施例中，核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物具有连接的荧光团、磷酸化或间隔子。在一些实施例中，引物是封端的和/或是融合引物或融合聚核苷酸，其中引物或聚核苷酸的不同区域设计成与两个引物结合位点中的一个结合和/或设计成被两个引物中的一个结合。
在一些实施例中，引物是封端的引物以防止所述引物的3'端延伸。在一些实施例中，封端的引物是带尾引物，其中5'端包含与模板核酸分子非互补的序列。5'序列可用作引物延伸反应的模板。在一些实施例中，引物是封端的，其中5'结构域的长度在15到30个核苷酸。在一些实施例中，引物包含在其5'或3'端处或在5'和3'端处的封端部分。在涉及引物延伸的反应(例如预植入扩增)中，在封端的融合引物的3'端处的封端部分可降低引物二聚体形成的水准。在某些实施例中，预植入反应混合物包含封端的引物，其中3'结构域的长度在14到25个核苷酸。在其它实施例中，3'结构域的长度在15到25个核苷酸。在又其它实施例中，5'结构域是至少15个核苷酸且3'结构域是至少10个核苷酸，其中引物的长度不超过100、90、80、75、70、60或50个核苷酸。在实施例中，正向引物的3'结构域的3'核苷酸与正向引物结合序列错配。在实施例中，将封端引物的5'结构域和3'结构域分开的核糖碱基(ribobase)包含rU、rG、rC或rA。在某些实施例中，将封端引物的5'结构域和3'结构域分开的核糖碱基包含rC。在本发明传授内容的任一个实施例中，封端引物的3'结构域的长度在14到20个核苷酸，且核糖碱基是rU、rG、rC或rA。
在本发明传授内容的任一个实施例中，反应混合物包含去除封端引物的一部分以留下游离3'OH的酶。在去除引物的封端端之后，聚合酶可从游离3'OH起始复制以开始复制模板链。在一些实施例中，这种酶是RNA酶，尤其RNA酶H。所属领域的技术人员将辨识使用的封端引物的其它组合物和用于去除封端引物的一部分的适合酶。
预植入反应混合物以及本文中所提供的方法中的任何其它扩增反应物(包含模板反应混合物)，通常包含被聚合酶用作延伸反应的底物的核苷酸或其类似物源。在本发明传授内容的任一个实施例中，预植入反应混合物通常包含用于模板核酸分子的链延伸从而产生与一种或多种载体连接的模板核酸分子序列的大体上单克隆群体的核苷酸(dNTP)。在一些实施例中，核苷酸未被外部标记。举例来说，核苷酸可以是不包含荧光部分、染料或其它外来光学可检测标记的天然存在的核苷酸或合成类似物。任选地，核苷酸不包含终止核酸合成的基团(例如双脱氧基团、可逆终止子和其类似物)。在其它实施例中，核苷酸包含标记或标签。
在一些实施例中，用于核酸扩增的方法包含至少一种辅因子，例如增强DNA或RNA聚合酶活性的辅因子。在一些实施例中，辅因子包含一种或多种二价阳离子。二价阳离子的实例包括镁、锰和钙。在各种实施例中，预植入反应混合物包含含有一种或多种二价阳离子的缓冲液。在说明性实施例中，缓冲液含有镁或锰离子。在本发明传授内容的任一个实施例中，通过添加辅因子，尤其二价阳离子，来起始预植入反应或模板反应。在一些实施例中，本文中用于核酸扩增所使用的预植入反应混合物可包含至少一种辅因子，以用于在核酸上进行重组酶组装或用于同源核酸配对。在一些实施例中，辅因子包含任何形式的ATP，包含ATP和ATPγS。在一些实施例中，用于核酸扩增的方法包含使ATP再生的至少一种辅因子。举例来说，辅因子可包含将ADP转化成ATP的酶系统。在一些实施例中，辅因子酶系统是磷酸肌酸和肌酸激酶。
在本发明传授内容的任何方面中，预植入反应混合物包含使模板核酸分子部分地变性的组分。在一些实施例中，部分地变性条件包含用一种或多种酶处理待扩增的模板核酸分子或使所述模板核酸分子与所述一种或多种酶接触，所述一种或多种酶能够任选地以序列特异性或序列定向方式(如在RPA反应中)使核酸模板部分地变性。在一些实施例中，至少一种酶任选地以序列特异性方式催化链侵入和/或解开。任选地，一种或多种酶包含选自以下的一种或多种酶：重组酶、拓扑异构酶和解螺旋酶。在一些实施例中，使模板部分地变性包含使模板与重组酶接触和形成包含重组酶的核蛋白复合物。任选地，使模板核酸分子在第一和任选地第二引物存在下与重组酶接触。部分地变性可包含使用重组酶催化链交换和使第一引物与第一引物结合序列杂交(或使第二引物与第二引物结合序列杂交)。在一些实施例中，部分地变性包含使用重组酶进行链交换，和使第一引物与第一引物结合序列杂交且使第二引物与第二引物结合序列杂交。
在一些实施例中，使模板核酸分子部分地变性包含使模板与一种或多种重组酶或核蛋白复合物接触。核蛋白复合物中的至少一个可包含重组酶。核蛋白复合物中的至少一个可包含引物(例如第一引物或第二引物，或包含与模板中的对应引物结合序列互补的序列的引物)。在一些实施例中，使模板部分地变性包含使模板与包含引物的核蛋白复合物接触。部分地变性可包含使核蛋白复合物的引物与模板中的对应引物结合序列杂交，从而形成引物-模板双螺旋。在一些实施例中，使模板核酸分子部分地变性包含使模板与包含第一引物的第一核蛋白复合物接触。部分地变性可包含使第一核蛋白复合物的第一引物与正向链的第一引物结合序列杂交，从而形成第一引物-模板双螺旋。在一些实施例中，使模板部分地变性包含使模板与包含第二引物的第二核蛋白复合物接触。部分地变性可包含使第二核蛋白复合物的第二引物与反向链的第二引物结合序列杂交，从而形成第二引物-模板双螺旋。
因此，本公开的预植入反应混合物和本公开的模板反应物包含重组酶，且部分变性和/或扩增，包含本文中所描述的任何一个或多个步骤或方法，可使用重组酶和任选地重组酶辅助蛋白实现。重组酶可包含能够诱导重组事件发生或增加其发生频率的任何药剂。重组事件包含借此两条不同聚核苷酸链彼此重组的任何事件。重组可包含同源重组。重组酶任选地可与第一引物结合(例如结合)。在一些实施例中，催化同源重组的酶可通过结合单链模板核酸分子形成核蛋白复合物。在一些实施例中，作为核蛋白复合物的一部分的同源重组酶可结合双链聚核苷酸的同源部分。在一些实施例中，聚核苷酸的同源部分与第一引物的至少一部分杂交。在一些实施例中，聚核苷酸的同源部分与第一引物的至少一部分部分或完全互补。适合的重组酶包含RecA和其原核或真核同源物、或其功能片段或变异体，任选地与一种或多种单链结合蛋白(single-strand binding protein；SSB)组合。在某些实施例中，重组酶任选地涂覆ssDNA，以形成侵入模板上的同源性双链区的核蛋白长丝。
在一些实施例中，通过形成核蛋白复合物和与双链聚核苷酸的同源部分结合以形成具有三条链结构的重组中间物(D-环形成)，同源重组酶催化链侵入(Zarling的美国专利第5,223,414号；Sena的美国专利第5,273,881号和第5,670,316号；和美国专利第7,270,981号、第7,399,590号、第7,435,561号、第7,666,598号、第7,763,427号、第8,017,339号、第8,030,000号、第8,062,850号和第8,071,308号，以其全文引用的方式并入本文中)。
反应混合物、组合物和试剂盒的重组酶包含可促进聚核苷酸分子之间的重组的任何适合药剂。重组酶可以是催化同源重组的酶。举例来说，反应混合物可包含重组酶，所述重组酶包含或来源于细菌、真核生物或病毒(例如噬菌体)重组酶。
在本发明传授内容的任一个实施例中，同源重组酶是野生型、突变体、重组体、融合物或其片段。在一些实施例中，同源重组酶包含来自任何生物体的酶，所述生物体包含肌病毒科(myoviridae)(例如来自噬菌体T4的uvsX、RB69和其类似物)、大肠杆菌(例如recA)或人类(例如RAD51)。在实施例中，反应混合物包含选自以下的一种或多种重组酶：uvsX、RecA、RadA、RadB、Rad51、其同源物、其功能类似物，或其组合。在说明性实施例中，重组酶是uvsX。UvsX蛋白可例如以50-1000ng/μl、100-750ng/μl、200-600ng/μl或250到500ng/μl存在。
在一些实施例中，用于核酸扩增的方法、试剂盒和组合物包含含一种或多种重组酶辅助蛋白的预植入反应混合物。举例来说，辅助蛋白可提高重组酶的活性。在一些实施例中，辅助蛋白可结合模板核酸分子的单链，或可将重组酶负载到模板核酸分子上。在一些实施例中，辅助蛋白是野生型、突变体、重组体、融合物或其片段。在一些实施例中，辅助蛋白可来源于与用于进行核酸扩增反应的重组酶相同或不同物种的任何组合。辅助蛋白可来源于任何细菌噬菌体，包括肌病毒噬菌体。肌病毒噬菌体的实例包含T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、不动杆菌(Acinetobacter)噬菌体133、气单胞菌(Aeromonas)噬菌体65、噬藻体(cyanophage)P-SSM2、噬藻体PSSM4、噬藻体S-PM2、Rb14、Rb32、气单胞菌噬菌体25、弧菌噬菌体nt-1、phi-1、Rb16、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3和噬菌体LZ2。辅助蛋白可来源于任何细菌物种，包含大肠杆菌、硫化叶菌属(Sulfolobus)(例如硫磺矿硫化叶菌(S.solfataricus))或甲烷球菌属(Methanococcus)(例如詹氏甲烷球菌(M.jannaschii))。在一些实施例中，用于核酸扩增的方法可包含单链结合蛋白。单链结合蛋白包含肌病毒gp32(例如T4或RB69)、来自硫磺矿硫化叶菌的Sso SSB、来自詹氏甲烷球菌的MjA SSB和大肠杆菌SSB蛋白。
在一些实施例中，用于核酸扩增的方法包含提高重组酶负载到核酸上的蛋白质。举例来说，UvsY蛋白是重组酶负载蛋白。在一些实施例中，反应混合物包含重组酶辅助蛋白。在说明性实施例中，重组酶辅助蛋白是uvsY。UvsY可以在约20与500ng/μl之间，例如在约20与250ng/μl之间或在约20与125ng/μl之间。在非限制性实例中，UvsY在75与125ng/μl之间。
在本发明传授内容的任一个实施例中，预植入反应混合物或模板反应混合物内的扩散，通过添加扩散限制性药剂来限制，所述扩散限制性药剂有效地防止或减缓聚核苷酸模板中的一个或多个和/或扩增反应产物中的一个或多个在预植入反应混合物中扩散。当在反应混合物的单一连续液相内扩增两种或更多种模板核酸分子时，包含扩散限制性药剂可为有利的。举例来说，扩散限制性药剂可防止或减缓模板核酸分子或所扩增的通过模板核酸分子的至少一些部分的复制所产生的聚核苷酸在预植入反应混合物内扩散，因此防止形成多克隆杂质而不需要在扩增期间通过物理手段或包封手段(例如乳液)将预植入反应混合物区室化。在单一反应混合物的单一连续液相内扩增模板而无需区室化的这类方法极大地降低与产生适合于高通量方法(如数字PCR、下一代测序和其类似方法)的文库产生相关的成本、时间和工作量。
在一些实施例中，扩散限制性药剂是筛分药剂。筛分药剂可以是有效筛分存在于预植入反应混合物中的一种或多种模板核酸分子或聚核苷酸，例如扩增反应产物和/或模板核酸分子，的任何药剂。在一些实施例中，筛分药剂限制或减缓聚核苷酸扩增产物在预植入反应混合物中迁移。在一些实施例中，筛分药剂的平均孔径是使得选择性地延缓或防止预植入反应混合物内的靶组分(例如聚核苷酸)移动的孔径。在一个实例中，筛分药剂包含提供具有多个孔的基质的任何化合物，所述多个孔足够小以减缓或延缓聚核苷酸或模板核酸分子在含有筛分药剂的反应混合物中的移动。因此，筛分药剂可减少聚核苷酸的布朗运动(Brownian motion)。
在一些实施例中，筛分药剂是聚合物化合物。在一些实施例中，筛分药剂是交联或非交联的聚合物化合物。借助于非限制性实例，筛分药剂可包含多醣、多肽、有机聚合物或任何其它适合的聚合物。在任一个实施例中，筛分药剂是呈直链或分支链的聚合物。在一些实施例中，筛分药剂是带电或中性聚合物。在一些实施例中，筛分药剂可包含各自具有平均分子量和粘度的一种或多种聚合物的掺合物。在一些实施例中，筛分药剂是具有在约10,000与2,000,000Da之间的平均分子量的聚合物：例如在约10,000与1,000,000Da之间、在约10,000与500,000Da之间、在约10,000与250,000Da之间或在约10,000与100,000Da之间。在某些实施例中，聚合物具有在约12,000与95,000Da之间或在约13,000与95,000Da之间的平均分子量。
在一些实施例中，当以2重量百分比溶解于水中在约25℃测量下时，筛分药剂呈现约5厘泊到约15,000厘泊的平均粘度范围；或在呈2％水溶液在约25℃下测量时，约10厘泊到约10,000厘泊的平均粘度范围；或在呈2％水溶液在约25℃下测量时，约15厘泊到约5,000厘泊的平均粘度范围。
在一些实施例中，筛分药剂具有约25到约1,5000kMv、或约75-1,000kMv或约85-800kMv的粘度平均分子量(Mv)。在一些实施例中，反应混合物包含在约0.1到约20％重量/体积(w/v)或约1-10％w/v或约2-5％w/v下的筛分药剂。
在一些实施例中，筛分药剂是多醣聚合物。在一些实施例中，筛分药剂是葡萄糖或半乳糖的聚合物。在一些实施例中，筛分药剂是以下聚合物中的一个或多个：纤维素、葡聚糖、淀粉、肝醣、琼脂、甲壳素、果胶或琼脂糖。在一些实施例中，筛分药剂是吡喃葡萄糖聚合物。在一些实施例中，筛分药剂包含纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠、羧甲基2-羟乙基纤维素钠、甲基纤维素、羟基乙基纤维素、2-羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、(羟丙基)甲基纤维素或羟乙基乙基纤维素、或包含这类聚合物中的任一个或多个的混合物。
在一些实施例中，预植入反应混合物和/或模板反应混合物包含不同筛分药剂的混合物，例如不同纤维素衍生物、淀粉、聚丙烯酰胺和其类似物的混合物。在一些实施例中，预植入反应混合物包含拥挤药剂(crowding agent)。在一些实施例中，预植入反应混合物包含拥挤药剂和筛分药剂两个。
在一些实施例中，扩散限制性药剂是扩散降低剂(diffusion-reducing agent)。扩散降低剂包含降低模板核酸分子或聚核苷酸从较高浓度区域迁移到较低浓度区域的任何化合物。在一些实施例中，扩散降低剂包含无关于大小降低核酸扩增反应的任何组分的迁移的任何化合物。
应注意，筛分药剂和扩散降低剂的概念不一定相互排斥；筛分药剂可常常有效地降低反应混合物中的靶标化合物的扩散，而扩散降低剂可常常对于反应组分具有筛分效果。在一些实施例中，相同化合物或预植入反应混合物添加物均可用作筛分药剂和/或扩散降低剂。在一些实施例中，本发明传授内容的任一种筛分药剂可以能够充当扩散降低剂，且反之亦然。
在一些实施例中，扩散降低剂和/或筛分药剂包含聚丙烯酰胺、琼脂、琼脂糖或纤维素聚合物，如羟基乙基纤维素(hydroxyethyl cellulose；HEC)、甲基纤维素(methyl-cellulose；MC)或羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose；CMC)。
在一些实施例中，预植入反应混合物中包含浓度为以下的筛分药剂和/或扩散降低剂：至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、90％或95％w/v(药剂重量/单位体积的反应混合物)。
在一些实施例中，扩散限制性药剂是拥挤药剂。举例来说，拥挤药剂可通过产生拥挤的反应环境而增加核酸扩增反应中的一种或多种组分的浓度。在一些实施例中，预植入反应混合物包含筛分药剂和/或扩散试剂和拥挤药剂两个。
在一些实施例中，将不同模板核酸分子预植入到一种或多种不同离散载体(例如珠粒或粒子)上而不需要在扩增之前区室化。在其它实施例中，在扩增之前，将模板核酸分子分配(partitioned/distributed)到乳液中。与单一连续液相内的扩增相反，可在多个分隔反应体积中平行进行预植入反应。各反应体积可包含预植入反应混合物。举例来说，可将模板核酸分子分配或置于反应室阵列或反应体积阵列中，使得阵列中的至少两个这类区室或体积接受单一模板核酸分子。在一些实施例中，形成多个单独反应体积。可在扩增之前，任选地将反应室(或反应体积)密封。可在每一个反应室中进行预植入反应，以产生大体上单克隆模板核酸分子群体。在另一实施例中，将反应混合物分区或分隔成分散于乳化液连续相内的多个微反应器。各区室或微反应器充当非依赖性扩增反应器，因此整个乳化液能够支持在单一反应容器(例如Eppendorf管或孔)中于单独(非连续)液相中进行许多单独扩增反应。如本文所用，术语“乳化液”包含含第一液体与第二液体的混合物的任何组合物，其中第一和第二液体大体上彼此不混溶。分区或单独反应体积任选地不彼此混合或连通，或不能够彼此混合或连通。微反应器中的预植入反应混合物可以是本文所论述的任一种预植入反应混合物。
