PT1196430E - Purificação e estabilização de péptidos e proteínas em agentes farmacêuticos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Purificação e estabilização de péptidos e proteínas em agentes farmacêuticos"

Antecedentes do invento O presente invento é de um modo geral na área das formulações farmacêuticas e mais especificamente relaciona-se com métodos e composições para purificar e estabilizar péptidos e proteínas, tal como insulina, que são utilizados em aplicações farmacêuticas.

Numa pessoa normal, as células β dos ilhéus de Langerhans pancreáticos produzem insulina que o corpo necessita para o metabolismo da glucose em resposta a um aumento na concentração sanguínea de glucose. A insulina metaboliza a glucose absorvida e pára temporariamente a conversão pelo fígado de glicogénio e lípidos em glucose permitindo assim que o corpo mantenha actividade metabólica entre as refeições. O diabético do tipo I, contudo, tem uma capacidade reduzida ou uma total incapacidade para produzir insulina devido à destruição de células β e necessita substituir a insulina através de injecções diárias ou de uma bomba de insulina. A diabetes do tipo II é contudo mais comum do que a diabetes do tipo I e a diabetes de tipo II caracteriza-se por resistência à insulina e incapacidade crescente da função de células β pancreáticas. Os diabéticos de tipo II podem ainda produzir insulina mas podem também necessitar de terapia de substituição de insulina.

Os diabéticos de tipo II apresentam tipicamente uma resposta atrasada aos aumentos dos níveis de glucose sanguínea. Enquanto as pessoas normais libertam habitualmente insulina num intervalo de 2-3 minutos após o consumo de alimentos, os diabéticos de tipo II podem não excretar insulina endógena durante várias horas após o consumo. Em resultado, a produção de glucose endógena continua após o consumo (Pfeiffer, Am. J. Med, 7_0:579-88 (1981)) e o doente sofre hiperglicemia devido a níveis elevados de glucose sanguínea. 2 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ A perda de excreção de insulina induzida por glucose é um dos distúrbios mais precoces no funcionamento das células β (Cerasi et al., Diabetes, 2_l:224-34 (1972); Polonsky et al., N. Engl. J. Med, 318:1231-39 (1988)), embora as causas e o grau de disfunção das células β sejam desconhecidos na maioria dos casos. Apesar dos factores genéticos desempenharem um papel importante (Leahy, Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes, 2j_300-06 (1995) ) , algumas perturbações da excreção de insulina parecem ser adquiridas e podem ser pelo menos parcialmente reversíveis através de um controlo óptimo da glucose. 0 controlo óptimo da glucose através de terapia de insulina após uma refeição pode levar a uma melhoria significativa na libertação natural de insulina induzida pela glucose por necessitar tanto da sensibilização de tecido normal à insulina administrada como de um aumento brusco das concentrações séricas de insulina. Assim, o desafio apresentado pelo tratamento dos diabéticos de tipo II de estágio precoce que não apresentem perda excessiva de função de células β, consiste em restaurar a libertação de insulina após as refeições. A maioria dos diabéticos de tipo II de estágio precoce é presentemente tratada com agentes orais embora com pouco sucesso. As injecções subcutâneas de insulina são também raramente eficazes para proporcionar insulina aos diabéticos do tipo II e podem pelo contrário piorar a acção da insulina devido a um desencadear atrasado, variável e fraco da sua acção. Demonstrou-se contudo que se a insulina for administrada por via intravenosa com uma refeição, os diabéticos de tipo II de estágio precoce sofrem paragem da glucogénese hepática e apresentam aumento do controlo fisiológico da glucose. Além disso, os seus niveis de ácidos gordos livres decaem a uma velocidade maior do que na ausência de terapia de insulina. Apesar de ser possivelmente eficaz no tratamento de diabetes do tipo II, a administração intravenosa de insulina não é uma solução razoável por não ser segura ou exequível para doentes administrar insulina por via intravenosa a todas as refeições. A insulina, um polipéptido com uma massa molecular nominal de 6 000 daltons, tem sido tradicionalmente produzida pelo processamento de pâncreas de porco e vaca para isolar o 3

ΕΡ 1 196 430/PT produto natural. Mais recentemente, contudo, tem-se utilizado tecnologia recombinante para produzir insulina humana in vitro. A insulina natural e recombinante humana em solução aquosa está numa configuração hexamérica ou seja, seis moléculas de insulina recombinante estão associadas de forma não covalente num complexo hexamérico quando dissolvidas em água na presença de iões zinco. A insulina hexamérica não é absorvida rapidamente. De modo a que a insulina humana recombinante seja absorvida na circulação do doente, a forma hexamérica deve primeiramente associar-se em formas diméricas e/ou monoméricas antes que o material se possa deslocar para a corrente sanguínea. O atraso na absorção requer que a insulina recombinante humana seja administrada aproximadamente meia hora antes da refeição de modo a produzir um nivel terapêutico de insulina no sangue, o que pode ser uma sobrecarga para doentes que necessitam de prever de forma correcta os horários das suas refeições. Para ultrapassar este atraso desenvolveram-se análogos de insulina recombinante humana, tal como HUMALOG™, que se dissociam rapidamente para uma forma virtualmente completamente monomérica após administração subcutânea. Estudos clínicos demonstraram que HUMALOG™ é absorvido quantitativamente mais rapidamente do que insulina recombinante humana após administração subcutânea. Consultar, por exemplo, patente U.S. n° 5 547 929 de Anderson Jr., et al.

Numa tentativa de evitar as desvantagens associadas com entrega por injecção e com velocidade de absorção, desenvolveu-se a administração de análogos monoméricos de insulina através da via pulmonar. Por exemplo, patente U.S. n° 5 888 477 de Gonda, et al. revela a inalação por um doente de uma formulação em aerossol de insulina monomérica para depositar partículas de insulina no tecido do pulmão do doente. Contudo, a formulação monomérica é instável e perde actividade rapidamente, ao passo que a velocidade de absorção permanece inalterada.

Apesar de ser desejável produzir insulina de absorção rápida derivada de fontes naturais, a transformação da forma hexamérica na forma monomérica tal como por remoção de zinco do complexo, gera uma insulina que é instável e que tem um tempo de vida útil indesejavelmente curto. Seria portanto desejável proporcionar formas monoméricas de insulina, 4

ΕΡ 1 196 430/PT enquanto se mantém a sua estabilidade na ausência de zinco. Seria também vantajoso proporcionar aos doentes diabéticos composições de insulina monomérica que sejam adequadas para administração pulmonar, proporcionar absorção rápida e que possam ser produzidas em formulações prontas a utilizar e que tenham um prazo de validade comercialmente útil.

Estes problemas com impurezas e iões metálicos que afectam a estabilidade ou a biodisponibilidade ocorrem com muitas outras proteínas e péptidos. A patente U.S. n° 6 071 497 de Steiner, et al. revela sistemas de entrega de fármacos de micropartículas nos quais o fármaco está encapsulado em micropartículas de dicetopiperazina que são estáveis a um pH de 6,4 ou inferior e instáveis a um pH superior a 6,4, ou que são estáveis tanto a pH ácido como a pH básico mas que são instáveis a um pH entre 6,4 e 8. A patente não descreve composições de insulina monomérica que sejam adequadas para administração pulmonar, que proporcionem absorção rápida e que possam ser produzidas em formulações prontas a utilizar e que tenham um prazo de validade comercialmente útil.

Seria portanto vantajoso desenvolver composições alternativas de entrega de insulina para diabéticos do tipo II que proporcionem uma elevação mais rápida dos niveis sanguíneos de insulina e que sejam facilmente administradas para assegurar a adesão do doente. Seria também desejável aplicar as composições e métodos de entrega a outros agentes biologicamente activos. É portanto um objectivo do presente invento proporcionar métodos melhorados de purificar péptidos e proteínas, especialmente na preparação de composições adequadas para administração pulmonar. É outro objectivo do presente invento proporcionar composições de péptido monomérico estáveis adequadas para entrega pulmonar. É um objectivo adicional do presente invento proporcionar métodos e composições para o transporte facilitado de insulina 5 ΕΡ 1 196 430/PT e outros péptidos biologicamente activos através de membranas biológicas. É outro objectivo do presente invento proporcionar métodos e composições para a absorção melhorada de insulina ou outros péptidos biologicamente activos na corrente sanguínea. É ainda outro objectivo do presente invento proporcionar métodos e composições para a absorção melhorada de insulina ou outros péptidos biologicamente activos na corrente sanguínea, caracterizados por facilidade de administração.

