JP2005518215A - リコンビナーゼポリメラーゼ増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、U.S.S.N.60/358,563(2002年2月21日出願)に対する優先権の利益を主張する。U.S.S.N.60/358,563は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
本明細書を通して、種々の特許、公開特許出願および科学参考文献が、当該分野の水準および内容を記載するために、引用される。これらの開示は、その全体が、本明細書中で参考として援用される。
本発明は、RPAと称されるDNA増幅方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する。第一に、第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーとリコンビナーゼ因子とを接触させて、第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを形成する。第二に、この第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを、二本鎖標的配列に接触させて、第一鎖の第一の部分において第一の二本鎖構造を形成し、そして該二鎖の第二の部分にて第二の二本鎖構造を形成し、その結果、この第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーの3’末端は、所定のテンプレートDNA分子上で互いに向かい合う。第三に、この第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーの3’末端を、DNAポリメラーゼによって伸長させて、第一の二本鎖核酸および第二の二本鎖核酸、ならびに第一の核酸置換鎖および第二の核酸置換鎖を生成する。最後に、所望の程度の増幅が達成されるまで、第二の工程および第三の工程を繰り返す。
本発明は、標的核酸ポリマーの増幅のための方法である、リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅(RPA)を提供する。RPAの1つの利点は、これが、二本鎖テンプレートの熱融解を必要とせずに実施され得、従って、高価なサーモサイクラーもまた排除するという点である。本発明は、RPAが標的核酸ポリマーの指数関数的増幅を可能にするように構成され得る、2つの関連するストラテジーを記載する。
リーディング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅(lsRPA)において、一本鎖または部分的に一本鎖の核酸プライマーが、Dループ構造を形成するリコンビナーゼ因子を使用して、相同な二本鎖または部分的に二本鎖の配列に標的化される。侵入一本鎖プライマー(これは、Dループの一部である)が、ポリメラーゼ合成反応を開始するために使用される。単一のプライマー種が、二本鎖侵入およびその後の合成の、複数のラウンドを通じて、標的核酸配列を増幅する。2つの対向するプライマーが使用される場合、フラグメント(標的配列)の増幅が達成され得る。lsRPAは、図1および2において簡潔に記載される。
RPAは、RecAまたは機能的ホモログで覆われた合成オリゴヌクレオチドを使用して配列を標的化することによって開始される。指数関数的増幅を可能にするために、2つのこのような合成オリゴヌクレオチドを、その遊離3’末端が互いに対して向き合うような様式で、使用した。これらのオリゴヌクレオチドおよびRecAタンパク質を含む核タンパク質フィラメントは、複雑なDNA中の標的を、迅速かつ特異的に同定する。一旦標的化されると、RecAタンパク質が鎖交換を触媒し、その結果、Dループ構造が形成される。効率的な増幅のための手順において、ATPγSではなくATPを使用することが必要であり得る。ATPが使用される場合、RecO分子、RecR分子および/またはRecF分子は、効率的な増幅に重要であることを立証し得る。
DNAポリメラーゼは、侵入オリゴヌクレオチドとテンプレートDNAとの間のハイブリッドを検出し、そしてこのハイブリッドに結合し、そしてハイブリッド中の露出した遊離3’−ヒドロキシルからDNA合成を開始する。この3’−ヒドロキシルの露出および引き続くDNA合成は、鎖交換によって形成された二本鎖ハイブリッドからの、RecAタンパク質の解体を必要とする可能性がある。この解体に達するために、侵入複合体からのRecAの自発的な解体を支持し得る、ATPを使用する必要がおそらくある。さらに、解体は、鎖交換産物からRecAを剥ぎ取るように作用し得る、反応混合物中に含まれる他のタンパク質(例えば、RuvA、RuvB、RuvC、recG、他のヘリカーゼ)または他の刺激成分の使用によって、刺激/増強され得る。