在一些实施例中，核酸合成方法进一步包含从乳化液回收至少一些与大体上单克隆模板核酸分子群体连接的载体。在一些实施例中，核酸合成方法进一步包含将至少一些与大体上单克隆模板核酸分子群体连接的载体放置到表面上。在一些实施例中，核酸合成方法进一步包含通过将至少一些与大体上单克隆模板核酸分子群体连接的载体放置到表面上而形成阵列。
在一些实施例中，本公开大体上涉及组合物、以及系统、方法、试剂盒和设备，其包含预植入反应混合物和模板反应混合物。因此，在某些实施例中，本文提供包含聚合酶和一种或多种预植入载体的反应混合物。反应混合物组合物可包含重组酶和任选地如已知用于RPA反应的重组酶辅助蛋白。在这类实施例中，反应混合物，尤其预植入反应混合物，可在溶液中包含5×107与109个之间的模板核酸分子，所述溶液包含5×106与1010个之间的珠粒，如离子球形粒子。在说明性实例中，预植入反应混合物中的每珠粒包含1或小于1模板核酸分子。举例来说，每固体载体可包含在约0.1与0.9之间的模板核酸分子，例如每固体载体可包含在约0.1与0.7之间的模板核酸分子、在约0.1与0.5之间的模板核酸分子或在约0.1与0.3之间的模板核酸分子。在某些实例中，模板反应混合物包含在溶液中的小于1,000,000、500,000、1,000、500、100、10或0个模板核酸分子，以及本发明传授内容的预植入的固体载体。在预植入和模板反应混合物中，聚合酶和任选地重组酶通常以扩增有效浓度存在，如RPA反应已知的，或以更高浓度存在，使得其可与其它反应组分合并到最终预植入反应混合物中。在本发明传授内容的任一个实施例中，预植入反应混合物和/或模板反应混合物的体积是在约50与2,000μl之间，例如在约50与1,500μl之间、在约50与1,000μl之间、在约50与500μl之间、在约50与250μl之间或在约50与150μl之间。在任一个所公开的实施例中，预植入反应混合物的体积与模板反应混合物的体积不同。
预植入反应混合物和模板反应混合物可进一步包含其它组分。举例来说，组合物可包含核苷酸、第一引物群体、任选地第二引物、辅因子和缓冲液。第一引物群体和任选地第二引物群体可与一种或多种载体连接。作为非限制性实例，组合物包含：一种或多种载体；重组酶，如uvsX；聚合酶，如Sau DNA聚合酶；重组酶负载蛋白，如uvsY；单链结合蛋白，如gp32蛋白；核苷酸；ATP；磷酸肌酸；和肌酸激酶。组合物可呈液体形式，或其可呈固体形式，如可复水的干燥团块形式(dried-down pellet form)。此外，可将组合物的组分分开，使得任何组合的组分可呈团块或液体形式，且其余组分的一种或多种组合可呈一种或多种单独团块或液体形式。这类组合可形成包含这类组合中的至少两种的试剂盒。举例来说，试剂盒可包含含除聚合酶以外的本发明传授内容的所有反应混合物组分的团块，所述聚合酶可以单独团块或液体提供于试剂盒中。
在说明性实施例中，组合物包含模板核酸分子群体、聚合酶、重组酶、正向引物、反向引物、核苷酸和缓冲液。在一些实施例中，组合物包含模板核酸分子、正向引物、反向引物、uvsX重组酶、uvsY重组酶负载蛋白、gp32蛋白、Sau DNA聚合酶、dNTP、ATP、磷酸肌酸和肌酸激酶。
在一些实施例中，组合物包含具有第一引物结合序列和第二引物结合序列的至少两种不同的模板核酸分子、重组酶、重组酶辅助蛋白、聚合酶、第一通用引物、第二通用引物、dNTP和缓冲液。在一些实施例中，组合物进一步包含一种或多种载体。在说明性实施例中，组合物包含具有第一引物结合序列和第二引物结合序列的至少两种不同的模板核酸分子、uvsX重组酶、uvsY重组酶负载蛋白、gp32蛋白、Sau DNA聚合酶、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、与珠粒载体连接的第一通用引物、第二通用引物和缓冲液。
在一些实施例中，通过向水溶液或乳化液溶液单独添加每一组分，形成预植入反应混合物或模板反应混合物。在其它实施例中，反应混合物呈需要在使用前复水的脱水团块形式。脱水团块可包含例如重组酶、任选的重组酶辅助蛋白、任选地gp32、DNA聚合酶、dNTP、ATP、任选地磷酸肌酸、任选的拥挤药剂和任选地肌酸激酶。复水缓冲液可包含例如Tris缓冲液、乙酸钾盐和任选地如PEG的拥挤药剂。DNA聚合酶可以是例如T4或T7 DNA聚合酶，且当聚合酶是T7 DNA聚合酶时可进一步包含硫氧还蛋白。在一些实施例中，当使用包含反应混合物组分的脱水团块时，团块用复水缓冲液复水，且添加模板核酸分子、引物和额外无核酸酶水到最终体积。
在一些实施例中，在抑制过早反应起始的条件下，预培育预植入反应混合物或模板反应混合物。举例来说，可从反应容器扣留预植入反应混合物中的一种或多种组分，以防止过早反应起始。为了起始反应，添加二价阳离子(例如镁或锰)。在另一实例中，在抑制酶活性的温度下，预培育预植入反应混合物。可在约0-15℃或约15-25℃下，预培育反应物，以抑制过早反应起始。随后，在较高温度下培育反应物，以提高酶促活性。在说明性实施例中，在反应期间，不将预植入反应混合物暴露于高于42℃的温度。
在任一个所公开的实施例中，预植入反应任选地包含重复的核酸扩增循环。扩增循环任选地包含：(a)第一引物与模板链杂交，(b)引物延伸以形成第一延伸链，(c)来自模板链的延伸链部分或不完全变性。任选地，来自步骤(c)的模板链的变性部分任意与下一扩增循环中的不同第一引物杂交。在一些实施例中，后续扩增循环中的引物延伸涉及置换来自模板链的第一延伸链。可包含与第一延伸链的3'端杂交的第二引物。在一些实施例中，所公开的方法(和相关组合物、系统和试剂盒)进一步包含一个或多个引物延伸步骤。举例来说，所述方法包含使用聚合酶通过核苷酸并入来延伸引物。在实施例中，延伸引物包含在核苷酸并入条件下使杂交的引物与聚合酶和一种或多种类型的核苷酸接触。通常，延伸引物以模板依赖性方式发生。任选地，所公开的方法(和相关组合物、系统和试剂盒)包含通过使用聚合酶，将一个或多个核苷酸并入到第一引物-模板双螺旋的第一引物的3'OH上来延伸第一引物，从而形成延伸的第一引物。任选地，所公开的方法(和相关组合物、系统和试剂盒)包含通过任何合适方法(例如接合或杂交)，使第二引物与第一延伸的引物的第二引物结合序列结合。任选地，所公开的方法(和相关组合物、系统和试剂盒)包含通过使用聚合酶，将一个或多个核苷酸并入到第二引物-模板双螺旋的第二引物中来延伸第二引物，从而形成延伸的第二引物。
在一些实施例中，延伸第一引物使得形成第一延伸的引物。第一延伸的引物可包含模板反向链序列的一些或全部。任选地，第一延伸的引物包含第二引物结合序列。在一些实施例中，延伸第二引物使得形成第二延伸的引物。第二延伸的引物可包含模板正向链序列的一些或全部。任选地，第二延伸的引物包含第一引物结合序列。在一些实施例中，方法(和相关组合物、系统和试剂盒)可进一步包含使一条或多条延伸的引物链与载体连接。可任选地在扩增期间或替代地在完成扩增之后进行连接。在一些实施例中，将载体与第一引物群体连接。举例来说，载体可包含第一引物群体，且所述方法可包含使延伸的第二引物中的至少一个与载体的第一引物杂交，从而将延伸的第二引物与载体连接。举例来说，第一引物可与延伸的第二引物中的第一引物结合序列杂交。在一些实施例中，载体包含第二引物的多个例子，且所述方法包含使延伸的第一引物链中的至少一个与载体的第二引物杂交，如在桥式PCR中。
在本发明传授内容的任一个实施例中，使用RPA反应进行预植入反应，其中使用聚合酶、重组酶和通常重组酶辅助蛋白，实现部分变性和/或扩增，包含本文中所描述的任何一个或多个步骤或方法。不受理论限制，人们相信，重组酶涂覆单链DNA(single-strandedDNA；ssDNA)，以形成侵入模板核酸分子上的同源性双链区域的核蛋白长丝。这产生短杂合体和被称为D-环的置换链气泡。利用DNA聚合酶，使杂交引物的游离3'端延伸，以合成新的互补链。互补链在其伸长时，置换模板核酸分子的最初配对的伴侣链。在一实施例中，在与模板核酸分子(其任选地是双链)接触之前，使一对引物中的一个或多个与一种或多种重组酶接触。RPA反应通常是等温反应且在乳化液内进行。
在本发明传授内容的任一个实施例中，通过模板步移进行预植入反应，其中双链核酸分子的部分变得解离，使得引物与一条链结合以起始新一轮的复制(参见例如2012年6月21日公开的美国专利公开案第2012/0156728号，其以全文引用的方式并入本文中)。模板步移的实施例包含引物延伸方法，包含：(a)引物杂交步骤，(b)延伸步骤，和(c)步移步骤。任选地，引物杂交步骤包含使第一引物与模板核酸分子(“反向链”)上的第一引物结合序列杂交。任选地，延伸步骤包含产生延伸的第一正向链，所述延伸的第一正向链是反向链的全长互补序列且与其杂交。例如通过使用反向链作为模板，以模板依赖性方式延伸第一正向引物，来产生延伸的第一正向链。任选地，步移步骤包含使另一第一引物与第一引物结合序列杂交，其中反向链也与第一正向链杂交。举例来说，步移步骤包含使来自正向链的第一引物结合序列的至少一部分变性，其中反向链的另一部分仍与正向链杂交。在任一个所公开的实施例中，反应混合物包含具有与其结合的第一引物的一种或多种载体，其中模板核酸分子中的至少一个上的第一引物结合序列与第一引物的至少一部分互补或一致。在一些实施例中，模板核酸分子中的至少一个具有与第二引物的至少一部分互补或一致的第二引物结合序列。在一些实施例中，第二引物也与载体结合，使得可在表面上来回发生扩增。在各种实施例中，第二引物在溶液中。在其它实施例中，将第二引物固定于载体上。模板步移反应通常是在等温下进行且是在乳化液内进行。
模板步移可使得在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入许多相同核苷酸。在一些实施例中，以使得所连接的模板核酸分子在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入少于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250或300个相同核苷酸的方式，在一种或多种载体上进行模板步移。在其它实施例中，以使得所连接的模板核酸分子在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入约10与300个之间的相同核苷酸的方式，例如在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入约10与200个之间的相同核苷酸、约10与150个之间或约10与100个之间的相同核苷酸，在一种或多种载体上进行模板步移。在任何实施例中，近侧末端是模板核酸分子中最接近于连接各模板核酸分子的载体的末端。在一些方面中，与载体连接的模板核酸分子是与模板核酸分子或模板核酸区段连接的一系列相同核苷酸。在一些实施例中，大体上单克隆模板核酸分子群体中的每一个的小于5％、10％、15％、20％或25％在近侧末端处具有可变数量的相同核苷酸。举例来说，大体上单克隆模板核酸分子群体中的每一个的小于5％、10％、15％、20％或25％可在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入约10与300个之间的相同核苷酸，例如在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入约10与200个之间的相同核苷酸、约10与150个之间、约10与100个之间或约20与50个之间的相同核苷酸。
在任一个所公开的实施例中，使用PCR方法进行预植入反应。所属领域的技术人员将辨识进行将产生大体上单克隆模板核酸分子群体的PCR的各种方法。在一些实施例中，在单轮PCR中进行预植入反应。在其它实施例中，在多轮PCR中进行预植入反应。举例来说，所述方法可包含稀释一定量的与载体反应的模板核酸分子，以降低与多于一个模板核酸分子反应的载体的百分比。在一些实施例中，稀释模板核酸分子，使得预植入反应具有载体:模板核酸分子比率，选择所述比率以优化具有与其连接的模板核酸分子的大体上单克隆群体的载体的百分比。举例来说，可用以下的载体:模板核酸分子比率进行预植入反应：至少约1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1 10:1、25:1、50:1、75:1和100:1。在一些实施例中，在乳化液中进行PCR，其中如本文中其它地方所描述，在乳化液中的多个微反应器中进行PCR。
用于预植入载体的所描述方法包含在预植入反应期间固定一种或多种反应组分(例如一种或多种模板核酸分子和/或引物)，以防止扩增反应产物的交叉污染和随之而来的单克隆性降低。一个这类实例包含桥式扩增，其中扩增所需的所有引物(例如正向和反向引物)均与基质载体的表面连接。除这类固定以外，反应混合物中包含额外固定组分。举例来说，可在扩增期间，将模板核酸分子和/或扩增引物悬浮于凝胶或其它基质中，以防止扩增反应产物从合成位点迁移。这类凝胶和基质通常需要在之后去除，从而需要使用适当“熔解”或其它回收步骤且随之而来的产量损失。
在本发明传授内容的任一个实施例中，在等温条件下进行预植入反应。在一些实施例中，等温条件包含使反应在至少一些部分扩增(或整个扩增过程)期间经受约束在有限范围内的温度变化，包括例如等于或小于约10℃、或约5℃、或约1-5℃、或约0.1-1℃或小于约0.1℃的温度变化，或例如温度变化等于或小于或10℃、或5℃、或1-5℃、或0.1-1℃或小于0.1℃。等温反应的温度可通常在约15℃与65℃之间，例如在约15℃与55℃之间、在约15℃与45℃之间、在约15℃与37℃之间、在约30℃与60℃之间、在约40℃与60℃之间、在约55℃与60℃之间、在约35℃与45℃之间或在约37℃与42℃之间。在其它实施例中，不将预植入反应暴露于高于以下的温度：40℃、41℃、42℃、43℃、45℃或50℃。因此，在某些实施例中，不将反应混合物暴露于热起始条件。然而，应理解，在这些温度下使用的酶将需要组合优化，且可能需要改变酶，例如使用不同DNA聚合酶，如Bst而非Bsu。速率限制酶可以是聚合酶，其中高浓度或过量(即，非限制性)量的聚合酶或较低温度确保扩增反应基于聚合酶的动力学进行。
可进行预植入反应0.25分钟到240分钟，从而扩增核酸模板。在某些实施例中，进行预植入反应约0.25到240分钟，例如约0.25到120分钟、约0.25到60分钟、约0.25到30分钟、约0.25到15分钟、约0.25到10分钟、约0.25到7.5分钟、约0.25到5分钟或约2到5分钟。在其它说明性实施例中，进行预植入反应约1.5到10分钟，例如约1.5到8分钟、约1.5到6分钟、约1.5到5分钟或约1.5到4分钟，反应是等温反应，且反应的温度在约35℃与65℃之间，例如在约35℃与55℃之间、在约35℃与45℃之间、在约30℃与60℃之间、在约40℃与60℃之间、在约40℃与55℃之间、在约50℃与60℃之间或在约37℃与42℃之间。举例来说，可在等温反应中进行预植入反应约1到10分钟，其中反应温度可在约35℃与45℃之间，或可在等温反应中进行预植入反应约2到5分钟，其中反应温度可在37℃约与42℃之间。
在一些实施例中，进行方法而无需在扩增期间使双链模板核酸分子经受极限变性条件。举例来说，可进行方法而无需在扩增期间使模板核酸模板经受等于或大于模板的Tm的温度。在一些实施例中，进行方法而无需在扩增期间使模板与化学变性剂(NaOH、脲、胍盐和其类似物)接触。在一些实施例中，扩增包含等温扩增。
在一些实施例中，进行方法，而无需在约2与50个之间的连续循环、在约2与40个之间的连续循环、在约2与30个之间的连续循环、在约2与25个之间的连续循环、在约2与20个之间的连续循环或在约2与15个之间的连续循环期间，使模板核酸分子经受极限变性条件。举例来说，方法可包含在约2与50个之间的连续循环、在约2与40个之间的连续循环、在约2与30个之间的连续循环、在约2与25个之间的连续循环、在约2与20个之间的连续循环或在约2与15个之间的连续核酸合成循环，无需使核酸模板与化学变性剂接触或升高温度高于50℃或55℃。在一些实施例中，方法包含进行在约2与50个之间的连续循环、在约2与40个之间的连续循环、在约2与30个之间的连续循环、在约2与25个之间的连续循环、在约2与20个之间的连续循环或在约2与15个之间的连续核酸合成循环，而无需使核酸模板经受高于比模板或模板群体的实际或计算Tm(或模板或模板群体的实际或计算的平均Tm)低25℃、20℃、15℃、10℃、5℃、2℃或1℃的温度。连续核酸合成循环可包含或可不包含间插部分变性和/或引物延伸步骤。任选地，模板类复制的至少一个循环包含部分变性步骤、退火步骤和延伸步骤。在一些实施例中，预植入反应中的所连接的一致引物是长度在约5与100个核苷酸之间的腺苷或尿苷序列或腺苷与尿苷的某种组合，例如长度在约5与80个核苷酸之间、长度在约5与60个核苷酸之间、长度在约5与40个核苷酸之间、长度在约10与75个核苷酸之间、长度在约15与75个核苷酸之间或长度在约20与50个核苷酸之间。
