CN113906148A - 用于操纵核酸的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于操纵核酸的方法、组合物和试剂盒以及系统，所述方法包含使用预植入的固体载体对核酸模板实施等温扩增，如重组酶‑聚合酶扩增(RPA)。提供了用于产生与固体载体结合的包括特异性核苷酸序列的模板核酸分子的快速且有效的方法。此类方法可以用于例如操纵核酸以为利用单克隆核酸群体的分析方法做准备。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于美国专利申请第16/403,339号的优先权，所述美国专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请在此以引用的方式并入有与此同时提交的电子序列表材料。电子序列表中的材料以2020年4月29日创建的标题为“LT01179-1PCT_ST25.txt”的文本(.txt)文档形式提交，其文件大小是1.67KB并且以全文引用的方式并入本文中。
通过引用并入
本文所引用的所有专利、专利申请和公开案的公开内容均以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开总体上涉及用于操纵和分析核酸的方法和用于进行其的组合物和试剂盒。
背景技术
对核酸样品的操纵，例如核酸扩增在分子生物学中极为有用，且实际上在生物学、治疗、诊断、法医学和研究的每一方面中具有广泛的适用性。生物和医疗研究日益转向用于增强生物研究和医学的核酸测序。例如，生物学家和动物学家正转向用以研究动物迁移、物种进化和性状来源的测序。医学团体正使用测序来研究疾病的起因、对药品的敏感性和感染的起因。测序的使用可能会受样品中的核酸的数量和/或质量不足限制。另外地，测序在历史上一直是一种昂贵的方法，因此限制了其实践。
通常，为了增加可用于分析的核酸的量，使用一种或多种引物从核酸分子产生扩增子，其中扩增子与产生其的模板的全部或一部分互补。多重扩增也可以简化过程并减少开销。对于一些下游应用，单克隆是合乎期望的，这是因为多克隆群体内的多种多样的核酸分子的不同特性可能会使测定数据的解译变得复杂化。在其中核酸的单克隆群体期望用于分析性方法中的实例中，在含有单克隆核酸群体和保持其为分离型且不含或相对不含大量与单克隆群体中的那些核酸不相同的其它核酸杂质方面，也存在挑战。当试图以高通量、自动化、有成本效益的方式对不同核酸的多个样品进行分析(例如测序)时，这尤其是一个问题。在核酸测序应用中，多克隆群体的存在可能会使测序数据的解译变得复杂化；然而，许多测序系统对检测来自单一模板核酸分子的核苷酸序列数据不足够敏感，因此在测序之前对模板核酸分子进行扩增是必需的。
此类扩增的一个实例是重组酶-聚合酶扩增(recombinase-polymeraseamplification；RPA)，其是一种利用酶来将寡核苷酸引物与双螺旋DNA中的其互补伴侣结合，随后进行等温扩增的DNA扩增方法。相对于传统的扩增方法，RPA提供多种优点，包含例如不需要初始热或化学熔解(melting)，能够在低恒定温度下运行而无需绝对温度控制，并且可以将反应混合物(例如，缺乏靶多核苷酸)存储在干燥条件下。这些优点表明，RPA是一种用于扩增核酸分子的强力且便利的工具。然而，在测序之前使用RPA来制备模板核酸分子的尝试已导致非所需多克隆群体和/或不足的制剂。因此，仍需要产生改进模板核酸分子的制备以用于分子表征，例如测序的改进方法。
发明内容
在一些实施例中，本公开总体上涉及操纵核酸的方法以及用于进行所述方法的系统、组合物、试剂盒和设备。
在一些实施例中，本文提供了用于产生包括特异性核苷酸序列的核酸分子的快速且有效的方法。可以例如在操纵核酸中使用此类方法以用于在使用单克隆核酸群体的方法中进行分析准备。本文所公开的用于产生单克隆核酸群体的克隆扩增方法的一些实施例以受约束的核酸分子模板开始。约束本文提供的核酸分子的方法包含通过结合待扩增和分析的不同核酸共有的特异性核苷酸序列来捕获单一核酸分子。为了产生具有可以用于易于限制的共同特异性核苷酸的不同核酸分子，本文公开的一种方法包含(a)获得核酸分子群体，例如双链的、含有衔接子的DNA文库，在所述文库中，就分子的一条链而言，每个分子含有在所述分子的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述分子的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列不同，在所述核酸分子群体中，所述核酸分子的所述第一连续核苷酸序列基本上相同并且所述核酸分子的所述第二连续核苷酸序列基本上相同；(b)在存在正向引物和反向引物的情况下，使所述核酸分子群体经受核酸扩增循环，所述正向引物含有与所述第一核苷酸序列基本上相同的寡核苷酸序列，所述反向引物含有与所述第二连续核苷酸序列的5'端的子序列互补的在与所述子序列互补的序列的3'端处连接到不与所述第二连续核苷酸序列互补的第四核苷酸序列的寡核苷酸序列；以及(c)在存在所述正向引物和所述反向引物的情况下，使步骤(b)的扩增循环的产物经受扩增循环以产生多种不同核酸产物，其中所述产物中的仅一种产物包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。在此方法的一些实施例中，所述反向引物包含与所述第二连续核苷酸序列的5'端互补的核苷酸序列，但不含与所述第二连续核苷酸序列的3'端互补的核苷酸序列。
本文提供的产生具有可以用于例如便于限制的共同特异性核苷酸序列的不同核酸分子的方法的其它实施例包含：(a)获得核酸分子群体，例如双链的、含有衔接子的DNA文库，在所述文库中，就分子的一条链而言，每个分子含有在所述分子的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述分子的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列不同，在所述核酸分子群体中，所述核酸分子的所述第一连续核苷酸序列基本上相同并且所述核酸分子的所述第二连续核苷酸序列基本上相同；以及(b)在存在一个或多个正向引物和反向引物的情况下，使所述核酸分子群体经受两个或更多个核酸扩增循环，所述一个或多个正向引物含有与所述第一核苷酸序列基本上相同的寡核苷酸序列，所述反向引物在3'端处封端并且含有在所述寡核苷酸序列的5'端处连接到不与所述第二核苷酸序列互补的第四核苷酸序列的与所述第二核苷酸序列互补的寡核苷酸序列，以产生核酸产物，其中基本上所有的产物都包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一些实施例中，本文提供了用于产生一种或多种模板化载体，例如固体载体的方法。此类方法包含例如：a)通过将一种或多种预植入的载体、核苷酸、重组酶和聚合酶组合来形成模板化反应混合物，其中所述一种或多种预植入的固体载体包含所连接的基本上相同的第一引物群体并且具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子，其中所述一种或多种预植入的固体载体形成于单独的预植入反应中，所述单独的预植入反应在模板化反应前进行，其中所述基本上单克隆模板核酸分子包含包括所述第一引物的近侧区段，在一些实施例中，所述第一引物不包含100或更多个相同核苷酸，其中所述近侧区段将模板核酸区段与预植入的固体载体连接，并且其中所述预植入的固体载体进一步包含与所述预植入的固体载体连接并且未与模板核酸分子结合的所连接的第一引物，其中所述模板化反应混合物进一步包含基本上相同的可溶性第二引物群体，并且其中所述模板核酸分子包含在与所述近侧区段相对的末端处或其附近的第二引物的引物结合位点；以及b)通过向所述模板化反应混合物添加阳离子并在等温条件下温育所述反应混合物持续至少10分钟来进行模板化反应，以在模板化反应中扩增模板核酸分子，以便产生一种或多种模板化固体载体，其中所述模板化固体载体中的每个模板化固体载体包含至少100,000个基本上单克隆模板核酸分子，并且其中当开始模板化反应时，模板核酸分子不以溶液形式存在于反应混合物中，由此产生一种或多种模板化固体载体。在一些实施例中，在测序反应中使用一种或多种模板化固体载体，以确定模板核酸分子的序列。在另外的实施例中，所述模板化固体载体是模板化珠粒，并且所述测序包含在进行测序反应之前将珠粒分配在固体载体的孔中。在一些实施例中，一种或多种模板化固体载体包含：第一模板化固体载体，其与具有第一序列的模板核酸分子的基本上单克隆群体连接；以及至少一种其它模板化固体载体，其与具有第二序列的模板核酸分子的基本上单克隆群体连接，其中第一连接的模板核酸分子的序列不同于第二连接的模板核酸分子的序列。在另外的实施例中，与每个预植入的固体载体连接的基本上单克隆模板核酸分子包含至少70％与每个预植入的固体载体连接的所有模板核酸分子。在一些实施例中，模板化反应混合物包含预植入的固体载体群体。在另外的实施例中，所述固体载体群体中的每个预植入的固体载体具有介于10与50,000个之间的与其连接的基本上单克隆模板核酸分子，并且所述一种或多种固体载体是珠粒。在一些实施例中，预植入反应混合物和/或模板化反应混合物进一步包含重组酶辅助蛋白。在另外的实施例中，重组酶辅助蛋白是单链结合蛋白和/或重组酶负载蛋白。在一些实施例中，在介于35℃与45℃之间的温度下，温育模板化反应混合物和/或预植入反应混合物。在一些实施例中，温育模板化反应混合物10到60分钟。在一些实施例中，存在于模板化固体载体上的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的基本上单克隆模板核酸分子的至少100倍。
在一些实施例中，本公开总体上涉及方法、以及用于进行所述方法的系统、组合物、试剂盒和设备，其中所述方法是用于确定模板核酸分子的序列，并且包含：进行预植入反应和随后模板化反应。在一些实施例中，预植入反应产生多个预植入的固体载体，其中多个预植入的固体载体中的单独预植入的载体包含与固体载体连接的多个第一引物，其中所述多个第一引物具有基本上相同序列，并且其中所述多个第一引物中的一些与模板核酸分子接合并且所述多个第一引物中的一些不与模板核酸分子接合。在一些实施例中，本公开总体上涉及用于确定模板核酸分子的序列的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，所述方法包含：a)产生包含所连接的相同的第一引物群体的预植入的固体载体群体，其中在预植入条件下产生预植入的固体载体，并且其中所述预植入的固体载体中的每个预植入的固体载体具有介于10与100,000个之间的包含与其连接的所述第一引物的基本上单克隆模板核酸分子，并且包含所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与预植入的固体载体连接并且不与模板核酸分子结合；b)通过将预植入的固体载体群体、核苷酸、重组酶、聚合酶和呈溶液形式的未与任何底物连接的相同的第二引物群体组合来形成模板化反应混合物，其中所述模板核酸分子包含在与包含所述第一引物的近侧区段相对的末端处或其附近的所述第二引物的引物结合位点；c)通过向所述模板化反应混合物添加阳离子开始模板化反应，其中当开始模板化反应时，模板核酸分子不以溶液形式存在于反应混合物中；d)在等温条件下温育已开始的模板化反应混合物至少10分钟，以在模板化反应中扩增模板分子，以产生一种或多种模板化固体载体，所述一种或多种模板化固体载体包含的在模板化固体载体上的所连接的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的至少10倍；以及e)对一种或多种模板化固体载体上的模板核酸分子进行测序，由此确定模板核酸分子的序列。在一些实施例中，模板核酸分子包含具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在一些实施例中，与预植入的固体载体连接和/或与模板化固体载体连接的基本上单克隆模板核酸分子包含具有两种或更多种不同序列的模板核酸分子。在另外的实施例中，与每个预植入的固体载体连接的基本上单克隆模板核酸分子包含至少70％与每个预植入的固体载体连接的所有模板核酸分子。在一些实施例中，所述模板化固体载体是模板化珠粒，并且所述测序包含在进行测序反应之前将珠粒分配在固体载体的孔中。在一些实施例中，所述固体载体群体的各预植入的固体载体具有在10与50,000个之间的与其连接的基本上单克隆模板核酸分子，并且所述一种或多种固体载体是珠粒。在一些实施例中，预植入反应混合物和/或模板化反应混合物进一步包含重组酶辅助蛋白。在另外的实施例中，重组酶辅助蛋白是单链结合蛋白和/或重组酶负载蛋白。在一些实施例中，在介于35℃与45℃之间的温度下，温育模板化反应混合物和/或预植入反应混合物。在一些实施例中，温育模板化反应混合物10到60分钟。在一些实施例中，使用第一重组酶-聚合酶扩增(RPA)反应产生预植入的固体载体，并且模板化反应是第二RPA反应。在另外的实施例中，通过在介于35℃与45℃之间的温度下，温育RPA反应混合物2到5分钟，来进行第一RPA反应。在一些实施例中，存在于模板化固体载体上的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的基本上单克隆模板核酸分子的至少100倍。
在一些实施例中，本公开总体上涉及方法、以及用于进行所述方法的系统、组合物、试剂盒和设备，其中所述方法是用于确定模板核酸分子的序列，并且包含：a)通过在预植入反应条件下，温育第一重组酶-聚合酶扩增(RPA)反应混合物进行预植入反应，以产生一种或多种预植入的固体载体，所述第一重组酶-聚合酶扩增反应混合物包含模板核酸分子群体和包含所连接的相同的第一引物群体的固体载体群体，其中所述预植入反应条件包含在等温条件下温育所述RPA反应混合物，并且其中所述预植入的固体载体各自具有在10与100,000个之间的与其连接的基本上单克隆核酸分子，和/或所述预植入反应条件包含在等温条件下温育所述RPA反应混合物2到5分钟，其中所述预植入的固体载体包含：(i.)通过所述第一引物与所述固体载体连接的模板核酸分子的基本上单克隆群体，和(ii.)所连接的第一引物，其与所述预植入的固体载体连接并且不与模板核酸分子结合；b)通过使第二RPA反应混合物中包含一种或多种预植入的固体载体形成模板化反应混合物，其中模板核酸分子不与不包含在所述模板化反应混合物中的所述预植入的固体载体缔合，其中所述模板化反应混合物进一步包含呈溶液形式的不与任何底物连接的相同的第二引物群体，并且其中所述模板核酸分子包含在与包括所述第一引物的近侧区段相对的末端处或其附近的所述第二引物的引物结合位点；c)通过向所述模板化反应混合物添加阳离子开始模板化反应；d)在等温条件下温育已开始的模板化反应混合物至少10分钟，以在模板化反应中扩增模板核酸分子来产生一种或多种模板化固体载体，所述一种或多种模板化固体载体包含的在模板化固体载体上的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的至少10倍；以及e)对一种或多种模板化固体载体上的模板核酸分子进行测序，由此确定模板核酸分子的序列。在一些实施例中，模板核酸分子包含具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在一些实施例中，与预植入的固体载体连接和/或与模板化固体载体连接的基本上单克隆模板核酸分子包含具有两种或更多种不同序列的模板核酸分子。在另外的实施例中，与各预植入的固体载体连接的基本上单克隆模板核酸分子包含至少70％与各预植入的固体载体连接的所有模板核酸分子。在一些实施例中，所述模板化固体载体是模板化珠粒，并且所述测序包含在进行测序反应之前将珠粒分配在固体载体的孔中。在一些实施例中，所述固体载体群体的各预植入的固体载体具有在10与50,000个之间的与其连接的基本上单克隆模板核酸分子，并且所述一种或多种固体载体是珠粒。在一些实施例中，预植入反应混合物和/或模板化反应混合物进一步包含重组酶辅助蛋白。在另外的实施例中，重组酶辅助蛋白是单链结合蛋白和/或重组酶负载蛋白。在一些实施例中，在介于35℃与45℃之间的温度下，温育模板化反应混合物和/或预植入反应混合物。在一些实施例中，温育模板化反应混合物10到60分钟。在一些实施例中，存在于模板化固体载体上的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的基本上单克隆模板核酸分子的至少100倍。
在一些实施例中，本公开总体上涉及组合物、以及关于组合物的系统、方法、试剂盒和设备，其中所述组合物包含包括预植入的固体载体群体、核苷酸、重组酶和聚合酶的模板化反应混合物，其中所述预植入的固体载体群体具有介于10与50,000个之间的包含与其连接的第一引物的基本上单克隆模板核酸分子，并且进一步包含所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与预植入的固体载体连接并且不与模板核酸分子结合，其中所述反应混合物不包含能够开始重组酶-聚合酶扩增反应的阳离子，并且其中所述反应混合物中的至少95％的模板核酸分子与一种或多种固体载体连接。在一些实施例中，模板核酸分子包含具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在一些实施例中，与预植入的固体载体连接和/或与模板化固体载体连接的基本上单克隆模板核酸分子包含具有两种或更多种不同序列的模板核酸分子。在一些实施例中，预植入的固体载体是预植入的珠粒。在一些实施例中，所述模板化反应混合物包含重组酶辅助蛋白。在另外的实施例中，重组酶辅助蛋白是单链结合蛋白和/或重组酶负载蛋白。在一些实施例中，使用第一重组酶-聚合酶扩增(RPA)反应，来产生预植入的固体载体。在另外的实施例中，通过在介于35℃与45℃之间的温度下，温育RPA反应混合物2到5分钟，来进行第一RPA反应。在一些实施例中，预植入反应混合物进一步包含呈溶液形式的相同的第二引物群体，并且模板核酸分子在第一末端处或其附近包含第一引物的引物结合位点。在一些实施例中，模板化反应混合物进一步包含能够开始重组酶-聚合酶扩增反应的阳离子。
在用于产生一种或多种模板化载体，例如本文提供的固体载体的方法的一些实施例中，与方法中所产生的模板化载体或载体连接的至少一些、大部分或所有核酸含有至少一个修饰的核苷酸，所述至少一个修饰的核苷酸包含与其连接的连接物，例如第一连接子部分。此类方法可以进一步包含将模板化载体与磁珠连接，所述磁珠具有与模板化载体连接的核酸的经修饰的核苷酸可以通过修饰的核苷酸的连接物或连接子结合、连接(link)或连接(attach)的部分(例如结合伴侣或第二连接子部分)，由此形成模板化载体与磁珠的珠粒组合件。在这些方法的一些实施例中，通过向珠粒组合件施加磁场，将珠粒组合件与不包含磁珠的任何元件分开，由此将珠粒组合件与任何此类元件分开并且形成富集的模板化载体群体。在所述方法的一些实施例中，使分开的珠粒组合件进一步置于从磁珠释放模板化载体的条件下，并且在另外的方法，例如测序方法中进行分析。
本文还提供了制备用于分析核酸，例如对核酸进行测序的装置的方法。在一些实施例中，所述方法包含：产生含有捕获序列部分、模板部分和含第一连接子部分的引物部分的核酸；例如通过杂交在具有与核酸的捕获序列部分互补的多个捕获引物的载体上捕获核酸，所述载体例如固体载体，如珠粒；将所捕获的核酸的第一连接子部分与磁珠上所含的第二连接子部分连接，以形成载体上的所捕获核酸与磁珠的珠粒组合件；向珠粒组合件施加磁场，由此将珠粒组合件与不包含磁珠的任何元件分开；从磁珠释放载体上的捕获核酸；将载体上所释放的捕获核酸与磁珠混合，载体上的所捕获的核酸不与所述混合物连接(attach/link)或结合；和将混合物并入到用于分析所捕获核酸的装置中。在一些实施例中，将载体上的所捕获核酸与磁珠的混合物涂覆于表面，例如芯片，如半导体芯片，并且向表面施加磁场。所述表面可含有微孔，通过在向表面施加磁场时在表面上移动磁珠而将载体上的所捕获核酸负载到微孔中。在一些此类实施例中，磁珠的大小使得磁珠不能进入微孔。
在制备用于分析核酸的装置的方法的一些实施例中，所述方法包含：产生含有捕获序列部分、模板部分和含第一连接子部分的引物部分的核酸；在具有与核酸的捕获序列部分互补的多个捕获引物的载体上捕获核酸，所述载体例如固体载体，如珠粒；将所捕获的核酸与具有第二连接子部分的磁珠连接，以形成珠粒组合件，使得连接第一和第二连接子部分；以及使用磁场将珠粒组合件负载到装置的孔中。
附图说明
图1A到1D是示出了在大批等温扩增之后高通量测序中的读段长度的频率分布图。
图1A示出了使用不具有预植入的模板的离子球形颗粒(Ion Sphere Particle；ISP)(无模板对照(no template control(NTC))的读段长度。
图1B示出了使用预植入有约70个拷贝/ISP的ISP的读段长度。
图1C示出了使用预植入有约665个拷贝/ISP的ISP的读段长度。
图1D示出了使用预植入有约4,170个拷贝/ISP的ISP的读段长度(图1D)。
图2A-2F是示出了使用NTC P1 ISP和预植入有约70、约665和约4,170个拷贝/ISP的ISP，在大批等温扩增之后高通量测序的各种度量的条形图。
图2A示出了NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的ISP负载百分比。
图2B示出了来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的可使用读段的百分比。
图2C示出了来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的总读段的数量。
图2D示出了来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的读段长度的平均值、中值和众数。
图2E示出了NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的空孔百分比。
图2F示出了NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的低质量孔百分比。
图3A-3F是示出了使用不具有模板对照(NTC)的ISP和预植入有约82、约775和约5,400个拷贝/ISP的ISP，在预植入扩增反应之后，高通量测序的各种度量的条形图。
图3A示出了NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的ISP负载百分比。
图3B示出了来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的可使用读段的百分比。
图3C示出了来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的总读段的数量。
图3D示出了来自NTC ISP和预植入有不同模板拷贝数的ISP的读段长度的平均值、中值和众数。
图3E示出了预植入有不同模板拷贝数的ISP的空孔百分比。
图3F示出了预植入有不同模板拷贝数的ISP的低质量孔百分比。
图4是示出了模板核酸分子的上下链的引物延伸反应的示意图。
图5、图6和图7展示了用于将核酸与载体连接的示例方案。
图8是用于制备测序装置的示例方法的图示。
图9展示了用于将核酸与珠粒连接的示例方案的图示。
图10是使用若干不同方法，对于所产生的核酸模板进行的测序运行的结果的图。
图11是用于通过将珠粒与连接到连接子部分的核酸结合来直接捕获核酸的示例方法的图示。
图12展示了用于将核酸连接到载体的示例方案。
图13是用于通过将珠粒与含有单链手柄区的核酸结合来间接捕获核酸的示例方法的图示。
提供以上所标识的图是代表性的且非限制性的。
定义
如本公开中所用，以下术语应理解为具有以下含义：
当提及一种或多种多核苷酸群体使用时，术语“单克隆”和其变体是指多核苷酸群体，其中在核苷酸序列水平上，约50-99％或至多100％的群体成员共享至少80％同一性。如本文所用，当提及一种或多种多核苷酸群体使用时，短语“基本上单克隆”和其变化形式是指一种或多种多核苷酸群体，其中所扩增的模板多核苷酸分子是群体中单一最普遍的多核苷酸。因此，单克隆或基本上单克隆群体的所有成员不一定完全相同或彼此互补。例如，可扩增或复制多核苷酸模板的不同部分，以产生所得单克隆群体的成员；类似地，可在初始模板的扩增期间发生一定数量的“差错”和/或不完全延伸，由此产生其个别成员可在其自身中呈现序列可变性的单克隆或基本上单克隆群体。在一些实施例中，可在本发明传授内容的核酸扩增反应期间发生低或非基本上水准的非同源多核苷酸的混合，且因此基本上单克隆群体可含有少数的一种或多种多核苷酸(例如小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％或小于0.001％的多种多样的多核苷酸)。在某些实例中，群体中的至少90％的多核苷酸与用作扩增基础的初始单一模板至少90％相同，以产生基本上单克隆群体。在某些实施例中，用于扩增的方法产生多核苷酸群体，其中至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多核苷酸群体成员与产生群体的模板核酸共享至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，用于扩增的方法产生多核苷酸群体，其中足够的大部分多核苷酸共享足够的序列同一性，以允许使用高通量测序系统对扩增模板的至少一部分进行测序。
在一些实施例中，至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％的与模板化载体连接的模板核酸分子的成员将与模板核酸分子共享大于90％、95％、97％、99％或100％同一性。在一些实施例中，使用任一种扩增方法产生的核酸群体的成员在高严格杂交条件下彼此进行杂交。
在一些实施例中，扩增方法产生基本上单克隆核酸分子群体，其包含充分少的多克隆杂质，使得其在高通量测序方法中成功进行测序。例如，扩增方法可产生基本上单克隆核酸分子群体，其产生使用特定测序系统检测到的信号(例如测序信号、核苷酸并入信号和其类似物)。任选地，随后可分析信号以正确地确定存在于群体的任何核酸分子内的任何一种或多种核苷酸的序列和/或碱基同一性。用于检测和/或分析此类信号的适合测序系统的实例包含Ion Torrent测序系统，如Ion Torrent PGMTM序列系统，包含314、316和318系统；Ion Torrent ProtonTM测序系统，包含Proton I(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)；以及Ion Torrent ProtonTM测序系统，包含Ion S5和S5XL(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)。在一些实施例中，单克隆扩增子准许在Ion Torrent测序系统上对至少5个连续核苷酸残基进行准确测序。
如本文所用，术语“克隆扩增”和其变体是指由此通过扩增多核苷酸模板产生基本上单克隆多核苷酸群体的任何方法。在克隆扩增的一些实施例中，扩增两种或更多种多核苷酸模板以产生至少两个基本上单克隆多核苷酸群体。
如本文所用，术语“预植入”，在本文中也被称为“植入”，是指涉及将一种或多种核酸分子与载体连接的过程。在一些实施例中，预植入涉及将一种或多种核酸与载体连接，使得所连接核酸可以被进一步操纵和/或分析，例如经受核酸扩增、测序和/或其它过程。在一些实施例中，预植入过程产生单个载体，其中单个核酸分子与其连接。具有与其连接的单个核酸分子的单个载体可以包含在两个或更多个载体的群体、多个载体或两个或更多个载体的集合中，其中每个载体具有与其连接的单个核酸分子。在一些实施例中，每个此类载体具有与其连接的不同的单个核酸分子。在一些实施例中，在预植入过程中，核酸分子的多个拷贝与载体连接和/或多个不同的核酸与载体连接。在一些实施例中，在预植入过程中，将有限数量的基本上相同核酸的拷贝与载体连接以产生基本上单克隆核酸群体。在一些实施例中，载体的预植入包含核酸与载体的连接，例如，通过核酸与和载体连接的互补多核苷酸的杂交，不涉及核酸扩增。在一些实施例中，载体的预植入包含核酸扩增，例如，核酸扩增(例如，PCR)和/或等温扩增的一个或多个循环。例如，可以在预植入过程中使用核酸扩增以产生能够连接(例如，通过杂交)到载体的核酸的一个或多个拷贝。通常，产生连接有超过一个核酸模板或核酸模板的多个拷贝的载体的预植入包含核酸扩增。在如本文提供的预植入或植入过程中产生的载体被称为“预植入的”或“植入的”载体。
如本文所用，当指在预植入和/或模板化方法中连接到载体的核酸(或核酸的拷贝)的数量时，“有限数量”通常是指被控制用于各种目的的不同的核酸的数量。一种核酸的有限拷贝数量可以是，例如，足以在载体上的核酸的任何后续更大规模扩增(例如模板化)中提供拥挤效应以产生更大的基本上单克隆的核酸群体，以便通过防止或减少模板在反应位点之间的迁移来防止或减少多克隆群体的形成。此类有限数量的模板拷贝是有限的，以便使用相对较短的核酸扩增时间，例如，以防止或减少模板在反应位点之间的迁移，但产生足够数量的模板拷贝以在随后的扩增中提供拥挤效应。
如本文所用，术语“包括(comprises/comprising)”、“包含(includes/including)”、“具有(has/having)”或其任何其它变型均旨在涵盖非排他性的包含。例如，包括一系列特征的工艺，方法，制品或设备不必仅限于那些特征，而是可以包含未明确列出的或此类工艺，方法，制品或设备固有的其它特征。进一步，除非有相反的明确说明，“或”指的是包含性或，而不是排他性或。例如，条件A或B由以下任一条件满足：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，并且A和B均为真(或存在)。
此外，使用“一个(a)”或“一种(an)”来描述本文所描述的元件和组件。这样做仅仅是为了方便和给出本发明范围的一般含义。除非明显意指其它情况，否则这种描述应被理解为包含一个或至少一个，且单数也包含复数。
根据以下详细描述和权利要求，本公开的其它特征和优点将显而易见。
具体实施方式
在一些实施例中，本公开总体上涉及操纵核酸的方法以及用于进行所述方法的系统、组合物、试剂盒和设备。在一些实施例中，所述方法包含核苷酸聚合、核苷酸序列修饰(例如，接合衔接子和/或引物序列，例如可切割引物)、核苷酸修饰(例如，向核酸分子中的一个或多个核苷酸添加标记或连接子分子(例如，生物素))、核酸扩增、核酸限制、核酸捕获、核酸容纳(containment)和/或核酸转移。本文提供的方法和组合物可以用于例如产生特异性特定核酸分子，所述核酸分子用于例如产生可以用于例如核酸测序方法的模板核酸群体。在一些实例中，可以使用本文提供的方法和组合物以产生单克隆或基本上单克隆的核酸群体。在一些实施例中，使用所述方法来产生单克隆或基本上单克隆的核酸群体，其中核酸与载体，例如固体载体连接。在一些实施例中，使用所述方法来将核酸与两种或更多种载体连接。在此类实施例中，两种或更多种载体可以相同或不同，包含例如聚合和/或磁性载体。在一些实施例中，使用所述方法来将与一种或多种载体连接的核酸转移到反应位点和/或反应室。在一些实施例中，使用所述方法以在反应位点和/或反应室或多个反应位点和/或多个反应室内产生单克隆或基本上单克隆的核酸群体。可单独或以任何组合进行本文所提供的方法以用于任何一种或多种用途，且提供核酸分析方面的优点。例如，本文中所公开的方法和/或组合物的使用提供改进质量、数量和/或准确性的核酸分析结果，例如核酸测序结果。在另一个实例中，单独和/或以任何组合使用本文中所公开的方法和/或组合物，增强核酸操纵方法，以明显地提高工作流程效率和/或促进核酸分析，例如核酸测序的工作流程自动化。
在一些实施例中，本公开总体上涉及改进高通量核酸测序结果的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备。所述方法、系统、组合物、试剂盒和设备并入用于产生、含有、分离、转移、复制和/或操纵基本上单克隆核酸群体的方法和组合物，所述方法和组合物是快速、有效且节约成本的同时提供相较于现有方法，显著地增加高质量核酸测序读段和/或较长长度的核酸测序读段的生产与降低重复、非信息、错误和/或库读段的数量和运行时间。在一些实施例中，所述方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备包含载体，例如固体载体，以约束、富集、掩蔽、分离、定位、扩增和/或转移可用于分析方法中的核酸。在一些实施例中，载体预植入有来自较大核酸集合(例如，核酸文库或样品)的一个核酸分子或有限数量的主要基本上相同核酸分子，以提供与单个核酸分子或与局部基本上单克隆的核酸群体连接的单独载体。此类预植入的载体易于操纵并且用作例如单独的单个核酸分子或两个或更多个基本上相同的核酸分子的清洁、封闭、包含和/或分离的来源，其可以被克隆扩增，例如，在模板化反应中，产生相对纯净、封闭、包含和/或分离的核酸模板集合，用于高通量测序工作流程以改进测序结果。在一些实施例中，可以至少部分地产生预植入的载体，和/或使用等温扩增，尤其是重组酶介导的扩增反应，如重组酶-聚合酶扩增(RPA)来进行扩增。因此，在本文提供的操纵核酸的方法的一些实施例或方面中，例如，在高通量测序工作流程中，预植入反应在模板化反应之前进行。
在典型的高通量测序工作流程中，使用样品中的核酸分子来制备适合于下游测序的模板核酸分子文库。可以在文库制备之前、期间或之后，任选地对于核酸分子进行多重扩增。随后，将模板核酸分子文库扩增到用于测序反应的一种或多种载体上。在本文提供的方法的一些实施例中，载体例如固体载体上的模板的扩增通常是在两种或更多种反应中进行，包含例如一种或多种预植入反应，所述一种或多种预植入反应产生具有与其连接的一个模板核酸分子或与其连接的基本上单克隆模板核酸分子群体的一种或多种预植入的载体；随后在预植入的载体上进行一种或多种模板化反应，所述一种或多种模板化反应在一种或多种载体上产生一个或多个所连接的模板核酸分子的更多拷贝(例如，至少多10×拷贝)。进行预植入反应和模板化反应的优点是，这个工作流程在高通量测序反应中产生更高质量的测序读段。在一些实施例中，用封端的引物进行预植入反应，以防止在预植入反应期间形成引物二聚体扩增子。在先前方法中，在模板化期间可产生引物二聚体扩增子，这可产生较低质量的测序读段和降低来自模板核酸分子的测序读段的数量。因此，添加单独预植入反应提供相对于先前方法的这个和大量其它优点。
在一些实施例中，本公开总体上涉及用于扩增模板核酸分子的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，所述方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备包含包括一种或多种预植入的载体的模板化反应混合物。在各个方面中，使用本文提供的模板化载体来进行下游测序方法。模板化反应通常使用重组酶来使双链模板核酸分子变性或分离，并且是在等温温度下用适合于RPA反应的聚合酶进行。在一些方面中，在单独预植入反应混合物中产生预植入的载体。
在一些实施例中，本文提供的预植入(或植入)方法包含将单链核酸分子与和载体结合且固定于所述载体上的互补核酸，例如寡核苷酸杂交。此类方法通常在退火条件下在短时间段内进行。在一些实施例中，植入方法涉及在其中载体例如固体载体，如珠粒或颗粒将与仅一个单链核酸分子连接的条件下杂交。此类条件包含例如使单链核酸(例如，来自核酸文库或样品)群体与相对于核酸分子数量大量过量的载体在退火条件下接触。例如，在一些实施例中选择载体与模板核酸分子的比率以优化具有单个模板多核苷酸分子或与其连接的基本上单克隆的模板核酸分子群体的载体的百分比。例如，可以用以下的载体:模板核酸分子比率进行预植入：至少约1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1或100:1。
在一些实施例中，本文提供的预植入(或植入)方法包含通过杂交将核酸与载体连接且在同时扩增所连接的核酸到低水准，例如约20拷贝的组合过程。在这些实施例中预植入反应混合物通常包含模板核酸分子群体、聚合酶、核苷酸、第一引物群体和如二价阳离子的辅因子。所属领域的技术人员将理解，各种方法可用于用基本上单克隆模板核酸分子预植入固体载体。作为非限制性实例，可以使用RPA反应、模板步移反应、PCR、乳化液PCR或桥式PCR来进行预植入反应。可在溶液中大批进行预植入反应和/或模板化反应。此外，预植入反应混合物和/或模板化反应混合物可以包含：与一种或多种载体连接的第一通用引物；呈溶液形式的第二通用引物(可溶性第二通用引物)；和多个模板核酸分子，其中个别模板核酸分子与可在文库制备期间添加的至少一个通用引物结合序列接合，并且其中通用引物结合序列结合第一和任选的第二通用引物。在一些实施例中，在孔中进行预植入反应和/或模板化反应。在一些实施例中，使用连续RPA反应进行预植入反应和模板化反应，其中在预植入反应之后在进行模板化反应之前，洗掉模板核酸分子。
将修饰具有核酸分子的载体，例如珠粒负载到受约束的区域或容器(receptacle)，如微孔或凹坑中，以形成呈现若干核酸模板化和/或测序优点的阵列。以有组织的紧密封装方式放置核酸涂覆的珠粒，例如放置到小微孔中，可增加每循环的通量且降低客户成本。随着微孔的密度增加或随着微孔大小减小，珠粒负载变得困难，由此产生许多空的微孔且降低孔中的珠粒计数。太多的空微孔使得碱基读段的数量降低且因此测序性能不佳。在一些实施例中，本文提供了将载体，如固体载体，例如珠粒，引入到微孔或反应室中的方法、以及用于所述方法中的系统、组合物、试剂盒和设备。在一些实施例中，所述方法包含将具有修饰具有连接子部分的所捕获模板核酸的珠粒载体与具有互补连接子部分的磁珠连接，以形成珠粒组合件，和使用磁场将珠粒组合件负载到孔中。可以使珠粒组合件变性以释放磁珠，使得珠粒载体与孔中的靶核酸连接。可以例如在制备用于核酸测序的装置中使用此类方法。在一实施例中，在孔中进行的反应可以是用来鉴定或确定所关注的分析物的特征或特性的分析反应。此类反应可直接或间接产生提供可以指示分析物是否以特征方式反应的信号的副产物。如果此类副产物少量产生或快速衰减或与其它成分反应，那么可同时在孔中分析相同分析物的多个拷贝，以便增加所产生的输出信号。在本文所提供的方法的实施例中，可以在置于孔中之前或之后，将分析物，例如核酸的多个拷贝与固相载体连接。例如，可以在微孔中扩增靶核酸，以提供适用于靶核酸测序的靶核酸的克隆群体。固相载体可以是例如包括凝胶或类似物的微米颗粒、纳米颗粒、珠粒、固体或多孔。为了简化和便于说明，固相载体在本文中也被称作颗粒或珠粒。对于核酸分析物，可以通过滚环扩增(RCA)、指数RCA或类似技术制备多个连接的拷贝，以产生扩增子而不需要固体载体。