DNAポリメラーゼが、侵入オリゴヌクレオチドの遊離3’−ヒドロキシルを使用して、テンプレートDNAの相補コピーまたはそれらの部分的伸長産物を合成する場合、このポリメラーゼは、反応中に含まれる一本鎖結合タンパク質(SSB)で覆われ得る、一本鎖DNAを置換する。理想的な構成において、標的核酸配列の両方の末端でのオリゴヌクレオチドの侵入は、同じテンプレート核酸上の2つのポリメラーゼが、互いに向かって最初に進行するように、類似の時間枠で生じる。これらの伸長する複合体が互いに遭遇する場合、元のテンプレートは、単純にばらばらにされるはずであり、そしてポリメラーゼは、鎖置換を必要とせずに合成し続けて、ここで、SSBに結合したssDNAテンプレートをコピーする。立体障害に起因して、ポリメラーゼが遭遇して、2つのテンプレート鎖の分離を可能にする場合、テンプレートから一時的に解離し得る。
一旦、テンプレート鎖が分離されると、ポリメラーゼは、テンプレートの末端への(または、最初のテンプレートが所望の産物よりも長い場合、第二の対向する標的部位として作用する配列を通過して)伸長を完了し得る。指数関数的増幅を可能にするために、両方の標的化末端からである、元のテンプレートと類似の様式で、新たな産物が標的化および複製されることが必要である。新たに合成された標的化部位は、RecA/オリゴヌクレオチドフィラメントを標的化するために、自由に利用可能である。合成を開始するために最初に使用される部位はまた、鎖交換産物からのRecAの解体に有利な、反応系中の条件の使用の結果として、遊離化されていなければならない。この後者の部位での再侵入が、ポリメラーゼが第二の標的化部位を通過して合成し、その第二の部位で開始され、そして第一の部位に戻るのにかかる時間よりも短い時間で生じる場合、一本鎖DNAは、初代の産物ではなく、そして指数関数的増幅が生じる。同じテンプレートに対して作用する複数の合成複合体を有することは、非常に短い増幅時間が達成され得る可能性を上昇させる。
本発明者らの(リーディング鎖RPA)lsRPAの記載において、本発明者らは、標的化配列を再生する能力、従って、二本鎖DNAの指数関数的増幅を可能にする能力を有する多成分系を詳述する。Zarling法とは異なり、lsRPAは、一本鎖DNAの線形生成を回避する。一本鎖産物の可能性および同時末端開始の要件を完全に回避する、この問題を解決するための別のアプローチが存在する。この方法は、より複雑な反応混合物を必然的に包含する。それにもかかわらず、全ての必要な成分は、ここで十分理解され、そして単一の系への構築に従うはずである。この系は、細胞の正常な複製サイクルの間に生じる事象を繰り返して、リーディング鎖およびラギング鎖の合成を組み合わせることを可能にする。この方法、リーディング鎖/ラギング鎖RPAは、図1および3に簡単に記載される。
RPAは、RecAで覆われた合成オリゴヌクレオチドまたは機能的ホモログを使用して、配列を標的化することによって開始される。このような核タンパク質フィラメントは、複雑なDNA中の標的を、迅速かつ特異的に同定する。一旦標的化されると、RecAタンパク質は、Dループ構造が形成されるように、鎖置換を触媒する。効率的な増幅のための手順において、ATPγSではなくATPを使用することが必要であり得る。しかし、リーディング鎖およびラギング鎖の合成の連結は、合成開始後の非常に迅速なRecA剥ぎ取りの要件を排除し得る。ATPが使用される場合、RecO分子、RecR分子および/またはRecF分子は、効率的な増幅に重要であることを立証し得る。
プライモソームは、Dループにて構築され得る。通常、Dループ構造は、インビボのDNA損傷をレスキューする機構の一部として、または他の形態の組換えの間に、RecAによって形成される。RecA媒介性の鎖交換およびプライモソーム構築の合わされた作用の目的は、複製フォークを生成することである。複製フォークは、分離されたテンプレートDNAおよびレプリソーム(replisome)を含む核タンパク質構造である。このレプリソームは、ポリメラーゼホロ酵素複合体、プライモソームおよびテンプレートDNAの両方の鎖を同時に複製するために必要とされる他の構成要素からなる。プライモソームは、複製フォークの進行に必要な、DNA巻き戻しおよび岡崎フラグメントの開始機能の両方を提供する。
複製フォークは、プライモソーム構築の部位にて構築する。Dループの侵入鎖上の遊離3’末端の存在は、以前に詳述したDnaXクランプローダー複合体を刺激して、スライディングクランプとして作用するように、β−ダイマーをこの部位にて構築させる。ホロ酵素および2つのコアユニットは、足場τサブユニットによって一緒に連結される。τサブユニットはまた、プライモソームの、β−ダイマー要素、クランプローダー要素およびDnaBヘリカーゼ要素についての相互作用表面を有する。これらの複数の相互作用は、2つの非対称的に連結されたコアポリメラーゼ複合体を使用して、リーディング鎖およびラギング鎖の両方の合成を調和させるために必要である。