预植入反应使得形成具有与其连接的大体上单克隆模板核酸分子群体的预植入的载体群体。在各种方面中，大体上单克隆模板核酸分子群体是在序列水平上具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％一致性的模板核酸分子。在一些实施例中，与预植入的载体连接的大体上单克隆模板核酸分子的百分比是与其连接的模板核酸分子的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在各种实施例中，预植入的载体群体中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的载体具有在预植入反应期间连接的大体上单克隆核酸分子群体。在说明性实施例中，预植入的载体群体中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的载体具有在预植入反应期间连接的大体上单克隆核酸分子群体。
在一些实施例中，预植入反应产生：零个模板核酸分子与其连接的载体(空固体载体)、一种类型的模板核酸分子与其连接的其它预植入的载体和多于一种类型的模板核酸分子与其连接的其它预植入的载体。在本发明传授内容的任一个实施例中，与一种或多种预植入的载体连接的大体上单克隆模板核酸分子群体中的所连接的模板核酸分子的数量是预植入数量。在任一个所公开的实施例中，预植入数量是在约1与150,000个之间的模板核酸分子，例如在约1与100,000个之间、在约1与75,000个之间、在约1与50,000个之间、在约1与25,000个之间、在约1与10,000个之间、在约1与5,000个之间或在约1与2,500个之间的模板核酸分子。在说明性实施例中，预植入数量是在约10与100,000个之间的模板核酸分子，例如在约10与75,000个之间、在约10与50,000个之间、在约10与25,000个之间、在约10与10,000个之间、在约10与5,000个之间或在约10与2,500个之间的模板核酸分子。
在一些实施例中，在预植入反应之后，大部分与载体连接的任何引物不与模板核酸分子结合。这些未结合引物可用于后续模板反应中以用于进一步扩增模板核酸分子。举例来说，在预植入反应之后，与载体连接的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的引物通常不与模板核酸分子结合。
在一些实施例中，本公开大体上涉及方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，其中所述方法通常包含在预植入反应之后的模板反应，其中进一步扩增预植入的载体上的模板核酸分子(在本文中被称作模板反应)。模板反应混合物不包含溶液中的额外模板核酸分子，使得在起始模板反应之前，与一种或多种预植入的载体连接的模板核酸分子是模板反应混合物中的模板核酸分子的主要来源或唯一来源。在说明性实施例中，在将其引入到模板反应混合物中之前，在一种或多种预植入的载体上进行一次或多次洗涤。在一些实施例中，在预植入反应混合物结束时，溶液中小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.1％的模板核酸分子存在于模板反应中。在本发明传授内容的任一个实施例中，模板反应混合物中在起始模板反应之前连接(已预植入)在一种或多种载体上的模板核酸分子的百分比，是反应混合物中的模板核酸分子的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。
在本发明传授内容的任一个实施例中，模板反应通常是RPA反应。因此，关于上文关于预植入反应所论述的RPA反应的组分和条件的任何详情适用于模板反应，不同之处在于模板核酸通常存在于预植入反应的初始反应混合物中，但不存在于模板反应的初始反应混合物中。模板反应混合物通常包含以下中的所有或一些：一种或多种预植入的固体载体，其包含所连接的大体上一致的第一引物群体，且具有与其连接的大体上单克隆模板核酸分子；聚合酶；重组酶；任选的单链结合蛋白；任选的重组酶负载蛋白；任选的第二引物或反向引物，其可与固体载体连接，但在说明性实例中其是在溶液中；dNTP；ATP；缓冲液；和任选地磷酸肌酸和肌酸激酶中的一个或两个。可添加二价阳离子，如MgCl2或Mg(OAc)2，以起始反应。在各种实施例中，缓冲液包含拥挤药剂，如PEG；Tris缓冲液；和/或乙酸钾盐。模板核酸分子上的正向引物结合序列与正向引物的至少一部分互补或一致，且模板核酸分子上的任选的反向引物结合序列与反向引物的至少一部分互补或一致。模板反应自身的反应混合物形成本发明的个别方面。在其它说明性实施例中，RPA模板反应是大批等温扩增，或是在多孔固体载体的孔中进行(例如参见本文中进一步论述的预植入扩增反应)。
在一些实施例中，在抑制过早反应起始的条件下，预培育模板反应混合物。举例来说，可从反应容器扣留模板反应混合物中的一种或多种组分，以防止过早反应起始。为了起始反应，添加二价阳离子(例如镁或锰)。在另一实例中，在抑制酶活性的温度下，预培育模板反应混合物。在约0-15℃或约15-25℃下，预培育反应物，以抑制过早反应起始。随后，可在较高温度下培育反应物，以提高酶促活性。在说明性实施例中，在反应期间，不将模板反应混合物暴露于高于42℃的温度。
由于模板反应通常是RPA反应，所以其是在等温条件下进行。在一些实施例中，等温条件包含使反应在至少一些部分扩增(或整个扩增过程)期间经受约束在有限范围内的温度变化，包括例如等于或小于约10℃、或约5℃、或约1-5℃、或约0.1-1℃或小于约0.1℃的温度变化，或例如温度变化等于或小于或10℃、或5℃、或1-5℃、或0.1-1℃或小于0.1℃。等温反应的温度可通常在约15℃与65℃之间，例如在约15℃与55℃之间、在约15℃与45℃之间、在约15℃与37℃之间、在约30℃与60℃之间、在约40℃与60℃之间、在约55℃与60℃之间、在约35℃与45℃之间或在约37℃与42℃之间约15℃。在其它实施例中，不将预植入反应暴露于高于以下的温度：40℃、41℃、42℃、43℃、45℃或50℃。因此，在某些实施例中，不将反应混合物暴露于热起始条件。然而，应理解，在这些温度下使用的酶将需要组合优化，且可能需要改变酶，例如使用不同DNA聚合酶，如Bst而非Bsu。速率限制酶可以是聚合酶，其中高浓度或过量(即，非限制性)量的聚合酶或较低温度确保扩增反应基于聚合酶的动力学进行。
在本发明传授内容的任一个实施例中，模板反应通常是RPA反应，其进行约0.25到240分钟，例如约0.25到120分钟、约0.25到60分钟、约0.25到30分钟、约0.25到15分钟、约0.25到10分钟、约0.25到7.5分钟、约0.25到5分钟或约2到5分钟。在说明性实施例中，进行模板反应约10到120分钟，例如约10到60分钟、约10到45分钟、约10到30分钟或约10到20分钟。在其它说明性实施例中，进行模板反应约20到60分钟，例如约20到50分钟、约20到40分钟、约20到35分钟或约20到30分钟。
在本发明传授内容的任一个实施例中，模板反应包含扩增一种或多种预植入的载体上的不同模板核酸分子的群体，以产生一种或多种模板化载体。举例来说，在模板反应之后，存在于模板化固体载体上的所连接的大体上单克隆模板核酸分子，可为存在于预植入固体载体上的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、25,000、50,000、100,000、250,000、500,000或106倍。在说明性实施例中，存在于模板化固体载体上的所连接的大体上单克隆模板核酸分子，为存在于预植入的固体载体上的至少10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、25,000或50,000倍。在一些实施例中，至少50,000、75,000或100,000个大体上单克隆模板核酸分子或在约25,000与1,000,000个之间的大体上单克隆模板核酸分子存在于预植入的固体载体上，例如在约25,000与500,000个之间、在约25,000与250,000个之间、在约25,000与125,000个之间或在约25,000与100,000个之间的大体上单克隆模板核酸分子存在于预植入的固体载体上。在模板反应期间，一个或多个载体通常仍流体联通。
由于根据本发明传授内容，预植入反应可以是RPA反应且模板反应通常是RPA反应，所以方法包含依序RPA反应。第一RPA反应是预植入反应，随后是第二RPA模板反应。在相同条件下进行反应。然而，在说明性实施例中，进行预植入RPA反应，使得发生比模板RPA反应少的扩增循环。举例来说，预植入RPA反应可进行比模板RPA反应短的时间，所述模板RPA反应扩增与通过预植入的RPA反应所产生的预植入的固体载体连接的模板核酸分子。作为非限制性说明性实例，进行预植入RPA反应2到5分钟，以产生一种或多种例如预植入的固体载体群体，随后使其经受模板RPA反应，所述模板RPA反应进行10到60分钟。在这些非限制性说明性实例中，在模板RPA反应之前，从预植入的固体载体洗掉包含模板核酸的反应组分。预植入和模板反应中均包含预植入和模板反应的所有其它反应组分，除模板核酸分子在溶液中以外。
在一些实施例中，在模板反应之后，具有与其连接的大体上单克隆模板核酸分子的载体群体中的一个或多个载体上的位点的百分比是总扩增载体(即，总载体包含模板核酸分子的空、多克隆或大体上单克隆群体)的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在说明性实施例中，在模板反应之后，具有与其连接的大体上单克隆模板核酸分子的载体群体中的一个或多个载体上的位点的百分比是从反应混合物回收的总扩增载体(即，总载体包含模板核酸分子的空、多克隆或大体上单克隆群体)的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，在模板反应之后，具有与其连接的大体上单克隆模板核酸分子的载体群体中的一个或多个载体上的位点的百分比是从反应混合物回收的总载体(即，总载体包含未连接模板核酸分子的载体，和具有模板核酸分子的多克隆或大体上单克隆群体的载体)的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在说明性实施例中，在模板反应之后，具有与其连接的大体上单克隆模板核酸分子的载体群体中的一个或多个载体上的位点的百分比是从反应混合物回收的总载体(即，总载体包含未连接模板核酸分子的载体，和具有模板核酸分子的多克隆或大体上单克隆群体的载体)的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施例中，引物的至少一部分与模板反应混合物中的聚核苷酸的至少一条链的一部分杂交。举例来说，引物的至少一部分可与同聚核苷酸的一端或两端接合的核酸衔接子杂交。在一些实施例中，引物的至少一部分与聚核苷酸的一部分或与核酸衔接子部分或完全互补。在一些实施例中，引物兼容适用于任何类型的测序平台，包含化学降解平台、链终止平台、合成测序平台、焦磷酸酯平台、大规模平行平台、离子敏感平台和单分子平台。
在一些实施例中，引物(例如第一、第二或第三引物)具有不与反应混合物中的聚核苷酸的至少一条链的一部分杂交的5'或3'突出端尾部(带尾引物)。在一些实施例中，带尾引物具有任何长度，包含长度在约1与100个核苷酸之间，例如在约1与90之间、长度在约1与80个核苷酸之间、长度在约1与70个核苷酸之间、长度在约1与60个核苷酸之间、长度在约1与50个核苷酸之间、长度在约1与40个核苷酸之间或长度在约1与30个核苷酸之间。
所公开的方法使得产生扩增子群体，在某些实施例中，所述扩增子中的至少一些包含扩增的核酸群体。通过本公开的方法所产生的扩增群体适用于各种目的。在一些实施例中，所公开的方法(和相关组合物、系统和试剂盒)任选地包含对扩增的群体(扩增子)的进一步分析和/或操纵。举例来说，在一些实施例中，检测呈现某些期望特性的扩增子的数量且任选地进行量化。在一些实施例中，在扩增之后，对扩增产物进行测序。进行测序的扩增产物可以是呈大体上单克隆核酸群体的扩增子。在一些实施例中，所公开的方法包含扩增在不同位点处或在不同载体上的扩增子群体的单一成员。不同位点任选地形成位点阵列的一部分。在一些实施例中，位点阵列中的位点包含isFET阵列表面上的孔(反应室)。任选地，将待测序的核酸分子置于位点处。位点可包含反应室或孔。位点可以是类似或一致位点阵列的一部分。阵列可包含表面上(例如流动池、电子装置、电晶体芯片、反应室、通道和其类似物的表面)的二维位点阵列、或基质或其它介质(例如固体、半固体、液体、流体和其类似物)内的三维位点阵列。在本发明传授内容的任一个实施例中，将位点可操作地耦接到传感器。所述方法包含使用传感器检测核苷酸并入。任选地，位点和传感器位于耦接到传感器的位点阵列中。
在本发明传授内容的任一个实施例中，在模板反应之后，模板化载体具有至少50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000或500,000个与各模板化载体连接的大体上单克隆模板核酸分子。在一些实施例中，在模板反应之后，模板化载体具有在约50,000与500,000个之间的与各模板化载体连接的大体上单克隆模板核酸分子，例如在约50,000与400,000个之间的大体上单克隆模板核酸分子、在约50,000与300,000个之间的大体上单克隆模板核酸分子、在约50,000与200,000个之间的大体上单克隆模板核酸分子或在约50,000与100,000个之间与各模板化载体连接的大体上单克隆模板核酸分子。在说明性实施例中，在模板反应之后，模板化载体具有在约100,000与400,000个之间的与连接的大体上单克隆模板核酸分子、在约100,000与300,000个之间的大体上单克隆模板核酸分子、在约100,000与200,000个之间的大体上单克隆模板核酸分子或在约150,000与300,000个之间与各模板化载体连接的大体上单克隆模板核酸分子。
在任一个所公开的实施例中，对于载体上的扩增的模板核酸分子进行测序。测序方法可包含所属领域中已知的任何适合的测序方法。在一些实施例中，在任何核酸测序工作流程中使用已根据本发明传授内容进行扩增的模板核酸分子，包含通过寡核苷酸探针接合和检测(例如SOLiDTM，来自Life Technologies，WO 2006/084131)进行的测序、探针-锚接合测序(例如Complete GenomicsTM或PolonatorTM)、合成测序(例如基因分析仪和HiSeqTM，来自Illumina)、焦磷酸酯测序(例如基因组测序仪FLX，来自454Life Sciences)、离子敏感性测序(例如个性化基因组机器(PGMTM)、Ion ProtonTM测序仪、Ion S5和Ion S5 XL，全部均来自Ion TorrentTM Systems,Inc.)、单分子测序平台(例如HeliScopeTM，来自HelicosTM)、通过读取在碱基穿过纳米孔时的个别碱基的纳米孔测序(例如MinION，来自OxfordNanopore Technologies)、化学降解测序、毛细电泳法、凝胶电泳，和任何其它下一代、大规模平行测序平台。
在一些测序装置中，例如Ion Torrent Systems，在表面(例如半导体芯片)的微孔中进行测序反应。在包含反应室(如孔)的测序装置中使用珠粒载体的示范性实施例描绘于图8中。举例来说，参考图8，示范性测序装置416包含孔阵列418。将包含待测序的靶聚核苷酸402的珠粒载体406与磁性珠粒410连接，以形成设计成用于将具有连接的靶聚核苷酸的珠粒载体引入到孔中的珠粒组装件412。在一些实施例中，通过双链聚核苷酸连接，将磁性珠粒410与珠粒载体406连接。在一些情况下，使连接子部分与珠粒载体406上的靶聚核苷酸的一部分杂交。在这个实例中，连接子部分与磁性珠粒410上的互补连接子部分连接。在另一实例中，用于形成与珠粒406连接的靶核酸的模板聚核苷酸包含与磁性珠粒410连接的连接子部分。在另一实例中，从修饰具有与磁性珠粒410连接的连接子的引物，产生与同珠粒载体406连接的靶聚核苷酸互补的模板聚核苷酸。在一些实施例中，与聚核苷酸连接的连接子部分和与磁性珠粒连接的连接子部分彼此互补且彼此连接。在一实例中，连接子部分具有亲和力且包含：抗生物素蛋白部分与生物素部分；抗原表位与抗体或其免疫反应性片段；抗体与半抗原；地高辛部分与抗地高辛抗体；荧光素部分与抗荧光素抗体；操纵子与抑制子；核酸酶与核苷酸；凝集素与多醣；类固醇与类固醇结合蛋白；活性化合物与活性化合物受体；激素与激素受体；酶与底物；免疫球蛋白与蛋白A；或寡核苷酸或聚核苷酸与其对应互补序列。在一特定实例中，与聚核苷酸连接的连接子部分包含生物素，且与磁性珠粒连接的连接子部分包含抗生蛋白链菌素。