Sumário do invento

Assim, num primeiro aspecto, o presente pedido proporciona um método para purificar um péptido compreendendo proporcionar micropartícuias de dicetopiperazina preformadas numa suspensão; proporcionar uma composição de péptido contendo uma impureza a remover; formar um complexo do péptido com as micropartícuias de dicetopiperazina preformadas; e remover essencialmente todas as impurezas do complexo por lavagem com um não solvente para o péptido e a dicetopiperazina.

Num segundo aspecto, o presente pedido proporciona uma composição para a administração de um péptido a um doente, compreendendo um péptido complexado com uma dicetopiperazina; em que a composição é obtida por combinação de um péptido com micropartículas da dicetopiperazina preformadas para formar um revestimento do péptido nas micropartículas e o péptido é uma hormona, citoquina ou outro péptido, antigénio ou vacina que são imuno-moduladores.

Num terceiro aspecto, o presente pedido proporciona a utilização de micropartículas formadas num complexo de (i) um agente activo e (ii) uma quantidade eficaz de dicetopiperazina em que o complexo se forma por combinação de micropartículas de dicetopiperazina preformadas com o agente activo, no fabrico de um medicamento para tratamento profiláctico ou terapêutico por administração do agente activo a uma membrana mucosa em que o agente activo é um péptido terapêutico, profiláctico ou diagnóstico. O agente activo pode, por 6 ΕΡ 1 196 430/PT exemplo, ser uma molécula carregada. A composição pode, por exemplo, ser administrada aos pulmões por via de inalação.

Num quarto aspecto, o presente pedido proporciona a utilização de micropartícuias de uma dicetopiperazina na qual insulina monomérica ou dimérica está complexada com a dicetopiperazina, em que a insulina está substancialmente isenta de zinco e em que o complexo é formado por combinação de microparticulas da dicetopiperazina preformadas com insulina, no fabrico de um medicamento para entregar insulina a um doente que dele necessite. A composição pode, por exemplo, estar numa forma de pó seco adequada para administração aos pulmões através de inalação.

Num quinto aspecto, o presente pedido proporciona microparticulas formadas por um complexo de (i) um agente activo e (ii) uma quantidade eficaz de uma dicetopiperazina, em que o complexo se forma por combinação de microparticulas de dicetopiperazina preformadas com o agente activo para utilização em medicina em que o agente activo é uma hormona peptidica, citoquina ou outro péptido, antigénio ou vacina que são imuno-moduladores.

Num sexto aspecto, o presente pedido proporciona microparticulas de uma dicetopiperazina na qual a insulina monomérica ou dimérica está complexada e em que o complexo é formado por combinação de microparticulas da dicetopiperazina preformadas com insulina para utilização em medicina. Numa concretização do sexto aspecto, as microparticulas de dicetopiperazina são para utilização no tratamento de diabetes tipo II.

Num sétimo aspecto, o presente pedido proporciona um método para estabilizar um péptido compreendendo: proporcionar microparticulas de uma dicetopiperazina preformadas numa suspensão; proporcionar um péptido; e formar um complexo do péptido com uma quantidade eficaz das microparticulas de dicetopiperazina preformadas para estabilizar o péptido.

Num oitavo aspecto, o presente pedido proporciona uma composição para a administração de um péptido em que o péptido é estabilizado de acordo com o método do sétimo aspecto. 7

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Num nono aspecto, o presente pedido proporciona uma formulação para utilização em medicina compreendendo insulina complexada com uma dicetopiperazina e em que o complexo é formado por combinação de microparticulas da dicetopiperazina preformadas com a insulina que, quando administrada a um doente numa quantidade eficaz, produz um pico de concentração sanguínea de insulina no doente, que simula uma resposta normal a alimentação, em que a formulação está numa forma adequada para administração por inalação ou oralmente. Numa concretização do nono aspecto, a formulação pode ser administrada por inalação e opcionalmente a dicetopiperazina é fumarildicetopiperazina e atinge-se um pico de concentração sanguínea de insulina em cerca de 13 minutos após administração ou atinge-se o pico de concentração sanguínea de insulina num período de tempo entre 3 a 10 minutos após administração.

Num décimo aspecto, o presente pedido proporciona uma formulação para utilização em medicina compreendendo um péptido complexado com uma dicetopiperazina por combinação de microparticulas da dicetopiperazina preformadas com o péptido; formulação essa que, quando administrada a um doente por entrega pulmonar, proporciona um pico de concentração sanguínea de insulina num período entre 3 e 10 minutos após administração e em que o péptido é insulina, calcitonina de salmão, hormona paratiróide 1-34, octreótido, leuprolida ou péptido RSV.

Num décimo primeiro aspecto, o presente pedido proporciona a utilização de uma composição compreendendo insulina complexada com uma dicetopiperazina e em que o complexo é formado por combinação de microparticulas da dicetopiperazina preformadas com a insulina, para o fabrico de um medicamento para tratar diabetes tipo II que, quando administrado a um doente numa quantidade eficaz produz um pico de concentração sanguínea de insulina no doente, que simula uma resposta normal à alimentação em que a formulação está na forma adequada para administração por inalação ou oralmente.

Num décimo segundo aspecto, o presente pedido proporciona um método de complexar um péptido com uma dicetopiperazina 8 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ compreendendo: (i) proporcionar uma suspensão de microparticulas de dicetopiperazina, (i i) proporcionar uma solução do péptido e (iii) combinar a suspensão e a solução para formar um complexo do péptido e as microparticulas de dicetopiperazina. 0 método pode compreender adicionalmente remover o solvente por liofilização.

Num décimo terceiro aspecto, o presente pedido proporciona a utilização de uma formulação de entrega para insulina monomérica ou dimérica compreendendo uma quantidade eficaz de insulina complexada com um derivado de uma dicetopiperazina, em que a formulação de entrega é preparada por complexação de insulina com microparticulas do derivado de dicetopiperazina e em que as microparticulas libertam insulina monomérica ou dimérica por dissociação no fabrico de um medicamento para entregar insulina monomérica ou dimérica a um doente que dele necessite.

Assim, o presente pedido descreve métodos para purificar péptidos por formação de um complexo do péptido com microparticulas de uma dicetopiperazina preformadas numa suspensão para facilitar remoção de uma ou mais impurezas, i.e. componentes indesejáveis, do péptido. Numa concretização preferida um péptido, tal como insulina contendo uma ou mais impurezas, e.g., iões zinco, reveste microparticulas de dicetopiperazina para formar um precipitado de péptido/dicetopiperazina/impureza que é então lavado com um solvente para a impureza a remover, que é um não solvente para a dicetopiperazina e um não solvente para o péptido. Alternativamente, a impureza pode ser removida por utilização de agentes de complexação para complexar selectivamente as impurezas e deslocá-las, por exemplo, tal como por diálise.

Descrevem-se aqui formulações e métodos para o transporte melhorado de agente activos através de membranas biológicas resultando, por exemplo, num aumento rápido da concentração sanguínea do agente. As formulações incluem microparticulas formadas por (i) um agente activo, que pode ser carregado ou neutro e (ii) um facilitador de transporte que mascara a carga do agente e/ou que forma ligações de hidrogénio com a membrana biológica alvo de modo a facilitar o transporte. Numa concretização preferida administra-se insulina através de 9 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ entrega pulmonar de micropartículas compreendendo fumarildicetopiperazina e insulina na sua forma biologicamente activa. A carga da molécula de insulina é mascarada pela sua ligação a dicetopiperazina através de ligações de hidrogénio permitindo assim que a insulina passe através da membrana alvo. Este método de entregar insulina resulta num aumento rápido da concentração sanguínea de insulina que é comparável ao aumento resultante de entrega intravenosa.

Descrição sucinta dos esquemas A figura la é um gráfico dos valores médios de glucose sanguínea ao longo do tempo (minutos) . A figura lb é um gráfico de concentrações médias de péptido C no decorrer de experiências que comparam os níveis de péptido C (ng/ml) ao longo do tempo (minutos) quando se administrou insulina pelas vias intravenosa, subcutânea e por inalação. A figura 2a é um gráfico da taxa de infusão de glucose (mg/kg/min) ao longo do tempo (minutos) comparando insulina administrada por via intravenosa, subcutânea e por inalação. A figura 2b é um gráfico de concentrações médias de insulina (pU/ml) ao longo do tempo (minutos) comparando insulina administrada por via intravenosa, subcutânea e por inalação.

