PT1368045E

PT1368045E - Processo para obtenção de decoctos de cascas de vitis labrusca e vitis vinifera

Info

Publication number: PT1368045E
Application number: PT02702184T
Authority: PT
Inventors: R S Moura
Original assignee: Univ Do Estado Do Rio De Janei
Priority date: 2001-03-13
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2006-12-29
Also published as: ES2269650T3; EP1368045A1; CA2440333C; EP1368045B1; DE60213211T2; CA2440333A1; US20040202737A1; WO2002072118A1; BRPI0106382B1; MXPA03008161A; BR0106382A; ATE333283T1; JP2004525124A; DE60213211D1; BRPI0106382B8

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE DECOCTOS DE CASCAS DE VITIS LABRUSCA E

VITIS VINIFERA

Processo para obtenção de decoctos de cascas de Vitis labrusca e Vitis vinifera; Processo para obtenção de hidroalcoólicos e hidroalcoólicos de acetato de etilo a partir dos decoctos; preparações farmacêuticas contendo o decocto e os extractos e indicações terapêuticas das preparações na prevenção e tratamento de hipertensão arterial e outras doenças cardiovasculares. I) Campo da Invenção A presente invenção trata de produtos que possuem propriedades anti-hipertensivas, processo de obtenção de produtos a partir de plantas pertencendo à familia Vitacea mais especificamente as espécies Vitis labrusca e Vitis vinifera, aplicação daqueles produtos, processo para obtenção daqueles produtos, mais especificamente um processo para obtenção de um decocto a partir de cascas daquelas plantas, mais especificamente um processo para obtenção de um extracto hidroalcoólico e hidroalcoólico de acetato de etilo a partir daqueles decoctos, mais especificamente, um processo para obtenção de preparações farmacêuticas contendo estes produtos e indicações terapêuticas de preparações farmacêuticas no tratamento de hipertensão arterial e doenças causadas por hipertensão arterial. 1 II) Antecedentes da Invenção A hipertensão arterial é uma doença com elevada prevalência entre a população adulta e induz muitos efeitos deletérios em doentes hipertensos, incluindo disfunções cardíacas, renais e cerebrais. A hipertensão arterial é, neste momento, uma das maiores causas de morte. Por conseguinte, o tratamento farmacológico, que possui o âmbito de reduzir o nivel elevado de pressão sanguínea arterial e as complicações cardiovasculares da hipertensão arterial, é útil para o doente e suportado pela agência de saúde pública. Normalmente, o tratamento farmacológico da hipertensão é obtido com utilização de diuréticos, agentes beta-bloqueantes, inibidores do sistema renina-angiotensina, inibidores do sistema simpático e compostos vasodilatadores.

Dados da literatura sugerem que a mortalidade cardiovascular esteja inversamente relacionada com ingestão moderada de bebidas alcoólicas. Leger et ai., L: Lancet 1:1017-1020, 1979 sugeriram que a ingestão diária de quantidade moderada de vinho tinto pode ser responsável pela baixa incidência de doença cardiaca coronária. Esta observação foi cunhada como "Paradoxo Francês" (Lancet 338:464-486, 1991) visto que a incidência de doença cardiaca coronária em algumas partes de França, onde a ingestão de uma dieta rica em gordura não está correlacionada com uma incidência elevada de doença cardiaca coronária, como observado em outros países. Uma explicação para o Paradoxo Francês poderia estar relacionada com a presença de polifenóis no vinho tinto, compostos que poderiam actuar sobre o metabolismo de LDE, um importante factor de risco para a doença cardíaca coronária. 2

Neste momento, os mecanismos da protecção induzida pelo pequeno consumo de vinho na redução da mortalidade cardiaca não são conhecidos, mas provavelmente uma acção sobre o metabolismo dos lipidos pode ser tida em consideração. Por mais que se considere que a hipertensão arterial é um factor de risco importante para a doença cardiaca coronária, a presente invenção suqere um mecanismo protector baseado nos dados experimentais objecto desta patente, que demonstrou que produtos obtidos a partir de cascas de uva reduzem o desenvolvimento de hipertensão arterial em ratos, e também reduzem os niveis elevados de pressão sanguinea arterial na hipertensão experimental. III) Sumário da Invenção. A presente invenção refere-se a um processo para obtenção de produtos que possuem propriedades anti-hipertensivas. Refere-se, igualmente, àqueles produtos que são obtidos a partir de plantas pertencendo à familia Vitacea, mais especificamente às espécies Vitis vinifera e Vitis labrusca, em particular, a um processo para obtenção de produtos que incluem extracção daqueles produtos dos frutos daquelas plantas.

