ES2711670T3 - Composiciones y métodos para la prevención o tratamiento de la fibrosis pulmonar - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento de fibrosis pulmonar en un sujeto que resulta de la administración de bleomicina, una reacción alérgica, la inhalación de partículas ambientales, el tabaquismo, una infección bacteriana, una infección vírica, daños mecánicos en un pulmón del sujeto, rechazo del trasplante pulmonar, un trastorno autoinmunológico, un trastorno genético, o una combinación de los mismos, en donde la fibrosis pulmonar se caracteriza por como mínimo una patología seleccionada del grupo que consiste en una deposición aberrante de una proteína de la matriz extracelular en un intersticio pulmonar, una estimulación aberrante de la proliferación de fibroblastos en el pulmón, una inducción aberrante de la diferenciación de los miofibroblastos en el pulmón y una estimulación aberrante de la unión de miofibroblastos a la matriz extracelular, en comparación con un sujeto de control sano normal, en donde la composición farmacéutica comprende: (a) una cantidad terapéutica de un polipéptido de la secuencia de aminoácidos YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID nº 1) o un equivalente funcional del mismo seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de secuencia de aminoácidos FAKLAARLYRKALARQLGVAA (SEC ID nº 3), un polipéptido de secuencia de aminoácidos KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA (SEC ID nº 4), y un polipéptido de secuencia de aminoácidos HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA (SEC ID nº 7) y (b) un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la cantidad terapéutica resulta eficaz (1) para inhibir la actividad de quinasa de una quinasa seleccionada del grupo de una proteína quinasa 2 activada por proteína quinasa activada por mitógeno (MK2), una proteína quinasa 3 activada por proteína quinasa activada por mitógeno (MK3), una proteína quinasa I dependiente de calcio/calmodulina (CaMKI, proteína quinasa específica de serina/treonina) y un receptor de factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB, tirosina quinasa) y (2) para reducir la proliferación de fibroblastos y la deposición de matriz extracelular en los tejidos del sujeto.

Description

DESCRIPCION

Composiciones y metodos para la prevencion o tratamiento de la fibrosis pulmonar

CAMPO DE LA INVENCION

La invencion se encuentra comprendida en los campos de la biologfa celular y molecular, polipeptidos y metodos terapeuticos de utilizacion.

ANTECEDENTES

1. Mecanismos de cicatrizacion de heridas y fibrosis

La expresion "cicatrizacion de heridas" se refiere al proceso por el que el cuerpo repara los traumatismos de cualquiera de sus tejidos, especialmente los causados por medios ffsicos y con interrupcion de continuidad.

Una respuesta de cicatrizacion de heridas con frecuencia se describe como presentando tres etapas diferentes: lesion, inflamacion y reparacion. En terminos generales, el cuerpo responde a la lesion con una respuesta inflamatoria, que resulta crucial para mantener la salud e integridad de un organismo. Sin embargo, si se desequilibra, puede resultar en la destruccion de tejidos.

Etapa I: lesion

La lesion causada por factores entre los que se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, las reacciones autoinmunologicas o alergicas, las partfculas ambientales, la infeccion o dano mecanico, con frecuencia resulta en la alteracion de la arquitectura normal de los tejidos, iniciando una respuesta de cicatrizacion. Las celulas epiteliales y endoteliales danadas deben sustituirse para mantener la funcion de barrera y la integridad y evitar la perdida de sangre, respectivamente. El dano agudo a las celulas endoteliales conduce a la liberacion de mediadores inflamatorios y al inicio de una cascada de coagulacion antifibrinolftica, taponando temporalmente el vaso danado con un coagulo rico en plaquetas y fibrina. Por ejemplo, los homogenados pulmonares, las celulas epiteliales o el ftquido de lavado broncoalveolar procedente de pacientes de fibrosis pulmonar idiopatica (FPI) contienen niveles mas elevados del factor de diferenciacion de plaquetas, protema-1 de union a X-box, en comparacion con los pacientes de enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) y de control, sugiriendo que las respuestas de formacion de coagulo se activan continuamente. Ademas, la trombina (una serina proteasa necesaria para convertir el fibrinogeno en fibrina) tambien se detecta facilmente dentro del pulmon y en los espacios intraalveolares en varias condiciones fibroticas pulmonares, confirmando adicionalmente la activacion de la ruta de coagulacion. La trombina tambien puede activar directamente los fibroblastos, incrementando la proliferacion y estimulando la diferenciacion de los fibroblastos en miofibroblastos productores de colageno. El dano al epitelio de las vfas respiratorias, espedficamente a los neumocitos alveolares, puede inducir una cascada antifibrinolftica similar y conduce a edema intersticial, zonas de inflamacion aguda y separacion del epitelio respecto de la membrana basal.

La captacion de plaquetas, degranulacion y formacion del coagulo rapidamente avanzan hacia una fase de vasoconstriccion con permeabilidad incrementada, permitiendo la extravasacion (movimiento de globulos blancos de los capilares hacia los tejidos circundantes) y la atraccion de los leucocitos hacia el sitio del dano. La membrana basal, que forma la matriz extracelular subyacente al epitelio y endotelio de tejido parenquimatoso, impide el acceso directo al tejido danado. Para romper esta barrera ffsica, las endopeptidasas dependientes de cinc, tambien denominadas metaloproteinasas de matriz (MMP, por sus siglas en ingles), cortan uno o mas constituyentes de la matriz extracelular, permitiendo la extravasacion de celulas hacia el interior y exterior de los sitios de dano. Especfticamente, MMP-2 (gelatinasa A, colagenasa de tipo N) y MMP-9 (gelatinasa B, colagenasa de tipo IV) cortan los colagenos de tipo N y la gelatina, dos constituyentes importantes de la membrana basal. Estudios recientes han encontrado que m MP-2 y MMP-9 se encuentran regulados positivamente, subrayando que los procesos destructores de tejido y regenerativos son habituales en las condiciones fibroticas. Las actividades de las MMP estan controladas por varios mecanismos, entre ellos la regulacion transcripcional, la regulacion proenzimatica y los inhibidores tisulares espedficos de las MMP. El equilibrio entre las MMP y los diversos mecanismos de inhibicion puede regular la inflamacion y determinar la cantidad neta de colageno depositada durante la respuesta de cicatrizacion.

Estudios anteriores que han utilizado un modelo de inflamacion alergica y remodelado de las vfas respiratorias en ratones MMP-2'/_, m Mp -9'/_ y con doble desactivacion MMP-2'/_ MMP-9'/_ demuestran que MMP-2 y MMP-9 resultan necesarias para la salida y eliminacion con exito de las celulas inflamatorias respecto del tejido inflamado y hacia el interior de los espacios aereos. En ausencia de estas MMP, las celulas resultaban atrapadas dentro del parenquima del pulmon y no eran capaces de entrar en los espacios aereos, resultando en asfixia fatal.

Etapa II: inflamacion

Una vez se ha conseguido acceder al sitio de dano tisular, los gradientes de quimioquinas atraen a las celulas inflamatorias. Se observan neutrofilos, eosinofilos, linfocitos y macrofagos en los sitios de dano agudo, con eliminacion de los residuos celulares y zonas de necrosis por los fagocitos.

La atraccion temprana de eosinofilos, neutrofilos, linfocitos y macrofagos que proporcionan citoquinas y quimioquinas inflamatorias puede contribuir a la acumulacion local de TGF-p e IL-13. Tras el insulto y onda de celulas inflamatorias iniciales, una atraccion de estadio tardfo de celulas inflamatorias puede ayudar en la fagocitosis, en la eliminacion de residuos celulares y en el control de la proliferacion celular excesiva, que juntos podnan contribuir a la cicatrizacion normal. La inflamacion de estadio tardfo puede presentar un papel antifibrotico y puede resultar necesaria para la resolucion con exito de las respuestas de cicatrizacion de herida. Por ejemplo, un perfil inflamatorio de etapa tardfa rico en macrofagos fagocfticos, que ayudan en la eliminacion de fibroblastos, ademas de celulas T reguladoras secretoras de IL-10, que suprimen la produccion local de quimioquinas y TGF-p, puede evitar la activacion excesiva de los fibroblastos.

La naturaleza del insulto o agente causal con frecuencia gobierna el caracter de la respuesta inflamatoria subsiguiente. Por ejemplo, los estfmulos exogenos, tales como los patrones moleculares asociados a patogenos (PAMP, por sus siglas en ingles) son reconocidos por receptores de reconocimiento de patogenos, tales como los receptores tipo Toll y los receptores tipo NOD (protemas citoplasmaticas que presentan una diversidad de funciones en la regulacion de las respuestas inflamatorias y apoptoticas) e influyen sobre la respuesta de las celulas innatas a los patogenos invasores. Las senales de peligro endogenas tambien pueden influir sobre las celulas innata locales y organizar la cascada inflamatoria.

La naturaleza de la respuesta inflamatoria influye drasticamente sobre las celulas de los tejidos residentes y las celulas inflamatorias generadas. Las celulas inflamatorias mismas tambien propagan una inflamacion adicional mediante la secrecion de quimioquinas, citoquinas y factores de crecimiento. Muchas citoquinas participan durante toda la respuesta de cicatrizacion de heridas y fibrotica, con la activacion de grupos espedficos de genes en las diversas condiciones. Por ejemplo, la enfermedad alergica cronica de las vfas respiratorias en asmaticos esta asociada habitualmente a perfiles elevados de citoquinas relacionadas con celulas T ayudantes de tipo 2 (Th2) (incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, la interleuquina-4 (IL-4), la interleuquina-5 (IL-5), la interleuquina-6 (IL-6), la interleuquina-13 (IL-13) y la interleuquina-9 (IL-9)), mientras que los pacientes de enfermedad pulmonar obstructiva cronica y enfermedad pulmonar fibrotica (tal como la fibrosis pulmonar idiopatica) mas frecuentemente presentan perfiles de citoquinas proinflamatorias (incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, la interleuquina-1 alfa (IL-1a), la interleuquina-1 beta (IL-Ip), la interleuquina-6 (IL-6), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), el factor beta de crecimiento transformante (TGF-p) y los factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF)). Cada una de dichas citoquinas se ha demostrado que muestra una actividad profibrotica significativa, actuando mediante la atraccion, activacion y proliferacion de fibroblastos, macrofagos y miofibroblastos.

Etapa III: reparacion y contraccion tisular

La etapa de cierre de la cicatrizacion de heridas consiste en una reorganizacion celular organizada guiada por la formacion de andamiaje rico en fibrina (una protema fibrosa que se polimeriza para formar una "malla" que forma un coagulo sobre un sitio de herida), contraccion de la herida, cierre y reepitelizacion. La gran mayona de estudios que dilucidan los procesos que participan en esta etapa de la reparacion de heridas proceden de estudios sobre heridas dermicas y sistemas in vitro.

Los colagenos derivados de miofibroblastos y actina de musculo liso (a-SMA, por sus siglas en ingles) forman la matriz extracelular provisional, en la que los macrofagos, plaquetas y fibronectina derivada de fibroblastos forman un andamiaje de fibrina. Colectivamente, estas estructuras se denominan comunmente tejidos de granulacion. Los fibroblastos primarios o macrofagos alveolares aislados a partir de pacientes de fibrosis pulmonar idiopatica producen significativamente mas fibronectina y a-SMA que los fibroblastos de control, indicativos de un estado de activacion incrementada de los fibroblastos. Se ha informado de que los pacientes de FPI sometidos a tratamiento de esteroides presentaban niveles elevados de fibronectina derivada de macrofagos similares a los de pacientes de FPI sin tratamiento. De esta manera, de manera similar a la diferenciacion de miofibroblastos mediada por IL-13 resistente a esteroides, la liberacion de fibronectina derivada de macrofagos aparentemente tambien es resistente al tratamiento de esteroides, proporcionando otro motivo de que el tratamiento de esteroides pueda resultar ineficaz. A partir de modelos animales, la fibronectina aparentemente resulta necesaria para el desarrollo de la fibrosis pulmonar, ya que los ratones con una delecion espedfica de un dominio de tipo III adicional de la fibronectina (EDA, por sus siglas en ingles) desarrollaron significativamente menos fibrosis tras la administracion de bleomicina que sus contrapartidas de tipo salvaje.

Ademas de la fibronectina, la matriz extracelular provisional consiste en glucoprotemas (tales como PDGF), glucosaminoglicanos (tales como acido hialuronico), proteoglicanos y elastina. Los fibroblastos activados por factor de crecimiento y TGF-p migran a lo largo de la red de la matriz extracelular y reparan la herida. Dentro de las heridas en la piel, TGF-p tambien induce una respuesta de contraccion, regulando la orientacion de las fibras de colageno. La diferenciacion de fibroblastos en miofibroblastos, tal como se ha comentado anteriormente, tambien crea fibras de estres y la neoexpresion de a-SMA, los cuales confieren ambos la elevada actividad contractil dentro de los miofibroblastos. La union de miofibroblastos a la matriz extracelular en sitios especializados denominados "fibronexus" o "adhesiones focales supermaduras" tiran uniendo la herida, reduciendo el tamano de la lesion durante la etapa de contraccion. La extension del establecimiento de matriz extracelular y la cantidad de miofibroblastos activados determina la cantidad de deposicion de colageno. Con este fin, el equilibrio de metaloproteinasas matriciales (MMP) a inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP, por sus siglas en ingles) y de colagenos a colagenasas vana durante la respuesta, desplazandose de prosmtesis y deposito incrementado de colageno a un equilibrio controlado, sin incremento neto de colageno. Para una cicatrizacion de herida exitosa, dicho equilibrio con frecuencia se alcanza cuando los fibroblastos experimentan apoptosis, la inflamacion empieza a ceder y retrocede el tejido de granulacion, dejando una lesion rica en colageno. La eliminacion de las celulas inflamatorias, y especialmente de los miofibroblastos positivos para a-SMA, resulta esencial para terminar el deposito de colageno. Resulta interesante que en los pacientes de fibrosis pulmonar idiopatica, puede retrasarse la eliminacion de los fibroblastos, con celulas resistentes a las senales apoptoticas, a pesar de la observacion de niveles elevados de moleculas proapoptoticas y senalizacion de FAS. Esta resistencia relativa a la apoptosis potencialmente podna subyacer a dicha enfermedad fibrotica. Sin embargo, varios estudios tambien han observado tasas incrementadas de apoptosis de fibroblastos secretores de colageno y de celulas epiteliales en la fibrosis pulmonar idiopatica, sugiriendo que todavfa otro equilibrio requiere la monitorizacion de la apoptosis de los fibroblastos y de la proliferacion de los fibroblastos. A partir de estudios de la piel se conoce que la reepitelizacion de los sitios de herida reestablece la funcion de barrera y permite la reorganizacion celular encapsulada. Varios modelos in vitro e in vivo que utilizan celulas epiteliales humanas o de rata cultivadas sobre una matriz de colageno, o heridas traqueales in vivo, se han utilizado para identificar estadios significativos de la migracion y proliferacion celular y de la propagacion celular. En las horas siguientes a la herida inicial se produce una motilidad y proliferacion rapidas y dinamicas, con restitucion epitelial desde los bordes de la zona denudada. Ademas, laminas deslizantes de celulas epiteliales pueden migrar sobre la zona danada, ayudando a cubrir la herida. Se ha demostrado que varios factores regulan la reepitelizacion, entre ellos el factor alfa de crecimiento transformante derivado de suero (TGF-a) y la metaloproteinasa de matriz 7 (MMP-7) (ella misma regulada por TIMP-1).

Colectivamente, el grado de inflamacion, angiogenesis y la cantidad de deposito de matriz extracelular contribuyen todos al desarrollo en ultima instancia de una lesion fibrotica. De esta manera, la intervencion terapeutica que interfiere con la activacion fibroblastica, la proliferacion o la apoptosis requieren una comprension y apreciacion profundas de todas las etapas de la reparacion de heridas. Aunque dichas tres etapas con frecuencia se presentan secuencialmente, durante la lesion cronica o repetida, estos procesos funcionan en paralelo, imponiendo una demanda significativa a los mecanismos reguladores (Wilson y Wynn, Mucosal Immunol., 2009, 3(2):103-121).

2. Fibrosis como patologia

La fibrosis representa la formacion o desarrollo de tejido conectivo fibroso en exceso en un organo o tejido, que se forma como consecuencia de la respuesta normal o anormal/reactiva de cicatrizacion de heridas que conduce a una cicatriz. La fibrosis se caracteriza por, por ejemplo, aunque sin limitacion, un deposito aberrante de una protema de la matriz extracelular, una estimulacion aberrante de la proliferacion fibroblastica, una induccion aberrante de la diferenciacion de una poblacion de fibroblastos en una poblacion de miofibroblastos, una estimulacion aberrante de la union de los miofibroblastos a la matriz extracelular, o una combinacion de los mismos.