Descrição detalhada do invento A encapsulação ou sequestração de polímeros grandes, tal como proteínas e péptidos, em dicetopiperazinas pode ser utilizada para remover impurezas ou contaminantes tal como iões metálicos ou outras moléculas pequenas. 0 primeiro aspecto do presente invento baseia-se na formação de um complexo entre um péptido e micropartículas preformadas da dicetopiperazina. As dicetopiperazinas também servem tanto para estabilizar como para melhorar a entrega dos materiais complexados. Também se desenvolveram formulações para o transporte melhorado de péptidos através de membranas biológicas. Estas formulações incluem micropartículas formadas por uma dicetopiperazina e um péptido a revesti-las que podem ser carregados ou neutros. A dicetopiperazina pode mascarar a carga do péptido e/ou pode formar ligações de hidrogénio com a membrana. As formulações podem proporcionar aumentos rápidos 10 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ da concentração do péptido no sangue após administração das formulações.

Por exemplo, verificou-se que a insulina hexamérica pode ser entregue ao pulmão em formulação de fumarildicetopiperazina, atingindo concentrações sanguíneas de pico num periodo de 3-10 minutos. Contrariamente, a insulina administrada pela via pulmonar sem fumarildicetopiperazina demora tipicamente entre 25-60 minutos a atingir concentrações sanguíneas de pico, enquanto a insulina hexamérica demora 30-90 minutos a atingir níveis sanguíneos de pico quando administrada por injecção. Este fenómeno tem sido sucessivamente replicado com sucesso várias vezes e em várias espécies, incluindo humanos. A remoção de zinco da insulina produz tipicamente insulina instável com um prazo de validade indesejavelmente curto. Os exemplos demonstram purificação para remover zinco, estabilização e entrega aumentada de insulina. Verificou-se que formulações de insulina sequestrada em fumarildicetopiperazina eram estáveis e tinham um prazo de validade aceitável. A medição dos níveis de zinco demonstrou que o zinco tinha sido largamente removido durante o processo de sequestração, proporcionando insulina monomérica numa formulação de entrega estável. A absorção rápida de vários outros péptidos incluindo calcitonina de salmão, hormona paratiróide 1-34, octreótido, leuprolida e péptido RSV tem sido observada quando o péptido é entregue pulmonarmente em fumarildicetopiperazina, proporcionando concentrações sanguíneas de pico no período de 3-10 minutos após entrega pulmonar. I. Materiais A. Agente a ser entregue O agente a ser entregue é um péptido e pode referir-se aqui como o agente activo ou molécula a ser complexada. Pode ser ou não uma espécie carregada. Os exemplos de classes de péptidos adequados para utilização nas composições e métodos 11

ΕΡ 1 196 430/PT aqui descritos incluem péptidos terapêuticos, profilácticos e diagnósticos assim como suplementos alimentares. 0 mecanismo exacto pelo qual as dicetopiperazinas formam um complexo com os materiais a entregar não é conhecido, mas pensa-se que as dicetopiperazinas formam um complexo com o material a ser purificado. Este processo é aqui referido como complexação.

Os péptidos têm menos de 100 resíduos de aminoácidos. Os péptidos a serem incorporados podem ter várias actividades biológicas tal como agentes vasoactivos, agentes neuroactivos, hormonas, anticoagulantes, agentes de imuno-modulação, agentes citotóxicos, antibióticos, antiviricos, anti-sentido, antigénios e anticorpos. Nalguns casos, os péptidos podem ser anticorpos ou antigénios que teriam que ser de outro modo administrados por injecção para desencadear uma resposta apropriada.

Os péptidos preferidos incluem hormonas, citoquinas e outros agentes peptídicos de imuno-modulação e antigénios/vacinas. Numa concretização preferível, o péptido é insulina monomérica ou uma forma estabilizada de insulina que foi purificada para remover zinco. Noutra concretização preferida o péptido é glucagon. O péptido pode ser um antigénio, em que se pretende que a molécula desencadeie uma resposta imunitária protectora, especialmente contra um agente que infecte preferentemente os pulmões, tal como micoplasma, bactérias que causam pneumonia e virus sincicial respiratório. Nestes casos, pode também ser útil administrar o fármaco em combinação com um adjuvante para aumentar a resposta imunitária ao antigénio.

As impurezas que podem ser removidas da composição de agente activo incluem iões metálicos tal como zinco e outros iões divalentes ou multivalentes e moléculas inorgânicas pequenas e resíduos de solvente. 12

ΕΡ 1 196 430/PT Β. Dicetopiperazinas

Descrevem-se dicetopiperazinas úteis nas presentes composições e métodos em por exemplo, patente U.S. n° 6 071 497 . (i): Fórmula geral

As dicetopiperazinas ou os seus análogos de substituição são anéis planares rígidos com pelo menos seis átomos de anel contendo heteroátomos e pares de electrões não ligantes. Um ou ambos os azotos podem ser substituídos por oxigénio para criar os análogos de substituição dicetomorfolina e dicetodioxano, respectivamente. Apesar de ser possível substituir um azoto por um átomo de enxofre, tal não proporciona uma estrutura estável.

Apresenta-se dicetopiperazina e seguidamente seus análogos a fórmula geral para o II íts

R3 O R3 e Rô são cadeias laterais definidas como Q-T-Q-u ou Q-u em que Q é independentemente, um alquilo, aralquilo, alcarilo, alcenilo, alcinilo, heteroalquilo, heterocíclico, alquil-heterocíclico ou heterocíclico-alquilo C1-20 linear, ramificado ou cíclico; T é -C(0)0, -OC(O), -C(0)NH, -NH, -NQ, -OQO, -O, -NHC(O), -OP(O), -P(0)0, -0P(0)2, -P(0)20, -0S(0)2 ou -S(0)3; U é um grupo ácido tal como ácido carboxílico, ácido fosfórico, ácido fosfónico e ácido sulfónico ou um grupo básico, tal como aminas primárias, secundárias e terciárias, sais de amónio quaternários, guanidina, anilina, derivados heterocíclicos tais como piridina e morfolina ou uma cadeia Ci-2o zwiteriónica contendo pelo menos um grupo ácido e pelo menos um grupo básico, por exemplo, os anteriormente descritos em que as cadeias laterais podem ser adicionalmente funcionalizadas com um grupo alceno ou alcino em qualquer posição, um ou mais dos carbonos da cadeia lateral podem ser substituídos por um 13

ΕΡ 1 196 430/PT oxigénio por exemplo, para proporcionar cadeias curtas de polietilenoglicol, um ou mais dos carbonos podem ser funcionalizados por um grupo ácido ou básico, tal como anteriormente descrito e em que os átomos de anel X nas posições 1 e 4 são O ou N.

Os exemplos de cadeias laterais ácidas incluem entre outras, cis e trans -CH=CH-C02H, -CH (CH3) =CH (CH3)-C02H, - (CH2) 3-co2h, -CH2CH (CH3)-co2h, -CH(CH2C02H)=CH2. -ácido tetrafluorobenzóico, -ácido benzóico e -CH (NHC (O) CF3) -CH2C02H.

Os exemplos de cadeias laterais básicas incluem entre outras, -anilina, -fenil-C(NH)NH2, -fenil-C(NH)NH(alquilo), - fenil-C (NH)N (alquilo) 2 e - (CH2) 4NHC (O) CH (NH2) CH (NH2) C02H.