Mais particularmente, a presente invenção, refere-se ao processo para obtenção de produtos que possuem actividade anti-hipertensiva, que inclui separação de cascas, polpas e grainhas dos frutos, para obtenção de um decocto a partir das cascas dos frutos e extracção do decocto com solventes, particularmente solventes fisiologicamente aceitáveis como etanol, acetato de etilo e/ou as suas misturas, e processo posterior dos decoctos e extractos para obtenção de produtos com actividades farmacológicas. 3

Mais particularmente, a presente invenção refere-se também, a métodos de obtenção de produtos com propriedades anti-hipertensivas como decocção, que incluem uma extracção com um solvente fisiologicamente aceitável, como por exemplo, água como uma decocção durante 3 a 30 minutos. A presente invenção refere-se igualmente ao processamento dos decoctos e extractos para obtenção de produtos com actividades farmacológicas. A presente invenção refere-se igualmente a processos para obtenção de produtos, como os extractos hidroalcoólicos e hidroalcoólicos de acetato de etilo, e posterior separação, concentração e liofilização para obtenção dos produtos.

Igualmente, a presente invenção refere-se, como acima mencionado, aos produtos anteriormente mencionados per se e, também, à utilização dos produtos anteriormente mencionados e medicamentos contendo os produtos anteriormente mencionados, com propriedades anti-hipertensivas. IV) Descrição condensada da metodologia utilizada. A presente invenção é suportada por dados científicos obtidos em experimentações químicas e farmacológicas. Abaixo, dá-se uma visão resumida do processo de investigação que suporta a invenção. 4 IV.A) Método para obtenção dos decoctos de casca de uva.

Os frutos de Vitis labrusca e Vitis vinífera foram lavados e após separação das polpas, as cascas foram colocadas dentro de um recipiente feito de vidro neutro ou de aço inoxidável, contendo uma determinada quantidade de água destilada, fervidas, picadas e deixadas maceradas durante um determinado periodo de tempo e, posteriormente, filtradas com o fim de obter a fase liquida do decocto. A fase liquida é concentrada num evaporador rotativo de baixa pressão a aproximadamente 40 °C e, em seguida, liofilizada. O liofilizado é mantido congelado (-20 °C). IV.B) Método de obtenção do extracto hidroalcoólico de casca de uva a partir do decocto de cascas.

Os frutos de Vitis labrusca ou Vitis vinífera foram lavados e após separação das polpas, as cascas foram colocadas dentro de um recipiente feito de vidro neutro ou de aço inoxidável contendo uma determinada quantidade de água destilada e fervidas. O decocto foi picado, extraído com etanol, a mesma quantidade de água e, em seguida, deixado macerado durante um determinado período de tempo. A mistura é filtrada, a fase líquida é mantida refrigerada e a fase semi-sólida pode ser extraída de novo com uma mistura de água/etanol (v:v) por uma ou duas vezes. As fases liquidas são concentradas num evaporador rotativo de baixa pressão a aproximadamente 40 °C e, em seguida, liofilizadas e mantidas a -20 °C. 5 IV.C) Método de obtenção de extracto hidroalcoólico de acetato de etilo de casca de uva a partir do decocto da casca.

Os frutos de Vitis labrusca ou Vitis vinífera foram lavados e após separação das polpas, as cascas foram colocadas dentro de um recipiente feito de vidro neutro ou de aço inoxidável contendo uma determinada quantidade de água destilada, fervidas, picadas, extrair com um mistura de etanol-acetato de etilo-decocto (v:v:v) e, em seguida, deixadas maceradas durante um determinado período de tempo. A mistura é filtrada, a fase líquida é mantida refrigerada e a fase semi-sólida pode ser extraída de novo com uma mistura de água/etanol/acetato de etilo (v:v:v), por uma ou duas vezes, as fases líquidas são concentradas num evaporador rotativo de baixa pressão a aproximadamente 40 °C e, em seguida, liofilizadas e mantidas a -20 °C. IV.D) Métodos farmacodinâmicos e farmacotécnicos.

As actividades farmacológicas dos produtos obtidos a partir de cascas de Vitis labrusca e Vitis vinífera foram avaliadas por testes farmacodinâmicos que avaliaram a acção anti-hipertensiva dos produtos em ratos com hipertensão espontânea, ratos com hipertensão de sal de Doca e ratos com hipertensão L-NAME. O método farmacotécnico refere-se à forma de obtenção de cápsulas contendo o liofilizado de extractos obtidos a partir de cascas de Vitis labrusca e Vitis vinífera. 6 V.) Descrição detalhada da Invenção.

