CN110945141A - 基于甲磺酸盐的预混液 - Google Patents

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Abstract

本文公开了含有甲磺酸盐的组合物、此类组合物的使用方法以及实现此类组合物的组分试剂盒，用于改进核酸的扩增，特别是在酶抑制剂存在的情况下。以上所述在法医分析和环境分析中特别有用。本公开提供了用于克服PCR抑制的新组合物、方法和组分试剂盒。本文在一些实施例中公开的是一种PCR预混液，所述PCR预混液包含甲磺酸盐。

Description

基于甲磺酸盐的预混液
技术领域
本文公开了含有甲磺酸盐的组合物、此类组合物的使用方法以及构成此类组合物的分装组分的试剂盒，用于改进核酸的扩增，特别是在酶抑制剂存在的情况下。
背景技术
PCR抑制剂是阻止核酸通过聚合酶链反应(PCR)扩增的因子。当存在足够数量的DNA时，PCR抑制是扩增失败的原因。PCR抑制剂通常通过与DNA相互作用或干扰DNA聚合酶来影响PCR。
法医遗传分析中的常见问题是PCR抑制剂的存在。由于对短串联重复序列的扩增具有抑制作用，对于法医而言，这些干扰物质对人类鉴定提出了挑战。总体结果可以是无扩增产物或仅有部分扩增。
本文公开了用于克服PCR抑制，特别是在法医分析中的组合物、方法和试剂盒。
发明内容
只要科学家使用聚合酶链反应(PCR)，PCR抑制剂就是成功的障碍。法医调查中遇到的材料(如血液、织物、组织和土壤)本身就含有PCR抑制剂。本公开提供了用于此类克服PCR抑制的新的组合物、方法和组分的试剂盒。
在一些实施例中，本文所公开的是一种PCR预混液，所述PCR预混液包含甲磺酸盐。
在一些实施例中，公开了一种分装组分的试剂盒，所述分装组分的试剂盒包含含有PCR预混液的容器，所述PCR预混液包含甲磺酸盐。
在一些实施例中，公开了一种方法，所述方法包含使样品与组合物接触，从而形成接触组合物，所述组合物包含生物缓冲液、甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、脱氧核苷三磷酸、至少两个引物和聚合酶，使接触的组合物经历热循环方案，从而形成循环的接触组合物，并使循环的接触组合物经历电泳分离。
其它实施例可以见于以下款项中。
1.一种PCR预混液，其包含甲磺酸盐。
2.根据第1项所述的PCR预混液，其进一步包含稳定剂化合物。
3.根据第2项所述的PCR预混液，其中所述稳定剂化合物包含甘油或蔗糖。
4.根据第1项所述的PCR预混液，其进一步包含蛋白质化合物。
5.根据第4项所述的PCR预混液，其中所述蛋白质化合物为牛血清白蛋白。
6.根据第1项所述的PCR预混液，其进一步包含脱氧核苷三磷酸。
7.根据第1项所述的PCR预混液，其进一步包含DNA聚合酶。
8.根据第1项所述的PCR预混液，其中所述甲磺酸盐为甲基磺酸钾。
9.根据第1项所述的PCR预混液，其包含：Tris-甲磺酸盐(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)和甘油(3-8％体积)。
10.根据第9项所述的PCR预混液，其进一步包含脱氧核苷三磷酸、非离子清洁剂和DNA聚合酶。
11.一种试剂盒，其包括包含预混液的第一带盖的管和包含引物的第二带盖的管，所述预混液包含甲磺酸盐。
12.根据第11项所述的试剂盒，其中所述预混液进一步包含蛋白质化合物。
13.根据第11项所述的试剂盒，其中所述预混液进一步包含聚合酶。
14.根据第13项所述的试剂盒，其进一步包含第三带盖的管，所述第三带盖的管包含等位基因阶梯。
15.一种方法，所述方法包含将样品与PCR预混液接触，从而形成接触样品，所述PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8体积％)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、至少两种引物和DNA聚合酶；对所述接触样品执行热循环方案，从而形成循环样品；以及对所述循环样品执行电泳分离，从而检测出扩增子的存在或不存在。
这些和其它实施例将在下文进行更详细地描述。
附图说明
所属领域的技术人员将理解下文描述的图式仅出于说明的目的。附图不旨在以任何方式限制本发明教导的范围。
图1.在抑制剂腐殖酸存在下，PCR产生的扩增子进行毛细管电泳分离得到的电泳图。(A)不含甲磺酸盐的预混液和(B)含甲磺酸盐的预混液的结果。可以看出，当PCR预混液中存在甲磺酸盐时，相对于缺少甲磺酸盐的PCR预混液，解析的扩增子的数目更大。
图2.当样品类型为血液时，在存在抑制剂血色素的情况下，PCR产生的扩增子进行毛细管电泳分离的电泳图。为了了解甲磺酸盐PCR预混液改进扩增子的回收率是否受限于样品类型，将血液用作样品。如用纯化的DNA观察到的(实例1，图1)，相对于缺乏甲磺酸盐的PCR预混液(顶部电泳图)，当PCR预混液中存在甲磺酸盐时(底部电泳图)，解析的扩增子数量更大。
图3.从实验测试的设计得到的结果的概述。实验测试的设计描述于实例中。简单来说，甲磺酸盐PCR预混液的构成组分的浓度变化而其它组分不变化。在最上方的图表中，在x轴上，从左到右，为在30-80mM范围内的甲基磺酸钾、在1.2-1.8mM范围内的甲基磺酸镁和在600-1000mM范围内的总脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的变化。“期望”指数位于最右侧。在y轴上，从上到下是在短串联重复序列D13轨迹上观察到的扫描残迹百分数，而在D22轨迹上恰好低于所述扫描残迹百分数。当通过PCR扩增高度重复序列(如短串联重复序列)时，扫描残迹是观测到的一种假象。在扫描残迹下，指示了每种条件下观察到的等位基因(不同的扩增子)的数量。“期望”指数位于最底部。在最下面的图表中，在x轴上从左到右分别是
Figure BDA0002357430200000041
(聚山梨醇酯20)在0.2-0.6％范围内、Taq聚酰胺在0.2-0.6单位/微升范围内和牛血清白蛋白在3-6mg/ml范围内的变化。“期望”指数位于最右侧。在y轴上，从上到下，指示了每种情况下观察到的等位基因(不同的扩增子)的数量。“期望”指数位于最底部。
具体实施方式
在过去的几十年中，聚合酶链反应(PCR)已成为最强大的分子生物学工具之一。PCR通常可用于诊断感染性或遗传性疾病以及进行遗传分析。PCR是一种酶反应，并且因此对抑制剂敏感。
大多数PCR抑制剂为有机化合物，例如胆盐、尿素、苯酚、乙醇、多醣、腐殖酸、鞣酸、黑色素、胶原蛋白、肌球蛋白、血球蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G和蛋白酶。
PCR抑制剂存在于多种物质(器官、血液和其它体液)中，在环境(水和土壤)和食品(肉、牛奶、水果、蔬菜和海鲜)中。
通常在法医调查和环境研究过程中发现PCR抑制剂与分离的核酸相关。经常在法医研究样品中发现腐殖酸，在分解过程中在土壤、水和最近的沉积物中产生的一系列物质。
为了克服样品中存在的PCR抑制剂，本发明提供了组合物。
组合物
为了克服PCR抑制剂的作用，本文公开了一种组合物，所述组合物是包含甲磺酸的PCR预混液。“PCR预混液”是其组分包括生物缓冲液，并且将使用聚合酶链反应用于核酸扩增的组合物。通常将预混液作为浓缩物提供，以由使用者稀释至工作浓度。当参考本文PCR预混液中组分的浓度时，所提供的浓度是组分的最终工作浓度。
“甲磺酸盐”也被称为甲基磺酸盐或甲磺酸盐(mesilate)，具有通式CH3SO3-。在一些实施例中，本文所公开的甲磺酸盐是甲基磺酸钾[CH3KO3S；CAS第2386-56-3号]。在其它实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁[C2H6MgO6S2；CAS第62512-01号]。在其它实施例中，甲磺酸盐为Tris-甲磺酸盐。因此，在一些实施例中，PCR预混液包含甲基磺酸钾。在其它实施例中，PCR预混液包含甲基磺酸镁或硫酸镁。
在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，甲基磺酸钾以35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在于PCR预混液中。
在其它实施例中，甲基磺酸镁或硫酸镁以1.2-1.8mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。
PCR预混液的组分是生物缓冲液。“生物缓冲液”是pKa在pH 5和9之间的溶液，其是水溶性的，并且其中与阳离子形成的络合物通常保持可溶。生物缓冲液的实例为MES、双Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、双-HCl丙烷、BES、MOPS、DIPSO、TAPSO、