在一些实施例中，本公开总体上涉及用于产生一种或多种模板化固体载体的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，所述方法包含：a)通过将一种或多种预植入的固体载体、核苷酸、重组酶和聚合酶组合来形成模板化反应混合物，其中所述一种或多种预植入的固体载体包含所连接的基本上相同的第一引物群体并且具有与其连接的一个模板核酸分子或具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子，其中模板核酸分子包含包括所述第一引物的近侧区段，其中所述近侧区段在所述第一引物处将模板核酸区段与固体载体连接，并且其中所述预植入的固体载体进一步包含所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与所述预植入的固体载体连接并且不与模板核酸分子结合，其中所述模板化反应混合物进一步包含基本上相同的可溶性第二引物群体，并且其中所述模板核酸分子包含在与所述近侧区段相对的末端处或其附近的所述第二引物的引物结合位点；以及b)执行一种或多种模板化反应。在一些实施例中，模板化反应在等温条件下进行。在一些实施例中，通过向模板化反应混合物添加阳离子并在等温条件下温育反应混合物来进行模板化反应。在一些实施例中，模板化反应混合物在等温条件下温育至少10分钟以在模板化反应中扩增模板核酸分子，以便产生一种或多种模板化固体载体。在一些实施例中，所述方法提供模板化固体载体，其中每个载体包含至少100,000个基本上单克隆模板核酸分子。
在一些实施例中，两个或更多个反应在模板化方法中进行。在一些实施例中，在模板化方法中进行两个或更多个单独的反应。例如，在本文提供的一些方法中，进行第一或初始模板化反应，并且然后是第二或后续模板化反应。在一些情况下，初始模板化反应包含一种或多种载体，一种或多种模板多核苷酸连接到所述载体上，所述模板多核苷酸在模板化反应开始之前在单独的预植入过程中产生。初始模板化反应包含例如在基本上等温条件下使用重组酶和聚合酶(即，RPA)在预植入的载体上扩增一种或多种模板多核苷酸。与随后的第二模板化反应的持续时间相比，初始第一模板化反应随后进行第二或后续模板化反应通常进行更短的时间段。例如，初始第一模板化反应，随后是第二或后续模板化反应可以进行约1-10分钟、约1-9分钟、约1-8分钟、约1-7分钟、约1-6分钟，约1-5分钟，约1-4分钟，约1-3分钟，约1-2.5分钟，约1-2分钟，约1-1.5分钟，约2-10分钟，约2-9分钟，约2-8分钟，约2-7分钟，约2-6分钟，约2-5分钟，约2-4分钟，约2-3分钟，约2-2.5分钟，约2.5-10分钟，约2.5-9分钟、约2.5-8分钟、约2.5-7分钟、约2.5-6分钟、约2.5-5分钟、约2.5-4分钟或约2.5-3分钟。在一些实例中，初始第一模板化反应，随后是第二或随后的模板化反应，可以进行少于约15分钟、少于约10分钟、少于约5分钟、少于约4分钟、少于约3分钟、少于约2.5分钟、少于约2分钟、少于约1.5分钟或少于约1分钟。在一个非限制性实例中，使用RPA在约40℃下进行约2.5分钟的初始模板化反应。在一些实施例中，初始或第一模板化反应在开始第二或后续模板化反应之前终止或限制。例如，终止组合物，例如模板化反应抑制剂，可以添加到抑制或停止反应和/或阻止反应继续的初始或第一模板化反应中。模板化反应抑制剂的实例包含但不限于抑制核酸扩增反应的一种或多种组分，例如聚合酶抑制剂或重组酶抑制剂，和/或限制反应所需的组分的组合物反应进行。例如，在包含重组酶-聚合酶核酸扩增的初始模板化反应中，模板化反应抑制剂可以是螯合剂，例如金属或阳离子螯合剂，例如EDTA，其结合所需的阳离子，例如镁，用于重组酶-聚合酶扩增中重组酶介导的反应。在另一个实例中，模板化反应可以通过去除反应组分例如通过用不含模板化反应所需的一种或多种组分的溶液洗涤模板化反应位点，例如反应室或孔来限制。例如，可以用不含重组酶、聚合酶、阳离子、核苷酸和/或用于模板化反应的RPA反应的其它组分的溶液洗涤或冲洗模板化反应位点。在一些实施例中，通过将一种或多种模板化反应组分添加或接触到已经进行初始或第一模板化反应的模板结合载体来开始或促进在初始或第一模板化反应之后的第二或后续模板化反应。例如，在包含重组酶-聚合酶核酸扩增的第二或后续模板化反应中，可以将以下组分中的一种或多种组分添加到模板结合的载体或与模板结合载体接触：重组酶、聚合酶、核苷酸和/或阳离子。在第一或初始模板化反应之后的第二或后续模板化反应通常进行比第一模板化反应的持续时间更长的时间段。例如，在第一模板化反应之后的第二或后续模板化反应可以进行约5-60分钟、约5-50分钟、约5-45分钟、约5-40分钟、约5-35分钟、约5-30分钟，约5-25分钟，约5-20分钟，约5-15分钟，约5-10分钟，约10-60分钟，约10-50分钟，约10-45分钟，约10-40分钟，约10-35分钟，约10-30分钟，约10-25分钟，约10-20分钟，约10-15分钟，约15-60分钟，约15-50分钟，约15-45分钟，约15-40分钟，约15-35分钟，约15-30分钟，约15-25分钟，约15-20分钟，约20-60分钟，约20-50分钟，约20-45分钟，约20-40分钟、约20-35分钟、约20-30分钟或约20-25分钟。在一些实例中，在第一或初始模板化反应之后的第二或后续模板化反应可进行至少约60分钟、至少约55分钟、至少约50分钟、至少约45分钟、至少约40分钟、至少约35分钟、至少约30分钟、至少约25分钟、至少约20分钟、少于2分钟、少于1.5分钟或少于1分钟。在一个非限制性实例中，使用RPA在约40℃下进行第二或随后的模板化反应约20分钟。在一些实施例中，在设定时间处终止或限制第二或随后的模板化反应。例如，终止组合物，例如模板化反应抑制剂，可以添加到抑制或停止反应和/或阻止反应继续的第二或后续模板化反应中。在另一个实例中，模板化反应可以通过去除反应组分例如通过用不含模板化反应所需的一种或多种组分的溶液洗涤模板化反应位点，例如反应室或孔来限制。
在模板化过程中包含两个或更多个反应以产生基本上单克隆的核酸群体的一个优点是其促进了模板扩增的控制，这可以减少或防止核酸群体中的多克隆性。例如，数量和/或持续时间有限的预植入载体上的模板多核苷酸的初始或第一扩增可以限制可以用于移动或迁移到另一个模板化反应位点的游离模板的量。初始或第一模板化反应提供复制的模板与预先植入的载体上的另外固定引物的结合，并因此提供对于模板核酸扩散在第二次或后续模板化反应扩增中发生的不太开放的环境。在其中在模板化方法中进行两个或更多个反应的一些实施例中，所述反应中的一个或多个反应包含一种或多种扩散限制性药剂，所述扩散限制性药剂的实例在本文中提供。扩散限制性药剂可以进一步阻止或减缓模板核酸分子或通过模板核酸分子的至少一些部分在模板化反应混合物中的复制产生的扩增多核苷酸的扩散，由此防止或减少用于产生单克隆模板群体的模板化反应混合物中的核酸转移到用于产生不同单克隆模板群体的另一模板化反应混合物中，由此减少在模板化反应中核酸扩增期间多克隆污染物的形成。在一些实施例中，包含在一个或多个模板化反应中的扩散限制性药剂是筛分药剂，例如聚合物，例如甲基纤维素。在一些实施例中包含在一个或多个模板化反应中的扩散限制性药剂是药物组合物。例如，药物化合物可以是在模板化反应过程中，例如在模板核酸扩增过程中结合或连接到模板核酸上以降低模板核酸在模板化反应混合物中的迁移率的化合物。在一些实施例中，模板核酸被修饰以包含与药物化合物结合的部分(称为“药物标签”)。在一个非限制性实例中，模板核酸被生物素化并且包含在一个或多个模板化反应中的药物化合物是链霉亲和素或其衍生物，例如中性亲和素。在一些实施例中，药物化合物被包含在第一或初始模板化反应中。在一些实施例中，药物化合物包含在第一或初始模板化反应中，但不包含在第二或后续模板化反应中。
通常，模板核酸分子不以溶液形式包含在模板化反应混合物中。在一些实施例中，当开始模板化反应时，模板核酸分子通常以溶液形式存在于反应混合物中。通常在与模板化反应分开的预植入反应中产生预植入的固体载体。在一些实施例中，通过不包含100或更多个相同核苷酸的近侧区段，模板核酸与固体载体连接。在一些实施例中，近侧区段不包含大于2、3、4、5、6、7、8、9或10个相同核苷酸的连续序列。在以上方面的一些实施例中，在测序反应中使用一种或多种模板化固体载体，以确定模板核酸分子的序列。
在一些实施例中，本公开总体上涉及用于确定模板核酸分子的序列的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，所述方法包含：a)产生包含所连接的基本上相同的第一引物群体的预植入的固体载体群体，其中在预植入条件下产生预植入的固体载体，并且其中所述预植入的固体载体中的每个预植入的固体载体具有包含与其连接的第一引物的一个模板核酸分子或例如介于10与100,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子，并且进一步包含所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与预植入的固体载体连接并且不与模板核酸分子结合；b)通过将预植入的固体载体、核苷酸、重组酶和聚合酶的群体组合来形成模板化反应混合物；c)通过向所述模板化反应混合物添加阳离子开始模板化反应，其中当开始模板化反应时，模板核酸分子不以溶液形式存在于反应混合物中；d)在等温条件下温育已开始的模板化反应混合物至少10分钟，以在模板化反应中扩增模板分子，以产生一种或多种模板化固体载体，所述一种或多种模板化固体载体包含的在模板化固体载体上的所连接的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的至少10倍；以及e)对一种或多种模板化固体载体上的模板核酸分子进行测序，由此确定模板核酸分子的序列。
在一些实施例中，本公开总体上涉及用于确定模板核酸分子的序列的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，所述方法包含：a)产生包含所连接的基本上相同的第一引物的一个或多个或多个预植入的载体，其中在预植入条件下产生预植入的载体，并且其中每个预植入的载体具有包含与其连接的第一引物的一个模板核酸分子或更多个(例如介于10与100,000个之间的)基本上单克隆模板核酸分子，并且进一步包含所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与预植入的载体连接并且不与模板核酸分子结合；b)通过将预植入的载体、核苷酸、重组酶和聚合酶组合来形成第一模板化反应混合物；c)开始第一模板化反应；d)在等温条件下温育已开始的第一模板化反应混合物，以在模板化反应中扩增模板分子，以产生一种或多种模板化载体，所述模板化载体上具有的所连接的基本上单克隆模板核酸分子比存在于预植入的载体上的更多；以及e)对一种或多种模板化载体上的模板核酸分子进行测序，由此确定模板核酸分子的序列。在用于确定模板核酸分子序列的此类方法的一些实施例中，当模板化反应开始时，模板核酸分子不存在于反应混合物中的溶液中。在一些实施例中，用于确定模板核酸分子的序列的此类方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备进一步包含在步骤d)之后和在步骤e)之前：(i)停止、中断或限制第一模板化反应，(ii)通过将来自第一模板化反应的模板化载体、核苷酸、重组酶和聚合酶组合来形成第二模板化反应混合物；(iii)开始或促进第二模板化反应；(iv)在等温条件下温育已开始的第二模板化反应混合物，以在模板化反应中扩增模板分子，以产生一种或多种模板化载体，所述模板化载体上具有的所连接的基本上单克隆模板核酸分子比存在于来自第一模板化反应的模板化载体上的更多。在一些实施例中，一个或多个或所有模板化反应在反应室例如孔或微孔中进行。
在一些实施例中，本公开总体上涉及用于确定模板核酸分子的序列的方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，所述方法包含：a)通过在预植入反应条件下，温育包含模板核酸分子群体和包含所连接的基本上相同的第一引物群体的固体载体群体的重组酶-聚合酶扩增(RPA)反应混合物来进行预植入反应，以产生一种或多种预植入的固体载体，所述一种或多种预植入的固体载体包含通过第一引物与固体载体连接的模板核酸分子的基本上单克隆群体和所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与预植入的固体载体连接且不与模板核酸分子结合，其中所述预植入反应条件包含在等温条件下温育所述RPA反应混合物，其中所述预植入的固体载体各自具有介于10与100,000个之间的与其连接的基本上单克隆核酸分子，和/或所述预植入反应条件包含在等温条件下温育所述RPA反应混合物2到5分钟；b)通过使RPA反应混合物中包含一种或多种预植入的固体载体形成模板化反应混合物，其中不与预植入的固体载体缔合的模板核酸分子不包含在所述模板化反应混合物中；c)通过向所述模板化反应混合物添加阳离子开始模板化反应；d)在等温条件下温育已开始的模板化反应混合物至少10分钟，以在模板化反应中扩增模板核酸分子来产生一种或多种模板化固体载体，所述一种或多种模板化固体载体包含的在模板化固体载体上的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的固体载体上的至少10倍；以及e)对一种或多种模板化固体载体上的模板核酸分子进行测序，由此确定模板核酸分子的序列。
在一些实施例中，所述多个模板核酸分子包含具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在一些实施例中，与预植入的固体载体连接和/或与模板化固体载体连接的基本上单克隆模板核酸分子包含具有两种或更多种不同序列的模板核酸分子。基本上单克隆模板核酸分子通常通过引物与固体载体连接，所述引物可包含连续相同核苷酸、或无连续相同核苷酸或不大于2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续核苷酸；或通过包含连续非相同核苷酸的引物与固体载体连接。然而，在一些实施例中，模板核酸的近侧区段包含少于100个相同核苷酸，所述近侧区段是与固体载体连接的区段并且通常是引物。在一些实施例中，模板化固体载体是模板化珠粒，且测序包含在进行测序反应之前将珠粒分配在固体载体的孔中。在一些实施例中，固体载体群体中的每个预植入的固体载体可以具有例如介于10与50,000个之间或介于100与25,000个之间的与其连接的基本上单克隆模板核酸分子。在说明性实例中，预植入反应混合物和/或模板化反应混合物进一步包含呈溶液形式的相同的第二引物群体。在这些实例中，模板核酸分子通常包含在第一末端处或其附近的第一引物的引物结合位点和在其它末端处或其附近的第二引物的引物结合位点。
在另一方面中，模板化反应混合物包含预植入的固体载体群体、核苷酸、重组酶和聚合酶，其中所述预植入的固体载体群体具有每个载体上的一个模板核酸分子或介于10与50,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子，其中所述模板核酸分子包含与其连接的第一引物，并且所述预植入的固体载体进一步包含所连接的未与模板核酸分子结合的第一引物，其中所述反应混合物不包含能够开始重组酶-聚合酶扩增反应的阳离子，并且其中所述反应混合物中至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％的模板核酸分子与一种或多种固体载体连接。
在一些实施例中，使用预植入反应混合物，在预植入反应期间形成一种或多种预植入的载体。在一些实施例中，预植入反应混合物包含以下中的一些或全部：模板核酸分子群体、一种或多种载体、聚合酶、第一引物群体、核苷酸和二价阳离子。在一些实施例中，预植入反应混合物包含一种或多种模板核酸分子、一种或多种载体和第一引物群体。在一些实施例中，第一引物群体与一种或多种载体连接。在一些实施例中，预植入反应混合物包含一个或多个、多个或一群体模板核酸分子，例如单链模板核酸，和一个或多个或多个具有多个第一引物的载体与其相连，其中模板核酸分子含有与第一引物互补的核苷酸序列，并且预植入反应混合物任选地包含聚合酶和核苷酸。在本发明传授内容中的任一实施例，预植入反应混合物进一步包含第二引物和任选地扩散限制性药剂。在说明性实施例中，第二引物在溶液中。在一些实施例中，预植入反应混合物包含重组酶和任选地重组酶辅助蛋白。
在一些实施例中，通过采用核酸扩增，使用以下来进行预植入和/或模板化反应：(i)多个核酸分子，其包含靶序列和一种或多种通用衔接子序列；(ii)多个可溶性正向引物；(iii)多个可溶性反向封端的带尾引物；和(iv)其上固定有捕获引物的多个固体载体，所述捕获引物与通用衔接子序列杂交。在一些实施例中，在具有含相同或不同靶序列的多个核酸分子的单一反应混合物中，进行预植入和/或模板化反应。在一些实施例中，从样品产生的个别核酸分子包含在末端处与至少一个通用衔接子序列(例如A-衔接子和/或P1-衔接子序列)接合的靶序列。在一些实施例中，核酸分子是具有互补上下链的双链分子。在一些实施例中，使用与衔接子序列杂交的正向和反向可溶性引物，进行预植入反应，以扩增核酸分子并且将核酸分子的基本上单克隆拷贝与固体载体连接(参见例如，图4)。尽管图4描绘单一反应混合物内的单一双链核酸分子和单一珠粒的一系列反应，但所属领域的技术人员应了解，相同单一反应混合物含有进行同一系列反应的多个双链核酸分子和多个珠粒，以产生各自与靶序列的基本上单克隆群体连接的至少两种珠粒。另外地，所属领域的技术人员应了解，珠粒可连接多个B捕获引物。进一步，图4的下侧描绘与B捕获引物结合的生物素标记的引物延伸产物，但所属领域的技术人员应了解，非生物素标记的引物延伸产物可结合B捕获引物。所属领域的技术人员也应了解，生物素标记和非生物素标记的引物延伸产物的混合物可与和珠粒连接的多个B捕获引物连接。在一些实施例中，单一反应混合物含有多个核酸分子，其中具有相同或不同靶序列的个别核酸分子与至少一个通用衔接子序列连接。现参考图4，使具有上下链的核酸分子变性，并且在使用可溶性引物(例如，可溶性A引物)和可溶性封端的带尾引物(例如，可溶性封端的带尾P1/B引物)的引物延伸反应中，使用分开的上下链，以在预植入和/或模板化反应期间，产生具有可以结合所固定的B引物的衔接子序列的多个引物延伸产物。如图4中所示，归因于上下链的不同序列和取向与所使用引物的差异，引物延伸反应产生两条链的不同产物。
在一些实施例中，在第一引物延伸反应中，使用结合A引物结合位点的可溶性引物，产生下链的互补链。出于说明的目的，在图4(左侧)中，可溶性A′引物与A衔接子序列互补。在一些实施例中，使用具有变化长度的可溶性A′引物的混合物来进行第一引物延伸反应。可溶性A′引物的混合物的其5′端、3′端或5′和3′端两个处的长度可变化。例如，引物混合物S(具有或不具有5′生物素加合物(在图4中描述为“Bio”)的A′引物的混合物，所述A′引物可包含各种长度的5′非互补序列的，且可用于引物延伸反应中，以视使用哪种可溶性A′引物来进行第一引物延伸反应而定，产生若干可能的第一延伸产物中的一个(图4左侧)。例如，在5′到3′方向上，第一延伸产物含有互补A-衔接子序列(在图4左侧中显示为A′)、互补下序列(在图4左侧中显示为下′(bottom′))和互补P1序列(在图4左侧中显示为P1′)。在一些实施例中，在第二引物延伸反应中，第一延伸产物中的新合成的P1′序列可与可溶性P1引物结合，以允许从第一引物延伸产物的P1′序列的3′端进行引物延伸。可溶性P1引物可以是带尾引物。可溶性P1引物可在其3′端处携带封端部分，其中所述封端部分可抑制从引物的3′端进行引物延伸。可溶性P1引物可以是反向带尾P1引物，其包含所连接的5′B衔接子序列，使得使用带尾引物P1作为模板，第一延伸产物的引物延伸引起向3′端添加B序列的互补序列(在图4左侧中描述为B′)。在说明性实施例中，可溶性P1引物可具有3′封端端(在图4左侧中，显示为带圈的“X”)，以防止从可溶性P1引物的3′端延伸(图4左侧)。视在第一延伸反应中使用哪种可溶性A′引物而定，第二引物延伸反应可产生具有各种长度的多个第二延伸产物。在5′到3′方向上，多个第二延伸产物含有互补A-衔接子序列(在图4左侧中显示为A′)、互补下链序列(在图4左侧中显示为下′)、互补P1序列(在图4左侧中显示为P1′)和互补B衔接子序列(在图4左侧中显示为B′)。第二引物延伸产物可包含或缺乏5′生物素加合物(图4左侧)。第二延伸反应可产生多个第二延伸产物，所述多个第二延伸产物具有不同长度，且可包含或缺乏生物素加合物，且包含B′衔接子序列。这些第二延伸产物中的任一个可与固定于固体表面(珠粒)的B捕获序列结合/杂交。所固定的B引物可以进行第三引物延伸反应，由此产生固定于珠粒且与第二延伸产物互补的第三延伸产物(图4下侧)。
现参考图4(右侧)，其描绘双链核酸进行变性和上链的一系列反应。在一些实施例中，上链的P1′衔接子序列可以结合可溶性P1引物，且进行第一引物延伸反应，以产生第一延伸产物(图4右侧)。在一些实施例中，可溶性P1引物是带尾引物。可溶性P1引物可以在其3′端处携带封端部分，其中所述封端部分可抑制从引物的3′端进行引物延伸(图4右侧)。可溶性P1引物可以是带尾P1引物，其包含所连接的5′B衔接子序列，使得使用带尾引物P1作为模板，引物延伸引起向第一延伸产物的3′端添加B序列的互补序列(B′)(图4右侧)。在说明性实施例中，可溶性P1引物可以具有3′封端端(在图4右侧中，显示为带圈的“X”)，以防止从P1引物的3′端延伸(图4右侧)。第一引物延伸反应产生多个第一延伸产物，所述多个第一延伸产物在5′到3′方向上含有A′衔接子序列、上链序列、P1′衔接子序列和B′衔接子序列(图4右侧)。包含B′衔接子序列的第一延伸产物可与固定于固体表面(珠粒)的B捕获序列结合/杂交。所固定的B引物可进行第二引物延伸反应，由此产生固定于珠粒且与第一延伸产物互补的第二延伸产物(图4下侧)。
在一些实施例中，可如图5所图示进行预植入(或植入)反应。在这个实例中，在具有捕获引物的珠粒载体存在下，扩增靶多核苷酸B-A'和其互补序列模板多核苷酸(A-B')。靶多核苷酸具有与和珠粒载体偶联的捕获引物的序列相同或大体类似的捕获部分(B)。基本上类似序列是其互补序列可与基本上类似序列中的每一个杂交的序列。珠粒载体可具有与靶多核苷酸的B部分的序列相同的序列或大体类似的序列的捕获引物，以准许靶多核苷酸的捕获部分(B)的互补序列与和珠粒载体连接的捕获引物杂交。任选地，靶多核苷酸可包含与靶多核苷酸的捕获部分(B)相邻的第二引物位置(P1)，且可进一步包含与引物相邻且通过互补序列部分(A')与靶多核苷酸的测序引物部分(A)结合的靶区域。当在包含捕获引物的珠粒载体存在下扩增时，与靶多核苷酸互补的模板多核苷酸可与捕获引物(B)杂交。靶多核苷酸可残留于溶液中。系统可进行延伸，其中使与模板多核苷酸互补的捕获引物B延伸，得到与珠粒载体结合的靶序列。在具有捕获引物的载体存在下，可以在此阶段进行一次或多次另外的扩增。可在游离引物(B)、珠粒载体和具有与其连接的连接子部分(L)的游离修饰的测序引物(A)存在下，进行一种或多种另外扩增。引物(B)和修饰的引物(L-A)可干扰游离浮动靶多核苷酸和模板多核苷酸，妨碍其与珠粒载体结合和彼此结合。具体地，具有与其连接的连接子部分的修饰的测序引物(A)可与和珠粒载体连接的靶多核苷酸的互补部分(A')杂交。任选地，可使与靶多核苷酸杂交的连接子修饰的测序引物L-A延伸，形成连接子修饰的模板多核苷酸。此类连接子修饰的模板多核苷酸与和珠粒载体连接的靶核酸杂交，所述靶核酸随后可由磁珠捕获且用于测序装置的磁性负载。可使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；PCR)扩增、重组酶聚合酶扩增(RPA)或其它扩增技术，进行扩增或延伸。在特定实例中，使用PCR扩增进行图5中图示的方案的每一步骤。
在一些实施例中，可以如图6中所展示进行预植入(或植入)反应。在这个实例中，替代方案包含靶多核苷酸(P1-A')和其互补序列模板多核苷酸(A-P1')。在包含连接子修饰的测序引物(L-A)和具有含捕获引物(B)的序列的部分的截短的P1引物(trP1)的溶液中，扩增靶多核苷酸和模板多核苷酸。在实例中，截短的P1引物(trP1)包含P1序列的子集或所有序列P1。随后在连接子修饰的测序引物(L-A)和截短的P1引物(trP1-B)存在下扩增期间，单一物种702包含可操作以与具有捕获引物(B)的珠粒载体杂交的连接子修饰的模板多核苷酸(L-A-B')。因此，连接子修饰的模板多核苷酸(L-A-B')与珠粒上的捕获引物(B)杂交，且延伸以形成与珠粒载体连接的靶多核苷酸(B-A')。可使用与连接珠粒的靶多核苷酸杂交的连接子修饰的模板多核苷酸来与磁珠连接，其例如可用于实施将珠粒磁性负载到测序装置中和/或用于富集与珠粒连接的核酸。连接子修饰的模板多核苷酸的连接子部分可采用各种形式，如生物素，其可与和磁珠连接的连接子部分结合，如抗生蛋白链菌素。可以使用PCR、RPA或其它扩增技术，来进行扩增反应中的每一个。在图6中展示的实例中，可以使用三个聚合酶链式反应(PCR)循环来实施例。这系列的PCR反应产生较高百分比的具有与其连接的单一靶多核苷酸的珠粒载体。因此，可以在测序装置中的孔中产生更多单克隆群体。
在一些实施例中，可以如图7中所展示进行预植入(或植入)方法。在此实例中，所述方法被设计成从一系列扩增循环产生期望的载体连接的核酸分子，其中所述扩增产物中的仅一种扩增产物(其是期望的靶核酸)将与载体连接。期望的靶标含有与核酸的5'端连接的连接子部分，例如生物素(在图7中，用字母“L”标记)；和在3'端处与固定于载体上的引物(在图7中，用字母“B”标记)互补的衔接子核苷酸序列(在图7中，用字母“B'”标记)。相比之下，图6所示的方法产生与载体杂交的两种核酸扩增产物，所述核酸扩增产物中的仅一种核酸扩增产物具有期望的连接子部分。在产生仅一种将与载体连接的扩增产物方面，图7中描绘的方法避免产生不含有期望的靶核酸(例如将不用于下游分析的缺乏连接子部分的核酸)的载体。因此，这种方法避免浪费载体和核酸，并且确保仅单个核酸靶分子将与载体杂交，所述载体是维持高水平单克隆，随后使用具有仅一个与其结合的核酸模板的载体进行模板化扩增所期望的。如图7中所展示的，双链文库核酸含有在每个端处的不同衔接子序列，示出为在5'端处的A衔接子序列和在3'端处的P1衔接子序列(例如，标准Ion Torrent A和P1文库衔接子；赛默飞世尔科技公司)。为开始植入过程，文库核酸在引物存在下进行一个循环扩增(即变性、引物退火和引物延伸)，如图7所示。用于扩增的示例性引物是生物素化引物A(正向引物)和反向融合引物。融合引物(例如，图7中标记为trP1的引物)是与靶核酸3'端的衔接子序列的一部分互补的序列和与固定在载体上的B引物的序列相同的B引物序列的融合物。在图7所示的实例中，trP1是具有SEQ ID NO:1的序列的Ion P1衔接子的23聚体片段。融合引物将在接近于文库插入序列的文库核酸分子的3'衔接子序列的内部部分处杂交和引发，并且不在文库核酸的极限3'端处与衔接子序列的其余部分杂交。这在融合引物序列与文库核酸上的衔接子的极限3'端部分之间形成错配端。如图7中所示，在两个扩增(例如PCR)循环之后，尽管产生四个扩增产物，但仅一个产物将能够植入(或杂交)载体(例如，离子球形颗粒)。因此，在扩增产物的随后变性后，所述产物中的仅一种产物的单链将与载体上的B引物杂交。这个引物可以延伸，以形成双链模板核酸，其中一条链含有可以例如用于将载体结合的核酸与用于孔的富集和/或磁性负载的磁珠结合的连接子部分。尽管图7描绘单一反应混合物内的单一双链核酸分子和单一载体的一系列反应，但所属领域的技术人员应了解，相同单一反应混合物含有进行同一系列反应的多个双链核酸分子和多个载体，以产生各自与靶模板核酸连接的至少两种载体。
在一些实施例中，预植入(或植入)方法基本上如图5-7中所展示执行，其中在所述方法中添加一个或多个扩增(例如，PCR)循环。因此，在采用多个扩增循环(例如，PCR)的任何此类预植入方法中，预植入方法中可以包含两个或更多个，例如3、4、5个或更多个扩增循环。例如，在最大可能的核酸文库输入低于最佳范围的情况下，植入过程中可包含另外的扩增循环以产生足够量的模板植入载体，其可用于另外的方法，包含，例如，模板化扩增以产生基本上单克隆核酸模板群体和下游测序过程。此类情况可以包含，例如，由文库制备方法导致的低于预期的文库浓度。虽然在这种情况下，可以通过扩大植入反应将文库模板拷贝数增加到更优化的水平，以适应更大的文库输入量，但由于反应容器或处理中的体积限制，这有时不是可用的选择。在预植入方法中的任何点，例如在将具有连接到其上的寡核苷酸引物的载体引入扩增方案之前和/或之后，可以包含增加数量的扩增循环。例如，参考图7中描述的方法，如果在将载体引入反应混合物的点之前包含另外的扩增循环，则总共四种扩增产物将产生核酸链这将与载体上的B引物杂交，相比之下，只有一种产物会产生一条链，如所示的方案中没有添加另一个扩增循环。此外，四个产物链中的每一个将包含连接到核酸的5'端的连接子部分。因此，在添加的扩增循环之后，当将固定有B引物的载体添加到反应混合物中时，变性、引物杂交和引物延伸的下一个扩增循环将导致所有四个扩增产物链都包含与载体上的B引物互补的与载体杂交并被延伸的序列，由此与一个载体相比植入了四个载体。如果在图7所示的最后一个扩增循环之后包含一个另外的扩增循环，其中已将连接有B引物的载体添加到反应混合物中，则总共有四种扩增产物将产生一条核酸链，与载体上的B引物杂交，相比之下，只有一个产物产生一条链，如所示的方案中杂交，而没有添加另一个扩增循环。此外，四个产物链中的每一个将包含连接到核酸的5'端的连接子部分。因此，在添加的扩增循环之后，假设将足够数量的具有与其固定的B引物的载体添加到反应混合物中，与如果不包含另外的扩增的一个植入的载体相比，总共四个载体将植入有核酸模板。因此，通过在诸如这些的预植入方法中增加扩增循环的数量，从相同数量的输入文库核酸分子获得更多数量的植入载体。
在一些实施例中，在进行预植入(植入)和/或模板化反应之后，在其表面具有结合或连接至靶模板核酸上的连接子(例如，生物素)的部分的珠粒用于直接捕获并富集植入的靶核酸。例如，在一些实施例中，使用可溶性封闭的带尾P1/B引物(例如，如图4中描绘的)或生物素化引物A(例如，如图7中描绘的)在植入反应中产生的携带生物素加合物的靶模板核酸，与固定在载体上的引物杂交，然后延伸形成与载体结合的双链靶模板分子。然后将植入的载体与链霉亲和素包被的珠粒接触，例如磁珠，其通过生物素加合物结合靶核酸以形成珠粒组合件(见图11)，由此捕获植入的载体。然后可以将珠组合件与任何其它反应组分分离，例如，通过用磁铁将珠粒组合件造粒。随后将链霉亲和素包被的珠粒从靶模板核酸上分离(例如，通过使结合到固体载体的双链靶标变性)并从分离的珠粒上去除结合到固体载体上的靶模板核酸产生丰富的单链模板结合固体载体集合。捕获过程中可以包含过量的链霉亲和素包被的磁珠，以确保捕获所有模板核酸植入的载体。任何携带连接子(例如，生物素)但未与载体结合的植入的扩增反应产物可以被磁珠捕获并与植入的载体一起从其洗脱，在进一步的下游加工中(例如，在负载植入的载体进入反应位点，例如表面上的微孔，例如芯片，用于对结合到固体载体的模板进行测序，如本文所描述的。
在一些实施例中，可以如图12中所展示进行预植入(或植入)方法。在此实例中，所述方法被设计成从靶核酸的一系列扩增循环产生期望的固体载体连接的核酸分子，其中所述扩增产物中的仅一种扩增产物(其是期望的靶核酸)将与载体连接。期望的靶标含有被在核酸的5'端处的被称为“手柄”部分的单链核苷酸序列和在3'端处的与固定在载体上的引物(在图12中用字母B标记)互补的衔接子核苷酸序列(在图12中用字母B'标记)。如图12中所示，双链文库靶核酸含有在每个端处的衔接子序列，例如在5'端处的A衔接子序列和在3'端处的P1衔接子序列(标准Ion Torrent A和P1文库衔接子；赛默飞世尔科技公司)。在某些情况下，如图12所示，输入文库可能已经在A衔接子上具有手柄配置。如果输入文库在A衔接子上没有手柄配置，则可以将其添加在文库的扩增反应中，所述扩增反应包含引物，所述引物在5'到3'方向上含有手柄核苷酸序列、不可复制的部分(例如，聚合酶终止位点)和A衔接子序列。为了开始预植入扩增反应，文库在引物存在下进行一个扩增循环(即，变性、引物退火和引物延伸)，如图12所示。用于扩增的示例性引物是引物A(正向引物)，其在其5'端处具有聚合酶终止位点和定位于不可复制部分的5'的手柄序列，以及反向融合引物。含有手柄的引物的不可复制部分可以是聚合酶不能复制的任何组合物。此类不可复制部分包含例如不能支持聚合酶进行的基于模板的核苷酸聚合的任何部分。例如，不可复制部分可以包含非核苷酸部分(例如，PEG或其它基于碳的间隔基、氨基酸或不被用于进行引物延伸的聚合酶识别的核苷酸类似物)。当含有手柄的引物用于聚合酶的模板依赖性核酸合成时，聚合酶不能将合成的核酸链延伸超过不可复制部分。这通常导致核酸合成的停止或终止，并且不可复制部分充当聚合酶终止位点。融合引物(例如，图12中标记为trP1的引物)是与在靶核酸的3'端处的衔接子序列的一部分互补的序列和与固定在固体载体上的引物相同的B引物的融合物。在图12所示的实例中，trP1是具有SEQ ID NO:1的序列的Ion P1衔接子的23聚体片段。融合引物将在接近于文库插入序列的文库核酸分子的3'衔接子序列的内部部分处杂交和引发，并且不在文库核酸的极限3'端处与衔接子序列的其余部分杂交。这在融合引物序列与文库核酸上的衔接子的极限3'端部分之间形成错配端。如图12中所示，在两个扩增(例如，PCR)循环之后，尽管产生四个扩增产物，但仅一个产物将能够植入(或杂交)载体(例如，离子球形颗粒)。因此，在扩增产物的随后变性后，所述产物中的仅一种产物的单链将与载体上的B引物杂交。这个引物可以延伸，以形成双链模板核酸，其中一条链含有可以例如用于将载体结合的核酸与用于孔的富集和/或磁性负载的磁珠结合的手柄。
在图12中描绘的预植入(或植入)方法的一些实施例中，含有手柄序列的引物在3'到5'方向包含与第一双链衔接子在文库DNA扩增子的一端上的序列互补的第一核苷酸序列、聚合酶终止位点以及与第一核苷酸序列至少部分互补或完全互补的第二核苷酸序列(手柄序列)。手柄序列可以例如与第一核苷酸序列的一部分互补，但在所述部分内含有一个或多个错配碱基，所述错配碱基不与第一核苷酸序列的所述部分的对应位置中的碱基互补。在某些许可条件下，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列将彼此杂交形成发夹结构。然而，在植入过程中发生的扩增反应的条件下，例如在图12中描述的方法中，含有手柄的引物的核苷酸的第一和第二序列将不杂交。相反，在此类非许可条件下，引物的第一核苷酸序列与文库扩增子的互补衔接子序列(例如，A衔接子)的杂交将是有利的并且发生，并且手柄序列将在聚合酶终止部分的位点从A衔接子和引物的第一核苷酸序列的双链体延伸，作为在植入扩增反应中未复制的单链部分。含有手柄的引物的第一苷酸序列和第二核苷酸序列可以杂交的许可条件可以包含例如相对低的温度，例如低于进行植入扩增反应的温度或低于标准PCR操作温度。低温包含基本上或显著低于A衔接子的双链体双链核酸和引物的第一核苷酸序列的Tm的温度。在一些实施例中，含有手柄的引物的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的双链体核酸的Tm基本上或显著小于A衔接子和引物的第一核苷酸序列的双链体核酸的Tm。例如，在含有手柄的引物的第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间形成的杂交体的Tm可以小于约50℃、45℃、40℃、35℃、30℃、25℃，20℃或更低。允许条件的另一个实例是相对高的盐浓度，例如0.25M、0.3M、0.4M、0.5M、0.75M、1M或更高的NaCl浓度。非许可条件可以包含，例如，更高的温度(例如，温度显著高于在含有手柄的引物的第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间形成的杂交体的Tm)和/或低水平或不存在盐水平(例如，NaCl浓度为0.2M、0.1M、0.05M、0.001M或更低)。
在一些实施例中，在进行如图12所示的植入(或预植入)方法之后，植入的载体通过与其它反应组分的分离而富集。在一种富集方法中，植入的载体通过连接到载体上双链靶模板手柄的连接子部分(例如，生物素)间接捕获。具有继而结合或连接于与靶模板核酸相连的连接子的部分(例如，链霉亲和素)的珠粒可用于富集植入的载体。例如，如图13所描绘的，与载体结合的模板靶核酸上的手柄序列互补并与连接子部分(例如，生物素加合物)连接的寡核苷酸(即，“捕获”寡核苷酸)与植入的载体和具有链霉亲和素包被的表面的珠粒(例如，磁珠)接触。这导致通过形成珠粒组合件间接捕获与载体结合的双链靶模板核酸。在磁珠的情况下，组合件可以在磁体上沉淀，并去除含有任何其它反应组分的上清液。在一些实施例中，捕获过程在其中与含有游离手柄的引物至少部分互补的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列将杂交的条件下进行，例如允许条件。在此类条件下，存在的含有游离手柄的引物将呈发夹构型，其不会与捕获寡核苷酸杂交。因此，含有游离手柄的引物不会被链霉亲和素包被的磁珠捕获。
图13所示的将与载体结合的模板核酸与磁珠连接的过程称为间接捕获方法，而图11中描述的将与载体结合的模板核酸与磁珠连接的过程称为间接捕获方法被称为直接捕获方法。如图11所示，链霉亲和素包被的磁珠与生物素连接子部分结合，所述部分直接连接到靶模板双链体的链上，所述链与一条链杂交，所述链是固定在载体上的延伸引物。相比之下，在图13所示的间接捕获方法中，链霉亲和素包被的磁珠与生物素化的捕获寡核苷酸结合，所述寡核苷酸不是载体结合的靶模板双链体的链，而是与延伸的单链手柄杂交。从双工。因此，在直接和间接捕获方法中通过磁珠捕获植入的载体后形成的珠粒组合件是不同的。在某些情况下，珠粒组合件的差异可能会影响载体结合的靶模板双链体的杂交链之间的关联。例如，通过磁珠的移动施加在直接连接到磁珠的模板链上的力有时可能与通过植入载体的移动施加在双链体链上的力相对。与其中磁珠通过捕获寡核苷酸间接连接到模板双链体的模板双链体相比，这种力对相关模板双链体链的影响可能更大。效果的程度可能受一种或多种因素的影响，例如模板杂交体的长度、培养基的盐浓度、温度以及在捕获和富集期间珠粒组合件的混合、转移等的量。随着这种力对载体结合的靶模板双链体的影响增加，模板双链体解离的可能性也会增加。在富集过程中靶模板双链体的解离可能导致富集植入的载体产量的降低和/或更长的模板双链体被富集的百分比增加。然而，捕获寡核苷酸和在间接捕获方法中形成的珠粒组合件的模板双链体之一的手柄部分之间的短杂交可能比模板双链体更容易和更快地解离，由此释放磁珠并消除磁珠强制模板双工。此外，捕获寡核苷酸的短核酸序列和模板双链的手柄部分可能比已分离的较长模板双链更容易结合，这可以减轻富集植入的载体产量的任何潜在降低。因此，可以选择捕获方法和捕获条件以匹配所需的植入的模板双链长度和植入的载体产量。通常，为了在使用直接捕获方法时优化植入载体的产量，使用更温和的条件(例如缓慢移液和温和混合)处理由此类方法产生的珠粒组合件，而不是剧烈条件(例如涡旋)。当使用间接捕获方法产生珠粒组合件时，植入的载体产量通常不会受到更剧烈地处理珠粒组合件的不利影响。