RPAにおいて、複製は、2つの離れた部位にて開始され、そして複製フォークは互いにい向き合っている。複製フォークが集中すると、2つの元のテンプレート鎖は、互いから解離して、各フォークの後ろおよび前の両方で、完全に分離する。次いで、各フォークのリーディング鎖コアが完全に合成され、残りのRNAプライマーがプロセシングされ、そして最終産物は、2つの二本鎖分子である。本発明者らは、このようなアプローチによって、数メガベース(Mb)規模で、DNAを増幅することを合理的に予測し得る。本開示において、メガベースはまた、メガ塩基対を包含する。PolIIIホロ酵素の既知の合成速度に基づいて、本発明者らは、複製フォークが、約1Mb/1000秒、すなわち、1Mbのフラグメントについて、1サイクル当たり約15〜20分の速度で進行することを予測し得る。
別の実施形態において、RPA複製は、「ネスティドRPA」と本明細書中で称されるプロセスにおいて実施され得る。
リーディング鎖RPA、リーディング鎖およびラギング鎖RPA、ならびにネスティドRPAの詳細は、上記に列挙した。この節は、上記で考察した3つの方法のいずれかについての、試薬およびパラメータの選択を記載する。
本発明のリコンビナーゼ因子は、RecA、RadA、RadB、Rad51またはこれらのタンパク質の機能的アナログもしくはホモログであり得る。所望の場合、リコンビナーゼは、温度感受性(本明細書中で「ts」という)リコンビナーゼ因子であり得る。tsリコンビナーゼが使用される場合、RPAは、1つの温度(許容温度)で開始され得、そして別の温度(非許容温度)で終結され得る。許容温度の組み合わせは、例えば、25℃/30℃、30℃/37℃、37℃/42℃などであり得る。好ましい実施形態において、tsタンパク質は可逆性である。可逆性tsタンパク質の活性は、非許容温度から許容温度にシフトする場合に、回復される。
DNA配列を、図1に示されるリコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅(RPA)方法に従うリーディング鎖合成を使用して増幅し得る。
RPA反応を、実施例1において記載されるように実施する。反応の1/10の画分および1/100の画分を取り出し、そして第二ラウンドのRPAにおいてDNAテンプレートの代わりに使用する。lsRPA、リーディング/ラギングRPAおよびこれらの組み合わせを、ネスティドRPAのために使用し得る。
DNA配列を、図2に示されるリコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅(RPA)方法に従うリーディング鎖およびラギング鎖の合成を使用して増幅し得る。
Claims (72)
- 二本鎖標的配列のDNA増幅のRPAプロセスであって、該標的配列は、DNAの第一鎖および第二鎖を含み、該プロセスは、以下の工程:
(a)第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーとリコンビナーゼ因子とを接触させて、第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを形成する工程;
(b)該第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを、該二本鎖標的配列に接触させ、それによって、該第一鎖の第一の部分において第一の二本鎖構造を形成し、そして該第二鎖の第二の部分にて第二の二本鎖構造を形成し、その結果、該第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーの3’末端は、同じテンプレート核酸分子上で互いに向かい合う、工程;
(c)該第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーの3’末端を、1つ以上のポリメラーゼおよびdNTPを用いて伸長させて、第一の二本鎖核酸および第二の二本鎖核酸、ならびに第一の核酸置換鎖および第二の核酸置換鎖を生成する、工程、
(d)所望の程度の増幅が達成されるまで、(b)および(c)を繰り返して、該反応を継続する工程、
を包含する、プロセス。 - 前記工程(C)において、前記核酸の置換鎖は、同時RPA反応によって増幅される、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸の置換鎖が、以下:
(a)前記第一の核タンパク質プライマーまたは第二の核タンパク質プライマーを、該置換鎖と接触させる工程;および
(b)該第一の核タンパク質プライマーまたは第二の核タンパク質プライマーを、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて伸長させる工程、
によって増幅される、請求項2に記載の方法。 - 前記第一の置換鎖および第二の置換鎖が、互いに対して少なくとも部分的に相補的であり、かつハイブリダイズして、娘二本鎖核酸を形成し得、該娘二本鎖核酸は、引き続く工程(b)および(c)において、二本鎖テンプレート核酸として作用し得る、請求項1に記載のプロセス。
- 前記第一の置換鎖および第二の置換鎖が、前記第一のプライマーまたは第二のプライマーに対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ該第一のプライマーまたは第二のプライマーにハイブリダイズし得る、請求項1に記載のプロセス。