Figure BDA0002357430200000051
(Tris-HCl碱)、POPSO、HEPPS、TRICINE、Gly-Gly、Bicine、HEPBS和TAPS的溶液。在一些实施例中，生物缓冲液的pH为约7.0。在一些实施例中，生物缓冲液的pH为约8.0。在其它实施例中，生物缓冲液的pH为约9.0。在一些实施例中，生物缓冲液的pH为约8.3。
在一些实施例中，生物缓冲液为Tris-甲磺酸盐[(NH2C(CH2OH)3·甲基磺酸)]的溶液。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。所属领域的技术人员将理解，可在各种实施例中用上文所列的生物缓冲液的甲磺酸盐替换Tris-甲磺酸盐。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲基磺酸钾和Tris-甲磺酸盐。在其它实施例中，PCR预混液包含甲基磺酸钾和Tris-甲磺酸盐，其中Tris-甲磺酸盐为10-50mM。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)和甲基磺酸钾(30-80mM)。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐为约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)和甲基磺酸钾(30mM)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲基磺酸镁和Tris-甲磺酸盐。在其它实施例中，PCR预混液包含甲基磺酸镁和Tris-甲磺酸盐，其中Tris-甲磺酸盐为10-50mM。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)和甲基磺酸镁(1.2-1.8mM)。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐为约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐和蛋白质化合物。“蛋白质化合物”为其功能是稳定酶活性，特别是聚合酶活性的蛋白质。蛋白质化合物的实例包括白蛋白和明胶。在一些情况下，白蛋白为牛血清白蛋白。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐和蛋白质化合物，其中蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和蛋白质化合物，其中蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和蛋白质化合物，其中甲基磺酸盐是甲基磺酸钾并且蛋白质化合物是白蛋白。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)和甲基磺酸钾(30-80mM)。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐和蛋白质化合物，其中蛋白质化合物为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐和蛋白质化合物，其中蛋白质化合物为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和蛋白质化合物，其中甲磺酸盐是甲基磺酸钾并且蛋白质化合物是白蛋白。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)和牛血清白蛋白(4mg/ml)。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和蛋白质化合物，其中蛋白质化合物为明胶。在一些实施例中，明胶以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，明胶以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和蛋白质化合物，其中甲基磺酸盐是甲基磺酸钾并且蛋白质化合物是明胶。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。在一些实施例中，明胶以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甲基磺酸钾为30-80mM。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和蛋白质化合物，其中甲磺酸盐是甲基磺酸镁并且蛋白质化合物是牛血清白蛋白。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和蛋白质化合物，其中甲基磺酸盐是甲基磺酸镁并且蛋白质化合物是明胶。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。在一些实施例中，明胶以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。
在其它实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐和稳定剂化合物。如通过酶活性分析所测量，相对于不含稳定剂化合物的在-20℃下储存的酶溶液，在维持酶活性的同时，“稳定剂化合物”防止储存在-20℃的温度下的含有酶的溶液的冻结。稳定剂化合物的实例是：甘油和蔗糖。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐和稳定剂化合物，其中稳定剂化合物为甘油。在其它实施例中，稳定剂化合物为蔗糖。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐和稳定剂化合物，其中稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和稳定剂化合物，其中稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和稳定剂化合物，其中甲磺酸盐是甲基磺酸钾并且稳定剂化合物是甘油。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，PCR预混液包含甲基磺酸钾(30-80mM)。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)和甘油5％。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和稳定剂化合物，其中甲磺酸盐是甲基磺酸镁并且稳定剂化合物是甘油。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和稳定剂化合物，其中稳定剂化合物为蔗糖。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和稳定剂化合物，其中甲磺酸盐是甲基磺酸钾并且稳定剂化合物是蔗糖。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.3。在一些实施例中，PCR预混液包含甲基磺酸钾(30-80mM)。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和稳定剂化合物，其中甲磺酸盐是甲基磺酸镁并且稳定剂化合物是蔗糖。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物，其中蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些情况下，白蛋白为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，蛋白质化合物为明胶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物，其中稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在其它实施例中，稳定剂化合物为蔗糖。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、牛血清白蛋白(2mg/ml)和甘油(5％)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐和非离子清洁剂。在一些实施例中，非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20[聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯]。聚山梨醇酯20的常见商业名称为：