Mediadores proinflamatorios

La creciente evidencia sugiere que mediadores polipeptfdicos conocidos como citoquinas, incluyendo diversas linfoquinas, interleuquinas y quimioquinas, son importantes estfmulos del deposito de colageno en la fibrosis. Las citoquinas, las cuales son liberadas por celulas de tejido residente y por celulas inflamatorias producidas, se cree que estimulan la proliferacion de fibroblastos e incrementan la smtesis de protemas de la matriz extracelular, incluyendo el colageno. Por ejemplo, una caractenstica temprana en la patogenesis de la fibrosis pulmonar idiopatica es la lesion celular epitelial y/o capilar alveolar. Lo anterior estimula la atraccion al interior del pulmon de celulas inmunologicas circulantes, tales como monocitos, neutrofilos, linfocitos y eosinofilos. Estas celulas efectoras, junto con celulas pulmonares residentes, tales como macrofagos, celulas epiteliales y endoteliales alveolares, liberan citoquinas, que estimulan las celulas diana, tfpicamente los fibroblastos, a que se repliquen y sinteticen cantidades incrementadas de colageno. La degradacion de las protemas de la matriz extracelular tambien puede resultar inhibida, contribuyendo de esta manera al proceso fibrotico (Coker y Laurent, Eur Respir J, 1998; 11:1218-1221).

Numerosas citoquinas han sido implicadas en la patogenesis de la fibrosis, entre ellas, aunque sin limitacion, el factor p de crecimiento transformante (TGF-p), el factor a de necrosis tumoral (TNF-a), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor-1 de crecimiento similar a insulina (IGF-1), la endotelina-1 (ET-1) y las interleuquinas, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-8 (IL-8) e interleuquina-17 (IL-17). Las quimioquinas quimioatrayentes de leucocitos, incluyendo el factor regulado con la activacion en celulas T normales, expresadas y secretadas (RANTES, por sus siglas en ingles), se cree que tambien desempenan un papel importante. Los niveles elevados de citoquinas proinflamatorias, tales como la interleuquina-8 (IL-8), asf como moleculas de adhesion celular (CAM, por sus siglas en ingles) posteriores, tales como la molecula-1 de adhesion intercelular (ICAM-1, por sus siglas en ingles) y la molecula-1 de adhesion celular vascular (VCAM-1), metaloproteinasas de matriz, tales como la metaloproteinasa-7 de matriz (MMP-7) y moleculas de senalizacion, tales como la protema A12 de union al calcio S10 0(S100A12, tambien conocida como calgranulina C), en sangre periferica, se ha encontrado que estan asociados a mortalidad, supervivencia sin trasplante de pulmon y progresion de enfermedad en pacientes con fibrosis pulmonar idiopatica (Richards et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2012, 185: 67-76).

La familia TGF-p de protema presenta un potente efecto estimulante de la deposicion de la matriz extracelular y, de hecho, se ha utilizado en la construccion de modelos animales inducidos de fibrosis mediante transferencia genica. Los estudios in vitro demuestran que TGF-p1, secretado en forma de un precursor latente, estimula la expresion genica y smtesis de protema de procolageno en fibroblastos. Los datos sugieren que las otras isoformas de mairnfero, TGF-p2 y TGF-p3, tambien estimulan la smtesis de colageno en fibroblastos pulmonares humanos y reducen la degradacion in vitro. En modelos animales de fibrosis pulmonar, la expresion potenciada de gen TGF-p1 esta relacionada temporal y espacialmente con la expresion genica incrementada de colageno y la deposicion de protema. Los anticuerpos de TGF-p1 reducen la deposicion de colageno en la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina murina y el tejido pulmonar fibrotico humano muestra una expresion de gen y protema TGF-p1 potenciados.

TNF-a puede estimular la replicacion de los fibroblastos y la smtesis de colageno in vitro y la expresion pulmonar del gen de TNF-a se incrementa tras la administracion de bleomicina en ratones. Los receptores solubles de TNF-a reducen la fibrosis pulmonar en modelos murinos y la sobreexpresion pulmonar de TNF-a en ratones transgenicos se caracteriza por fibrosis pulmonar. En pacientes con FPI o asbestosis (una condicion medica inflamatoria cronica y fibrotica que afecta al tejido parenquimatoso de los pulmones causada por la inhalacion y retencion de fibras de amianto), la liberacion de macrofagos derivados de hquido de lavado broncoalveolar incremento la cantidad de TNF-a en comparacion con los controles.

La endotelina (ET-1) tambien satisface los criterios para una citoquina profibrotica. Esta molecula estimula la proliferacion y quimiotaxis de los fibroblastos y estimula la produccion de procolageno. Se encuentra presente en los pulmones de pacientes con fibrosis pulmonar y un informe reciente sugiere que el antagonista del receptor de ET-1 bosentan mejora la fibrosis pulmonar al administrarlo en animales experimentales.

ProMferacion/activacion de miofibroblastos no controlada y formacion de focos fibroticos

La diferenciacion de los fibroblastos en miofibroblastos se cree desde hace mucho tiempo que es un suceso importante en muchas condiciones, incluyendo la reparacion de heridas y la fibrosis. Por ejemplo, se ha informado de que los miofibroblastos aparencen en zonas de fibrosis activa y son responsables de la produccion y deposicion de protemas de la matriz extracelular (MEC) en la fibrosis pulmonar (Liu, T. et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 2007, 37:507-517).

Una hipotesis para la causacion de fibrosis pulmonar idiopatica sugiere que un estfmulo todavfa no identificado produce episodios repetidos de lesion pulmonar aguda. La cicatrizacion de heridas en estos sitios de lesion conduce en ultima instancia a fibrosis, con perdida de funcion pulmonar. Los focos de fibroblastos, las lesiones caractensticas de la fibrosis pulmonar idiopatica, muestran una replicacion vigorosa de celulas mesenquimales y una deposicion exuberante de matriz extracelular nueva. Tales focos son tfpicos de lesion de las celulas epiteliales alveolares, con exudacion plasmatica endoluminal y colapso del espacio aereo distal. Los mediadores asociados normalmente a la cicatrizacion de heridas, tales como el factor p1 de crecimiento transformante (TGF-p1) y el factor de crecimiento de tejido conectivo, tambien se expresan en estos sitios. Se desconoce cual es la fuerza que impulsa esta lesion pulmonar aguda focal y la reparacion de heridas.

3. Enfermedad o condiciones en las que la fibrosis desempena un papel

Se ha implicado la fibrosis en varias enfermedades o condiciones heterogeneas, entre ellas, aunque sin limitacion, la enfermedad pulmonar intersticial, tal como la fibrosis pulmonar idiopatica, la lesion pulmonar aguda (LPA), la fibrosis inducida por radiacion y el rechazo del trasplante.

3.1. Fibrosis pulmonar idiopatica (FPI)

La fibrosis pulmonar idiopatica (FPI, tambien conocida como alveolitis fibrosante criptogenica, AFC, o neumoma intersticial fibrosante idiopatica) se define como una forma espedfica de neumoma intersticial fibrosante progresiva cronica de etiologfa indeterminada que aparece principalmente en adultos mayores, esta limitada a los pulmones y se asocia al patron radiologico e histologico de la neumoma intersticial usual (NlU) (Raghu G. et al., Am J Respir Crit Care Med., 183(6):788-824, 2011; Thannickal, V. et al., Proc Am Thorac Soc., 3(4):350-356, 2006). Puede caracterizarse por una deposicion anormal y excesiva de tejido fibrotico en el intersticio pulmonar. En las imagenes de tomograffa computerizada de alta resolucion (HRCT, por sus siglas en ingles), la NIU se caracteriza por la presencia de opacidades reticulares asociadas con frecuencia con las bronquiectasias de traccion. A medida que avanza la FPI, el patron en panal de abeja se vuelve mas prominente (Neininger A. et al., J Biol Chem., 277(5):3065-8, 2002). Los ensayos de funcion pulmonar con frecuencia revelan alteraciones restrictivas y una capacidad difusiva reducida del monoxido de carbono (Thomas, T. et al., J Neurochem., 105(5): 2039-52, 2008). Los estudios han informado de incrementos significativos de la liberacion de TNF-a e IL-6 en pacientes con fibrosis pulmonar idiopatica (FPI) (Zhang, Y, et al. J. Immunol. 150(9):4188-4196, 1993), que se ha atribuido al nivel de expresion de IL-Ip (Kolb, M., et al. J. Clin. Invest, 107(12):1529-1536, 2001). La aparicion de smtomas de FPI, falta de aliento y tos, habitualmente son insidiosos pero progresan gradualmente, produciendose la muerte en 70% de los pacientes dentro de los cinco anos posteriores al diagnostico. Este mal pronostico es similar al numero de muertes anuales atribuibles al cancer de mama (Raghu G. et al., Am J Respir Crit Care Med., 183(6):788-824, 2011).

La FPI afecta a practicamente 130.000 pacientes en los Estados Unidos, con aproximadamente 50.000 pacientes nuevos cada ano y practicamente 40.000 muertes cada ano en todo el mundo (Raghu G. et al., Am J Respir Crit Care Med., 183(6):788-824, 2011). Aunque estos datos son notables, un estudio reciente informa de que la FpI puede ser 5 a 10 veces mas prevalente de lo que se crefa, quiza debido a la creciente prevalencia o a las mejores capacidades diagnosticas (Thannickal, V. et al., Proc Am Thorac Soc., 3(4):350-356, 2006). El trasplante de pulmon se considera una terapia definitiva para la FPI pero la supervivencia a cinco anos tras el trasplante de pulmon es inferior al 50%. Por consiguiente, ni siquiera el trasplante de pulmon puede considerarse una "cura" para la FPI. Ademas, de la carga ffsica y emocional para el paciente, la FPI presenta un tratamiento y atencion extremadamente caros, con costes de la atencion sanitaria publica del orden de 2.800 millones de dolares cada 100.000 pacientes cada ano.

Ademas, los estudios anteriores sugieren que los insultos ambientales anadidos podnan ser importantes durante la patogenesis de la fibrosis pulmonar idiopatica. En la mayona de series de casos informados, hasta el 75 por ciento de los pacientes mdice con fibrosis pulmonar idiopatica son fumadores actuales o anteriores. En estudios epidemiologicos grandes se ha encontrado una asociacion fuerte entre tabaquismo de cigarrillos y fibrosis pulmonar idiopatica. Ademas, muchas de las caractensticas inflamatorias de la fibrosis pulmonar idiopatica estan mas fuertemente asociadas al estado de tabaquismo que a la enfermedad pulmonar subyacente. De esta manera, el tabaquismo de cigarrillos podna ser un factor de riesgo independiente de fibrosis pulmonar idiopatica. Las infecciones vmcas latentes, especialmente las de la familia del virus herpes, tambien se ha informado de que estan asociadas a la fibrosis pulmonar idiopatica.

Debido a que no existe ningun tratamiento eficaz conocido para la FPI, incluyendo el trasplante de pulmon, sigue existiendo una necesidad cntica de desarrollo de nuevos terapeuticos. Actualmente se esta investigando una diversidad de enfoques terapeuticos, incluyendo terapias antifibroticas que pueden retrasar o inhibir la capacidad del cuerpo de producir tejido cicatricial o fibrotico, y vasodilatadores pulmonares para incrementar la superficie de tejido para el intercambio gaseoso en el pulmon. Aparte del trasplante de pulmon, entre los tratamientos potenciales de la FPI se incluyen los corticoesteroides, la azatioprina, la ciclofosfamida, los anticoagulantes y la N-acetilcistema (Raghu G. et al., Am J Respir Crit Care Med., 183(6):788-824, 2011). Ademas, rutinariamente se utilizan terapias de apoyo, tales como la terapia de oxfgeno y la rehabilitacion pulmonar. Sin embargo, ninguna de ellas ha impactado definitivamente en la supervivencia a largo plazo de los pacientes de FPI, lo que subraya todavfa mas la necesidad medica no satisfecha de opciones de tratamiento en la FPI. A modo de ejemplo, a pesar de los resultados contradictorios de los programas clmicos, la molecula pequena oral de InterMune Esbriet® (pirfenadona) ha recibido autorizaciones europea y japonesa para los pacientes con FPI. De esta manera, Esbriet® se ha convertido en la primera medicacion espedficamente indicada para el tratamiento de la FPI; debido a los resultados ambiguos de los ensayos y los efectos secundarios del farmaco, la utilidad del farmaco se percibe con escepticismo en los Estados Unidos y no ha recibido la autorizacion de la FDA basandose en los datos presentados en su momento. De acuerdo con lo anterior, se esta realizando un gran ensayo clmico de fase 3 para determinar su eficacia para apoyar una Solicitud de nuevo farmaco en los Estados Unidos.

Histopatologicamente, la FPI puede describirse como la acumulacion de miofibroblastos (o celulas mesenquimales) en focos fibroblasticos (Thannickal, V. et al., Proc Am Thorac Soc., 3(4):350-356, 2006). La apoptosis alterada de miofibroblastos puede resultar en un proceso de reparacion persistente y desregulado que culmina en la fibrosis tisular. Probablemente la inflamacion tambien desempena un papel cntico en la FPI, quiza mediante la estimulacion aguda dclica de los fibroblastos. Estos resultados apuntan a potenciales dianas para la intervencion terapeutica.

3.1.1. Patogenesis de la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI)

Aunque no se entienden por completo los mecanismos patogenicos, el paradigma actualmente aceptado propone que a la lesion del epitelio alveolar sigue un estallido de mediadores proinflamatorios y fibroproliferativos que inducen respuestas asociadas a la reparacion normal de los tejidos. Por motivos que no estan claros, estos procesos de reparacion nunca se resuelven y sigue la fibrosis progresiva (Selman M, et al., Ann Intern Med, 134(2):136-151,2001; Noble, P. y Homer R., Clin Chest Med, 25(4):749-58, 2004; Strieter, R., Chest, 128 (5 supl. 1):526S-532S, 2005).

3.1.2. Modelo en raton de bleomicina en la fibrosis pulmonar

Aunque existen varios modelos animales y pueden resultar utiles (p.ej., el modelo de transduccion adenovrnca de TGF-p o el modelo de fibrosis inducida por radiacion), el modelo de bleomicina esta bien documentado y es el modelo murino mejor caracterizado en uso actualmente para demostrar la eficacia de un farmaco o inhibidor de protema quinasa actual en los estadios postinflamatorios/prefibroticos/fibropreventivos (Vittal, R. et al., J Pharmacol Exp Ther., 321(1):35-44, 2007; Vittal, R. et al., Am J Pathol., 166(2):367-75, 2005; Hecker L. et al., Nat Med., 15(9):1077-81, 2009).

El antibiotico bleomicina fue aislado originariamente de Streptomyces verticillatus (Umezawa, H. et al., Cancer 20: 891-895, 1967). Posteriormente se encontro que este antibiotico resultaba eficaz contra los carcinomas de celulas escamosas y tumores cutaneos (Umezawa, H., Fed Proc, 33: 2296-2302, 1974); sin embargo, su utilidad como agente antineoplasico estaba limitada por la toxicidad pulmonar dependiente de dosis que resultaba en fibrosis (Muggia, F. et al., Cancer Treat Rev, 10: 221-243, 1983). La administracion de bleomicina por via intratraqueal (generalmente 1,25 a 4 U/kg, segun el origen) presenta la ventaja de que una unica inyeccion del farmaco produce lesion pulmonar y fibrosis resultante en roedores (Phan, S. et al., Am Rev Respir Dis 121: 501-506, 1980; Snider, G. et al., Am Rev Respir Dis. 117: 289-297, 1978; Thrall, R. et al., Am J Pathol, 95: 117-130, 1979). La administracion intratraqueal del farmaco en roedores resulta en danos directos inicialmente en las celulas epiteliales alveolares. Tras este suceso se desarrolla una pan-alveolitis neutrofflica y linfodtica dentro de la primera semana (Janick-Buckner, D. et al., Toxicol Appl Pharmacol., 100(3):465-73, 1989). Posteriormente, se eliminan las celulas inflamatorias alveolares, se observa proliferacion de fibroblastos y se sintetiza matriz extracelular (Schrier D. et al., Am Rev Respir Dis., 127(1):63-6,1983) El desarrollo de fibrosis en este modelo puede observarse bioqmmica e histologicamente alcanzado el dfa 14, observando generalmente respuestas maximas en torno a los dfas 21-28 (Izbicki G. et al., Int J Exp Pathol., 83(3):111-9, 2002; Phan, S. et al., Chest., 83(5 supl.):44S-45S, 1983). Sin embargo, mas alla de los 28 dfas la respuesta a la bleomicina es mas variable. Los informes originales sugieren que la bleomicina administrada por via intratraqueal podna inducir fibrosis que progresa o persiste durante 60 a 90 dfas (Thrall R. et al., Am J Pathol., 95(1): 117-30, 1979; Goldstein R., et al., Am Rev Respir Dis., 120(1):67-73, 1979; Starcher B. et al., Am Rev Respir Dis., 117(2):299-305, 1978); sin embargo, otros informes demuestran una respuesta autolimitada que empieza a resolverse despues de este periodo (Thrall R. et al., Am J Pathol., 95(1): 117-30, 1979; Phan, S. et al., Chest, 83(5 Suppl): 44S-45S, 1983; Lawson W. et al., Am J Pathol. 2005;167(5):1267-1277). Aunque la naturaleza de resolucion en este modelo no imita la enfermedad humana, este aspecto del modelo ofrece la oportunidad de estudiar la resolucion fibrotica en estos puntos temporales posteriores.