Os exemplos de cadeias laterais zwiteriónicas incluem entre outras, - CH (NH2) -CH2-C02H e -NH (CH2) i_20CO2H. A expressão aralquilo refere-se a um grupo arilo com um substituinte alquilo. A expressão heterociclico-alquilo refere-se a um grupo heterociclico com um substituinte alquilo. A expressão alcarilo refere-se a um grupo alquilo com um substituinte arilo. A expressão alquilo-heterociclico refere-se a um grupo alquilo com um substituinte heterociclico. A expressão alceno, tal como aqui referida e salvo indicação em contrário, refere-se a um grupo alceno de C2 a Cio e inclui especificamente vinilo e alilo. A expressão alcino, tal como aqui referida e salvo indicação em contrário, refere-se a um grupo alcino de C2 a Cio ·

Tal como aqui utilizada, "dicetopiperazinas" inclui dicetopiperazinas e seus derivados e modificações abrangidos pelo âmbito da fórmula geral anteriormente apresentada. 14 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ A fumarildicetopiperazina é a mais preferida para aplicações pulmonares. (ii). Sintese

Podem formar-se dicetopiperazinas por ciclodimerização dos derivados de ésteres de aminoácidos, tal como descrito por Katchalski, et al., J. Amer. Chem. Soc. 6_8:879-80 (1946), por ciclização dos derivados de éster dipeptidico ou por desidratação térmica de derivados de aminoácido em solventes de ponto de ebulição elevado tal como descrito por Kopple, et al., J. Org. Chem. 33(2):862-64 (1968). Preparou-se 2,5- diceto-3,6-di(aminobutil)piperazina (referido por Katchalski et al. como anidrido de lisina) por ciclodimerização de N-epsilon-P-L-lisina em fenol fundido, de forma semelhante ao método Kopple em J. Org. Chem., seguido de remoção dos grupos (P) bloqueadores com HBr 4,3 M em ácido acético. Esta via é preferida porque utiliza um material de partida disponível comercialmente, envolve condições reaccionais que se relata como conservando a estereoquímica dos materiais de partida no produto e todas as etapas podem ser facilmente escaladas para fabrico.

Podem preparar-se derivados dicetomorfolino e diceto-oxetano por ciclização por etapas de uma forma semelhante à revelada em Katchalski, et al., J. Amer. Chem. Soc. 68:879-80 (1946) .

As dicetopiperazinas podem ser marcadas radioquimicamente. São conhecidos dos peritos na especialidade formas de ligar marcadores radioactivos. Podem preparar-se dicetopiperazinas marcadas radioquimicamente por exemplo, por reacção de tritio gasoso com os compostos anteriormente listados que contenham uma ligação dupla ou tripla. Pode incorporar-se um carbono marcado radioquimicamente com carbono-14 na cadeia lateral utilizando precursores marcados com 14C que estão facilmente disponíveis. Estas dicetopiperazinas marcadas radioquimicamente podem detectar-se in vivo após administração a um indivíduo das microparticulas resultantes. 15 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ (a) Síntese de derivados simétricos de dicetopiperazina

Os derivados de dicetopiperazina são simétricos quando ambas as cadeias laterais são idênticas. As cadeias laterais podem conter grupos ácidos, grupos básicos ou suas combinações.

Um exemplo de derivado de dicetopiperazina simétrico é 2,5-diceto-3,6-di(4-succinilaminobutil)piperazina. A 2,5-diceto-3,6-di(aminobutil)piperazina é exaustivamente succinilada com anidrido succinico em solução aquosa moderadamente alcalina para proporcionar um produto que é facilmente solúvel em solução aquosa pouco alcalina mas que é bastante insolúvel em soluções aquosas ácidas. Quando soluções concentradas do composto em meio pouco alcalino são rapidamente acidificadas em condições apropriadas, o material separa-se da solução como microparticulas.

Podem obter-se outros compostos preferidos por substituição do(s) grupo(s) succinilo no composto anterior por grupos glutarilo, maleilo ou fumarilo. (b) Síntese de derivados assimétricos de dicetopiperazina

Um método para preparar derivados de dicetopiperazina assimétricos é proteger grupos funcionais da cadeia lateral, desproteger selectivamente uma das cadeias laterais, fazer reagir o grupo funcional desprotegido para formar uma primeira cadeia lateral, desproteger o segundo grupo funcional e fazer reagir o grupo funcional desprotegido para formar uma segunda cadeia lateral.

Os derivados de dicetopiperazina com cadeias laterais ácidas protegidas, tal como ciclo-Lis(P)Lis(P) , em que P é um grupo benziloxicarbonilo ou outro grupo protector conhecido dos peritos na especialidade, podem ser desprotegidos selectivamente. Os grupos protectores podem ser clivados selectivamente utilizando reagentes limitantes, tais como HBr no caso do grupo benziloxicarbonilo ou ião fluoreto no caso de grupos protectores de silicio e utilizando intervalos de tempo controlados. Deste modo, podem obter-se misturas reaccionais contendo derivados de dicetopiperazina não protegidos, 16

ΕΡ 1 196 430/PT monoprotegidos e di-protegidos. Estes compostos têm solubilidades diferentes em vários solventes e gamas de pH e podem ser separados por precipitação selectiva e remoção. Pode então adicionar-se a tais misturas reaccionais um solvente apropriado, por exemplo éter, para precipitar conjuntamente todos estes materiais. Tal pode parar a reacção de desprotecção antes da sua conclusão por remoção das dicetopiperazinas dos reagentes utilizados para desproteger os grupos protectores. Por agitação do precipitado misto em água podem dissolver-se tanto as espécies que reagiram parcialmente como as espécies que reagiram completamente como sais no meio aquoso. O material de partida que não reagiu pode ser removido por centrifugação ou filtração. Por ajuste do pH da solução aquosa para uma condição pouco alcalina, o produto assimétrico monoprotegido contendo um único grupo protector precipita de solução deixando em solução o material completamente desprotegido.

No caso de derivados de dicetopiperazina com cadeias laterais básicas, os grupos básicos podem também ser desprotegidos selectivamente. Tal como anteriormente descrito, pode parar-se a etapa de desprotecção antes da sua finalização por exemplo, por adição de um solvente adequado à reacção. Por ajuste cuidadoso do pH da solução, pode remover-se o derivado desprotegido por filtração deixando em solução os derivados parcialmente desprotegido e totalmente desprotegido. Por ajuste do pH da solução para uma condição ligeiramente ácida, o derivado monoprotegido precipita de solução e pode ser isolado.

Podem também desproteger-se selectivamente derivados zwiteriónicos de dicetopiperazina tal como descrito anteriormente. Na última etapa, o ajuste de pH a uma condição ligeiramente ácida precipita o composto monoprotegido com um grupo ácido livre. O ajuste de pH para uma condição ligeiramente básica precipita o composto monoprotegido com um grupo básico livre. A remoção limitada de grupos protectores por outros mecanismos, incluindo entre outros grupos protectores cliváveis que são clivados por hidrogenação utilizando uma quantidade limitada de hidrogénio gasoso na presença de 17

ΕΡ 1 196 430/PT catalisadores de paládio. O produto resultante é também um derivado de dicetopiperazina assimétrico e parcialmente desprotegido. Estes derivados podem ser isolados essencialmente como descrito anteriormente.

Faz-se reagir a dicetopiperazina monoprotegida para produzir uma dicetopiperazina com uma cadeia lateral e grupo protector. A remoção de grupos protectores e acoplamento com outras cadeias laterais proporciona dicetopiperazinas substituídas assimetricamente com uma mistura de cadeias laterais ácidas, básicas e zwiteriónicas.

Podem obter-se outros materiais que apresentam esta resposta ao pH por funcionalização dos azotos do anel amida do anel da dicetopiperazina. C. Facilitador de transporte

Numa concretização preferida, o péptido é complexado com uma dicetopiperazina como um facilitador de transporte que é degradável e capaz de formar ligações de hidrogénio com a membrana biológica alvo de modo a facilitar o transporte do agente através da membrana. O facilitador de transporte é também capaz de formar ligações de hidrogénio com o péptido, caso esteja carregado, de modo a mascarar a carga e facilitar o transporte do péptido através da membrana. O facilitador de transporte é preferentemente biodegradável e pode proporcionar a libertação do agente activo de forma linear, pulsada ou de uma só vez.

Um facilitador de transporte preferido é fumarildicetopiperazina. Descrevem-se anteriormente outras dicetopiperazinas que podem ser úteis como facilitadoras de transporte.

Tal como a maioria de proteínas e péptidos a insulina é uma molécula carregada, o que impede que atravesse membranas biológicas carregadas. Verificou-se que quando a insulina forma ligações de hidrogénio com fumarildicetopiperazina, a carga do péptido é mascarada facilitando ou melhorando assim a 18 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ passagem de insulina através das membranas, tal como membranas mucosas, para o sangue. II. Métodos A. Encapsulação

Revela-se que o agente activo pode (a) ser encapsulado no interior de microparticulas por dissolução de uma dicetopiperazina com cadeias laterais ácidas em bicarbonato ou outra solução básica, adicionar o agente activo em solução ou suspensão e seguidamente precipitar a micropartícula por adição de ácido tal como ácido cítrico 1 M.