如图8中所描绘的实施例中所说明，将多个珠粒载体404以及多个聚核苷酸402(靶聚核苷酸或模板聚核苷酸)置于溶液中。将多个珠粒载体404活化或以其它方式制备以与聚核苷酸402结合。举例来说，珠粒载体404包含与多个聚核苷酸402中的一聚核苷酸的一部分互补的寡核苷酸(捕获引物)。在另一实例中，使用技术，如生物素-抗生蛋白链菌素结合，珠粒载体404被修饰具有靶多核苷酸402。在一特定实施例中，使亲水性珠粒粒子和聚核苷酸经受聚合酶链式反应(PCR)扩增或重组酶聚合酶扩增(RPA)。模板聚核苷酸将与捕获引物杂交。捕获引物延伸以形成包含与其连接的靶聚核苷酸的珠粒406。其它珠粒可仍未与靶核酸连接，且其它模板聚核苷酸可自由浮动于溶液中。多种方法可用于植入珠粒载体和被磁性珠粒捕获。举例来说，转向图9的502处，模板聚核苷酸(B*-A)被与珠粒载体510连接的的捕获探针(B)捕获。与模板聚核苷酸互补的捕获探针(B)延伸，从而产生B-A*。任选地，将所得双链聚核苷酸变性，从而去除模板核酸(B*-A)且留下与珠粒载体510连接的单链(B-A*)。如图9的504处所图示，使修饰具有连接子部分(如生物素)的引物(A)与同珠粒载体510连接的核酸(B-A*)的部分(A*)杂交。任选地，引物(A)延伸，以形成互补核酸(A-B*)。如506处所示，将磁性珠粒512引入到溶液中。磁性珠粒512包含与同引物(A)连接的连接子部分互补的连接子。在这个实例中，与引物(A)连接的连接子是生物素，且磁性珠粒512涂覆有抗生蛋白链菌素。磁性珠粒512可用以清洁溶液和帮助将珠粒载体510和所连接的核酸(B-A*)置放到测序装置的孔中。如图9的508中所图示，在一些情况下，506的使双链聚核苷酸变性，使得从与珠粒载体510连接的核酸(B-A*)脱杂交出核酸(B*-A)。因此，将珠粒载体510置放到测序装置的孔中，且所述珠粒载体具有单链靶核酸(B-A*)。替代地，连接子修饰的探针(A)可能不延伸，以形成具有一定长度的聚核苷酸(B-A*)的互补聚核苷酸。可使用聚合酶链式反应(PCR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)或其它扩增反应来进行延伸反应。
转回图8，在使用磁性珠粒来帮助将珠粒载体和所连接的核酸置放到测序装置的孔中的一实施例中，将珠粒组装件412涂覆在包含孔418的测序装置的基底416上。在一实例中，可向基底416施加磁场以将珠粒组装件412的磁性珠粒410牵拉向孔418。珠粒载体406进入孔418。举例来说，磁体可平行于基底416的表面移动，从而使得将珠粒载体406置放于418孔中。使珠粒组装件412变性，以去除磁性珠粒410，将珠粒载体406留在孔418中。举例来说，可使用热循环或离子性溶液使珠粒组装件412的杂交的双链DNA变性，以释放磁性珠粒410和具有与磁性珠粒410连接的连接子部分的模板聚核苷酸。任选地，可如在模板反应中扩增靶多核苷酸406，同时在孔418中，提供具有靶多核苷酸的多个拷贝的珠粒载体414。特定来说，珠粒414具有靶聚核苷酸的单克隆群体。例如使用聚合酶链式反应(PCR)扩增、重组聚合酶扩增(RPA)或其组合，来进行这类扩增反应。在一特定实施例中，酶(如聚合酶)存在、结合于或紧密靠近于粒子或珠粒。在一实例中，聚合酶存在于溶液中或孔中以促进聚核苷酸的复制。本文所描述的方法中可使用多种核酸聚合酶。在一示范性实施例中，聚合酶可包含可催化聚核苷酸复制的酶、其片段或亚基。在另一实施例中，聚合酶可以是天然存在的聚合酶、重组聚合酶、突变聚合酶、变异聚合酶、融合物或以其它方式工程改造的聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子或类似物、其衍生物或片段。尽管珠粒载体414的聚核苷酸示出为在表面上，但聚核苷酸可延伸在珠粒载体414内。具有相对于水的低浓度聚合物的水凝胶和亲水性粒子可包含珠粒载体414的内部上和整个中的聚核苷酸区段，或聚核苷酸可存在于孔和其它开口中。特定来说，在一些实例中，珠粒载体414准许用于监测反应的酶、核苷酸、引物和反应产物扩散。每个粒子大量聚核苷酸产生更好的信号。
在一些实施例中，测序包含通过利用聚合酶进行的核苷酸并入，使模板核酸分子或扩增模板核酸分子延伸，或使与模板或扩增模板杂交的测序引物延伸。在一些实施例中，测序包含通过使模板或延伸引物与测序引物、聚合酶和至少一种类型的核苷酸接触，对与载体连接的模板或扩增模板进行测序。在一些实施例中，测序包含使模板或扩增模板或延伸引物与测序引物、聚合酶和与仅一种类型的不包含外来标记或链终止基团的核苷酸接触。在一些实施例中，使用与聚核苷酸构筑体的任何部分(包含核酸衔接子或靶聚核苷酸序列)杂交的至少一种测序引物，来进行测序反应。
返回到图8，在一实例中，向孔418添加测序引物，或在放置于孔418中之前，将珠粒载体414预先暴露于引物。特定来说，珠粒载体414包含结合的测序引物。测序引物和聚核苷酸形成包含与测序引物杂交的聚核苷酸(例如模板核酸)的核酸双螺旋。核酸双螺旋是至少部分地双链聚核苷酸。向孔418提供酶和核苷酸以促进可检测的反应，如核苷酸并入。在一些实施例中，测序涉及检测核苷酸添加。检测核苷酸添加的方法包含荧光发射方法或离子检测方法。举例来说，向系统416提供一组荧光标记的核苷酸且将其迁移到孔418中。还向孔418提供激发能。当核苷酸被聚合酶捕获且添加到延伸引物的末端时，核苷酸标记发荧光，从而指示添加了哪种类型的核苷酸。在一替代实例中，依序馈入包含单一类型的核苷酸的溶液。响应于核苷酸添加，孔418的局部环境内的pH可改变。这种pH改变可以通过离子敏感性场效应晶体管(ISFET)检测。因此，pH改变可用于产生指示与粒子410的聚核苷酸互补的核苷酸的次序。
在离子类核酸测序的典型实施例中，通过检测通过聚合酶催化的延伸反应产生的氢离子的存在和/或浓度来检测核苷酸并入。在一个实施例中，可将模板核酸分子，任选地预结合于测序引物和/或聚合酶的模板核酸分子，负载到反应室中，之后重复核苷酸添加循环且进行洗涤。在一些实施例中，这类模板作为大体上单克隆群体与载体(如粒子、珠粒或类似物)连接，且将所述大体上单克隆群体负载到反应室中。
在循环的每个添加步骤中，斤当模板中的下一个碱基是溶液中所添加的核苷酸的互补碱基时，聚合酶通过并入所添加的核苷酸来延伸引物。如果模板核酸分子上存在一个互补碱基，那么一个并入；如果模板核酸分子上存在连续两个互补碱基，那么存在两个并入；如果三个，那么存在三个并入；等。在每个这类并入的情况下，存在所释放的氢离子，且模板释放氢离子群体共同地改变反应室的局部pH。氢离子的产生与模板中的连续互补碱基数量(以及具有引物和聚合酶的参与延伸反应的模板分子总数)单调相关。因此，当模板中存在许多连续一致互补碱基(即，均聚物区域)时，所产生的氢离子的数量和因此局部pH变化的幅值与连续一致互补碱基的数量成正比。如果模板中下一个碱基不与所添加的核苷酸互补，那么不会发生并入且不释放氢离子。在一些实施例中，在添加核苷酸的各个步骤之后，进行额外步骤，其中使用在预定pH下的无缓冲洗涤溶液来去除前述步骤的核苷酸以防止随后循环中的误并入。在一些实施例中，在添加核苷酸的每个步骤之后，进行额外步骤，其中用核苷酸破坏剂(如腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase))处理反应室以消除残留在腔室中的可能在随后循环中产生假延伸的任何残余核苷酸。
在特定实施例中，测序系统包含安置于离子性传感器(如场效应晶体管(FET)的传感器垫上的孔或多个孔。在一些实施例中，FET是FET阵列。FET或阵列可包含例如102、103、104、105、106、107或更多FET。在实施例中，系统包含负载到安置于离子性传感器(例如FET)的传感器垫上的一孔中的一个或多个聚合物粒子，或安置于离子性传感器(例如FET)的传感器垫上的多个孔中的一个或多个聚合物粒子。在实施例中，FET是chemFET或ISFET。“chemFET”或化学场效应晶体管包含充当化学传感器的场效应晶体管类型。chemFET具有MOSFET晶体管的结构类似物，其中栅极电极上的电荷通过化学方法施加。“ISFET”或离子敏感性场效应晶体管用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(如H+)改变时，通过晶体管的电流因此改变。在一些实施例中，在FET传感器阵列上制造一个或多个微流体结构，以提供生物学或化学反应的容纳或约束。举例来说，在一个实施方案中，微流体结构被配置成安置于阵列的一个或多个传感器上方的一个或多个孔(或孔、或反应室、或反应孔，因为所述术语在本文中可互换使用)，使得其上安置既定孔的一个或多个传感器检测和测量既定孔中的分析物存在、水平或浓度。在实施例中，FET传感器和反应孔之间可存在1:1对应。
返回图8，在另一实例中，将孔阵列的孔418可操作地连接到测量装置。举例来说，对于荧光发射法，可将孔418可操作地耦接到光检测装置。在离子性检测的情况下，孔418的下表面可安置于离子性传感器(如场效应晶体管)的传感器垫上。
在一些实施例中，将不同类别的核苷酸依序添加到反应室，使得将各反应物以一次一个地暴露于不同核苷酸。举例来说，按以下顺序添加核苷酸：dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dATP、dCTP、dGTP、dTTP等；其中各暴露之后是洗涤步骤。视所需序列信息长度而定，循环可以重复50次、100次、200次、300次、400次、500次、750次或更多次。
在一些实施例中，方法(和相关组合物、系统和试剂盒)包含任选地使用FET，检测在阵列的一位点处的一种或多种核苷酸并入副产物的存在。在一些实施例中，方法包含任选地使用FET，检测在至少一个反应室内发生的pH改变。在一些实施例中，所公开的方法进一步包含检测由于至少一个扩增循环所致的至少一个位点中的离子浓度的变化。
一种涉及通过检测核苷酸并入的离子性副产物测序的示范性系统是Ion TorrentPGMTM、ProtonTM或S5TM测序仪(Thermo Fisher Scientific)，其是通过检测作为核苷酸并入的副产物产生的氢离子来对核酸模板进行测序的离子类测序系统。通常，氢离子作为使用聚合酶的模板依赖性核酸合成期间发生的核苷酸并入的副产物释放。Ion Torrent PGMTM、ProtonTM或S5TM测序仪通过检测核苷酸并入的氢离子副产物来检测核苷酸并入。在一些实施例中，Ion Torrent PGMTM、ProtonTM或S5TM测序仪包含待测序的多个模板聚核苷酸，各模板安置在阵列中的个别测序反应孔内。将阵列的孔各自耦接到检测作为核苷酸并入的副产物所产生的H+离子的释放或溶液pH改变的至少一个离子传感器。离子传感器包括耦接到感测H+离子的存在或溶液pH改变的离子敏感性检测层的场效应晶体管(FET)。离子传感器提供指示核苷酸并入的输出信号，其可表示为电压变化，其幅值与个别孔或反应室中的H+离子浓度相关。将不同核苷酸类型连续流入反应室，且可通过聚合酶以通过模板序列测定的次序并入到延伸引物(或聚合位点)中。举例来说，含有流控回路的测序系统通过入口连接到至少两个试剂储槽、废液储槽，和通过用于流体连通的流体路径连接到生物传感器。来自储槽的试剂通过多种方法(包含压力、泵(例如注射泵)、重力供给和类似方法)来驱动到流控回路，且通过阀的控制来选择。驱动来自流控回路的试剂通过从控制系统接受信号的阀。控制系统包含阀的控制器，其通过电连接产生用于打开和关闭的信号。控制系统还包含系统的其它组件的控制器，如通过电连接连接到其上的洗涤溶液阀和参考电极。各核苷酸并入伴随着反应孔中的H+离子释放，以及局部pH中的伴随改变。通过传感器的FET登记H+离子的释放，所述FET产生指示发生核苷酸并入的信号。在特定核苷酸流动期间未并入的核苷酸可能不产生信号。来自FET的信号的幅值也可与并入到延伸核酸分子中的特定类型的核苷酸的数量有关，从而准许解析均聚物区域。因此，在测序仪运行期间，多个核苷酸流入反应室中以及在多个孔或反应室中并入监测，准许仪器同时解析多个核酸模板的序列。
在一些实施例中，下游分析的方法包含对扩增子群体中的至少一些进行平行测序。任选地，对位于阵列的不同位点的多个模板/扩增模板/延伸第一引物进行平行测序。
在一些实施例中，测序包含使测序引物与至少两种不同的模板核酸分子或至少两种不同的大体上单克隆群体的核酸分子结合。在一些实施例中，测序包含使用聚合酶，将核苷酸并入到测序引物的3'OH上。任选地，并入包含形成至少一种核苷酸并入副产物。
在本公开的涉及将模板核酸分子分配到isFET阵列的孔中和后续在阵列的孔内部进行模板扩增的实施例中，在量化包含扩增产物的位点或孔的数量的扩增之后，进行任选的下游分析步骤。在一些实施例中，检测核酸扩增反应的产物，以便计数包含扩增模板的位点或孔的数量。在一些实施例中，在扩增之后，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的孔包含模板核酸分子的大体上单克隆群体。
在一些实施例中，将模板化载体分配到单独反应室(例如孔阵列)中以用于测序。在一些实施例中，至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的反应室具有含模板核酸分子的大体上单克隆群体的模板化载体。在一些实施例中，约25％与95％之间的反应室具有含模板核酸分子的大体上单克隆群体的模板化载体，例如在约25％与85％之间、在约25％与75％之间、在约35％与95％之间、在约35％与85％之间、在约35％与75％之间、在约45％与95％之间、在约45％与85％之间、在约45％与75％之间、在约55％与95％之间、在约55％与85％之间、在约55％与75％之间、在约65％与95％之间、在约65％与85％之间、在约65％与75％之间、在约75％与95％之间、在约75％与85％或在约85％与95％之间的反应室具有含模板核酸分子的大体上单克隆群体的模板化载体。在一些实施例中，单独反应室是测序芯片上的孔。在一些实施例中，不大于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的孔产生低质量结果，其中通过测序方法测定低质量孔。
在各种实施例中，本文中所描述的方法、系统和计算机可读媒体可以有利地用于处理和/或分析从电子或电荷类核酸测序获得的数据和信号。在电子或电荷类测序(如pH类测序)中，可以通过检测作为聚合酶催化的核苷酸延伸反应的天然副产物产生的离子(例如，氢离子)确定核苷酸并入事件。这可用于对模板核酸分子进行测序，所述模板核酸分子可以是例如所关注核酸序列的片段，且其可作为核酸分子的大体上单克隆群体直接或间接连接在载体(如粒子、微粒、珠粒等)上。样本或模板核酸可可操作地与引物和聚合酶相连，且可经受重复循环或核苷酸添加的“流动”(其在本文中可称为“核苷酸流动”，由其可产生核苷酸并入)和洗涤。引物可与样本或模板结合，使得每当添加与模板中的下一碱基互补的核苷酸时，引物的3'端通过聚合酶延伸。随后，基于核苷酸流动的已知序列和基于从化学传感器所测得的指示在每个核苷酸流动期间的离子浓度的输出信号，可以确定与耦接到化学传感器的反应区中存在的样本核酸结合的核苷酸的类型、序列以及数量的鉴定。
在模板反应中，可产生足够数量的大体上单克隆或单克隆群体，以在Ion TorrentPGMTM314、316或318测序仪上产生至少100MB、200MB、300MB、400MB、500MB、750MB、1GB或2GB的AQ20测序读段。关于相关高通量系统，可在单一扩增反应中产生足够数量的大体上单克隆或单克隆扩增子，以在Ion Torrent Proton、S5或S5XL测序仪上产生至少100MB、200MB、300MB、400MB、500MB、750MB、1GB、2GB、5GB、10GB或15GB的AQ20测序读段。如本文所用，术语“AQ20”和其变化形式是指一种测量Ion Torrent PGMTM测序仪中的测序准确性的特定方法。可关于Phred样Q评分测量准确性，所述Q评分在对数尺度上测量准确性：Q10＝90％，Q20＝99％，Q30＝99.9％，Q40＝99.99％和Q50＝99.999％。举例来说，在特定测序反应中，可以通过预测算法或通过与已知参考基因组的实际比对来计算准确性度量值。预测的质量评分(“Q”评分)可从查看输入信号的固有特性的算法导出且关于测序“读段”中所包括的既定单一碱基是否将比对获得极其准确的估计值。在一些实施例中，这类预测的质量评分适用于在下游比对之前过滤且去除较低质量读段。在一些实施例中，关于在对数尺度上测量准确性的Phred样Q评分报告准确性以使得：Q10＝90％，Q17＝98％，Q20＝99％，Q30＝99.9％，Q40＝99.99％和Q50＝99.999％。在一些实施例中，过滤从既定聚合酶反应获得的数据以仅测量聚合酶读段，其测量“N”个核苷酸或更长核苷酸且具有超过某一阈值的Q评分，例如Q10、Q17、Q100(在本文中被称作“NQ17”评分)。举例来说，100Q20评分可指示从给定反应获得的读段数量，其长度为至少100个核苷酸且Q评分为Q20(99％)或更大。类似地，200Q20评分可以指示长度为至少200个核苷酸且Q评分为Q20(99％)或更大的读段数量。