3.2. Lesion pulmonar aguda (LPA)

La lesion pulmonar aguda (LPA) y su forma mas severa, el smdrome de distres respiratorio agudo (SDRA), son smdromes de insuficiencia respiratoria aguda que resulta del edema y la inflamacion pulmonar aguda. LPA/SDRA es una causa de insuficiencia respiratoria aguda que se desarrolla en pacientes de todas las edades a partir de una diversidad de trastornos clmicos, incluyendo sepsis (pulmonar y no pulmonar), neumoma (bacteriana, vmca y fungica), aspiracion del contenido gastrico y orofanngeo, traumatismo mayor y algunos otros trastornos clmicos, incluyendo pancreatitis aguda severa, sobredosis de farmaco y productos sangumeos (Ware, L. y Matthay, M., N Engl J Med, 342:1334-1349, 2000). La mayona de pacientes requieren ventilacion asistida con presion positiva. Las anormalidades fisiologicas primarias son la hipoxemia arterial severa, asf como un incremento marcado en ventilacion minuto secundaria a un fuerte incremento de la fraccion de espacio muerto pulmonar Los pacientes con LPA/SDRA desarrollan edema pulmonar rico en protemas que resulta de la exudacion de lfquidos hacia los compartimientos intersticial y de espacio aereo del pulmon secundario a una permeabilidad incrementada de la barrera. Los cambios patologicos adicionales indican que los mecanismos implicados en el edema pulmonar son complejos y que el edema es solo uno de los sucesos fisiopatologicos en LPA/SDRa . Una consecuencia fisiologica es una reduccion significativa de la flexibilidad pulmonar que resulta en un trabajo respiratorio incrementado (Nuckton T. et al., N Engl J Med, 346:1281-1286, 2002), uno de los motivos de que resulte necesaria la ventilacion asistida para el apoyo de la mayona de pacientes.

Se ha sugerido que la ventilacion mecanica (VM), un pilar del tratamiento de la LPA, contribuye potencialmente y empeora la permeabilidad al ejercer estres mecanico sobre los diversos componentes del sistema respiratorio, causando lesion pulmonar asociada al ventilador (LPIVM) (Fan, E. et al., JAMA, 294:2889-2896, 2005; MacIntyre N., Chest, 128:561S+567, 2005). Un ensayo reciente ha demostrado una mejora significativa de la supervivencia de los pacientes ventilados con un volumen de ventilacion bajo (LV^t) en comparacion con volumenes de ventilacion altos (HV^t) (The Acute Respiratory Distress Syndrome N. Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome. N Engl J Med; 342:1301-1308, 2000). Aparte de la ventilacion con volumenes bajos, que presumiblemente transmite un estres mecanico mas bajo, la comprension mecamstica de la fisiopatologfa es incompleta y no existen terapias dirigidas para la LPIVM.

Se ha sugerido que la ventilacion mecanica (VM) con volumenes de ventilacion altos (HVT) resulta en la fosforilacion de la MAP quinasa p38, la activacion de MK2 y la fosforilacion de HSPB1, un proceso que provoca que la actina se disocie de HSPB1 y se polimerice, formando fibras de estres, que en ultima instancia conducen a huecos paracelulares e incrementan la permeabilidad vascular. Ademas, se ha demostrado que la inhibicion de la MAP quinasa p38 o su efecto posterior sobre MK2 evita la fosforilacion de HSPB1 y protege de la permeabilidad vascular mediante la anulacion de la formacion de fibras de estres de actina y la reorganizacion citoesqueletica, sugiriendo que la inhibicion dirigida de MK2 podna ser una potencial estrategia terapeutica para el tratamiento de la lesion pulmonar aguda (Damarla, M. et al., PLoS ONE, 4(2): E4600, 2009).

Ademas, estudios han sugerido que la fibrosis pulmonar tambien puede resultar de la LPA. La LPA puede resolverse por completo o continuar a alveolitis fibrosante acompanada de niveles bajos persistentes de oxfgeno en sangre (hipoxemia) y a una capacidad reducida del pulmon de expandirse con cada inspiracion (flexibilidad reducida del pulmon). Se ha sugerido que, aunque la etiologfa de la fibrosis pulmonar inducida por lesion es diferente de la fibrosis pulmonar idiopatica, ambas enfermedades comparten un mecanismo patologico comun, es decir, la infiltracion de fibroblastos en los espacios aereos del pulmon (Tager et al., Nat. Med. 14: 45-54, 2008; Ley, K. y Zarbock, A., Nat. Med. 14: 20-21; 2008).

3.3. Fibrosis inducida por radiacion

La fibrosis es una secuela comun tanto del tratamiento del cancer mediante radioterapia como de la irradiacion accidental. Las lesiones fibroticas secundarias a radioterapia se han descrito en muchos tejidos, incluyendo la piel (Bentzen, S. et al., Radiother. Oncol. 15: 261-214, 1989; Brocheriou, C., et al., Br. J. Radiol. supl. 19: 101-108, 1986), el pulmon (Lopez Cardozo, B. et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 11: 907-914, 1985), el corazon (Fajardo, L. y Stewart, J., Lab. Invest., 29: 244-257, 1973), y el tftgdo (Ingold, J. et al., Am. J. Roentgenol., 93: 200-208, 1965).

En el pulmon (tejido de respuesta tarofta), pueden producirse dos smdromes de toxicidad de la radiacion: la neumonitis por radiacion y la fibrosis pulmonar. La neumonitis se manifiesta 2 a 3 meses despues de completarse la radioterapia. Patologicamente, la neumonitis se caracteriza por edema intersticial, presencia de celulas inflamatorias intersticiales y alveolares, y un incremento del numero de neumocitos de tipo II (Gross, N. et al., Radiat. Res., III: 143-50, 1981; Guerry-Force, M. et al., Radiat. Res. 114: 138-53, 1988). En la neumonitis, el dano principal al tejido esta causado con toda probabilidad por la reduccion del numero de celulas parenquimatosas (Hendry, J., Radiat. Oncol. vol. 4,2: 123­ 132, 1994; Rosiello, R. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 148: 1671-1676, 1993; Travis, E. y Terry, N., Front. Radiat. Ther. Oncol., 23: 41-59, 1989).

La reaccion fibrotica se tipifica por una deposicion incrementada de colageno intersticial, el engrosamiento de las paredes vasculares y oclusiones vasculares (Vergava, J. et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2: 723-732, 1987). Los examenes histologicos de las lesiones fibroticas han revelado que el tejido fibrotico contiene celulas inflamatorias infiltrantes, fibroblastos y cantidades mayores de diversos componentes de la matriz extracelular. En los tejidos fibroticos, se ha descrito una smtesis y deposicion potenciadas de los colagenos intersticiales, fibronectina y proteoglicanos (Maasiha, P. et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 20: 973-980, 1991), y ello se ha interpretado como el resultado de la modulacion inducida por la radiacion del sistema de celulas fibroblasticas (Remy, J. et al., Radiat. Res. 125: 14-19, 1991).

La fibrosis inducida por radiacion, especialmente del pulmon, se ha sugerido que se debe a una interaccion de sucesos celulares y moleculares entre varios sistemas celulares comprometidos en una reaccion fibrotica. La irradiacion por sf sola es capaz de inducir un proceso de diferenciacion terminal prematura del sistema de fibroblastos/celulas fibrocfticas, resultando en una mayor acumulacion de fibrocitos postmitoticos, los cuales se caracterizan por un incremento de varias veces en la smtesis de colagenos intersticiales. Concomitantemente, la irradiacion de los tipos celulares parenquimatosos acompanantes, tales como los macrofagos alveolares y los neumocitos de tipo II alveolares, induce la smtesis intermedia de citoquinas espedficas, como TGF-p1, que seguidamente alteran la interaccion entre celulas parenquimatosas y el sistema celular fibroblastico. TGF-p1, como una de las citoquinas principales responsables de la reaccion fibrotica, induce la proliferacion fibroblastica mediante una expansion de los tipos celulares fibroblasticos progenitores, asf como una diferenciacion terminal prematura de los fibroblastos progenitores en fibrocitos postmitoticos. Esto conduce a una acumulacion de fibrocitos postmitoticos debido a una perturbacion del equilibrio correcto de proporciones de tipos celulares, de fibroblastos progenitores y fibrocitos postmitoticos. Se ha propuesto que la respuesta tisular fisiopatologica tras la irradiacion esta causada por una interaccion alterada mediada por citoquinas y factores de crecimiento de sistemas multicelulares que resulta en una perturbacion del equilibrio correcto de proporciones de tipos celulares del sistema de fibroblastos intersticiales/celulas fibrocfticas (Rodemann, H. y Bamberg, M., Radiotherapy and Oncology, 35, 83-90, 1995).

3.4. Rechazo del trasplante

El trasplante es el acto de transferir celulas, tejidos u organos de un sitio a otro. El mal funcionamiento de un sistema organico puede corregirse con el trasplante de un organo (p.ej., rinon, tngado, corazon, pulmon o pancreas) de un donante. Sin embargo, el sistema inmunologico sigue siendo la barrera mas grande al trasplante como tratamiento medico rutinario, y el rechazo de tales organos con frecuencia corresponde a un fenotipo fibrotico en el organo injertado. El sistema inmunologico ha desarrollado mecanismos complejos y eficaces para combatir los agentes foraneos. Estos mecanismos tambien participan en el rechazo del organo trasplantado, que es reconocido como foraneo por el sistema inmunologico del huesped.

El grado de respuesta inmunologica a un injerto depende en parte del grado de disparidad genetica entre organo injertado y huesped. Los xenoinjertos, que son injertos entre miembros de diferentes especies, presentan la maxima disparidad e inducen la maxima respuesta inmunologica, experimentando un rapido rechazo. Los autoinjertos, que son injertos de una parte del cuerpo en otra (p.ej., injertos de piel), no son tejido foraneo y, por lo tanto, no inducen rechazo. Los isoinjertos, que son injertos entre individuos geneticamente identicos (p.ej., gemelos monocigoticos) tambien experimentan rechazo.

Los aloinjertos son injertos entre miembros de la misma especie que difieren geneticamente. Esta es la forma mas comun de trasplante. El grado en que los aloinjertos experimentan rechazo depende en parte del grado de similitud o histocompatibilidad entre donante y huesped.

El grado y tipo de respuesta tambien vana con el tipo de trasplante. Algunos sitios, tales como el ojo y el cerebro, son inmunologicamente privilegiados (es dedr, presentan una cantidad minima o nula de celulas del sistema inmunologico y pueden tolerar incluso injertos desiguales). Los injertos de piel inicialmente no estan vascularizados y por lo tanto no manifiestan rechazo hasta que se desarrolla el riego sangumeo. Los pulmones, corazon, rinones e fugado son organos altamente vascularizados y con frecuencia conducen a una vigorosa respuesta mediada por celulas en el huesped, que requiere terapias inmunosupresoras.

La bronquiolitis constrictiva (BC), tambien denominada en pacientes de trasplante de pulmon, bronquiolitis obliterante, es inflamacion y fibrosis que se produce predominantemente en las paredes y tejidos contiguos de bronquiolos membranosos y respiratorios, con un estrechamiento resultante de sus luces. La Be se observa en una diversidad de contextos, con frecuencia como una complicacion del trasplante de pulmon y de corazon-pulmon (que afecta a 34% a 39% de los pacientes, habitualmente en los primeros 2 anos del trasplante) y del trasplante de medula osea, aunque tambien en la artritis reumatoide, tras la inhalacion de agentes toxicos tales como el dioxido de nitrogeno, tras la ingestion de determinados farmacos, tales como la penicilamina y la ingestion de la verdura del este asiatico Sauropus androgynous, y como una complicacion rara de las infecciones por adenovirus, influenza de tipo A, sarampion y por Mycoplasma pneumoniae en ninos. En trasplantes de pulmon, la BC es el principal factor que conduce a muerte. En un estudio, la tasa global de mortalidad era del 25%. Sin embargo, simultaneamente, el 87% de los pacientes que eran asintomaticos y diagnosticados unicamente mediante biopsia transbronquial experimentaron resolucion o estabilizacion de la enfermedad. Las reducciones de VEF¹ respecto a la lmea base pueden utilizarse para apoyar clmicamente la BC en pacientes de trasplante; la expresion "smdrome de bronquiolitis obliterante" se utiliza para referirse a esta disfuncion clmica y se ha establecido un sistema de gradacion para el mismo que actualmente se utiliza ampliamente en la literatura. Entre los factores de riesgo significativos de desarrollo de BC en los trasplantes de pulmon se incluyen mecanismos dependientes e independientes de aloantfgenos. En el primer grupo se encuentran el rechazo agudo tardfo y las incompatibilidades de h La en los loci A; en el ultimo se encuentran las lesiones por isquemia/reperfusion de las vfas respiratorias que resultan de la cirugfa de trasplante y la infeccion por citomegalovirus (Schlesinger C. et al, Curr Opin Pulm. Med., 4(5): 288-93, 1998).

Mecanismos de rechazo

La respuesta inmunologica a un organo trasplantado consiste en mecanismos tanto celulares (mediados por linfocitos) como humorales (mediados por anticuerpos). Aunque tambien participan otros tipos celulares, las celulas T son cruciales en el rechazo de los injertos. La reaccion de rechazo consiste en una etapa de sensibilizacion y una etapa efectora.

Etapa de sensibilizacion

En esta etapa, las celulas T CD4 y CD8, mediante sus receptores de celula T, reconocen los aloantfgenos expresados sobre las celulas del injerto foraneo. Se requieren dos senales para el reconocimiento de un antfgeno: el primero lo proporciona la interaccion entre el receptor de celulas T y el antfgeno presentado por las moleculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH); el segundo, una interaccion coestimuladora de receptor/ligando sobre la superficie de las celulas T/celulas presentadoras de antfgeno (CPA). De las numerosas rutas coestimuladoras, las mas estudiadas son la interaccion de CD28 sobre la superficie de las celulas T con sus ligandos de superficie de CPA, B7-1 o B7-2 (conocidos comunmente como CD80 y CD86, respectivamente) (Clarkson, M. y Sayegh, M., Transplantation; 80(5): 555-563, 2005). Ademas, el antfgeno-4 asociado a linfocito T citotoxico (CTLA4, por sus siglas en ingles) tambien se une a estos ligandos y proporciona una senal de inhibicion. Entre otras moleculas coestimuladoras se incluyen CD40 y su ligando CD40L (CD154). Tfpicamente, las helices de las moleculas del CMH forman el surco de union a peptidos y estan ocupadas por peptidos derivados de protemas celulares normales. Los mecanismos tfmicos o de tolerancia central (delecion clonal) y los mecanismos de tolerancia periferica (p.ej., anergia) garantizan que estos complejos CMH autopeptfdicos no resulten reconocidos por las celulas T, evitando de esta manera las respuestas autoinmunologicas.

Etapa efectora

Los factores dependientes e independientes de aloantfgenos contribuyen a los mecanismos efectores. Inicialmente, las "respuestas a lesiones" no inmunologicas (isquemia) inducen una respuesta inflamatoria no espedfica. Debido a ello, la presentacion de antfgenos a las celulas T se incrementa al regularse positivamente la expresion de las moleculas de adhesion, los CMH de clase II, las quimioquinas y las citoquinas. Tambien estimula el desprendimiento de moleculas de CMH solubles intactas que pueden activar la ruta indirecta de alorreconocimiento. Tras la activacion, las celulas T positivas para CD4 inician las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado (HTR) mediadas por macrofagos y proporcionan ayuda a las celulas B para la produccion de anticuerpos.

Diversas celulas T y citoquinas derivadas de celulas T, tales como IL-2 e IFN-y, se encuentran reguladas positivamente poco despues del trasplante. Posteriormente, las quimioquinas p como RANTES (quimioquina de regulacion por activacion expresada y secretada por linfocitos T normales), IP-10 y MCP-1, se expresan, y ello estimula una intensa infiltracion de macrofagos en el aloinjerto. IL-6, TNF-a, oxido mtrico sintasa (NOS, por sus siglas en ingles) inducible y factores de crecimiento, tambien desempenan un papel en este proceso. Los factores de crecimiento, incluyendo TGF-p y endotelina, causan la proliferacion del musculo liso, el engrosamiento intimal, la fibrosis intersticial y, en el caso del rinon, glomeruloesclerosis.

Las celulas endoteliales activadas por citoquinas derivadas de celulas T y los macrofagos expresan moleculas de adhesion al CMH de clase II, y moleculas coestimuladoras. Estas pueden presentar antigenos y de esta manera atraer mas celulas T, amplificando el proceso de rechazo. Las celulas T positivas para CD8 median en las reacciones de citotoxicidad mediadas por celulas, mediante la administracion de un "golpe letal" o, alternativamente, mediante la induccion de apoptosis.

Ademas, nuevos estudios sugieren la implicacion de procesos fibroticos en el rechazo cronico del trasplante de un organo trasplantado. Por ejemplo, se ha demostrado que el rechazo cronico del aloinjerto pulmonar esta mediado por una deficiencia relativa de HIF-1a derivado de celulas endoteliales del aloinjerto, conduciendo a un remodelado fibrotico del organo trasplantado (Wilkes, D., J Clin Invest., 121(6): 2155-2157, 2011; Jiang, X. et al., J Clin Invest., 121(6): 2336-2349, 2011).