Figure BDA0002357430200000151
Scattics和Alkest TW 20。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。
因此，在本文所公开的一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和非离子清洁剂。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在其它实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM；pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)和聚山梨醇酯20(0.2％)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和非离子清洁剂。在一些实施例中，生物缓冲液为Tris-甲磺酸盐并且Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和非离子清洁剂，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和非离子清洁剂，其中蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些情况下，白蛋白为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，蛋白质化合物为明胶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和非离子清洁剂，其中非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、牛血清白蛋白(2mg/ml)和聚山梨醇酯20(0.2％)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和非离子清洁剂。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、稳定剂化合物和非离子清洁剂。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和非离子清洁剂，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和非离子清洁剂，其中稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在其它实施例中，稳定剂化合物为蔗糖。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂和非离子清洁剂，其中非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM；pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、甘油(5％)和聚山梨醇酯20(0.2％)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物和非离子清洁剂。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物，其中蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些情况下，白蛋白为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，蛋白质化合物为明胶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物，其中稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在其它实施例中，稳定剂化合物为蔗糖。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂和非离子清洁剂，其中非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、牛血清白蛋白(2mg/ml)、甘油(5％)和聚山梨醇酯20(0.2％)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐和硫酸镁(MgSO4)。在一些实施例中，硫酸镁为1.2-2.4mM。在一些实施例中，硫酸镁为1.6mM。
在本文所公开的一些实施例中，PCR预混液包含生物缓冲液、甲磺酸盐和硫酸镁。在一些实施例中，生物缓冲液为Tris-甲磺酸盐。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在其它实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，硫酸镁为1.2-2.4mM。在一些实施例中，硫酸镁为1.6mM。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM；pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)和硫酸镁(1.6mM)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和硫酸镁。在一些实施例中，生物缓冲液为Tris-甲磺酸盐并且Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和硫酸镁，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和硫酸镁，其中蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些情况下，白蛋白为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，蛋白质化合物为明胶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和硫酸镁，其中硫酸镁为1.2-2.4mM。在一些实施例中，硫酸镁为1.6mM。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM；pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、牛血清白蛋白(2mg/ml)和硫酸镁(1.6mM)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和硫酸镁。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、稳定剂化合物和硫酸镁。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和硫酸镁，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和硫酸镁，其中稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在其它实施例中，稳定剂化合物为蔗糖。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和硫酸镁，其中硫酸镁为1.2-2.4mM。在一些实施例中，硫酸镁为1.6mM。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM；pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、甘油(5％)和硫酸镁(1.6mM)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、非离子清洁剂和硫酸镁。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、非离子清洁剂和硫酸镁，其中非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、非离子清洁剂和硫酸镁，其中硫酸镁为1.2-2.4mM。在一些实施例中，硫酸镁为1.6mM。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、聚山梨醇酯20(0.2％)和硫酸镁(1.6mM)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些情况下，白蛋白为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，蛋白质化合物为明胶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在其它实施例中，稳定剂化合物为蔗糖。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中硫酸镁为1.2-2.4mM。在一些实施例中，硫酸镁为1.6mM。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、牛血清白蛋白(2mg/ml)、甘油(5％)、聚山梨醇酯20(0.2％)和硫酸镁(1.6mM)。