Alternativamente, o agente activo pode (b) ser encapsulado no interior de microparticulas por dissolução de uma dicetopiperazina com cadeias laterais básicas numa solução ácida, tal como ácido cítrico 1 M, adicionando o agente activo em solução ou suspensão e seguidamente precipitando as microparticulas por adição de bicarbonato ou outra solução básica.

Alternativamente, o agente activo pode (c) ser encapsulado no interior de microparticulas por dissolução de uma dicetopiperazina com cadeias laterais ácidas e básicas numa solução ácida ou básica, adicionando o agente activo em solução ou suspensão a ser encapsulado e seguidamente precipitando as microparticulas por neutralização da solução.

Podem armazenar-se as microparticulas no estado seco e suspenderem-se para administração a um doente. Na opção (a) as microparticulas reconstituídas mantêm a sua estabilidade num meio ácido e dissociam-se à medida que o meio se aproxima do pH fisiológico na gama entre 6 e 14. Na opção (b) as microparticulas reconstituídas mantêm a sua estabilidade num meio básico e dissociam-se a um pH entre 0 e 6. Na opção (c), as microparticulas reconstituídas mantêm a sua estabilidade num meio ácido ou básico e dissociam-se à medida que o meio se aproxima do pH fisiológico na gama entre 6 e 8.

Removem-se tipicamente as impurezas quando as microparticulas são precipitadas. Contudo, podem também 19 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ remover-se impurezas lavando então as partículas para dissolver as impurezas. Uma solução de lavagem preferida é água ou um tampão aquoso. Também se podem utilizar solventes diferentes de água para lavar as microesferas ou precipitar as dicetopiperazinas, de modo a remover impurezas que não são solúveis em água. Qualquer solvente é adequado desde que nem a carga nem a fumarildicetopiperazina sejam solúveis nesse solvente. Os exemplos incluem ácido acético, etanol e tolueno. B. Complexação 0 invento presentemente reivindicado proporciona uma alternativa ao processo de encapsulação discutido na secção A. Mais especificamente, o invento presentemente reivindicado utiliza complexação de péptido às micropartículas de dicetopiperazina preformadas.

Numa concretização, preparam-se micropartículas de dicetopiperazina e proporcionam-se numa suspensão, tipicamente uma suspensão aquosa, à qual se adiciona então uma solução do péptido. Liofiliza-se então a suspensão para obter micropartículas de dicetopiperazina com um revestimento de péptido. Numa concretização preferida o péptido é insulina numa forma hexamérica. Podem então remover-se iões zinco por lavagem das micropartículas com um solvente apropriado.

Tal como aqui utilizada, a expressão "sequestração" relativamente ao agente activo em/com uma dicetopiperazina refere-se ao revestimento do péptido ao redor de micropartículas da dicetopiperazina.

Verificou-se que as micropartículas de dicetopiperazina têm uma afinidade mais elevada para insulina do que o zinco. Verificou-se que a insulina se estabilizava no interior de uma matriz em rede organizada de fumarildicetopiperazina. Neste estado, na ausência suficiente de iões zinco, a insulina é predominantemente dimérica e monomérica contrariamente ao seu estado hexamérico. Assim, a insulina dissocia-se mais facilmente para o seu estado monomérico, que é o estado no qual a insulina exerce a sua actividade biológica: 20 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ A dicetopiperazina pode ser substituída por outros agentes complexantes. Outros agentes complexantes representativos incluem albumina de soro e outras proteínas, ácido algínico, anticorpos, ciclodextrinas, fosfolípidos e lecitina. Por exemplo, a insulina contaminada com zinco pode ser complexada com albumina de soro bovino. O complexo pode ser dialisado num tubo com um corte de peso molecular menor que 1 000 dalton para separar e remover o zinco. Após diálise de quantidade suficiente de zinco, tal como evidenciado pela sua presença no dialisado, transfere-se a dispersão para tubo de diálise com um corte de peso molecular inferior a 10 000 dalton. Apenas a insulina monomérica passará através do tubo para o dialisado, deixando para trás qualquer insulina complexada com zinco hexamérica. A insulina purificada pode ser capturada do dialisado.

Estes materiais não podem contudo, proporcionar estabilização suficiente de fármacos instáveis ou lábeis. C. Administração

As composições de péptido complexado a micropartícuias de dicetopiperazina, tal como aqui descritas, podem ser administradas a doentes que necessitem do péptido. As composições são de preferência administradas sob a forma de micropartí cuias, que podem estar sob a forma de um pó seco para administração pulmonar ou suspensas num transportador farmacêutico adequado, tal como solução salina.

As micropartícuias são de preferência armazenadas na forma seca ou liofilizada até imediatamente antes de administração. As micropartículas podem então ser administradas directamente como um pó seco, tal como por inalação, utilizando por exemplo inaladores de pó seco conhecidos na especialidade. Alternativamente, as micropartículas podem ser suspensas num volume suficiente de transportador farmacêutico, por exemplo, como uma solução aquosa para administração como um aerossol.

As micropartículas também podem ser administradas através das vias oral, subcutânea e intravenosa. 21 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ

As composições podem ser administradas a qualquer membrana biológica alvo, de preferência uma membrana mucosa de um doente. Numa concretização preferida, o doente é um humano que sofre de diabetes de tipo II. Numa concretização preferida, a composição entrega insulina na forma activa biologicamente ao doente, o que proporciona um pico da concentração sérica de insulina que simula a resposta normal à alimentação.

Numa concretização preferida, sequestra-se insulina hexamérica em fumarildicetopiperazina para formar um precipitado sólido de insulina monomérica na fumarildicetopiperazina, que é então lavado com solução aquosa para remover o zinco livre. Esta formulação demonstra absorção sanguínea após administração pulmonar a uma taxa que é 2,5 vezes a taxa de absorção de insulina após injecção subcutânea, com níveis sanguíneos de pico atingidos entre 7,5 e 10 minutos após administração. A gama de carga do fármaco a ser entregue é tipicamente entre cerca de 0,01% e 90%, dependendo da forma e tamanho do fármaco a ser entregue e do tecido alvo. Numa concretização preferida utilizando dicetopiperazinas, a gama preferida é de 0,1% a 50% de carga por peso de fármaco. A dosagem adequada pode ser determinada, por exemplo, pela quantidade de péptido complexado, a taxa da sua libertação das micropartículas e, numa concretização preferida, o nível de glucose no sangue do doente.

Uma aplicação preferida é no tratamento de hiperinsulinemia. Numa concretização preferida, as micropartículas da composição em que o péptido é glucagon podem ser administradas por infusão subcutânea contínua. O glucagon é um péptido extremamente instável, mas pode ser estabilizado em partículas de dicetopiperazina, por exemplo. As micropartículas de glucagon estabilizado/dicetopiperazina podem ser preparadas por complexação com micropartículas de dicetopiperazina preformadas de acordo com o presente invento ou pelo método de encapsulação não reivindicado por adição de glucagon a uma solução de dicetopiperazina que se liga por ligações de hidrogénio ao glucagon e quando a solução é acidificada, tal como por adição de um ácido alimentar, tanto a dicetopiperazina como o glucagon auto-organizam-se para 22 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ formarem microesferas uniformes, com um tamanho de partícula médio de, por exemplo, cerca de 2 ym. Neste processo aproximadamente 95% do glucagon é removido de solução e é distribuído uniformemente no interior da micropartícula de dicetopiperazina. Estas partículas podem ser facilmente suspensas e infundidas subcutaneamente com uma bomba de infusão padrão. Seguidamente as partículas de glucagon/dicetopiperazina põe-se em contacto com o ambiente de pH aproximadamente neutro do fluido subcutâneo, onde se dissolvem, libertando assim glucagon no seu estado farmacologicamente activo.

As composições e métodos aqui descritos são descritos adicionalmente nos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1: Remoção de zinco de insulina injectável U.S.P. A insulina sequestrada em fumarildicetopiperazina foi analisada para avaliar se o zinco foi removido durante o processo de sequestração. A insulina utilizada como material de partida cumpria os padrões U.S.P. para insulina injectável e, de acordo com o certificado de análise, a insulina continha uma quantidade considerável de zinco: 0,41%. Esta insulina foi então sequestrada em fumarildicetopiperazina para formar uma mistura sólida de fumarildicetopiperazina/insulina, tal como descrito anteriormente.