3.5. Enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC)

La enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) es una descripcion colectiva de enfermedades pulmonares representadas por una disfuncion cronica y relativamente irreversible del flujo de aire espiratorio debido a alguna combinacion de bronquitis cronica obstructiva, enfisema y/o asma cronica. La EPOC esta causada por un abanico de factores de riesgo ambientales y geneticos, incluyendo el tabaquismo, que contribuyen a la enfermedad.

La prevalencia de EPOC esta creciendo en todo el mundo y la EPOC se ha convertido en la cuarta causa principal de muerte en los Estados Unidos. En los Estados Unidos, a pesar de la reduccion del tabaquismo de cigarrillos en las ultimas decadas, tanto la prevalencia como la mortalidad asociadas a EPOC se han incrementado y se prove que continuen incrementandose todavfa durante algunos anos. Ademas, la EPOC resulta costosa y las exacerbaciones agudas, que se producen aproximadamente una vez al ano en pacientes con EPOC de severidad moderada o de grado mayor, constituyen el componente mas costoso.

En la EPOC, la obstruccion de las vfas respiratorias puede producirse basada en dos procesos fisiopatologicos muy diferentes en el pulmon: 1) inflamacion del parenquima que resulta en proteolisis del parenquima pulmonar y perdida de elasticidad pulmonar (enfisema), y 2) inflamacion, cicatrizacion y estrechamiento de las vfas respiratorias pequenas ("enfermedad de las vfas respiratorias pequenas"). En un paciente individual, uno de estos procesos, que puede estar controlado por diferentes factores geneticos, puede predominar, aunque habitualmente ambos coexisten. En ultima instancia, ambos procesos producen patrones similares de deterioro funcional: flujo espiratorio reducido, hiperinflado y anormalidades en el intercambio de gases.

En un estadio temprano de la EPOC, se observan los smtomas siguientes en los pulmones de los pacientes de EPOC: 1) ruptura del epitelio de las vfas respiratorias por aerosoles daninos, 2) acumulacion de exudados mucosos inflamatorios, 3) infiltracion de la pared de las vfas respiratorias por celulas inmunologicas inflamatorias, 4) remodelado/engrosamiento de las vfas respiratorias de la pared de las mismas e intromision en el espacio luminal, y 5) resistencia incrementada al flujo de aire. Durante este estadio temprano, la contraccion del musculo liso y la hiperrespuesta tambien incrementan la resistencia, pero la mayor resistencia se alivia con broncodilatadores.

En un estadio avanzado, los pacientes de EPOC desarrollan tfpicamente depositos de tejido conectivo fibroso en los compartimientos subepitelial y aventicial circundantes a las paredes de las vfas respiratorias. Tal fibrosis peribronquiolar contribuye a una obstruccion fija de las vfas respiratorias mediante restriccion del agrandamiento del calibre de las vfas respiratorias que se produce durante el inflado de los pulmones.

3.5.1. Bronquitis cronica

La bronquitis cronica se define como la presencia cronica de tos y produccion de esputo durante por lo menos tres meses en dos anos consecutivos en ausencia de otras enfermedades que se reconoce que causan produccion de esputo. En la bronquitis cronica, epidemiologicamente el epitelio bronquial se inflama cronicamente con hipertrofia de las glandulas mucosas y un numero incrementado de celulas caliciformes. Los cilios tambien resultan destruidos y se deteriora mucho la eficiencia del escalador mucociliar. Se incrementa la viscosidad del moco y la produccion de moco, llevando a una dificultad para expectorar. La agregacion del moco conduce a una mayor susceptibilidad a infecciones.

Microscopicamente se observa infiltracion de las paredes de las vfas respiratorias por celulas inflamatorias. Tras la inflamacion sigue cicatrizacion y remodelado que engrosa las paredes y tambien resulta en un estrechamiento de las vfas respiratorias. A medida que progresa la bronquitis cronica, se produce metaplasia escamosa (un cambio anormal del tejido que reviste el interior de las vfas respiratorias) y fibrosis (engrosamiento y cicatrizacion adicionales de las paredes de las vfas respiratorias). La consecuencia de estos cambios es la limitacion al flujo de aire. Las infecciones e inflamacion repetidas durante el tiempo conducen a un dano estructural irreversible en las paredes de las vfas respiratorias y a cicatrizacion, con estrechamiento y distorsion de las vfas respiratorias perifericas, mas pequenas.

3.5.2. Enfisema

El enfisema se define en terminos de sus caractensticas patologicas, caracterizado por una dilatacion anormal de los espacios aereos terminales, distales respecto a los bronquiolos terminales, con destruccion de su pared y perdida de la elasticidad pulmonar. Pueden desarrollarse bullas (ampollas de mas de 1 cm de anchura) como resultado de la distension excesiva si las zonas de enfisema presentan un diametro superior a 1 cm. La distribucion de los espacios aereos anormales permite la clasificacion de dos patrones principales de enfisema: enfisema panacinar (panlobular), que resulta en distension y destruccion de todo el acino, en particular en la mitad inferior de los pulmones. El enfisema centriacinar (centrilobular) implica dano en torno a los bronquiolos respiratorios, afectando a los lobulos superiores y partes superiores de los lobulos inferiores del pulmon. Es conocido que determinadas formas de enfisema ademas se presentan asociadas a fibrosis.

El proceso destructivo del enfisema se asocia predominantemente al tabaquismo de cigarrillos. El humo de cigarrillo es un irritante y resulta en inflamacion de grado bajo de las vfas respiratorias y alveolos. Es conocido que los cigarrillos contienen mas de 4.000 compuestos qmmicos toxicos, que afectan al equilibrio entre las antiproteasas y proteasas dentro de los pulmones, causando danos permanentes. Las celulas inflamatorias (macrofagos y neutrofilos) producen un enzima proteolftico conocido como elastasa, que destruye la elastina, un componente importante del tejido pulmonar.

Los alveolos o sacos aereos del pulmon contienen tejido elastico, que apoya y mantiene la potencia de las vfas respiratorias intrapulmonares. La destruccion de las paredes alveolares permite el estrechamiento de las vfas respiratorias pequenas aflojan las cuerdas tensoras que ayudan a mantener abiertas las vfas respiratorias. Durante la inspiracion normal, el diafragma se mueve hacia abajo, mientras que la caja toracica se mueve hacia afuera y se aspira aire hacia el interior de los pulmones por la presion negativa que se crea. Con la espiracion, a medida que se relajan la caja toracica y el diafragma, el retroceso elastico del parenquima pulmonar empuja el aire hacia arriba y hacia afuera. Con la destruccion del parenquima pulmonar, que resulta en pulmones flaccidos y la perdida de las cuerdas tensoras alveolares, las vfas respiratorias pequenas se colapsan y se produce el atrapado de aire, conduciendo al hiperinflado de los pulmones. El hiperinflado aplana el diafragma, resultando en una contraccion menos eficaz y reduciendo la eficiencia alveolar, que a su vez conduce a mas atrapado de aire. Con el tiempo, el mecanismo descrito conduce a una obstruccion severa del flujo de aire, resultando en una espiracion insuficiente para permitir que los pulmones se desinflen por completo antes de la siguiente inspiracion.

3.5.3. Asma cronico

El asma se define como una condicion inflamatoria cronica de las vfas respiratorias que conduce a una obstruccion generalizada y variable de las vfas respiratorias que es reversible espontaneamente o con el tratamiento. En algunos pacientes con asma cronico, la enfermedad progresa, conduciendo a una obstruccion irreversible de las vfas respiratorias, en particular si el asma se deja sin tratar, debido a que no ha sido diagnosticada o por un mal control, o en el caso de que sea particularmente severa. Los ninos con asma presentan una probabilidad de uno a diez de desarrollar asma irreversible, mientras que el riesgo para los asmaticos de aparicion en la adultez es de uno a cuatro. Algunos estudios tambien han encontrado que tanto en ninos como adultos el asma puede conducir a un deterioro irreversible de la funcion pulmonar si su asma no ha sido tratado adecuadamente, en particular con terapia de corticoesteroides.

La inflamacion de las vfas respiratorias en el asma con el tiempo puede conducir a un remodelado de las vfas respiratorias mediante el incremento del musculo liso, la alteracion del epitelio superficial, la deposicion incrementada de colageno y el engrosamiento de la membrana basal.

3.6 Otros tipos de fibrosis

Entre los demas tipos de fibrosis se incluye, aunque sin limitarse a ellos, la fibrosis qrnstica del pancreas y los pulmones, la fibrosis por inyeccion, la fibrosis endomiocardica, la fibrosis mediastinal, la mielofibrosis, la fibrosis retroperitoneal y la fibrosis sistemica nefrogenica.

La fibrosis qrnstica (FQ, mucovidosis, mucovisidosis) es un trastorno recesivo autosomico hereditario. Es uno de los trastornos geneticos fatales mas comunes en los Estados Unidos, afectando a aproximadamente 30.000 personas y es mas prevalente en la poblacion caucasica, apareciendo en uno de cada 3.300 nacimientos vivos. El gen implicado en la fibrosis qrnstica, que fue identificado en 1989, codifica una protema denominada regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis qrnstica (CFTR, por sus siglas en ingles) La CFTR normalmente se expresa mediante los epitelios exocrinos en todo el cuerpo y regula el movimiento de los iones cloro, iones bicarbonato y glutation hacia el interior y exterior de las celulas. En los pacientes de fibrosis qrnstica, las mutaciones en el gen de CFTR conducen a alteraciones o la perdida total de la funcion de la protema CFTR, resultando en efectos en la osmolaridad, pH y propiedades redox de las secreciones exocrinas. En los pulmones, la FQ se manifiesta por la presencia de una secrecion mucosa espesa que obstruye las vfas respiratorias. En otros organos exocrinos, tales como las glandulas sudonparas, la FQ puede no manifestarse por un fenotipo obstructivo, sino en una composicion salina anormal de las secreciones (de aqrn el ensayo clmico de osmolaridad del sudor para detectar los pacientes de FQ). La causa predominante de enfermedad y muerte en pacientes de fibrosis qrnstica es la enfermedad pulmonar progresiva. El espesor del moco de la FQ, que bloquea el paso de las vfas respiratorias, se cree que nace de anormalidades en la osmolaridad de las secreciones, asf como de la presencia de cantidades masivas de ADN, actina, proteasas y enzimas prooxidativos originados en un subgrupo de celulas inflamatorias denominadas neutrofilos. En efecto, la enfermedad pulmonar de la FQ se caracteriza por reacciones inflamatorias tempranas mediadas por neutrofilos hiperactivos frente a patogenos tanto vmcos como bacterianos. El smdrome hiperinflamatorio de los pulmones de FQ presenta varias bases, de entre las cuales se informa que desempena un papel importante el desequilibrio entre las quimioquinas proinflamatorias, principalmente IL-8, y las citoquinas antiinflamatorias, principalmente IL-10. Ver Chmiel et al., Clin Rev Allergy Immunol. 3(1):5-27, 2002. Algunos estudios han informado de que los niveles de TNF-a, IL-6 e IL-1p son mas altos en el lfquido de lavado broncoalveolar de los pacientes de fibrosis qmstica que en lfquido de lavado broncoalveolar de control sano (Bondfield, T. L., et al. Am. J. Resp. Crit. Care Med. 152(1):2111-2118, 1995).

La fibrosis por inyeccion (FI) es una complicacion de la inyeccion intramuscular que con frecuencia se produce en el cuadnceps, triceps y musculos gluteos de bebes y ninos, en la que los sujetos no pueden flexionar por completo el musculo afectado. Tfpicamente es indolora, pero progresiva. Algunos estudios han informado de que la glucoprotema osteopontina (OPN) desempena un papel en el remodelado de los tejidos (Liaw L. et al., J. Clin. Invest, 101(7):1469-1478, 1998) y de que este mediador proinflamatorio induce la regulacion positiva de IL-1p en monocitos humanos, acompanada de una produccion incrementada de TNF-a e IL-6 (Naldini, A., et al. J. Immunol. 177:4267-4270, 2006; Weber, G. F., y Cantor, H. Cytokine Growth Factor Reviews. 7(3):241-248, 1996).

La enfermedad endomiocardica (smdrome hipereosinofflico (SH)) es un proceso patologico caracterizado por un recuento de eosinofilos persistentemente elevado (1.500 eosinofilos/mm3) en sangre. El SH afecta simultaneamente a muchos organos. Algunos estudios han informado de que IL-Ip, IL-6 y TNF-a se expresan a niveles elevados en pacientes de miocarditis inducida vmcamente (Satoh, M., et al. Virchows Archiv. 427(5):503-509, 1996). Entre los smtomas puede incluirse cardiomiopatfa, lesiones en la piel, enfermedad tromboembolica, enfermedad pulmonar, neuropatfa, hepatoesplenomegalia (agrandamiento concurrente de hngado y bazo) y tamano ventricular reducido. El tratamiento puede incluir la utilizacion de corticoesteroides para reducir los niveles de eosinofilos.

La fibrosis mediastinal (FM) se caracteriza por una fibrosis calcificada invasiva centrada en ganglios linfaticos que bloquea los vasos y vfas respiratorias principales. La FM es una complicacion tardfa de la histoplasmosis. Los estudios en modelos murinos de fibrosis han informado de que IL-10 y TNF-a se elevan significativamente (Ebrahimi B. et al., Am. J. Pathol. 158:2117-2125, 2001).

La mielofibrosis (metaplasia mieloide, mielofibrosis idiopatica cronica, mielofibrosis primaria) es un trastorno de la medula osea en el que la medula experimenta fibrosis. La mielofibrosis conduce a la insuficiencia progresiva de la medula osea. La supervivencia media es de cinco anos y entre las causas de muerte se incluyen la infeccion, sangrado, fallo organico, hipertension portal y transformacion leucemica. Se ha informado de que los niveles de TNF-a e IL-6 se encuentran elevados en modelos animales de mielofibrosis inducida vmcamente (Bousse-Kerdiles M. et al. Ann. Hematol. 78:434-444, 1999).

La fibrosis retroperitoneal (enfermedad de Ormond) es una enfermedad que se manifiesta en la proliferacion de tejido fibrosis en el retroperitoneo. El retroperitoneo es el compartimiento corporal que contiene los rinones, aorta, tracto renal y otras estructuras. Se ha informado de que IL-1, IL-6 y TNF-a presentan funciones clave en la patogenesis de la fibrosis retroperitoneal (Demko T. et al., J. Am. Soc. Nephrol. 8:684-688, 1997). Entre los smtomas de la fibrosis retroperitoneal pueden incluirse, aunque sin limitarse a ellos, dolor lumbar, insuficiencia renal, hipertension y trombosis venosa profunda.

La fibrosis sistemica nefrogenica (FSN, dermopatfa fibrosante nefrogenica) implica la fibrosis de la piel, articulaciones, ojos y organos internos. La FSN puede estar asociada a la exposicion al gadolinio. Los pacientes desarrollan grandes zonas de piel endurecida con nodulos fibroticos y placas. Tambien pueden producirse contracturas de flexion con limitacion acompanante del rango de movilidad. La FSN se manifiesta en una proliferacion de fibroblastos dermicos y celulas dendnticas, haces de colageno engrosados, incremento de fibras elasticas y depositos de mucina. Algunos informes sugieren que un estado proinflamatorio proporciona un factor de predisposicion a la fibrosis sistemica nefrogenica (Saxena S. et al., Int. Urol. Nephrol. 40:715-724, 2008), y que el nivel de TNF-a se encuentra incrementado en modelos animales de fibrosis sistemica nefrogenica (Steger-Hartmann, T., et al. Exper. Tox. Pathol. 61(6): 537-552, 2009).

4. Factores de riesgo

4.1. Factores de riesgo primario

4.1.1. Tabaquismo de cigarrillos

Aunque se han identificado varios factores de riesgo de enfermedades fibroticas de las vfas respiratorias (algunos de los cuales podna desempenar un papel en su causacion), el tabaquismo de cigarrillos sigue siendo la causa principal y mas importante de EPOC. Cuanto mayor es el numero de cigarrillos consumido, mayor es el riesgo de desarrollar enfermedades fibroticas de las vfas respiratorias. Una gran mayona de las personas que desarrollan enfermedades fibroticas de las vfas respiratorias son fumadores y su funcion pulmonar se reduce mas rapidamente que la de los no fumadores.

La intervencion mas eficaz es dejar de fumar, preferentemente en un estadio temprano. Los fumadores que dejan de fumar no recuperaran la funcion pulmonar perdida pero la tasa de declive puede revertirse a la de un no fumador. Dejar de fumar en un estadio temprano mejora el pronostico con independencia de cuantos intentos se necesiten para dejar de fumar. La susceptibilidad individual a desarrollar enfermedades fibroticas de las vfas respiratorias en relacion al tabaquismo de cigarrillos es variable. Aproximadamente el 15% de los fumadores desarrollaran EPOC clmicamente significativa, mientras que aproximadamente el 50% nunca desarrollara ningun smtoma. La reduccion de la funcion pulmonar es gradual y la enfermedad habitualmente se diagnostica tardfamente debido a que los pacientes pueden adaptarse a los smtomas de falta de aliento o pueden no advertir los smtomas. Los estudios han demostrado que segun el numero de cigarrillos fumados al dfa, el 24% a 47% de los fumadores desarrolla obstruccion del flujo aereo. La exposicion al tabaquismo pasivo incrementa la susceptibilidad a la enfermedad.