No âmbito da presente invenção, os frutos das espécies Vitis labrusca e Vitis vinífera, antes de serem submetidos ao processo de extracção, de acordo com a invenção, se não forem utilizados após a colheita, podem ser armazenados durante longos períodos à temperatura de +4 a -20 °C. V.A) Método de obtenção do decocto de casca de uva.

Frutos de Vitis labrusca ou Vitis vinífera são lavados em água e a casca é separada da polpa. As cascas são lavadas em água, colocadas, mais tarde dentro de recipientes de vidro neutro ou de aço inoxidável, na proporção de 1 a 100 g de casca para 100 mL de água, por exemplo 25 g /100 mL e fervidas durante 3 a 60 minutos, por exemplo cerca de 5 minutos. Após o tempo de fervura, o decocto é deixado arrefecer para 20 a 90 °C, por exemplo 75 °C, e picado. O decocto picado foi macerado durante um determinado período de tempo (1 hora a 30 dias) , por exemplo 6 horas, no interior de um refrigerador, a 4 °C, ou a temperatura ambiente, por exemplo 25 °C, sob agitação. O decocto é filtrado num coador com poro de 0,1 a 1,0 mm, por exemplo 0,2 mm, sendo também filtrado através de gaze e, finalmente, filtrado através de um papel de filtro Whartman n.l. A fase líquida é concentrada num evaporador de baixa pressão a uma temperatura de 30 a 60 °C, por exemplo 40 °C, e, em seguida, liofilizada e mantida sob -4 a -70 °C. 7 V.B) Método de obtenção do extracto hidroalcoólico de casca de uva a partir do decocto. 0 decocto da casca de uva, após ser picado pouco tempo depois da fervura, é extraido com etanol a 95% numa proporção de decocto/etanol (v:v) de 1:0,5 a 1:10, por exemplo 1:1. Aquela mistura é picada e macerada durante um determinado periodo de tempo de 3 horas a 30 dias, por exemplo 6 horas, e mantida no interior de um frigorifico, a 4 °C, ou à temperatura ambiente, a 25 °C, e agitada. No fim do periodo de maceração é filtrada através de um coador com poros de 0,1 a 1 mm, por exemplo 0,2 mm, sendo também filtrada através de gaze e finalmente filtrada através de um papel de filtro, Whartman n.l. A fase semi-sólida pode ser extraída, de novo, nas mesmas condições como acima descrito, por 1 ou 3 vezes, por exemplo 2 vezes. A fase líquida da primeira extracção é mantida no interior de um frigorífico a 4 °C, e, em seguida, adicionada à fase liquida das outras extracções. A fase líquida final é concentrada num evaporador sob baixa pressão a uma temperatura de 35 a 65 °C, por exemplo 40 °C, e, em seguida liofilizada e mantida a -4 °C a -70 °C, por exemplo -20 °C. V.C) Método de obtenção do extracto hidroalcoólico de acetato de etilo de casca de uva a partir do decocto. O decocto, após ser picado depois da fervura, é extraído com uma mistura de decocto/etanol/acetato de etilo (v:v:v) de proporção variável, por exemplo 1:1:1. Aquela mistura é picada e macerada durante um determinado período de tempo, de 3 horas a 30 dias, por exemplo 6 horas, e mantida no interior de um frigorífico, a 4 °C, ou à temperatura ambiente, a 25 °C, e agitada. No fim do periodo de maceração o extracto é filtrado através de um papel de filtro Whartman η. I , a fase liquida mantida no interior de um frigorifico a 4 °C e a fase semi-sólida pode ser extraida, de novo, nas mesmas condições como descrito acima, por uma ou três vezes, por exemplo duas vezes. A fase liquida da primeira extracção é mantida no interior de um frigorifico a 4 °C, e em seguida, adicionada à fase liquida das outras extracções. A fase liquida final é concentrada num evaporador sob baixa pressão a uma temperatura de 35 a 65 °C, por exemplo 40 °C e, em seguida, liofilizada e mantida a 4 °C a -70 °C, por exemplo -20 °C. VI.) Observação Geral. O processo especifico descrito no item V.A a V.C acima, foram descritos não com o âmbito de limitar, mas com o âmbito de ilustrar as possibilidades de realização da presente invenção, âmbito esse que é limitado apenas pelas reivindicações anexas. VII.) Métodos Farmacodinâmicos e Farmacotécnicos.