在一些实施例中，基于使用参考基因组序列的适当比对计算准确性，在本文中被称作“原始”准确性。与测量作为多个读段的结果的与共有序列的误差率的共有准确性相反，这是涉及测量与单一读段相关的“真实”每个碱基误差的单向准确性。原始准确性测量值可以在“AQ”评分(针对比对质量)方面报告。在一些实施例中，过滤从既定聚合酶反应获得的数据以仅测量聚合酶读段，其测量“N”个核苷酸或更长核苷酸，具有超过某一阈值的AQ评分，例如AQ10、AQ17、AQ100(在本文中被称作“NAQ17”评分)。举例来说，100AQ20评分可指示从既定聚合酶反应获得的读段的数量，其长度为至少100个核苷酸且AQ评分为AQ20(99％)或更大。类似地，200AQ20评分可指示长度为至少200个核苷酸且AQ评分为AQ20(99％)或更大的读段数量。
在一些实施例中，本公开提供用于在预植入反应随后模板反应中进行核酸扩增的试剂盒。本文所论述的组合物也服从试剂盒格式，其中引物和扩增组分可在同一容器中、单独容器中，且呈液体或脱水形式。试剂盒可包含用于进行扩增模板核酸分子的方法的说明书，所述方法包含用于下游测序方法的预植入反应。在一个实施例中，试剂盒提供关于核酸测序制备的说明书。
在一些实施例中，一种试剂盒，其包含至少两个容器，其中至少一个包含引物且其中至少一个包含重组酶。重组酶和引物可在相同或不同管中。在一些实施例中，至少一种引物与一种或多种载体连接。试剂盒可进一步包含一种或多种预植入的固体载体。
在一些实施例中，包含重组酶的容器进一步包含一种或多种扩增试剂，其包含重组酶辅助蛋白、聚合酶、dNTP和缓冲液。在某些实施例中，试剂盒包含具有以下的一个或多个容器：uvsX重组酶、uvsY重组酶负载蛋白、gp32蛋白、Sau DNA聚合酶、dNTP、ATP、磷酸肌酸和肌酸激酶。
在一些实施例中，试剂盒包含以下的任何组合：任选地具有所连接的至少一种引物的群体的一种或多种固体载体、聚核苷酸、重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白(SSB)、聚合酶、核苷酸、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、杂交溶液、洗涤溶液、缓冲液和/或阳离子(例如二价阳离子)。试剂盒可包含这些组分中的所有或一些，通常是在至少两个单独容器中。试剂盒可包含预植入反应混合物或模板反应混合物的组分中的任一个。
提出以下实例以便提供所属领域的一般技术人员如何使用本发明传授内容的实施例的完整公开内容和描述，且并不打算限制本公开的范围，它们也不打算表示以下实例是所执行的所有或仅有实验。已努力确保关于所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应当考虑到一些实验性误差和偏差。除非另外指示，否则份数是按体积计的份数，且温度是以摄氏度为单位。应理解，可以在不改变实例意图说明的基本方面的情况下，对所描述的方法进行改变。
实例
实例1.在大批等温扩增之前，用单一循环PCR，预植入P1离子球形粒子(ISP)
这个实例提供一种在等温扩增以用于下游下一代测序之前预植入具有单克隆模板的ISP的方法。这些预植入的ISP在等温扩增步骤期间在溶液中不需要额外模板，且能够生成产生比不具有预植入的模板的ISP(非模板对照或“NTC”)更好的测序结果的模板。对具有正向P1衔接子的Ion Torrent ISP(“P1ISP”)预植入不同拷贝数的单克隆模板，且在大批等温扩增中扩增(“Bulk IA”)。将预植入的ISP与无模板对照(“NTC”)ISP进行比较，所述无模板对照ISP在模板反应期间而非在模板反应之前的预植入反应期间具有所添加的相同模板聚核苷酸。使用各种度量，比较不同扩增反应产生的测序结果。
产生模板核酸分子
使用来自Oncomine Focus Assay(OFA)(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)的PCR引物1、12和13，从基因组DNA扩增DNA。在第二带尾PCR的10个循环期间，向扩增子中，添加促进与植入反应中使用的溶液中的所固定引物B和引物A结合的衔接子。扩增产生3个模板：OFA 1 AB，19.2ng/μl(148nM)；OFA 12 AB，15.6ng/μl(100nM)；和OFA 13AB，17.2ng/μl(76nM)。
预植入反应
制备OFA 1AB、OFA 12AB和OFA 13AB模板的稀释液，且用于在预植入反应中产生单独预植入的P1 ISP。预植入反应包含6.67μl具有固定的引物B的P1 ISP(400,000,000ISP)、88.33μl 1X铂HiFi混合物(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)和5μl适当的模板稀释液，以产生所需数量的大体上单克隆模板分子(对于P1 ISP，拷贝数为70,665和4,170)将ISP预植入反应混合物置于热循环仪中以进行98℃的变性步骤2min，随后98℃持续25秒和56℃持续10min，以产生预植入的ISP。为了检查ISP的相对大小，将1μl各预植入的P1 ISP稀释于999μl退火缓冲液(Ion PGMTM Hi-QTM View Sequencing Solution，(产品号A30275))中，且使用Guava easyCyte流式细胞仪(EMD Millipore，马萨诸塞州比尔里卡)分析。也分析在不存在结合的模板下，NTC P1 ISP的相对大小。
在总体积1ml的OneTouch Wash Solution洗涤缓冲液中，洗涤残留的预植入的P1ISP两次。在第一次洗涤之后，在>21,000g下离心样本8min，且去除上清液，留下～100μl。在第二次洗涤和离心之后，去除上清液，留下～50μl样本于管中。随后，样本用300μl新鲜制备的熔脱溶液(melt off solution)(125mM NaOH，0.1％Tween 20)处理，且在室温下培育5分钟之前充分地涡旋。随后，这些样本用无核酸酶(nuclease-free；NF)的H2O洗涤三次，最终体积为1ml。在每一次洗涤之后，在>21,000g下离心样本8min，且去除上清液，留下～100μl。为了检查在最后一次洗涤之后预植入的P1 ISP的大小，将1μl各预植入的P1 ISP稀释于99μl退火缓冲液中，且使用Guava easyCyte流式细胞仪分析。也分析在不存在结合的模板下，NTC P1 ISP的相对大小。
测定预植入的P1 ISP上的拷贝数量
基于在洗涤之后来自Guava easyCyte流式细胞仪的样本计数，制备预植入的P1ISP的稀释液，得到50,000、5,000、500或50ISP/μl。这些稀释液如下用于qPCR中：10μl FastSYBR(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)、0.2μl 10μM截短的PCR A引物(5'-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TC-3'；SEQ ID NO:2)、0.2μl 10μM截短的PCR B引物(5'-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TG-3'；SEQ ID NO:3)、2μl预植入的P1 ISP和7.6μl NF H2O。将反应混合物置于实时PCR仪中以进行95℃变性步骤20秒，随后40个循环(95℃持续3秒和60℃持续30秒)。将各qPCR反应的Ct与具有已知分子数量的qPCR反应的Ct值进行比较，以计算各ISP上的单克隆模板的拷贝数。将具有相同的预植入的模板量的样本合并，以获得各组每ISP的平均拷贝数。
模板反应
将具有相同的各单克隆模板的拷贝数的预植入的P1 ISP合并，即将已预植入有70个OFA 1 AB、OFA 12 AB或OFA 13 AB拷贝的P1 ISP全部合并，和类似地将预植入有665个模板拷贝的P1 ISP合并，以及将预植入有4,170个模板拷贝的P1 ISP合并。将预植入的P1 ISP(100μl，含有～375,000,000个预植入的P1 ISP)的池与4μl引物混合物S(Ion PGMTMTemplate IA 500试剂盒，ThermoFisher Scientific)合并于不与任何底物连接的溶液中，其中模板核酸分子在近侧区段相反的末端处或其附近包含第二引物的引物结合位点)和146ISP稀释缓冲，两个均来自Ion PGMTM Template IA 500。将NTC P1 ISP(100μl，含有375,000,000个ISP)与4μl引物混合物S、131μl ISP稀释缓冲液和三个5μl文库等分试样合并。两个Ion PGMTM Template IA(等温扩增)团块各自用720μl复水缓冲液复水，涡旋和短暂旋转。脱水的模板IA团块含有T7聚合酶、uvsX重组酶、uvsY重组酶负载蛋白、gp32蛋白、Bsu DNA聚合酶、dNTP、ATP、硫氧还蛋白、磷酸肌酸和肌酸激酶。在试剂盒(管2)供应的120μL复水缓冲液(25mM Tris，pH 8.3；5mM DTT；3mM dNTP；3.5625％海藻糖；0.1mg/ml肌酸激酶；1.1375mg/ml Twist gp32；0.4mg/ml UvsX；0.1mg/ml UvsY；0.25mU/μL PPi酶；0.02mg/mlSau Pol；0.03063mg/ml T7 Dbl Exo-Pol；0.0225mg/ml硫氧还蛋白(5×)；1.425％PEG 35)中，将来自TwistAmpTM基础试剂盒的四个团块复水。涡旋且旋转重组酶溶液，随后冰冻。向预植入的P1 ISP和NTC ISP的各池中，添加360μl复水的团块溶液。将溶液充分地涡旋且短暂旋转。在40℃下进行模板反应30分钟。为了终止模板反应，添加650μl 100mM EDTA，涡旋溶液，且短暂旋转管。
富集模板化ISP
使用MyOne珠粒(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)来富集模板化ISP。简言之，将各终止的模板反应物分成2管，且向各管中添加100μl MyOne珠粒。在室温下旋转管15分钟，旋转，且置于磁性管架上。在珠粒充分集结之后，去除上清液且丢弃。随后，每管使用500μl 3mM SDS溶液，将类似样本合并，使得各类似样本组具有总共1ml 3mM SDS。充分地涡旋管，短暂旋转，且将其置于磁性管架上2分钟。去除上清液，且从磁性管架移出管。珠粒用200μl熔出溶液(125mM NaOH和0.1％Tween 20)再悬浮，充分地涡旋且短暂旋转。在2分钟室温培育之后，将珠粒溶液置于磁性管架上2分钟，且将上清液转移到新的0.2ml管。在最大速度下旋转管8分钟，且去除上清液，留下～10-15μl溶液。向模板化ISP中添加90μl水，且去除2μl以用于在Guava easyCyte流式细胞仪上进行分析。在15,000rcf下旋转管5分钟，且去除上清液，留下10μl含有模板化ISP的溶液。向ISP中添加20μl100％PBST和20μl测序引物，且涡旋管并短暂旋转。根据制造商的说明书，使用Ion Torrent PITM SequencingHiQ 200试剂盒(Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，使测序引物退火。
测序
根据制造商的说明书，使用Ion Torrent PITM Sequencing HiQ 200试剂盒(LifeTechnologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，在Ion Torrent PGM上进行标准测序反应。通过Torrent软件集分析测序信号，以确定这些ISP的扩增子内存在的序列。
结果
在Bulk IA之前对P1 ISP预植入单克隆模板产生比无预植入(即，NTC P1 ISP)的类似反应更好的测序度量值。此外，预植入有较多单克隆模板拷贝的P1 ISP，至多4170(这个实例中所测试的最大数量)，比预植入有较少拷贝的ISP具有更好的测序度量值。举例来说，读段长度频率分布图说明，预植入的样本具有较少的短长度读段(图1A-1D)。此外，所负载的ISP和来自这些负载的ISP的可使用读段的百分比，均随着预植入到ISP上拷贝数提高而增加(图2A-2B)。总读段和读段长度的平均值与中值也随着预植入的拷贝数增加(图2C-2D)。测序的阴性度量值以拷贝数依赖性方式随着预植入而降低。举例来说，空孔和低质量孔的百分比随着预植入的P1 ISP而降低(图2E-2F)。总的来说，这个实验表明，P1 ISP可在Bulk IA之前预植入单克隆模板，以得到下一代测序的显著改进。
实例2.用单个PCR循环预植入ISP，随后等温扩增
如在前述实例中，这个实例提供一种在等温扩增(模板反应)以用于下游下一代测序之前，对ISP预植入单克隆模板的方法。然而，在这个实例所公开的方法中，在将预植入的ISP分配到Ion Torrent芯片的孔中之后，进行模板反应。将预植入的ISP与无模板对照(“NTC”)ISP进行比较，所述无模板对照ISP在模板反应期间而非在模板反应之前和在预植入反应期间具有相同模板聚核苷酸。使用各种度量，比较不同扩增反应产生的测序结果。
预植入反应
因此，对具有P1衔接子的ISP预植入OFA 1 AB、OFA 12 AB或OFA 13 AB模板核酸分子，如实例1中所提供的。在预植入之后，洗涤预植入的ISP且计数，如实例1中所提供。将具有相同的各单克隆模板的拷贝数的预植入的ISP合并，即将已预植入有82个OFA 1 AB、OFA12 AB或OFA 13 AB拷贝的ISP全部合并，和类似地将预植入有775个模板拷贝的ISP合并，以及将预植入有5,400个模板拷贝的ISP合并。
盒负载
Ion Torrent 541芯片用100μl 100mM NaOH洗涤60秒，用200μl无核酸酶水冲洗，用200μl异丙醇冲洗且抽吸干燥。为了负载芯片，涡旋ISP(500,000,000个NTC ISP或合并、预植入的ISP)，用退火缓冲液(Ion PITM Hi-QTM Sequencing 200试剂盒，Ion Torrent)补到45μl，且通过负载通口注射到处理的芯片中。在1424rcf下离心芯片2分钟。将1ml泡沫(将980μl 50％退火缓冲液，与20μl 10％Triton X-100合并，吸取1ml空气在其中，且通过移液管进一步混合泡沫5秒)注射到芯片中，且抽吸过量的泡沫。将200μl 60％退火缓冲液/40％异丙醇冲洗溶液注射到芯片，且抽吸芯片到干燥。芯片用200μl退火缓冲液冲洗，且将芯片真空干燥。对于具有预植入的ISP的芯片，向芯片中添加40μl PBST，且用35μl PBST填充各通口。对于具有NTC ISP的芯片，向110μl退火缓冲液中添加5μl 100pM文库(等份OFA1 AB、OFA 12 AB和OFA 13 AB)，以制备文库混合物。向芯片中添加40μl文库混合物，用35μl文库混合物填充各通口。将芯片置于热循环仪上，且循环一次(在95℃下1分钟，随后37℃2分钟，随后4℃)。芯片用200μl退火缓冲液冲洗一次且保留为湿润的。
模板反应
Ion PGMTM Template IA团块用871μl Ion PGMTM复水缓冲液复水，充分地涡旋，且短暂旋转。对各芯片注射40μl团块IA溶液，且从出口抽吸置换的退火缓冲液。向负载通口中添加20μl团块IA溶液，且在1424rcf下旋转芯片2分钟。为了活化团块IA溶液，将218.2μlIon PGMTM起始溶液与8μl引物A合并，且添加到团块IA溶液中。涡旋活化的团块IA溶液且短暂旋转。向各芯片中，注射60μl活化的团块IA溶液，且抽吸置换的流体。各芯片将额外35μl团块IA溶液添加各通口。将芯片置于设定为40℃的热循环仪上，封盖，且培育15分钟。芯片用200μl 0.5M EDTA真空冲洗，且抽吸干燥。芯片用200μl退火缓冲液真空冲洗，且抽吸干燥。芯片用200μl 1％SDS真空冲洗两次，且抽吸干燥。芯片用200μl冲洗溶液(50％异丙醇/50％退火缓冲液)真空冲洗，且抽吸干燥。随后，芯片用200μl退火缓冲液冲洗，且抽吸干燥。向各芯片中，将40μl引物混合物(250μl测序引物和250μl退火缓冲液)注射到流动池中，且向各通口中添加35μl引物混合物。将芯片置于热循环仪上，且循环一次(在95℃下2分钟，随后37℃2分钟，随后4℃)。芯片用200μl退火缓冲液冲洗一次且抽吸。向各芯片中添加60μl酶混合物(60μl退火缓冲液和6μl PSP4酶)，且培育5分钟。将芯片真空干燥，且紧接着添加100μl退火缓冲液。将芯片负载到Ion Proton System上用于测序。