在一些实施例中，本文所公开的PCR预混液进一步包含聚合酶。“聚合酶”为催化核苷聚合的酶。DNA聚合酶催化脱氧核苷(如脱氧核苷三磷酸腺苷、胞苷、鸟苷和胸苷)的聚合。
DNA聚合酶的实例包括激烈火球菌(Pfu)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶、海滨嗜热球菌(Tli)DNA聚合酶(也称为Vent DNA聚合酶)、海栖热袍菌(Tma)DNA聚合酶、水生栖热菌(Taq酶)DNA聚合酶、柯达卡拉火球菌属KOD DNA聚合酶和火球菌属GB-D(PGB-D)DNA聚合酶。
在本文所公开的一些实施例中，PCR预混液包含生物缓冲液、甲磺酸盐和聚合酶。在一些实施例中，生物缓冲液为Tris-甲磺酸盐。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在其它实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，聚合酶是DNA聚合酶。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM；pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)和DNA聚合酶。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和聚合酶。在一些实施例中，生物缓冲液为Tris-甲磺酸盐并且Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和硫酸镁，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和硫酸镁，其中蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些情况下，白蛋白为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，蛋白质化合物为明胶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和DNA聚合酶。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM；pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、牛血清白蛋白(2mg/ml)和DNA聚合酶。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和聚合酶。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、稳定剂化合物和聚合酶。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和聚合酶，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和聚合酶，其中稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在其它实施例中，稳定剂化合物为蔗糖。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和聚合酶，其中聚合酶为DNA聚合酶。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM；pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、甘油(5％)和DNA聚合酶。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、非离子清洁剂和聚合酶。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和聚合酶。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和稳定剂化合物，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、非离子清洁剂和聚合酶，其中非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、非离子清洁剂和聚合酶，其中聚合酶为DNA聚合酶。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、聚山梨醇酯20(0.2％)和DNA聚合酶。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂、硫酸镁和聚合酶。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，蛋白质化合物为明胶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以1.2-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以2、3.0、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在其它实施例中，稳定剂化合物为蔗糖。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中硫酸镁为1.2-2.4mM。在一些实施例中，硫酸镁为1.6mM。在一些实施例中，聚合酶是DNA聚合酶。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、牛血清白蛋白(2mg/ml)、甘油(5％)、聚山梨醇酯20(0.2％)、硫酸镁(1.6mM)和DNA聚合酶。
在一些实施例中，PCR预混液包含核苷三磷酸。在一些实施例中，核苷三磷酸酯是脱氧核苷三磷酸，例如脱氧腺苷三磷酸酯、脱氧胞苷三磷酸酯、脱氧鸟苷三磷酸酯和脱氧胸苷三磷酸酯；统称为“dNTP”。
在本文所公开的一些实施例中，PCR预混液包含生物缓冲液、甲磺酸盐和核苷三磷酸。在一些实施例中，生物缓冲液为Tris-甲磺酸盐。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在其它实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，每个核苷三磷酸为150-250μM。在一些实施例中，每个核苷三磷酸为200μM。在一些实施例中，核苷三磷酸为dNTP。在一些实施例中，每个脱氧核苷三磷酸为150-250μM。在一些实施例中，每个脱氧核苷三磷酸为200μM。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM；pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)和dNTP(每个脱氧核苷三磷酸200μM)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和核苷三磷酸。