- 前記核酸プライマーが、DNA、RNA、PNAまたはそれらの組み合わせである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記核酸プライマーの各々が、少なくとも1つの一本鎖3’領域を有する、請求項1に記載のプロセス。
- 少なくとも1つのプライマーが、部分的に一本鎖かつ部分的に二本鎖であり、ここで、該プライマーは、特異的3’プライマー配列を有するより長い侵入鎖、および該より長い侵入鎖の5’末端に相補的なより短い非侵入鎖から構成される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記第一の核酸プライマーが、第一の非侵入鎖を含み、そして前記第二の核酸プライマーが、第二の非侵入鎖を含み、そして該第一の非侵入鎖および第二の非侵入鎖が、互いに相補的である、請求項8に記載のプロセス。
- 前記侵入鎖、前記非侵入鎖、または該侵入鎖および該非侵入鎖の両方が、検出可能な部分で標識されている、請求項9に記載のプロセス。
- 前記検出可能な部分が、蛍光色素、酵素、蛍光クエンチャー、酵素インヒビター、放射性標識およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項10に記載のプロセス。
- 前記侵入鎖および前記非侵入鎖の両方が標識され、該侵入鎖は、第一の蛍光色素または第一の酵素で標識されており、そして該非侵入鎖は、第二の蛍光色素、第二の酵素、蛍光クエンチャーまたは酵素インヒビターで標識されている、請求項10に記載のプロセス。
- 前記侵入鎖および前記非侵入鎖の両方が標識され、該非侵入鎖は、第一の蛍光色素または第一の酵素で標識されており、そして該侵入鎖は、第二の蛍光色素、第二の酵素、蛍光クエンチャーまたは酵素インヒビターで標識されている、請求項10に記載のプロセス。
- 前記核酸プライマーの一方または両方が、一本鎖プライマーである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記一本鎖プライマーが、蛍光色素、酵素、蛍光クエンチャー、酵素インヒビター、放射性標識およびこれらの組み合わせからなる群より選択される検出可能な部分で標識されている、請求項14に記載のプロセス。
- 工程(d)が、前記非侵入鎖の置換を引き起こす、請求項1に記載のプロセス。
- 前記侵入鎖および前記非侵入鎖が標識され、該侵入鎖と該非侵入鎖との分離が検出される、請求項9に記載のプロセス。
- 部分的に二本鎖の侵入オリゴヌクレオチドの一方の放出された鎖が、他方の二本鎖侵入オリゴヌクレオチドの放出された鎖に対して相補的な配列である、請求項1に記載のプロセス。
- 前記放出されたオリゴヌクレオチドが、一本鎖標的テンプレートに対して相補的であり、かつ該一本鎖標的テンプレートにハイブリダイズし、そして該一本鎖標的テンプレートの3’末端からのDNA合成を開始する、請求項18に記載のプロセス。
- 前記リコンビナーゼ因子が、RecA、RadA、RadB、Rad51、そのホモログ、その機能的アナログおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記ホモログが、E.coli RecAの193〜212残基である、請求項20に記載のプロセス。
- 前記ホモログが、RecA、RadAまたはRadBの古細菌ホモログである、請求項20に記載のプロセス。
- 前記リコンビナーゼ因子が、温度感受性であり、ここで、該温度感受性リコンビナーゼ因子は、許容温度で鎖侵入活性を有し、そして非許容温度で鎖侵入活性を有さない、請求項1に記載のプロセス。
- 前記RPAプロセスが、ATPまたはATPアナログの存在下で実施される、請求項1に記載のプロセス。
- RecO、RecRおよびRecFの存在下で実施される、請求項25に記載のプロセス。
- 前記ATPアナログが、dATP、ddATP、ATPγSおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項25に記載のプロセス。
- 前記1つ以上のポリメラーゼが、原核生物ポリメラーゼまたは真核生物ポリメラーゼである、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 前記原核生物ポリメラーゼが、E.coli pol I、E.coli pol II、E.coli pol III、E.coli pol IV、E.coli pol Vまたはこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項27に記載のRPAプロセス。
- 前記真核生物ポリメラーゼが、pol−α、pol−β、pol−δ、pol−εおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、真核生物の多タンパク質ポリメラーゼ複合体である、請求項27に記載のRPAプロセス。