4.1.2. Deficiencia de antitripsina alfa-1

Esta rara condicion hereditaria resulta en la ausencia completa de uno de los sistemas de proteccion antiproteasa clave en el pulmon. Es un trastorno recesivo que afecta a 1:4.000 de la poblacion. Los pacientes con deficiencia de antitripsina alfa-1 estan en riesgo de desarrollar enfisema a una edad temprana (entre los 20 y 40 anos de edad) y con frecuencia presentan un fuerte historial familiar de la enfermedad. Los pacientes con la deficiencia y enfisema heredan un gen anormal de cada progenitor; es decir, los progenitores son portadores del gen. Tales progenitores presentaran niveles la mitad de los normales de antripsina en sangre, lo que puede resultar suficiente para protegerles de desarrollar enfisema. De manera similar, todos los hijos de un paciente deficiente en antitripsina alfa-1 portaran un gen anormal pero no resultaran afectados. Las dos formas habituales de deficiencia de antitripsina alfa-1 resultan de mutaciones puntuales en el gen que codifica para la antitripsina alfa-1.

4.2. Factores de riesgo asociados

4.2.1. Contaminacion ambiental

Existe evidencia fuerte de que las enfermedades fibroticas de las vfas respiratorias pueden resultar agravadas por la contaminacion atmosferica, aunque el papel de la contaminacion en la etiologfa de las enfermedades fibroticas de las vfas respiratorias es pequeno en comparacion con el del tabaquismo de cigarrillos. La contaminacion atmosferica por material particulado pesado, carbono y dioxido de azufre, los cuales son producidos por la quema de carbon y combustibles fosiles derivados del petroleo, son causas importantes o cofactores en el desarrollo de las enfermedades fibroticas de las vfas respiratorias. Estos se originan principalmente de emisiones de escape de los vehroulos y son responsables los contaminantes fotoqmmicos, tales como el ozono, en particular. La contaminacion del aire en lugares cerrados por la quema de combustible de biomasa para cocinar y calentar en hogares mal ventilados podna ser un importante factor de riesgo de enfermedades fibroticas de las vfas respiratorias, tales como EPOC, en los pafses en desarrollo, en particular para mujeres.

4.2.2. Factores ocupacionales

Algunas ocupaciones en las que los trabajadores se exponen a carbon, sflice y cationes, tales como mineros, trabajadores textiles y trabajadores del cemento, estan asociadas a un riesgo incrementado de enfermedades fibroticas de las vfas respiratorias. La exposicion a cadmio, un metal pesado, y humos de soldadura se ha identificado como una causa de enfisema desde los anos 1950.

Muchas ocupaciones polvorientas son mas peligrosas que la exposicion a gases o humos y estan asociadas al desarrollo de bronquitis cronica y diversas formas de enfermedad obstructiva de las vfas respiratorias. Es bien conocido que los soldadores y calafateadores de astillero presentan un riesgo incrementado de desarrollar enfermedades fibroticas de las vfas respiratorias, asf como los trabajadores de las industrias de la construccion que estan expuestos al polvo de cemento.

4.2.3. Infecciones respiratorias en la infancia

Las infecciones toracicas en el primer ano de vida, tales como la neumorna y la bronquiolitis, pueden predisponer al desarrollo de EPOC posteriormente en la vida. Ello puede ser como resultado o desarrollo incompleto del sistema respiratorio al nacer hasta que finaliza el crecimiento pulmonar en la adultez temprana. Si los pulmones en desarrollo resultan danados, no se alcanzara la funcion pulmonar potencial maxima, produciendo smtomas de EPOC en una edad temprana.

4.3. Otros factores de riesgo

Entre otros factores de riesgo que pueden desempenar un papel en la causacion y/o servir como smtomas tempranos de enfermedades fibroticas de las vfas respiratorias, tales como las fibrosis pulmonares, se incluyen la neumonitis por hipersensibilidad (con frecuencia resultante de inhalar polvo contaminado con productos bacterianos, fungicos o animales), algunas enfermedades tipicas del tejido conectivo (tales como la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistemico (LES) y el escleroderma), otras enfermedades que implican el tejido conectivo (tales como la sarcoidosis y la granulomatosis de Wegener), infecciones, determinadas medicaciones (p.ej., amiodarona, bleomicina, busulfan, metotrexato y nitrofurantoma) y la terapia de radiacion en el torax.

5. Enfoques terapeuticos actuales y emergentes para el tratamiento de enfermedades o condiciones fibroticas

Los agentes terapeuticos actualmente utilizados para tratar las enfermedades fibroticas se dan a conocer en Datta et al., British Journal of Pharmacology, 163: 141-172, 2011; incorporada como referencia en la presente memoria). Entre los ejemplos no limitativos de tales agentes terapeuticos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, colagenos de tipo V bovinos purificados (p.ej., IW-001; ImmuneWorks; United Therapeutics), antagonistas de receptores de IL-13 (p.ej., QAX576; Novartis), inhibidores de protema tirosina quinasa (p.ej., imatinib (Gleevec®); Craig Daniels/Novartis), antagonistas de receptores endoteliales (p.ej., ACT-064992 (macitentan); Actelion), antagonistas de receptores duales de endotelina (p.ej., bosentan (Tracleer®); Actelion), analogos de prostaciclina (iloprost inhalado (p.ej., Ventavis®); Actelion), anticuerpos monoclonales anti-CTGF (p.ej., FG-3019), antagonistas de receptores de endotelina (A-selectivo) (p.ej., ambrisentan (Letairis®), Gilead), AB0024 (Arresto), anticuerpos monoclonales de protema 2 similar a lisil oxidasa (LOXL2) (p.ej., GS-6624 (anteriormente AB0024); Gilead), inhibidores de quinasa N-terminal de c-Jun (JNK) (p.ej., CC-930; Celgene), Pirfenidona (p.ej., Esbriet® (InterMune), Pirespa® (Shionogi)), IFN-Y1b (p.ej., Actimmune®; InterMune), anticuerpos humanos IgG4 pan-neutralizadores contra las tres isoformas de TGF-p (p.ej., GC1008; Genzyme), inhibidores de activacion de TGF-p (p.ej., Stromedix (STX-100)) protema Pentraxin-2 humana recombinante (rhPTX-2) (p.ej., PRM151; Promedior), anticuerpos biespedficos de IL4/lL13 (p.ej., SAR156597; Sanofi), anticuerpos monoclonales humanizados con diana en la integrina avp6 (BIBF 1120; Boehringer Ingelheim), N-acetilcistema (Zambon SpA), Sildenafilo (Viagra®; ), antagonistas de TNF (p.ej., etanercept (Enbrel®); Pfizer), glucocorticoides (p.ej., prednisona, budesonida, furoato de mometasona, propionato de fluticasona y furoato de fluticasona), broncodilatadores (p.ej., modificadores de leucotrieno (p.ej., Montelukast (SINGUAIR®)), broncodilatadores anticolinergicos (p.ej., bromuro de ipratropio y yiotropio), agonistas de p2 de accion corta (p.ej., mesilato de isoetarina (Bronkometer®), adrenalina, salbutanol/albuterol y terbutalina), agonistas p2 de accion prolongada (p.ej., salmeterol, formoterol, indecaterol (Onbrez®) y broncodilatadores de combinacion, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, SYMBICORT® (que contiene tanto budesonido como formoterol), corticosteroides (p.ej., ^{prednisona, budesonida, furoato de mometasona), xantina metilada y sus derivados (p.ej., cafema, aminofilina,} iBmX, paraxantina, pentoxifilina, teobromina y teofilina), inhibidores de elastasa de neutrofilo (p.ej., ONO-5046, MR-889, L-694,458, CE-1037, GW-311616 y TEI-8362, e inhibidores de estado de transicion, tales como ONO-6818, AE-3763, FK-706, ICI-200,880, ZD-0892 y ZD-8321), inhibidores de fosfodiesterasa (p.ej., roflumilast (DAXAS®; Daliresp®) y cilomilast (Ariflo®, SB-207499)).

5.1. Quinasas y fosforilacion

Las quinasas son un grupo ubicuo de enzimas que catalizan la reaccion de transferencia de fosforilos a partir de un donante de fosfatos (habitualmente adenosm-5’-trifosfato (ATP)) a un sustrato receptor. Aunque todas las quinasas catalizan esencialmente la misma reaccion de transferencia de fosforilos, muestran una diversidad notable en su especificidad de sustrato, estructura y las rutas en las que participan. Una reciente clasificacion de todas las secuencias de quinasa disponibles (aproximadamente 60.000 secuencias) indica que las quinasas pueden agruparse en 25 familias de protemas homologas (es decir, derivadas de un ancestro comun). Estas familias de quinasa se ensamblan en 12 grupos de plegamiento basados en la similitud del plegamiento estructural. Ademas, 22 de las 25 familias (aproximadamente 98,8% de todas las secuencias) pertenecen a 10 grupos de plegamiento del que se conoce el plegamiento estructural. De las otras 3 familias, la polifosfato quinasa forma un grupo de plegamiento diferente, y las 2 familias restantes son ambas quinasas de membrana integrales y comprenden el grupo de plegamiento final. Estos grupos de plegamiento no solo incluyen algunos de los plegamientos de protemas mas ampliamente distribuidos, tales como el plegamiento de tipo Rossmann (tres o mas cadenas p paralelas unidas mediante dos helices a en el orden topologico p-a-p-a-p), plegamiento de tipo ferredoxina (un plegamiento de protema a+p habitual con una estructura secundaria caractenstica pappap a lo largo de su esqueleto), plegamiento de tipo barril TIM (referido a un plegamiento de protema conservado que consiste en ocho helices a y ocho cadenas p paralelas que alternan a lo largo del esqueleto peptfdico) y plegamiento de barril p antiparalelo (un barril beta es una hoja beta grande que se retuerce y enrolla para formar una estructura cerrada en la que la primera cadena esta unida mediante hidrogenos hasta el final), sino tambien todas las clases principales (todo a, todo p, a+p, a/p) de estructuras de protema. Dentro de un grupo de plegamiento, el nucleo del dominio de union a nucleotidos de cada familia presenta la misma arquitectura y la topologfa del nucleo de la protema es identica o relacionada por permutacion circular. La homologfa entre las familias dentro de un grupo de plegamiento no esta implfcita.

Las quinasas de grupo I (23.124 secuencias) incorporan la protema S/T-Y quinasa, la protema quinasa atfpica, la lfpido quinasa y los enzimas ATP-grasp y comprenden ademas la protema S/T-Y quinasa, y la familia de protema quinasas atfpicas (22.074 secuencias). Entre estas quinasas se incluyen: colina quinasa (EC 2.7.1.32); protema quinasa (EC 2.7.137); fosforilasa quinasa (EC 2.7.1.38); homoserina quinasa (EC 2.7.1.39); I-fosfatidilinositol 4-quinasa (EC 2.7.1.67); estreptomicina 6-quinasa (EC 2.7.1.72); etanolamina quinasa (EC 2.7.1.82); estreptomicina 3'-quinasa (EC 2.7.1.87); canamicina quinasa (EC 2.7.1.95); 5-metiltioribosa quinasa (EC 2.7.1.100); viomicina quinasa (EC 2.7.1.103); [hidroximetilglutaril-CoA reductasa (NADPH2)] quinasa (EC 2.7.1.109); protema-tirosina quinasa (EC 2.7.1.112); [isocitrato deshidrogenasa (NADP+)] quinasa (EC 2.7.1.116); [cadena ligera de miosina] quinasa (EC 2.7.1.117); higromicina-B quinasa (EC 2.7.1.119); protema quinasa dependiente de calcio/calmodulina (EC 2.7.1.123); rodopsina quinasa (EC 2.7.1.125); [receptor beta-adrenergico] quinasa (EC 2.7.1.126); [cadena pesada de miosina] ^quinasa (eC ^{2.7.1.129); [protema Tau] quinasa (EC 2.7.1.135); macrolido 2'-quinasa (EC 2.7.1.136); I-fosfatidilinositol} 3-quinasa (EC 2.7.1.137); subunidad-[ARN-polimerasa] quinasa (EC 2.7.1.141); fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-quinasa (EC 2.7.1.153) y fosfatidilinositol-4-fosfato 3-quinasa (EC 2.7.1.154). El grupo I comprende ademas la familia de lfpido quinasas (321 secuencias). Entre estas quinasas se incluyen: I-fosfatidilinositol-4-fosfato 5-quinasa (EC 2.7.1.68); I D-mio-inositol-trifosfato 3-quinasa (EC 2.7.1.127); inositol-tetracisfosfato 5-quinasa (EC 2.7.1.140); I-fosfatidilinositol-5-fosfato 4-quinasa (EC 2.7.1.149); I-fosfatidilinositol-3-fosfato 5-quinasa (EC 2.7.1.150); inositolpolifosfato multiquinasa (EC 2.7.1.151) e inositol-hexacisfosfato quinasa (EC 2.7.4.21). El grupo I comprende ademas las quinasa ATP-grasp (729 secuencias) que incluye inositol-tetracisfosfato I-quinasa (EC 2.7.1.134), piruvato; fosfato diquinasa (EC 2.7.9.1) y piruvato, agua diquinasa (EC 2.7.9.2).

Las quinasas de grupo II (17.071 secuencias) incorporan las quinasas de tipo Rossman. El grupo II comprende la familia de la quinasa bucle-P (7.732 secuencias). Entre ellas se incluyen gluconoquinasa (EC 2.7.1.12); fosforibuloquinasa (EC 2.7.1.19); timidina quinasa (EC 2.7.1.21); ribosilnicotinamida quinasa (EC 2.7.1.22); defosfo-CoA quinasa (EC 2.7.1.24); adenililsulfato quinasa (EC 2.7.1.25); pantotenato quinasa (EC 2.7.1.33); protema quinasa (bacteriana) (EC 2.7.1.37); uridina quinasa (EC 2.7.1.48); shikimato quinasa (EC 2.7.1.71); desoxicitidina quinasa (EC 2.7.1.74); desoxiadenosina quinasa (EC 2.7.1.76); polinucleotido 5'-hidroxil-quinasa (EC 2.7.1.78); 6-fosfofructo-2-quinasa (EC 2.7.1.105); desoxiguanosina quinasa (EC 2.7.1.113); tetraacildisacarido 4'-quinasa (EC 2.7.1.130); desoxinucleosido quinasa (EC 2.7.1.145); adenosilcobinamida quinasa (EC 2.7.1.156); polifosfato quinasa (EC 2.7.4.1); fosfomevalonato quinasa (EC 2.7.4.2); adenilato quinasa (EC 2.7.4.3); nucleosido-fosfato quinasa (EC 2.7.4.4); guanilato quinasa (EC 2.7.4.8); timidilato quinasa (EC 2.7.4.9); nucleosido-trifosfato-adenilato quinasa (EC 2.7.4.10); (desoxi)nucleosido-fosfato quinasa (EC 2.7.4.13); citidilato quinasa (EC 2.7.4.14) y uridilato quinasa (EC 2.7.4.22). El grupo II comprende ademas la familia de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (815 secuencias). Entre estos enzimas se incluyen protema quinasa (HPr quinasa/fosfatasa) (EC 2.7.1.37); fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (GTP) (EC 4.1.1.32) y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (ATP) (EC 4.1.1.49). El grupo II comprende ademas la familia de la fosfoglicerato quinasa (1.351 secuencias). Entre estos enzimas se incluye la fosfoglicerato quinasa (EC 2.7.2.3) y la fosfoglicerato quinasa (GTP) (EC 2.7.2.10). El grupo II comprende ademas la familia de la aspartoquinasa (2.171 secuencias). Entre estos enzimas se incluye carbamato quinasa (EC 2.7.2.2), aspartato quinasa (EC 2.7.2.4), acetilglutamato quinasa (EC 2.7.2.8.1), glutamato 5-quinasa (EC 2.7.2.1) y uridilato quinasa (EC 2.7.4). El grupo Ii comprende ademas la familia de las quinasas de tipo fosfofructoquinasa (1.998 secuencias). Entre estos enzimas se ^{incluyen 6-fosfofructoquinasa (EC 2.7.1.1 1);} NaD ^{(+) quinasa (EC 2.7.1.23); I-fosfofructoquinasa (EC 2.7.1.56);} difosfato-fructosa-6-fosfato I-fosfotransferasa (EC 2.7.1.90); esfinganina quinasa (EC 2.7.1.91); diacilglicerol quinasa (EC 2.7.1.107) y ceramida quinasa (EC 2.7.1.138). El grupo II comprende ademas la familia de las quinasas de tipo ^{riboquinasa (2.722 secuencias). Entre estos enzimas se incluye glucoquinasa (EC 2.7.1.2), quetohexoquinasa} (Ec 2.7.1.3), fructoquinasa (EC 2.7.1.4), 6-fosfofructoquinasa (EC 2.7.1. 11); riboquinasa (EC 2.7.1.15); adenosina quinasa (EC 2.7.1.20); piridoxal quinasa (EC 2.7.1.35); 2-dehidro-3-desoxigluconoquinasa (EC 2.7.1.45); hidroximetilpirimidina quinasa (EC 2.7.1.49); hidroxietiltiazol quinasa (EC 2.7.1.50); I-fosfofructoquinasa (EC 2.7.1.56); inosina quinasa (EC 2.7.1.73); 5-dehidro-2-desoxigluconoquinasa (EC 2.7.1.92); tagatosa-6-fosfato quinasa (EC 2.7.1.144); ^{fosfofructoquinasa dependiente de} aDp ^{(EC 2.7.1.146); glucoquinasa dependiente de ADP (EC 2.7.1.147) y} fosfometilpirimidina quinasa (EC 2.7.4.7). El grupo II comprende ademas la familia de la tiamina pirofosfoquinasa (175 secuencias), que incluye la tiamina pirofosfoquinasa (EC 2.7.6.2). El grupo II comprende ademas la familia de la glicerato quinasa (107 secuencias), que incluye la glicerato quinasa (EC 2.7.1.31).