Após sequestração da insulina em fumarildicetopiperazina, teoricamente a quantidade de zinco deve estar presente na mesma proporção em que existia na insulina pura. Utilizando o valor do certificado de análise, calculou-se que seria de esperar encontrar 697 partes por milhão (ppm) de zinco por grama no produto sólido de fumarildicetopiperazina/insulina. Surpreendentemente, a quantidade de zinco presente na fumarildicetopiperazina/insulina sólida foi medida como sendo apenas 6 ppm. O zinco "em falta" foi presumivelmente eliminado com a água utilizada para lavar o precipitado de insulina/fumarildicetopiperazina. 23 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ

Exemplo 2: Biodisponibilidade de insulina na formulação pulmonar de dicetopiperazina

Indivíduos e métodos 0 estudo foi revisto e aprovado pelo comité de revisão ética da Universidade Heinrich-Heine, Dusseldorf e efectuado de acordo com a regulamentação local, a Declaração de Helsínquia e as regras de boas práticas clínicas. 0 estudo foi efectuado em 5 voluntários masculinos saudáveis. Os critérios de inclusão foram boa saúde, tal como avaliado por exame físico, idade: 18 a 40 anos, índice de massa corporal: 18 a 26 kg/m2, capacidade de atingir pico de fluxo inspiratório de 4 1/seg medido por espirometria computorizada e FEVi igual ou maior a 80% do valor previsto normal (FEVi = volume de expiração forçada em um segundo). Os critérios de exclusão foram diabetes mellitus de tipo 1 ou 2, prevalência de anticorpos para insulina humana, história de hipersensibilidade à medicação do estudo ou a fármacos com estruturas químicas semelhantes, história de alergias graves ou múltiplas, tratamento com qualquer outro fármaco de investigação nos últimos 3 meses antes da entrada no estudo, doença progressiva fatal, história de abuso de drogas ou álcool, terapia com fármacos actual com outros fármacos, história de doença cardiovascular, respiratória, gastrointestinal, hepática, renal, neurológica, psiquiátrica e/ou hematológica significativa, infecção do tracto respiratório em curso ou indivíduos definidos como fumadores com evidência ou história de uso de tabaco ou nicotina.

Realização do estudo

Na manhã dos dias de estudo, os indivíduos vieram ao hospital (em jejum, excepto de água desde a meia-noite) às 7h30m. Os indivíduos abstiveram-se de actividades físicas excessivas e de ingestão de álcool durante 24 horas antes de cada dia de tratamento. Foram atribuídos aleatoriamente a um dos três braços de tratamento. Os indivíduos receberam uma infusão de insulina humana regular intravenosa e constante, que foi mantida a 0,15 mU min-1 kg-1 de modo a que se estabelecessem concentrações séricas de insulina de 10-15 U/ml 24

ΕΡ 1 196 430/PT durante um periodo de 2 horas antes do ponto temporal 0. Esta infusão de dose baixa foi continuada ao longo do ensaio para suprimir excreção endógena de insulina. Manteve-se a glicólise sanguínea constante a um nível de 90 mg/dl ao longo do grampo de glucose através de um sistema de infusão controlada de glucose (BIOSTATOR™). O algoritmo de grampo de glucose baseou-se na concentração de glucose de facto medida e no grau de variabilidade nos minutos anteriores para calcular as taxas de infusão de glucose para manter a concentração de glucose sanguínea constante. A aplicação de insulina (5 U i.v. ou injecção de 10 U s.c. ou três inalações profundas por cápsula (2 cápsulas com 50 U cada) aplicada com um dispositivo de inalação comercial (Boehringer Ingelheim)) tinha que terminar imediatamente antes do ponto temporal 0. A duração da experiência de grampo foi de 6 horas a partir do ponto temporal 0. Mediram-se as taxas de infusão de glucose, glucose sanguínea, insulina sérica e péptido C.

Bioeficácia e biodisponibilidade

Para determinar a bioeficácia, calcularam-se as áreas sob as curvas das taxas de infusão de glucose durante as primeiras 3 horas (AUCo-iso) após a administração e para o período global de observação de seis horas após a administração (AUCo-sôo) e correlacionaram-se com a quantidade de insulina aplicada. Para determinar a biodisponibilidade, calcularam-se as áreas sob as curvas das concentrações de insulina para as primeiras 3 horas (AUC0-180) após a administração e para o período global de observação de seis horas após a administração (AUC0-36o) e correlacionaram-se com a quantidade de insulina aplicada.

Neste estudo de grampo, a inalação de 100 U de TECHNOSPHERE™/insulina foi bem tolerada e demonstrou-se que apresenta um efeito substancial de diminuição de glucose no sangue com uma biodisponibilidade relativa de 25,8% para as primeiras três horas, tal como calculada a partir das concentrações atingidas de insulina sérica. As TECHNOSPHERES™ são micropartícuias (aqui também denominadas microesferas) formadas de dicetopiperazina que se auto-organiza numa matriz de rede ordenada a determinados pH, tipicamente a pH baixo. São tipicamente produzidas de modo a ter um diâmetro médio entre cerca de 1 e cerca de 5 ym. 25

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Resultados

Os resultados farmacocinéticos apresentam-se nas figuras 1 e 2 e na tabela 1.

Resultados de eficácia A inalação de 100 U de TECHNOSPHERE™/insulina (inalação de 100 U) revelou um pico na concentração de insulina após 13 min (intravenosa (i.v.) (5 U) : 5 min, subcutânea (s.c.) (10 U) : 121 min) e um retorno aos niveis basais de insulina após 180 min (i.v.: 60 min, s.c. 360 min). A acção biológica tal como medida pela taxa de infusão de glucose apresentou um pico após 39 min (i.v. 14 min, s.c.: 163 min) e durou mais de 360 min (i.v.: 240 min, s.c.: > 360 min). A biodisponibilidade absoluta (comparação com a aplicação i.v.) foi de 14,6±5,1% durante as primeiras 3 horas e 15,515,6% para as primeiras 6 horas. A biodisponibilidade relativa (comparação com aplicação s.c.) foi de 25,8111,7% para as primeiras 3 horas e 16,417,9% para as primeiras 6 horas.

Tabela 1: Parâmetros farmacocinéticos

Parâmetro calculado Administração Inalação Administração a partir da taxa de intravenosa subcutânea infusão de glucose T50%* 9 min 13 min 60 min Tmax 14 min 3 9 min 163 min T-50%1 82 min 240 min 240 min T até linha de base 240 min >360 min >360 min Parâmetro calculado Administração Inalação Administração a partir dos niveis intravenosa subcutânea de insulina T50%* 2 min 2,5 min 2 7 min Tmax 5 min 13 min 121 min T-50%1 6 min 35 min 250 min T até linha de base 60 min 180 min 360 min * tempo desde a linha de base até metade dos valores máximos 1 tempo desde a linha de base até metade dos valores máximos, após passar Tmax 26

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Resultados de segurança

Verificou-se que TECHNOSPHERE™/insulina é segura em todos os doentes. Um dos doentes tossiu durante a inalação sem quaisquer outros sintomas ou sinais de deterioração adicionais do sistema respiratório.

Conclusões A inalação de 100 U de TECHNOSPHERE™/insulina foi bem tolerada e demonstrou que tem um efeito substancial de redução da glucose sanguínea com uma biodisponibilidade relativa de 25,8% durante as primeiras 3 horas, tal como calculada a partir das concentrações atingidas de insulina sérica.

Resumo

Neste estudo demonstrou-se que a inalação de TECHNOSPHERE™/insulina (a formulação do exemplo 1) em indivíduos humanos saudáveis apresenta um perfil de acção temporal com um pico rápido de concentração de insulina (Tmax: 13 min) e um rápido inicio de acção (Tmax: 39 min) e uma acção prolongada ao longo de mais de 6 horas. O efeito metabólico total medido após inalação de 100 U de TECHNOSPHERE™/insulina foi maior do que após injecção subcutânea de 10 U de insulina. Calculou-se uma bioeficácia relativa de TECHNOSPHERE™/insulina de 19,0% e determinou-se uma biodisponibilidade relativa de 25,8% nas primeiras três horas.