- 前記所望の程度の増幅が、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、または少なくとも1,000,000倍である、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 前記第一の部分および第二の部分が、間に入る標的DNA配列にわたる、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 前記間に入る標的DNA配列が、少なくとも1メガベースである、請求項31に記載のRPAプロセス。
- 1つ以上の補助成分の存在下で実施される、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 前記1つ以上の補助成分が、E.coli由来である、請求項33に記載のRPAプロセス。
- 前記補助成分が、一本鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、レソルバーゼおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項34に記載のRPAプロセス。
- 前記補助成分が、RecF、RecO、RecR、一本鎖結合タンパク質、RuvA、RuvB、RuvC、RecG、PriA、PriB DnaT、DnaB、DnaC、DnaG、E.coli β−ダイマースライディングクランプ、DnaXクランプローダー、ポリメラーゼコア複合体、DNAリガーゼである、請求項34に記載のRPAプロセス。
- 前記補助部分が、E.coli β−ダイマースライディングクランプ、真核生物PCNAスライディングクランプ、T4スライディングクランプgp45およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるスライディングクランプである、請求項34に記載のRPAプロセス。
- 前記補助成分が、β−クランプ、DnaXクランプローダーおよびポリメラーゼコア複合体からなる、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素複合体である、請求項34に記載のプロセス。
- 前記補助成分が、一本鎖結合(SSB)タンパク質、スライディングクランプ、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、レソルバーゼおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項34に記載のプロセス。
- 前記一本鎖結合(SSB)タンパク質が、E.coli由来である、請求項39に記載のプロセス。
- 前記スライディングクランプが、E.coli β−ダイマースライディングクランプ、真核生物PCNAスライディングクランプまたはT4スライディングクランプ(gp45)である、請求項40に記載のプロセス。
- 前記補助部分が、RuvA、RuvB、RuvCおよびRecGである、請求項34に記載のプロセス。
- 前記プロセスが、RecA/ssDNA核タンパク質フィラメントを安定化する因子の存在下で実施される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記因子が、RecR、RecO、RecFまたはこれらの組み合わせである、請求項43に記載のプロセス。
- 前記補助部分が、PriA、PriB、DnaT、DnaB、DnaCおよびDnaGからなるプライモソーム複合体である、請求項34に記載のプロセス。
- 前記プロセスが、20℃と50℃との間で実施される、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 前記プロセスが、20℃と40℃との間で実施される、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 前記プロセスが、20℃と30℃との間で実施される、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 前記プロセスが、前記テンプレート核酸の温度誘導性の溶融なしに実施される、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 前記2つの核タンパク質プライマーが、各々、少なくとも1000:1のプライマー:二本鎖核酸標的のモル比で存在する、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 前記工程(b)および(c)が、少なくとも1回繰り返される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記工程(b)および(c)が、少なくとも5回繰り返される、請求項1に記載のプロセス。
- 少なくとも1つのプライマーが、増幅されるべき特異的配列と相補的でない1つ以上のヌクレオチドを含む、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 少なくとも1つのプライマーが、その5’末端で前記標的配列と相補的でない1つ以上のヌクレオチドを含む、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 前記少なくとも1つのヌクレオチドが、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の配列を含むオリゴヌクレオチドである、請求項54に記載のRPAプロセス。