Las quinasas del grupo III (10.973 secuencias) comprenden las quinasas de plegamiento de tipo ferredoxina. El grupo II comprende ademas la familia de las quinasas de tipo fosfofructoquinasa (923 secuencias). Entre estos enzimas se incluye la nucleosido-difosfato quinasa (EC 2.7.4.6). El grupo III comprende ademas la familia de la HPPK quinasa (609 secuencias). Entre estos enzimas se incluye la 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetildihidropteridina pirofosfoquinasa (EC 2.7.6.3). El grupo III comprende ademas la familia de la guanido quinasa (324 secuencias). Entre estos enzimas se incluye la guanidoacetato quinasa (EC 2.7.3.1), la creatina quinasa (EC 2.7.3.2), arginina quinasa (EC 2.7.3.3) y lombricina quinasa (EC 2.7.3.5). El grupo III comprende ademas la familia de la histidina quinasa (9.117 secuencias). Entre estos enzimas se incluye la protema quinasa (histidina quinasa) (EC 2.7.1.37) [piruvato deshidrogenasa (lipoamida)] quinasa (EC 2.7.1.99) y la [3-metil-2-oxibutanoato deshidrogenasa (lipoamida)] quinasa (EC 2.7.1.115).

Las quinasas de grupo IV (2.768 secuencias) incorporan las quinasas de tipo ribonucleasa H. Entre estos enzimas se incluye hexoquinasa (EC 2.7.1.1); glucoquinasa (EC 2.7.1.2); fructoquinasa (EC 2.7.1.4); ramnuloquinasa (EC 2.7.1.5); manoquinasa (EC 2.7.1.7); gluconoquinasa (EC 2.7.1.12); L-ribuloquinasa (EC 2.7.1.16); xiluloquinasa (EC 2.7.1.17); eritritol quinasa (EC 2.7.1.27); glicerol quinasa (EC 2.7.1.30); pantotenato quinasa (EC 2.7.1.33); D-ribuloquinasa (EC ^{2.7.1.47); L-fucoloquinasa} (Ec ^{2.7.1.51); L-xiluloquinasa (EC 2.7.1.53); alosa quinasa (EC 2.7.1.55); 2-deshidro-3-}desoxigalactonoquinasa (EC 2.7.1.58); N-acetilglucosamina quinasa (EC 2.7.1.59); N-acilmanosamina quinasa (EC 2.7.1.60); polifosfato-glucosa fosfotransferasa (EC 2.7.1.63); beta-glucosido quinasa (EC 2.7.1.85); acetato quinasa (EC 2.7.2.1); butirato quinasa (EC 2.7.2.7); acido graso de cadena ramificada quinasa (EC 2.7.2.14) y propionato quinasa (EC 2.7.2.15).

Las quinasas de grupo V (1.119 secuencias) incorporan quinasas de barril-p TIM. Entre estos enzimas se incluye la piruvato quinasa (EC 2.7.1.40).

Las quinasas de grupo VI (885 secuencias) incorporan GHMP quinasas. Entre estos enzimas se incluyen galactoquinasa (EC 2.7.1.6), mevalonato quinasa (EC 2.7.1.36), homoserina quinasa (EC 2.7.1.39), L-arabinoquinasa (EC 2.7.1.46), fucoquinasa (EC 2.7.1.52), shikimato quinasa (EC 2.7.1.71), 4-(citidina-5'-difosfo)-2-C-metil-D-eritritol quinasa (EC 2.7.1.148) y fosfomevalonato quinasa (EC 2.7.4.2).

Las quinasas de grupo VII (1.843 secuencias) incorporan quinasas de tipo AIR sintetasa. Entre estos enzimas se incluyen tiamina-fosfato quinasa (EC 2.7.4.16) y selenido, agua diquinasa (EC 2.7.9.3).

Las quinasas de grupo VIII (565 secuencias) incorporan riboflavina quinasas (565 secuencias). Entre estos enzimas se incluye riboflavina quinasa (EC 2.7.1.26).

Las quinasas de grupo IX (197 secuencias) incorporan dihidroxiacetona quinasas. Entre estos enzimas se incluye glicerol quinasa (EC 2.7.1.29).

Las quinasas del grupo X (148 secuencias) incorporan glicerato quinasas putativas. Entre estos enzimas se incluye glicerato quinasa (EC 2.7.1.31).

Las quinasas de grupo XI (446 secuencias) incorporan polifosfato quinasas. Entre estos enzimas se incluye polifosfato quinasa (EC 2.7.4.1).

Las quinasas de grupo XII (263 secuencias) incorporan quinasas integrales de membrana. El grupo XII comprende la familia de la dolicol quinasa. Entre estos enzimas se incluyen las dolicol quinasas (EC 2.7.1.108). El grupO xii comprende ademas la familia de la undecaprenol quinasa. Entre estos enzimas se incluyen las undecaprenol quinasas (EC 2.7.1.66).

Las quinasas desempenan papeles indispensables en numerosas rutas celulares metabolicas y de senalizacion y son de los enzimas mejor estudiados a nivel estructural, bioqmmico y celular. A pesar del hecho de que todas las quinasas utilizan el mismo donante de fosfatos (en la mayona de casos, ATP) y cataliza aparentemente la misma reaccion de transferencia de fosforilos, muestran una notable diversidad en sus plegamientos estructurales y mecanismos de reconocimiento de sustrato. Ello probablemente se debe en gran parte de la extraordinariamente diversa naturaleza de las estructuras y propiedades de sus sustratos.

5.1.1 Protema quinasas activadas por protema quinasa activada por mitogeno (MK2 y MK3)

Se han definido diferentes grupos de protema quinasas activadas por MAPK (MAP-KAPK) posteriores a protema quinasas activadas por mitogeno (MApk, por sus siglas en ingles). Estos enzimas transducen senales a protemas diana que no son sustratos directos de los MAPK y, por lo tanto, sirve para transmitir la senalizacion dependiente de fosforilacion con cascadas de MAPK a diversas funciones celulares. Uno de estos grupos esta formado por las tres MAPKAPK: MK2, MK3 (tambien conocida como 3pK) y MK5 (tambien denominada PRAK). La protema quinasa 2 activadas por protema quinasa activada por mitogeno (tambien denominada "MAPKAPK2", "MAPKAP-K2", o "MK2") es una quinasa de la familia de las serina/treonina (Ser/Thr) protema quinasas. MK2 es altamente homologo de MK3 (identidad de aminoacidos de aproximadamente 75%). Los dominios de quinasa de MK2 y MK3 son los mas similares (identidad de aproximadamente 35% a 40%) respecto a la protema quinasa dependiente de calcio/calmodulina (CaMK), la fosforilasa b quinasa y el dominio quinasa C-terminal (CTKD) de las isoformas de quinasa S6 ribosomica (RSK). El gen mk2 codifica dos transcritos alternativamente procesados de 370 aminoacidos (MK2A) y 400 aminoacidos (MK2B). El gen MK3 codifica un transcrito de 382 aminoacidos. Las protemas Mk2 Y mk3 son altamente homologas, aunque MK2A posee una region C-terminal mas corta. El extremo C-terminal de MK2B contiene una secuencia de localizacion nuclear (SLN) bipartita funcional (Lys-Lys-Xaa-¹⁰-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys; SEC ID n° 23) que no se encuentra presente en la isoforma m K2A, mas corta, indicando que el procesamiento alternativo determina la localizacion celular de las isoformas de MK2. MK3 posee una secuencia de localizacion nuclear similar. La secuencia de localizacion nuclear observada tanto en M2KB como en MK3 comprende un dominio D (Leu-Leu-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys; SEC ID n° 24) que se ha demostrado en estudios que media en la interaccion espedfica de MK2B y MK3 con p38a y p38p. M2KB y MK3 posee ademas una senal de exportacion nuclear (SEN) funcional situado N-terminalmente respecto al SLN y el dominio D. El SEN en MK2B resulta suficiente para inducir la exportacion nuclear tras la estimulacion, un proceso que puede ser inhibido por la leptomicina B. La secuencia N-terminal respecto al dominio catalftico en MK2 y MK3 es rico en prolinas y contiene uno (MK3) o dos (MK2) sitios de union putativos a dominio de homologfa de Src 3 (SH3), donde los estudios han demostrado, para MK2, que median en la union al dominio SH3 de c-AbI in vitro. Estudios recientes sugieren que este dominio participa en la migracion celular mediada por MK2.

MK2B y MK3 se localizan predominantemente en el nucleo de celulas quiescentes, mientras que MK2A se encuentra presente en el citoplasma. Tanto MK2B como MK3 son rapidamente exportados al citoplasma mediante un mecanismo dependiente de protema de mantenimiento de region cromosomica (CRM1) tras la estimulacion de estres. La exportacion nuclear de MK2B aparentemente esta mediada por la activacion de quinasa, ya que la mutacion fosfomimetica de Thr334 dentro del bucle de activacion de la quinasa potencia la localizacion citoplasmatica de MK2B. Sin respaldo teorico, se cree que MK2B y MK3 podnan contener un SLN constitutivamente activo y un Sen regulados por fosforilacion.

MK2 y MK3 aparentemente se expresan ubicuamente, con expresion predominante en el corazon, en musculo esqueletico y en tejidos renales.

5.1.2. Activacion

Diversos activadores de p38a y p38p estimulan potentemente la actividad de MK2 y MK3. P38 media en la fosforilacion in vitro e in vivo de MK2 en cuatro sitios dirigidos por prolina: Thr25, Thr222, Ser272 y Thr334. De estos sitios, solo Thr25 no se encuentra conservado en MK3. Sin respaldo teorico, aunque la funcion de Thr25 fosforilado es desconocida, su localizacion entre dos sitios de union a dominio SH3 sugiere que podna regular interacciones de protema-protema. Thr222 en MK2 (Thr201 en MK3) se encuentra localizado en el bucle de activacion del dominio de quinasa y se ha demostrado que resulta esencial para la actividad de las quinasas MK2 y MK3. Thr334 en MK2 (Thr313 en MK3) se encuentra situado C-terminalmente respecto al dominio catalttico y resulta esencial para la actividad de quinasa. La estructura cristalina de MK2 se ha resuelto y, sin respaldo teorico, sugiere que la fosforilacion de Thr334 podna servir de interruptor para la importacion y exportacion nuclear de MK2. La fosforilacion de Thr334 tambien puede debilitar o interrumpir la union del extremo C-terminal de MK2 al dominio catalftico, exponiendo el SEN y estimulando la exportacion nuclear.

Estudios han demostrado que, aunque p38 es capaz de activar MK2 y MK3 en el nucleo, la evidencia experimental sugiere que la activacion y exportacion nuclear de MK2 y MK3 estan acopladas mediante un interruptor conformacional dependiente de fosforilacion que tambien dicta la estabilizacion y localizacion de p38, y la localizacion celular de p38 misma esta controlada por MK2 y posiblemente MK3. Estudios adicionales han demostrado que p38 nuclear es exportado al citoplasma en un complejo con MK2 tras la fosforilacion y activacion de MK2. La interaccion entre p38 y m K2 podna resultar importante para la estabilizacion de p38, ya que estudios indican que los niveles de p38 son bajos en las celulas deficientes en m K2 y la expresion de una protema MK2 catalfticamente inactiva restaura los niveles de p38.

5.1.3. Sustratos y funciones

Estudios adicionales han demostrado que la protema de choque termico pequena HSPB1 (tambien conocida como protema de choque termico 27 o Hsp27), protema espedfica de linfocitos LSP-1 y vimentina son fosforiladas por MK2. HSPB1 resulta de interes particular debido a que forma oligomeros grandes, que pueden actuar como chaperones moleculares y proteger las celulas del choque termico y el estres oxidativo. Tras la fosforilacion, HSPB1 pierde su capacidad de formar oligomeros grandes y es incapaz de bloquear la polimerizacion de la actina, sugiriendo que la fosforilacion mediada por MK2 de HSPB1 sirve a una funcion homeostatica destinada a regular la dinamica de la actina, que de otro modo resultana desestabilizada durante el estres.

MK3 tambien ha demostrado fosforilar HSPB1 in vitro e in vivo, aunque su papel durante las condiciones de estres todavfa no ha sido aclarada. MK2 comparte muchos sustratos con MK3. Ambos enzimas presentan preferentes de sustrato comparables y fosforilan sustratos peptfdicos con constantes cineticas similares. La secuencia minima requerida para la fosforilacion eficiente por MK2 se encontro que era Hyd-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-pSer/Thr (SEC ID n° 25), en la que Hyd es un residuo hidrofobico voluminoso.

La evidencia experimental apoya un papel de p38 en la regulacion de la biosmtesis de citoquinas y la migracion celular. La delecion dirigida del gen mk2 en ratones sugiere que, aunque p38 media en la activacion de muchas quinasas similares, MK2 aparentemente es la quinasa clave responsable de estos procesos biologicos dependientes de p38. La perdida de MK2 conduce a: (i) un defecto en la smtesis de citoquinas inducida por lipopolisacarido (LPS), tal como el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a), interleuquina-6 (IL-6) e interferon gamma (IFN-y), e (ii) cambios en la migracion de los fibroblastos embrionarios de raton, celulas de musculo liso y neutrofilos.

En coherencia con su papel para MK2 en respuestas inflamatorias, los ratones deficientes en MK2 mostraron una susceptibilidad incrementada a la infeccion por Listeria monocytogenes y una muerte neuronal mediada por inflamacion reducida tras isquemia focal. Debido a que los niveles de protema p38 tambien estan reducidos significativamente en celulas deficientes en MK2, resulto necesario distinguir si estos fenotipos se debfan unicamente a la perdida de MK2. Para conseguirlo, los mutantes de MK2 se expresaron en celulas deficientes en MK2 y los resultados indican que la actividad catalftica de MK2 no era necesaria para restaurar los niveles de p38 pero resultaba necesaria para regular la biosmtesis de citoquinas.

Los estudios de desactivacion o inactivacion parcial de MK2 proporcionaron fuerte apoyo a la idea de que MK2 activado potencia la estabilidad del ARNm de IL-6 mediante fosforilacion de las protemas que interactuan con la region 3' no traducida rica en AU del ARNm de IL-6. En particular, se ha demostrado que MK2 es principalmente responsable de la fosforilacion de hnRNPAO, una protema de union a ARNm que estabiliza el ARN de IL-6. Ademas, varios estudios adicionales que investigan diversas enfermedades inflamatorias han encontrado que los niveles de citoquinas proinflamatorias, tales como IL-6, IL-1p, TNF-a e IL-8, estan incrementados en esputo inducido de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) estable o de macrofagos alveolares de fumadores de cigarrillos (Keatings V. et al, Am J Resp Crit Care Med, 1996, 153:530-534; Lim, S. et al., J Respir Crit Care Med, 2000, 162:1355­ 1360). Los niveles elevados de citoquinas proinflamatorias, tales como la interleuquina-8 (IL-6), asf como moleculas de adhesion celular (CAM) posteriores, tales como la molecula-1 de adhesion intercelular (ICAM-1) y la molecula-1 de adhesion celular vascular (VCAM-1), metaloproteinasas de matriz, tales como la metaloproteinasa-7 de matriz (MMP-7) y moleculas de senalizacion, tales como la protema A12 de union al calcio S100 (S100A12, tambien conocida como calgranulina C), en sangre periferica, se ha encontrado que estan asociados a mortalidad, supervivencia sin trasplante de pulmon y progresion de enfermedad en pacientes con fibrosis pulmonar idiopatica (Richards et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2012, 185: 67-76; Richards, T. et al., Am J Respir Crit Care Med, 181: A1120, 2010; Moodley, Y. et al., Am J Respir Cell Mol Biol., 29(4): 490-498, 2003). Juntos, estos estudios sugieren que los niveles elevados de citoquinas inflamatorias inducidas por la activacion de MK2 podnan estar implicados en la patogenesis de las enfermedades de las vfas respiratorias o del tejido pulmonar, y sugieren una potencial terapia anticitoquina para el tratamiento de enfermedades de las vfas respiratorias o del tejido pulmonar, tales como la fibrosis pulmonar idiopatica y la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) (Chung K., Eur. Respir. J. 2001, 18: supl. 34: 50-59).