Os dados também demonstram que a inalação de TECHNOSPHERE™/insulina resultou num inicio de acção muito mais rápido do que a injecção s.c. de insulina e que foi próximo do inicio de acção de injecção i.v. de insulina, enquanto a duração da acção de TECHNOSPHERE™/insulina foi comparável à de injecção s.c. de insulina. O fármaco foi bem tolerado e não se relataram quaisquer eventos adversos graves durante todo o ensaio. 27

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Exemplo 3: Remoção de Impureza de péptido registado

Sequestrou-se um péptido registado contendo uma impureza em fumarildicetopiperazina, formando um precipitado de péptido/fumarildicetopiperazina. Lavou-se o precipitado com água para remover a impureza. O péptido é bastante instável e sequestrá-lo em fumarildicetopiperazina melhora acentuadamente a sua estabilidade; tanto como um pó seco, como em suspensão aquosa para injecção.

Exemplo 4: Formulações de glucagon estabilizado

Formulação

Formulou-se glucagon em condições estéreis, num complexo estabilizado por precipitação em solução ácida com fumarildicetopiperazina (3,β-bis[N-fumaril-N-(n-butil)amino]-2,5-dicetopiperazina). O complexo foi lavado e liofilizado resultando numa formulação em pó seco estéril de dicetopiperazina/glucagon (doravante denominada "TG") contendo desde 1,2 a 8,2% de glucagon em peso, dependendo dos parâmetros de formulação pretendidos (permitindo que o médico aumente a dose mantendo o volume constante). Suspendeu-se o pó TG num meio adequado para entrega subcutânea numa bomba de infusão MiniMed 507C.

Protocolo de estabilidade

Suspendeu-se glucagon e TG em meio de infusão e incubou-se a 40 °C num banho de água, durante vários intervalos de tempo até 150 horas.

Análise de HPLC de glucagon

Utilizou-se uma adaptação do método USP para análise de glucagon. Utilizou-se uma coluna Waters Symmetry Shield RP8 (5 ym, 3,9 x 150 mm) e uma pré-coluna RP8 (5 ym, 3,9 x 20 mm) a um caudal de 1 mL/min e um comprimento de onda de detecção de 214 nm. O método de gradiente consistiu da fase móvel A: 9,8 g de NaH2P04 (0, 0816 M) e 170 mg de L-cisteina (1,4 mM) por litro de água para HPLC, ajustada a pH 2,6 com ácido fosfórico; e B: acetonitrilo. Diluiram-se as soluções de 28 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ glucagon com água, tal como necessário, e injectaram-se. As amostras de TG foram preparadas por adição de 1/10 do volume de Tris 1 M pH 10,0 à amostra para solubilizar a fumarildicetopiperazina.

Protocolo do estudo em ratos

Fizeram-se jejuar durante a noite ratos Sprague Dawley de 200-250 g e administrou-se injecção subcutânea de glucagon ou TG (0,75 mg/kg) num meio adequado que foi mantido a 25 °C durante 0, 24 ou 48 horas. Obtiveram-se amostras de sangue a -10, -5, 0, 5, 10, 15, 20, 30, 45 e 60 minutos após a dose e analisou-se a glucose sanguínea (analisador de glucose HemCue B, Hemocue AB, Angelholm Suécia). Determinou-se a linha de base média (medições pré-dose) e subtraiu-se aos dados subsequentes e representaram-se em função do tempo. Tal foi feito para assegurar que a formulação de TG, que pareceu não degradar significativamente, apresentasse actividade farmacológica adequada.

Resultados

Após incubação a 40 °C, a análise por HPLC mostrou um aumento nos produtos de degradação na preparação de glucagon. Contrariamente, TG apresentou apenas um pico de degradação minoritário (RT=6) que se correlacionou com a forma oxidada ligeiramente menos activa de glucagon. O glucagon sem dicetopiperazina (i.e. sem TECHNOSPHERES™) apresentava muitos picos de degradação, alguns dos quais contribuíam para um efeito aumentado e outros que reduziam a potência de glucagon. O pó liofilizado estéril de TG foi enviado congelado para um hospital, onde foi ressuspenso em meio estéril. O material ressuspendeu bem e cada frasquinho foi infundido continuamente ao longo de um período de 72 horas.

Conclusão

As preparações padrão de glucagon não são adequadas para a regulação da glucose sanguínea por infusão subcutânea contínua. A administração de tais preparações contendo quantidades variáveis das formas desamidada e hidrolisada 29 ΕΡ 1 196 430/ΡΤ resultou em níveis altamente variáveis de glucose sanguínea. As suspensões de TECHNOSPHERES™/glucagon, que está estabilizado, não agregam e contêm quantidades clinicamente irrelevantes de produtos de degradação. Como tal, TG pode ser utilizado e foi utilizado como uma terapia para hiperinsulinemia, proporcionando níveis de glucose elevados e consistentes quando administrado subcutaneamente ao longo do tempo.

Lisboa, 2012-04-10

Claims (45)