然后，通过在其中与植入的载体结合的双链靶模板核酸不会变性的条件下使捕获寡核苷酸与靶模板上的手柄序列之间的相对较小的杂交区域变性，从与磁珠结合的捕获寡核苷酸中洗脱所捕获的植入的载体。例如，可以通过利用由手柄序列和捕获寡核苷酸形成的短杂交体的解链温度(Tm)的差异(例如，在高盐缓冲液中的Tm为约32℃)和双-与载体结合的链靶模板核酸(例如，Tm大于32℃)。例如，在一些实施例中，任何适度的变性条件，例如增加的温度(例如，温和加热至大于35℃，如42℃持续约5分钟)、较低的盐浓度(例如，低TE、添加水)和/或物理干扰或搅动(例如，涡旋、移液)可以用于解离捕获寡核苷酸-手柄序列杂交体而不破坏双链载体结合的靶模板核酸。与捕获寡核苷酸结合的磁珠被丢弃，留下富集的双链靶模板与植入的载体结合。在其中含有手柄的引物的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列不互补并且在植入过程中使用的任何条件下不杂交以形成发夹结构的实施例中，过量的捕获寡核苷酸和过量的链霉亲和素包被的磁珠可以包含在捕获过程中以确保捕获所有模板核酸植入的载体。在进一步的下游处理中(例如，在将植入的载体负载到反应位点，如表面上的微孔，例如芯片中，用于对与固体载体结合的模板进行测序)，可以将任何含有手柄的引物和未与载体结合的可以被磁珠捕获并与植入的载体一起从其洗脱植入扩增反应产物与植入的载体分开，如本文所描述的。
与图11中描述的富集方法相比，在变性以去除磁珠后产生结合到载体的单链模板，图13中描述的富集方法产生与变形后的载体结合的双链模板以去除磁珠。在一些实施例中，将双链模板连接到载体上有助于检测可能在植入过程中发生的误差，排除对含有误差的模板植入的载体的任何下游分析结果的考虑，由此减少误差例如，在多个植入的模板群体的测序的总体结果中。例如，在某些情况下，在产生与载体结合的双链靶模板时固定在载体上的引物的模板依赖性延伸期间可能发生聚合误差。如果发生这种类型的误差，并且后续捕获和富集植入的载体只会产生单链植入的模板，如图11所描述的，唯一可用于下游过程的模板序列(例如在模板化扩增和测序中)将含有误差。在此情况下，从植入的载体扩增的模板将是含有误差的单克隆序列群体，并且模板的测序将产生相同的读段。相反，如果双链植入的模板由间接捕获和富集产生，如图13所示，则两条链，即，一条是具有误差的延伸固定引物，另一条是与没有误差的所固定的引物可用于进一步处理和分析。这有效地将模板误差从100％(在只有单链植入的模板的情况下)稀释到约50％(即，植入误差率降低了约50％)。因为从这种双链植入的载体扩增的模板将产生多克隆序列群体(即，某些序列(约50％)有误差，而某些序列(约50％)没有误差)，误差可以是在下游分析中检测到，例如测序。在分析多个核酸模板群体的序列结果时，可以排除来自所述多克隆群体测序的序列读段。因此，如果绑定到正在测序的其它载体的模板中没有其它误差，则其余模板的测序误差率实际上为0％。
在一些实施例中，根据本文提供的任何预植入和/或模板化方法(包含例如，图4-7和12中描绘的一系列反应)产生的连接于载体(富集或未富集)的靶核酸被测序，例如在大规模平行测序反应中。在一些实施例中，将与靶核酸分子连接的载体(已富集或未富集)置于耦接到场效应晶体管(FET)或离子敏感性场效应传感器(ISFE)的反应室阵列上，并且对靶核酸分子进行测序。
在一些实施例中，模板核酸分子是来源于来自天然或非天然来源的样品。在一些实施例中，样品中的核酸分子是来源于活生物体或细胞。可使用任何核酸分子，例如样品可包含覆盖来自活生物体或细胞的部分或全部基因组、mRNA或miRNA的基因组DNA。在其它实施例中，模板核酸分子是合成或重组的。在一些实施例中，样品含有具有基本上相同序列或具有不同序列的混合物的核酸分子。通常使用在活细胞内产生且由活细胞产生的核酸分子来进行说明性实施例。此类核酸分子通常是直接从天然来源，如细胞或体液分离，无需任何活体外扩增。因此，样品核酸分子直接用于后续步骤中。在一些实施例中，样品中的核酸分子可包含具有不同序列的两种或更多种核酸分子。
从样品制备模板核酸分子的各种方法是所属领域中已知的，并且可以用于预植入和/或模板化方法、以及系统、组合物、试剂盒和/或设备的任一方面中。在一些实施例中，核酸分子呈片段或未片段化形式存在于样品中。在任一个所公开的实施例中，样品中的核酸分子是片段化的，或在用于预植入反应之前进一步片段化以产生具有任何选择长度的核酸分子。所属领域的技术人员将辨识用于进行此类片段化来获得在所选择长度范围内的片段的方法。例如，可使用以下方法将核酸分子片段化：物理方法，如超声处理；酶促方法，如通过DNA酶I或限制性核酸内切酶消化；或化学方法，如在二价金属阳离子存在下加热。在一些实施例中，将样品中的核酸分子片段化，以产生具有任何选择长度的核酸分子。所属领域的技术人员将辨识用于进行此类片段化来实现一系列选择长度的方法。在其它实施例中，使用在所属领域中已知的方法，选择在范围选择长度内的核酸片段。在一些方面中，使用在所属领域中已知的方法，选择特定大小范围的核酸分子或核酸片段。在一些实施例中，核酸分子或片段的长度在约2与10,000个核苷酸之间，例如长度在约2与5,000个核苷酸之间、在约2与3,000个核苷酸之间或在约2与2,000个核苷酸之间。
在一些实施例中，本公开总体上涉及方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，来自样品的核酸分子用作高通量测序工作流程的一部分，如以便产生模板核酸分子文库。在一些实施例中，使用本发明传授内容中的任一种扩增方法扩增的不同模板核酸分子的群体，包含在一个或两个末端具有核酸衔接子序列的模板核酸分子的文库。例如，文库中的模板核酸分子可包含第一和第二末端，其中第一末端与第一核酸衔接子接合。文库中的模板核酸分子还可包含与第二核酸衔接子接合的第二末端。可将第一和第二核酸衔接子接合或以其它方式引入到模板核酸分子中。可以将衔接子接合或以其它方式引入到直链模板的末端或直链或环状模板核酸分子的主体内。任选地，模板核酸分子可在接合或引入衔接子之后环化。在一些实施例中，将第一衔接子接合或引入到直链模板的第一末端，且将第二衔接子接合或引入到模板的第二末端。第一和第二衔接子可以具有相同或不同序列。第一和第二衔接子可具有相同或不同的引物结合序列。在一些实施例中，第一或第二核酸衔接子的至少一部分(即，如文库中的模板核酸分子的一部分)可以与第一引物杂交，所述第一引物是通用引物。
核酸分子可具有在进一步文库制备之前可修复的5′和/或3′突出端。在说明性实施例中，使用在所属领域中已知的方法，修复具有5′和3′突出端的模板核酸分子，以产生平端样品核酸分子。例如，在适当缓冲液中，Klenow大片段聚合酶的聚合酶和核酸外切酶活性可用于填补5′突出端且去除核酸分子上的3′突出端。在一些实施例中，使用多核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase；PNK)和所属领域的技术人员将理解的反应条件，在所修复的核酸分子的5′端添加磷酸。在其它说明性实施例中，向双链分子的一条链添加单个核苷酸或多个核苷酸，以产生“粘性末端”。例如，可在核酸分子的3′端上连接腺苷(A)(加A尾)。在一些实施例中，可使用除A突出端以外的其它粘性末端。在一些实施例中，添加其它衔接子，例如环形接合衔接子。在一些实施例中，在PCR步骤期间添加衔接子。在本发明传授内容的任一个实施例中，不进行、进行这些修饰的所有或任何组合。用于产生用于后续测序的模板核酸分子群体的许多试剂盒和方法是所属领域中已知的。此类试剂盒将通常进行修饰以包含为本发明传授内容的方法和组合物的扩增和测序步骤所定制的衔接子。也可使用可商购的试剂盒，如Agilent SureSelect试剂盒(安捷伦(Agilent))中存在的接合试剂盒，来进行衔接子接合。
在一些实施例中，扩增方法任选地包含在文库制备之前、期间或之后且在预植入反应之前的靶标富集步骤。可以例如通过多重核酸扩增或杂交来富集包含靶基因座或所关注区域的靶核酸分子。进行多重核酸扩增以产生扩增子的各种方法(如多重PCR)是所属领域中已知的，并且可以用于本发明传授内容的任一个实施例中。在向预植入反应混合物中添加模板核酸分子之前，可通过任何方法进行富集，随后进行通用扩增反应。本发明传授内容的任一实施例包含富集多个至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个靶核酸分子、靶基因座或所关注区域。在所公开的实施例中的任何实施例中，靶基因座或所关注区域是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1,000个核苷酸长，并且包含模板核酸分子的一部分或全部。在其它实施例中，靶基因座或所关注区域的长度在约1与10,000个核苷酸之间，例如长度在约2与5,000个核苷酸之间、在约2与3,000个核苷酸之间或在约2与2,000个核苷酸之间。在本发明传授内容的任一个实施例中，多重核酸扩增包含产生至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个各靶核酸分子、靶基因座或所关注区域的拷贝。在任一个所公开的实施例中，用于预植入的方法、以及相关组合物、系统、试剂盒和设备包含使用来自预植入反应中的多重核酸扩增的扩增子产生预植入的固体载体群体。
在一些实施例中，在文库制备和任选的富集步骤之后，将模板核酸分子文库模板化到一种或多种载体上。在一些实施例中，一种或多种载体在两个或更多个反应中模板化，预植入反应以产生预植入载体和使用一种或多种预植入载体扩增的一种或多种(例如，两个)模板化反应连接的模板核酸分子。在一些实施例中，预植入(或植入)反应包括模板核酸(例如单链模板核酸)与固定在载体上的引物寡核苷酸的杂交，所述载体与模板核酸中包含的序列互补。在一些实施例中，预植入(或植入)反应进一步包含在模板核酸与固定在载体上的引物杂交之前和/或同时对文库或样品核酸进行操作。此类操纵包含核酸扩增。如本文所用，核酸扩增是指通过核苷酸聚合合成核酸的新链的过程，并且涉及以下的一个或多个循环：将双链核酸分离，例如变性或解离成单链、引物与分离的双链核酸的单链的杂交以及杂交引物的延伸。在一些实施例中，预植入反应包含核酸扩增并且可以使用技术人员将理解的多种方法进行。例如，在一些实施例中，预植入反应可以在RPA反应、模板步移反应或PCR中进行。在RPA反应中，在引物和核苷酸存在下，使用重组酶、聚合酶和任选地重组酶辅助蛋白来扩增模板核酸分子。重组酶和任选地重组酶辅助蛋白可解离至少一部分的双链模板核酸分子，以使得引物杂交，随后聚合酶可结合以开始复制。在一些实施例中，重组酶辅助蛋白是防止解离的模板核酸分子再杂交的单链结合蛋白(single-stranded bindingprotein；SSB)。通常，在等温温度下进行RPA反应。在模板步移反应中，在允许至少一部分的双链模板核酸分子解离使得引物可杂交和聚合酶可随后结合以开始复制的反应条件中，在引物和核苷酸存在下，使用聚合酶来扩增模板核酸分子。在PCR中，通过热循环使双链模板核酸分子解离。冷却后，引物与互补序列结合并可以用于聚合酶的复制。在本文提供的实施例中的一些实施例中，在预植入反应混合物中进行预植入反应，所述预植入反应混合物是由扩增模板核酸分子所必需的组分形成。在所公开的方面中的任何方面中，预植入反应混合物包含以下中的一些或全部：模板核酸分子群体、聚合酶、具有所连接的第一引物群体的一种或多种载体(例如，固体载体)、核苷酸和辅因子(如二价阳离子)。在一些实施例中，预植入反应混合物进一步包含第二引物和任选地扩散限制性药剂。在一些实施例中，模板核酸分子群体包括与和第一或第二引物杂交的至少一个衔接子序列接合的模板核酸分子。在一些实施例中，如在乳化液RPA或乳化液PCR中，反应混合物形成乳化液。在通过RPA反应进行的预植入反应中，预植入反应混合物包含重组酶和任选地重组酶辅助蛋白。本文中进一步详细论述反应混合物的各种组分。
在一些实施例中，预植入反应混合物包含通常来源于文库制备或靶标富集的模板核酸分子群体。在一些实施例中，模板核酸分子或模板核酸分子群体是模板核酸分子文库的至少一些和通常所有成员。在一些实施例中，预植入反应混合物包含至少一种模板核酸分子。在一些实施例中，预植入反应混合物包含具有不同序列的至少两种模板核酸分子。在说明性实施例中，预植入反应混合物包含具有不同序列的模板核酸分子群体。在一些实施例中，预植入反应混合物包含基本上单克隆模板核酸分子群体。在本发明传授内容的任一个实施例中，当模板核酸分子在本文中可替代地提及时，模板核酸分子是多核苷酸，(模板核酸分子在本文中可互换地称为模板或核酸模板或多核苷酸模板)。在各个实施例中，模板核酸分子是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物的聚合物。在一些实施例中，多核苷酸是天然存在的、合成、重组、克隆、扩增、未扩增或存档(例如，保藏)形式。在一些实施例中，多核苷酸是DNA、cDNA、RNA或嵌合RNA/DNA和核酸类似物。
待扩增的模板核酸分子可以是双链，或在预植入反应之前使用适当程序使其是至少部分地双链的。在一些实施例中，模板是直链。可替代地，模板可以是环状，或包含直链和环状区域的组合。在一些实施例中，扩增包含形成部分变性或解离的模板或完全变性或解离的模板。例如，扩增可包含使双链模板核酸分子部分地变性。任选地，部分地变性包含使双链模板核酸分子经受部分地变性条件。在一些实施例中，部分变性的模板包含单链部分和双链部分。在一些实施例中，单链部分包含第一引物结合序列。在一些实施例中，单链部分包含第二引物结合序列。在一些实施例中，单链部分包含第一引物结合序列和第二引物结合序列。
任选地，双链模板核酸分子包含正向链。双链模板核酸分子可以进一步包含反向链。正向链任选地包含第一引物结合序列。反向链任选地包含第二引物结合序列。如上文所公开，通常在文库制备期间，连接引物结合序列。在一些实施例中，模板核酸分子已经包含第一引物结合序列和任选地第二引物结合序列。可替代地，模板核酸分子任选地最初不包含引物结合序列，且文库制备可任选地包含将引物结合序列连接或引入到模板，如上文所公开。
在一些实施例中，模板核酸分子包含单链或双链多核苷酸，或两个的混合物。在一些实施例中，模板核酸分子包含具有相同或不同核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施例中，模板核酸分子包含具有相同或不同长度的多核苷酸。在各个实施例中，预植入反应混合物包含在约2与1012个之间的不同模板核酸分子，例如在约2与1011个之间的不同模板核酸分子、在约2与1010个之间的不同模板核酸分子、在约2与109个之间的不同模板核酸分子、在约2与108个之间的不同模板核酸分子、在约2与107个之间的不同模板核酸分子、在约2与106个之间的不同模板核酸分子或在约2与500,000个之间的不同模板核酸分子。在任一个所公开的实施例中，预植入反应混合物或模板化反应混合物包含在5×106与1010个之间的载体，例如固体载体。例如，预植入反应混合物或模板化反应混合物可以包含在5×108与10×109之间的载体、在5×108与9×109之间的载体、在5×108与8×109之间的载体、在5×108与7×109之间的载体、在5×108与6×109之间的载体、在5×108与5×109之间的载体、在5×108与4×109之间的载体、在5×108与3×109之间的载体、在5×108与2×109之间的载体、在5×108与109之间的载体、在109与1010之间的载体、在109与9×109之间的载体、在109与8×109之间的载体、在109与7×109之间的载体、在109与6.5×109之间的载体、在109与6×109之间的载体、在109与5.5×109之间的载体、在109与5×109之间的载体、在109与4.5×109之间的载体或在109与4×109之间的载体。在另一个实例中，预植入反应混合物或模板化反应混合物可以包含至少约5×108个载体、至少约109个载体、至少约2×109个载体、至少约3×109个载体，至少约4×109个载体，至少约5×109个载体，至少约5.5×109个载体，至少约6×109个载体，至少约6.5×109个载体，至少约7×109个载体、至少约7.5×109个载体、至少约8×109个载体、至少约8.5×109个载体、至少约9×109个载体、至少约9.5×109个载体或至少约1010个载体。固体载体可具有50微米或更小的最小横截面长度(例如直径)，优选地10微米或更小、3微米或更小、大约1微米或更小、大约0.5微米或更小，例如大约0.1、0.2、0.3或0.4微米或更小(例如小于1纳米，约1-10纳米、约10-100纳米或约100-500纳米)。在本发明传授内容的任一个实施例中，预植入反应混合物和/或模板化反应混合物的体积是在约50与2,000μl之间，例如在约50与1,500μl之间、在约50与1,000μl之间、在约50与500μl之间、在约50与250μl之间或在约50与150μl之间。
进行预植入反应，以产生一种或多种预植入的载体。因此，在任一个所公开的方面中，预植入反应混合物可以包含在预植入反应中与模板核酸分子连接的一种或多种固体或半固体载体。如本文所用，固体或半固体载体还可以指具有可在下游测序方法中清楚地分析的连接位点的一种载体。在说明性实施例中，一种或多种载体包含所连接的基本上相同的第一引物群体。在一些实施例中，反应混合物中的至少一种模板核酸分子包含第一引物结合序列。第一引物结合序列可与第一引物的序列基本上相同或基本上互补。在一些实施例中，载体中的至少一种、一些或所有包含彼此基本上相同的第一引物群体。在一些实施例中，载体上的所有引物彼此基本上相同，或所有均包含基本上相同的第一引物序列。在一些实施例中，载体中的至少一个包含与其连接的两种或更多种不同引物。例如，至少一种载体可包含第一引物群体和第二引物群体。载体可与通用引物连接。通用引物与反应混合物内的所有或基本上所有模板核酸分子任选地杂交(或能够杂交)。反应混合物可包含与第一靶标特异性引物共价连接的第一载体和与第二靶标特异性引物共价连接的第二载体，其中第一和第二靶特异性引物彼此不同。任选地，第一靶标特异性引物与第一靶核酸序列基本上互补，且第二靶标特异性引物与第二靶核酸序列基本上互补，且其中第一和第二靶核酸序列不同。
在一些实施例中，预植入反应混合物中包含具有第一引物结合序列的两种或更多种不同模板核酸分子。在一些实施例中，将至少两种不同的模板核酸分子直接扩增到载体上，如包含多个位点的载体上的位点、珠粒或微粒、或阵列的反应室。可将模板核酸分子大批预植入于溶液中，且随后分配到固体载体上的孔阵列或反应位点中。在一些实施例中，孔或反应位点含有每个孔或反应位点的一个预先植入的载体。在一些实施例中，连接到已分布到孔或反应位点的预先植入的载体的模板核酸然后经历一个或多个模板化反应，其中模板在载体上被扩增以产生模板核酸的基本上单克隆群体。可替代地，可将固体载体分配到孔阵列中，可将模板核酸分子预植入在固体载体上同时将其原位保持在孔阵列中。在一些实施例中，已预先植入到孔或反应位点中的载体上的连接的模板核酸然后经历一种或多种模板化反应，其中模板在载体上被扩增以产生模板核酸的基本上单克隆群体。在一些实施例中，用于核酸扩增的方法包含一个或多个表面。
在一些实施例中，表面已连接第一引物群体，群体中的第一引物共享共有第一引物序列。在一些实施例中，表面已连接第一引物群体和第二引物群体，群体中的第一引物共享共有第一引物序列，且第二引物群体中的第二引物共享共有第二引物序列。在一些实施例中，已在表面上固定有第一引物群体。在其它实施例中，已在表面上固定有第一引物群体和第二引物群体。
载体或表面可涂覆有用于连接核酸分子(例如第一引物或第二引物)的丙烯酰胺、羧酸或胺化合物。在一些实施例中，将氨基修饰的核酸分子(例如引物)与涂覆有羧酸的载体连接。在一些实施例中，使氨基修饰的核酸分子与EDC(或EDAC)反应以与羧酸涂覆的表面(具有或不具有NHS)连接。可将第一引物与涂覆在表面上的丙烯酰胺化合物连接。颗粒可涂覆有抗生物素蛋白样化合物(例如抗生蛋白链菌素)以结合生物素标记的核酸。
在一些实施例中，反应混合物包含多个不同表面，例如预植入反应混合物包含一种或多种珠粒(如颗粒、纳米颗粒、微米颗粒和其类似物)，并且将至少两种不同的模板核酸分子扩增到不同珠粒上，由此形成至少两种不同的珠粒，其中的每一个与不同模板核酸分子连接。在一些实施例中，预植入反应混合物包含单个表面(例如平面样表面、流动池或反应室阵列)，并且将至少两种不同的模板核酸分子扩增到表面上的两个不同的区域、位点或位置上，由此形成与两种或更多种模板核酸分子连接单个表面。
在一些实施例中，固体载体的表面是多孔、半多孔或无孔的。在一些实施例中，表面是平面表面，以及凹面、凸面或其任何组合。在一些实施例中，表面是珠粒、颗粒、微粒、球体、过滤器、流动池、孔、凹槽、通道储集器、凝胶或毛细管的内壁。在一些实施例中，表面包含纹理(例如，蚀刻、形成空洞、孔、三维支架或凸块)。
在一些实施例中，固体载体的表面是磁性或顺磁珠(例如磁性或顺磁性纳米颗粒或微米颗粒)。在一些实施例中，顺磁性微米颗粒是与抗生蛋白链菌素连接的顺磁珠(例如，来自加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA)的DynabeadsTM M-270)。颗粒可以具有铁芯，或可以是水凝胶或琼脂糖(例如，SepharoseTM)。
在一些实施例中，表面包含珠粒的表面。在一些实施例中，珠粒是聚合物材料。例如，珠粒可以是凝胶、水凝胶或丙烯酰胺聚合物。珠粒可以是多孔的。颗粒可以具有空洞或孔，或可包含三维架构。在一些实施例中，颗粒是Ion SphereTM颗粒(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)。
通常，聚合物颗粒或珠粒载体可进行处理以包含生物分子，包含核苷、核苷酸、核酸(寡核苷酸和多核苷酸)、多肽、醣、多醣、脂质或其衍生物或类似物。例如，聚合物颗粒可与生物分子结合或连接。生物分子的末端或任何内部部分可与聚合物颗粒结合或连接。使用连接化学方法，聚合物颗粒可与生物分子结合或连接。连接化学方法包括共价或非共价键，包含离子键、氢键、亲和力键、偶极-偶极键、范德华键(van der Waals bond)和疏水性键。连接化学方法包含结合配偶体之间的亲和力，例如以下之间的亲和力：抗生物素蛋白部分与生物素部分；抗原表位与抗体或其免疫反应性片段；抗体与半抗原；地高辛部分(digoxigen moiety)与抗地高辛抗体；荧光素部分与抗荧光素抗体；操纵子与抑制子；核酸酶与核苷酸；凝集素与多醣；类固醇与类固醇结合蛋白；活性化合物与活性化合物受体；激素与激素受体；酶与底物；免疫球蛋白与蛋白A；或寡核苷酸或多核苷酸与其对应互补体。
具体地，固相载体，如珠粒载体，可包含多核苷酸的拷贝。在特定实例中，聚合物颗粒在测序技术期间可用作多核苷酸的载体。例如，此类亲水性颗粒可固定用于使用荧光测序技术测序的多核苷酸。在另一个实例中，亲水性颗粒可固定用于使用离子传感技术测序的多核苷酸的多个拷贝。可替代地，上文所描述的处理可提高聚合物基质与传感器阵列表面的粘合。聚合物基质可以捕获分析物，如用于测序的多核苷酸。
在一些实施例中，将一种或多种核酸模板固定到一种或多种载体上。可通过任何方法，包含但不限于物理吸附，通过离子或共价键形成或其组合，将模板核酸分子固定于载体上。固体载体可以包含聚合物、玻璃或金属材料。固体载体的实例包含膜、平面表面、微量滴定板、珠粒、过滤器、测试条、载玻片、盖玻片和管。固体载体意指在其上合成、连接、接合或以其它方式固定寡聚物的任何固相材料。载体可任选地包含“树脂”、“相”、“表面”和「载体」。载体可包括有机聚合物，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基和聚丙烯酰胺以及其共聚物和接枝物。载体也可是无机的，如玻璃、二氧化硅、受控孔玻璃(controlled-pore-glass；CPG)或反相二氧化硅。载体的构形可呈珠粒、球体、颗粒、颗粒、凝胶或表面形式。表面可以是平面、基本上平面或非平面的。载体可以是多孔或无孔的，且可具有溶胀或非溶胀特征。载体可塑形成包含一个或多个孔、凹陷或其它容器(container)、容器(vessel)、特征或位置。可以将一种或多种载体配置于阵列中的不同位置。载体任选地是可寻址(例如用于机械递送试剂)，或通过检测手段，包含利用激光照射扫描和共焦或偏光聚焦来寻址。可以将载体(例如珠粒)放置在另一载体内或上(例如第二载体的孔内)。在一些实施例中，载体是离子球形颗粒。
在一些实施例中，固体载体是“微粒”、“珠粒”、“微珠粒”等，(形状任选地但未必是球形)，其具有50微米或更小的最小横截面长度(例如直径)，优选地10微米或更小、3微米或更小、大约1微米或更小、大约0.5微米或更小，例如大约0.1、0.2、0.3或0.4微米或更小(例如小于1纳米、约1-10纳米、约10-100纳米或约100-500纳米)。微米颗粒(例如Dynabead，Dynal，挪威奥斯陆)可由各种无机或有机材料制成，所述无机或有机材料包含但不限于玻璃(例如受控孔玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化钛、乳胶、聚苯乙烯等。磁化可促进在扩增之后微粒连接的试剂(例如多核苷酸或连接酶)聚集和浓缩，且也可促进另外步骤(例如洗涤、试剂去除等)。在某些实施例中，使用具有不同形状尺寸和/或颜色的微米颗粒群体。微米颗粒可任选地例如用量子点进行编码，使得每一微粒或微米颗粒组可分别或独特地识别。
在一些实施例中，使珠粒表面功能化以用于连接第一引物群体。在一些实施例中，珠粒是可以放入反应室中的任何大小。例如，一个珠粒可以放入反应室中。在一些实施例中，多于一个珠粒放入反应室中。在一些实施例中，珠粒的最小截面长度(例如，直径)是约50微米或更小、或约10微米或更小、或约3微米或更小、大约1微米或更小、大约0.5微米或更小，例如大约0.1、0.2、0.3或0.4微米或更小(例如小于1纳米、约1-10纳米、约10-100纳米或约100-500纳米)。
在一些实施例中，在预植入反应之前，将两种或更多种不同模板核酸分子定位、放入或置于不同位点。在一些实施例中，将两种或更多种不同模板核酸分子预植入于溶液中，任选地单一预植入反应混合物内，且随后在此类扩增之后，将所得两种或更多种基本上单克隆的模板核酸分子群体定位、放入或置于不同位点。不同位点任选地是阵列位点的成员。阵列可以包含表面上(例如，流动池、电子装置、电晶体芯片、反应室、通道和其类似物的表面)的二维位点阵列、或基质或其它介质(例如，固体、半固体、液体、流体和其类似物)内的三维位点阵列。
在一些实施例中，用于将模板核酸分子预植入到一种或多种载体上的方法以及模板化反应，通常使用一种或多种能够进行聚合的酶。在本发明传授内容的任一个实施例中，能够进行聚合的一种或多种酶包含至少一种聚合酶。在一些实施例中，所述至少一种聚合酶包含热稳定或热不稳定的聚合酶。在一些实施例中，所述至少一种聚合酶包含DNA或RNA聚合酶的保持足够的催化活性以在任何适合条件下聚合或并入至少一种核苷酸的生物活性片段。在不同实施例中，所述至少一种聚合酶包含保持足够催化活性以在任何适合条件下进行核苷酸聚合的突变型DNA或RNA聚合酶。在不同实施例中，所述至少一种聚合酶包含保持足够催化活性以进行聚合的一种或多种氨基酸突变。聚合酶任选地可具有或缺乏核酸外切酶活性。在一些实施例中，聚合酶具有5′到3′核酸外切酶活性、3′到5′核酸外切酶活性或两个。任选地，聚合酶缺乏此类核酸外切酶活性中的任一个或多个。在一些实施例中，聚合酶具有链置换活性。适用的链置换聚合酶的实例包含噬菌体Ф29DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶。
在一些实施例中，聚合酶包含可催化核苷酸和/或核苷酸类似物的聚合的任何酶或其片段或亚基。在一些实施例中，聚合酶需要可延伸的3'端。例如，聚合酶需要核酸引物的末端3′OH以开始核苷酸聚合。聚合酶可以是除热稳定聚合酶以外的。例如，聚合酶可以在37℃下具有活性，和/或在37℃下比在50℃、60℃、70℃或更高温度下更具活性。在一些实施例中，聚合酶可以在40℃下具有活性，和/或在40℃下比在50℃、60℃、70℃或更高温度下更具活性。在各种实施例中，聚合酶在42℃、45℃、50℃、55℃或60℃下可以是具有活性的，和/或在这些温度下比在37℃下更具活性。
聚合酶可包含可催化核苷酸(包含其类似物)聚合到核酸链中的任何酶。通常但未必，此类核苷酸聚合可以模板依赖性方式进行。在一些实施例中，聚合酶是高保真度聚合酶。此类聚合酶可以包含但不限于天然存在的聚合酶和其任何亚基和截短物、突变型聚合酶、变异型聚合酶、重组、融合或以其它方式工程改造的聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子或组合件，以及其保留催化此类聚合的能力的任何类似物、衍生物或片段。任选地，聚合酶是具有一个或多个突变的突变聚合酶，所述一或多个突变涉及用其它氨基酸置换一个或多个氨基酸、来自聚合酶的一个或多个氨基酸的插入或缺失或两个或更多个聚合酶的部分的连接。如本文所用，术语「聚合酶」和其变化形式也是指包含彼此连接的至少两个部分的融合蛋白，其中第一部分可包含可催化核苷酸聚合到核酸链中且与第二部分连接的肽，所述第二部分可包含第二多肽，例如报告酶或增强持续合成能力的结构域。通常，聚合酶包含可进行核苷酸结合和/或核苷酸聚合催化的一个或多个活性位点。在一些实施例中，聚合酶可包含或缺乏其它酶促活性，例如3′到5′核酸外切酶活性或5′到3′核酸外切酶活性。在一些实施例中，聚合酶是从细胞中分离，或使用重组DNA技术或化学合成方法产生。在本发明传授内容的任一个实施例中，在原核生物、真核生物、病毒或噬菌体生物体中表达聚合酶。在各种实施例中，聚合酶是DNA聚合酶且包含但不限于细菌DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶、古细菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶和噬菌体DNA聚合酶。在各种实施例中，使用所属领域中已知的方法来纯化所表达的聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是翻译后修饰的蛋白质或其片段。
在一些实施例中，聚合酶包含如以下中所描述的任何一种或多种聚合酶或聚合酶的生物活性片段：Davidson等人，2011年10月27日公开的美国专利公开案第2011/0262903号；和/或Vander Horn等人，2013年2月14日公开的国际PCT公开案第WO 2013/023176号，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，聚合酶是复制酶、DNA依赖性聚合酶、引发酶、RNA依赖性聚合酶(包含RNA依赖性DNA聚合酶，例如逆转录酶)、热不稳定聚合酶或热稳定聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是任何A或B家族型聚合酶。许多类型的A(例如大肠杆菌(E.coli)Pol I)、B(例如大肠杆菌Pol II)、C(例如大肠杆菌Pol III)、D(例如广古菌(Euryarchaeotic)Pol II)、X(例如人类Polβ)和Y家族(例如，大肠杆菌UmuC/DinB和真核生物RAD30/着色性干皮病变体)聚合酶描述于Rothwell和Watsman 2005《蛋白质化学进展(Advances in ProteinChemistry)》71:401-440中。在一些实施例中，聚合酶是T3、T5、T7或SP6 RNA聚合酶。
在一些实施例中，用一种类型的聚合酶和/或连接酶、或聚合酶和/或连接酶的混合物来进行核酸扩增反应。在一些实施例中，用低保真度或高保真度聚合酶进行核酸扩增反应，或不考虑保真度。
示例性聚合酶是Bst DNA聚合酶(Exonuclease Minus)，其是一种登录号2BDP_A中例示的67kDa嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶蛋白(大片段)，其具有5′到3′聚合酶活性和链置换活性但缺乏3′到5′核酸外切酶活性。其它聚合酶包含来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的Taq DNA聚合酶I(由登录号1TAQ例示)、来自大肠杆菌(Escherichia coli)的Eco DNA聚合酶I(登录号P00582)、来自超嗜热菌(Aquifexaeolicus)的Aea DNA聚合酶I(登录号067779)，或其例如在核苷酸水准上具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的功能片段或变异体。
在说明性实施例中，DNA聚合酶是Bsu DNA聚合酶(大片段(NEB))。Bsu DNA聚合酶I大片段保留枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DNA聚合酶I(1)的5′到3′聚合酶活性但缺乏5′到3′核酸外切酶结构域。在某些实施例中，Bsu DNA聚合酶大片段缺乏3′到5′核酸外切酶活性。在各个实施例中，Bsu DNA聚合酶大片段在37℃下具有最优活性。
在某些说明性实施例中，尤其当预植入反应是RPA反应时，能够进行聚合的一种或多种酶包含T5或T7 DNA聚合酶。在一些实施例中，能够进行聚合的一种或多种酶包含具有降低3′到5′核酸外切酶活性的一种或多种氨基酸突变的T5或T7 DNA聚合酶。在一些实施例中，具有降低3到5′核酸外切酶活性的一种或多种氨基酸突变的T5或T7 DNA聚合酶不含有干扰T5或T7 DNA聚合酶的持续合成能力的氨基酸突变。在一些实施例中，T5或T7 DNA聚合酶包含消除可检测的3′到5′核酸外切酶活性的一种或多种氨基酸突变；且其中所述一种或多种氨基酸突变不干扰T5或T7 DNA聚合酶的持续合成能力。在某些说明性实施例中，预植入反应混合物包含Sau聚合酶、3′到5′核酸外切酶活性降低的T7 DNA聚合酶、Bsu聚合酶或其组合。尤其较适用于RPA反应的这些聚合酶不仅非常适用于预植入反应，而且适用于模板化反应。
在一些实施例中，能够进行聚合的一种或多种酶包含任何适合的RNA聚合酶。适合的RNA聚合酶包含但不限于T3、T5、T7和SP6 RNA聚合酶。
在各个实施例中，本发明传授内容的任一种方法(包含预植入反应和模板化反应)中使用的模板核酸分子，通常包含第一引物结合序列(例如，“正向”)和任选地第二引物结合序列(例如，“反向”)。引物包含任何单链核酸分子，一旦与互补核酸序列杂交，就可以引发核酸合成。通常，这种核酸合成以依赖模板的方式发生，并且在这种核酸合成过程中核苷酸聚合到引物的至少一端。如本文所用，术语“引物延伸”及其变体涉及用于催化核苷酸掺入核酸分子末端的任何方法。在本文提供的方法和组合物的一些实施例中，预植入反应混合物和模板化反应包含分别结合正向引物结合序列和反向引物结合序列的第一引物群体和任选地第二引物群体。在一些实施例中，第一和第二引物被称作引物对。在一些实施例中，第一引物和/或第二引物通常是通用引物。第一引物可与正向引物结合序列或反向引物结合序列结合，且第二引物可与正向引物结合序列或反向引物结合序列结合。因此，术语“第一”和“第二”在本文中关于引物使用时是相对术语，并且每个都可以指正向或反向引物，这取决于它们使用的上下文。
在任一个所公开的实施例中，反应混合物包含与模板核酸分子内的序列结合的第一引物群体和第二引物群体。第一引物群体可以是相同拷贝或不同序列。第二引物群体可以是相同拷贝或不同序列。然而，第一引物群体和任选的第二引物群体通常是通用引物，且所有拷贝是相同的。因此，在说明性实施例中，第一引物群体和第二引物群体两者均是结合模板核酸分子上的通用引物结合序列的通用引物。在其它实施例中，第一引物群体和第二引物群体均是靶标特异性引物。第一引物群体和第二引物群体可具有相同或不同序列。在本发明传授内容的任一个实施例中，在与预植入反应混合物一起温育之前，将第一引物群体和/或第二引物群体与一种或多种载体连接。在其它实施例中，在与预植入反应混合物一起温育期间，第一引物群体和/或第二引物群体在溶液中。在说明性实施例中，在与预植入反应混合物一起温育之前，将第一引物群体与一种或多种载体连接；且在与预植入反应混合物一起温育期间，第二引物群体通常在溶液中。
因此，在于溶液中包含所固定的第一引物群体和第二引物群体的这些说明性实施例中，不受理论限制，在预植入反应期间，将模板核酸至少部分地变性，并且模板上的第一引物结合位点与和固体载体连接的第一引物结合。聚合酶使用第一引物，以产生模板核酸的一条链的互补链。那条互补链现通过引物与固体载体共价连接。溶液中的第二引物是呈与重组酶的复合物形式，且与互补链上的引物结合位点结合，因此使结合的模板核酸分子部分变性。聚合酶使用引物合成与原始模板核酸链相同的新链。认为，随后这条链将通过结合重组酶的复合物和同固体载体连接的附近第一引物而部分地变性，且聚合酶合成另一条互补链。通过这个方法的重复步骤，模板核酸分子的基本上单克隆群体在预植入反应期间产生，且在模板化反应期间进一步扩增。
在一些实施例中，本公开总体上涉及方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，其中引物通常具有游离3′羟基。在一些实施例中，引物是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物的聚合物。在一些实施例中，引物是天然存在的、合成、重组、克隆、扩增或未扩增形式。在一些实施例中，引物包含在所有核苷酸之间的磷酸二酯键。在本发明传授内容的任一个实施例中，引物的长度在约5与100个核苷酸之间，例如长度在约5与80个核苷酸之间、长度在约5与60个核苷酸之间、长度在约5与40个核苷酸之间、长度在约10与75个核苷酸之间、长度在约15与75个核苷酸之间或长度在约20与50个核苷酸之间。
在一些实施例中，至少一个引物具有修饰。例如，核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物可以具有与其连接的生物素或叠氮化物，在一些实施例中，其用作连接子部分。在一些实施例中，核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物具有连接的荧光团、磷酸化或间隔子。在一些实施例中，引物是封端的和/或是融合引物或融合多核苷酸，其中引物或多核苷酸的不同区域设计成与两个引物结合位点中的一个结合和/或设计成被两个引物中的一个结合。