As actividades farmacológicas dos vários produtos obtidos a partir de cascas de Vitis labrusca e Vitis vinifera foram avaliadas por métodos farmacodinâmicos que estudaram a actividade anti-hipertensiva dos produtos nos seguintes modelos de hipertensão experimental: Hipertensão de sal de DOCA, ratos com hipertensão espontânea (SHR) e hipertensão induzida por inibição da sintase do óxido nitrico. O método farmacotécnico refere-se ao método de obtenção de cápsulas contendo o residuo 9 liofilizado dos produtos obtidos a partir de cascas de Vitis labrusca e Vitis vinifera. VIII) Exemplo ilustrativo da Invenção

Abaixo estão exemplos com o objectivo de ilustrar e não de limitar a presente invenção, objectivo esse que, como acima mencionado, possui as suas delimitações nas reivindicações anexas. VIII.A) Método de obtenção do liofilizado do decocto de casca de uva de Vitis labrusca

Aproximadamente 2000 g de frutos de Vitis labrusca foram lavados em água da torneira. As cascas foram isoladas das polpas e lavadas em água da torneira durante aproximadamente 3 minutos. As cascas (1000 g) foram lavadas em 4000 mL de água destilada durante 5 minutos. Após fervura, enquanto o decocto ainda estava quente, foi picado a aproximadamente 80 °C e deixado para maceração durante 6 horas, sob agitação. O decocto foi filtrado através de um coador com poros de 0,2 mm, em seguida filtrado em gaze e, depois, através de um papel de filtro Whatman n.l. A fase liquida, obtida após filtração, foi concentrada num evaporador sob baixa pressão a 45°, liofilizada e mantida a -20 °C, até ao dia de utilização. 10 VIII.B) Método de obtenção do liofilizado do decocto de casca de uva de Vi tis vinifera

Aproximadamente 2000 g de frutos de Vitis vinifera foram lavados em água da torneira. As cascas foram isoladas das polpas e lavadas em água da torneira durante aproximadamente 3 minutos. As cascas (1000 g) foram fervidas em 4000 mL de água destilada durante 5 minutos. Após fervura, enquanto o decocto ainda estava quente, foi picado a aproximadamente 80 °C e deixado para maceração durante 6 horas, sob agitação. O decocto foi filtrado através de um coador com poros de 0,2 mm, em seguida filtrado em gaze e, depois, através de um papel de filtro Whatman n.l. A fase liquida, obtida após filtração, foi concentrada num evaporador sob baixa pressão a 45° C, liofilizada e mantida a -20 °C, até ao dia de utilização. VIII.C) Método de obtenção do liofilizado do extracto hidroalcoólico obtido a partir do decocto de casca de uva de Vitis labrusca.

Aproximadamente 1000 g de frutos de Vitis labrusca foram lavados em água da torneira. As cascas foram isoladas das polpas e lavadas em água da torneira durante aproximadamente 3 minutos. As cascas (500 g) foram fervidas em 2 L de água destilada durante 5 minutos. Após fervura, o decocto foi picado. Foram adicionados dois litros de etanol ao decocto e picado. O extraido foi deixado em maceração durante 6 horas, filtrado através de um coador, poros de 0,2 mm e, em seguida, filtrado através de um papel de filtro Whartman n.l. A fase liquida, obtida após filtração foi concentrada num evaporador sob baixa pressão a 45 °C, para evaporar o etanol e, em seguida, 11 liofilizada para obter o liofilizado do extracto hidroalcoólico do decocto de Vitis labrusca. VIII.D) Método de obtenção do liofilizado do extracto hidroalcoólico obtido a partir do decocto de casca de uva de Vitis vinifera.

Aproximadamente 1000 g de frutos de Vitis vinifera foram lavados em água da torneira. As cascas foram isoladas das polpas e lavadas em água da torneira durante aproximadamente 3 minutos. As cascas (500 g) foram fervidas em 2 L de água destilada durante 5 minutos. Após fervura, o decocto foi picado. Foram adicionados dois litros de etanol ao decocto e picado. O extraído foi deixado em maceração durante 6 horas e filtrado através de um coador, poros de 0,2 mm e, em seguida, filtrado num papel de filtro Whartman n.l. A fase líquida, obtida após filtração foi concentrada num evaporador sob baixa pressão a 45 °C, para evaporar o etanol e, em seguida, liofilizada para obter o liofilizado do extracto hidroalcoólico do decocto de Vitis vinifera. VIII.E) Método de obtenção do liofilizado do extracto hidroalcoólico de acetato de etilo obtido a partir do decocto de casca de uva de Vitis labrusca.