在一些实施例中，生物缓冲液为Tris-甲磺酸盐并且Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和硫酸镁，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和硫酸镁，其中蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些情况下，白蛋白为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，蛋白质化合物为明胶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和核苷三磷酸。在一些实施例中，每个核苷三磷酸为150-250μM。在一些实施例中，每个核苷三磷酸为200μM。在一些实施例中，核苷三磷酸为dNTP。在一些实施例中，每个脱氧核苷三磷酸为150-250μM。在一些实施例中，每个脱氧核苷三磷酸为200μM。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM；pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、牛血清白蛋白(2mg/ml)和dNTP(每个脱氧核苷三磷酸200μM)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和核苷三磷酸。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、稳定剂化合物和核苷三磷酸。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和核苷三磷酸，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和聚合酶，其中稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在其它实施例中，稳定剂化合物为蔗糖。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和核苷三磷酸。在一些实施例中，每个核苷三磷酸为150-250μM。在一些实施例中，每个核苷三磷酸为200μM。在一些实施例中，核苷三磷酸为dNTP。在一些实施例中，每个脱氧核苷三磷酸为150-250μM。在一些实施例中，每个脱氧核苷三磷酸为200μM。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM；pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、甘油(5％)和dNTP(每个脱氧核苷三磷酸200μM)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、非离子清洁剂和核苷三磷酸。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和核苷三磷酸。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、非离子清洁剂和核苷三磷酸，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、非离子清洁剂和核苷三磷酸，其中非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、非离子清洁剂和核苷三磷酸。在一些实施例中，每个核苷三磷酸为150-250μM。在一些实施例中，每个核苷三磷酸为200μM。在一些实施例中，核苷三磷酸为dNTP。在一些实施例中，每个脱氧核苷三磷酸为150-250μM。在一些实施例中，每个脱氧核苷三磷酸为200μM。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、聚山梨醇酯20(0.2％)和dNTP(每个脱氧核苷三磷酸200μM)。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂、硫酸镁、聚合酶和脱氧核苷三磷酸。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些情况下，白蛋白为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，蛋白质化合物为明胶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在其它实施例中，稳定剂化合物为蔗糖。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中硫酸镁为1.2-2.4mM。在一些实施例中，硫酸镁为1.6mM。在一些实施例中，聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施例中，每个核苷三磷酸为150-250μM。在一些实施例中，每个核苷三磷酸为200μM。在一些实施例中，核苷三磷酸为dNTP。在一些实施例中，每个脱氧核苷三磷酸为150-250μM。在一些实施例中，每个脱氧核苷三磷酸为200μM。
在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、牛血清白蛋白(2mg/ml)、甘油(5％)、聚山梨醇酯20(0.2％)、硫酸镁(1.6mM)、DNA聚合酶和dNTP(每个脱氧核苷三磷酸200μM)。
表1中显示了PCR预混液的非限制性实施例的表格视图。值代表试剂的最终工作浓度。
表1
Figure BDA0002357430200000331
在一些实施例中，PCR预混液包含叠氮化钠。在一些实施例中，叠氮化钠为0.01-0.04％。在一些实施例中，叠氮化钠为0.02％。
因此，在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐(30mM，pH 8.3)、甲基磺酸钾(35mM)、牛血清白蛋白(2mg/ml)、甘油(5％)、聚山梨醇酯20(0.2％)、硫酸镁(1.6mM)、DNA聚合酶、dNTP(每个脱氧核苷三磷酸200μM)和叠氮化钠(0.02％)。
试剂盒
本文公开了试剂盒。“试剂盒”是指可以彼此结合使用以实现特定目的的一组物品或器具。
在一些实施例中，公开了试剂盒，所述试剂盒包含第一带盖的管或其它形式的流体输送，其含有包含如本文所公开的甲磺酸盐的PCR预混液。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸钾。在一些实施例中，甲基磺酸钾以30-80mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸钾以约35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM存在。在一些实施例中，甲磺酸盐为甲基磺酸镁。在一些实施例中，甲基磺酸镁以1.2-1.8mM存在。在其它实施例中，甲基磺酸镁以约1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或1.7mM存在。在一些实施例中，本文所公开的PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐和甲磺酸盐。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐以10-50mM存在于PCR预混液中。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐以约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM存在于PCR预混液中。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约7.0。在一些实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约8.0。在其它实施例中，Tris-甲磺酸盐的pH为约9.0。在其它实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐和蛋白质化合物。在一些实施例中，蛋白质化合物为白蛋白。在一些实施例中，白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些情况下，白蛋白为牛血清白蛋白。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.2-4mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，牛血清白蛋白以1.5、2、2.5、3或3.5mg/ml存在于PCR预混液中。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和蛋白质化合物。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐和稳定剂化合物。在一些实施例中，稳定剂化合物为甘油。在一些实施例中，甘油以3-8％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，甘油以3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于PCR预混液中。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和稳定剂化合物。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和蛋白质化合物。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、稳定剂化合物和蛋白质化合物。