在一些实施例中，引物是封端的引物以防止所述引物的3′端延伸。在一些实施例中，封端的引物是带尾引物，其中5′端包含与模板核酸分子非互补的序列。此5′序列可以用作引物延伸反应的模板。在一些实施例中，引物是封端的，其中5′结构域的长度在15到30个核苷酸。在一些实施例中，引物包含在其5′或3′端处或在5′和3′端处的封端部分。在涉及引物延伸的反应(例如，预植入扩增)中，在封端的融合引物的3′端处的封端部分可降低引物二聚体形成的水准。在某些实施例中，预植入反应混合物包含封端的引物，其中3′结构域的长度在14到25个核苷酸。在其它实施例中，3′结构域的长度在15到25个核苷酸。在又其它实施例中，5′结构域是至少15个核苷酸且3′结构域是至少10个核苷酸，其中引物的长度不超过100、90、80、75、70、60或50个核苷酸。在实施例中，正向引物的3′结构域的3′核苷酸与正向引物结合序列错配。在实施例中，将封端引物的5′结构域和3′结构域分开的核糖碱基(ribobase)包含rU、rG、rC或rA。在某些实施例中，将封端引物的5′结构域和3′结构域分开的核糖碱基包含rC。在本发明传授内容的任一个实施例中，封端引物的3′结构域的长度在14到20个核苷酸，且核糖碱基是rU、rG、rC或rA。在一些实施例中，引物被封端，因为所述引物含有不可复制的部分。不可复制部分可以是不能被聚合酶复制的任何组合物，例如聚合酶终止位点。例如，此类引物可以具有聚合酶终止位点不可复制部分，所述部分位于与模板核酸不互补的引物的5'端序列和与模板核酸互补的引物的3'端序列之间。在这种情况下，含有此类引物的延伸产物的模板依赖性聚合将不包含模板依赖性聚合中引物的5'端的序列，因为引物的5'端定位于聚合酶终止位点之后，这将阻止聚合酶使用引物的5'端作为模板。此类不可复制部分包含例如不能支持聚合酶进行的基于模板的核苷酸聚合的任何部分。例如，不可复制的部分可以包含不被用于进行引物延伸的聚合酶识别的非核苷酸部分(例如，PEG或其它基于碳的间隔基、氨基酸或核苷酸类似物)。在一些实施例中，位于此类引物中不可复制部分之前和之后的核苷酸序列能够在某些条件下彼此杂交。含有不可复制部分的引物的实例描述于例如国际申请公开第WO2014/062717号中，所述国际申请公开通过全文引用的方式并入本文。
在本发明传授内容的实施例中的一些实施例中，反应混合物包含去除封端引物的一部分以留下游离3′OH的酶。在去除引物的封端端之后，聚合酶可从游离3′OH开始复制以开始复制模板链。在一些实施例中，这种酶是RNA酶，尤其RNA酶H。所属领域的技术人员将辨识使用的封端引物的其它组合物和用于去除封端引物的一部分的适合酶。
在一些实施例中，本文提供的方法、试剂盒、组合物、系统和装置中使用的引物具有二级结构，在某些条件下抑制引物与另一种多核苷酸(例如，捕获寡核苷酸)的杂交。例如，引物可以是能够形成发夹或茎环结构的引物。此类引物的实例描述于例如国际申请公开第WO2014/062717号中。
预植入反应混合物以及本文中所提供的方法中的任何其它扩增反应(包含模板化反应混合物)，通常包含被聚合酶用作延伸反应的底物的核苷酸或其类似物源。在本发明传授内容的任一个实施例中，预植入反应混合物通常包含用于模板核酸分子的链延伸由此产生与一种或多种载体连接的模板核酸分子序列的基本上单克隆群体的核苷酸(dNTP)。在一些实施例中，核苷酸未被外部标记。例如，核苷酸可以是不包含荧光部分、染料或其它外来光学可检测标记的天然存在的核苷酸或合成类似物。任选地，核苷酸不包含终止核酸合成的基团(例如双脱氧基团、可逆终止子和其类似物)。在其它实施例中，核苷酸包含标记或标签。
在一些实施例中，用于核酸扩增的方法包含至少一种辅因子，例如增强DNA或RNA聚合酶活性的辅因子。在一些实施例中，辅因子包含一种或多种二价阳离子。二价阳离子的实例包含镁、锰和钙。在各个实施例中，预植入反应混合物包含含有一种或多种二价阳离子的缓冲液。在说明性实施例中，缓冲液含有镁或锰离子。在本发明传授内容的任一个实施例中，通过添加辅因子，尤其二价阳离子，来开始预植入反应或模板化反应。在一些实施例中，本文中用于核酸扩增所使用的预植入反应混合物可包含至少一种辅因子，以用于在核酸上进行重组酶组装或用于同源核酸配对。在一些实施例中，辅因子包含任何形式的ATP，包含ATP和ATPγS。在一些实施例中，用于核酸扩增的方法包含使ATP再生的至少一种辅因子。例如，辅因子可以包含将ADP转化成ATP的酶系统。在一些实施例中，辅因子酶系统是磷酸肌酸和肌酸激酶。
在本发明传授内容的任何方面中，预植入反应混合物包含使模板核酸分子部分地变性的组分。在一些实施例中，部分地变性条件包含用一种或多种酶处理待扩增的模板核酸分子或使所述模板核酸分子与所述一种或多种酶接触，所述一种或多种酶能够任选地以序列特异性或序列定向方式(如在RPA反应中)使核酸模板部分地变性。在一些实施例中，至少一种酶任选地以序列特异性方式催化链侵入和/或解开。任选地，一种或多种酶包含选自以下的一种或多种酶：重组酶、拓扑异构酶和解螺旋酶。在一些实施例中，使模板部分地变性包含使模板与重组酶接触和形成包含重组酶的核蛋白复合物。任选地，使模板核酸分子在第一和任选地第二引物存在下与重组酶接触。部分地变性可包含使用重组酶催化链交换和使第一引物与第一引物结合序列杂交(或使第二引物与第二引物结合序列杂交)。在一些实施例中，部分地变性包含使用重组酶进行链交换，和使第一引物与第一引物结合序列杂交且使第二引物与第二引物结合序列杂交。
在一些实施例中，使模板核酸分子部分地变性包含使模板与一种或多种重组酶或核蛋白复合物接触。核蛋白复合物中的至少一个可包含重组酶。核蛋白复合物中的至少一个可包含引物(例如第一引物或第二引物，或包含与模板中的对应引物结合序列互补的序列的引物)。在一些实施例中，使模板部分地变性包含使模板与包含引物的核蛋白复合物接触。部分地变性可包含使核蛋白复合物的引物与模板中的对应引物结合序列杂交，由此形成引物-模板双螺旋。在一些实施例中，使模板核酸分子部分地变性包含使模板与包含第一引物的第一核蛋白复合物接触。部分地变性可包含使第一核蛋白复合物的第一引物与正向链的第一引物结合序列杂交，由此形成第一引物-模板双螺旋。在一些实施例中，使模板部分地变性包含使模板与包含第二引物的第二核蛋白复合物接触。部分地变性可包含使第二核蛋白复合物的第二引物与反向链的第二引物结合序列杂交，由此形成第二引物-模板双螺旋。
因此，本公开的预植入反应混合物和本公开的模板化反应包含重组酶，且部分变性和/或扩增，包含本文所描述的任何一个或多个步骤或方法，可使用重组酶和任选地重组酶辅助蛋白实现。重组酶可以包含能够诱导重组事件发生或增加其发生频率的任何药剂。重组事件包含借此两条不同多核苷酸链彼此重组的任何事件。重组可包含同源重组。重组酶任选地可与第一引物结合(例如结合)。在一些实施例中，催化同源重组的酶可通过结合单链模板核酸分子形成核蛋白复合物。在一些实施例中，作为核蛋白复合物的一部分的同源重组酶可结合双链多核苷酸的同源部分。在一些实施例中，多核苷酸的同源部分与第一引物的至少一部分杂交。在一些实施例中，多核苷酸的同源部分与第一引物的至少一部分部分或完全互补。适合的重组酶包含RecA和其原核或真核同源物、或其功能片段或变异体，任选地与一种或多种单链结合蛋白(SSB)组合。在某些实施例中，重组酶任选地涂覆ssDNA，以形成侵入模板上的同源性双链区的核蛋白长丝。
在一些实施例中，通过形成核蛋白复合物和与双链多核苷酸的同源部分结合以形成具有三条链结构的重组中间物(D-环形成)，同源重组酶催化链侵入(Zarling的美国专利第5,223,414号；Sena的美国专利第5,273,881号和第5,670,316号；和美国专利第7,270,981号、第7,399,590号、第7,435,561号、第7,666,598号、第7,763,427号、第8,017,339号、第8,030,000号、第8,062,850号和第8,071,308号，以其全文引用的方式并入本文中)。
反应混合物、组合物和试剂盒的重组酶包含可促进多核苷酸分子之间的重组的任何适合药剂。重组酶可以是催化同源重组的酶。例如，反应混合物可包含重组酶，所述重组酶包含或来源于细菌、真核生物或病毒(例如噬菌体)重组酶。
在本发明传授内容的任一个实施例中，同源重组酶是野生型、突变体、重组体、融合物或其片段。在一些实施例中，同源重组酶包含来自任何生物体的酶，所述生物体包含肌病毒科(myoviridae)(例如来自噬菌体T4的uvsX、RB69和其类似物)、大肠杆菌(例如，recA)或人类(例如，RAD51)。在实施例中，反应混合物包含选自以下的一种或多种重组酶：uvsX、RecA、RadA、RadB、Rad51、其同源物、其功能类似物，或其组合。在说明性实施例中，重组酶是uvsX。UvsX蛋白可例如以50-1000ng/μl、100-750ng/μl、200-600ng/μl或250到500ng/μl存在。
在一些实施例中，用于核酸扩增的方法、试剂盒和组合物包含含一种或多种重组酶辅助蛋白的预植入反应混合物。例如，辅助蛋白可提高重组酶的活性。在一些实施例中，辅助蛋白可结合模板核酸分子的单链，或可将重组酶负载到模板核酸分子上。在一些实施例中，辅助蛋白是野生型、突变体、重组体、融合物或其片段。在一些实施例中，辅助蛋白可来源于与用于进行核酸扩增反应的重组酶相同或不同物种的任何组合。辅助蛋白可来源于任何细菌噬菌体，包含肌病毒噬菌体。肌病毒噬菌体的实例包含T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、不动杆菌(Acinetobacter)噬菌体133、气单胞菌(Aeromonas)噬菌体65、噬藻体(cyanophage)P-SSM2、噬藻体PSSM4、噬藻体S-PM2、Rb14、Rb32、气单胞菌噬菌体25、弧菌噬菌体nt-1、phi-1、Rb16、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3和噬菌体LZ2。辅助蛋白可以来源于任何细菌物种，包含大肠杆菌、硫化叶菌属(Sulfolobus)(例如，硫磺矿硫化叶菌(S.solfataricus))或甲烷球菌属(Methanococcus)(例如詹氏甲烷球菌(M.jannaschii))。在一些实施例中，用于核酸扩增的方法可包含单链结合蛋白。单链结合蛋白包含肌病毒gp32(例如T4或RB69)、来自硫磺矿硫化叶菌的Sso SSB、来自詹氏甲烷球菌的MjA SSB和大肠杆菌SSB蛋白。
在一些实施例中，用于核酸扩增的方法包含提高重组酶负载到核酸上的蛋白质。例如，UvsY蛋白是重组酶负载蛋白。在一些实施例中，反应混合物包含重组酶辅助蛋白。在说明性实施例中，重组酶辅助蛋白是uvsY。UvsY可以在约20与500ng/μl之间，例如在约20与250ng/μl之间或在约20与125ng/μl之间。在非限制性实例中，UvsY在75与125ng/μl之间。
在本发明传授内容的任一个实施例中，预植入反应混合物或模板化反应混合物内的扩散，通过添加扩散限制性药剂来限制，所述扩散限制性药剂有效地防止或减缓多核苷酸模板中的一个或多个多核苷酸模板和/或扩增反应产物中的一个或多个扩增反应产物通过预植入或模板化反应混合物的扩散。当在反应混合物的单一连续液相内扩增两种或更多种模板核酸分子时，包含扩散限制性药剂可为有利的。例如，扩散限制性药剂可以防止或减缓模板核酸分子或所扩增的通过模板核酸分子的至少某个部分的复制所产生的多核苷酸在预植入或模板化反应混合物内扩散，因此防止形成多克隆杂质而不需要在扩增期间通过物理手段或包封手段(例如乳液)将预植入或模板化反应混合物区室化。在单一反应混合物的单一连续液相内扩增模板而无需区室化的此类方法极大地降低与产生适合于高通量方法(如数字PCR、下一代测序和其类似方法)的文库产生相关的成本、时间和工作量。
在一些实施例中，扩散限制性药剂是筛分药剂。筛分药剂可以是有效筛分存在于预植入或模板化反应混合物中的一种或多种模板核酸分子或多核苷酸，例如扩增反应产物和/或模板核酸分子，的任何药剂。在一些实施例中，筛分药剂限制或减缓多核苷酸扩增产物通过预植入或模板化反应混合物的迁移。在一些实施例中，筛分药剂的平均孔大小使得靶组分在预植入或模板化反应混合物(例如，多核苷酸)内的移动被选择性地延迟或阻止。在一个实例中，筛分药剂包含提供具有多个孔的基质的任何化合物，所述多个孔足够小以减缓或延缓多核苷酸或模板核酸分子在含有筛分药剂的反应混合物中的移动。因此，筛分药剂可以减少多核苷酸的布朗运动(Brownian motion)。
在一些实施例中，筛分药剂是聚合物化合物。在一些实施例中，筛分药剂是交联或非交联的聚合物化合物。借助于非限制性实例，筛分药剂可包含多醣、多肽、有机聚合物或任何其它适合的聚合物。在任一个实施例中，筛分药剂是呈直链或分支链的聚合物。在一些实施例中，筛分药剂是带电或中性聚合物。在一些实施例中，筛分药剂可以包含各自具有平均分子量和粘度的一种或多种聚合物的掺合物。在一些实施例中，筛分药剂是具有在约10,000与2,000,000Da之间的平均分子量的聚合物：例如在约10,000与1,000,000Da之间、在约10,000与500,000Da之间、在约10,000与250,000Da之间或在约10,000与100,000Da之间。在某些实施例中，聚合物具有在约12,000与95,000Da之间或在约13,000与95,000Da之间的平均分子量。
在一些实施例中，当以2重量百分比溶解于水中在约25℃测量下时，筛分药剂呈现约5厘泊到约15,000厘泊的平均粘度范围；或在呈2％水溶液在约25℃下测量时，约10厘泊到约10,000厘泊的平均粘度范围；或在呈2％水溶液在约25℃下测量时，约15厘泊到约5,000厘泊的平均粘度范围。
在一些实施例中，筛分药剂具有约25到约1,5000kMv、或约75-1,000kMv或约85-800kMv的粘度平均分子量(Mv)。在一些实施例中，反应混合物包含在约0.1到约20％重量/体积(w/v)或约1-10％w/v或约2-5％w/v下的筛分药剂。
在一些实施例中，筛分药剂是多醣聚合物。在一些实施例中，筛分药剂是葡萄糖或半乳糖的聚合物。在一些实施例中，筛分药剂是以下聚合物中的一个或多个：纤维素、葡聚糖、淀粉、肝醣、琼脂、甲壳素、果胶或琼脂糖。在一些实施例中，筛分药剂是吡喃葡萄糖聚合物。在一些实施例中，筛分药剂包含纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠、羧甲基2-羟乙基纤维素钠、甲基纤维素、羟基乙基纤维素、2-羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、(羟丙基)甲基纤维素或羟乙基乙基纤维素、或包含此类聚合物中的任一个或多个的混合物。
在一些实施例中，预植入反应混合物和/或模板化反应混合物包含不同筛分药剂的混合物，例如不同纤维素衍生物、淀粉、聚丙烯酰胺和其类似物的混合物。在一些实施例中，预植入反应混合物包含拥挤药剂(crowding agent)。在一些实施例中，预植入反应混合物包含拥挤药剂和筛分药剂两个。
在一些实施例中，扩散限制性药剂是扩散降低剂(diffusion-reducing agent)。扩散降低剂包含降低模板核酸分子或多核苷酸从较高浓度区域迁移到较低浓度区域的任何化合物。在一些实施例中，扩散降低剂包含无关于大小降低核酸扩增反应的任何组分的迁移的任何化合物。
在一些实施例中，扩散限制性药剂是药物化合物。术语“药物化合物”和其变体是指可以与核酸连接并阻止其扩散通过反应混合物，但仍然允许在核酸合成反应中使用此类多核苷酸、引物、模板或扩增产物进行核酸合成的任何组合物，例如化学组合物。此类药物化合物在合成反应中与核酸的连接通常会降低此类核酸在反应混合物中的迁移率，并可用于防止同一反应混合物发生的不同合成反应之间扩增产物或模板的交叉污染。在一些实施例中，核酸被修饰以与药物化合物连接或结合。例如，亲和部分，例如连接子部分，可以连接到核酸并且药物化合物是一种结合配偶体部分，例如受体类型部分，其与亲和部分结合。在一些实施例中，核酸连接至生物素部分，所述生物素部分可结合用作药物化合物的抗生物素蛋白样部分。抗生物素蛋白样部分包含抗生物素蛋白和与生物素结合的抗生物素蛋白的任何衍生物、类似物和其它非天然形式的抗生物素蛋白(例如，中性抗生物素蛋白)。在一些实施例中，药物组分与一种或多种核酸组分的连接可以增加单克隆产物的数量或比例。例如，与缺少连接的化合物的核酸相比，通过改变修饰的核酸的整体大小、长度、半径、形状或电荷，当连接到核酸时，药物化合物可以提供流体动力学阻力。在一些实施例中，与水性介质和缺少连接化合物的核酸之间的相互作用相比，连接到核酸上的药物化合物可以改变核酸和水性介质之间的相互作用。在一些实施例中，药物化合物可以是合成的、重组的或天然存在的。在一些实施例中，药物化合物可以是带电的、不带电的、极性的或疏水的。在一些实施例中，药物化合物可以是直链的、支化的或具有树枝状结构。在一些实施例中，药物化合物可以包括核苷、糖类、脂质或氨基酸的单个部分或聚合物。任选地，药物化合物包括糖部分、多糖、蛋白质、糖蛋白或多肽。任选地，药物化合物包括BSA、溶菌酶、β-肌动蛋白、肌球蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白、β-半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶或免疫球蛋白(例如，IgG)。任选地，改变核酸通过水性介质的迁移率的药物化合物包括一个或多个聚环氧乙烷(PEO)或聚环氧丙烷(PPO)部分，包含聚环氧乙烷(PEO)或聚环氧丙烷(PPO)的聚合物。此类聚合物的非限制性实例包含三嵌段共聚物(例如，PEO-PPO-PEO)、PluronicsTM型聚合物和疏水改性的PEO聚合物。任选地，药物化合物包括一个或多个氨基酸部分、多肽和类多肽。任选地，药物化合物包括糖部分、多糖、疏水改性的多糖、纤维素衍生物、羧甲基纤维素钠、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素。任选地，药物化合物包括h疏水改性的碱溶性缔合(HASE)聚合物、疏水改性的聚丙烯酰胺、热响应聚合物或N-异丙基丙烯酰胺(NTPAAm)，任选地，药物化合物包括聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(PEGMEA)、四乙二醇二丙烯酸酯(TEGDA)、聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(EGDMA)或N,N'-亚甲基-双-丙烯酰胺(NMBA)。任选地，药物化合物包括蛋白质或多肽，包含BSA、溶菌酶、β-肌动蛋白、肌球蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白、β-半乳糖苷酶或乳酸脱氢酶。
应注意，筛分药剂和扩散降低剂的概念不一定相互排斥；筛分药剂可以常常有效地降低反应混合物中的靶标化合物的扩散，而扩散降低剂可以常常对于反应组分具有筛分效果。在一些实施例中，相同化合物或预植入反应混合物添加物均可以用作筛分药剂和/或扩散降低剂。在一些实施例中，本发明传授内容的任一种筛分药剂可以能够充当扩散降低剂，并且反之亦然。
在一些实施例中，扩散降低剂和/或筛分药剂包含聚丙烯酰胺、琼脂、琼脂糖或纤维素聚合物，如羟基乙基纤维素(hydroxyethyl cellulose；HEC)、甲基纤维素(methyl-cellulose；MC)或羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose；CMC)。
在一些实施例中，预植入反应混合物中包含浓度为以下的筛分药剂和/或扩散降低剂：至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、90％或95％w/v(药剂重量/单位体积的反应混合物)。
在一些实施例中，扩散限制性药剂是拥挤药剂。例如，拥挤药剂可通过产生拥挤的反应环境而增加核酸扩增反应中的一种或多种组分的浓度。在一些实施例中，预植入和/或模板化反应混合物包含筛分药剂和/或扩散剂以及拥挤药剂。
在一些实施例中，将不同模板核酸分子预植入到一种或多种不同离散载体(例如珠粒或颗粒)上而不需要在扩增之前区室化。在其它实施例中，在扩增之前，将模板核酸分子分配(partitioned/distributed)到乳液中。与单一连续液相内的扩增相反，可在多个分隔反应体积中平行进行预植入反应。各反应体积可包含预植入反应混合物。例如，可将模板核酸分子分配或置于反应室阵列或反应体积阵列中，使得阵列中的至少两个此类区室或体积接受单一模板核酸分子。在一些实施例中，形成多个单独反应体积。可在扩增之前，任选地将反应室(或反应体积)密封。可在每一个反应室中进行预植入反应，以产生基本上单克隆模板核酸分子群体。在另一个实施例中，将反应混合物分区或分隔成分散于乳化液连续相内的多个微反应器。各区室或微反应器充当非依赖性扩增反应器，因此整个乳化液能够支持在单一反应容器(例如Eppendorf管或孔)中于单独(非连续)液相中进行许多单独扩增反应。如本文所用，术语“乳化液”包含含第一液体与第二液体的混合物的任何组合物，其中第一和第二液体基本上彼此不混溶。分区或单独反应体积任选地不彼此混合或连通，或不能够彼此混合或连通。微反应器中的预植入反应混合物可以是本文所论述的任一种预植入反应混合物。
在一些实施例中，核酸合成方法进一步包含从乳化液回收至少一些与基本上单克隆模板核酸分子群体连接的载体。在一些实施例中，核酸合成方法进一步包含将至少一些与基本上单克隆模板核酸分子群体连接的载体放置到表面上。在一些实施例中，核酸合成方法进一步包含通过将至少一些与基本上单克隆模板核酸分子群体连接的载体放置到表面上而形成阵列。
在一些实施例中，本公开总体上涉及组合物、以及系统、方法、试剂盒和设备，其包含预植入反应混合物和模板化反应混合物。因此，在某些实施例中，本文提供了包含聚合酶和一种或多种预植入载体的反应混合物。反应混合物组合物可包含重组酶和任选地如已知用于RPA反应的重组酶辅助蛋白。在此类实施例中，反应混合物，尤其预植入反应混合物，可以在溶液中包含5×107与109个之间的模板核酸分子，所述溶液包含5×106与1010个之间的珠粒，如离子球形颗粒。在说明性实例中，预植入反应混合物中的每珠粒包含1或小于1模板核酸分子。例如，每固体载体可包含在约0.1与0.9之间的模板核酸分子，例如每固体载体可包含在约0.1与0.7之间的模板核酸分子、在约0.1与0.5之间的模板核酸分子或在约0.1与0.3之间的模板核酸分子。在某些实例中，模板化反应混合物包含在溶液中的小于1,000,000、500,000、1,000、500、100、10或0个模板核酸分子，以及本发明传授内容的预植入的固体载体。在预植入和模板化反应混合物中，聚合酶和任选地重组酶通常以扩增有效浓度存在，如RPA反应已知的，或以更高浓度存在，使得其可与其它反应组分合并到最终预植入反应混合物中。在本发明传授内容的任一个实施例中，预植入反应混合物和/或模板化反应混合物的体积是在约50与2,000μl之间，例如在约50与1,500μl之间、在约50与1,000μl之间、在约50与500μl之间、在约50与250μl之间或在约50与150μl之间。在任一个所公开的实施例中，预植入反应混合物的体积与模板化反应混合物的体积不同。
预植入反应混合物和模板化反应混合物可进一步包含其它组分。例如，组合物可包含核苷酸、第一引物群体、任选地第二引物、辅因子和缓冲液。第一引物群体和任选地第二引物群体可与一种或多种载体连接。作为非限制性实例，组合物包含：一种或多种载体；重组酶，如uvsX；聚合酶，如Sau DNA聚合酶；重组酶负载蛋白，如uvsY；单链结合蛋白，如gp32蛋白；核苷酸；ATP；磷酸肌酸；和肌酸激酶。组合物可呈液体形式，或其可呈固体形式，如可复水的干燥沉淀物形式(dried-down pellet form)。此外，可将组合物的组分分开，使得任何组合的组分可呈沉淀物或液体形式，且其余组分的一种或多种组合可呈一种或多种单独沉淀物或液体形式。此类组合可形成包含此类组合中的至少两种的试剂盒。例如，试剂盒可包含含除聚合酶以外的本发明传授内容的所有反应混合物组分的沉淀物，所述聚合酶可以单独沉淀物或液体提供于试剂盒中。
在说明性实施例中，组合物包含模板核酸分子群体、聚合酶、重组酶、正向引物、反向引物、核苷酸和缓冲液。在一些实施例中，组合物包含模板核酸分子、正向引物、反向引物、uvsX重组酶、uvsY重组酶负载蛋白、gp32蛋白、Sau DNA聚合酶、dNTP、ATP、磷酸肌酸和肌酸激酶。
在一些实施例中，组合物包含具有第一引物结合序列和第二引物结合序列的至少两种不同的模板核酸分子、重组酶、重组酶辅助蛋白、聚合酶、第一通用引物、第二通用引物、dNTP和缓冲液。在一些实施例中，组合物进一步包含一种或多种载体。在说明性实施例中，组合物包含具有第一引物结合序列和第二引物结合序列的至少两种不同的模板核酸分子、uvsX重组酶、uvsY重组酶负载蛋白、gp32蛋白、Sau DNA聚合酶、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、与珠粒载体连接的第一通用引物、第二通用引物和缓冲液。
在一些实施例中，通过向水溶液或乳化液溶液单独添加每一组分，形成预植入反应混合物或模板化反应混合物。在其它实施例中，反应混合物呈需要在使用前复水的脱水沉淀物形式。脱水沉淀物可以包含例如重组酶、任选的重组酶辅助蛋白、任选地gp32、DNA聚合酶、dNTP、ATP、任选地磷酸肌酸、任选的拥挤药剂和任选地肌酸激酶。复水缓冲液可包含例如Tris缓冲液、乙酸钾盐和任选地如PEG的拥挤药剂。DNA聚合酶可以是例如T4或T7 DNA聚合酶，并且当聚合酶是T7 DNA聚合酶时可以进一步包含硫氧还蛋白。在一些实施例中，当使用包含反应混合物组分的脱水沉淀物时，沉淀物用复水缓冲液复水，且添加模板核酸分子、引物和另外无核酸酶水到最终体积。
在一些实施例中，在抑制过早反应开始的条件下，预温育预植入反应混合物或模板化反应混合物。例如，可从反应容器扣留预植入反应混合物中的一种或多种组分，以防止过早反应开始。为了启动反应，添加二价阳离子(例如，镁或锰)。在另一个实例中，在抑制酶活性的温度下，预温育预植入反应混合物。可在约0-15℃或约15-25℃下，预温育反应，以抑制过早反应开始。随后，在较高温度下温育反应，以提高酶促活性。在说明性实施例中，在反应期间，不将预植入反应混合物和/或模板化反应混合物暴露于高于42℃的温度。
在所公开的实施例中的一些实施例中，预植入和/或模板化反应任选地包含核酸扩增的重复循环。在一些实施例中，扩增循环包含(a)双链核酸的链的部分、不完全或完全变性或解离，(b)引物与部分或完全单链核酸的杂交或退火以及(c)引物延伸以形成延伸的引物链。在一些实施例中，扩增循环任选地包含：(a)第一引物与模板链杂交，(b)引物延伸以形成第一延伸链，(c)来自模板链的延伸链部分或不完全变性。任选地，来自步骤(c)的模板链的变性部分任意与下一扩增循环中的不同第一引物杂交。在一些实施例中，扩增循环中的引物延伸涉及从双链体的另一条链置换双链体核酸的一条链或从模板链置换第一条延伸链。可包含与第一延伸链的3′端杂交的第二引物。在一些实施例中，所公开的方法(和相关组合物、系统和试剂盒)进一步包含一个或多个引物延伸步骤。例如，所述方法包含使用聚合酶通过核苷酸并入来延伸引物。在实施例中，延伸引物包含在核苷酸并入条件下使杂交的引物与聚合酶和一种或多种类型的核苷酸接触。通常，延伸引物以模板依赖性方式发生。任选地，所公开的方法(和相关组合物、系统和试剂盒)包含通过使用聚合酶，将一个或多个核苷酸并入到第一引物-模板双螺旋的第一引物的3′OH上来延伸第一引物，由此形成延伸的第一引物。任选地，所公开的方法(和相关组合物、系统和试剂盒)包含通过任何合适方法(例如接合或杂交)，使第二引物与第一延伸的引物的第二引物结合序列结合。任选地，所公开的方法(和相关组合物、系统和试剂盒)包含通过使用聚合酶，将一个或多个核苷酸并入到第二引物-模板双螺旋的第二引物中来延伸第二引物，由此形成延伸的第二引物。
在一些实施例中，延伸第一引物使得形成第一延伸的引物。第一延伸的引物可包含模板反向链序列的一些或全部。任选地，第一延伸的引物包含第二引物结合序列。在一些实施例中，延伸第二引物使得形成第二延伸的引物。第二延伸的引物可包含模板正向链序列的一些或全部。任选地，第二延伸的引物包含第一引物结合序列。在一些实施例中，方法(和相关组合物、系统和试剂盒)可进一步包含使一条或多条延伸的引物链与载体连接。可任选地在扩增期间或可替代地在完成扩增之后进行连接。在一些实施例中，将载体与第一引物群体连接。例如，载体可包含第一引物群体，且所述方法可包含使延伸的第二引物中的至少一个与载体的第一引物杂交，由此将延伸的第二引物与载体连接。例如，第一引物可以与延伸的第二引物中的第一引物结合序列杂交。在一些实施例中，载体包含第二引物的多个实例，并且所述方法包含使延伸的第一引物链中的至少一个与载体的第二引物杂交，如在桥式PCR中。
在本发明传授内容的任一个实施例中，使用RPA反应进行预植入反应，其中使用聚合酶、重组酶和通常重组酶辅助蛋白，实现部分变性和/或扩增，包含本文所描述的任何一个或多个步骤或方法。不受理论限制，据信，重组酶涂覆单链DNA(single-stranded DNA；ssDNA)，以形成侵入模板核酸分子上的同源性双链区域的核蛋白长丝。这产生短杂合体和被称为D-环的置换链气泡。利用DNA聚合酶，使杂交引物的游离3′端延伸，以合成新的互补链。互补链在其伸长时，置换模板核酸分子的最初配对的伴侣链。在一实施例中，在与模板核酸分子(其任选地是双链)接触之前，使一对引物中的一个或多个与一种或多种重组酶接触。RPA反应通常是等温反应且在乳化液内进行。
在本发明传授内容的任一个实施例中，通过模板步移进行预植入反应，其中双链核酸分子的部分变得解离，使得引物与一条链结合以开始新一轮的复制(参见例如，2012年6月21日公开的美国专利公开案第2012/0156728号，其以全文引用的方式并入本文中)。模板步移的实施例包含引物延伸方法，包含：(a)引物杂交步骤，(b)延伸步骤，和(c)步移步骤。任选地，引物杂交步骤包含使第一引物与模板核酸分子(“反向链”)上的第一引物结合序列杂交。任选地，延伸步骤包含产生延伸的第一正向链，所述延伸的第一正向链是反向链的全长互补序列且与其杂交。例如通过使用反向链作为模板，以模板依赖性方式延伸第一正向引物，来产生延伸的第一正向链。任选地，步移步骤包含使另一第一引物与第一引物结合序列杂交，其中反向链也与第一正向链杂交。例如，步移步骤包含使来自正向链的第一引物结合序列的至少一部分变性，其中反向链的另一部分仍与正向链杂交。在任一个所公开的实施例中，反应混合物包含具有与其结合的第一引物的一种或多种载体，其中模板核酸分子中的至少一个上的第一引物结合序列与第一引物的至少一部分互补或相同。在一些实施例中，模板核酸分子中的至少一个具有与第二引物的至少一部分互补或相同的第二引物结合序列。在一些实施例中，第二引物也与载体结合，使得可在表面上来回发生扩增。在各种实施例中，第二引物在溶液中。在其它实施例中，将第二引物固定于载体上。模板步移反应通常是在等温下进行且是在乳化液内进行。
模板步移可使得在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入许多相同核苷酸。在一些实施例中，以使得所连接的模板核酸分子在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入少于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250或300个相同核苷酸的方式，在一种或多种载体上进行模板步移。在其它实施例中，以使得所连接的模板核酸分子在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入约10与300个之间的相同核苷酸的方式，例如在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入约10与200个之间的相同核苷酸、约10与150个之间或约10与100个之间的相同核苷酸，在一种或多种载体上进行模板步移。在任何实施例中，近侧末端是模板核酸分子中最接近于连接各模板核酸分子的载体的末端。在一些方面中，与载体连接的模板核酸分子是与模板核酸分子或模板核酸区段连接的一系列相同核苷酸。在一些实施例中，基本上单克隆模板核酸分子群体中的每一个的小于5％、10％、15％、20％或25％在近侧末端处具有可变数量的相同核苷酸。例如，基本上单克隆模板核酸分子群体中的每一个的小于5％、10％、15％、20％或25％可在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入约10与300个之间的相同核苷酸，例如在与载体连接的模板核酸分子的近侧末端处引入约10与200个之间的相同核苷酸、约10与150个之间、约10与100个之间或约20与50个之间的相同核苷酸。
在所公开的实施例中的一些实施例中，使用PCR方法进行预植入反应。所属领域的技术人员将辨识进行将产生基本上单克隆模板核酸分子群体的PCR的各种方法。在一些实施例中，在单轮或单循环PCR中进行预植入反应。在其它实施例中，在多轮或多循环PCR中进行预植入反应。例如，在一些使用扩增(例如，PCR)循环的预植入方法中，可以在不存在载体的情况下进行一个或两个或更多个PCR循环以产生所需模板和/或其量，其可以遵循在存在载体的情况下通过一个、或两个或多个循环的PCR将所需模板核酸植入到载体上(参见例如图7)。例如，所述方法可包含稀释一定量的与载体反应的模板核酸分子，以降低与多于一个模板核酸分子反应的载体的百分比。在一些实施例中，稀释模板核酸分子，使得预植入反应具有载体:模板核酸分子比率，选择所述比率以优化具有与其连接的模板核酸分子的基本上单克隆群体的载体的百分比。例如，可用以下的载体:模板核酸分子比率进行预植入反应：至少约1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1、和100:1。在一些实施例中，PCR在单一反应混合物的溶液中批量进行。在一些实施例中，PCR在连续溶液中的孔或反应室中进行。在一些实施例中，在乳化液中进行PCR，其中如本文中其它地方所描述，在乳化液中的多个微反应器中进行PCR。
用于预植入载体的所描述方法包含在预植入反应期间固定一种或多种反应组分(例如一种或多种模板核酸分子和/或引物)，以防止扩增反应产物的交叉污染和随之而来的单克隆性降低。一个此类实例包含桥式扩增，其中扩增所需的所有引物(例如正向和反向引物)均与基质载体的表面连接。除此类固定以外，反应混合物中包含另外固定组分。例如，可在扩增期间，将模板核酸分子和/或扩增引物悬浮于凝胶或其它基质中，以防止扩增反应产物从合成位点迁移。此类凝胶和基质通常需要在之后去除，由此需要使用适当“熔解”或其它回收步骤且随之而来的产量损失。
在本发明传授内容的任一个实施例中，在等温条件下进行预植入和/或模板化反应。在一些实施例中，等温条件包含使反应在至少一些部分扩增(或整个扩增过程)期间经受约束在有限范围内的温度变化，包括例如等于或小于约10℃、或约5℃、或约1-5℃、或约0.1-1℃或小于约0.1℃的温度变化，或例如温度变化等于或小于或10℃、或5℃、或1-5℃、或0.1-1℃或小于0.1℃。等温反应的温度可通常在约15℃与65℃之间，例如在约15℃与55℃之间、在约15℃与45℃之间、在约15℃与37℃之间、在约30℃与60℃之间、在约40℃与60℃之间、在约55℃与60℃之间、在约35℃与45℃之间或在约37℃与42℃之间。在其它实施例中，不将预植入反应暴露于高于以下的温度：40℃、41℃、42℃、43℃、45℃或50℃。因此，在某些实施例中，不将反应混合物暴露于热启动条件。然而，应理解，在这些温度下使用的酶将需要组合优化，且可能需要改变酶，例如使用不同DNA聚合酶，如Bst而非Bsu。速率限制酶可以是聚合酶，其中高浓度或过量(即，非限制性)量的聚合酶或较低温度确保扩增反应基于聚合酶的动力学进行。
可进行预植入和/或模板化反应0.25分钟到240分钟，由此扩增核酸模板。在某些实施例中，进行预植入反应约0.25到240分钟，例如约0.25到120分钟、约0.25到60分钟、约0.25到30分钟、约0.25到15分钟、约0.25到10分钟、约0.25到7.5分钟、约0.25到5分钟或约2到5分钟。在另外的说明性实施例中，进行预植入和/或模板化反应约1.5到20分钟，例如约1.5到15分钟、约1.5到10分钟、约1.5到8分钟、约1.5到6分钟、约1.5到5分钟或约1.5到4分钟，并且任选地，反应是等温的，并且反应的温度在约35℃与65℃之间，例如在约35℃与55℃之间、在约35℃与45℃之间、在约30℃与60℃之间、在约40℃与60℃之间、在约40℃与55℃之间、在约50℃与60℃之间或在约37℃与42℃之间。例如，可以在等温反应中进行预植入反应约1到10分钟，其中反应温度可以在约35℃与45℃之间，或可以在等温反应中进行预植入反应约2到5分钟，其中反应温度可以在37℃约与42℃之间。在一些实施例中，使用一个或多个PCR扩增循环进行预植入反应并且总反应时间可以在约1.5与50分钟之间、约1.5与45分钟之间、约1.5与40分钟之间、在约1.5与35分钟之间、在约1.5与30分钟之间、在约1.5与25分钟之间、在约1.5与20分钟之间、在约1.5与15分钟之间、在约1.5与14分钟之间、在约1.5与13分钟之间、在约1.5与12分钟之间，在约1.5与10分钟之间，在约1.5与8分钟之间、在约1.5与6分钟之间、在约1.5与5分钟之间或在约1.5与4分钟之间。
在一些实施例中，进行方法而无需在扩增期间使双链模板核酸分子经受极限变性条件。例如，可以进行方法而无需在扩增期间使模板核酸模板经受等于或大于模板的Tm的温度。在一些实施例中，进行方法而无需在扩增期间使模板与化学变性剂(如NaOH、脲、胍盐和其类似物)接触。在一些实施例中，扩增包含等温扩增。
在一些实施例中，进行方法，而无需在约2与50个之间的连续循环、在约2与40个之间的连续循环、在约2与30个之间的连续循环、在约2与25个之间的连续循环、在约2与20个之间的连续循环或在约2与15个之间的连续循环期间，使模板核酸分子经受极限变性条件。例如，方法可以包含在约2与50个之间的连续循环、在约2与40个之间的连续循环、在约2与30个之间的连续循环、在约2与25个之间的连续循环、在约2与20个之间的连续循环或在约2与15个之间的连续核酸合成循环，无需使核酸模板与化学变性剂接触或升高温度高于50℃或55℃。在一些实施例中，方法包含进行在约2与50个之间的连续循环、在约2与40个之间的连续循环、在约2与30个之间的连续循环、在约2与25个之间的连续循环、在约2与20个之间的连续循环或在约2与15个之间的连续核酸合成循环，而无需使核酸模板经受高于比模板或模板群体的实际或计算Tm(或模板或模板群体的实际或计算的平均Tm)低25℃、20℃、15℃、10℃、5℃、2℃或1℃的温度。连续核酸合成循环可以包含或可以不包含间插部分变性和/或引物延伸步骤。任选地，模板类复制的至少一个循环包含部分变性步骤、退火步骤和延伸步骤。在一些实施例中，预植入反应中的所连接的相同引物是长度在约5与100个核苷酸之间的腺苷或尿苷序列或腺苷与尿苷的某种组合，例如长度在约5与80个核苷酸之间、长度在约5与60个核苷酸之间、长度在约5与40个核苷酸之间、长度在约10与75个核苷酸之间、长度在约15与75个核苷酸之间或长度在约20与50个核苷酸之间。