Aproximadamente 1000 g de frutos de Vitis labrusca foram lavados em água da torneira. As cascas (500 g) foram isoladas das polpas e lavadas em água da torneira durante aproximadamente 3 minutos. As cascas foram fervidas em 2 L de água destilada durante 5 minutos. Após fervura, o decocto foi picado. Um litro 12 de etanol mais um litro de acetato de etilo foram adicionados ao decocto e picado. 0 extraído foi deixado em maceração durante 6 horas e filtrado através de um coador, poros de 0,2 mm e em seguida filtrado num papel de filtro Whartman n.l. A fase liquida, obtida após filtração, foi concentrada num evaporador sob baixa pressão a 45 °C, para evaporar o etanol e, em seguida, liofilizada para obter o liofilizado do extracto hidroalcoólico do decocto de Vitis labrusca. VIII.F) Método de obtenção do liofilizado do extracto hidroalcoólico de acetato de etilo obtido a partir do decocto de casca de uva de Vitis vinifera.

Aproximadamente 1000 g de frutos de Vitis vinifera foram lavados em água da torneira. As cascas foram isoladas das polpas e lavadas em água da torneira durante aproximadamente 3 minutos. As cascas foram fervidas em 2 L de água destilada durante 5 minutos. Após fervura, o decocto foi picado. Um litro de etanol mais um litro de acetato de etilo foram adicionados ao decocto e picado. O extraído foi deixado em maceração durante 6 horas e filtrado através de um coador, poros de 0,2 mm e, em seguida, filtrado num papel de filtro Whartman n.l. A fase líquida, obtida após filtração, foi concentrada num evaporador sob baixa pressão a 45 °C, para evaporar o etanol e, em seguida, liofilizada para obter o liofilizado do extracto hidroalcoólico do decocto de Vitis vinifera. 13 IX) . Exemplo de testes biológicos realizados com os produtos da invenção. A actividade anti-hipertensiva do liofilizado de vários produtos foi avaliada testando a eficácia do liofilizado na redução dos niveis de hipertensão arterial experimental e na redução do desenvolvimento de hipertensão em ratos. A actividade anti-hipertensiva foi avaliada em ratos Wistar macho adultos, com hipertensão espontânea ou tornados hipertensos pelos seguintes métodos: inibição do óxido nítrico por utilização de um análogo da L-arginina, isto é, L-NAME, e injecção subcutânea de DOCA seguida por administração oral de solução salina em ratos uninefrectomizados; A pressão sanguínea arterial foi medida na cauda dos ratos por um método não invasivo enquanto os ratos estavam acordados, utilizando uma manga e um sensor ligado a equipamento fabricado por Letica-Barcelona-Espanha. 0 liofilizado foi administrado oralmente, na água da bebida, para que os ratos fossem tratados com os produtos continuamente durante o período de tratamento. A pressão arterial foi medida três vezes por semana antes e durante o tratamento com o liofilizado. Os valores da pressão arterial sanguínea foram comparados utilizando o teste de Student e as diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05. IX.A). Efeitos do liofilizado obtido a partir do decocto de cascas de Vitis labrusca na hipertensão arterial induzida por inibição da síntese de óxido nítrico em ratos.

Ratos Wistar macho, adultos (250 - 350 g, n = 10) foram mantidos em gaiola com não mais de 4 animais por gaiola. A pressão sanguínea arterial média foi medida de modo não 14 invasivo, com equipamento Letica (Barcelona). Uma manga e um sensor à volta da cauda do animal foram ligados ao equipamento. A manga é insuflada automaticamente para medir a pressão sanguínea arterial média.

Após um periodo de adaptação às condições experimentais, para medição da pressão sanguínea arterial média, foi iniciado o teste farmacodinâmico. Durante o periodo de adaptação, o peso corporal foi calculado três vezes por semana, os animais receberam água da torneira e alimento até à saciedade, e foi calculado o consumo diário de água.

Os animais foram divididos em dois grupos de 5 ratos. Um grupo (controlo) foi tratado oralmente com L-NAME, 50 mg/kg/dia, diluido na água da bebida. O outro grupo foi igualmente tratado com L-NAME, 50 mg/kg/dia mais 100 mg/kg/dia do liofilizado do decocto de Vitis labrusca na água da bebida. A figura 1 mostra o efeito anti-hipertensivo do liofilizado do decocto de Vitis labrusca nesta experiência especifica. IX.B) Efeitos do liofilizado do extracto hidroalcoólico obtido a partir do decocto de cascas de Vitis labrusca na hipertensão arterial induzida por inibição da sintese de óxido nitrico em ratos.