在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐和聚合酶。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐和聚合酶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物和聚合酶。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、稳定剂化合物和聚合酶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、蛋白质化合物和聚合酶。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、蛋白质化合物和聚合酶。在一些实施例中，PCR预混液包含甲磺酸盐、稳定剂化合物、蛋白质化合物和聚合酶。在一些实施例中，PCR预混液包含Tris-甲磺酸盐、甲磺酸盐、稳定剂化合物、蛋白质化合物和聚合酶。
在一些实施例中，公开了一种试剂盒，其包含第一带盖的管或其它形式的流体输送，其含有包含甲磺酸盐的PCR预混液；以及第二带盖的管或其它形式的流体输送，其含有聚合酶。
在其它实施例中，公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含第一带盖的管或其它形式的流体输送，其包含包含如本文公开的甲磺酸盐的PCR预混液；以及第二带盖的管或其它形式的流体输送，其包含引物。“引物”是指寡核苷酸，其是模板多核苷酸序列的反向互补序列，并能够充当引发聚合酶介导的核苷酸延伸的起点。在一些实施例中，引物以100-350μM存在。
“引物对”是指两个引物，其为双链多核苷酸的相反链的反向互补序列。在其它实施例中，公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含第一带盖的管或其它形式的流体输送，其包含包含如本文公开的甲磺酸盐的PCR预混液；以及第二带盖的管或其它形式的流体输送，其包含引物对。在一些实施例中，引物对的每个引物以100-350μM存在。在一些实施例中，引物对侧接短串联重复序列轨迹。
在一些实施例中，第二带盖的管或其它形式的流体输送含有1-1000个引物对，1-500个引物对，1-200个引物对，1-100个引物对，1-99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2个引物对。在其它实施例中，第二带盖的管或其它形式的流体输送含有99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个引物对。
在一些实施例中，公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含第一带盖的管或其它形式的流体输送，其包含包含如本文公开的甲磺酸盐的PCR预混液；以及第二带盖的管或其它形式的流体输送，其包含等位基因阶梯。
“等位基因阶梯”是指一种核酸大小标准，其提供特定短串联重复序列(“STR”)标记物的一个或多个等位基因的大小标准。等位基因阶梯充当从STR轨迹扩增的等位基因的参照标准和核酸大小标志物。在一些实施例中，等位基因阶梯可以包含用于不同STR的等位基因的大小标准。在一些实施例中，等位基因阶梯可以由DNA组成。在一些实施例中，等位基因阶梯可以由非天然存在的核酸类似物组成。在一些实施例中，等位基因阶梯内的不同的单独的大小标准可以用可检测标记进行标记，例如荧光团。在一些实施例中，用相同荧光团标记等位基因阶梯组分。在一些实施例中，用不同荧光团标记等位基因阶梯组分。大小标准可以经选择以适用于特异性寡核苷酸引物对(一或多个)。例如，如果标记物X的第一组引物产生对应于等位基因7的150个碱基对扩增子，则相应的标记物将充当150个碱基扩增子的大小标准；当第二对引物标记物X产生对应于等位基因7的175个碱基对扩增子时，相应的标记物将充当175个碱基扩增子的大小标准。因此，包含了相同等位基因的不同大小扩增子的不同大小标准。来源于指定等位基因的指定扩增子的大小标准可以具有与扩增子或获得扩增子的等位基因的核酸碱基序列相同或不同的核酸碱基序列。关于在电泳系统中的等位基因分析，大小标准可以经选择以具有与相关扩增子相同的电泳迁移率。或者，在一些实施例中，可选择大小标准以便具有与相关扩增子不同的电泳迁移率，在理解差异的不可预测性质的情况下，可确定扩增子的身份。关于在质谱系统中的等位基因分析，大小标准(重量/电荷比，不是电泳迁移率)可以经选择以便具有与相关扩增子相同的信号。或者，在一些实施例中，可选择大小标准(重量/电荷比，不是电泳迁移率)以便具有与相关扩增子不同的分离特性，在理解差异的不可预测性质的情况下，可确定扩增子的身份。
在其它实施例中，公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含第一带盖的管或其它形式的流体输送，其包含包含如本文公开的甲磺酸盐的PCR预混液；和第二带盖的管或其它形式的流体输送，其包含引物；以及第三带盖的管或其它形式的输液管，其包含等位基因阶梯。
方法
在一些实施例中，公开了一种方法。所公开的方法需要使样品与包含甲磺酸盐的组合物接触，并且使这一组合经历PCR扩增。
“样品”是指疑似含有核酸的固体或液体。样品可以是例如血液、唾液、口腔液、精液或阴道液。样品可以是细胞收集于其上的滤纸；举例来说，口腔细胞、血细胞、精液或阴道液。样品可以是已经与表面接触的滤纸，例如滤纸上存在指纹的表面。样品可以是拭子或其一部分，细胞已经收集于其上；举例来说，口腔细胞、血细胞、精液或阴道液。拭子可以由如棉或
Figure BDA0002357430200000371
的材料制成。样品可以是已与表面接触的拭子；举例来说，上面存在指纹、血液、唾液或阴道液的表面。
在一些实施例中，方法包含使样品与组合物接触，其中所述组合物包含甲基磺酸钾(30-80mM)。在所述方法的其它实施例中，组合物包含包含甲基磺酸镁(1.2-1.8mM)。在所述方法的一些实施例中，组合物包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)和甲基磺酸钾(30-80mM)。在所述方法的一些实施例中，组合物包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)和甲基磺酸镁(1.2-1.8mM)。在所述方法的一些实施例中，组合物包含甲磺酸盐和蛋白质化合物。在所述方法的一些实施例中，蛋白质化合物为白蛋白。在所述方法的一些实施例中，白蛋白为牛血清白蛋白(1.2-6.0mg/ml)。在所述方法的一些实施例中，组合物包含Tris-甲磺酸盐-HCl(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)和牛血清白蛋白(1.2-6.0mg/ml)。在所述方法的一些实施例中，组合物包含甲磺酸盐和稳定剂化合物。在所述方法的一些实施例中，稳定剂化合物为甘油。在所述方法的一些实施例中，甘油以1.2-8％存在于组合物中。在一些实施例中，甘油以2、3.0、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5％存在于组合物中。在所述方法的其它实施例中，稳定剂化合物为蔗糖。在所述方法的一些实施例中，组合物包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中非离子清洁剂以0.1-0.9％存在。在所述方法的一些实施例中，非离子清洁剂为聚山梨醇酯20。在所述方法的一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.1-0.9％存在。在所述方法的一些实施例中，聚山梨醇酯20以0.2％存在。在所述方法的一些实施例中，组合物包含甲磺酸盐、蛋白质化合物、稳定剂化合物、非离子清洁剂和硫酸镁，其中硫酸镁为1.2-2.4mM。在所述方法的一些实施例中，硫酸镁为1.6mM。在所述方法的一些实施例中，组合物包含甲磺酸盐和聚合酶。在所述方法的一些实施例中，聚合酶为DNA聚合酶。在所述方法的一些实施例中，DNA聚合酶是Taq。