5.1.4. Regulacion de la traduccion del ARNm

Los estudios anteriores con ratones de desactivacion de MK2 o celulas deficientes en MK2 han demostrado que MK2 incrementa la produccion de citoquinas inflamatorias, incluyendo TNF-a, IL-1, e IL-6, mediante el incremento de la tasa de traduccion de su ARNm. No pudieron detectarse reducciones significativas en la transcripcion, procesamiento y liberacion de TNF-a en ratones deficientes en MK2. La ruta de p38 es conocido que desempena un papel importante en la regulacion de la estabilidad de ARNm y MK2 representa una diana probable mediante la que p38 media en su funcion. Los estudios con ratones deficientes en MK2 indican que la actividad catalftica de MK2 resulta necesaria para sus efectos sobre la produccion de citoquinas y la migracion, sugiriendo que, sin respaldo teorico, MK2 fosforila las dianas que participan en la estabilidad del ARNm. En coherencia con lo anterior, se ha demostrado que MK2 se une y/o fosforila la ribonucleoprotema nuclear heterogenea (hnRNP, por sus siglas en ingles) A0, tristetraprolina, la protema de union a poli(A) PABP1 y HuR, un miembro de expresion ubicua de la familia de elav (embrionario-letal anormal visual en Drosophila melanogaster) de protemas de union a ARN. Estos sustratos es conocido que se unen o copurifican con los ARNm que contienen elementos ricos en AU en la region 3' no traducida, sugiriendo que MK2 podna regular la estabilidad de los ARNm ricos en AU, tales como TNF-a. Actualmente no se conoce si MK3 desempena funciones similares, aunque el tratamiento con LPS de fibroblastos deficientes en MK2 anula por completo la fosforilacion del hnRNP A0, sugiriendo que MK3 no es capaz de compensar la perdida de MK2.

MK3 participa con MK2 en la fosforilacion de la quinasa del factor de elongacion eucariotico 2 (eEF2). La quinasa eEF2 fosforila e inactiva eEF2. La actividad de eEF2 resulta cntica para la elongacion del ARNm durante la traduccion y la fosforilacion por eEF2 de Thr56 resulta en la terminacion de la traduccion de ARNm. La fosforilacion con MK2 y MK3 de la quinasa eEF2 de Ser377 sugiere que estos enzimas podnan molecular la actividad de la quinasa eEF2 y regulan de esta manera la elongacion de la traduccion de ARNm.

5.1.5. Regulacion transcripcional por MK2 y MK3

La MK2 nuclear, de manera similar a muchas MK, contribuye a la fosforilacion del factor de union al elemento de respuesta al AMPc (CREB, por sus siglas en ingles), del factor de respuesta en suero (SRF, por sus siglas en ingles) y el factor transcripcional e R81. La comparacion entre las celulas de tipo salvaje y las deficientes en MK2 revela que MK2 es la quinasa SRF principal inducida por estres, sugiriendo un papel para MK2 en la respuesta inmediatatemprana mediada por estres. Tanto MK2 como MK3 interaction con el factor de transcripcion helice-bucle-helice basico E47 in vivo y fosforilan E47 in vitro. La fosforilacion de E47 mediada por MK2 se ha encontrado que reprime la actividad transcripcional de E47 y, de esta manera, inhibe la expresion genica dependiente de E47, sugiriendo que MK2 y MK3 podnan regular la expresion genica espedfica de tejidos y la diferenciacion celular.

5.1.6. Otras dianas de MK2 y MK3

Tambien se han identificado varios otros sustratos de MK2 y MK3, que reflejan las diversas funciones de MK2 y MK3 en varios procesos biologicos. La protema de andamiaje 14-3-3Z es un sustrato de MK2 fisiologico. Estudios indican que 14-3-3^ interaction con varios componentes de las rutas de senalizacion celular, incluyendo las protema quinasas, las fosfatasas y los factores de transcripcion. Estudios adicionales han demostrado que la fosforilacion mediada por MK2 por 14-3-3Z de Ser58 compromete su actividad de union, sugiriendo que MK2 podna afectar a la regulacion de varias moleculas de senalizacion normalmente reguladas por 14-3-3Z.

Estudios adicionales han demostrado que MK2 tambien interactua y fosforila la subunidad p16 del complejo de siete elementos Arp2 y Arp3 (p16-Arc) en Ser77. p16-Arc presenta funciones en la regulacion del citoesqueleto de actina, sugiriendo que MK2 podna participar en este proceso.

MK2 y MK3 tambien podnan fosforilar la 5-lipooxigenasa. La 5-lipooxigenasa cataliza las etapas iniciales en la formacion de los leucotrienos mediadores inflamatorios. La tirosina hidroxilasa, la glucogeno sintasa y Akt tambien se ha demostrado que resultan fosforilados por MK2. Finalmente, la MK2 fosforila la protema supresora tumoral tuberina en Ser1210, creando un sitio de enlace para 14-3-3Z. La tuberina y hamartina normalmente forman un complejo funcional que regula negativamente el crecimiento celular mediante el antagonismo de la senalizacion dependiente de mTOR, sugiriendo que la activacion mediada por p38 de MK2 podna regular el crecimiento celular mediante el incremento de la union de 14-3-3Z a la tuberina.

5.2. Inhibicion de quinasas

Las protema quinasas eucarioticas constituyen una de las superfamilias mas grandes de protemas homologas que estan relacionadas en virtud de sus dominios cataltticos. Las protema quinasas mas relacionadas son espedficas de la fosforilacion de serina/treonina o de tirosina. Las protema quinasas desempenan un papel integral en la respuesta celular a los estfmulos extracelulares. De esta manera, la estimulacion de las protema quinasas se considera que es uno de los mecanismos de activacion mas comunes en los sistemas de transduccion de senales. Se conocen muchos sustratos que experimentan fosforilacion por multiples protema quinasas y se ha publicado una cantidad considerable de informacion sobre la secuencia primaria de los dominios cataltticos de diversas protema quinasas. Estas secuencias comparten un gran numero de residuos que participan en la union del ATP, la catalisis y el mantenimiento de la integridad estructural. La mayona de protema quinasas posee un dominio catalftico de 30-32 kDa bien conservado.

Estudios han intentado identificar y utilizar elementos reguladores de las protema quinasas. Entre estos elementos reguladores se incluyen inhibidores, anticuerpos y peptidos de bloqueo.

5.2.1. Inhibidores

Los inhibidores enzimaticos son moleculas que se unen a enzimas, reduciendo de esta manera la actividad enzimatica. La union de un inhibidor puede detener la entrada de un sustrato en el sitio activo del enzima y/o dificultar la catalisis de la reaccion por parte del enzima. La union del inhibidor es reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles habitualmente reaccionan con el enzima y lo modifican qmmicamente (p.ej., mediante la modificacion de residuos aminoacidos clave necesarios para la actividad enzimatica), de manera que ya no son capaces de catalizar su reaccion. En contraste, los inhibidores reversibles se unen no covalentemente y se producen diferentes tipos de inhibicion dependiendo de si estos inhibidores se unen al enzima, al complejo de enzima-sustrato o a ambos.

Los inhibidores enzimaticos con frecuencia se evaluan para su especificidad y potencia. El termino "especificidad" tal como se utiliza en el presente contexto se refiere a la union selectiva de un inhibidor o a su falta de union a otras protemas. El termino "potencia" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la constante de disociacion de un inhibidor, que indica la concentracion de inhibidor necesaria para inhibir un enzima.

Los inhibidores de las protema quinasas han sido estudiadas para la utilizacion como una herramienta en la regulacion de la actividad de las protema quinasas. Se han estudiado inhibidores para la utilizacion con, por ejemplo, quinasa dependiente de ciclina (Cdk), MAP quinasa, serina/treonina quinasa, protema tirosina quinasa de la familia de Src, tirosina quinasa, calmodulina (CaM) quinasa, casema quinasa, quinasa de punto de comprobacion (ChkI), glucogeno sintasa quinasa 3 (GSK-3), quinasa N-terminal de c-Jun (JNK), protema quinasa 1 activada por mitogeno (MEK), quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK), protema quinasa A, Akt (protema quinasa B), protema quinasa C, protema quinasa G, protema tirosina quinasa, Raf quinasa y Rho quinasa.

5.2.2. Peptidos de bloqueo

Un peptido es un compuesto qmmico que esta compuesto de una cadena de dos o mas aminoacidos, en donde el grupo carboxilo de un aminoacido en la cadena se une al grupo amino del otro mediante un enlace peptfdico. Los peptidos se han utilizado, entre otros, para el estudio de la estructura y funcion de las protemas. Pueden utilizarse peptidos sinteticos, entre otros, como sondas para identificar donde se producen interacciones protema-peptido. Los peptidos inhibidores pueden utilizarse, entre otros, en investigacion clmica para examinar los efectos de los peptidos sobre la inhibicion de las protema quinasas, las protemas del cancer y otros trastornos.

Se ha estudiado la utilizacion de varios peptidos de bloqueo. Por ejemplo, la quinasa regulada por senal extracelular (ERK), una protema quinasa MAPK, resulta esencial para la proliferacion y diferenciacion celular. La activacion de MAPK requiere un mecanismo de cascada en el que MAPK es fosforilado por un MAPKK cadena arriba (MEK) que despues, a su vez, es fosforilado por una tercera quinasa MAPKKK (MEKK). El peptido inhibidor ERK funciona como un senuelo de MEK mediante la union a ERK.

Entre otros peptidos de bloqueo se incluyen el peptido inhibidor relacionado con autocamtide-2 (AIP). Este peptido sintetico es un inhibidor altamente espedfico y potente de la protema quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKII). AIP es un analogo no fosforilable de autocamtide-2, un sustrato peptfdico altamente selectivo de CaMKII. AIP inhibe CaMKII con una IC⁵⁰ de 100 nM (IC⁵⁰ es la concentracion de inhibidor requerida para alcanzar una inhibicion de 50%). La inhibicion de AIP es no competitiva con respecto a syntide-2 (sustrato peptfdico de CaMKII) y ATP aunque competitiva con respecto a autocamtide-2. La inhibicion no resulta afectada por la presencia o ausencia de Ca2+/calmodulina. La actividad de CaMKII resulta inhibida por completo por AIP (1 j M) mientras que PKA, PKC y CaMKIV no resultan afectadas.

Entre otros peptidos de bloqueo se incluyen el peptido inhibidor (CIP) de la protema quinasa 5 de la division celular (Cdk5) Cdk5 fosforila la protema tau de los microtubulos en fosfoepftopos espedficos de la enfermedad de Alzheimer cuando se asocia con p25. La protema p25 es un activador truncado, que es producido a partir del activador de Cdk5 fisiologico p35 tras la exposicion a peptidos p amiloides. Tras las infecciones neuronales con CIP, las CIP inhiben selectivamente la actividad de p25/Cdk5 y suprimen la fosforilacion aberrante de tau en las neuronas corticales. Los motivos para la especificidad demostrada por CIP no se entienden del todo.

Se han estudiado peptidos de bloqueo adicionales para la quinasa 2 regulada extracelularmente (ERK2), p38/HOG1, protema quinasa C, casema quinasa II, Ca2+/calmodulina quinasa IV, casema quinasa II, Cdk4, Cdk5, protema quinasa dependiente de ADN (ADN-Pk ), serina/treonina-protema quinasa PAK3, fosfoinositida (PI)-3 quinasa, quinasa PI-5, PSTAIRE (la secuencia altamente conservada de cdk), quinasa S6 ribosomica, GSK-4, quinasa central germinal (GCK), SAPK (protema quinasa activada por estres), SEK1 (quinasa de senalizacion de estres) y quinasa de adhesion focal (FAK).

5.3. Peptidos penetrantes de celulas (CPP, por sus siglas en ingles)

Los peptidos penetrantes de celulas (CPP) son una clase de peptidos capaces de penetrar en la membrana plasmatica de celulas de mairnfero y de transportar compuestos de muchos tipos y pesos moleculares a traves de la membrana. Entre estos compuestos se incluyen moleculas efectoras, tales como protemas, peptidos conjugados con ADN, oligonucleotidos y partfculas pequenas, tales como liposomas. En el caso de que los CPP se unan o fusionen qmmicamente con otras protemas, las protemas de fusion resultantes todavfa son capaces de entrar en las celulas. Aunque no se conoce cual es el mecanismo exacto de transduccion, no se cree que la internalizacion de estas protemas este mediada por receptores o por transportadores. Los CPP generalmente presentan una longitud de 10 a 16 aminoacidos y pueden agruparse segun su composicion, tales como, por ejemplo, peptidos ricos en arginina y/o lisina.

La utilizacion de CPP capaces de transportar moleculas efectoras al interior de las celulas se ha vuelto crecientemente atractiva en el diseno de farmacos, ya que estimulan la incorporacion celular de moleculas de carga. Estos peptidos penetrantes de celulas, generalmente clasificados como anfipaticos (es decir, que presentan tanto un extremo polar como un extremo no polar) o cationicos (referido o relacionado a que contienen atomos de carga positiva neta). Los CPP con frecuencia se denominan "peptidos troyanos", "secuencias de traslocacion de membrana", "dominios de transduccion de protemas (PTD, por sus siglas en ingles)" o "protemas permeables celulares (CPP)". Los CPP tambien pueden utilizarse para ayudar a nuevos inhibidores de quinasa HSPB1 a penetrar en las membranas celulares (Ver la solicitud de patente US n° de serie 11/972.459, titulada "Polypeptide Inhibitors of HSPB1 Kinase and Uses Therefor", presentada el 10 de enero de 2008, y n° de serie 12/188.109, titulada "Kinase Inhibitors and Uses Thereof', presentada el 7 de agosto de 2008, el contenido de cada solicitud se incorpora en su totalidad en la presente memoria).

5.3.1. Protemas que contienen CPP vmicos

Las primeras protemas que se ha descrito que presentan propiedades de transduccion eran de origen vmco. Estas protemas todavfa son los modelos mas comunmente aceptados de accion de los CPP. Entre los peptidos penetrantes de celulas, los peptidos penetrantes de celulas ricos en arginina, incluyendo, aunque sin limitacion, el peptido TAT, han sido los mas ampliamente estudiados (El-Sayed A. et al., AAPSJ. 11, 13-22, 2009; Wender, P. et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 452-472, 2008).

TAT (producto del gen transactivador de VIH-1) es un polipeptido de 86 aminoacidos que actua como un potente factor de transcripcion del genoma de VIH-1 integrado. TAT actua sobre el genoma vmco estimulando la replicacion vmca en celulas infectadas latentemente. Las propiedades de traslocacion de la protema TAT permiten que active celulas infectadas quiescentes y podna participar en la sensibilizacion de celulas no infectadas para la infeccion posterior mediante la regulacion de muchos genes celulares, incluyendo las citoquinas. El CPP mmimo de TAT es la secuencia proteica de 9 aminoacidos RKKRRQRRR (TAT 49-57, SEC ID n° 20). Estudios que utilizan un fragmento mas largo de TAT demuestran la transduccion con exito de protemas de fusion de hasta 120 kDa. La adicion de multiples TAT-CPP, asf como de derivados de TAT sinteticos, se ha demostrado que media en la traslocacion de membrana. Las protemas de fusion que contienen TAT CPP se han utilizado como fracciones terapeuticas en experimentos que implican cancer, transportando una protema de muerte al interior de la celula y modelos de enfermedad de trastornos neurodegenerativos.

VP22 es la protema del tegumento de VHS-1, una parte estructural del virion del VHS. VP22 es capaz de la traslocacion independiente de receptor y se acumula en el nucleo. Esta propiedad de VP22 clasifica la protema como peptido que contiene CPP. Las protemas de fusion que comprenden VP22 de longitud completa se han traslocado eficientemente a traves de la membrana plasmatica.

5.3.2. Homeoprotemas con propiedades de traslocacion intercelular

Las homeoprotemas son factores de transcripcion transactivadores altamente conservados que participan en procesos morfologicos. Se unen al ADN mediante una secuencia espedfica de 60 aminoacidos. El homeodominio de union a ADN es la secuencia mas altamente conservada de la homeoprotema. Se han descrito varias homeoprotemas que muestran actividad de tipo CPP; son capaces de traslocacion eficiente a traves de las membranas celulares de una manera independiente de energfa y de endocitosis sin especificidad de tipo celular.

La protema Antennapedia (Antp) es un factor transactivador capaz de traslocacion a traves de las membranas celulares; la secuencia minima capaz de traslocacion es un peptido de 16 aminoacidos correspondiente a la tercera helice del homeodominio de la protema (HD). La internalizacion de esta protema se produce a 4°C, sugiriendo que este proceso no es dependiente de endocitosis. Los peptidos de hasta 100 aminoacidos producidos como protemas de fusion con AntpHD penetran en las membranas celulares.

Entre otros homeodominios capaces de traslocacion se incluyen el homeodominio Fushi tarazu (Ftz) y Engrailed (En). Muchos homeodominios comparten una tercera helice altamente conservada.