Ratos Wistar macho, adultos (250 - 350 g, n = 12) foram mantidos em gaiola com não mais de 4 animais por gaiola. A pressão sanguínea arterial média foi medida de modo não invasivo, com equipamento Letica (Barcelona). Uma manga e um sensor à volta da cauda do animal foram ligados ao equipamento. A manga é insuflada automaticamente para medir a pressão 15 sanguínea arterial média. Após um período de adaptação às condições experimentais, para medição da pressão sanguínea arterial média, foi iniciado o teste farmacodinâmico. Durante o período de adaptação, o peso corporal foi calculado três vezes por semana, os animais receberam água da torneira e alimento at libitum, e foi calculado o consumo diário de água.

Os animais foram divididos em dois grupos de 6 ratos. Um grupo (controlo) foi tratado oralmente com L-NAME, 50 mg/kg/dia, diluído na água da bebida. O outro grupo foi igualmente tratado com L-NAME, 50 mg/kg/dia mais 100 mg/kg/dia do liofilizado do extracto hidroalcoólico do decocto de Vitis labrusca na água da bebida, cinco dias após o início do tratamento com L-NAME. A figura 2 mostra o efeito anti-hipertensivo do liofilizado do extracto hidroalcoólico obtido a partir do decocto de Vitis labrusca nesta experiência específica. IX.C) Efeitos do liofilizado do extracto hidroalcoólico de acetato de etilo obtido a partir do decocto de cascas de Vitis labrusca na hipertensão arterial induzida por inibição da síntese de óxido nítrico em ratos.

Ratos Wistar macho, adultos (250 - 350 g, n = 12) foram mantidos em gaiola com não mais de 4 animais por gaiola. A pressão sanguínea arterial média foi medida de modo não invasivo, com eguipamento Letica (Barcelona). Uma manga e um sensor à volta da cauda do animal foram ligados ao equipamento. A manga é insuflada automaticamente para medir a pressão sanguínea arterial média. 16

Durante o período de adaptação, os animais receberam alimento e água at libitum, e foi calculado o consumo diário de água. 0 peso corporal foi calculado três vezes por semana. Após a obtenção dos níveis basais de pressão, os ratos foram tratados com L-NAME 70 mg/kg/dia na água da bebida. Quando a pressão arterial atingia um nível elevado, o animal era tratado com 100 mg/kg/dia do liofilizado do hidroalcoólico de acetato de etilo mais L-NAME. Como pode ser observado na figura 3, mostra o extracto induziu um efeito anti-hipertensivo significativo nesta experiência específica. IX.D) Efeitos do liofilizado do extracto hidroalcoólico de acetato de etilo obtido a partir do decocto de cascas de Vitis labrusca em ratos com hipertensão espontânea. A actividade anti-hipertensiva do extracto hidroalcoólico de acetato de etilo obtido a partir do decocto de Vitis labrusca foi avaliado em cinco ratos com hipertensão espontânea pesando 250 a 350 g. Antes do início do tratamento com o extracto, a pressão arterial foi medida durante duas semanas, quando após esse período, os animais foram tratados oralmente com liofilizado do extracto 100 mg/Kg/dia. Como mostrado na figura 4, o tratamento oral com o extracto induziu uma resposta anti-hipertensiva significativa neste género específico de hipertensão experimental. 17 IX.E) Efeitos do liofilizado do extracto hidroalcoólico obtido a partir do decocto de cascas de Vitis labrusca em ratos com hipertensão de Sal de DOCA.

Doze ratos Wistar macho, pesando 250 a 350 g foram divididos em dois grupos, cada grupo mantido em gaiolas diferentes. Todos os ratos eram uninefrectomizados. Foi medida a pressão arterial de modo não invasivo utilizando um equipamento Letica (Barcelona), que inclui uma manga, um sensor, colocados à volta da cauda do rato e ligados ao equipamento que insufla automaticamente a manga e mede, por conseguinte, o nivel da pressão arterial média.

Sete dias após a nefrectomia, o animal é adaptado ao processo de medição da pressão e recebeu alimento e água at libitum e o peso corporal foi calculado três vezes por semana.