- 前記増幅された核酸が、遺伝病に関連する少なくとも1つの特異的変異を含む、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 前記増幅された核酸配列が、病原生生物、癌遺伝子、活性化癌遺伝子または抑制された癌遺伝子中に含まれる、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 少なくとも1つのプライマーが、遺伝病に関連する配列に対して相補的である、請求項1に記載のRPAプロセス。
- 少なくとも1つのプライマーが、病原生生物、癌遺伝子、活性化癌遺伝子または抑制された癌遺伝子中の核酸配列に対して相補的である、請求項1に記載のRPAプロセス。
- ネスティドRPA増幅のプロセスであって、該プロセスは、以下の工程:
(a)第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いて請求項1に記載のRPAプロセスを使用してDNAの領域を増幅して、第一の増幅産物を生成する工程;
(b)第三および第四のプライマーを用いて請求項1に記載のRPAプロセスを使用して該増幅産物を増幅して、第二の増幅産物を生成する工程であって、ここで、該第二の増幅産物は、該第一の増幅産物内に含まれる、より小さい配列である、工程、
を包含する、プロセス。 - 前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、前記第三のプライマーおよび前記第四のプライマーが、各々異なる、請求項60に記載のプロセス。
- 前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーの一方が、前記第三のプライマーおよび第四のプライマーの一方と同一である、請求項60に記載のプロセス。
- 二本鎖標的分子のDNA増幅のRPAプロセスであって、該プロセスは、以下の工程:
(a)リコンビナーゼ因子を、第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーと接触させて、第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを形成する工程;
(b)該第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを、該二本鎖標的配列に接触させ、それによって、該標的分子の第一の部分において第一の二本鎖構造を形成し、そして該標的分子の第二の部分にて第二の二本鎖構造を形成し、その結果、該第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーの3’末端は、同じテンプレート核酸分子上で互いに向かい合う、工程;
c)該標的配列を、プライモソーム構築タンパク質およびクランプローダー/ポリメラーゼIIIホロ酵素複合体と接触させて、該標的分子の第一の部分にて複製フォークを形成し、そして該標的分子の第二の部分にて第二の複製フォークを形成する、工程;
d)該標的分子を、DNAポリメラーゼIIIコア、DNAポリメラーゼI、プライマーゼ、ヘリカーゼおよびリガーゼに接触させて、リーディング鎖とラギング鎖のDNA合成を組み合わせ、そして該複製フォークを互いに対して移動させる、工程;
f)所望の程度の増幅が達成されるまで、工程(b)、(c)および(d)の繰り返しによって該反応を継続する、工程、
を包含する、プロセス。 - dNTPおよびrNTPの存在下で実施される、請求項63に記載の方法。
- 一本鎖DNA結合タンパク質の存在下で実施される、請求項63に記載の方法。
- 前記リコンビナーゼ因子が、RecAまたはその機能的ホモログである、請求項63に記載の方法。
- 前記プライモソーム構築タンパク質が、PriA、PriB、PriC、DnaT、DnaC、DnaB、DnaG、Pol IIIホロ酵素およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項63に記載の方法。
- 前記クランプローダーが、DnaXクランプローダー複合体である、請求項63に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼIIIホロ酵素が、E.coliポリメラーゼIIIである、請求項63に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼIが、E.coliポリメラーゼIである、請求項68に記載の方法。
- 前記プライマーゼが、E.coli DnaGプライマーゼである、請求項68に記載の方法。
- 前記ヘリカーゼが、E.coli DnaBヘリカーゼである、請求項68に記載の方法。
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