测序
Ion Proton System用Hi-Q 200材料启动，且使用400个流动(flows)进行测序。
结果
对ISP预植入单克隆模板，且随后将预植入的ISP负载到Ion Torrent sequencing芯片上，比NTC ISP产生更好的测序度量值，其具有连接的单克隆模板且在一个反应中扩增。所负载的ISP的百分比增加，其中82个模板拷贝预植入到ISP上，但较高水平的预植入将所负载的ISP的百分比降低低于NTC ISP(图3A)。可使用读段的百分比随着预植入的ISP而增加(图3B)。在总读段方面，预植入的ISP相对于NTC ISP也具有至多9倍增加，且在读段长度的平均值、中值和众数方面，大于2倍增加(图3C-3D)。所有预植入的ISP均显示较低的低质量孔百分比和无模板孔百分比(图3E-3F)。这个实例表明，可在其中在分配在IonTorrent芯片的孔内的ISP上进行模板反应的方法中，对ISP预植入单克隆模板核酸分子，以实现测序数据改进。
实例3.在RPA反应中对ISP预植入复合文库
如在前述实例中，这个实例提供一种预植入ISP的方法。然而，在这个实例中所公开的方法中，使用短RPA反应而非单个PCR循环来完成模板反应。此外，在Ion Torrent 541芯片的孔中的ISP上进行反应。在RPA预植入反应之后，在进行第二次等温RPA反应(模板反应)之前，洗涤预植入的ISP。将用预植入ISP随后模板反应(其中在模板反应之前洗掉模板核酸分子)的两步法产生的ISP，与经受单次RPA扩增而不洗涤的ISP(其在整个培育的反应混合物中具有相同模板聚核苷酸)进行比较。一步和两步反应中的每一个进行四个重复，且进行比较。
预植入反应
因此，向Ion Torrent芯片的孔中添加500,000,000个ISP，且对所述ISP预植入在片段(A-B、A-AV5或A-AV6)的末端具有衔接子的大肠杆菌基因组的130碱基对片段的160,000,000个拷贝，且预植入反应混合物中的其它组分(与实例2中的相同)。衔接子包含引物结合位点，所述引物结合位点促进与同ISP连接的所固定的通用引物(引物B、AV5或AV6)、在预植入和模板反应期间溶液中的通用引物(引物A)、和测序引物结合。简言之，向芯片中添加40μl预植入反应混合物，用35μl预植入反应混合物填充各通口。在40℃下培育预植入反应物2.5分钟，且随后通过用200μl 0.5M EDTA真空冲洗终止，且随后抽吸干燥。用退火缓冲液洗涤预植入的ISP。
如上组装NTC ISP的模板反应，且在40℃培育下培育30分钟。在模板反应之后，以与预植入的ISP相同的方式，处理NTC ISP。
模板反应
如实例2中，进行模板反应。在40℃下培育用于预植入的ISP的模板反应物30分钟。
测序
如在实例1中，使用Ion Torrent PITM Sequencing HiQ 200试剂盒进行测序。
结果
对ISP预植入模板核酸分子且随后在第二反应(即，模板反应)中使所连接的模板核酸分子进行模板反应，产生比无单独预植入反应所产生的模板化ISP多平均7,750,000个读段。此外，在预植入反应的情况下，其它测序度量值更好。对于一步和两步(单独预植入反应，随后模板反应)反应来说，平均AQ20评分分别是109和110.75，平均AQ20GBases评分分别是2.375和3.075。这个实例表明，预植入有模板核酸分子的复合群体的ISP改进对于模板所产生的测序数据。
实例4.在大批等温扩增中对ISP预植入复合文库
如在前述实例中，这个实例提供一种对ISP预植入模板核酸分子的复合群体的方法。然而，这个实例提供一种利用较长培育的预植入RPA反应。在预植入反应之后，在进行第二次等温RPA反应(即，模板反应)之前，使用MyOne磁性珠粒富集预植入的ISP。在模板反应之后，在针对下游测序进行处理之前，使用MyOne磁性珠粒进一步富集模板化ISP。将用预植入ISP随后模板反应(其中在模板反应之前洗掉模板核酸分子)的两步法产生的ISP，与经受单次RPA扩增而不洗涤的ISP(其在整个培育的反应混合物中具有相同模板聚核苷酸)进行比较。
预植入反应
进行用A'引物与封端的P1引物的混合物的预植入反应(参见图4)。将包括50μl退火缓冲液(Ion PGMTM Hi-QTM View Sequencing Solutions，(产品号A30275))、引物混合物S(3种A'引物的混合物：5'-ACG ATC CAT CTC ATC CCT GCG TGT C-3'(SEQ ID NO:4)；5'-TCC ATA AGG TCA GTA ACG ATC CAT CTC ATC CCT GCG TGT-3'(SEQ ID NO:5)；和5'-/5-Bio/TCC ATA AGG TCA GTA ACG ATC CAT CTC ATC CCT GCG TGT-3'(SEQ ID NO:5))、封端的融合引物(5'-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CCA CTA CGC CTC CGC TTTCCT CTC TAT GGA A/3-Phos/-3'；(SEQ ID NO:6))、7.5×106ISP和35pM来自人类基因组文库的130bp模板核酸分子的管，进行涡旋，短暂旋转且在98℃下培育2分钟，且随后在37℃下培育2分钟。添加另一等分试样的退火缓冲液(75μl)，且将溶液转移到新管中且涡旋。IonPGMTM模板IA团块(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)用720μl Ion PGMTM模板IA复水缓冲液复水，充分地混合，且存储在冰上。将375μl复水的Ion PGMTM模板IA团块与先前制备的含有文库的125μl溶液合并，涡旋，随后放回冰上。将混合物与150μl预混合的Ion PGMTM模板IA起始溶液合并，充分地混合以形成预植入反应混合物，短暂离心，且置于冰上。为了起始预植入反应，将管置于40℃加热块中，且随后在40℃下培育4分钟，以产生预植入的ISP。通过添加650μl 100mM EDTA随后涡旋，来终止预植入反应。
如上组装对照反应，其中差异如下：使用5.625×106个ISP和11pM模板，且维持40℃培育30分钟。以与预植入的样本相同的方式处理这些对照反应，之后富集模板化ISP。
富集预植入的ISP
使用MyOne珠粒(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)来富集预植入的ISP。简言之，向具有预植入的ISP的管中添加100μl MyOne珠粒，且涡旋。旋转管10分钟，旋转，且置于磁性管架上。在珠粒充分集结之后，去除上清液且丢弃。使用磁性管架，用1mlIon PGMTM洗涤溶液洗涤珠粒一次。随后，使用磁性管架，用1ml 3mM SDS溶液洗涤珠粒一次，且将上清液转移到新管中以用于进一步处理。在21,000rcf下旋转来自SDS洗涤的上清液8分钟，且去除上清液，留下大致50μl。预植入的ISP用150μl熔出溶液(125mM NaOH和0.1％Tween 20)再悬浮，且转移到新管中。在15,000rcf下旋转管5分钟，且去除上清液，留下10μl溶液。向预植入的ISP中添加190μl水，且去除2μl以用于在Guava easyCyte流式细胞仪上进行分析。在15,000rcf下旋转管5分钟，且去除上清液，留下10μl含有残留的预植入的ISP的溶液。
模板反应
向含有预植入的ISP的管中添加111μl退火缓冲液和4μl引物混合物S。来回吸取预植入的ISP以合并，且将全部溶液转移到新管中。向管中添加375μl复水的Ion PGMTM模板IA团块，且涡旋管，短暂旋转且置于冰上。将反应混合物与150μl预混合的Ion PGMTM模板IA起始溶液合并，充分地混合，短暂离心，且置于冰上。为了起始模板反应，将管置于40℃加热块中，且随后在40℃下培育30分钟。通过添加650μl 100mM EDTA随后涡旋，来终止反应。
富集模板化ISP
使用MyOne珠粒(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)来富集模板化ISP。简言之，向具有模板化ISP的管中添加100μl MyOne珠粒，且涡旋。旋转管10分钟，旋转，且置于磁性管架上。在珠粒充分集结之后，去除上清液且丢弃。使用磁性管架，用1ml IonPGMTM洗涤溶液洗涤珠粒一次。向管中添加200μl熔出溶液(125mM NaOH和0.1％Tween 20)，混合，且将溶液转移到新管中。在15,000rcf下旋转管5分钟，且去除上清液。用200μl水洗涤ISP，且去除2μl以用于在Guava easyCyte流式细胞仪上进行分析。随后，根据Proton Hi-Q用户指南，处理ISP以用于测序。
结果
对ISP预植入模板核酸分子且随后在第二反应(即，模板反应)中使所连接的模板核酸分子进行模板反应，产生比无单独预植入反应所产生的模板化ISP多平均9,167,000个读段。此外，在预植入反应的情况下，其它测序度量值更好。对于一步和两步(单独预植入反应，随后模板反应)反应来说，平均AQ20评分分别是105和110.25，平均AQ20GBases评分分别是2.889和4.267。这个实例表明，预植入有模板核酸分子的复合群体的ISP产生对于模板改进的测序数据。
实例5
植入
在PCR管中，将文库(2.4B拷贝)与生物素TPCRA(1μL，100μM)混合。管用1×铂HiFi混合物填充到20μL。在热循环仪上使管热循环一次(在98℃下2min，在37℃下5min，在54℃下5min)。向管中添加60亿珠粒。添加1×HiFi以增加体积50％(即，20μL珠粒+10μL铂Hifi混合物)。在热循环仪上将溶液热循环一次(在98℃下2min，在37℃下5min，在54℃下5min)。
将1mL myOne珠粒吸取到1.5mL管(1mL myOne珠粒，用于2个样本)中，且将管置于磁体上，且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加1mL含3％BSA的1×PBS，涡旋，脉冲旋转。将混合物置于磁体上，且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加1mL AB，涡旋，脉冲旋转。将混合物置于磁体上，且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加250μL AB(一个样本使用125μL 4×浓MyOne)。将纯化的MyOne混合物转移到新1.5mL管中。
将样本从PCR管转移到新1.5mL管中。向中添加125μL 4×浓MyOne。来回吸取混合物3次(200μL/s)，且使其静置10min。将混合物置于磁体上，牵拉出MyOne捕获的ISP(chef速度80μL/s)，且丢弃上清液。添加20μL NF水，脉冲涡旋，脉冲旋转，且置于磁体上以使MyOne集结。
芯片制备
用200μL NF水冲洗芯片2×。
磁性ISP负载
将20μL ISP混合物与4.5μL 10×退火缓冲液和20.5μL水混合(总计45μL)。涡旋ISP，且将其与10×退火缓冲液和水合并。涡旋ISP溶液且快速旋转。通过负载通口，将ISP溶液缓慢注射到芯片中。以30秒/扫描，进行磁性负载40分钟。将200μL泡沫(含0.2％Triton的1×AB)注射入芯片，且提取过量的泡沫。在真空抽吸出口同时，添加200μL 1×AB，且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，抽吸200μL冲洗液(60％AB/40％IPA)，且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL 1×AB。将芯片保持在1×AB中，直到准备扩增芯片上的ISP为止。
扩增，将所有试剂保持在冰上
第1步骤扩增
制备具有生物素标记的引物A和封端分子(中性抗生物素蛋白)的管，且在冰上培育>15分钟。溶液包含1.1μL 100μM引物每芯片和1μL 10mg/mL NAv(在0-PEG缓冲液中复水)每芯片。向1×IA团块(批号LTBP0047，PN100032944)中，添加871μL复水缓冲液。脉冲涡旋溶液10×，快速旋转，以收集管内含物。将内含物分成相同体积的两管(在单独管中放入900μL)。一个900μL管用于第1步骤扩增，存储另一个900μL管用于第2步骤扩增。
对于待运行的各芯片来说，将60μL团块溶液缓慢注射到芯片中。从出口抽吸置换的退火缓冲液。在RT下，将芯片与团块溶液一起培育4分钟。向团块溶液管中添加177.4μL起始溶液，脉冲涡旋10×，且快速旋转。将110μL/芯片的起始溶液转移到具有引物和封端剂的管中，脉冲涡旋10×且快速旋转。对于各芯片来说，将～60μL活化的团块溶液缓慢注射到芯片中。从两个通口抽吸所有置换的流体。向各通口中添加25μL团块溶液。将芯片放到设定为40℃的加热板(热循环仪)上。芯片用移液管尖端盒盖或类似物(不是加热的热循环仪盖子)盖住，且培育2.5分钟。
短暂反应终止和在扩增步骤之间的清洁
将扩增的芯片放在配备有真空的罩附近。在真空抽吸出口同时，添加200μL 0.5MEDTA pH 8(VWR E522-100ML)，随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，抽吸200μL 1×AB，且随后抽吸以干燥芯片。重复AB添加，且湿润芯片以进行第2步骤扩增。(抽空AB两次，且将第3个AB留在芯片中)
第2步骤扩增(无封端剂)
制备具有生物素标记的引物A的管，且在冰上培育>15分钟。溶液包含1.1μL 100μM引物每芯片。向1×IA团块(批号LTBP0047，PN 100032944)中，添加871μL复水缓冲液。脉冲涡旋溶液10×，快速旋转，以收集管内含物。在丢弃适当体积的团块溶液之后，向团块混合物中添加6.6μL 100μM生物素标记的引物，且对其脉冲涡旋10×。
向团块溶液管中添加177.4μL起始溶液，脉冲涡旋10×，且快速旋转。对于各芯片来说，将～60μL活化的团块溶液注射到预旋转的芯片中。从两个通口抽吸置换的流体。向各通口中添加额外25μL团块溶液。将芯片放到设定为40℃的加热板(热循环仪)上。芯片用移液管尖端盒盖或类似物(不是加热的热循环仪盖子)盖住，且培育20分钟。
反应终止和清理
将扩增的芯片放在配备有真空的罩附近。在真空抽吸出口同时，添加200μL 0.5MEDTA pH 8，且抽吸芯片以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL 1×AB)，且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL含1％SDS溶液的水(Ambion PN AM9822)，且随后抽吸以干燥芯片。重复SDS洗涤。在真空抽吸出口同时，添加200μL甲酰胺。在50℃下培育芯片3分钟，随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL冲洗(50％IPA/50％AB)溶液。抽吸芯片到干燥。在真空抽吸出口同时，添加200μL退火缓冲液。将芯片留在1×AB中，直到准备引发为止。
芯片上测序引物杂交和酶
将测序引物管解冻。制备最终50％/50％AB/引物混合物的引物混合物，且涡旋孔。如果测序引物管具有250μL的体积，那么添加250μL 1×AB。抽吸芯片到干燥，随后向芯片中添加80μL引物混合物(流动池中50μL，通口中30μL)。将芯片置于热循环仪上，且在50℃下培育2min，在20℃下培育5min。在真空抽吸出口同时，注射200μL 1×AB。用60μL退火缓冲液和6μL PSP4酶，制备酶混合物。清洁通口且从入口抽真空以干燥芯片。向芯片中添加60μL酶混合物，且在RT下培育5分钟。从入口抽吸芯片以干燥芯片。紧接着向芯片中添加100μL 1×AB。清洁通口，且干燥芯片的背面，且将芯片负载到用于测序的Proton上。
实例6
植入