在一些实施例中，预植入和/或模板化反应使得形成具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子群体的预植入的和/或模板化载体群体。在各个方面中，基本上单克隆模板核酸分子群体是在序列水平上具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性的模板核酸分子。在一些实施例中，与预植入的和/或模板化载体连接的基本上单克隆模板核酸分子的百分比是与其连接的模板核酸分子的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在各个实施例中，预植入的和/或模板化载体群体中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的载体具有在预植入和/或模板化反应期间连接的基本上单克隆核酸分子群体。在说明性实施例中，预植入的和/或模板化载体群体中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的载体具有在预植入和/或模板化反应期间连接的基本上单克隆核酸分子群体。
在一些实施例中，预植入反应可以产生：零个模板核酸分子与其连接的载体(空固体载体)、一种类型的模板核酸分子与其连接的其它预植入的载体和多于一种类型的模板核酸分子与其连接的其它预植入的载体。在本发明传授内容的任一个实施例中，与一种或多种预植入的载体连接的基本上单克隆模板核酸分子群体中的所连接的模板核酸分子的数量是预植入数量。在所公开的实施例中的任何实施例中，预植入数量是1个或在约1与150,000个之间的模板核酸分子，例如在约1与100,000个之间、在约1与75,000个之间、在约1与50,000个之间、在约1与25,000个之间、在约1与10,000个之间、在约1与5,000个之间或在约1与2,500个之间的模板核酸分子。在说明性实施例中，预植入数量是在约10与100,000个之间的模板核酸分子，例如在约10与75,000个之间、在约10与50,000个之间、在约10与25,000个之间、在约10与10,000个之间、在约10与5,000个之间或在约10与2,500个之间的模板核酸分子。
在一些实施例中，在预植入反应之后，大部分与载体连接的任何引物不与模板核酸分子结合。这些未结合引物可用于后续模板化反应中以用于进一步扩增模板核酸分子。例如，在预植入反应之后，与载体连接的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的引物通常不与模板核酸分子结合，或除了与载体连接的引物之一外，所有引物均不与模板核酸分子结合。
在一些实施例中，本公开总体上涉及方法、以及系统、组合物、试剂盒和设备，其中所述方法通常包含在预植入反应之后的模板化反应，其中进一步扩增预植入的载体上的模板核酸分子(在本文中被称作模板化反应)。模板化反应混合物不包含溶液中的另外模板核酸分子，使得在开始模板化反应之前，与一种或多种预植入的载体连接的模板核酸分子是模板化反应混合物中的模板核酸分子的主要来源或唯一来源。在说明性实施例中，在将其引入到模板化反应混合物中之前，在一种或多种预植入的载体上进行一次或多次洗涤。在一些实施例中，在预植入反应混合物结束时，溶液中小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.1％的模板核酸分子存在于模板化反应中。在本发明传授内容的任一个实施例中，模板化反应混合物中在开始模板化反应之前连接(已预植入)在一种或多种载体上的模板核酸分子的百分比，是反应混合物中的模板核酸分子的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。
在本发明传授内容的任一个实施例中，模板化反应通常是RPA反应。因此，关于上文关于预植入反应所论述的RPA反应的组分和条件的任何详情适用于模板化反应，不同之处在于模板核酸通常存在于预植入反应的初始反应混合物中，但不存在于模板化反应的初始反应混合物中。模板化反应混合物通常包含以下中的所有或一些：一种或多种预植入的固体载体，其包含所连接的基本上相同的第一引物群体，并且具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子例如一个模板分子；聚合酶；重组酶；任选的单链结合蛋白；任选的重组酶负载蛋白；任选的第二引物或反向引物，其可与固体载体连接，但在说明性实例中其是在溶液中；dNTP；ATP；缓冲液；和任选地磷酸肌酸和肌酸激酶中的一个或两个。可添加二价阳离子，如MgCl2或Mg(OAc)2，以启动反应。在各个实施例中，缓冲液包含拥挤药剂，如PEG；Tris缓冲液；和/或乙酸钾盐。模板核酸分子上的正向引物结合序列与正向引物的至少一部分互补或相同，且模板核酸分子上的任选的反向引物结合序列与反向引物的至少一部分互补或相同。模板化反应自身的反应混合物形成本发明的个别方面。在其它说明性实施例中，RPA模板化反应是大批等温扩增，或是在多孔固体载体的孔中进行(例如参见本文中进一步论述的预植入扩增反应)。
在一些实施例中，在抑制过早反应开始的条件下，预温育模板化反应混合物。例如，可从反应容器扣留模板化反应混合物中的一种或多种组分，以防止过早反应开始。为了启动反应，添加二价阳离子(例如，镁或锰)。在另一实例中，在抑制酶活性的温度下，预温育模板化反应混合物。在约0-15℃或约15-25℃下，预温育反应，以抑制过早反应开始。随后，可在较高温度下温育反应，以提高酶促活性。在说明性实施例中，在反应期间，不将模板化反应混合物暴露于高于42℃的温度。
由于模板化反应通常是RPA反应，所以其是在等温条件下进行。在一些实施例中，等温条件包含使反应在至少一些部分扩增(或整个扩增过程)期间经受约束在有限范围内的温度变化，包括例如等于或小于约10℃、或约5℃、或约1-5℃、或约0.1-1℃或小于约0.1℃的温度变化，或例如温度变化等于或小于或10℃、或5℃、或1-5℃、或0.1-1℃或小于0.1℃。等温反应的温度可通常在约15℃与65℃之间，例如在约15℃与55℃之间、在约15℃与45℃之间、在约15℃与37℃之间、在约30℃与60℃之间、在约40℃与60℃之间、在约55℃与60℃之间、在约35℃与45℃之间或在约37℃与42℃之间约15℃。在其它实施例中，不将预植入反应暴露于高于以下的温度：40℃、41℃、42℃、43℃、45℃或50℃。因此，在某些实施例中，不将反应混合物暴露于热启动条件。然而，应理解，在这些温度下使用的酶将需要组合优化，且可能需要改变酶，例如使用不同DNA聚合酶，如Bst而非Bsu。速率限制酶可以是聚合酶，其中高浓度或过量(即，非限制性)量的聚合酶或较低温度确保扩增反应基于聚合酶的动力学进行。
在本发明传授内容的任一个实施例中，模板化反应通常是RPA反应，其进行约0.25到240分钟，例如约0.25到120分钟、约0.25到60分钟、约0.25到30分钟、约0.25到15分钟、约0.25到10分钟、约0.25到7.5分钟、约0.25到5分钟或约2到5分钟。在说明性实施例中，进行模板化反应约10到120分钟，例如约10到60分钟、约10到45分钟、约10到30分钟或约10到20分钟。在其它说明性实施例中，进行模板化反应约20到60分钟，例如约20到50分钟、约20到40分钟、约20到35分钟或约20到30分钟。在一些实施例中，进行一个或多个模板化反应(或模板化反应在两个单独扩增的两个步骤中进行，例如两个单独的RPA反应)。在此类实施例中，单独的模板化或RPA反应可以进行相同或不同的时间量。例如，在包含两个单独的等温扩增反应(例如，RPA反应)的两步模板化方法中，第一反应可以进行约2.5分钟并且第二或后一反应可以进行约20分钟。
在本发明传授内容的任一个实施例中，模板化反应包含扩增一种或多种预植入的载体上的不同模板核酸分子的群体，以产生一种或多种模板化载体。例如，在一种或多种模板化反应之后，存在于模板化载体上的所连接的基本上单克隆模板核酸分子，可为存在于预植入载体上的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、25,000、50,000、100,000、250,000、500,000或106倍。在一些实施例中，在一个或多个模板化反应之后，可以有约100,000到106倍所连接的基本上单克隆模板核酸分子存在于模板化载体上，就像存在于预植入载体上一样。在说明性实施例中，存在于模板化载体上的所连接的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的载体上的至少10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、25,000或50,000倍。在一些实施例中，每个预植入载体上仅存在约1个或仅1个模板核酸分子。在一些实施例中，至少50,000、75,000或100,000个基本上单克隆模板核酸分子或在约25,000与1,000,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子存在于预植入的固体载体上，例如在约25,000与500,000个之间、在约25,000与250,000个之间、在约25,000与125,000个之间或在约25,000与100,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子存在于预植入的固体载体上。在模板化反应期间，一个或多个载体通常仍流体联通。
由于根据本发明传授内容，预植入反应可以是RPA反应和/或模板化过程可以包含超过一个RPA反应，所以方法包含依序RPA反应。例如，第一RPA反应可以是预植入反应，随后是第二RPA模板化反应。在另一个实例中，预植入反应可以是一个或多个PCR循环或非等温扩增循环，其后是一个或多个涉及RPA反应的模板化反应。RPA反应可以在相同条件下进行。然而，在说明性的实施例中，进行预植入RPA反应或初始模板RPA反应，然后是一个或多个后续模板RPA反应，使得与模板RPA反应或在初始模板RPA反应之后发生的模板化反应相比，发生的扩增循环更少。例如，预植入RPA反应可进行比模板化RPA反应短的时间，所述模板化RPA反应扩增与通过预植入的RPA反应所产生的预植入的固体载体连接的模板核酸分子。作为非限制性说明性实例，进行预植入RPA反应或初始模板RPA反应，然后是一个或多个模板RPA反应2到5分钟，以产生一种或多种例如预植入的载体或模板化载体群体，随后使其经受模板RPA反应，所述模板RPA反应进行10到60分钟。在这些非限制性说明性实例中的一些实例中，在模板化RPA反应之前，从预植入的固体载体洗掉包含模板核酸的反应组分。预植入和模板化反应中均包含预植入和模板化反应的所有其它反应组分，除模板核酸分子在溶液中以外。
在一些实施例中，在模板化反应之后，具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子的载体群体中的一个或多个载体上的位点的百分比是总扩增载体(即，总载体包含模板核酸分子的空、多克隆或基本上单克隆群体)的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在说明性实施例中，在模板化反应之后，具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子的载体群体中的一个或多个载体上的位点的百分比是从反应混合物回收的总扩增载体(即，总载体包含模板核酸分子的空、多克隆或基本上单克隆群体)的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，在模板化反应之后，具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子的载体群体中的一个或多个载体上的位点的百分比是从反应混合物回收的总载体(即，总载体包含未连接模板核酸分子的载体，和具有模板核酸分子的多克隆或基本上单克隆群体的载体)的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在说明性实施例中，在模板化反应之后，具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子的载体群体中的一个或多个载体上的位点的百分比是从反应混合物回收的总载体(即，总载体包含未连接模板核酸分子的载体，和具有模板核酸分子的多克隆或基本上单克隆群体的载体)的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施例中，引物的至少一部分与模板化反应混合物中的多核苷酸的至少一条链的一部分杂交。例如，引物的至少一部分可与和多核苷酸的一端或两端接合的核酸衔接子杂交。在一些实施例中，引物的至少一部分与多核苷酸的一部分或与核酸衔接子部分或完全互补。在一些实施例中，引物兼容适用于任何类型的测序平台，包含化学降解平台、链终止平台、合成测序平台、焦磷酸酯平台、大规模平行平台、离子敏感平台和单分子平台。
在一些实施例中，引物(例如第一、第二或第三引物)具有不与反应混合物中的多核苷酸的至少一条链的一部分杂交的5′或3′突出端尾部(带尾引物)。在一些实施例中，带尾引物具有任何长度，包含长度在约1与100个核苷酸之间，例如在约1与90之间、长度在约1与80个核苷酸之间、长度在约1与70个核苷酸之间、长度在约1与60个核苷酸之间、长度在约1与50个核苷酸之间、长度在约1与40个核苷酸之间或长度在约1与30个核苷酸之间。
所公开的方法使得产生扩增子群体，在某些实施例中，所述扩增子中的至少一些包含扩增的核酸群体。通过本公开的方法所产生的扩增群体适用于各种目的。在一些实施例中，所公开的方法(和相关组合物、系统和试剂盒)任选地包含对扩增的群体(扩增子)的进一步分析和/或操纵。例如，在一些实施例中，检测呈现某些期望特性的扩增子的数量且任选地进行量化。在一些实施例中，在扩增之后，对扩增产物进行测序。进行测序的扩增产物可以是呈基本上单克隆核酸群体的扩增子。在一些实施例中，所公开的方法包含扩增在不同位点处或在不同载体上的扩增子群体的单一成员。不同位点任选地形成位点阵列的一部分。在一些实施例中，位点阵列中的位点包含isFET阵列表面上的孔(反应室)。任选地，将待测序的核酸分子置于位点处。位点可以包含反应室或孔。位点可以是类似或相同位点阵列的一部分。阵列可包含表面上(例如，流动池、电子装置、电晶体芯片、反应室、通道和其类似物的表面)的二维位点阵列、或基质或其它介质(例如，固体、半固体、液体、流体和其类似物)内的三维位点阵列。在本发明传授内容的任一个实施例中，将位点可操作地耦接到传感器。所述方法包含使用传感器检测核苷酸并入。任选地，位点和传感器位于耦接到传感器的位点阵列中。
在本发明传授内容的任一个实施例中，在模板化反应之后，模板化载体具有至少50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或106个与各模板化载体连接的基本上单克隆模板核酸分子。在一些实施例中，在模板化反应之后，模板化载体具有在约50,000与500,000个之间的与各模板化载体连接的基本上单克隆模板核酸分子，例如在约50,000与400,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子、在约50,000与300,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子、在约50,000与200,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子或在约50,000与100,000个之间与各模板化载体连接的基本上单克隆模板核酸分子。在说明性实施例中，在模板化反应之后，模板化载体具有在约100,000与400,000个之间的与每个模板化载体连接的基本上单克隆模板核酸分子、在约100,000与300,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子、在约100,000与200,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子或在约150,000与300,000个之间的与每个模板化载体连接的基本上单克隆模板核酸分子。
在任一个所公开的实施例中，对于载体上的扩增的模板核酸分子进行测序。测序方法可包含所属领域中已知的任何适合的测序方法。在一些实施例中，在任何核酸测序工作流程中使用已根据本发明传授内容进行扩增的模板核酸分子，包含通过寡核苷酸探针接合和检测(例如SOLiDTM，来自生命技术公司(Life Technologies)，WO 2006/084131)进行的测序、探针-锚接合测序(例如Complete GenomicsTM或PolonatorTM)、合成测序(例如基因分析仪和HiSeqTM，来自Illumina)、焦磷酸酯测序(例如基因组测序仪FLX，来自454生命科学(Life Sciences))、离子敏感性测序(例如个性化基因组机器(PGMTM)、Ion ProtonTM测序仪、Ion S5和Ion S5 XL，全部均来自Ion TorrentTM Systems,Inc.)、单分子测序平台(例如HeliScopeTM，来自HelicosTM)、通过读取在碱基穿过纳米孔时的个别碱基的纳米孔测序(例如MinION，来自牛津纳米孔科技有限公司(Oxford Nanopore Technologies))、化学降解测序、毛细电泳法、凝胶电泳，和任何其它下一代、大规模平行测序平台。
在一些测序装置中，例如Ion Torrent Systems，在表面(例如半导体芯片)的微孔中进行测序反应。在包含反应室(如孔)的测序装置中使用珠粒载体的示例性实施例描绘于图8中。例如，参考图8，示例性测序装置416包含孔阵列418。将包含待测序的靶多核苷酸402的珠粒载体406与磁珠410连接，以形成设计成用于将具有连接的靶多核苷酸的珠粒载体引入到孔中的珠粒组合件412。在一些实施例中，通过双链多核苷酸连接，将磁珠410与珠粒载体406连接。在一些情况下，使连接子部分与珠粒载体406上的靶多核苷酸的一部分杂交。在这个实例中，连接子部分与磁珠410上的互补连接子部分连接。在另一实例中，用于形成与珠粒406连接的靶核酸的模板多核苷酸包含与磁珠410连接的连接子部分。在另一实例中，从修饰具有与磁珠410连接的连接子的引物，产生与和珠粒载体406连接的靶多核苷酸互补的模板多核苷酸。在一些实施例中，与多核苷酸连接的连接子部分和与磁珠连接的连接子部分彼此互补且彼此连接。在一个实例中，连接子部分具有亲和力并且包含：抗生物素蛋白部分与生物素部分；抗原表位与抗体或其免疫反应性片段；抗体与半抗原；地高辛部分(digoxigen moiety)与抗地高辛抗体；荧光素部分与抗荧光素抗体；操纵子与抑制子；核酸酶与核苷酸；凝集素与多醣；类固醇与类固醇结合蛋白；活性化合物与活性化合物受体；激素与激素受体；酶与底物；免疫球蛋白与蛋白A；或寡核苷酸或多核苷酸与其对应互补体。在具体实例中，附接于多核苷酸的连接子部分包含生物素，并且与磁珠连接的连接子部分包含链霉抗生物素蛋白。
如图8中所描绘的实施例中所说明，将多个珠粒载体404以及多个多核苷酸402(靶多核苷酸或模板多核苷酸)置于溶液中。将多个珠粒载体404活化或以其它方式制备以与多核苷酸402结合。例如，珠粒载体404包含与多个多核苷酸402中的一多核苷酸的一部分互补的寡核苷酸(捕获引物)。在另一个实例中，使用技术，如生物素-抗生蛋白链菌素结合，珠粒载体404被修饰具有靶多核苷酸402。在特定实施例中，使亲水性珠粒颗粒和多核苷酸经受聚合酶链式反应(PCR)扩增或重组酶聚合酶扩增(RPA)。模板多核苷酸将与捕获引物杂交。捕获引物延伸以形成包含与其连接的靶多核苷酸的珠粒406。其它珠粒可仍未与靶核酸连接，且其它模板多核苷酸可自由浮动于溶液中。多种方法可用于植入珠粒载体和被磁珠捕获。例如，转向图9的502处，模板多核苷酸(B*-A)被与珠粒载体510连接的捕获探针(B)捕获。与模板多核苷酸互补的捕获探针(B)延伸，由此产生B-A*。任选地，将所得双链多核苷酸变性，由此去除模板核酸(B*-A)且留下与珠粒载体510连接的单链(B-A*)。如图9的504处所图示，使修饰具有连接子部分(如生物素)的引物(A)与和珠粒载体510连接的核酸(B-A*)的部分(A*)杂交。任选地，引物(A)延伸，以形成互补核酸(A-B*)。如506处所示，将磁珠512引入到溶液中。磁珠512包含与和引物(A)连接的连接子部分互补的连接子。在这个实例中，与引物(A)连接的连接子是生物素，且磁珠512涂覆有抗生蛋白链菌素。磁珠512可用以清洁溶液和帮助将珠粒载体510和所连接的核酸(B-A*)置放到测序装置的孔中。如图9的508中所图示，在一些情况下，506的使双链多核苷酸变性，使得从与珠粒载体510连接的核酸(B-A*)脱杂交出核酸(B*-A)。因此，将珠粒载体510置放到测序装置的孔中，且所述珠粒载体具有单链靶核酸(B-A*)。可替代地，连接子修饰的探针(A)可能不延伸，以形成具有一定长度的多核苷酸(B-A*)的互补多核苷酸。可使用聚合酶链式反应(PCR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)或其它扩增反应来进行延伸反应。
转回图8，在使用磁珠来帮助将珠粒载体和所连接的核酸置放到测序装置的孔中的一实施例中，将珠粒组合件412涂覆在包含孔418的测序装置的基底416上。在一实例中，可向基底416施加磁场以将珠粒组合件412的磁珠410牵拉向孔418。珠粒载体406进入孔418。例如，磁体可平行于基底416的表面移动，由此使得将珠粒载体406置放于418孔中。使珠粒组合件412变性，以去除磁珠410，将珠粒载体406留在孔418中。例如，可使用热循环或离子性溶液使珠粒组合件412的杂交的双链DNA变性，以释放磁珠410和具有与磁珠410连接的连接子部分的模板多核苷酸。任选地，可以如在模板化反应中扩增靶多核苷酸406，同时在孔418中，提供具有靶多核苷酸的多个拷贝的珠粒载体414。具体地，珠粒414具有靶多核苷酸的单克隆群体。例如使用聚合酶链式反应(PCR)扩增、重组聚合酶扩增(RPA)或其组合，来进行此类扩增反应。在特定实施例中，酶(如聚合酶)存在、结合于或紧密靠近于颗粒或珠粒。在一实例中，聚合酶存在于溶液中或孔中以促进多核苷酸的复制。本文所描述的方法中可使用多种核酸聚合酶。在示例性实施例中，聚合酶可以包含可催化多核苷酸复制的酶、其片段或亚基。在另一个实施例中，聚合酶可以是天然存在的聚合酶、重组聚合酶、突变聚合酶、变异聚合酶、融合物或以其它方式工程改造的聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子或类似物、其衍生物或片段。尽管珠粒载体414的多核苷酸示出为在表面上，但多核苷酸可延伸在珠粒载体414内。具有相对于水的低浓度聚合物的水凝胶和亲水性颗粒可以包含珠粒载体414的内部上和整个中的多核苷酸区段，或多核苷酸可存在于孔和其它开口中。具体地，在一些实例中，珠粒载体414准许用于监测反应的酶、核苷酸、引物和反应产物扩散。每个颗粒大量多核苷酸产生更好的信号。
在一些实施例中，测序包含通过利用聚合酶进行的核苷酸并入，使模板核酸分子或扩增模板核酸分子延伸，或使与模板或扩增模板杂交的测序引物延伸。在一些实施例中，测序包含通过使模板或延伸引物与测序引物、聚合酶和至少一种类型的核苷酸接触，对与载体连接的模板或扩增模板进行测序。在一些实施例中，测序包含使模板或扩增模板或延伸引物与测序引物、聚合酶和与仅一种类型的不包含外来标记或链终止基团的核苷酸接触。在一些实施例中，使用与多核苷酸构筑体的任何部分(包含核酸衔接子或靶多核苷酸序列)杂交的至少一种测序引物，来进行测序反应。
返回到图8，在一个实例中，向孔418添加测序引物，或在放置于孔418中之前，将珠粒载体414预先暴露于引物。具体地，珠粒载体414包含结合的测序引物。测序引物和多核苷酸形成包含与测序引物杂交的多核苷酸(例如模板核酸)的核酸双螺旋。核酸双螺旋是至少部分地双链多核苷酸。向孔418提供酶和核苷酸以促进可检测的反应，如核苷酸并入。在一些实施例中，测序涉及检测核苷酸添加。检测核苷酸添加的方法包含荧光发射方法或离子检测方法。例如，向系统416提供一组荧光标记的核苷酸且将其迁移到孔418中。还向孔418提供激发能。当核苷酸被聚合酶捕获且添加到延伸引物的末端时，核苷酸标记发荧光，由此指示添加了哪种类型的核苷酸。在一替代实例中，依序馈入包含单一类型的核苷酸的溶液。响应于核苷酸添加，孔418的局部环境内的pH可改变。这种pH改变可以通过离子敏感性场效应晶体管(ISFET)检测。因此，pH改变可用于产生指示与颗粒410的多核苷酸互补的核苷酸的次序。
在基于离子的核酸测序的典型实施例中，通过检测通过聚合酶催化的延伸反应产生的氢离子的存在和/或浓度来检测核苷酸并入。在一个实施例中，可以将模板核酸分子，任选地预结合于测序引物和/或聚合酶的模板核酸分子，负载到反应室中，之后重复核苷酸添加循环且进行洗涤。在一些实施例中，此类模板作为基本上单克隆群体与载体(如颗粒、珠粒或类似物)连接，且将所述基本上单克隆群体负载到反应室中。
在循环的每个添加步骤中，斤当模板中的下一个碱基是溶液中所添加的核苷酸的互补碱基时，聚合酶通过并入所添加的核苷酸来延伸引物。如果模板核酸分子上存在一个互补碱基，那么一个并入；如果模板核酸分子上存在连续两个互补碱基，那么存在两个并入；如果三个，那么存在三个并入；等。在每个此类并入的情况下，存在所释放的氢离子，且模板释放氢离子群体共同地改变反应室的局部pH。氢离子的产生与模板中的连续互补碱基数量(以及具有引物和聚合酶的参与延伸反应的模板分子总数)单调相关。因此，当模板中存在许多连续相同互补碱基(即，均聚物区域)时，所产生的氢离子的数量和因此局部pH变化的幅值与连续相同互补碱基的数量成正比。如果模板中下一个碱基不与所添加的核苷酸互补，那么不会发生并入且不释放氢离子。在一些实施例中，在添加核苷酸的各个步骤之后，进行另外步骤，其中使用在预定pH下的无缓冲洗涤溶液来去除前述步骤的核苷酸以防止随后循环中的误并入。在一些实施例中，在添加核苷酸的每个步骤之后，进行另外步骤，其中用核苷酸破坏剂(如腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase))处理反应室以消除残留在腔室中的可能在随后循环中产生假延伸的任何残余核苷酸。
在特定实施例中，测序系统包含安置于离子性传感器(如场效应晶体管(FET)的传感器垫上的孔或多个孔。在一些实施例中，FET是FET阵列。FET或阵列可包含例如102、103、104、105、106、107或更多FET。在实施例中，系统包含负载到安置于离子性传感器(例如FET)的传感器垫上的一孔中的一个或多个聚合物颗粒，或安置于离子性传感器(例如FET)的传感器垫上的多个孔中的一个或多个聚合物颗粒。在实施例中，FET是chemFET或ISFET。“chemFET”或化学场效应晶体管包含充当化学传感器的场效应晶体管类型。chemFET具有MOSFET晶体管的结构类似物，其中栅极电极上的电荷通过化学方法施加。“ISFET”或离子敏感性场效应晶体管用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(如H+)改变时，通过晶体管的电流因此改变。在一些实施例中，在FET传感器阵列上制造一个或多个微流体结构，以提供生物学或化学反应的容纳或约束。例如，在一个实施例中，微流体结构被配置成安置于阵列的一个或多个传感器上方的一个或多个孔(或孔、或反应室、或反应孔，因为所述术语在本文中可互换使用)，使得其上安置既定孔的一个或多个传感器检测和测量既定孔中的分析物存在、水平或浓度。在实施例中，FET传感器和反应孔之间可存在1:1对应。
返回图8，在另一实例中，将孔阵列的孔418可操作地连接到测量装置。例如，对于荧光发射法，可将孔418可操作地耦接到光检测装置。在离子性检测的情况下，孔418的下表面可安置于离子性传感器(如场效应晶体管)的传感器垫上。
在一些实施例中，将不同类别的核苷酸依序添加到反应室，使得将各反应以一次一个地暴露于不同核苷酸。例如，按以下顺序添加核苷酸：dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dATP、dCTP、dGTP、dTTP等；其中各暴露之后是洗涤步骤。视所需序列信息长度而定，循环可以重复50次、100次、200次、300次、400次、500次、750次或更多次。
在一些实施例中，方法(和相关组合物、系统和试剂盒)包含任选地使用FET，检测在阵列的一位点处的一种或多种核苷酸并入副产物的存在。在一些实施例中，方法包含任选地使用FET，检测在至少一个反应室内发生的pH改变。在一些实施例中，所公开的方法进一步包含检测由于至少一个扩增循环所致的至少一个位点中的离子浓度的变化。
一种涉及通过检测核苷酸并入的离子性副产物测序的示例性系统是Ion TorrentPGMTM、ProtonTM或S5TM测序仪(赛默飞世尔科技公司)，其是通过检测作为核苷酸并入的副产物产生的氢离子来对核酸模板进行测序的离子类测序系统。通常，氢离子作为使用聚合酶的模板依赖性核酸合成期间发生的核苷酸并入的副产物释放。Ion Torrent PGMTM、ProtonTM或S5TM测序仪通过检测核苷酸并入的氢离子副产物来检测核苷酸并入。在一些实施例中，Ion Torrent PGMTM、ProtonTM或S5TM测序仪包含待测序的多个模板多核苷酸，各模板安置在阵列中的个别测序反应孔内。将阵列的孔各自耦接到检测作为核苷酸并入的副产物所产生的H+离子的释放或溶液pH改变的至少一个离子传感器。离子传感器包括耦接到感测H+离子的存在或溶液pH改变的离子敏感性检测层的场效应晶体管(FET)。离子传感器提供指示核苷酸并入的输出信号，其可表示为电压变化，其幅值与个别孔或反应室中的H+离子浓度相关。将不同核苷酸类型连续流入反应室，且可通过聚合酶以通过模板序列确定的次序并入到延伸引物(或聚合位点)中。例如，含有流控回路的测序系统通过入口连接到至少两个试剂储槽、废液储槽，和通过用于流体连通的流体路径连接到生物传感器。来自储槽的试剂通过多种方法(包含压力、泵(例如注射泵)、重力供给和类似方法)来驱动到流控回路，且通过阀的控制来选择。驱动来自流控回路的试剂通过从控制系统接受信号的阀。控制系统包含阀的控制器，其通过电连接产生用于打开和关闭的信号。控制系统还包含系统的其它组件的控制器，如通过电连接连接到其上的洗涤溶液阀和参考电极。各核苷酸并入伴随着反应孔中的H+离子释放，以及局部pH中的伴随改变。通过传感器的FET登记H+离子的释放，所述FET产生指示发生核苷酸并入的信号。在特定核苷酸流动期间未并入的核苷酸可能不产生信号。来自FET的信号的幅值也可与并入到延伸核酸分子中的特定类型的核苷酸的数量有关，由此准许解析均聚物区域。因此，在测序仪运行期间，多个核苷酸流入反应室中以及在多个孔或反应室中并入监测，准许仪器同时解析多个核酸模板的序列。
在一些实施例中，下游分析的方法包含对扩增子群体中的至少一些进行平行测序。任选地，对位于阵列的不同位点的多个模板/扩增模板/延伸第一引物进行平行测序。
在一些实施例中，测序包含使测序引物与至少两种不同的模板核酸分子或至少两种不同的基本上单克隆群体的核酸分子结合。在一些实施例中，测序包含使用聚合酶，将核苷酸并入到测序引物的3′OH上。任选地，并入包含形成至少一种核苷酸并入副产物。
在本公开的涉及将模板核酸分子分配到isFET阵列的孔中和后续在阵列的孔内部进行模板扩增的实施例中，在量化包含扩增产物的位点或孔的数量的扩增之后，进行任选的下游分析步骤。在一些实施例中，检测核酸扩增反应的产物，以便计数包含扩增模板的位点或孔的数量。在一些实施例中，在扩增之后，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的孔包含模板核酸分子的基本上单克隆群体。
在一些实施例中，将模板化载体分配到单独反应室(例如，孔阵列)中以用于测序。在一些实施例中，至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的反应室具有含模板核酸分子的基本上单克隆群体的模板化载体。在一些实施例中，约25％与95％之间的反应室具有含模板核酸分子的基本上单克隆群体的模板化载体，例如在约25％与85％之间、在约25％与75％之间、在约35％与95％之间、在约35％与85％之间、在约35％与75％之间、在约45％与95％之间、在约45％与85％之间、在约45％与75％之间、在约55％与95％之间、在约55％与85％之间、在约55％与75％之间、在约65％与95％之间、在约65％与85％之间、在约65％与75％之间、在约75％与95％之间、在约75％与85％或在约85％与95％之间的反应室具有含模板核酸分子的基本上单克隆群体的模板化载体。在一些实施例中，单独反应室是测序芯片上的孔。在一些实施例中，不大于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的孔产生低质量结果，其中通过测序方法确定低质量孔。
在各种实施例中，本文所描述的方法、系统和计算机可读媒体可以有利地用于处理和/或分析从电子或电荷类核酸测序获得的数据和信号。在电子或电荷类测序(如pH类测序)中，可以通过检测作为聚合酶催化的核苷酸延伸反应的天然副产物产生的离子(例如，氢离子)确定核苷酸并入事件。这可用于对模板核酸分子进行测序，所述模板核酸分子可以是例如所关注核酸序列的片段，且其可作为核酸分子的基本上单克隆群体直接或间接连接在载体(如颗粒、微粒、珠粒等)上。样品或模板核酸可可操作地与引物和聚合酶相连，且可经受重复循环或核苷酸添加的“流动”(其在本文中可称为“核苷酸流动”，由其可产生核苷酸并入)和洗涤。引物可与样品或模板结合，使得每当添加与模板中的下一碱基互补的核苷酸时，引物的3'端通过聚合酶延伸。然后，基于核苷酸流的已知序列并基于在每个核苷酸流期间指示离子浓度的化学传感器的实测输出信号，可以确定与化学传感器偶联的反应区中存在的样品核酸相关联的核苷酸的类型身份、序列和数量。
在用于产生本文提供的一个或多个基本上单克隆的模板核酸群体的方法的一些实施例中，产生足够数量的基本上单克隆或单克隆的模板核酸群体以产生至少6000万个序列读段，或至少7000万个序列读段，或至少8000万个序列读段，或至少9000万个序列读段，或约1亿个序列读段或至少1.2亿个序列读段，或至少1.4亿个序列读段或至少1.5亿个序列读段，在一台或多台Ion Torrent测序仪上长度至少为200-400个核苷酸。在用于产生本文提供的一个或多个基本上单克隆模板核酸群体的方法的一些实施例中，产生足够数量的基本上单克隆或单克隆的模板核酸群体以在一台或多台Ion Torrent测序仪上产生长度为约200到400或约300到400个核苷酸之间的介于约6000万到1亿个之间的序列读段。在用于产生本文提供的一个或多个基本上单克隆的模板核酸群体的方法的一些实施例中，产生足够数量的基本上单克隆或单克隆的模板核酸群体以在一个或多个Ion Torrent测序仪上产生长度在约100到300或约100到200个核苷酸之间的约1亿到1.5亿个序列读段。在用于产生本文提供的一种或多种基本上单克隆的模板核酸群体的方法的一些实施例中，产生足够数量的基本上单克隆或单克隆的模板核酸群体以在一个或多个Ion Torrent测序仪上产生至少100MB、200MB、300MB、400MB、500MB、750MB、1GB、2GB、5GB、10GB或15GB的测序读段。在模板化反应中，可产生足够数量的基本上单克隆或单克隆群体，以在Ion Torrent PGMTM 314、316或318测序仪上产生至少100MB、200MB、300MB、400MB、500MB、750MB、1GB或2GB的AQ20测序读段。关于相关高通量系统，可在单一扩增反应中产生足够数量的基本上单克隆或单克隆扩增子，以在Ion Torrent Proton、S5或S5XL测序仪上产生至少100MB、200MB、300MB、400MB、500MB、750MB、1GB、2GB、5GB、10GB或15GB的AQ20测序读段。如本文所用，术语“AQ20”和其变化形式是指一种测量Ion Torrent PGMTM测序仪中的测序准确性的特定方法。可关于Phred样Q评分测量准确性，所述Q评分在对数尺度上测量准确性：Q10＝90％，Q20＝99％，Q30＝99.9％，Q40＝99.99％和Q50＝99.999％。例如，在特定测序反应中，可以通过预测算法或通过与已知参考基因组的实际比对来计算准确性度量值。预测的质量评分(“Q”评分)可从查看输入信号的固有特性的算法导出且关于测序“读段”中所包含的既定单一碱基是否将比对获得极其准确的估计值。在一些实施例中，此类预测的质量评分适用于在下游比对之前过滤且去除较低质量读段。在一些实施例中，关于在对数尺度上测量准确性的Phred样Q评分报告准确性以使得：Q10＝90％，Q17＝98％，Q20＝99％，Q30＝99.9％，Q40＝99.99％和Q50＝99.999％。在一些实施例中，过滤从既定聚合酶反应获得的数据以仅测量聚合酶读段，其测量“N”个核苷酸或更长核苷酸且具有超过某一阈值的Q评分，例如Q10、Q17、Q100(在本文中被称作“NQ17”评分)。例如，100Q20评分可指示从给定反应获得的读段数量，其长度为至少100个核苷酸且Q评分为Q20(99％)或更大。类似地，200Q20评分可以指示长度为至少200个核苷酸且Q评分为Q20(99％)或更大的读段数量。
在一些实施例中，基于使用参考基因组序列的适当比对计算准确性，在本文中被称作“原始”准确性。与测量作为多个读段的结果的与共有序列的误差率的共有准确性相反，这是涉及测量与单一读段相关的“真实”每个碱基误差的单向准确性。原始准确性测量值可以在“AQ”评分(针对比对质量)方面报告。在一些实施例中，过滤从既定聚合酶反应获得的数据以仅测量聚合酶读段，其测量“N”个核苷酸或更长核苷酸，具有超过某一阈值的AQ评分，例如AQ10、AQ17、AQ100(在本文中被称作“NAQ17”评分)。例如，100AQ20评分可指示从既定聚合酶反应获得的读段的数量，其长度为至少100个核苷酸且AQ评分为AQ20(99％)或更大。类似地，200AQ20评分可指示长度为至少200个核苷酸且AQ评分为AQ20(99％)或更大的读段数量。
在一些实施例中，本公开提供了用于在预植入反应随后模板化反应中进行核酸扩增的试剂盒。本文所论述的组合物也服从试剂盒格式，其中引物和扩增组分可在同一容器中、单独容器中，且呈液体或脱水形式。试剂盒可包含用于进行扩增模板核酸分子的方法的说明书，所述方法包含用于下游测序方法的预植入反应。在一个实施例中，试剂盒提供用于核酸测序制备的说明书。
在一些实施例中，一种试剂盒，其包含至少两个容器，其中至少一个包含引物且其中至少一个包含重组酶。重组酶和引物可以处于相同或不同管中。在一些实施例中，至少一种引物与一种或多种载体连接。试剂盒可以进一步包含一种或多种预植入的固体载体。