在所述方法的一些实施例中，组合物包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶。
在一些实施例中，所公开的方法需要使样品与组合物接触，其中样品包含核酸，并且组合物包含Tris-甲磺酸盐-HCl(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶。在一些实施例中，所公开的方法需要使样品与组合物接触，其中样品包含口腔细胞，并且组合物包含Tris-甲磺酸盐-HCl(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01--0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶。在一些实施例中，所公开的方法需要使样品与组合物接触，其中样品包含血细胞，并且组合物包含Tris-甲磺酸盐-HCl(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶。在一些实施例中，所公开的方法需要使样品与组合物接触，其中样品包含滤纸，并且组合物包含Tris-甲磺酸盐-HCl(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶。在一些实施例中，所公开的方法需要使样品与组合物接触，其中样品包含疑似具有核酸的滤纸，并且组合物包含Tris-甲磺酸盐-HCl(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶。在一些实施例中，所公开的方法需要使样品与组合物接触，其中样品包含滤纸，所述滤纸包含口腔或血细胞，并且组合物包含Tris-甲磺酸盐-HCl(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶。
在一些实施例中，所公开的方法需要使样品与包含甲磺酸盐的组合物接触，并且由此形成接触样品，并且使接触样品经历热循环方案并由此形成循环样品。“热循环方案”是指重复温度程序，使接触样品达到第一温度和第二温度，或第一、第二和第三温度。热循环方案的非限制性实例是将接触样品的温度达到95℃，且随后达到65℃，且随后回到95℃或95℃，且随后达到55℃，且随后达到72℃，且随后回到95℃。这些温度中的每一个都维持不同的时间量，通常从一秒到几分钟。
因此，在所述方法的一些实施例中，使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次。在所述方法的一些实施例中，使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，并且随后回到第一温度至少20次，但不超过50次。在所述方法的一些实施例中，使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，并且随后回到第一温度至少25次，但不超过50次。在所述方法的一些实施例中，使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，并且随后回到第一温度至少25次，但不超过35次。
在所述方法的一些实施例中，使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，随后达到第三温度，并且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次。在所述方法的一些实施例中，使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，随后达到第三温度，并且随后回到第一温度至少20次，但不超过50次。在所述方法的一些实施例中，使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，随后达到第三温度，并且随后回到第一温度至少25次，但不超过50次。在所述方法的一些实施例中，使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，随后达到第三温度，并且随后回到第一温度至少25次，但不超过35次。
在一些实施例中，公开了一种方法，所述方法需要使样品与组合物接触，且从而形成接触样品，并使接触样品经历热循环方案，且从而形成循环样品，其中样品包含核酸，所述组合物包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶，并且热循环方案包含使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次。在其它实施例中，热循环方案包含使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，随后达到第三温度，并且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次。
在一些实施例中，所公开的方法需要使样品与组合物接触，且从而形成接触样品，并使接触样品经历热循环方案，且从而形成循环样品，其中样品包含口腔细胞，所述组合物包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶，并且热循环方案包含使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次。在其它实施例中，热循环方案包含使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，随后达到第三温度，并且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次。
在一些实施例中，所公开的方法需要使样品与组合物接触，且从而形成接触样品，并使接触样品经历热循环方案，且从而形成循环样品，其中样品包含血细胞，所述组合物包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶，并且热循环方案包含使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次。在其它实施例中，热循环方案包含使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，随后达到第三温度，并且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次。
在一些实施例中，所公开的方法需要使样品与组合物接触，且从而形成接触样品，使接触样品经历热循环方案，且从而形成循环样品，其中样品包含疑似具有核酸的滤纸，所述组合物包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶，并且热循环方案包含使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次。在其它实施例中，热循环方案包含使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，随后达到第三温度，并且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次。
在一些实施例中，所公开的方法需要使样品与包含甲磺酸盐的组合物接触，且从而形成接触样品，使接触样品经历热循环方案，且从而形成循环样品，并且使循环样品经历电泳分离。
电泳使用电场与筛分基质的组合来分离分析物，如多核苷酸。在多核苷酸的情况下，每个核苷酸单元的磷酸基携带相对较强的负电荷，比碱基上的任何电荷强得多。因此，多核苷酸的质荷比在很大程度上与碱基组合物无关。
在电场存在下，10个核苷酸长的DNA分子将经历与100个核苷酸长的DNA分子上的相同的拉力。因此，根据长度电泳分离核酸物种，需要电泳种类通过阻碍移动性的筛分基质。较大物种穿过基质的进程比小分子慢。以此方式，在进行电泳时，较小物种在较大物种之前迁移。