Após o periodo de adaptação, os animais foram tratados subcutaneamente com 25 mg/kg/semana e receberam solução salina como água de bebida. A pressão arterial foi medida três vezes por semana. Após o inicio do tratamento, a pressão sanguínea arterial começou a elevar-se. Dezasseis dias após o inicio do tratamento, quando a pressão arterial tinha atingido um nivel elevado, 6 ratos foram tratados oralmente com o extracto 100 mg/kg/dia. O outro grupo de 6 ratos foi tratado apenas com DOCA mais solução salina. Como mostrado na figura 5, o extracto induziu uma redução significativa da pressão sanguínea arterial média em ratos hipertensos. 18 IX.F) Efeitos do liofilizado obtido a partir do decocto de cascas de Vitis vinifera na hipertensão arterial induzida por inibição da síntese de óxido nítrico em ratos.

Ratos Wistar macho, adultos (250 - 350 g, n = 11) foram

mantidos em gaiola com não mais de 4 animais por gaiola. A pressão sanguínea arterial média foi medida de modo não invasivo, com equipamento Letica (Barcelona) . Uma manga e um sensor colocados à volta da cauda do animal foram ligados ao equipamento. A manga é insuflada automaticamente para medir a pressão sanguínea arterial média.

Os animais foram submetidos a um período de adaptação às condições experimentais, para medição da pressão sanguínea arterial média. Durante o período de adaptação, os animais receberam água da torneira e alimento at libitum, e foi calculado o consumo diário de água. O peso corporal foi calculado três vezes por semana.

Após a obtenção dos níveis de pressão basais, um grupo (controlo, n = 5) foi tratado oralmente com 70 mg/Kg/dia de L-NAME na água da bebida. O outro grupo (n = 6) seis dias após o início do tratamento com L-NAME, foi tratado com 100 mg/kg/dia de extracto hidroalcoólico liofilizado obtido a partir do decocto da casca de Vitis vinifera mais L-NAME na água da bebida. Como mostrado na figura 6, o extracto induziu um efeito anti-hipertensivo significativo nesta experiência específica. 19 IX.G) Efeitos do liofilizado do extracto hidroalcoólico de acetato de etilo obtido a partir do decocto de cascas de Vitis vinifera na hipertensão arterial induzida por inibição da síntese de óxido nítrico em ratos.

Ratos Wistar macho, adultos (250 - 350 g, n = 11) foram

mantidos em gaiola com não mais de 4 animais por gaiola. A pressão sanguínea arterial média foi medida de modo não invasivo, com equipamento Letica (Barcelona). Uma manga e um sensor colocados à volta da cauda do animal foram ligados ao equipamento. A manga é insuflada automaticamente para medir a pressão sanguínea arterial média.

Os animais foram divididos em dois grupos, foram submetidos a um período de adaptação às condições experimentais, para medição da pressão sanguínea arterial média. Durante o período de adaptação, os animais receberam água da torneira e alimento at libitum, e foi calculado o consumo diário de água. O peso corporal foi calculado três vezes por semana. Após a obtenção dos níveis de pressão arterial basais, ambos os grupos foram tratados oralmente com 70 mg/Kg/dia de L-NAME na água da bebida. Após a pressão sanguínea arterial ter atingido níveis elevados, em virtude do tratamento com L-NAME, um grupo (n = 5) recebeu apenas L-NAME e o outro grupo (n = 6) foi tratado com L-NAME mais o extracto, 100 mg/kg/dia oralmente. Este tratamento induziu uma redução significativa dos níveis elevados de pressão arterial, quando comparado com o grupo controlo, como mostrado na figura 7. 20 X) Aspectos farmacotécnicos da preparação de cápsulas e comprimidos contendo o residuo seco das várias fracções obtidas a partir da casca dos frutos de Vitis labrusca e Vitis vinifera.

As cápsulas e/ou comprimidos contendo 100 a 500 mg de liofilizado de Vitis labrusca ou Vitis vinifera foram obtidas de acordo com os processos farmacotécnicos habituais. As cápsulas foram obtidas com o fim de conterem 100 a 500 mg, por exemplo 250 mg do liofilizado mais amido de milho e dióxido de silicio coloidal. Cada cápsula poderia ter a seguinte composição:

Liofilizado 250 mg 5, 5% Amido de milho 200 mg 44,4 Dióxido de silicio coloidal 0,5 mg 0,1% Total 450,5 mg 100% O amido de milho foi adicionado para completar a massa total da cápsula para aproximadamente 450 mg. O dióxido de silicio coloidal foi utilizado para adsorver humidade e para facilitar a preparação das cápsulas.