在PCR管中，将具有A和B衔接子的Ampliseq外显子组文库(2.4B拷贝)与同A衔接子互补的5'-生物素标记的引物TPCRA(1μL，100μM)混合。用含有高保真度Taq DNA聚合酶、盐、镁和dNTP的1×铂HiFi混合物，填充管到20μL。在热循环仪上使管热循环一次(在98℃下2min，在37℃下5min，在54℃下5min)。向管中添加离子球形粒子(ISP)珠粒(60亿)，其各自在其上固定有数千个B引物。添加1×HiFi以增加体积50％(即，20μL珠粒+10μL铂Hifi混合物)。在热循环仪上使溶液热循环一次(在98℃下2min，在37℃下5min，在54℃下5min)。
在替代方法中，在PCR管中，将Ion Ampliseq外显子组文库的12亿拷贝(20μL100pM，具有标准Ion Torrent A和P1文库衔接子)与3μL 3μM生物素-TPCRA(序列5'生物素-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TC-3'；SEQ ID NO:2)和3μL 1.5μM B-trP1(trP1是Ion P1衔接子的23聚体区段，其具有序列CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT；SEQ ID NO:1；B是ISP引物序列)引物和9μL Ion Ampliseq HiFi主混合物5×混合。用10μL无核酸酶水将体积补足到45μL。用以下温度分布，在热循环仪上使管进行热循环：在98℃下2min、2个[在98℃下15秒-在58℃下2min]循环，最终保持在10℃。在热循环之后，向管中添加60亿ISP(75μL，8000万/微升)和6μL Ion Ampliseq HiFi主混合物5×。也添加5μL无核酸酶水以将总体积带到131μL。将溶液充分混合，且将管返回热循环仪。用以下温度分布进行第三个扩增循环：在98℃下2min，在56℃下5min，最终保持在10℃。在热循环之后，添加5μL EDTA 0.5M，且混合，以终止反应。
富集ISP
将具有与珠粒表面共价偶合的抗生蛋白链菌素的MyOne超顺磁珠粒(1mL)吸取到1.5mL管(1mL MyOne珠粒，用于2个样本)中，且将管置于磁体上，且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加1mL含3％BSA的1×PBS，随后涡旋且脉冲旋转。将混合物置于磁体上，且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加退火缓冲液(AB；1mL)，涡旋且脉冲旋转。将混合物置于磁体上，且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加AB(250μL)(一个样本使用125μL4×浓MyOne)。将纯化的MyOne混合物转移到新1.5mL管中。
将样本从含有ISP混合物的PCR管转移到新1.5mL管中。向ISP混合物中添加浓(4×)MyOne珠粒(125μL)。来回吸取混合物3次(200μL/s)，且随后使其静置10min。将混合物置于磁体上，牵拉出MyOne捕获的ISP(chef速度80μL/s)，且丢弃上清液。向管中添加无核酸酶(NF)水(20μL)，随后脉冲涡旋，脉冲旋转，且置于磁体上以使MyOne珠粒集结。
在富集ISP的替代方法中，将120μL MyOne抗生蛋白链菌素C1珠粒转移到单独管中，且将管置于磁体上以使磁性珠粒集结。丢弃上清液，且从磁体移出管。珠粒通过再悬浮于150μL Ion Torrent退火缓冲液中来洗涤，随后在磁体上集结。丢弃上清液，且另外重复一次用150μL退火缓冲液洗涤。在从第二洗涤液丢弃上清液之后，用50μL退火缓冲液再悬浮洗涤的MyOne C1珠粒。将退火缓冲液中的洗涤后的MyOne C1的全部内含物转移到含有文库和ISP的热循环的PCR管中。将移液管体积设定为160μL，且通过在1秒/抽吸下来回吸取三次或施配运动将内含物缓慢混合。使混合物在室温下在无搅动下静置30min，以使磁性珠粒捕获文库植入的ISP。随后，将管置于磁体上以使磁性珠粒集结，且丢弃上清液。向团块中添加含Tween-20(25μL，0.1％)的水。剧烈地涡旋混合物以从MyOne C1珠粒洗脱植入的ISP。脉冲旋转管，随后返回磁体。将含有植入的ISP的上清液(洗脱液)收集到新鲜管中以用于下游芯片负载和扩增步骤。
芯片制备
用200μL NF水冲洗芯片2×。
将ISP磁性负载到芯片上
使用制备ISP/文库混合物和将其负载到含有反应室微孔的Ion Torrent半导体芯片上的若干方法。在一种方法中，将ISP/文库混合物(20μl)与4.5μl 10×退火缓冲液和20.5μl水混合(总计45μl)。涡旋混合物且旋转。通过负载通口，将ISP溶液缓慢注射到芯片中。以30秒/扫描，进行磁性负载40分钟。将含有含0.2％Triton的1×AB的泡沫(200μL)注射入芯片，且提取过量泡沫。在真空抽吸芯片的出口同时，将200μL 1×AB注射到芯片中，且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，随后将200μL冲洗液(60％AB/40％IPA)注射到芯片中，且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，随后通过注射将200μL 1×AB添加到芯片中。将芯片保持在1×AB中，直到准备扩增芯片上的ISP上的核酸为止。
在另一方法中，将150μL Dynabead M-270抗生蛋白链菌素(Thermo FisherScientific)，其是具有与其表面结合的抗生蛋白链菌素的磁性珠粒，转移到管中，随后将管置于磁体中以使磁性珠粒集结。丢弃上清液，且从磁体移出管。随后，向含有M-270集结珠粒的管中添加以下：20μL来自植入过程的ISP混合物，9μL 5×退火缓冲液和16μL无核酸酶水，总计45μL。替代地，将20μl ISP/文库混合物与3.2μL 10×退火缓冲液、3μL浓M270磁性珠粒和5.8μL水混合，总计32μl。混合混合物以再悬浮M-270团块，且通过负载通口缓慢注射到芯片中。放在芯片下方的磁体反复来回扫描芯片，以将ISP负载到芯片微孔中。以30秒/扫描，进行磁性负载扫描40分钟。在负载之后，剧烈地振荡含有5mL1％SDS的15mL falcon管，以产生致密泡沫，随后将800μL注射入芯片以从芯片流动池去除磁性珠粒。丢弃芯片出口处的流过物。随后，将退火缓冲液(200μL)注射入芯片，且丢弃流过物。从芯片出口真空干燥芯片。将冲洗液(200μL，60％退火缓冲液，40％IPA)注射入芯片，随后真空干燥芯片。注射退火缓冲液(200μL)以填充芯片流动池，且丢弃芯片出口处的流过物。芯片用退火缓冲液填充，直到准备在下游扩增步骤中扩增为止。
扩增
第一步骤扩增
对于正扩增的各芯片来说，将1.1μL生物素标记的引物A(100μM)和1μL封端分子(复水于缓冲液中的10mg/mL中性抗生物素蛋白)合并在管中，且在冰上培育>15分钟。
向来自ION PGMTM TEMPLATE IA 500试剂盒的含有用于进行重组酶-聚合酶扩增的反应组分(例如重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、核苷酸、缓冲液和其它成分)的1×IA团块(PN 100032944)中，添加复水缓冲液(871μL)。脉冲涡旋溶液10×，且快速旋转，以收集管内含物。在过程期间，将复水的内含物(被称作“团块溶液”，大约900μl)保持在冰上。
对于各Ion Torrent芯片来说，将60μL复水的IA团块溶液缓慢注射到芯片中。从出口抽吸置换的退火缓冲液。在RT下，将芯片与复水的IA团块溶液一起培育4分钟。
对于正扩增的各芯片来说，将90μL复水的IA团块溶液转移到新管中。添加先前制备的生物素标记的引物A和中性抗生物素蛋白封端分子(2.1μL)，且脉冲混合。向复水的IA团块溶液的管中添加含有28mM Mg(OAc)2水溶液、10mM乙酸Tris和3.75％(V/V)甲基纤维素的起始溶液(30μL)，脉冲涡旋10×，且快速旋转，以形成总体积为～120μL的活化的扩增溶液。对于各芯片来说，将～60μL活化的扩增溶液缓慢注射到芯片中。从两个通口抽吸所有置换的流体。接下来，向各芯片通口中添加25μL残留的活化的扩增溶液。将芯片放到设定为40℃的加热板(热循环仪)上。芯片用移液管尖端盒盖或类似盖(不是加热的热循环仪盖子)盖住，且培育2.5分钟。
短暂反应终止和在扩增步骤之间的清洁
从加热板或热循环仪取下扩增的芯片。在真空抽吸出口同时，将200μL 0.5MEDTApH 8(VWR E522-100ML)注射到芯片中，且随后使用真空抽吸芯片到干燥。在真空抽吸出口同时，将200μL 1×AB注射到芯片中，随后抽吸芯片到干燥。另外重复AB添加两次，且填充芯片以进行第2步骤扩增。(抽空AB两次，且将第三个AB添加留在芯片中。)
第二步骤扩增(无封端剂)
对于各芯片来说，将60μL复水的团块溶液减缓注射到芯片中。从出口抽吸置换的退火缓冲液。在RT下，将芯片与团块溶液一起培育4分钟。
对于正制备的各芯片来说，将90μL复水的团块溶液转移到新鲜管中。添加生物素标记的引物A(1.1μL，100μM)，且脉冲涡旋管且旋转。
向含有复水的团块溶液和引物A的管中添加起始溶液(30μL)，且脉冲涡旋10×，且快速旋转，以产生活化的扩增溶液。将大致60μL活化的扩增溶液注射到芯片中。从两个通口抽吸置换的流体。向各通口中添加额外25μL残留的扩增溶液。将芯片放到设定为40℃的加热板(热循环仪)上。芯片用移液管尖端盒盖或类似盖盖住，且培育20分钟。
反应终止和清理
将已经受扩增反应的芯片放置在配备有真空的罩附近。在真空抽吸出口同时，添加200μL 0.5M EDTA pH 8，且抽吸芯片以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL 1×AB，且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL含1％SDS溶液的水(AmbionPN AM9822)，且随后抽吸以干燥芯片。重复SDS洗涤。在真空抽吸出口同时，添加200μL甲酰胺。在50℃下培育芯片3分钟，随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL冲洗(50％IPA/50％AB)溶液。抽吸芯片到干燥。在真空抽吸出口同时，添加200μL退火缓冲液。将芯片留在1×AB中，直到准备引发为止。
芯片上测序引物杂交和酶反应
将含有Ion测序引物(100μM)的管解冻。对于正测序的各芯片来说，制备40μL退火缓冲液和40μL测序引物的引物混合物，且涡旋孔。抽吸芯片到干燥，随后向芯片中添加80μL引物混合物(流动池中50μL，各通口中15μL)。将芯片置于热循环仪上，且在50℃下培育2min，在20℃下培育5min。在真空抽吸出口同时，注射200μL 1×AB。用60μL退火缓冲液和6μL测序酶(Ion PSP4测序聚合酶)制备酶混合物。清洁通口且从入口抽真空以干燥芯片。向芯片中添加酶混合物(60μL)，且在RT下培育5分钟。抽吸芯片到干燥。紧接着注射AB(100μL，1×)以填充芯片。清洁通口，将芯片背面干燥，且将芯片负载到Ion Torrent Proton(ThermoFisher Scientific)设备上以用于对文库核酸进行测序。
实例7.使用不同核酸操纵方法测序结果的比较
图10显示使用四个不同扩增条件(图中A-D)所产生的核酸模板的核酸测序运行组的总可使用读段。在方法A中，根据本文中实例2中所描述的方法，将非模板化离子球形粒子(ISP)负载到Ion Torrent 541芯片的微孔中。随后，在将文库扩增子注射到芯片中之后，通过单次95℃1min/37℃1min热循环步骤，使具有与ISP引物互补的衔接子的文库分子(110bphg19片段文库)与预负载的ISP杂交。在文库杂交之后，使用基本上如实例2中所描述的单步RPA模板扩增方法进行扩增。引物未被生物素标记。方法B相对于扩增方案A采用两个重要变化：1)在模板扩增之前额外扩增步骤(“第一”扩增步骤)；和2)在所添加的第一扩增步骤中并入中性抗生物素蛋白和生物素标记的溶液引物。在这个实例中，第一扩增步骤，其是等温RPA扩增，是2.5分钟，且含有等效浓度的生物素标记的溶液引物和中性抗生物素蛋白。第二扩增步骤是15分钟，且不含有中性抗生物素蛋白。在这个方法中，第一扩增步骤用于局部扩增模板拷贝同时添加拖拽(drag)(通过中性抗生物素蛋白)以限制新生链的孔-2-孔扩散。在2.5分钟之后，产生足够的局部拷贝，不再需要拖拽组分。随后，如实例2中所描述进行第二扩增步骤。在方法C和D中，使用220bp hg19 Ampliseq外显子组文库。通过用如本文实例6中所描述的溶液类预扩增ISP富集方法置换方法A和B中的文库杂交方法，方法C对于方法B进行改进。因此，代替在孔中进行所有步骤，在溶液中完成文库与ISP杂交的第一步骤，随后向管中添加磁性珠粒，富集含模板的ISP，且随后与磁性珠粒分开且负载到孔中以如方法B中所完成的进行2步扩增。预扩增富集方法使得能够负载具有单一文库模板拷贝的ISP。最终，扩增方法D，其根据方法C进行，相较于方法C采用修饰的ISP引物序列。修饰的引物AV4具有以下序列：ATTCGAGCTGTTCATCTGTATCTTGCGCTACCAA(SEQ ID NO:7)。如图10所示，由方法A-D得到的改进组合使得总读段能够等效于对于通过乳化液PCR扩增的模板核酸进行的测序。
所公开的实施例、实例和实验并不打算限制本公开的范围或并不打算表示以下实验是所执行的所有或仅有实验。已经努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应当考虑到一些实验性误差和偏差。应理解，可以在不改变实验意图说明的基本方面的情况下，对所描述的方法进行改变。
应注意，以上在一般描述或实例中描述的所有活动并非都是必需的，可能不需要一部分特定活动，且除所描述的那些以外可以执行一个或多个其它活动。又另外，所列的活动次序未必是执行活动的次序。所属领域的技术人员可设计在本公开的范围和精神内的许多修改和其它实施例。实际上，在不改变本公开的基本方面的情况下，熟练的技术人员可对所描述材料、方法、图式、实验、实例和实施例进行变化。所公开的任一个实施例可与任何其它所公开的实施例组合使用。当对于范围给出多个低值和多个高值时，所属领域的技术人员应认识到，所选择的范围将包含小于高值的低值。本说明书中的所有标题均是为了方便阅读起见且不是限制性的。在前文说明书中，所述概念已经参考特定实施例来描述。然而，所属领域的一般技术人员了解，可以在不脱离如所附权利要求书中所阐述的本发明范围的情况下进行各种修改和改变。因此，说明书和图式应该以说明性而不是限制性意义来看待，且所有这些修改意图包含在本发明范围内。上文关于特定实施例描述了益处、其它优点和问题解决方案。然而，可能使任何益处、优点或解决方案产生或变得更加明显的益处、优点、问题解决方案以及任何特征均不应被解释为任何或全部权利要求的关键的、必需的或必要的特征。在阅读本说明书之后，熟练的技术人员应了解，为了清楚起见，本文中在单独实施例的情况下所描述的某些特征也可以组合地在单个实施例中提供。相反，为了简洁起见，在单个实施例的情况下所描述的各种特征也可以单独地或以任何子组合形式提供。此外，对以范围陈述的值的参考包含在那个范围内的每一个值。

Claims (54)

1.一种用于产生核酸模板的方法，其包括：
(a)获得核酸分子群体，所述核酸分子群体中各分子包括在所述分子5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述分子3'端处的第二连续核苷酸序列和位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三连续核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列和所述第二连续核苷酸序列彼此不同，并且其中在所述群体中，所述核酸分子的所述第一连续核苷酸序列一致且所述核酸分子的所述第二连续核苷酸序列一致；
(b)使所述核酸分子群体在正向引物和反向引物存在下经受核酸扩增循环以形成核酸产物，其中所述正向引物包括与所述第一连续核苷酸序列一致的寡核苷酸序列，且所述反向引物包括与所述第二连续核苷酸序列5'端的子序列互补的寡核苷酸序列，所述反向引物的寡核苷酸序列在所述子序列的3'端处与不和所述第二连续核苷酸序列互补的第四连续核苷酸序列连接；和
(c)使(b)的所述扩增循环的核酸产物在所述正向引物和所述反向引物存在下经受扩增循环，以产生多种不同核酸产物；
其中：
所述反向引物包含与所述第二连续核苷酸序列的5'端互补的寡核苷酸序列但不含有与所述第二连续核苷酸序列的3'端互补的寡核苷酸序列，和