电泳技术是毛细管电泳(CE)。在CE中，将标本引入装有聚合物溶液的狭窄毛细管的一端。聚合物溶液充当筛分基质。
通常通过检测沿毛细管的固定位置处的激光诱导的荧光来进行CE中分离的核酸物种的检测。将用荧光标记的引物用于扩增核酸物种。较小的经标记的核酸物种首先到达检测点，随后是较大的经标记的核酸物种。通过差异地标记引物，且进而标记扩增物种，可以在同一毛细管中分析多个轨迹。使用不同的染料甚至可以分辨以相同速率迁移的两种不同的核酸物种。
因此，在一些实施例中，公开了一种方法，其包含使样品与组合物接触，且从而形成接触样品，使接触样品经历热循环方案，且从而形成循环样品，且随后使循环样品经历电泳分离，其中样品包含疑似具有核酸的滤纸，所述组合物包含Tris-甲磺酸盐(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8％体积)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP(150-250mM)、dCTP(150-250mM)、dGTP(150-250mM)、dTTP(150-250mM)、引物对和DNA聚合酶，热循环方案包含使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次，且电泳分离为毛细管电泳。在其它实施例中，热循环方案包含使接触样品达到第一温度，随后达到第二温度，随后达到第三温度，并且随后回到第一温度至少15次，但不超过50次。
在一些实施例中，公开一种方法，所述方法包含使样品与组合物接触，且从而形成接触样品，使接触样品经历热循环方案，且从而形成循环样品，并且使循环样品经历电泳分离且从而侦测扩增子存在与否。“扩增子”是指扩增的多核苷酸序列；更具体地说，是PCR扩增产生的多核苷酸序列。
实例
在存在抑制剂的情况下，含有甲磺酸盐的PCR预混液改进扩增子回收率
在存在PCR抑制剂的情况下，在短串联重复序列轨迹的回收中，将含有甲磺酸盐的预混液与缺乏甲磺酸盐的预混液进行比较。制备含有Tris-甲磺酸盐(15mM)、35mM甲基磺酸钾、0.02％叠氮化钠、2.1％甘油、800mM(dNTP)、
Figure BDA0002357430200000444
4mg/ml牛血清白蛋白和0.28U/μl
Figure BDA0002357430200000445
Taq的PCR甲磺酸盐预混液。控制预混液含有Tris-甲磺酸盐·HCl(15mM)、35mM KCl、1.5mM MgCl2、0.02％叠氮化钠、2.1％甘油、800mM(dNTP)、
Figure BDA0002357430200000442
4mg/ml牛血清白蛋白和0.28U/μl
Figure BDA0002357430200000443
Taq。对于PCR，使用0.5ng男性DNA(克隆“007”)作为模板。短串联重复序列轨迹是扩增目标。这些实验中使用的抑制剂是腐殖酸(300ng/μl)。反应体积为25μl。
PCR条件为：95℃持续60秒，随后为29个循环(94℃，10秒；59℃，90秒)。在59℃下最终延伸之后，将反应物在60℃下保持10分钟且随后为4℃。
通过毛细管电泳检测扩增的短串联重复序列轨迹的存在与否。对于每个PCR，0.4μl GeneScanTM600LIZTM大小标准v2.0和9.6μl Hi-DiTM甲酰胺。在添加这些试剂之后，使每个反应物涡旋并且短暂地进行离心。随后将反应物加热至95℃维持3分钟，且随后置于冰上。此后，将反应物装载到毛细管电泳仪器上。通过检测荧光确定扩增的短串联重复序列轨迹的存在与否。荧光标记用于扩增每个短串联重复序列轨迹的每个引物对的一个引物。
实验线的结果如图1所示。相对于含有无甲磺酸盐的预混液的反应，使用含有甲磺酸盐的预混液进行PCR使得检测到明显更多的短串联重复序列轨迹。
在存在抑制剂的情况下，含有甲磺酸盐的PCR预混液改进来自血液的扩增子回收率
血液是法医调查期间收集的常见样品类型。在抑制剂存在下，测试了含有甲磺酸盐的预混液是否会改进来自血液的扩增子回收率。上文直接描述所遵循的实验条件。唯一的例外是，用
Figure BDA0002357430200000446
纸上点样的血液代替了007 DNA作为模板来源。来自此实验的结果显示于图2中。
当模板来源为血液时，相对于含有无甲磺酸盐的预混液的反应，使用含有甲磺酸盐的预混液进行PCR使得检测到明显更多的短串联重复序列轨迹。
确定预混液组分和条件对甲磺酸盐预混液性能的影响的“实验设计”测试
实验设计是确定影响过程的因素与所述过程的输出之间的关系的系统方法。测试了许多组分和条件，以确定那些因素如何影响甲磺酸盐预混液的性能。这些测试包括pH值和不同浓度的甲基磺酸钾、甲基磺酸镁、聚山梨醇酯20、dNTP、牛血清白蛋白和Taq聚合酶对甲磺酸盐预混液性能的影响。每个测试使用两个样品。并且每个测试重复四次。
表2总结了这种测试的实例；通过改变甲磺酸盐母液中的聚合酶活性的量和牛血清白蛋白和聚山梨醇酯20的百分比，同时保持甲磺酸盐预混液的其它组分和条件固定，来确定Taq聚合酶、牛血清白蛋白和聚山梨醇酯20的影响。
表2
Taq聚合酶 牛血清白蛋白 聚山梨醇酯20
0.2单位/μl 2.0mg/ml 0
0.2单位/μl 2.0mg/ml 0.4％
0.2单位/μl 3.0mg/ml 0.2％
0.2单位/μl 4.0mg/ml 0
0.2单位/μl 4.0mg/ml 0.4％
0.25单位/μl 2.0mg/ml 0.2％
0.25单位/μl 3.0mg/ml 0
0.25单位/μl 3.0mg/ml 0.2％
0.25单位/μl 3.0mg/ml 0.4％
0.25单位/μl 4.0mg/ml 0.2％
0.3单位/μl 2.0mg/ml 0
0.3单位/μl 2.0mg/ml 0.4％
0.3单位/μl 3.0mg/ml 0.2％
0.3单位/μl 4.0mg/ml 0
0.3单位/μl 4.0mg/ml 0.4％
实验设计测试的数据的概述如图3所示。

Claims (15)

1.一种PCR预混液，其包含甲磺酸盐。
2.根据权利要求1所述的PCR预混液，其进一步包含稳定剂化合物。
3.根据权利要求2所述的PCR预混液，其中所述稳定剂化合物包含甘油或蔗糖。
4.根据权利要求1所述的PCR预混液，其进一步包含蛋白质化合物。
5.根据权利要求4所述的PCR预混液，其中所述蛋白质化合物是牛血清白蛋白。
6.根据权利要求1所述的PCR预混液，其进一步包含脱氧核苷三磷酸。
7.根据权利要求1所述的PCR预混液，其进一步包含DNA聚合酶。
8.根据权利要求1所述的PCR预混液，其中所述甲磺酸盐是甲基磺酸钾。
9.根据权利要求1所述的PCR预混液，其包含：三-甲磺酸盐(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)和甘油(3-8体积％)。
10.根据权利要求9所述的PCR预混液，其进一步包含脱氧核苷三磷酸、非离子清洁剂和DNA聚合酶。
11.一种试剂盒，其包含包含预混液的第一带盖的管和包含引物的第二带盖的管，所述预混液包含甲磺酸盐。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述预混液进一步包含蛋白质化合物。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述预混液进一步包含聚合酶。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其进一步包含第三带盖的管，所述第三带盖的管包含等位基因阶梯。
15.一种方法，所述方法包含将样品与PCR预混液接触，从而形成接触样品，所述PCR预混液包含三-甲磺酸盐(10-50mM)、甲基磺酸钾(30-80mM)、牛血清白蛋白(1.2-4mg/ml)、甘油(3-8体积％)、MgSO4(1.4-2.4mM)、叠氮化钠(0.01-0.04％)、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、至少两种引物和一种DNA聚合酶；对所述接触样品执行热循环方案使形成循环样品；以及对所述循环样品执行电泳分离从而检测出扩增子的存在与否。
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杜绍财 等: "稳定剂保护PCR扩增dU-DNA效果研究", 《中国现代医学杂志》, vol. 13, no. 2, 31 January 2003 (2003-01-31), pages 4 - 6 *

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