在一些实施例中，包含重组酶的容器进一步包含一种或多种扩增试剂，其包含重组酶辅助蛋白、聚合酶、dNTP和缓冲液。在某些实施例中，试剂盒包含具有以下的一个或多个容器：uvsX重组酶、uvsY重组酶负载蛋白、gp32蛋白、Sau DNA聚合酶、dNTP、ATP、磷酸肌酸和肌酸激酶。
在一些实施例中，试剂盒包含以下的任何组合：任选地具有所连接的至少一种引物的群体的一种或多种固体载体、多核苷酸、重组酶、重组酶负载蛋白、单链结合蛋白(SSB)、聚合酶、核苷酸、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、杂交溶液、洗涤溶液、缓冲液和/或阳离子(例如二价阳离子)。试剂盒可包含这些组分中的所有或一些，通常是在至少两个单独容器中。试剂盒可以包含预植入反应混合物和/或模板化反应混合物的组分中的任何组分。
用于产生具有特异性序列的核酸模板或包含特异性序列的两个或更多个核酸模板的群体的方法
本文提供的方法、组合物、试剂盒、系统和装置的某些实施例包含用于产生具有特异性核苷酸序列的核酸模板的方法。在一个实施例中，一种用于产生具有特异性核苷酸序列的核酸模板的方法包含：(a)获得核酸分子群体，在所述核酸分子群体中，每个核酸包含在所述分子的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述分子的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列彼此不同，并且其中在所述群体中，所述核酸分子的所述第一核苷酸序列基本上相同并且所述核酸分子的所述第二核苷酸序列基本上相同；(b)在存在正向引物和反向引物的情况下，使所述核酸分子群体经受核酸扩增循环，其中所述正向引物包含与所述第一核苷酸序列基本上相同的寡核苷酸序列，所述反向引物包含与所述第二核苷酸序列的5'端的子序列互补的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在子序列的3'端处连接到不与所述第二核苷酸序列互补的第四核苷酸序列的；在存在正向和反向引物的情况下，使(b)的扩增循环的产物经受扩增循环以产生多种不同的核酸产物；其中所述反向引物包含与所述第二核苷酸序列的5'端互补的核苷酸序列但不含与所述第二核苷酸序列的3'端互补的核苷酸序列，并且所述产物中的仅一种产物包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在另一个实施例中，一种用于产生具有特异性核苷酸序列的核酸模板的方法包含：(a)获得含有核酸链的核酸，所述核酸链具有在所述核酸链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述核酸链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列和所述第二连续核苷酸序列彼此不同；(b)在存在第一引物和第二引物的情况下，使核酸经受核酸扩增循环，其中所述第一引物包含与第一连续核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列，并且所述第二引物包含：(i)与所述第二连续核苷酸序列在所述第二连续核苷酸序列的5'端处的部分互补的核苷酸序列；以及(ii)不与所述第二连续核苷酸序列互补并且与同所述第二连续核苷酸序列的所述部分互补的序列在所述互补序列的3'端处连接的第四核苷酸序列，并且所述第二引物不含有与第二连续核苷酸序列的3'端互补的核苷酸序列；以及(c)在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使(b)的核酸扩增循环的产物经受核酸扩增循环以产生多种不同的核酸产物，其中所述产物中的仅一种产物含有与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一些实施例中，所述方法进一步包括在存在第一引物和第二引物的情况下，使(c)的核酸扩增循环的产物经受一个或多个核酸扩增循环以产生含有与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的另外核酸产物。
在一些实施例中，用于产生具有特异性序列的两个或更多个核酸模板的群体的方法包含：(a)获得初始核酸群体，在所述初始核酸分子群体中，每个核酸含有核酸链，所述核酸链具有在所述核酸链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述核酸链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列和所述第二连续核苷酸序列彼此不同，并且其中在所述群体中，所述第一连续核苷酸序列基本上相同，并且在所述群体中，所述第二连续核苷酸序列基本上相同；(b)在存在第一引物和第二引物的情况下，使所述初始核酸群体经受核酸扩增循环，其中所述第一引物包含与所述第一连续核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列，并且所述第二引物包含：(i)与所述第二连续核苷酸序列在所述第二连续核苷酸序列的5'端处的部分互补的核苷酸序列；以及(ii)不与所述第二连续核苷酸序列互补并且与和所述第二连续核苷酸序列的所述部分互补的序列在所述互补序列的3'端处连接的第四核苷酸序列，并且所述第二引物不含与所述二连续核苷酸的序列的3'端互补的核苷酸序列；(c)在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使(b)的核酸扩增循环的产物经受核酸扩增循环以产生多种不同核酸产物，其中步骤(a)中的所述初始核酸群体中的每个单独核酸的核酸扩增的多种不同核酸产物中的仅一种核酸产物包含与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列，由此产生不同核酸的群体，其中每个核酸包含与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一些实施例中，所述方法进一步包括在存在第一引物和第二引物的情况下，使(c)的核酸扩增循环的产物经受一个或多个核酸扩增循环以产生含有与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的另外核酸产物。
在用于产生具有特异性核苷酸序列的核酸模板或具有特异性核苷酸序列的两个或更多个核酸模板的群体的方法的一些实施例中，正向引物或第一引物包含含有与其连接的修饰核苷酸。在一些实施例中，与经修饰的核苷酸的连接包含连接子部分，例如生物素。在一些实施例中，正向引物或第一引物包含与第一核苷酸序列基本上相同的3'端核苷酸序列、5'端核苷酸序列和位于3'端核苷酸序列与5'端核苷酸序列之间的不可复制部分。在其中正向引物或第一引物是包含在与第一核苷酸序列基本上相同的3'端核苷酸序列与5'端核苷酸序列之间的不可复制部分的正向引物或第一引物的实施例中，来自最终核酸扩增的包含与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的仅一种产物还包含在5'端处的包含不可复制部分和第一引物的5'端核苷酸序列的单链区域。在一些实施例中，所述方法进一步包含在退火条件下将最终扩增循环的产物的单链核酸与和第四核苷酸序列基本上相同的单链寡核苷酸组合或接触，由此将包含与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的所述产物与和所述第四核苷酸序列基本上相同的所述单链寡核苷酸杂交，以产生部分双链核酸。在一些实施例中，与第四核苷酸序列基本上相同的单链寡核苷酸与一个或多个或多个载体连接。在一些实施例中，所述载体是固体载体。在特定实施例中，所述载体是颗粒或珠粒。在一些实施例中，所述方法进一步包含使部分双链核酸的寡核苷酸部分的3'端延伸，由此通过合成包含与第四核苷酸序列基本上相同的并且具有与和其杂交的产物互补的核苷酸序列的单链寡核苷酸的核酸链产生延伸的双链核酸。在一些实施例中，包含与所述第四核苷酸序列基本上相同的所述单链寡核苷酸的所述核酸链，在所述链的5'端处，通过所述链的作为所述寡核苷酸序列的部分与载体连接。在一些实施例中，所述方法进一步包含通过收集载体和/或从未与载体结合的任何其它核酸和/或反应组分中去除其来分离与载体连接的核酸链。
在某些方面，提供了一种用于产生具有特异性核苷酸序列的核酸分子的方法，所述方法包括：获得核酸分子群体，在所述核酸分子群体中，每个分子包含核酸链，所述核酸链具有在所述分子的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述分子的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列和所述第二连续核苷酸序列彼此不同，并且其中在所述群体中，所述第一连续核苷酸序列基本上相同，并且在所述群体中，所述第二连续核苷酸二序列在群体中基本上相同；以及在存在一个或多个正向引物和反向引物的情况下，使所述核酸分子群体经受两个或更多个核酸扩增循环，所述一个或多个正向引物包括与所述第一连续核苷酸序列基本上相同的寡核苷酸序列，所述反向引物在3'端处被封端并且包括与所述第二连续核苷酸序列互补的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在所述寡核苷酸序列的5'端处连接到不与所述第二连续核苷酸序列互补的第四核苷酸序列，以产生核酸产物，其中基本上所有或所有产物包含与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一些实施例中，正向引物包含含有与其连接的修饰核苷酸。在一些实施例中，与经修饰核苷酸的连接包括连接子部分，例如生物素。在一些实施例中，所述方法进一步包含在退火条件下使扩增的产物的单链核酸暴露于与第四核苷酸序列基本上相同的单链寡核苷酸，由此将包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的所述产物的单链核酸与和所述第四核苷酸序列基本上相同的所述单链寡核苷酸杂交，以产生部分双链寡核苷酸结合产物。在一些实施例中，与第四核苷酸序列基本上相同的单链寡核苷酸与载体连接。在一些实施例中，所述载体是固体载体。在某些实施例中，所述载体是颗粒或珠粒。在一些实施例中，所述方法进一步包括使与包括同所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的所述产物杂交的所述寡核苷酸的3'端延伸，由此通过合成核酸链产生双链核酸，所述核酸链包括与所述第四核苷酸序列基本上相同的所述单链寡核苷酸并且具有与和其杂交的所述产物互补的核苷酸序列。在一些实施例中，所述方法进一步包括分离双链核酸的链。在一些实施例中，包括与所述第四核苷酸序列基本上相同的所述单链寡核苷酸的所述核酸链，在所述链的5'端处，通过所述链的所述寡核苷酸序列部分与载体连接。在一些实施例中，所述进一步包括通过从不与所述载体结合的任何其它核酸去除所述载体来分离与所述载体连接的所述核酸链。
用模板核酸预植入或植入载体的方法
本文提供的方法、组合物、试剂盒、系统和装置的某些实施例包含用模板核酸预植入或植入载体的方法。在一些实施例中，本文提供的预植入(或植入)方法包括本文所描述的用于产生具有特异性序列的核酸模板或包含特异性序列的两个或更多个核酸模板的群体的任何方法，其中一个或多个所述方法的产物例如通过杂交与载体连接，例如通过与载体上的引物杂交。
在用本文提供的用核酸预植入或植入载体的方法的一些实施例中，在存在具有捕获引物的一个或多个或多个载体的情况下，扩增一个或多个或多个靶多核苷酸。一种此类方法包含在存在载体的情况下，扩增靶核酸，所述靶核酸具有第一引物部分、靶部分和第二引物部分，所述载体具有捕获引物、与所述第一引物部分互补的连接子修饰的第一引物和具有与所述第二引物部分的至少一部分互补的部分的第二引物，所述第二引物具有与所述部分接合的捕获引物部分并且与所述捕获引物互补，其中使所述珠粒载体捕获引物延伸以包含所述靶核酸的序列。在一些实施例中，扩增包含进行两个或更多个、或三个聚合酶链式反应(PCR)循环。
在一个实施例中，用于预植入或植入载体的方法包含(a)获得含有核酸链的核酸，所述核酸链具有所述核酸链的5'端处的第一连续核苷酸序列，在所述核酸链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列；(b)在存在捕获引物的情况下，使核酸经受核酸扩增循环，其中捕获引物包含括与所述第二连续核苷酸序列互补的核苷酸序列并与载体连接；(c)在存在不与载体连接的捕获引物和包含与所述第一连续核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的第一引物的情况下，使(b)的核酸扩增产物经受核酸扩增循环。在一些实施例中，第一引物与连接子部分连接。
用于在载体上产生一种或多种模板核酸群体的方法和组合物
在一个方面，提供了模板化反应混合物，所述模板化反应混合物包括预植入的固体载体群体、核苷酸、重组酶和聚合酶，其中所述预植入的固体载体群体包括介于10与50,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子，所述模板核酸分子包括与其连接的第一引物，并且所述预植入的固体载体群体进一步包括所连接的未与模板核酸分子结合的第一引物，其中所述反应混合物不包括能够开始重组酶-聚合酶扩增反应的阳离子，并且其中所述反应混合物中至少95％的模板核酸分子与一种或多种预植入的固体载体连接。在一些实施例中，模板核酸分子包括具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在一些实施例中，所述基本上单克隆模板核酸分子包括将模板核酸分子与固体载体连接的具有20到50个相同核苷酸的近侧区段。在一些实施例中，所述基本上单克隆模板核酸分子在将模板核酸分子与固体载体连接的近侧区段处包括少于100个相同核苷酸。在一些实施例中，预植入的固体载体是预植入的珠粒。在一些实施例中，预植入的固体载体群体中的每个预植入的固体载体具有介于10与10,000个之间的与其连接的基本上单克隆模板核酸分子，并且其中所述一种或多种预植入的固体载体是珠粒。在一些实施例中，小于10％的每个预植入的固体载体上的所述基本上单克隆模板核酸分子包括将其与所述预植入的固体载体连接的50-100个相同核苷酸。在一些实施例中，模板化反应混合物进一步包括重组酶辅助蛋白。在一些实施例中，重组酶辅助蛋白是单链结合蛋白和/或重组酶负载蛋白。在一些实施例中，使用第一重组酶-聚合酶扩增(RPA)反应来产生预植入的固体载体。在一些实施例中，通过在35℃与45℃之间的温度下温育RPA反应混合物2到5分钟来进行第一RPA反应。在一些实施例中，所述模板化反应混合物进一步包括呈溶液形式的相同的第二引物群体，并且其中所述模板核酸分子在第一末端处或其附近包括所述第一引物的引物结合位点。在一些实施例中，反应混合物进一步包括能够开始重组酶-聚合酶扩增反应的阳离子。
本文提供的用于产生一种或多种模板化载体的方法的一个实施例包括：(a)通过将一种或多种预植入的载体、核苷酸、重组酶和聚合酶组合来形成模板化反应混合物，其中所述一种或多种预植入的载体包括所连接的基本上相同的第一引物群体并且具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子，其中所述一种或多种预植入的载体形成于单独的预植入反应中，所述单独的预植入反应在模板化反应前进行并且包括预植入反应混合物，其中基本上单克隆模板核酸分子包括包含第一引物的近侧区段，并且所述第一引物不包括100或更多个相同核苷酸，其中所述近侧区段将模板核酸区段与预植入的载体连接，并且其中预植入的载体进一步包括与预植入的载体连接且未与模板核酸分子结合的所连接的第一引物，其中所述模板化反应混合物进一步包括基本上相同的可溶第二引物群体，并且其中所述模板核酸分子包括在与近侧区段相对的末端处或其附近的所述第二引物的引物结合位点；和(b)通过向模板化反应混合物添加阳离子和在等温条件下温育反应混合物至少10分钟进行模板化反应，以在模板化反应中扩增模板核酸分子来产生一种或多种模板化载体，其中所述模板化载体中的每个模板化载体包括至少100,000个基本上单克隆模板核酸分子，并且其中当开始模板化反应时，模板核酸分子不以溶液形式存在于反应混合物中，由此产生一种或多种模板化载体。
本文提供的用于产生一种或多种模板化载体的方法的一个实施例包括：(a)产生包括所连接的相同的第一引物群体的预植入的载体群体，其中在预植入条件下使用预植入反应混合物产生预植入的载体，并且其中所述预植入的载体中的每个预植入的载体具有介于10与100,000个之间的包括与其连接的第一引物的基本上单克隆模板核酸分子并且包括所连接的第一引物，所述所连接的第一引物与预植入的载体连接并且不与模板核酸分子结合；(b)通过将预植入的载体群体、核苷酸、重组酶、聚合酶和呈溶液形式的未与任何底物连接的相同的第二引物群体组合来形成模板化反应混合物，其中所述模板核酸分子包括在与包括所述第一引物的近侧区段相对的末端处或其附近的所述第二引物的引物结合位点；(c)通过向所述模板化反应混合物添加阳离子开始模板化反应，其中当开始模板化反应时，模板核酸分子不以溶液形式存在于反应混合物中；以及(d)在等温条件下温育已开始的模板化反应混合物至少10分钟，以在模板化反应中扩增基本上单克隆模板核酸分子来产生一种或多种模板化载体，所述一种或多种模板化载体包括的模板化载体上的所连接的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的载体上的至少10倍，由此产生一种或多种模板化载体。
在本文提供的用于产生一种或多种模板化载体的方法的另一个实施例包括：(a)通过在预植入反应条件下，温育预植入反应混合物进行预植入反应，以产生预植入的载体群体，所述预植入反应混合物包括模板核酸分子群体和包括所连接的相同的第一引物群体的载体群体，其中所述预植入反应条件包括在等温条件下温育所述预植入反应混合物，并且其中所述预植入的载体各自具有介于10与100,000个之间的与其连接的基本上单克隆核酸分子，和/或所述预植入反应条件包括在等温条件下温育所述预植入反应混合物2到5分钟，其中所述预植入的载体包括：(i)通过所述第一引物与所述载体连接的模板核酸分子的基本上单克隆群体，和(ii)所连接的第一引物，其与所述预植入的固体载体连接并且不与模板核酸分子结合；(b)通过使重组酶-聚合酶扩增(RPA)反应混合物中包含一种或多种预植入的载体形成模板化反应混合物，其中模板核酸分子不与不包含在所述模板化反应混合物中的所述预植入的载体缔合，其中所述模板化反应混合物进一步包括呈溶液形式的不与任何底物连接的相同的第二引物群体，并且其中所述模板核酸分子包括在与包括所述第一引物的近侧区段相对的末端处或其附近的所述第二引物的引物结合位点；(c)通过向所述模板化反应混合物添加阳离子开始模板化反应；以及(d)在等温条件下温育已开始的模板化反应混合物至少10分钟，以在模板化反应中扩增模板核酸分子来产生一种或多种模板化载体，所述一种或多种模板化载体包括的模板化载体上的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的载体上的至少10倍，由此产生一种或多种模板化载体。
在本文提供的用于产生一种或多种模板化载体的方法的一些实施例中，所述模板核酸分子包括具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在一些实施例中，小于10％的每个模板化固体载体上的所述基本上单克隆模板核酸分子包括将其与所述模板化载体连接的50-100个相同核苷酸。在一些实施例中，所述基本上单克隆模板核酸分子在将模板核酸分子与载体连接的所述近侧区段处包括少于100个相同核苷酸。例如，所述基本上单克隆模板核酸分子可以包括将模板核酸分子与载体连接的具有20到50个相同核苷酸的近侧区段。在所述方法的一些实施例中，预植入反应混合物进一步包括呈溶液形式的相同的第二引物群体，并且模板核酸分子在第一末端处或其附近包括第一引物的引物结合位点。在所述方法的一些实施例中，所述方法中使用的预植入的载体群体的每个预植入的载体具有介于10与50,000个之间或介于10与10,000个之间的与其连接的基本上单克隆模板核酸分子并且预植入的载体群体是珠粒。在一些实施例中，在所述方法中使用的与各预植入的固体载体连接的基本上单克隆模板核酸分子包括至少70％与各预植入的固体载体连接的所有模板核酸分子。在所述方法的一些实施例中，存在于模板化载体上的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预植入的载体上的基本上单克隆模板核酸分子的至少100倍。在所述方法的一些实施例中，所述预植入反应条件包括在等温条件下温育所述预植入反应混合物2到5分钟。在一些实施例中，使用第一重组酶-聚合酶扩增(RPA)反应产生预植入的载体，并且模板化反应是所述方法中的第二RPA反应。在一些实施例中，通过在35℃与45℃之间的温度下，温育RPA反应混合物2到5分钟，来进行第一RPA反应。在所述方法的一些实施例中，所述方法中的预植入反应混合物和/或模板化反应混合物进一步包括重组酶辅助蛋白，例如单链结合蛋白和/或重组酶负载蛋白。在所述方法的一些实施例中，在35℃与45℃之间的温度下，温育模板化反应混合物和/或预植入混合物。在所述方法的一些实施例中，模板化反应混合物是温育介于10与60分钟之间的模板化反应混合物。在本文提供的用于产生一种或多种模板化载体的方法的实施例中的任何实施例中，所述方法可以进一步包括在一个或多个模板化载体上对模板核酸分子进行测序。例如，在一些实施例中，模板化载体是模板化珠粒并且测序包括在进行测序反应之前将模板化珠粒分布在第二载体的孔中。在所述方法的一些实施例中，当所述固体载体是在测序晶片的孔内时，所述测序是对所述一种或多种模板化固体载体上的模板核酸分子进行，并且其中小于5％的所述孔确定为用于所述测序的低质量孔。在一些实施例中，所述第二固体载体中的至少40％或至少50％的所述孔包括包含模板核酸分子的基本上单克隆群体的一个模板化珠粒。在一些实施例中，至少60％的所述模板化珠粒包括基本上单克隆模板核酸分子。
在本发明的另一方面，提供了一种在载体上产生一个或多个模板核酸群体的方法，所述方法包括：(a)获得核酸群体，其中每个核酸包含核酸链，所述核酸链包括在所述核酸链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述核酸链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列不同；其中在所述核酸群体中，所述第一连续核苷酸序列基本上相同并且在所述核酸群体中，所述第二核苷酸序列基本上相同，并且定位于所述第一连续核苷酸与所述第二连续核苷酸序列之间的核苷酸序列在核酸群体中不同；并且其中所述第一连续核苷酸序列包括与其连接的第一连接子部分；b)在退火条件下使核酸群体的单链与载体接触，以通过与第二个连续核苷酸序列的杂交产生连接有单链核酸的载体，其中载体包括多个引物寡核苷酸，所述引物寡核苷酸具有与固定在其上的连续核苷酸的第二序列互补的核苷酸序列；c)延伸与核酸链杂交的载体的固定引物寡核苷酸以产生连接到载体的双链核酸；d)使结合有核酸的载体与包括第二连接部分的磁珠接触，第一连接部分连接至所述磁珠以产生固体载体-磁珠组合件；e)向磁珠组合件施加磁场，由此将磁珠组合件与不包含磁珠的元件分开；f)从磁珠上释放连接有核酸的载体；g)将其上连接有核酸的载体与磁珠结合，其中载体上的核酸与磁珠连接；h)将连接有核酸的载体和磁珠递送到包括孔的表面，并向表面施加磁场，由此将具有与其连接的核酸的载体负载到单独的孔中；以及i)在溶液中存在第一引物的情况下，使与孔中载体相连的核酸进行等温核酸扩增，其中第一引物包括与第一连续核苷酸序列基本上相同的寡核苷酸序列。在一些实施例中，(b)中的固体载体的数量超过核酸分子的数量至少2倍。在一些实施例中，(b)中的固体载体的数量超过核酸分子的数量至少5倍。在一些实施例中，所述方法进一步包括在溶液中存在第一引物的情况下，使连接到来自步骤(i)的孔中的载体的核酸进行第二等温核酸扩增。在一些实施例中，第二次扩增产生的核酸连接到载体上比在(i)中扩增后连接的核酸多至少100,000倍。在一些实施例中，第二次扩增产生的核酸比(i)中扩增后所连接的与固体载体连接的核酸多至少1,000,000倍。在一些实施例中，步骤(i)的等温核酸扩增和/或连接到步骤(i)的载体的核酸的任何后续等温核酸扩增是重组酶-聚合酶扩增。在一些实施例中，步骤(i)中溶液中的第一引物包括与其连接的连接子部分或亲和部分。
在一些实施例中，步骤(i)的扩增是在组合物存在下进行的，所述组合物结合或连接至连接至溶液中的第一引物的连接子部分或亲和部分以及连接至步骤(i)中的载体的核酸，进行第二等温核酸扩增，所述扩增不包含结合或连接于连接至溶液中的第一引物的连接子部分或亲和部分的组合物。在一些实施例中，步骤(i)的扩增和/或连接到步骤(i)的载体的核酸的任何后续等温核酸扩增在扩散限制性药剂例如聚合物的存在下进行，例如，纤维素或甲基纤维素。在一些实施例中，所述方法进一步包括使与载体连接的经扩增核酸经受核酸测序。在一些实施例中，所述测序方法产生至少6000万个长度为至少300个核苷酸的序列读段。在一些实施例中，所述测序方法产生至少8000万个长度为至少100个核苷酸的序列读段。在一些实施例中，所述测序方法产生至少8000万个长度在约100与约400个核苷酸之间的序列读段。
在另一方面，提供了一种在固体载体上产生一个或多个模板核酸群体的方法，所述方法包括：a)获得核酸群体，在所述核酸群体中，每个核酸包含核酸链，所述核酸链包括在所述核酸链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述核酸链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列和所述第二连续核苷酸序列不同，并且所述第一连续核苷酸序列基本上相同，并且所述第二连续核苷酸序列基本上相同；b)在退火条件下使核酸群体的单链与载体接触以通过与第二连续核苷酸序列杂交产生具有与其连接的单链核酸的固体载体，其中载体包括多个引物寡核苷酸，其具有与固定在其上的连续核苷酸的第二序列互补的核苷酸序列，并且任选地延伸载体的固定引物，所述引物与核酸链杂交以产生与载体连接的双链核酸；c)将连接有核酸的载体转移到包括孔的表面，由此将连接有核酸的载体负载到单独的孔中；d)在存在呈溶液形式的第一引物的情况下，使与固体载体连接的核酸分子经受等温核酸扩增，其中(1)第一引物包括与第一连续核苷酸序列基本上相同的寡核苷酸序列，并被修饰以包括与其连接的连接子部分或亲和力部分，以及(2)扩增是在存在与连接子部分或亲和力部分连接的组合物的情况下进行的，所述连接子部分或亲和力部分与第一引物连接；e)停止(d)的扩增并从孔中去除连接至第一引物的连接子部分或亲和部分的组合物；f)在存在呈形式的第一引物的情况下，使与孔中载体相连的核酸进行等温核酸扩增，其中所述第一引物包括与第一连续核苷酸序列基本上相同的寡核苷酸序列。在所述方法的一些实施例中，步骤f)中的扩增产生的核酸是步骤(d)的扩增后所连接的与固体载体连接的核酸的至少1000倍，或至少是100,000倍的核酸或至少是1,000,000倍的核酸。在一些实施例中，(b)中的载体的数量超过核酸分子的数量至少2倍。在一些实施例中，(b)中的载体的数量超过核酸分子的数量至少5倍。在一些实施例中，步骤(d)和/或步骤(f)的等温核酸扩增是重组酶-聚合酶扩增。在一些实施例中，步骤(d)和/或步骤(f)的扩增在扩散限制性药剂，例如聚合物，例如纤维素或甲基纤维素的存在下进行。在一些实施例中，所述方法进一步包括使与载体连接的经扩增核酸经受核酸测序。在一些实施例中，所述测序方法产生至少6000万个长度为至少300个核苷酸的序列读段。在一些实施例中，所述测序方法产生至少8000万个长度为至少100个核苷酸的序列读段。在一些实施例中，所述测序方法产生至少8000万个长度在约100与约400个核苷酸之间的序列读段。
在载体上产生多个基本上单克隆模板核酸群体的方法
本文提供的方法、组合物、试剂盒、系统和装置的某些实施例包含用于在载体上产生多个基本上单克隆模板核酸群体的方法。在一个实施例中，一种用于在载体上产生多个基本上单克隆模板核酸群体的方法包含(a)获得多个载体，其中每个载体具有固定到所述载体的多个单链寡核苷酸引物和与所述载体连接的模板核酸，其中所述模板核酸包括所连接的核酸链，所述所连接的核酸链在所述链的一端处具有连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列是寡核苷酸引物序列；(b)在(i)在存在呈溶液形式的与连接子部分或亲和力部分连接的第一引物和(ii)与所述连接子部分或亲和力部分连接或结合的组合物的情况下，使与所述多个载体连接的所述模板核酸经受第一等温核酸扩增，其中所述第一引物包括与所述所连接的核酸链的在所述链的与具有连续核苷酸序列的末端相对的末端处的引物结合序列互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸序列是所述寡核苷酸引物序列；以及(c)在存在呈溶液形式的所述第一引物并且不存在与连接子部分连接的组合物的情况下，使与多个载体连接的模板核酸经受第二等温核酸扩增，由此产生与所述载体连接的基本上单克隆的模板核酸群体，其中存在于所述第二等温核酸扩增中的第一引物与连接子部分(或亲和力部分)连接或不与连接子部分(或亲和力部分)连接。在所述方法的一些实施例中，所述第一等温核酸扩增和所述第二等温核酸扩增在单一反应混合物的单一连续液相内进行。在所述方法的一些实施例中，(i)步骤(a)的多个载体中的每个载体具有与其连接的不同的双链模板核酸，(ii)每个双链模板核酸包括与载体直接连接的所连接链和与所连接链杂交的链，以及(iii)每个双链模板核酸包括在与所连接的链杂交的链上的连接子部分，或者具有在与所连接的链杂交的链上的单链突出端核苷酸序列。在一些实施例中，所述方法进一步包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前：(1)通过使步骤(a)的所述多个载体与和所述连接子部分(或亲和力部分)结合的捕获部分或与和所述单链突出端核苷酸序列和捕获部分互补的寡核苷酸接触来形成多个所捕获载体，其中所述与所述单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸与所述单链突出端杂交并且包括与所述捕获部分结合的连接子部分；(2)收集所述所捕获载体；以及(3)将连接有模板核酸的所述载体与所述捕获部分或与所述与所述单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸分开。在所述方法的一些实施例中，步骤(1)的所述多个载体中的每个载体具有与所述载体连接的仅一个双链模板核酸。
在一个实施例中，一种用于在载体上产生多个基本上单克隆模板核酸群体的方法包含(a)获得多个载体，其中每个载体具有固定到所述载体的多个单链寡核苷酸引物和与所述载体连接的模板核酸，其中所述模板核酸包括所连接的核酸链，所述所连接的核酸链在所述链的一端处具有连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列是寡核苷酸引物序列；(b)在(i)在存在呈溶液形式的与连接子部分或亲和力部分连接的第一引物和(ii)与所述连接子部分或亲和力部分连接或结合的组合物的情况下，使与所述多个载体连接的所述模板核酸经受第一等温核酸扩增，其中所述第一引物包括与所述所连接的核酸链的在所述链的与具有连续核苷酸序列的末端相对的末端处的引物结合序列互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸序列是所述寡核苷酸引物序列；以及(c)在存在呈溶液形式的所述第一引物并且不存在与连接子部分连接的组合物的情况下，使与多个载体连接的模板核酸经受第二等温核酸扩增，由此产生与所述载体连接的基本上单克隆的模板核酸群体，其中存在于所述第二等温核酸扩增中的第一引物与连接子部分(或亲和力部分)连接或不与连接子部分(或亲和力部分)连接。在一些实施例中，步骤(a)的所述多个载体是通过包括以下的方法获得的：(A)获得初始核酸群体，在所述初始核酸群体中，每个核酸包括核酸链，所述核酸链具有在所述链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列和所述第二连续核苷酸序列彼此不同，并且其中在所述群体中，所述核酸群体的所述第一连续核苷酸序列基本上相同并且所述核酸群体的所述第二连续核苷酸序列基本上相同；(B)在存在第一引物和第二引物的情况下，使所述核酸群体经受核酸扩增循环，其中：所述第一引物包括与所述第一连续核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列，并且与连接子部分或亲和力部分连接，所述第二引物包括：(i)与所述第二连续核苷酸序列在所述第二连续核苷酸序列的5'端处的部分互补的核苷酸序列；以及(ii)不与所述第二连续核苷酸序列互补并且与和所述第二连续核苷酸序列的所述部分互补的序列在所述互补序列的3'端处连接的第四核苷酸序列，并且其中所述第二引物不含与所述第二连续核苷酸序列的3'端互补的核苷酸序列；(C)在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使步骤(B)的扩增循环的产物经受核酸扩增循环以产生多种不同的核酸产物，其中步骤(A)中的所述初始核酸群体中的每个单独核酸的核酸扩增的所述多种不同核酸产物中的仅一种核酸产物包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列以及连接子部分或亲和力部分；(D)在退火条件下使步骤(C)的所述核酸产物的单链与固定有与所述第四核苷酸序列基本上相同的多个单链寡核苷酸引物的载体接触，由此将步骤(C)的包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列以及连接子部分或亲和力部分的所述核酸产物的单链与所固定的单链寡核苷酸引物杂交以产生与包括部分双链核酸的模板核酸连接的载体；以及(E)通过模板依赖性核酸合成使所述部分双链核酸的所述所固定的寡核苷酸引物部分的3'端延伸以产生包括连接子部分或亲和力部分的延伸双链核酸，由此产生连接有模板核酸的多个载体，其中每个载体具有与其连接的不同双链模板核酸。在一些实施例中，在步骤(D)中与步骤(C)的所述核酸产物的所述单链接触的载体数量超过核酸产物数量至少2倍、或至少2.5倍、或至少3倍、或至少3.5倍、或至少4倍、或至少4.5倍、或至少5倍、或至少5.5倍、或至少6倍、或至少6.5倍、或至少7倍、或至少7.5倍、或至少10倍、或至少15倍、或至少20倍或至少25倍。在一些实施例中，此方法进一步包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前：(1)通过使步骤(a)的使用包括步骤(A)-(E)的方法获得的所述多个载体与和所述连接子部分(或亲和力部分)结合的捕获部分接触来形成多个所捕获载体；(2)收集所述所捕获载体；以及(3)使连接有模板核酸的所述载体与所述捕获部分分开。在一些实施例中，所述捕获部分与珠粒或颗粒连接，并且在收集所述所捕获载体之后，通过解离所述双链模板核酸的链，将连接有模板核酸的所述载体与和所述珠粒或颗粒连接的所述捕获部分分开，由此产生与单链模板核酸连接的多个载体。在一些实施例中，在将连接到多个载体的模板核酸进行第一等温核酸扩增之前，将连接到单链核酸的载体转移到包括孔的表面并负载到单独的孔中。在一些实施例中，将载体转移到包括孔的表面，在方法中，包括将连接有核酸的载体与磁珠组合，其中载体上的核酸不与磁珠连接，并将连接有核酸和磁珠的组合载体递送到包括孔的表面，并且向所述表面施加磁场，由此将具有与其连接的核酸的载体负载到单独的孔中。