所述核酸产物中的仅一种包括与所述第四连续核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述正向引物包括含有与其连接的连接物的修饰的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中与所述修饰的核苷酸连接的所述连接物包括生物素。
4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在退火条件下将(c)的单链核酸产物与同所述第四连续核苷酸序列一致的单链寡核苷酸组合，从而将包括与所述第四连续核苷酸序列互补的核苷酸序列的(c)的所述产物与同所述第四连续核苷酸序列一致的所述单链寡核苷酸杂交，以产生部分双链寡核苷酸结合产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中与所述第四连续核苷酸序列一致的所述单链寡核苷酸与载体连接。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述载体为固体载体。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述载体为粒子。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述载体为珠粒。
9.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括使与包括同所述第四连续核苷酸序列互补的核苷酸序列的所述单链核酸产物杂交的所述单链寡核苷酸的3'端延伸，从而通过合成核酸链产生双链核酸，所述核酸链包括与所述第四连续核苷酸序列一致的所述单链寡核苷酸且具有与同其杂交的所述单链核酸产物互补的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括将所述双链核酸的核酸链与核酸产物分开。
11.根据权利要求10所述的方法，其中包括与所述第四连续核苷酸序列一致的所述单链寡核苷酸的所述核酸链，在所述核酸链的5'端处，通过所述核酸链的为所述寡核苷酸序列的那一部分与载体连接。
12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括通过从不与所述载体结合的任何其它核酸去除所述载体来分离与所述载体连接的所述核酸链。
13.一种用于产生核酸分子的方法，其包括：
(a)获得核酸分子群体，所述核酸分子群体中各分子包括在所述分子5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述分子3'端处的第二连续核苷酸序列和位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三连续核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列和所述第二连续核苷酸序列彼此不同，并且其中在所述群体中，所述核酸分子的所述第一连续核苷酸序列一致且所述核酸分子的所述第二连续核苷酸序列一致；
和
(b)使所述核酸分子群体在一种或多种正向引物和反向引物存在下经受两个或更多个核酸扩增循环以产生核酸产物，所述一种或多种正向引物包括与所述第一连续核苷酸序列一致的寡核苷酸序列，所述反向引物在3'端处被封端且包括与所述第二连续核苷酸序列互补的寡核苷酸序列，所述反向引物的寡核苷酸序列在所述寡核苷酸序列的5'端处与不和所述第二连续核苷酸序列互补的第四连续核苷酸序列连接，其中所述核酸产物包括与所述第四连续核苷酸序列互补的核苷酸序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述正向引物包括含有与其连接的连接物的修饰的核苷酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中与所述修饰的核苷酸连接的所述连接物包括生物素。
16.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括在退火条件下将(b)的所述核酸产物的单链核酸暴露于与所述第四连续核苷酸序列一致的单链寡核苷酸，从而将包括与所述第四连续核苷酸序列互补的核苷酸序列的(b)的所述核酸产物与同所述第四连续核苷酸序列一致的所述单链寡核苷酸杂交，以产生部分双链寡核苷酸结合产物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中与所述第四连续核苷酸序列一致的所述单链寡核苷酸与载体连接。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述载体为固体载体。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述载体为粒子。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述载体为珠粒。
21.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括使与包括同所述第四连续核苷酸序列互补的核苷酸序列的所述核酸产物杂交的所述寡核苷酸的3'端延伸，从而通过合成核酸链产生双链核酸，所述核酸链包括与所述第四连续核苷酸序列一致的所述单链寡核苷酸且具有与同其杂交的所述产物互补的核苷酸序列。
22.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括将所述双链核酸的核酸链与核酸产物分开。
23.根据权利要求22所述的方法，其中包括与所述第四连续核苷酸序列一致的所述单链寡核苷酸的所述核酸链，在所述核酸链的5'端处，通过所述核酸链的为所述寡核苷酸序列的那一部分与载体连接。
24.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括通过从不与所述载体结合的任何其它核酸去除所述载体来分离与所述载体连接的所述核酸链。
25.一种在固体载体上产生一种或多种模板核酸群体的方法，其包括：
(a)获得核酸分子群体，其中各分子包括在所述分子的5'端处的第一连续核苷酸衔接子序列、在所述分子的3'端处的第二连续核苷酸衔接子序列和位于所述第一连续核苷酸衔接子序列与所述第二连续核苷酸衔接子序列之间的第三连续核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸衔接子序列和所述第二连续核苷酸衔接子序列不同；其中在所述群体中，所述核酸分子的所述第一连续核苷酸衔接子序列一致，所述核酸分子的所述第二连续核苷酸衔接子序列一致，且位于所述第一连续核苷酸衔接子序列与所述第二连续核苷酸衔接子序列之间的所述第三连续核苷酸序列不同；并且其中所述第一连续核苷酸衔接子序列包括与其连接的第一连接子部分；
(b)产生来自所述核酸分子群体的单链核酸，且在退火条件下使所述单链核酸与固体载体接触，以通过与所述单链核酸的所述第二连续核苷酸衔接子序列杂交产生具有与其连接的单链核酸的固体载体，其中所述固体载体包括多个引物寡核苷酸，所述多个引物寡核苷酸具有与固定于其上的所述单链核酸的所述第二连续核苷酸衔接子序列互补的核苷酸序列；
(c)使所述固体载体的与单链核酸杂交的所固定的引物寡核苷酸延伸，以产生与所述固体载体结合的双链核酸；
(d)使与所述固体载体结合的所述双链核酸分子在第一引物存在下经受核酸扩增循环，所述第一引物包括与所述第一连续核苷酸衔接子序列和与其连接的第一连接子部分一致的寡核苷酸序列，其中有限数量的单链核酸与各固体载体连接，且所述核酸扩增循环产生与个别载体连接的单克隆的核酸；
(e)将具有与其结合的核酸的所述固体载体与包括与所述第一连接子部分连接的第二连接子部分的磁性珠粒组合，以产生固体载体-磁性珠粒组装件；
(f)向所述珠粒组装件施加磁场，从而将所述珠粒组装件与不包括磁性珠粒的元件分开；
(g)从所述磁性珠粒释放具有与其连接的核酸的所述固体载体；
(h)将具有与其连接的核酸的所述固体载体与磁性珠粒组合，其中所述固体载体上的所述核酸将不与所述磁性珠粒连接；
(i)将经组合的具有与其连接的核酸的所述固体载体和磁性珠粒递送到包括微孔的表面，且向所述表面施加磁场，由此将具有与其连接的核酸的所述固体载体负载到单独微孔中；和
(j)使所述微孔中的与所述固体载体结合的所述核酸在呈溶液形式的所述第一引物和反向引物存在下经受至少一个核酸扩增循环，其中所述第一引物包括与所述第一连续核苷酸衔接子序列一致的寡核苷酸序列，并且其中所述扩增产生的与所述固体载体连接的核酸是在(d)中所阐述的所述扩增之后所连接的核酸的至少10倍；
其中所述反向引物包含与所述第二连续核苷酸衔接子序列的5'端互补的核苷酸序列但不含有与所述第二连续核苷酸衔接子序列的3'端互补的核苷酸序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中(b)中的固体载体的数量超过核酸分子的数量至少2倍。
27.根据权利要求25所述的方法，其中(b)中的固体载体的数量超过核酸分子的数量至少5倍。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中(j)中的所述扩增产生的与所述固体载体连接的核酸是在(d)中的所述扩增之后所连接的核酸的至少100,000倍。
29.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中(j)中的所述扩增产生的与所述固体载体连接的核酸是在(d)中的所述扩增之后所连接的核酸的至少1,000,000倍。
30.根据权利要求25所述的方法，其进一步包括使与所述固体载体连接的扩增出的核酸进行核酸测序。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述测序产生至少6000万个长度为至少300个核苷酸的序列读段。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述测序产生至少8000万个长度为至少100个核苷酸的序列读段。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述测序产生至少8000万个长度在100与400个核苷酸之间的序列读段。
34.一种在固体载体上产生一种或多种模板核酸群体的方法，其包括：
(a)获得核酸分子群体，其中各分子包括在所述分子的5'端处的第一连续核苷酸衔接子序列、在所述分子的3'端处的第二连续核苷酸衔接子序列和位于所述第一连续核苷酸衔接子序列与所述第二连续核苷酸衔接子序列之间的第三连续核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸衔接子序列和所述第二连续核苷酸衔接子序列不同，且所述核酸分子的所述第一连续核苷酸衔接子序列一致，且所述核酸分子的所述第二连续核苷酸衔接子序列一致，并且其中所述第一连续核苷酸衔接子序列进行修饰以包括与其连接的第一连接子部分；
(b)产生所述核酸分子群体的单链核酸，且在退火条件下使所述单链核酸与固体载体接触，以通过与所述单链核酸的所述第二连续核苷酸衔接子序列杂交产生具有与其连接的单链核酸的固体载体，其中所述固体载体包括多个引物寡核苷酸，所述多个引物寡核苷酸具有与固定于其上的所述单链核酸的所述第二连续核苷酸衔接子序列互补的核苷酸序列，且固体载体的数量超过核酸分子的数量至少5倍；
(c)将具有与其连接的所述单链核酸的所述固体载体转移到包括微孔的表面，由此将具有与其连接的所述单链核酸的所述固体载体分别负载到单独微孔中；
(d)使所述固体载体的与所述单链核酸杂交的所固定的引物寡核苷酸延伸，以产生与所述固体载体结合的双链核酸；
(e)使与所述固体载体结合的所述双链核酸在呈溶液形式的第一引物存在下经受核酸扩增循环，其中(1)所述第一引物包括与所述第一连续核苷酸衔接子序列一致的寡核苷酸序列且进行修饰以包括与其连接的所述第一连接子部分，(2)通过具有与固定于所述固体载体上的所述第二连续核苷酸衔接子序列互补的核苷酸序列的所述引物寡核苷酸与所述核酸的所述第二连续核苷酸衔接子序列之间的杂交，所述扩增产生有限数量的与所述固体载体连接的额外单链核酸，(3)与个别载体连接的所述额外单链或双链核酸是单克隆的，和(4)所述扩增是在与所述第一连续核苷酸衔接子序列的所述第一连接子部分连接的组合物存在下进行；
(f)终止(e)的所述扩增，且从所述微孔去除与所述第一连续核苷酸衔接子序列的所述第一连接子部分连接的所述组合物；和
(g)使所述微孔中的与所述固体载体结合的所述核酸分子在呈溶液形式的所述第一引物和反向引物存在下经受至少一个核酸扩增循环，其中所述第一引物包括与所述第一连续核苷酸衔接子序列一致的寡核苷酸序列，并且其中所述扩增产生的与所述固体载体连接的核酸是在步骤(e)中的所述扩增之后所连接的核酸的至少1000倍；
其中所述反向引物包含与所述第二连续核苷酸衔接子序列的5'端互补的核苷酸序列但不含有与所述第二连续核苷酸衔接子序列的3'端互补的核苷酸序列，且与个别载体连接的所述核酸是单克隆的。
35.一种制备用于核酸分析的装置的方法，所述方法包括：
产生模板核酸，所述模板核酸包含捕获序列部分、模板部分和进行修饰具有第一连接子部分的引物部分；
在具有多个与所述模板核酸的所述捕获序列部分互补的捕获引物的珠粒载体上捕获所述模板核酸，所述捕获引物与所述模板核酸的所述捕获序列部分杂交；
将所捕获的模板核酸与具有第二连接子部分的磁性珠粒连接，以形成珠粒组装件，所述第二连接子部分与所述第一连接子部分连接；和
使用磁场，将所述珠粒组装件负载到测序装置的孔中。
36.根据权利要求35所述的方法，其进一步包括使与所述模板核酸互补的所述捕获引物延伸以形成靶核酸，并且使所述模板核酸和所述靶核酸变性，以从所述珠粒载体释放所述磁性珠粒。
37.根据权利要求36所述的方法，其中变性包含酶促变性。
38.根据权利要求36所述的方法，其中变性包含在离子溶液存在下变性。
39.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括从所述测序装置洗涤出所述磁性珠粒。
40.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括扩增所述靶核酸，以在所述孔中的所述珠粒载体上形成靶核酸群体。
41.根据权利要求40所述的方法，其中扩增包含进行重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymerase amplification；RPA)。
42.根据权利要求41所述的方法，其中进行RPA包含在第一时段进行RPA，进行洗涤，和在第二时段进行RPA，所述第一时段短于所述第二时段。
43.根据权利要求35所述的方法，其中产生包含使与靶核酸互补的连接子修饰的引物延伸。
44.根据权利要求35所述的方法，其中延伸包含进行聚合酶链式反应(PCR)。
45.一种制备测序装置的方法，所述方法包括：
产生模板核酸，所述模板核酸包含捕获序列部分、模板部分和引物部分；
在与同所述捕获序列部分互补的捕获引物偶联的珠粒载体上捕获所述模板核酸，所述捕获引物与所述模板核酸的所述捕获序列部分杂交；
使与所述模板核酸互补的所述捕获引物延伸，以形成与所述模板核酸互补且与其杂交的靶核酸；
变性以将所述杂交的模板核酸与所述靶核酸分开；
在所述珠粒载体上将连接子修饰的引物与所述靶核酸杂交，所述连接子修饰的引物包含第一连接子部分；
使与所述靶核酸互补的所述连接子修饰的引物延伸；
将磁性珠粒偶联于所述第一连接子部分，所述磁性珠粒具有与所述第一连接子部分连接的第二连接子部分；和
使用磁场，将所述珠粒载体置于测序装置的孔中。
46.根据权利要求45所述的方法，其进一步包括使所述模板核酸和所述靶核酸变性，以从所述珠粒载体释放所述磁性珠粒。
47.根据权利要求46所述的方法，其中变性包含酶促变性。
48.根据权利要求46所述的方法，其中变性包含在离子溶液存在下变性。
49.根据权利要求46所述的方法，其进一步包括从所述测序装置洗涤出所述磁性珠粒。
50.根据权利要求45所述的方法，其进一步包括扩增所述靶核酸，以在所述孔中的所述珠粒载体上形成靶核酸群体。
51.根据权利要求50所述的方法，其中扩增包含进行重组酶聚合酶扩增(RPA)。
52.根据权利要求51所述的方法，其中进行RPA包含在第一时段进行RPA，进行洗涤，和在第二时段进行RPA，所述第一时段短于所述第二时段。
53.根据权利要求45所述的方法，其中产生包含使与靶核酸互补的连接子修饰的引物延伸。
54.根据权利要求45所述的方法，其中延伸包含进行聚合酶链式反应(PCR)。
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