Lisboa, 18 de Outubro de 2006 21

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para obtenção de decoctos de cascas de Vitis labrusca ou Vitis vinífera, caracterizado pelas etapas seguintes: a) Separar a fruta em cascas e polpas; b) Lavar a casca obtida na etapa (a) em água da torneira durante 3 minutos; c) Submeter as cascas da etapa (b) a um processo de extracção em água a ferver durante 3 a 10 minutos para obter o decocto; d) Picar o decocto da etapa (c) com um picador durante 3 a 5 minutos e macerar durante 6 horas a 10 dias à temperatura ambiente ou a 4 °C; e) Filtrar o macerado obtido na etapa (d) num coador com poros de 0,2 a 1 mm e, subsequentemente, num papel de filtro; f) Concentrar a fase liquida obtida na etapa (e) num evaporador rotativo a baixa pressão e a uma temperatura de 35 a 5 0 ° C; g) Liofilizar a fase liquida concentrada para obter um liofilizado do decocto com actividades farmacológicas; 1
2. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo motivo que a extracção da etapa (c) demora 5 minutos.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo motivo que o tempo de maceração é de 24 horas.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo motivo que a concentração da fase líquida (etapa f) é obtida a 40 °C.
5. Processo para obtenção de um extracto hidroalcoólico caracterizado pelo motivo que adicionalmente o decocto obtido na etapa (c) da reivindicação 1 é extraído com o solvente etanol na proporção de 1:1, v:v, picado fortemente durante 3 a 5 minutos e, em seguida, macerado durante 6 horas a 10 dias à temperatura ambiente ou a 4 °C; obtendo, deste modo, o extracto hidroalcoólico do decocto.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo motivo que o macerado é filtrado completamente num coador com poros de 0,2 a 1,0 mm e, subsequentemente, em papel de filtro.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo motivo que a fase líquida é concentrada num evaporador rotativo a baixa pressão e a 35 a 50 °C.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo motivo que a fase líquida após concentração é liofilizada para obter o extracto hidroalcoólico liofilizado do decocto com actividade farmacodinâmica. 2
9. Processo para obtenção de um extracto hidroalcoólico de acetato de etilo caracterizado pelo motivo que adicionalmente o decocto obtido na etapa (c) da reivindicação 1 é extraido com os solventes etanol e acetato de etilo na proporção de 1:1:1, v:v:v, picado fortemente durante 3 a 5 minutos e, em seguida, macerado durante um periodo de 6 horas a 10 dias à temperatura ambiente ou a 4 °C para obter o extracto hidroalcoólico de acetato de etilo do decocto.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo motivo que o macerado obtido é filtrado num coador com poros de 0,2 a 1,0 mm e, em seguida, em papel de filtro.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo motivo que a fase liquida é concentrada num evaporador rotativo sob baixa pressão e a 35 a 50 °C.
12 . caracterizado concentrada é do extracto decocto com Processo de acordo com a reivindicação 11 pelo motivo que a fase liquida após ser liofilizada para obter o liofilizado hidroalcoólico de acetato de etilo do actividade farmacodinâmica.
13. Preparações farmacêuticas caracterizadas pelo motivo que contêm 200 a 500 mg de liofilizado do decocto de Vitis labrusca ou Vitis vinifera das reivindicações 1 a 4 e, adicionalmente, 200 mg de amido de milho e 0,5 mg de dióxido de silicio coloidal.
14. Preparações farmacêuticas caracterizadas pelo motivo que contêm 200 a 500 mg de liofilizado do extracto 3 hidroalcoólico obtido a partir do decocto de Vitis labrusca ou Vitis vinifera das reivindicações 5 a 8 e, adicionalmente, 200 mg de amido de milho e 0,5 mg de dióxido de silicio coloidal.
15. Preparações farmacêuticas caracterizadas pelo motivo que contêm 200 a 500 mg de liofilizado do extracto hidroalcoólico de acetato de etilo obtido a partir do decocto de Vitis labrusca ou Vitis vinifera das reivindicações 9 a 12 e, adicionalmente, 200 mg de amido de milho e 0,5 mg de dióxido de silicio coloidal.
16. Utilização das preparações farmacêuticas mencionadas nas reivindicações 13, 14 e 15 para a preparação de um medicamento para a prevenção e tratamento da hipertensão arterial e doenças induzidas por hipertensão arterial.
17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, onde o medicamento é para aplicações humanas e veterinárias. Lisboa, 18 de Outubro de 2006 4