在一个实施例中，一种用于在载体上产生多个基本上单克隆模板核酸群体的方法包含(a)获得多个载体，其中每个载体具有固定到所述载体的多个单链寡核苷酸引物和与所述载体连接的模板核酸，其中所述模板核酸包括所连接的核酸链，所述所连接的核酸链在所述链的一端处具有连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列是寡核苷酸引物序列；(b)在(i)在存在呈溶液形式的与连接子部分或亲和力部分连接的第一引物和(ii)与所述连接子部分或亲和力部分连接或结合的组合物的情况下，使与所述多个载体连接的所述模板核酸经受第一等温核酸扩增，其中所述第一引物包括与所述所连接的核酸链的在所述链的与具有连续核苷酸序列的末端相对的末端处的引物结合序列互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸序列是所述寡核苷酸引物序列；以及(c)在存在呈溶液形式的所述第一引物并且不存在与连接子部分连接的组合物的情况下，使与多个载体连接的模板核酸经受第二等温核酸扩增，由此产生与所述载体连接的基本上单克隆的模板核酸群体，其中存在于所述第二等温核酸扩增中的第一引物与连接子部分(或亲和力部分)连接或不与连接子部分(或亲和力部分)连接。在一些实施例中，步骤(a)的所述多个载体是通过包括以下的方法获得的：(A)获得初始核酸分子群体，在所述初始核酸分子群体中，每个核酸包括核酸链，所述核酸链具有在所述链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列彼此不同，并且其中在所述群体中，所述核酸分子群体的所述第一核苷酸序列基本上相同并且所述核酸分子群体的所述第二核苷酸序列基本上相同；(B)在存在第一引物和第二引物的情况下，使所述核酸分子群体经受核酸扩增循环，其中：第一引物包括与第一核苷酸序列基本上相同的3'端核苷酸序列、5'端核苷酸序列和定位于3'端核苷酸序列与5'端核苷酸序列之间的不可复制部分，所述第二引物包括(i)在第二核苷酸序列的5'端处与第二核苷酸序列的一部分互补的核苷酸序列和(ii)与第二核苷酸序列不互补的并且与第二核苷酸序列的所述部分互补的序列在互补序列的3'端连接的第四个核苷酸序列，并且其中第二引物不含有与第二核苷酸序列的3'端互补的核苷酸序列；(C)在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使步骤(B)的扩增循环的产物经受核酸扩增循环以产生多种不同的核酸产物，其中来自步骤(A)中的所述初始核酸分子群体中的每个单独核酸分子的核酸扩增的所述多种不同核酸产物中的仅一种核酸产物包括在3'端处具有与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的链和在5'端处的单链区域，所述单链区域包含所述不可复制部分和所述第一引物的5'端核苷酸序列；(D)在退火条件下使步骤(C)的所述核酸产物的单链与固定有与所述第四核苷酸序列基本上相同的多个单链寡核苷酸引物的载体接触，由此将步骤(C)的包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的所述核酸产物的单链与和所述第四核苷酸序列基本上相同的所述单链寡核苷酸杂交以产生与包括部分双链核酸的模板核酸连接的载体；以及(E)通过模板依赖性核酸合成使所述部分双链核酸的所固定的寡核苷酸引物部分的3'端延伸以产生延伸双链核酸，其中所述所固定的寡核苷酸引物部分的延伸继续到延伸链杂交的存在于所述模板链上的所述不可复制部分的点，并且然后中断，导致部分双链核酸含有包含所述第一引物的所述5'端核苷酸序列的单链突出端核苷酸序列，由此产生连接有模板核酸的多个载体，其中每个载体具有与其连接的不同的部分双链模板核酸。在此方法的一些实施例中，第一引物的5'端核苷酸序列和第一引物的3'端核苷酸序列至少基本上彼此互补。在一些实施例中，此方法进一步包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前：(1)通过接触步骤(a)的多个载体形成多个捕获载体，所述多个载体具有含有单链突出端核苷酸序列的部分双链模板核酸，所述单链突出端核苷酸序列包含与其连接的第一引物的5'端核苷酸序列，所述多个载体使用包括步骤(A)-(E)的方法用与单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸和捕获部分获得，其中与单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸与单链突出端杂交，并且其中与单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸通过与单链突出端核苷酸序列杂交形成杂交体，并包含捕获部分结合的连接子部分，由此形成多个捕获载体；(2)收集所述所捕获载体；以及(3)将连接有模板核酸的所述载体与和所述单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸分开。在一些实施例中，其中使用包括步骤(A)-(E)的方法获得具有含有单链突出端核苷酸序列的部分双链模板核酸的载体，所述单链突出端核苷酸序列包含与其连接的第一引物的5'端核苷酸序列，其中第一引物的5'端核苷酸序列和第一引物的3'端核苷酸序列至少基本上彼此互补，多个载体与和单链突出端核苷酸互补的寡核苷酸和捕获部分的接触在第一引物的5'端核苷酸序列和第一引物的3'端核苷酸序列彼此不杂交的条件下进行。在一些实施例中，在与和所述单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸接触之后，连接有部分双链模板核酸的所述多个载体与捕获部分接触，并且与所述捕获部分的接触在所述第一引物的所述5'端核苷酸序列和所述第一引物的所述3'端核苷酸序列能够彼此杂交的条件下进行。在一些实施例中，所述捕获部分与珠粒或颗粒连接，并且在收集所述所捕获载体之后，通过解离所述单链突出端核苷酸序列和与所述单链突出端核苷酸互补的所述寡核苷酸的杂交物的链，将所述连接有模板核酸的所述多个载体与和所述珠粒或颗粒连接的所述捕获部分分开，由此产生与含有单链突出端核苷酸序列的部分双链模板核酸连接的多个载体。在一些实施例中，在所述第一等温核酸扩增之前，将所述与含有单链突出端核苷酸序列的部分双链模板核酸连接的载体转移到包括孔的表面并且负载到单独的孔中。在一些实施例中，将载体转移到包括孔的表面，在方法中，包括将连接有核酸的载体与磁珠组合，其中载体上的核酸不与磁珠连接，并将连接有核酸和磁珠的组合载体递送到包括孔的表面，并且向所述表面施加磁场，由此将具有与其连接的核酸的载体负载到单独的孔中。
一种用于核酸分析的装置的制备方法
在另一方面，提供了一种制备用于核酸分析的装置的方法，所述方法包括：产生包含捕获序列部分、模板部分和用连接子部分修饰的引物部分的模板核酸；在具有与模板核酸的捕获序列部分互补的多个捕获引物的珠粒载体上捕获模板核酸，所述捕获引物与模板核酸的捕获序列部分杂交；将捕获的模板核酸连接到具有第二连接子部分的磁珠以形成珠粒组合件，第二连接子部分连接到第一连接子部分；并且使用磁场将珠粒组合件负载到测序装置的孔中。在一些实施例中，所述方法进一步包括使与所述模板核酸互补的所述捕获引物延伸，以形成与所述珠粒载体连接的序列靶核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使所述模板核酸和所述序列靶核酸变性，以从所述珠粒载体释放所述磁珠。在某些实施例中，变性包含酶促变性。在某些实施例中，变性包含在离子溶液存在下变性。在一些实施例中，所述方法进一步包括从测序装置洗涤磁珠。在一些实施例中，所述方法进一步包括扩增所述序列靶核酸，以在所述孔中的所述珠粒载体上形成序列靶核酸群体。在一些实施例中，扩增包含进行重组酶聚合酶扩增(RPA)。在一些实施例中，在第一时段进行RPA包含进行RPA，洗涤和在第二时段进行RPA，所述第一时段短于所述第二时段。在一些实施例中，产生包含使与靶核酸互补的连接子修饰的引物延伸。在某些实施例中，产生包括：在存在珠粒载体的情况下，扩增靶核酸，所述靶核酸具有第一引物部分、靶部分和第二引物部分，所述珠粒载体具有捕获引物、与所述第一引物部分互补的连接子修饰的第一引物和具有与所述第二引物部分的至少一部分互补的部分的第二引物，所述第二引物具有与所述部分接合的捕获引物部分并且与所述捕获引物互补，其中使所述珠粒载体捕获引物延伸以包含所述靶核酸的序列。在一些实施例中，扩增包含进行三个聚合酶链式反应(PCR)循环。
在另一方面，提供了一种制备测序装置的方法，所述方法包括：产生包含捕获序列部分、模板部分和引物部分的模板核酸；在与捕获序列部分互补的捕获引物偶联的珠粒载体上捕获模板核酸，捕获引物与模板核酸的捕获序列部分杂交；延伸与模板核酸互补的捕获引物以形成与模板核酸互补并杂交的靶核酸；使变性以分离杂交的模板核酸和靶核酸；将连接子修饰的引物与珠粒载体上的靶核酸杂交，连接子修饰的引物包含连接子部分；延伸与靶核酸互补的连接子修饰引物；将磁珠偶联到连接子部分，磁珠具有连接到连接子部分的第二连接子部分；并且使用磁场将珠粒载体沉积到测序装置的孔中。在一些实施例中，所述方法进一步包括使所述模板核酸和所述序列靶核酸变性，以从所述珠粒载体释放所述磁珠。在一些实施例中，变性包含酶促变性。在一些实施例中，变性包含在离子溶液存在下变性。在一些实施例中，所述方法进一步包括从测序装置洗涤磁珠。在一些实施例中，所述方法进一步包括扩增所述序列靶核酸，以在所述孔中的所述珠粒载体上形成序列靶核酸群体。在一些实施例中，扩增包含进行重组酶聚合酶扩增(RPA)。在一些实施例中，在第一时段进行RPA包含进行RPA，洗涤和在第二时段进行RPA，所述第一时段短于所述第二时段。在一些实施例中，产生包含使与靶核酸互补的连接子修饰的引物延伸。在一些实施例中，延伸包含进行聚合酶链式反应(PCR)。
提出以下实例以便提供所属领域的一般技术人员如何使用本发明传授内容的实施例的完整公开内容和描述，且并不打算限制本公开的范围，它们也不打算表示以下实例是所执行的所有或仅有实验。已努力确保关于所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应当考虑到一些实验性误差和偏差。除非另外指示，否则份数是按体积计的份数，且温度是以摄氏度为单位。应理解，可以在不改变实例意图说明的基本方面的情况下，对所描述的方法进行改变。
实例
实例1.在大批等温扩增之前，用单一循环PCR，预植入P1离子球形颗粒(ISP)
这个实例提供了一种在等温扩增以用于下游下一代测序之前预植入具有单克隆模板的ISP的方法。这些预植入的ISP在等温扩增步骤期间在溶液中不需要另外模板，且能够产生产生比不具有预植入的模板的ISP(非模板对照或“NTC”)更好的测序结果的模板。对具有正向P1衔接子的Ion Torrent ISP(“P1 ISP”)预植入不同拷贝数的单克隆模板，且在大批等温扩增中扩增(“Bulk IA”)。将预植入的ISP与无模板对照(“NTC”)ISP进行比较，所述无模板对照ISP在模板化反应期间而非在模板化反应之前的预植入反应期间具有所添加的相同模板多核苷酸。使用各种度量，比较不同扩增反应产生的测序结果。
产生模板核酸分子
使用来自Oncomine聚焦测定(OFA)(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)的PCR引物1、12和13，从基因组DNA扩增DNA。在第二带尾PCR的10个循环期间，向扩增子中，添加促进与植入反应中使用的溶液中的所固定引物B和引物A结合的衔接子。扩增产生3个模板：OFA 1AB，19.2ng/μl(148nM)；OFA 12AB，15.6ng/μl(100nM)；以及OFA 13 AB，17.2ng/μl(76nM)。
预植入反应
制备OFA 1AB、OFA 12AB和OFA 13AB模板的稀释液，且用于在预植入反应中产生单独预植入的P1 ISP。预植入反应包含6.67μl具有固定的引物B的P1 ISP(400,000,000ISP)、88.33μl 1X铂HiFi混合物(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)和5μl适当的模板稀释液，以产生期望数量的基本上单克隆模板分子(对于P1 ISP，拷贝数为70,665和4,170)。将ISP预植入反应混合物置于热循环仪中以进行98℃的变性步骤2分钟，随后98℃持续25秒和56℃持续10分钟，以产生预植入的ISP。为了检查ISP的相对大小，将1μl各预植入的P1ISP稀释于999μl退火缓冲液(Ion PGMTM Hi-QTM查看测序溶液(View SequencingSolution)，(产品号A30275))中，且使用Guava easyCyte流式细胞仪(马萨诸塞州比尔里卡EMD密理博)分析。也分析在不存在结合的模板下，NTC P1 ISP的相对大小。
在总体积1ml的OneTouch Wash Solution洗涤缓冲液中，洗涤残留的预植入的P1ISP两次。在第一次洗涤之后，在>21,000g下离心样品8分钟，且去除上清液，留下约100μl。在第二次洗涤和离心之后，去除上清液，留下约50μl样品于管中。随后，样品用300μl新鲜制备的熔脱溶液(melt off solution)(125mM NaOH，0.1％Tween 20)处理，且在室温下温育5分钟之前充分地涡旋。随后，这些样品用无核酸酶(nuclease-free；NF)的H2O洗涤三次，最终体积为1ml。在每一次洗涤之后，在>21,000g下离心样品8分钟，且去除上清液，留下约100μl。为了检查在最后一次洗涤之后预植入的P1 ISP的大小，将1μl各预植入的P1 ISP稀释于99μl退火缓冲液中，且使用Guava easyCyte流式细胞仪分析。也分析在不存在结合的模板下，NTC P1 ISP的相对大小。
确定预植入的P1 ISP上的拷贝数量
基于在洗涤之后来自Guava easyCyte流式细胞仪的样品计数，制备预植入的P1ISP的稀释液，得到50,000、5,000、500或50ISP/μl。这些稀释液如下用于qPCR反应中：10μlFast SYBR(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)、0.2μl 10μM截短的PCR A引物(5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TC-3′；SEQ ID NO:2)、0.2μl 10μM截短的PCR B引物(5′-CCTATC CCC TGT GTG CCT TG-3′；SEQ ID NO:3)、2μl预植入的P1 ISP和7.6μl NF H2O。将反应混合物置于实时PCR仪中以进行95℃变性步骤20秒，随后40个循环(95℃持续3秒和60℃持续30秒)。将各qPCR反应的Ct与具有已知分子数量的qPCR反应的Ct值进行比较，以计算各ISP上的单克隆模板的拷贝数。将具有相同的预植入的模板量的样品合并，以获得各组每ISP的平均拷贝数。
模板化反应
将具有相同的各单克隆模板的拷贝数的预植入的P1 ISP合并，即将已预植入有70个OFA 1AB、OFA 12AB或OFA 13AB拷贝的P1 ISP全部合并，和类似地将预植入有665个模板拷贝的P1 ISP合并，以及将预植入有4,170个模板拷贝的P1 ISP合并。将预植入的P1ISP(100μl，含有约375,000,000个预植入的P1 ISP)的池与4μl引物混合物S(Ion PGMTMTemplate IA 500试剂盒，赛默飞世尔科技公司)合并于不与任何底物连接的溶液中，其中模板核酸分子包含在与近侧区段相对的末端处或其附近的第二引物的引物结合位点)和146ISP稀释缓冲，两个均来自Ion PGMTM模板IA 500。将NTC P1 ISP(100μl，含有375,000,000个ISP)与4μl引物混合物S、131μl ISP稀释缓冲液和三个5μl文库等分试样合并。两个Two Ion PGMTM Template IA(等温扩增)沉淀物各自用720μl复水缓冲液复水，涡旋和短暂旋转。脱水的模板IA沉淀物含有T7聚合酶、uvsX重组酶、uvsY重组酶负载蛋白、gp32蛋白、Bsu DNA聚合酶、dNTP、ATP、硫氧还蛋白、磷酸肌酸和肌酸激酶。在试剂盒(管2)供应的120μL复水缓冲液(25mM Tris，pH 8.3；5mM DTT；3mM dNTP；3.5625％海藻糖；0.1mg/ml肌酸激酶；1.1375mg/ml Twist gp32；0.4mg/ml UvsX；0.1mg/ml UvsY；0.25mU/ul PPi酶；0.02mg/mlSau Pol；0.03063mg/ml T7 Dbl Exo-Pol；0.0225mg/ml硫氧还蛋白(5×)；1.425％PEG 35)中，将来自TwistAmpTM基础试剂盒的四个沉淀物复水。涡旋且旋转重组酶溶液，随后冰冻。向预植入的P1 ISP和NTC ISP的各池中，添加360μl复水的沉淀物溶液。将溶液充分地涡旋且短暂旋转。在40℃下进行模板化反应30分钟。为了终止模板化反应，添加650μl 100mMEDTA，涡旋溶液，且短暂旋转管。
富集模板化ISP
使用MyOne珠粒(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)来富集模板化ISP。简言之，将各终止的模板化反应分成2管，且向各管中添加100μl MyOne珠粒。在室温下旋转管15分钟，旋转，且置于磁性管架上。在珠粒充分集结之后，去除上清液且丢弃。随后，每管使用500μl 3mM SDS溶液，将类似样品合并，使得各类似样品组具有总共1ml 3mM SDS。充分地涡旋管，短暂旋转，且将其置于磁性管架上2分钟。去除上清液，且从磁性管架移出管。珠粒用200μl熔出溶液(125mM NaOH和0.1％Tween 20)再悬浮，充分地涡旋且短暂旋转。在2分钟室温温育之后，将珠粒溶液置于磁性管架上2分钟，并且将上清液转移到新的0.2ml管。在最大速度下旋转管8分钟，并且去除上清液，留下约10-15μl溶液。向模板化ISP中添加90μl水，并且去除2μl以用于在Guava easyCyte流式细胞仪上进行分析。在15,000rcf下旋转管5分钟，且去除上清液，留下10μl含有模板化ISP的溶液。向ISP中添加20μl的100％PBST和20μl测序引物，且涡旋管并短暂旋转。根据制造商的说明书，使用Ion Torrent PITM测序HiQ 200试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司)，使测序引物退火。
测序
根据制造商的说明书，使用Ion Torrent PITM测序HiQ 200试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司)，在Ion Torrent PGM上进行标准测序反应。通过Torrent软件集分析测序信号，以确定这些ISP的扩增子内存在的序列。
结果
在Bulk IA之前对P1 ISP预植入单克隆模板产生比无预植入(即，NTC P1 ISP)的类似反应更好的测序度量值。此外，预植入有较多单克隆模板拷贝的P1 ISP，至多4170(这个实例中所测试的最大数量)，比预植入有较少拷贝的ISP具有更好的测序度量值。例如，读段长度频率分布图说明，预植入的样品具有较少的短长度读段(图1A-1D)。此外，所负载的ISP和来自这些负载的ISP的可使用读段的百分比，均随着预植入到ISP上拷贝数提高而增加(图2A-2B)。总读段和读段长度的平均值与中值也随着预植入的拷贝数增加(图2C-2D)。测序的阴性度量值以拷贝数依赖性方式随着预植入而降低。例如，空孔和低质量孔的百分比随着预植入的P1 ISP而降低(图2E-2F)。总的来说，这个实验表明，P1 ISP可在Bulk IA之前预植入单克隆模板，以得到下一代测序的显著改进。
实例2.用单个PCR循环预植入ISP，随后等温扩增
如在前述实例中，这个实例提供了一种在等温扩增(模板化反应)以用于下游下一代测序之前，对ISP预植入单克隆模板的方法。然而，在这个实例所公开的方法中，在将预植入的ISP分配到Ion Torrent芯片的孔中之后，进行模板化反应。将预植入的ISP与无模板对照(“NTC”)ISP进行比较，所述无模板对照ISP在模板化反应期间而非在模板化反应之前和在预植入反应期间具有相同模板多核苷酸。使用各种度量，比较不同扩增反应产生的测序结果。
预植入反应
因此，对具有P1衔接子的ISP预植入OFA 1AB、OFA 12AB或OFA 13AB模板核酸分子，如实例1中所提供的。在预植入之后，洗涤预植入的ISP且计数，如实例1中所提供。将具有相同的各单克隆模板的拷贝数的预植入的ISP合并，即将已预植入有82个OFA1AB、OFA 12AB或OFA13AB拷贝的ISP全部合并，和类似地将预植入有775个模板拷贝的ISP合并，以及将预植入有5,400个模板拷贝的ISP合并。
盒负载
Ion Torrent 541芯片用100μl 100mM NaOH洗涤60秒，用200μl无核酸酶水冲洗，用200μl异丙醇冲洗且抽吸干燥。为了负载芯片，涡旋ISP(500,000,000个NTC ISP或合并、预植入的ISP)，用退火缓冲液(Ion PITM Hi-QTM测序200试剂盒，离子激流公司(IonTorrent))补到45μl，且通过负载通口注射到处理的芯片中。在1424rcf下离心芯片2分钟。将1ml泡沫(将980μl 50％退火缓冲液，与20μl 10％Triton X-100合并，吸取1ml空气在其中，且通过移液管进一步混合泡沫5秒)注射到芯片中，且抽吸过量的泡沫。将200μl 60％退火缓冲液/40％异丙醇冲洗溶液注射到芯片，且抽吸芯片到干燥。芯片用200μl退火缓冲液冲洗，且将芯片真空干燥。对于具有预植入的ISP的芯片，向芯片中添加40μl PBST，且用35μl PBST填充各通口。对于具有NTC ISP的芯片，向110μl退火缓冲液中添加5μl 100pM文库(等份OFA 1AB、OFA12AB和OFA 13AB)，以制备文库混合物。向芯片中添加40μl文库混合物，用35μl文库混合物填充各通口。将芯片置于热循环仪上，且循环一次(在95℃下1分钟，随后37℃2分钟，随后4℃)。芯片用200μl退火缓冲液冲洗一次且保留为湿润的。
模板化反应
Ion PGMTM模板IA沉淀物用871μl的Ion PGMTM复水缓冲液复水，充分地涡旋，并且短暂旋转。对各芯片注射40μl沉淀物IA溶液，且从出口抽吸置换的退火缓冲液。向负载通口中添加20μl沉淀物IA溶液，并且在1424rcf下旋转芯片2分钟。为了活化沉淀物IA溶液，将218.2μl Ion PGMTM启动溶液与8μl引物A合并，并且添加到沉淀物IA溶液中。涡旋活化的沉淀物IA溶液且短暂旋转。向各芯片中，注射60μl活化的沉淀物IA溶液，且抽吸置换的流体。各芯片将另外35μl沉淀物IA溶液添加各通口。将芯片置于设定为40℃的热循环仪上，封盖，且温育15分钟。芯片用200μl 0.5M EDTA真空冲洗，且抽吸干燥。芯片用200μl退火缓冲液真空冲洗，且抽吸干燥。芯片用200μl 1％SDS真空冲洗两次，且抽吸干燥。芯片用200μl冲洗溶液(50％异丙醇/50％退火缓冲液)真空冲洗，且抽吸干燥。随后，芯片用200μl退火缓冲液冲洗，且抽吸干燥。向各芯片中，将40μl引物混合物(250μl测序引物和250μl退火缓冲液)注射到流动池中，且向各通口中添加35μl引物混合物。将芯片置于热循环仪上，且循环一次(在95℃下2分钟，随后37℃2分钟，随后4℃)。芯片用200μl退火缓冲液冲洗一次且抽吸。向各芯片中添加60μl酶混合物(60μl退火缓冲液和6μl PSP4酶)，且温育5分钟。将芯片真空干燥，且紧接着添加100μl退火缓冲液。将芯片负载到Ion Proton系统上用于测序。
测序
Ion Proton System用Hi-Q 200材料启动，且使用400个流动(flows)进行测序。
结果
对ISP预植入单克隆模板，且随后将预植入的ISP负载到Ion Torrent测序芯片上，比NTC ISP产生更好的测序度量值，其具有连接的单克隆模板且在一个反应中扩增。所负载的ISP的百分比增加，其中82个模板拷贝预植入到ISP上，但较高水平的预植入将所负载的ISP的百分比降低低于NTC ISP(图3A)。可使用读段的百分比随着预植入的ISP而增加(图3B)。在总读段方面，预植入的ISP相对于NTC ISP也具有至多9倍增加，且在读段长度的平均值、中值和众数方面，大于2倍增加(图3C-3D)。所有预植入的ISP均显示较低的低质量孔百分比和无模板孔百分比(图3E-3F)。这个实例表明，可在其中在分配在Ion Torrent芯片的孔内的ISP上进行模板化反应的方法中，对ISP预植入单克隆模板核酸分子，以实现测序数据改进。
实例3.在RPA反应中对ISP预植入复合文库
如在前述实例中，这个实例提供了一种预植入ISP的方法。然而，在这个实例中所公开的方法中，使用短RPA反应而非单个PCR循环来完成模板化反应。此外，在IonTorrent541芯片的孔中的ISP上进行反应。在RPA预植入反应之后，在进行第二次等温RPA反应(模板化反应)之前，洗涤预植入的ISP。将用预植入ISP随后模板化反应(其中在模板化反应之前洗掉模板核酸分子)的两步法产生的ISP，与经受单次RPA扩增而不洗涤的ISP(其在整个温育的反应混合物中具有相同模板多核苷酸)进行比较。一步和两步反应中的每一个进行四个重复，且进行比较。
预植入反应
因此，向Ion Torrent芯片的孔中添加500,000,000个ISP，且对所述ISP预植入在片段(A-B、A-AV5或A-AV6)的末端具有衔接子的大肠杆菌基因组的130碱基对片段的160,000,000个拷贝，并且预植入反应混合物中的其它组分(与实例2中的相同)。衔接子包含引物结合位点，所述引物结合位点促进与和ISP连接的所固定的通用引物(引物B、AV5或AV6)、在预植入和模板化反应期间溶液中的通用引物(引物A)、和测序引物结合。简言之，向芯片中添加40μl预植入反应混合物，用35μl预植入反应混合物填充各通口。在40℃下温育预植入反应2.5分钟，并且然后通过用200μl 0.5M EDTA真空冲洗终止，并且然后抽吸干燥。用退火缓冲液洗涤预植入的ISP。
如上组装NTC ISP的模板化反应，且在40℃温育下温育30分钟。在模板化反应之后，以与预植入的ISP相同的方式，处理NTC ISP。
模板化反应
如实例2中，进行模板化反应。在40℃下温育用于预植入的ISP的模板化反应30分钟。
测序
如在实例1中，使用Ion Torrent PITM测序HiQ 200试剂盒进行测序。
结果
对ISP预植入模板核酸分子且随后在第二反应(即，模板化反应)中使所连接的模板核酸分子进行模板化反应，产生比无单独预植入反应所产生的模板化ISP多平均7,750,000个读段。此外，在预植入反应的情况下，其它测序度量值更好。对于一步和两步(单独预植入反应，随后模板化反应)反应来说，平均AQ20评分分别是109和110.75，平均AQ20GBases评分分别是2.375和3.075。这个实例表明，预植入有模板核酸分子的复合群体的ISP改进对于模板所产生的测序数据。
实例4.在大批等温扩增中对ISP预植入复合文库
如在前述实例中，这个实例提供了一种对ISP预植入模板核酸分子的复合群体的方法。然而，这个实例提供了一种利用较长温育的预植入RPA反应。在预植入反应之后，在进行第二次等温RPA反应(即，模板化反应)之前，使用MyOne磁珠富集预植入的ISP。在模板化反应之后，在针对下游测序进行处理之前，使用MyOne磁珠进一步富集模板化ISP。将用预植入ISP随后模板化反应(其中在模板化反应之前洗掉模板核酸分子)的两步法产生的ISP，与经受单次RPA扩增而不洗涤的ISP(其在整个温育的反应混合物中具有相同模板多核苷酸)进行比较。
预植入反应
进行用A′引物与封端的P1引物的混合物的预植入反应(参见图4)。将包括50μl的退火缓冲液(Ion PGMTM Hi-QTM查看测序溶液，(产品号A30275))、引物混合物S(3种A′引物的混合物：5′–ACG ATC CAT CTC ATC CCT GCG TGT C–3′(SEQ ID NO:4)；5′–TCC ATA AGGTCA GTA ACG ATC CAT CTC ATC CCT GCG TGT–3′(SEQ ID NO:5)；以及5′–/5-Bio/TCC ATAAGG TCA GTA ACG ATC CAT CTC ATC CCT GCG TGT–3′(SEQ ID NO:5))、封端的融合引物(5′–CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CCA CTA CGC CTC CGC TTT CCT CTCTAT GGA A/3-Phos/–3′；SEQ ID NO:6)、7.5×106ISP和35pM来自人类基因组文库的130bp模板核酸分子的管，进行涡旋，短暂旋转并且在98℃下温育2分钟，并且随后在37℃下温育2分钟。添加另一等分试样的退火缓冲液(75μl)，且将溶液转移到新管中且涡旋。Ion PGMTM模板IA沉淀物(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)用720μl Ion PGMTM模板IA复水缓冲液复水，充分地混合，并且存储在冰上。将375μl复水的Ion PGMTM模板IA沉淀物与先前制备的含有文库的125μl溶液合并，涡旋，随后放回冰上。将混合物与150μl预混合的IonPGMTM模板IA启动溶液合并，充分地混合以形成预植入反应混合物，短暂离心，且置于冰上。为了开始预植入反应，将管置于40℃加热块中，且随后在40℃下温育4分钟，以产生预植入的ISP。通过添加650μl 100mM EDTA随后涡旋，来终止预植入反应。
如上组装对照反应，其中差异如下：使用5.625×106个ISP和11pM模板，并且维持40℃温育30分钟。以与预植入的样品相同的方式处理这些对照反应，之后富集模板化ISP。
富集预植入的ISP
使用MyOne珠粒(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)来富集预植入的ISP。简言之，向具有预植入的ISP的管中添加100μl MyOne珠粒，且涡旋。旋转管10分钟，旋转，并且置于磁性管架上。在珠粒充分集结之后，去除上清液且丢弃。使用磁性管架，用1ml IonPGMTM洗涤溶液洗涤珠粒一次。随后，使用磁性管架，用1ml 3mM SDS溶液洗涤珠粒一次，且将上清液转移到新管中以用于进一步处理。在21,000rcf下旋转来自SDS洗涤的上清液8分钟，且去除上清液，留下大约50μl。预植入的ISP用150μl熔出溶液(125mM NaOH和0.1％Tween20)再悬浮，且转移到新管中。在15,000rcf下旋转管5分钟，且去除上清液，留下10μl溶液。向预植入的ISP中添加190μl水，且去除2μl以用于在Guava easyCyte流式细胞仪上进行分析。在15,000rcf下旋转管5分钟，且去除上清液，留下10μl含有残留的预植入的ISP的溶液。
模板化反应
向含有预植入的ISP的管中添加111μl退火缓冲液和4μl引物混合物S。来回吸取预植入的ISP以合并，且将全部溶液转移到新管中。向管中添加375μl复水的Ion PGMTM模板IA沉淀物，且涡旋管，短暂旋转且置于冰上。将反应混合物与150μl预混合的Ion PGMTM模板IA启动溶液合并，充分地混合，短暂离心，且置于冰上。为了开始模板化反应，将管置于40℃加热块中，且随后在40℃下温育30分钟。通过添加650μl 100mM EDTA随后涡旋，来终止模板化反应。
富集模板化ISP
使用MyOne珠粒(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)来富集模板化ISP。简言之，向具有模板化ISP的管中添加100μl MyOne珠粒，且涡旋。旋转管10分钟，旋转，并且置于磁性管架上。在珠粒充分集结之后，去除上清液且丢弃。使用磁性管架，用1ml Ion PGMTM洗涤溶液洗涤珠粒一次。向管中添加200μl熔出溶液(125mM NaOH和0.1％Tween 20)，混合，且将溶液转移到新管中。在15,000rcf下旋转管5分钟，且去除上清液。用200μl水洗涤ISP，且去除2μl以用于在Guava easyCyte流式细胞仪上进行分析。随后，根据Proton Hi-Q用户指南，处理ISP以用于测序。
结果
对ISP预植入模板核酸分子且随后在第二反应(即，模板化反应)中使所连接的模板核酸分子进行模板化反应，产生比无单独预植入反应所产生的模板化ISP多平均9,167,000个读段。此外，在预植入反应的情况下，其它测序度量值更好。对于一步和两步反应(单独预植入反应，随后模板化反应)来说，平均AQ20评分分别是105和110.25，平均AQ20GBases评分分别是2.889和4.267。这个实例表明，预植入有模板核酸分子的复合群体的ISP产生对于模板改进的测序数据。
实例5
植入
在PCR管中，将文库(2.4B拷贝)与生物素TPCRA(1uL，100uM)混合。管用1×铂HiFi混合物填充到20uL。在热循环仪上使管热循环一次(在98℃下2分钟，在37℃下5分钟，在54℃下5分钟)。向管中添加60亿珠粒。添加1×HiFi以增加体积50％(即，20uL珠粒+10uL铂Hifi混合物)。在热循环仪上将溶液热循环一次(在98℃下2分钟，在37℃下5分钟，在54℃下5分钟)。
将1mL myOne珠粒吸取到1.5mL管(1mL myOne珠粒，用于2个样品)中，并且将管置于磁体上，并且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加1mL含3％BSA的1×PBS，涡旋，脉冲旋转。将混合物置于磁体上，并且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加1mL AB，涡旋，脉冲旋转。将混合物置于磁体上，并且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加250uL AB(一个样品使用125uL4×浓MyOne)。将纯化的MyOne混合物转移到新1.5mL管中。
将样品从PCR管转移到新1.5mL管中。向ISP混合物中添加125uL 4×浓MyOne。来回吸取混合物3次(200微升/秒)，并且使其静置10分钟。将混合物置于磁体上，牵拉出MyOne捕获的ISP(chef速度80微升/秒)，且丢弃上清液。添加20uL NF水，脉冲涡旋，脉冲旋转，且置于磁体上以使MyOne集结。
芯片制备
用200μL NF水冲洗芯片2×。
磁性ISP负载
将20uL ISP混合物与4.5uL 10×退火缓冲液和20.5uL水混合(总计45uL)。涡旋ISP，且将其与10×退火缓冲液和水合并。涡旋ISP溶液且快速旋转。通过负载通口，将ISP溶液缓慢注射到芯片中。以30秒/扫描，进行磁性负载40分钟。将200μL泡沫(含0.2％Triton的1×AB)注射入芯片，且提取过量的泡沫。在真空抽吸出口同时，添加200μL 1×AB，且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，抽吸200μL冲洗液(60％AB/40％IPA)，且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL 1×AB。将芯片保持在1×AB中，直到准备扩增芯片上的ISP为止。
扩增，将所有试剂保持在冰上
第1步骤扩增
制备具有生物素标记的引物A和封端分子(中性抗生物素蛋白)的管，且在冰上温育>15分钟。溶液包含1.1uL 100uM引物每芯片和1uL 10mg/mL NAv(在0-PEG缓冲液中复水)每芯片。向1×IA沉淀物(批号LTBP0047，PN 100032944)中，添加871μL复水缓冲液。脉冲涡旋溶液10×，快速旋转，以收集管内含物。将内含物分成相同体积的两管(在单独管中放入900uL)。一个900μL管用于第1步骤扩增，存储另一个900μL管用于第2步骤扩增。
对于待运行的各芯片来说，将60μL沉淀物溶液缓慢注射到芯片中。从出口抽吸置换的退火缓冲液。在RT下，将芯片与沉淀物溶液一起温育4分钟。向沉淀物溶液管中添加177.4μL启动溶液，脉冲涡旋10×，且快速旋转。将110uL/芯片的启动溶液转移到具有引物和封端剂的管中，脉冲涡旋10×且快速旋转。对于各芯片来说，将约60μL活化的沉淀物溶液缓慢注射到芯片中。从两个通口抽吸所有置换的流体。向各通口中添加25μL沉淀物溶液。将芯片放到设定为40℃的加热板(热循环仪)上。芯片用移液管尖端盒盖或类似物(不是加热的热循环仪盖子)盖住，且温育2.5分钟。
短暂反应终止和在扩增步骤之间的清洁
将扩增的芯片放在配备有真空的罩附近。在真空抽吸出口同时，添加200μL 0.5MEDTA pH 8(VWR E522-100ML)，随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，抽吸200μL 1×AB，且随后抽吸以干燥芯片。重复AB添加，且湿润芯片以进行第2步骤扩增。(抽空AB两次，且将第3个AB留在芯片中)
第2步骤扩增(无封端剂)
制备具有生物素标记的引物A的管，且在冰上温育>15分钟。溶液包含1.1uL 100uM引物每芯片。向1×IA沉淀物(批号LTBP0047，PN 100032944)中，添加871μL复水缓冲液。脉冲涡旋溶液10×，快速旋转，以收集管内含物。在丢弃适当体积的沉淀物溶液之后，向沉淀物混合物中添加6.6μL 100uM生物素标记的引物，且对其脉冲涡旋10×。
向沉淀物溶液管中添加177.4μL启动溶液，脉冲涡旋10×，且快速旋转。对于各芯片来说，将约60μL活化的沉淀物溶液注射到预旋转的芯片中。从两个通口抽吸置换的流体。向各通口中添加另外25μL沉淀物溶液。将芯片放到设定为40℃的加热板(热循环仪)上。芯片用移液管尖端盒盖或类似物(不是加热的热循环仪盖子)盖住，且温育20分钟。
反应终止和清理
将扩增的芯片放在配备有真空的罩附近。在真空抽吸出口同时，添加200μL 0.5MEDTA pH 8，并且抽吸芯片以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL 1×AB)，且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL含1％SDS溶液的水(Ambion PN AM9822)，并且随后抽吸以干燥芯片。重复SDS洗涤。在真空抽吸出口同时，添加200μL甲酰胺。在50℃下温育芯片3分钟，随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL冲洗(50％IPA/50％AB)溶液。抽吸芯片到干燥。在真空抽吸出口同时，添加200μL退火缓冲液。将芯片留在1×AB中，直到准备引发为止。
芯片上测序引物杂交和酶
将测序引物管解冻。制备最终50％/50％AB/引物混合物的引物混合物，且涡旋孔。如果测序引物管具有250μL的体积，那么添加250μL 1×AB。抽吸芯片到干燥，随后向芯片中添加80μL引物混合物(流动池中50μL，通口中30μL)。将芯片置于热循环仪上，且在50°℃下温育2分钟，在20℃下温育5分钟。在真空抽吸出口同时，注射200μL 1×AB。用60μL退火缓冲液和6μL PSP4酶，制备酶混合物。清洁通口且从入口抽真空以干燥芯片。向芯片中添加60μL酶混合物，并且在RT下温育5分钟。从入口抽吸芯片以干燥芯片。紧接着向芯片中添加100μL1×AB。清洁通口，且干燥芯片的背面，且将芯片负载到用于测序的Proton上。
实例6
植入
在PCR管中，将具有A和B衔接子的Ampliseq外显子组文库(2.4B拷贝)与和A衔接子互补的5'-生物素标记的引物TPCRA(1uL，100uM)混合。用含有高保真度Taq DNA聚合酶、盐、镁和dNTP的1×铂HiFi混合物，填充管到20uL。在热循环仪上使管热循环一次(在98℃下2分钟，在37℃下5分钟，在54℃下5分钟)。向管中添加离子球形颗粒(ISP)珠粒(60亿)，其各自在其上固定有数千个B引物。添加1×HiFi以增加体积50％(即，20uL珠粒+10uL铂Hifi混合物)。在热循环仪上使溶液热循环一次(在98℃下2分钟，在37℃下5分钟，在54℃下5分钟)。
在替代方法中，在PCR管中，将Ion Ampliseq外显子组文库的12亿拷贝(20μL100pM，具有标准Ion Torrent A和P1文库衔接子)与3μL 3μM生物素-TPCRA(序列5'生物素-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TC-3'；SEQ ID NO:2)和3μL 1.5μM B-trP1(trP1是Ion P1衔接子的23聚体区段，其具有序列CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT；SEQ ID NO:1；B是ISP引物序列)引物和9μL Ion Ampliseq HiFi主混合物5×混合。用10μL无核酸酶水将体积补足到45μL。用以下温度分布，在热循环仪上使管进行热循环：在98℃下2分钟、2个[在98℃下15秒-在58℃下2分钟]循环，最终保持在10℃。在热循环之后，向管中添加60亿ISP(75μL，8000万/微升)和6μL Ion Ampliseq HiFi主混合物5×。也添加5μL无核酸酶水以将总体积带到131μL。将溶液充分混合，且将管返回热循环仪。用以下温度分布进行第三个扩增循环：在98℃下2分钟，在56℃下5分钟，最终保持在10℃。在热循环之后，添加5μL EDTA 0.5M，且混合，以终止反应。
富集ISP
将具有与珠粒表面共价偶合的抗生蛋白链菌素的MyOne超顺磁珠(1mL)吸取到1.5mL管(1mL MyOne珠粒，用于2个样品)中，并且将管置于磁体上，并且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加1mL含3％BSA的1×PBS，随后涡旋且脉冲旋转。将混合物置于磁体上，并且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加退火缓冲液(AB；1mL)，涡旋且脉冲旋转。将混合物置于磁体上，并且丢弃上清液。向MyOne混合物中添加AB(250uL)(一个样品使用125uL 4×浓MyOne)。将纯化的MyOne混合物转移到新1.5mL管中。