1. ΕΡ 1 196 430/PT 1/7 REIVINDICAÇÕES 1. Método para purificar um péptido compreendendo proporcionar microparticulas preformadas de uma dicetopiperazina numa suspensão; proporcionar uma composição de péptido contendo uma impureza a ser removida; formar um complexo do péptido com as microparticulas da dicetopiperazina preformadas; e remover essencialmente toda a impureza do complexo por lavagem com um não solvente para o péptido e dicetopiperazina.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que o péptido ou proteína é seleccionado do grupo que consiste de insulina, calcitonina de salmão, hormona paratiróide 1-34, octreótido, leuprolida e péptido RSV.
3. 3. Método da reivindicação 1, em que a impureza é um ião multivalente.
4. 4. Método da reivindicação 2, em que o péptido é um complexo de insulina e a impureza é um ião zinco.
5. 5. Composição para a administração de um péptido a um doente, compreendendo um péptido complexado com uma dicetopiperazina; em que a composição é obtida por combinação do péptido com microparticulas preformadas da dicetopiperazina para formar um revestimento do péptido nas microparticulas e o péptido é uma hormona, citoquina ou outro péptido de imuno-modulação, antigénio ou vacina.
6. 6. Composição da reivindicação 5, em que o péptido é insulina dimérica ou monomérica.
7. 7. Composição da reivindicação 5, em que o péptido é glucagon.
8. 8. Composição da reivindicação 6, em que o péptido está substancialmente isento de iões zinco. ΕΡ 1 196 430/PT 2/7
9. 9. Composição de qualquer das reivindicações 5-8, em que as microparticulas se proporcionam sob a forma de um pó seco.
10. 10. Composição de qualquer das reivindicações 5-8, em que as microparticulas são proporcionadas como uma suspensão aquosa num transportador farmaceuticamente aceitável.
11. 11. Composição de qualquer das reivindicações 5, 8 ou 9 que está numa forma adequada para administração pulmonar.
12. 12. Composição da reivindicação 5 preparada pelo método de qualquer das reivindicações 1-4.
13. 13. Utilização de microparticulas formadas a partir de um complexo de (i) um agente activo e (ii) uma quantidade eficaz de dicetopiperazina, em que o complexo é formado por combinação de microparticulas preformadas de dicetopiperazina com o agente activo, no fabrico de um medicamento para tratamento terapêutico ou profiláctico por administração do agente activo a uma membrana mucosa, em que o agente activo é um péptido terapêutico, profiláctico ou de diagnóstico.
14. 14. Microparticulas formadas a partir de um complexo de (i) um agente activo e (ii) uma quantidade eficaz de dicetopiperazina, em que o complexo é formado por combinação de microparticulas preformadas de dicetopiperazina com o agente activo, para utilização no tratamento terapêutico ou profiláctico por administração do agente activo a uma membrana mucosa, em que o agente activo é um péptido terapêutico, profiláctico ou de diagnóstico.
15. 15. Utilização da reivindicação 13 ou as microparticulas da reivindicação 14, em que o agente activo é uma molécula carregada.
16. 16. Utilização de qualquer das reivindicações 13 ou 15 ou as microparticulas de qualquer das reivindicações 14 ou 15, em que a composição é administrada aos pulmões através de inalação.
17. 17. Utilização de microparticulas de uma dicetopiperazina nas quais a insulina monomérica ou dimérica está complexada ΕΡ 1 196 430/ΡΤ 3/7 com a dicetopiperazina, em que a insulina está substancialmente isenta de zinco e em que o complexo é formado por combinação de micropartículas preformadas da dicetopiperazina com insulina, no fabrico de um medicamento para entregar insulina a doente que dela necessite.
18. 18. Micropartículas de uma dicetopiperazina nas quais a insulina monomérica ou dimérica está complexada com a dicetopiperazina, em que a insulina está substancialmente isenta de zinco e em que o complexo é formado por combinação de micropartículas preformadas da dicetopiperazina com insulina, para utilização na entrega de insulina a doente que dela necessite.
19. 19. Utilização da reivindicação 17 ou as micropartículas da reivindicação 18, em que a composição está numa forma em pó seco adequada para administração aos pulmões através de inalação.
20. 20. Micropartículas formadas a partir de um complexo de (i) um agente activo e (ii) uma quantidade eficaz de uma dicetopiperazina, em que o complexo é formado por combinação de micropartículas preformadas de dicetopiperazina com o agente activo, para utilização em medicina, em que o agente activo é hormona peptídica, citoquina ou outro péptido de imuno-modulação, antigénio ou vacina.
21. 21. Micropartículas de uma dicetopiperazina nas quais está complexada insulina monomérica ou dimérica e em que o complexo é formado por combinação de micropartículas preformadas da dicetopiperazina com insulina, para utilização em medicina.
22. 22. Micropartículas da reivindicação 21 para utilização no tratamento de diabetes de tipo II.
23. 23. Método para estabilizar um péptido compreendendo proporcionar micropartículas preformadas de uma dicetopiperazina numa suspensão; proporcionar um péptido que forme um complexo do péptido com uma quantidade eficaz das micropartículas preformadas de dicetopiperazina para estabilizar o péptido. ΕΡ 1 196 430/ΡΤ 4/7
24. 24. Composição para a administração de um péptido, em que o péptido é estabilizado de acordo com o método da reivindicação 23.
25. 25. Formulação para utilização em medicina compreendendo insulina complexada com uma dicetopiperazina e em que o complexo é formado por combinação de microparticulas preformadas da dicetopiperazina com a insulina que, quando administrada a um doente numa quantidade eficaz, produz uma concentração sanguínea de pico de insulina no doente, que simula uma resposta normal à alimentação, em que a formulação está numa forma adequada para administração por inalação ou oralmente.
26. 26. Formulação da reivindicação 25 administrada por inalação.
27. 27. Formulação da reivindicação 26, em que a dicetopiperazina é fumarildicetopiperazina e a concentração sanguínea de pico de insulina é atingida cerca de 13 minutos após administração.
28. 28. Formulação da reivindicação 26 compreendendo insulina, em que a concentração sanguínea de pico de insulina é atingida num intervalo de tempo entre 3 a 10 minutos após administração.
29. 29. Formulação para utilização em medicina compreendendo um péptido complexado com uma dicetopiperazina por combinação de microparticulas preformadas da dicetopiperazina com o péptido; formulação essa que, quando administrada a um doente por entrega pulmonar, proporciona concentração sanguínea de pico no intervalo de 3 a 10 minutos após administração e em que o péptido é insulina, calcitonina de salmão, hormona paratiróide 1-34, octreótido, leuprolida ou péptido RSV.
30. 30. Formulação de qualquer das reivindicações 25 a 29 na forma de um pó seco.
31. 31. Utilização de uma composição compreendendo insulina complexada com uma dicetopiperazina e em que o complexo é formado por combinação de microparticulas preformadas da ΕΡ 1 196 430/PT 5/7 dicetopiperazina com a insulina, para o fabrico de um medicamento para tratar diabetes de tipo II que, quando administrada a um doente numa quantidade eficaz, produz uma concentração sanguínea de pico de insulina no doente, que simula uma resposta normal à alimentação, em que a formulação está numa forma adequada para administração por inalação ou oralmente.
32. 32. Composição compreendendo insulina complexada com uma dicetopiperazina e em que o complexo é formado por combinação de micropartícuias preformadas da dicetopiperazina com a insulina, para utilização no tratamento de diabetes de tipo II que, quando administrada a um doente numa quantidade eficaz, produz uma concentração sanguínea de pico de insulina no doente que simula uma resposta normal à alimentação, em que a formulação está numa forma adequada para administração por inalação ou oralmente.
33. 33. Método de complexar um péptido com uma dicetopiperazina compreendendo: (i) proporcionar uma suspensão de micropartículas de dicetopiperazina, (ii) proporcionar uma solução do péptido e (iii) combinar a suspensão e a solução para formar um complexo do péptido e das micropartículas de dicetopiperazina.
34. 34. Método da reivindicação 33 compreendendo adicionalmente a remoção do solvente por liofilização.
35. 35. Método de qualquer das reivindicações 2, 23, 33 ou 34 ou utilização ou as micropartículas da reivindicação 15 ou a composição da reivindicação 24, em que o agente activo é insulina.
36. 36. Método da reivindicação 35 enquanto dependente de qualquer das reivindicações 33 a 34, em que a insulina complexada é insulina monomérica ou dimérica. ΕΡ 1 196 430/PT 6/7
37. 37. Método da reivindicação 35 enquanto dependente de qualquer das reivindicações 33 a 34 ou reivindicação 36, em que a insulina é estável.
38. 38. Utilização de uma formulação para entrega de insulina monomérica ou dimérica compreendendo uma quantidade eficaz de insulina complexada com um derivado de dicetopiperazina, em que a formulação de entrega é preparada por complexação de insulina com microparticulas do derivado de dicetopiperazina e em que as microparticulas libertam insulina monomérica ou dimérica por dissociação, no fabrico de um medicamento para entrega de insulina monomérica ou dimérica a um doente que dela necessite.
39. 39. Formulação de entrega de insulina monomérica ou dimérica compreendendo uma quantidade eficaz de insulina complexada com um derivado de dicetopiperazina, em que a formulação de entrega é preparada por complexação de insulina com microparticulas do derivado de dicetopiperazina e em que as microparticulas libertam insulina monomérica ou dimérica por dissociação, para utilização em medicina.
40. 40. Método de qualquer uma das reivindicações 1-4, composição de qualquer uma das reivindicações 5-12, utilização de qualquer das reivindicações 13 ou 15 a 17 ou 19, microparticulas para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 18 ou 20 a 22, método da reivindicação 23, composição da reivindicação 24, formulação de qualquer uma das reivindicações 25 a 30, utilização da reivindicação 31, composição da reivindicação 32, método de qualquer uma das reivindicações 33-37, utilização da reivindicação 38 ou formulação da reivindicação 39, em que a dicetopiperazina é fumarildicetopiperazina.
41. 41. Método da reivindicação 1 ou 23, composição da reivindicação 5, utilização da reivindicação 13, 16 ou 38, formulação da reivindicação 39 ou microparticulas de qualquer das reivindicações 14, 18 ou 20, em que o derivado de dicetopiperazina tem a fórmula 2,5-diceto-3,6-di(4-X-aminobutil)piperazina, em que X é seleccionado do grupo que consiste de fumarilo, succinilo, maleilo e glutarilo. ΕΡ 1 196 430/ΡΤ 7/7
42. 42. Utilização da reivindicação 17, 19 ou 38 ou as microparticulas da reivindicação 18 ou 19 ou formulação da reivindicação 39, em que a formulação de entrega está numa forma em pó seco adequada para administração aos pulmões através de inalação.
43. 43. Utilização da reivindicação 17, 19 ou 38, ou as microparticulas da reivindicação 18 ou 19, ou formulação da reivindicação 39, em que o doente é um diabético de tipo II.
44. 44. Utilização da reivindicação 43, as microparticulas da reivindicação 43 ou formulação da reivindicação 43, em que a composição ou formulação de entrega é para administração ao doente simultaneamente ou num intervalo inferior a cerca de 20 minutos antes do doente ingerir uma refeição.
45. 45. Utilização da reivindicação 17, 19 ou 38, as microparticulas da reivindicação 18 ou 19 ou formulação da reivindicação 39, em que a formulação de entrega é proporcionada numa ou mais doses unitárias de insulina, em que cada dose é equivalente a cerca de 6 IU de insulina. Lisboa, 2012-04-10