将样品从含有ISP混合物的PCR管转移到新1.5mL管中。向ISP混合物中添加浓(4×)MyOne珠粒(125uL)。来回吸取混合物3次(200微升/秒)，并且随后使其静置10分钟。将混合物置于磁体上，牵拉出MyOne捕获的ISP(chef速度80微升/秒)，且丢弃上清液。向管中添加无核酸酶(NF)水(20uL)，随后脉冲涡旋，脉冲旋转，且置于磁体上以使MyOne珠粒集结。
在富集ISP的替代方法中，将120μL MyOne抗生蛋白链菌素C1珠粒转移到单独管中，且将管置于磁体上以使磁珠集结。丢弃上清液，且从磁体移出管。珠粒通过再悬浮于150μL Ion Torrent退火缓冲液中来洗涤，随后在磁体上集结。丢弃上清液，且另外重复一次用150μL退火缓冲液洗涤。在从第二洗涤液丢弃上清液之后，用50μL退火缓冲液再悬浮洗涤的MyOne C1珠粒。将退火缓冲液中的洗涤后的MyOne C1的全部内含物转移到含有文库和ISP的热循环的PCR管中。将移液管体积设定为160μL，且通过在1秒/抽吸下来回吸取三次或施配运动将内含物缓慢混合。使混合物在室温下在无搅动下静置30分钟，以使磁珠捕获文库植入的ISP。随后，将管置于磁体上以使磁珠集结，且丢弃上清液。向沉淀物中添加含Tween-20(25μL，0.1％)的水。剧烈地涡旋混合物以从MyOne C1珠粒洗脱植入的ISP。脉冲旋转管，随后返回磁体。将含有植入的ISP的上清液(洗脱液)收集到新鲜管中以用于下游芯片负载和扩增步骤。
芯片制备
用200μL NF水冲洗芯片2×。
将ISP磁性负载到芯片上
使用制备ISP/文库混合物和将其负载到含有反应室微孔的Ion Torrent半导体芯片上的若干方法。在一种方法中，将ISP/文库混合物(20ul)与4.5μl 10×退火缓冲液和20.5μl水混合(总计45μl)。涡旋混合物且旋转。通过负载通口，将ISP溶液缓慢注射到芯片中。以30秒/扫描，进行磁性负载40分钟。将含有含0.2％Triton的1×AB的泡沫(200μL)注射入芯片，且提取过量泡沫。在真空抽吸芯片的出口同时，将200μL 1×AB注射到芯片中，且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，随后将200μL冲洗液(60％AB/40％IPA)注射到芯片中，且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，随后通过注射将200μL 1×AB添加到芯片中。将芯片保持在1×AB中，直到准备扩增芯片上的ISP上的核酸为止。
在另一方法中，将150μL Dynabead M-270抗生蛋白链菌素(赛默飞世尔科技公司)，其是具有与其表面结合的抗生蛋白链菌素的磁珠，转移到管中，随后将管置于磁体中以使磁珠集结。丢弃上清液，且从磁体移出管。随后，向含有M-270集结珠粒的管中添加以下：20μL来自植入过程的ISP混合物，9μL 5×退火缓冲液和16μL无核酸酶水，总计45μL。可替代地，将20ul ISP/文库混合物与3.2uL 10×退火缓冲液、3uL浓M270磁珠和5.8uL水混合，总计32ul。混合混合物以再悬浮M-270沉淀物，且通过负载通口缓慢注射到芯片中。放在芯片下方的磁体反复来回扫描芯片，以将ISP负载到芯片微孔中。以30秒/扫描，进行磁性负载扫描40分钟。在负载之后，剧烈地振荡含有5mL 1％SDS的15mL falcon管，以产生致密泡沫，随后将800μL注射入芯片以从芯片流动池去除磁珠。丢弃芯片出口处的流过物。随后，将退火缓冲液(200μL)注射入芯片，且丢弃流过物。从芯片出口真空干燥芯片。将冲洗液(200μL，60％退火缓冲液，40％IPA)注射入芯片，随后真空干燥芯片。注射退火缓冲液(200μL)以填充芯片流动池，且丢弃芯片出口处的流过物。芯片用退火缓冲液填充，直到准备在下游扩增步骤中扩增为止。
扩增
第一步骤扩增
对于正扩增的各芯片来说，将1.1uL生物素标记的引物A(100uM)和1uL封端分子(复水于缓冲液中的10mg/mL中性抗生物素蛋白)合并在管中，且在冰上温育>15分钟。
向来自ION PGMTM模板IA 500试剂盒的含有用于进行重组酶-聚合酶扩增的反应组分(例如，重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、核苷酸、缓冲液和其它成分)的1×IA沉淀物(PN100032944)中，添加复水缓冲液(871μL)。脉冲涡旋溶液10×，且快速旋转，以收集管内含物。在过程期间，将复水的内含物(被称作“沉淀物溶液”，大约900ul)保持在冰上。
对于各Ion Torrent芯片来说，将60μL复水的IA沉淀物溶液缓慢注射到芯片中。从出口抽吸置换的退火缓冲液。在RT下，将芯片与复水的IA沉淀物溶液一起温育4分钟。
对于正扩增的各芯片来说，将90uL复水的IA沉淀物溶液转移到新管中。添加先前制备的生物素标记的引物A和中性抗生物素蛋白封端分子(2.1uL)，且脉冲混合。向复水的IA沉淀物溶液的管中添加含有28mM Mg(OAc)2水溶液、10mM乙酸Tris和3.75％(V/V)甲基纤维素的启动溶液(30μL)，脉冲涡旋10×，且快速旋转，以形成总体积为约120uL的活化的扩增溶液。对于各芯片来说，将约60μL活化的扩增溶液缓慢注射到芯片中。从两个通口抽吸所有置换的流体。接下来，向各芯片通口中添加25μL残留的活化的扩增溶液。将芯片放到设定为40℃的加热板(热循环仪)上。芯片用移液管尖端盒盖或类似盖(不是加热的热循环仪盖子)盖住，且温育2.5分钟。
短暂反应终止和在扩增步骤之间的清洁
从加热板或热循环仪取下扩增的芯片。在真空抽吸出口同时，将200μL 0.5M EDTApH8(VWR E522-100ML)注射到芯片中，且随后使用真空抽吸芯片到干燥。在真空抽吸出口同时，将200μL 1×AB注射到芯片中，随后抽吸芯片到干燥。另外重复AB添加两次，且填充芯片以进行第2步骤扩增。(抽空AB两次，且将第三个AB添加留在芯片中。)
第二步骤扩增(无封端剂)
对于各芯片来说，将60uL复水的沉淀物溶液减缓注射到芯片中。从出口抽吸置换的退火缓冲液。在RT下，将芯片与沉淀物溶液一起温育4分钟。
对于正制备的各芯片来说，将90uL复水的沉淀物溶液转移到新鲜管中。添加生物素标记的引物A(1.1uL，100uM)，且脉冲涡旋管且旋转。
向含有复水的沉淀物溶液和引物A的管中添加启动溶液(30μL)，且脉冲涡旋10×，且快速旋转，以产生活化的扩增溶液。将大约60μL活化的扩增溶液注射到芯片中。从两个通口抽吸置换的流体。向各通口中添加另外25μL残留的扩增溶液。将芯片放到设定为40℃的加热板(热循环仪)上。芯片用移液管尖端盒盖或类似盖盖住，并且温育20分钟。
反应终止和清理
将已经受扩增反应的芯片放置在配备有真空的罩附近。在真空抽吸出口同时，添加200μL 0.5M EDTA pH 8，并且抽吸芯片以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL 1×AB，并且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL含1％SDS溶液的水(Ambion PN AM9822)，并且随后抽吸以干燥芯片。重复SDS洗涤。在真空抽吸出口同时，添加200μL甲酰胺。在50℃下温育芯片3分钟，随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μL冲洗(50％IPA/50％AB)溶液。抽吸芯片到干燥。在真空抽吸出口同时，添加200μL退火缓冲液。将芯片留在1×AB中，直到准备引发为止。
芯片上测序引物杂交和酶反应
将含有Ion测序引物(100uM)的管解冻。对于正测序的各芯片来说，制备40uL退火缓冲液和40uL测序引物的引物混合物，且涡旋孔。抽吸芯片到干燥，随后向芯片中添加80μL引物混合物(流动池中50μL，各通口中15μL)。将芯片置于热循环仪上，且在50℃下温育2分钟，在20℃下温育5分钟。在真空抽吸出口同时，注射200μL 1×AB。用60μL退火缓冲液和6μL测序酶(Ion PSP4测序聚合酶)制备酶混合物。清洁通口且从入口抽真空以干燥芯片。向芯片中添加酶混合物(60μL)，且在RT下温育5分钟。抽吸芯片到干燥。紧接着注射AB(100μL，1×)以填充芯片。清洁通口，将芯片背面干燥，且将芯片负载到Ion Torrent Proton(赛默飞世尔科技公司)设备上以用于对文库核酸进行测序。
实例7.使用不同核酸操纵方法测序结果的比较
图10显示使用四个不同扩增条件(图中A-D)所产生的核酸模板的核酸测序运行组的总可使用读段。在方法A中，根据本文中实例2中所描述的方法，将非模板化离子球形颗粒(ISP)负载到Ion Torrent 541芯片的微孔中。随后，在将文库扩增子注射到芯片中之后，通过单次95℃1分钟/37℃1分钟热循环步骤，使具有与ISP引物互补的衔接子的文库分子(110bp hg19片段文库)与预负载的ISP杂交。在文库杂交之后，使用基本上如实例2中所描述的单步RPA模板化扩增方法进行扩增。引物未被生物素标记。方法B相对于扩增方案A采用两个重要变化：1)在模板化扩增之前另外扩增步骤(“第一”扩增步骤)；和2)在所添加的第一扩增步骤中并入中性抗生物素蛋白和生物素标记的溶液引物。在这个实例中，第一扩增步骤，其是等温RPA扩增，是2.5分钟，且含有等效浓度的生物素标记的溶液引物和中性抗生物素蛋白。第二扩增步骤是15分钟，且不含有中性抗生物素蛋白。在这个方法中，第一扩增步骤用于局部扩增模板拷贝同时添加拖拽(drag)(通过中性抗生物素蛋白)以限制新生链的孔-2-孔扩散。在2.5分钟之后，产生足够的局部拷贝，不再需要拖拽组分。随后，如实例2中所描述进行第二扩增步骤。在方法C和D中，使用220bp hg19 Ampliseq外显子组文库。通过用如本文实例6中所描述的溶液类预扩增ISP富集方法置换方法A和B中的文库杂交方法，方法C对于方法B进行改进。因此，代替在孔中进行所有步骤，在溶液中完成文库与ISP杂交的第一步骤，随后向管中添加磁珠，富集含模板的ISP，并且随后与磁珠分开并负载到孔中以如方法B中所完成的进行2步扩增。预扩增富集方法使得能够负载具有单一文库模板拷贝的ISP。最终，扩增方法D，其根据方法C进行，相较于方法C采用经修饰的ISP引物序列。经修饰的引物AV4具有以下序列：ATTCGAGCTGTTCATCTGTATCTTGCGCTACCAA(SEQ ID NO:7)。如图10所示，由方法A-D得到的改进组合使得总读段能够等效于对于通过乳化液PCR扩增的模板核酸进行的测序。
实例8.模板核酸植入方法和植入的载体的间接捕获
在这种用靶模板核酸植入固体载体的方法(如图12所示)中，进行了一系列衔接子修饰的核酸文库分子的扩增反应以产生能够连接到通过与固定在载体上的引物杂交的固体载体。所述产品包含单链的5'端突出端，称为“手柄”，提供短序列，可与捕获寡核苷酸杂交，用于富集靶模板核酸结合的载体。
植入方法
PCR扩增混合物是通过将文库DNA与聚合酶和两种引物组合来制备的：(1)具有核苷酸序列的引物，所述核苷酸序列包含在3'到5'方向上与文库DNA扩增子一端的第一个双链衔接子序列互补的核苷酸序列、聚合酶终止位点和与文库扩增子序列不互补的核苷酸序列(手柄序列)以及(2)具有核苷酸序列的融合引物，其包含在5'到3'方向上，与固定在固体载体上的引物序列相同的核苷酸序列，模板靶核酸将被植入到所述固体载体上，所述核苷酸序列与和双链衔接子序列的一部分互补的核苷酸序列融合，在与第一引物互补的第一衔接子所在的末端相对的文库DNA扩增子的末端。根据制造商的说明，使用OncomineTM综合测定v3(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司)和Oncomine焦点测定文库制备方案产生文库。第一引物是TPCRA引物(SEQ ID NO:2)，在引物的5'端有一个手柄序列，在手柄和TPCRA序列之间有一个聚合酶终止位点。第二引物是AV4引物序列与trP1序列的融合(trP1是SEQID NO:1的Ion P1衔接子的23聚体片段)。在0.2ml PCR管中，添加30μl的约100pM文库、3μl的3μM手柄-TPCRA引物、3μl的1.5μM AV4-trP1融合引物和9μl的Ion Ampliseq 5x HiFiPCR Master Mix并简要混合和快速旋转。PCR管中的45μl内容物在具有以下曲线的热循环仪中进行热循环：98℃下持续2分钟，然后98℃下持续15秒-64℃下持续90秒-58℃下持续2分钟的两个循环然后保持10℃。从热循环仪中取出管，并将60亿(54.5μL，110M/μL)离子球颗粒(ISP；赛默飞世尔科技公司)和6μL 5×HiFi PCR预混液添加到混合物中。将管短暂混合并离心。将PCR管中的105.5μL混合物再次放入热循环仪中，并按照以下曲线进行热循环：98℃下2分钟-56℃下5分钟–10℃下保持。
植入的载体的捕获和富集
将与手柄-TPCRA引物手柄互补的生物素化捕获寡核苷酸添加到从热循环仪取出的PCR管中，彻底涡旋并离心管。使管在室温下温育5分钟。在单独的管中，添加120μL MyOneC1磁珠。磁珠用150μL退火缓冲液洗涤两次，然后重悬于50μL退火缓冲液中。温育5分钟后，将洗涤过的50μL悬浮液中的磁珠与含有捕获寡核苷酸的PCR反应管混合。通过缓慢上下吹打3次轻轻混合全部内容物。使管在室温下不搅拌温育30分钟。温育30分钟后，将管小心地放置在磁性支架(或磁性板)上，使MyOne C1珠粒与文库植入的ISP组合件连接。在不干扰沉淀的情况下，去除上清液。向沉淀物中添加25μL水以洗脱靶模板植入的ISP。所述管被剧烈涡旋并快速旋转。将管再次放置在磁力架上以沉淀。将含有富集靶模板植入的ISP的上清液转移到新管中，准备用于进一步分析，例如测序。
为了分析富含植入的ISP的产量，将1μL产物在离子退火缓冲液中连续稀释100,000倍。SYBRTM金核酸凝胶染色剂(Gold Nucleic Acid Gel Stain)(赛默飞世尔科技公司，S11494)在最终稀释液中以0.5×的比例用于对ISP进行染色。在Guava easyCyte流式细胞仪(德克萨斯州奥斯汀路明克斯公司)上测量SYBR Gold染色的ISP稀释液，以分析未稀释样品中富集ISP的浓度和总产量。Oncomine焦点测定文库的产量和OncomineTM综合检测v3(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司)的ISP分别为4.75亿和3.83亿。
文库核酸的模板化扩增和测序
将富集的植入ISP负载到含有反应室微孔的IonTM半导体芯片(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司)上。负载过程如实例6中所述。将以下物质添加到含有150μL免疫磁珠M-270链霉亲和素(赛默飞世尔科技公司)的管中：20μL来自植入过程的ISP混合物、9μL 5×退火缓冲液和16μL无核酸酶水，总共45μL。混合混合物以再悬浮M-270沉淀物，且通过负载通口缓慢注射到芯片中。放在芯片下方的磁体反复来回扫描芯片，以将ISP负载到芯片微孔中。负载后，磁珠和多余的ISP从芯片流动池中去除。
然后使微孔中植入的ISP上的核酸进行两步扩增过程，如实例6中所描述，在两个扩增反应之间进行短暂的反应停止和芯片清洗。简言之，将复水化缓冲液(871μL)添加到含有反应组分的1x IA沉淀物中，用于从ION PGMTM模板IA 500试剂盒(目录号A24622；赛默飞世尔科技公司)进行重组酶-聚合酶扩增。在过程期间，将复水的内含物(被称为“沉淀物溶液”，大约900ul)保持在冰上，并且将90uL复水化的IA沉淀物溶液转移到新管中。接下来，将2.1μl 1.1uL生物素化引物A(100uM)和1uL封闭分子(10mg/mL Neutravidin在缓冲液中复水化)添加到管并进行脉冲混合。向复水的IA沉淀物溶液的管中添加含有28mM Mg(OAc)2水溶液、10mM乙酸Tris和3.75％(V/V)甲基纤维素的启动溶液(30μL)，以形成总体积为约120uL的活化的扩增溶液。将活化的扩增溶液注入置于设置为40℃的热板(热循环仪)上的芯片中。将芯片覆盖并温育2.5分钟，然后将出口抽真空，将200μL 1x退火缓冲液注入芯片中，然后将其吸干。另外重复退火缓冲液添加两次，并且填充芯片以进行第2步骤扩增。对于第二次扩增，将60uL复水的沉淀物溶液注射到芯片中。将生物素化引物A(1.1uL，100uM)添加到新管中的复水化沉淀物溶液(90uL)中。向含有复水的沉淀物溶液和引物A的管中添加启动溶液(30μL)以产生活化的扩增溶液。将活化的扩增溶液注射到芯片中。将芯片置于设置为40℃的热板(热循环仪)上，盖上盖子并温育20分钟，然后在抽真空出口的同时添加200μL 1x AB，然后吸干芯片，然后制备进行核酸模板的测序。
使用Ion Proton(赛默飞世尔科技公司)系统对含有扩增模板的ISP进行测序。将含有Ion测序引物(100uM)的管解冻。对于正测序的各芯片来说，制备40uL退火缓冲液和40uL测序引物的引物混合物，且涡旋孔。抽吸芯片到干燥，随后向芯片中添加80μL引物混合物(流动池中50μL，各通口中15μL)。将芯片置于热循环仪上，且在50℃下温育2分钟，在20℃下温育5分钟。在真空抽吸出口同时，注射200μL 1×AB。用60μL退火缓冲液和6μL测序酶(Ion PSP4测序聚合酶)制备酶混合物。清洁通口且从入口抽真空以干燥芯片。向芯片中添加酶混合物(60μL)，且在RT下温育5分钟。抽吸芯片到干燥。紧接着注射退火缓冲液(100μL，1×)以填充芯片。清洁通口，将芯片背面干燥，并且将芯片负载在Ion Proton设备上以用于对文库核酸进行测序。Oncomine焦点测定文库和Oncomine综合测定v3文库序列读段的平均读段长度分别为113bp和109bp。大多数(99％)已识别读段与靶区域对齐。
所公开的实施例、实例和实验并不打算限制本公开的范围或并不打算表示以下实验是所执行的所有或仅有实验。已经努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应当考虑到一些实验性误差和偏差。应理解，可以在不改变实验意图说明的基本方面的情况下，对所描述的方法进行改变。
应注意，以上在一般描述或实例中描述的所有活动并非都是必需的，可能不需要一部分特定活动，且除所描述的那些以外可以执行一个或多个其它活动。仍进一步，所列的活动次序未必是执行活动的次序。所属领域的技术人员可设计在本公开的范围和精神内的许多修改和其它实施例。实际上，在不改变本公开的基本方面的情况下，熟练的技术人员可对所描述材料、方法、图式、实验、实例和实施例进行变化。所公开的任一个实施例可与任何其它所公开的实施例组合使用。当对于范围给出多个低值和多个高值时，所属领域的技术人员应认识到，所选择的范围将包含小于高值的低值。本说明书中的所有标题均是为了方便阅读起见且不是限制性的。在前文说明书中，所述概念已经参考具体实施例来描述。然而，所属领域的一般技术人员了解，可以在不脱离如所附权利要求书中所阐述的本发明范围的情况下进行各种修改和改变。因此，说明书和图式应该以说明性而不是限制性意义来看待，且所有这些修改意图包含在本发明范围内。上文关于具体实施例描述了益处、其它优点和问题解决方案。然而，益处、优点、问题的解决方案以及可能导致任何益处，优点或解决方案发生或变得更明显的任何特征(多个特征)不应被解释为任何或所有权利要求的关键，必需或必要特征。在阅读本说明书之后，本领域技术人员将理解，为了清楚起见，本文在单独实施例的上下文中描述的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的各种特征也可以单独地或以任何子组合来提供。进一步，对以范围陈述的值的参考包含在那个范围内的每一个值。
序列表
<110> 生命技术公司（LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION）
ROSENBAUM, Abraham
SEEGER, Collyn
GRAY, Jeremy
YU, Hua
<120> 用于操纵核酸的方法和组合物
<130> LT01179.1PCT
<150> US 16/403,339
<151> 2019-05-03
<160> 7
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成DNA
<400> 1
cctctctatg ggcagtcggt gat 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成DNA
<400> 2
ccatctcatc cctgcgtgtc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成DNA
<400> 3
cctatcccct gtgtgccttg 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成DNA
<400> 4
acgatccatc tcatccctgc gtgtc 25
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成DNA
<400> 5
tccataaggt cagtaacgat ccatctcatc cctgcgtgt 39
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成DNA
<400> 6
cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag ccactacgcc tccgctttcc tctctatgga 60
a 61
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成DNA
<400> 7
attcgagctg ttcatctgta tcttgcgcta ccaa 34
Claims (23)
1.一种在载体上产生多个基本上单克隆模板核酸群体的方法，所述方法包括：
(a)获得多个载体，其中每个载体具有固定到所述载体的多个单链寡核苷酸引物和与所述载体连接的模板核酸，其中所述核酸包括所连接的核酸链，所述所连接的核酸链具有在所述链的一端处的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列是寡核苷酸引物序列；
(b)在存在(i)呈溶液形式的与连接子部分连接的第一引物和(ii)与所述连接子部分连接的组合物的情况下，使与所述多个载体连接的所述模板核酸经受第一等温核酸扩增，其中所述第一引物包括与所述所连接的核酸链的在所述链的与具有连续核苷酸序列的末端相对的末端处的引物结合序列互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸序列是所述寡核苷酸引物序列；以及
(c)在存在所述呈溶液形式的与连接子部分连接或不与连接子部分连接的所述第一引物和不存在与所述连接子部分连接的所述组合物的情况下，使与所述多个载体连接的所述模板核酸经受第二等温核酸扩增，由此产生与所述载体连接的基本上单克隆模板核酸群体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一等温核酸扩增和所述第二等温核酸扩增在单一反应混合物的单一连续液相内进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其中：
(i)步骤(a)的所述多个载体中的每个载体具有与所述载体连接的不同双链模板核酸，
(ii)每个双链模板核酸包括与所述载体直接连接的所连接链和与所述所连接链杂交的链，并且
(iii)每个双链模板核酸包括在与所述所连接链杂交的所述链上的连接子部分或在与所述所连接链杂交的所述链上的单链突出端核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前：
(1)通过使步骤(a)的所述多个载体与和所述连接子部分结合的捕获部分或与和所述单链突出端核苷酸序列和捕获部分互补的寡核苷酸接触来形成多个所捕获载体，其中所述与所述单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸与所述单链突出端杂交并且包括与所述捕获部分结合的连接子部分；
(2)收集所述所捕获载体；以及
(3)将连接有模板核酸的所述载体与所述捕获部分或与所述与所述单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸分开。
5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(1)的所述多个载体中的每个载体具有与所述载体连接的仅一个双链模板核酸。
6.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(1)的所述多个载体是通过包括以下的方法获得的：
(A)获得初始核酸群体，在所述初始核酸群体中，每个核酸包括核酸链，所述核酸链具有在所述链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列和所述第二连续核苷酸序列彼此不同，并且其中在所述群体中，所述核酸群体的所述第一连续核苷酸序列基本上相同并且所述核酸群体的所述第二连续核苷酸序列基本上相同；
(B)在存在第一引物和第二引物的情况下，使所述核酸群体经受核酸扩增循环，
其中：
所述第一引物包括与所述第一连续核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列，并且与连接子部分连接，
所述第二引物包括：(i)与所述第二连续核苷酸序列的在所述第二连续核苷酸序列的5'端处的一部分互补的核苷酸序列；以及(ii)不与所述第二连续核苷酸序列互补并且与和所述第二连续核苷酸序列的所述部分互补的序列在所述互补序列的3'端处连接的第四核苷酸序列，并且
所述第二引物不含与所述第二连续核苷酸序列的3'端互补的核苷酸序列；
(C)在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使步骤(B)的扩增循环的产物经受核酸扩增循环以产生多种不同的核酸产物，其中步骤(A)中的所述初始核酸群体中的每个单独核酸的核酸扩增的所述多种不同核酸产物中的仅一种核酸产物包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列以及连接子部分；
(D)在退火条件下使步骤(C)的所述核酸产物的单链与固定有与所述第四核苷酸序列基本上相同的多个单链寡核苷酸引物的载体接触，由此将步骤(C)的包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列以及连接子部分的所述核酸产物的单链与所固定的单链寡核苷酸引物杂交以产生与包括部分双链核酸的模板核酸连接的载体；以及
(E)通过模板依赖性核酸合成使所述部分双链核酸的所述所固定的寡核苷酸引物部分的3'端延伸以产生包括连接子部分的延伸双链核酸，由此产生连接有模板核酸的多个载体，其中每个载体具有与其连接的不同双链模板核酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤(D)中与步骤(C)的所述核酸产物的所述单链接触的载体数量超过核酸产物数量至少2倍、或至少2.5倍、或至少3倍、或至少3.5倍、或至少4倍、或至少4.5倍、或至少5倍、或至少5.5倍、或至少6倍、或至少6.5倍、或至少7倍、或至少7.5倍、或至少10倍、或至少15倍、或至少20倍或至少25倍。
8.根据权利要求6所述的方法，其中：
在步骤(C)之后和步骤(D)之前，在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使所述核酸产物经受一个或多个另外的核酸扩增循环，和/或
在步骤(E)之后，在存在所述第一引物和所述第二引物以及固定有与所述第四核苷酸序列基本上相同的多个单链寡核苷酸引物的载体的情况下，使连接有模板核酸的所述多个载体经受一个或多个核酸扩增循环。
9.根据权利要求6所述的方法，其中使连接有模板核酸的所述多个载体与和所述连接子部分结合的捕获部分接触，由此形成多个所捕获载体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述捕获部分与珠粒或颗粒连接，并且在收集所述所捕获载体之后，通过解离所述双链模板核酸的链，将连接有模板核酸的所述载体与和所述珠粒或颗粒连接的所述捕获部分分开，由此产生与单链模板核酸连接的多个载体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在所述第一等温核酸扩增之前，将所述与单链核酸连接的载体转移到包括微孔的表面并且负载到单独的微孔中。
12.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(1)的所述多个载体是通过包括以下的方法获得的：
(A)获得初始核酸分子群体，在所述初始核酸分子群体中，每个核酸包括核酸链，所述核酸链具有在所述链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列彼此不同，并且其中在所述群体中，所述核酸分子群体的所述第一核苷酸序列基本上相同并且所述核酸分子群体的所述第二核苷酸序列基本上相同；
(B)在存在第一引物和第二引物的情况下，使所述核酸分子群体经受核酸扩增循环，
其中：
所述第一引物包括与所述第一核苷酸序列基本上相同的3'端核苷酸序列、5'端核苷酸序列和定位于所述3'端核苷酸序列与所述5'端核苷酸序列之间的不可复制部分，
所述第二引物包括：(i)与所述第二核苷酸序列的在所述第二核苷酸序列的5'端处的一部分互补的核苷酸序列；以及(ii)不与所述第二核苷酸序列互补并且与和所述第二核苷酸序列的所述部分互补的序列在所述互补序列的3'端处连接的第四核苷酸序列，并且
所述第二引物不含与所述第二核苷酸序列的3'端互补的核苷酸序列；
(C)在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使步骤(B)的扩增循环的产物经受核酸扩增循环以产生多种不同的核酸产物，其中来自步骤(A)中的所述初始核酸分子群体中的每个单独核酸分子的核酸扩增的所述多种不同核酸产物中的仅一种核酸产物包括在3'端处具有与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的链和在5'端处的单链区域，所述单链区域包含所述不可复制部分和所述第一引物的5'端核苷酸序列；
(D)在退火条件下使步骤(C)的所述核酸产物的单链与固定有与所述第四核苷酸序列基本上相同的多个单链寡核苷酸引物的载体接触，由此将步骤(C)的包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的所述核酸产物的单链与和所述第四核苷酸序列基本上相同的所述单链寡核苷酸杂交以产生与包括部分双链核酸的模板核酸连接的载体；以及
(E)通过模板依赖性核酸合成使所述部分双链核酸的所固定的寡核苷酸引物部分的3'端延伸以产生延伸双链核酸，其中所述所固定的寡核苷酸引物部分的延伸继续到延伸链杂交的存在于所述模板链上的所述不可复制部分的点，并且然后中断，从而导致部分双链核酸含有包含所述第一引物的5'端核苷酸序列的单链突出端核苷酸序列，由此产生连接有模板核酸的多个载体，其中每个载体具有与其连接的不同的部分双链模板核酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中：
在步骤(C)之后和步骤(D)之前，在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使所述核酸产物经受一个或多个另外的核酸扩增循环，和/或
在步骤(E)之后，在存在所述第一引物和所述第二引物以及固定有与所述第四核苷酸序列基本上相同的多个单链寡核苷酸引物的载体的情况下，使连接有模板核酸的所述多个载体经受一个或多个核酸扩增循环。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一引物的5'端核苷酸序列和所述第一引物的3'端核苷酸序列至少基本上彼此互补。
15.根据权利要求12所述的方法，其中使连接有部分双链模板核酸的所述多个载体与和所述单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸以及捕获部分接触，其中与所述单链突出端核苷酸序列互补的所述寡核苷酸核通过与所述单链突出端核苷酸序列杂交形成杂交体，并且包括所述捕获部分结合的连接子部分，由此形成多个所捕获载体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一引物的5'端核苷酸序列和所述第一引物的3'端核苷酸序列至少基本上彼此互补，并且所述接触在所述第一引物的5'端核苷酸序列和所述第一引物的3'端核苷酸序列不彼此杂交的条件下进行。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在与和所述单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸接触之后，连接有部分双链模板核酸的所述多个载体与捕获部分接触，并且与所述捕获部分的接触在所述第一引物的5'端核苷酸序列和所述第一引物的3'端核苷酸序列能够彼此杂交的条件下进行。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述捕获部分与珠粒或颗粒连接，并且在收集所述所捕获载体之后，通过解离所述单链突出端核苷酸序列和与所述单链突出端核苷酸互补的所述寡核苷酸的杂交体的链，将连接有模板核酸的所述多个载体与和所述珠粒或颗粒连接的所述捕获部分分开，由此产生与含有单链突出端核苷酸序列的部分双链模板核酸连接的多个载体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在所述第一等温核酸扩增之前，将所述与含有单链突出端核苷酸序列的部分双链模板核酸连接的载体转移到包括微孔的表面并且负载到单独的微孔中。
20.一种用于产生包括特异性核苷酸序列的核酸模板的方法，所述方法包括：
(a)获得包括核酸链的核酸，所述核酸链具有在所述核酸链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述核酸链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列彼此不同；
(b)在存在第一引物和第二引物的情况下，使所述核酸经受核酸扩增循环，其中：
所述第一引物包括与所述第一连续核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列，
所述第二引物包括：(i)与所述第二连续核苷酸序列的在所述第二连续核苷酸序列的5'端处的一部分互补的核苷酸序列；以及(ii)不与所述第二连续核苷酸序列互补并且与和所述第二连续核苷酸序列的所述部分互补的序列在所述互补序列的3'端处连接的第四核苷酸序列，并且
所述第二引物不含与所述第二连续核苷酸序列的3'端互补的核苷酸序列；以及
(c)在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使步骤(b)的核酸扩增循环的产物经受核酸扩增循环以产生多种不同的核酸产物，其中所述产物中的仅一种产物包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的方法，其中：
(1)在步骤(a)中，获得初始核酸群体，在所述初始核酸群体中，每个核酸包括核酸链，所述核酸链具有在所述核酸链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述核酸链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列和所述第二连续核苷酸序列彼此不同，并且其中在所述群体中，所述第一连续核苷酸序列基本上相同，并且在所述群体中，所述第二连续核苷酸分子序列基本上相同；
(2)在步骤(b)中，在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使所述初始核酸群体经受核酸扩增循环；以及
(3)在步骤(c)中，在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使先前步骤的扩增循环的产物经受核酸扩增循环以产生多种不同的核酸产物，其中步骤(1)中的所述初始核酸群体中的每个单独核酸的核酸扩增的所述多种不同核酸产物中的仅一种核酸产物包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。
22.一种用于产生一种或多种模板化固体载体的方法，所述方法包括：
a)通过将一种或多种预植入的固体载体、核苷酸、重组酶和聚合酶组合来形成模板化反应混合物，其中所述一种或多种预植入的固体载体包括所连接的基本上相同的第一引物群体并且具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子，其中所述一种或多种预植入固体载体形成于单独预植入反应中，所述单独预植入反应在模板化反应之前并且包括预植入反应混合物，其中所述基本上单克隆模板核酸分子包括包含所述第一引物的近侧区段，其中所述近侧区段将模板核酸区段与预植入的固体载体连接，并且其中所述预植入的固体载体进一步包括与所述预植入的固体载体连接并且未与模板核酸分子结合的所连接的第一引物，其中所述模板化反应混合物进一步包括基本上相同的可溶性第二引物群体，并且其中所述模板核酸分子包括在与所述近侧区段相对的末端处或其附近的所述第二引物的引物结合位点；以及
b)通过向所述模板化反应混合物中添加阳离子并在等温条件下温育所述反应混合物持续至少10分钟进行模板化反应，以扩增所述模板化反应中的所述模板核酸分子，以便产生一种或多种模板化固体载体，其中所述模板化固体载体中的每一种包括至少100,000个基本上单克隆模板核酸分子，并且其中当开始所述模板化反应时，模板核酸分子不以溶液形式存在于所述反应混合物中，由此产生一种或多种模板化固体载体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一引物不包括100个或更多个相同核苷酸。
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