5.3.3. CPP humanos

Los CPP humanos pueden evitar potenciales problemas de inmunogenicidad al introducirlos en un paciente humano. Entre los peptidos con secuencias de CPP se incluyen: Hoxa-5, Hox-A4, Hox-B5, Hox-B6, Hox-B7, HOX-D3, GAX, MOX-2 y FtzCPP. Todas estas protemas comparten la secuencia observada en los AntpCPP. Entre otros CPP se incluyen Islote-1, interleuquina-1, factor de necrosis tumoral y la secuencia hidrofobica del factor de crecimiento fibroblastico de Kaposi o peptido de senal de FGF-4, que es capaz de traslocacion independiente de energfa, receptor y endocitosis. Entre los CPP no confirmados se incluyen la familia del factor de crecimiento fibroblastico (FGF).

6. Inhibidores de MK2 y tratamiento de las enfermedades o condiciones fibroticas

La protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MAPKAPK2 o MK2), un sustrato de serina/treonina quinasa posterior a p38MAPK, se ha implicado en muchas enfermedades inflamatorias complicadas por cicatrizacion y fibrosis (Lopes, L. et al., Biochem Biophys Res Commun., 382(3):535-9, 2009). Entre ellas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, cancer, hiperplasia intimal, fibrosis organica, adhesiones abdominales, enfermedad intestinal inflamatoria y artritis reumatoide. Ademas de la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI), entre otros trastornos que implican inflamacion y fibrosis y que impactan en el pulmon se incluyen la lesion pulmonar aguda (LPA), el rechazo del trasplante de organo (con el trasplante de pulmon, tambien un tratamiento de estadio mas tardfo para la FPI), la insuficiencia de organo secundaria a sepsis, la insuficiencia pulmonar aguda, las enfermedades autoinmunologicas, tales como escleroderma y enfermedad obstructiva pulmonar cronica (EPOC).

El desarrollo de fibrosis es conocido que requiere inflamacion, proliferacion y produccion de fibroblastos que resulta en celulas de fenotipo miofibroblastico (Horowitz J. et al., Semin Respir Crit Care Med., 27(6):600-612, 2006). Se ha demostrado que m K2 controla la expresion genica a los niveles transcripcional y post-transcripcional (Neininger A. et al., J Biol Chem. 2002;277(5):3065-8, Thomas T. et al., J Neurochem., 105(5): 2039-52,2008; Johansen C. et al., J Immunol., 176(3):1431-8, 2006; Rousseau S. et al., EMBO J. 21(23):6505-14, 2002) asf como la arquitectura citoesqueletica (Lopes, L. et al., Biochem Biophys Res Commun., 382(3):535-9, 2009). Ademas, se ha demostrado que MK2 activado incrementa la traduccion y estabilidad de los ARNm de citoquina inflamatoria y causa la reorganizacion de la actina, y que la inhibicion de MK2 esta asociada a menor inflamacion (Ward, B. et al., J Surg Res., 169(1):e27-36, 2011) and myofibroblast differentiation (Lopes, L. et al., Biochem Biophys Res Commun., 382(3):535-9, 2009).

Juntos, estos datos sugieren que la inhibicion de MK2 podna proporcionar beneficios terapeuticos a pacientes con trastornos o condiciones fibroticas, por ejemplo la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI), la lesion pulmonar aguda (LPA) y el rechazo del trasplante. A este respecto, la invencion descrita ofrece un enfoque para la intervencion en el proceso de inflamacion y fibrosis utilizando inhibidores de MK2 de base peptfdica penetrantes de la celula.

DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION

Segun un aspecto, la invencion descrita proporciona una composicion farmaceutica para la utilizacion en el tratamiento segun las reivindicaciones adjuntas.

Segun una realizacion, la etapa de administracion se realiza por via intratraqueal (incluyendo mediante inhalacion pulmonar), parenteral, intravenosa o intraperitoneal. Segun otra realizacion, la etapa de administracion se realiza por via intratraqueal (incluyendo mediante inhalacion pulmonar). Segun otra realizacion, la etapa de administracion se realiza de una vez como una dosis unica. Segun otra realizacion, la etapa de administracion se realiza como una pluralidad de dosis durante un periodo de tiempo. Segun otra realizacion, el periodo de tiempo es un dfa, una semana, un mes, un ano o multiplos de los mismos. Segun otra realizacion, la etapa de administracion se realiza por lo menos una vez al mes, por lo menos una vez a la semana o por lo menos una vez al dfa. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica comprende ademas por lo menos un agente terapeutico adicional. Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional se selecciona del grupo que consiste en un colageno de tipo V bovino purificado, un antagonista de receptor de IL-13, un inhibidor de protema tirosina quinasa, un antagonista de receptor endotelial, un antagonista dual de receptor de endotelina, un analogo de prostaciclina, un anticuerpo monoclonal anti-CTGF, un antagonista de receptor de endotelina (A-selectivo), AB0024, un anticuerpo monoclonal de tipo lisil oxidasa 2 (LOXL2), un inhibidor de quinasa N-terminal de c-Jun (JNK), pirfenidona, IFN-Ylb, un anticuerpo humano IgG4 pan-neutralizador contra la totalidad de las tres isoformas de TGF-p, un inhibidor de activacion de TGF-p, una protema pentraxina-2 humana recombinante (rhPTX-2), un anticuerpo biespedfico de IL-4/IL-13, un anticuerpo monoclonal humanizado con diana en la integrina avp6, N-acetilcistema, sildenafilo, un antagonista de factor de necrosis tumoral (TNF) (etanercept) y una combinacion de los mismos. Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional es un glucocorticoide seleccionado del grupo que consiste en prednisona, budesonido, furoato de mometasona, propionato de fluticasona, furoato de fluticasona y una combinacion de los mismos. Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional es un broncodilatador seleccionado del grupo que consiste en un modificador de leucotrieno, un broncodilatador anticolinergico, un agonista p2 de accion corta y un agonista p2 de accion prolongada y una combinacion de los mismos. Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional es un agente analgesico. Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional es un agente antiinfeccioso.

Segun otra realizacion, el portador se selecciona del grupo que consiste en un portador de liberacion controlada, un portador de liberacion retardada, un portador de liberacion sostenida y un portador de liberacion a largo plazo. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica se encuentra en una forma de polvos secos. Segun otra realizacion, los polvos secos comprenden micropartmulas con un diametro aerodinamico de la mediana de la masa (DAMM) de entre 1 y 5 micrometres. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica de la composicion farmaceutica se administra mediante un dispositivo de inhalacion. Segun otra realizacion, el dispositivo de inhalacion es un nebulizador. Segun otra realizacion, el dispositivo de inhalacion es un inhalador de dosis medida (IDM). Segun otra realizacion, el dispositivo de inhalacion es un inhalador de polvos secos (IPS). Segun otra realizacion, el dispositivo de inhalacion es un nebulizador de polvos secos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra el rendimiento de administracion de insulina seca mediante pulverizacion pura.

La figura 2 muestra la distribucion de los tamanos de partfcula de la insulina secada mediante pulverizacion, determinada mediante un impactador de cascada Anderson (ICA).

La figura 3 muestra la comparacion de eficiencia y caudal del inhalador de polvos secos (IPS) MicroDose vs. dos inhaladores de polvos secos (IPS) pasivos.

La figura 4 muestra la independencia respecto del caudal del peptido puro secado por pulverizacion.

La figura 5 muestra una micrograffa representativa de un peptido secado por pulverizacion (no insulina).

La figura 6 muestra la distribucion de los tamanos de partfcula de un peptido secado por pulverizacion (no insulina). La figura 7 muestra la distribucion de los tamanos de partrnula de una combinacion de lactosa micronizada, que se determina mediante un impactador de proxima generacion (IPG).

La figura 8 muestra el rendimiento de administracion de una molecula pequena micronizada (mezcla de agentes muscarmicos de accion prolongada (AMAP)/lactosa)

La figura 9 muestra el analisis inmunohistoqmmico de pulmones humanos con fibrosis pulmonar idiopatica, FPI incluidos en parafina, que muestra la localizacion nuclear de MK2 activado (es decir, Phospho-Thr334-MAPKAPK2) en el foco fibroblastico. Pulmones normales (panel izquierdo); seccion de biopsia de tejido pulmonar con FPI (panel derecho). El grafico insertado muestra la disrupcion del revestimiento epitelial en los focos con celulas tenidas positivas (gris oscuro) para MK2 activado. Las abreviaturas mostradas en la figura 9 son las siguientes: PN (arquitectura de pulmon normal con sacos alveolares); VR (vfas respiratorias); FF (focos fibroblasticos de un explante de tejido pulmonar con FPI).

La figura 10 muestra un diagrama esquematico para someter a ensayo la capacidad de un compuesto de inhibir el desarrollo de fibrosis en el modelo en raton de bleomicina para fibrosis pulmonar (modelo de prevencion de la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI)). Solucion salina tamponada con fosfato (PBS) o MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA (s Ec ID n° 1)) administrada diariamente, mediante nebulizacion o por via intraperitoneal, desde el dfa 7 despues de la administracion de bleomicina tras ceder la inflamacion y activarse los mecanismos fibroticos, hasta el dfa 21 despues de la administracion de bleomicina, cuando se observa fibrosis significativa.

La figura 11 muestra que la terapia de inhalacion y la administracion sistemica de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) protegen frente a la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones. Panel superior: tincion de hematoxilina y eosina (H+E) de tejidos pulmonares de raton representativos el dfa 21. Panel inferior: la tincion tricromica de azul de Masson de los mismos campos revelo amplia deposicion de colageno (flechas) con lesion por bleomicina. Abreviaturas: VR: vfas respiratorias; PN: arquitectura de pulmon normal; FF: focos fibroticos; V: vena.

La figura 12 muestra que MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) evita la deposicion significativa de colageno debido a la lesion por bleomicina. Los valores representan medias ± SEM. n = 5 animales en cada grupo. '*' p<0,05; '**' p<0,01; '***' p<0,001. fndice de colageno = factor constante para colageno 7,5 x concentraciones de hidroxiprolina.

La figura 13 muestra que Mm I-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) evita la fibrosis debida a la lesion por bleomicina de una manera dependiente de la dosis. La tincion de tricroirna de azul de Masson de secciones de pulmon de ratones con bleomicina. (A) MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1); (B) MMI-0200 (YARAAARQARAKALNRQLGVA; SEC ID n° 19).

La figura 14 muestra que MMI-0100 administrado sistematicamente (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) anula la activacion de celulas T sistemicas debido a la lesion por bleomicina. Los valores representan medias ± SEM. Valor 'p' <0,01. n = 4 animales /grupo. Las abreviaturas mostradas en la figura 14 son las siguientes: (i) ratones de tipo salvaje tratados con PBS (PBS); (ii) los ratones con bleomicina tratados con PBS (BLEO); (iii) los ^{ratones con bleomicina tratados con} mMi-0100 ^{nebulizado (YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1))} (BLEO MMI-0100 (NEB)); e (iv) los ratones con bleomicina tratados con MMI-0100 intraperitoneal (YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1)) (BLEO MMI-0100 (IP)).

La figura 15 muestra un diagrama esquematico para someter a ensayo la capacidad de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) de anular la progresion de la fibrosis en el modelo con bleomecina de fibrosis pulmonar idiopatica (modelo de tratamiento de la FPI). PBS o MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1)) se administro mediante nebulizacion o por via intraperitoneal a dosis de 50 pg/kg diarios desde el dfa 14 posterior a la administracion de bleomicina hasta el dfa 28 posterior a la administracion de bleomicina.

La figura 16 muestra que la administracion sistemica (IP) o nebulizada (NEB) de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) mejora la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones. Panel superior: Tincion de hematoxilina y eosina (H+E); panel inferior: Tincion tricromica de azul de Masson de los mismos campos. Las abreviaturas mostradas en la figura 16 son las siguientes: PBS (ratones de tipo salvaje tratados con PBS); BLEO (ratones con bleomicina tratados con PBS); MMI-0100 (NEB) (ratones con bleomicina tratados con MMI-0100 nebulizado (YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1)); MMI-0100 (IP) (ratones con bleomicina tratados con MMI-0100 intraperitoneal (YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1)); NL (arquitectura de pulmon normal con sacos alveolares); VR (vfas respiratorias); FF (focos fibroblasticos de un explante de tejido pulmonar con FPI).

La figura 17 muestra que MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1)) detiene la deposicion significativa de colageno debido a la lesion por bleomicina. Las abreviaturas mostradas en la figura 17 son las siguientes: PBS (ratones de tipo salvaje tratados con PBS); BLEO (ratones con bleomicina tratados con PBS); BLEO+MMI-0100 (NEB) (ratones con bleomicina tratados con MMI-0100 nebulizado (YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1)); BLEO+MMI-0100 (IP) (ratones con bleomicina tratados con MMI-0100 intraperitoneal (YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1)). Los valores representan medias ± SEM. n = 5 animales en cada grupo. fndice de colageno = factor constante para colageno 7,5 x concentraciones de hidroxiprolina.

La figura 18 muestra una micrograffa representativa de tinciones anti-phospho-Thr334-MAPKAPK2 (una forma activada de MK2) de secciones pulmonares (el dfa 28 posterior a la lesion con bleomicina) d (i) ratones de tipo salvaje tratados con PBS (PBS), (ii) ratones con bleomicina tratados con PBS (BLEO), (iii) ratones con bleomicina tratados con MMI-0100 nebulizado (YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1)) (BLEO MMI-0100 (NEB)); ^{e (iv) los ratones con bleomicina tratados con MMI-0100 intraperitoneal (YARAAARQARAKALARQLGVAA} (SeC ID n° 1)) (BLEO MMI-0100 (IP)). Se sometieron ratones C57-BL/6 a lesion con bleomicina el dfa 0. El dfa 14, en ratones se administraron 50 pg/kg de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) diariamente mediante inyeccion intraperitoneal (IP) o nebulizador (NEB) hasta el dfa 28 posterior a la lesion con bleomicina. Magnificaciones originales: 20X.

La figura 19 muestra moleculas de senalizacion clave implicadas en las rutas inflamatorias y fibroticas mediadas por TGF-p.

La figura 20 muestra que, 24 horas despues de la administracion final, MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) regula negativamente los niveles de citoquinas inflamatorias circulantes en el modelo de raton con bleomicina de fibrosis pulmonar idiopatica (modelo de tratamiento).

^{La figura 21 muestra que MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC} iD ^{n° 1) inhibe la activacion de la} alfa-actina de musculo liso de miofibroblasto (a-SMA) en el modelo de tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopatica. Se sometieron ratones C57-BL/6 a lesion con bleomicina el dfa 0. Del dfa 14 al dfa 28, en ratones se administraron 50 pg/kg/dfa de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) mediante inyeccion intraperitoneal (IP) o nebulizador (NEB). Se inmunotineron contra a-SMA secciones de tejido pulmonar fijado en formalina. La tincion de control fue con anticuerpo IgG secundario biotinilado. Se utilizo peroxidasa de rabano picante conjugada con estreptavidina con 3,3'-diaminobencideno como sustrato y se contratineron los nucleos con hematoxilina. Magnificaciones originales: 20X

La figura 22 muestra la modulacion de la activacion de los miofibroblastos inducida por TGF-p mediante inhibidores del peptido MK2 en fibroblastos de pulmon fetal humano normal (IMR-90). Se pretrataron celulas IMR-90 con MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) o MMI-0200 (YARAAARQARAKALNRQLGVA; SEC ID n° 19) a las dosis indicadas durante 1 h y despues se cultivaron en presencia o ausencia de TGF-p1 (2 ng/ml) durante 48 h. Los lisados celulares se inmunotransfirieron contra anticuerpos para a-SMA (un marcador de activacion de miofibroblastos) y GAPDH (control de carga).

La figura 23 muestra la modulacion de la expresion de fibronectina mediada por TGF-p en fibroblastos pulmonares de feto humano (IMR-90). Se pretrataron celulas IMR90 con MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) o MMI-0200 (YARAAARQARAKALNRQLGVA; SEC ID n° 19) a las dosis indicadas durante 1 h y despues se cultivaron en presencia o ausencia de TGF-p1 (2 ng/ml) durante 72 h. Se midio la fibronectina como fragmentos secretados en el medio acondicionado. Se cargaron en cada carril cantidades iguales (14 pg) de protemas totales del medio acondicionado.

La figura 24 muestra las moleculas de senalizacion clave implicadas en la regulacion de la migracion de las celulas madre mesenquimales por fibronectina mediante activacion mediada por integrina a5p1 de PDGFR-p (Veevers-Lowe J et al., J Cell Sci, 124: 1288-1300, 2011).

La figura 25 muestra los incrementos del nivel de una forma activada de quinasa MK2 en pacientes de FPI. (A) Analisis cuantitativo de los niveles de fosfo-Thr334 en tejidos normales y de FPI; (C) Correlacion entre la funcion pulmonar y la activacion de MK2.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La invencion descrita proporciona una composicion y metodo para tratar una fibrosis pulmonar en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el metodo la administracion de una cantidad terapeutica de una composicion que comprende un polipeptido con la secuencia de aminoacidos YARAAARQARAKALARQLGVAA (MMI-0100; SEC ID n° 1) o un equivalente funcional del mismo.

Glosario

La expresion "vfas respiratorias" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a las vfas a traves de las cuales entra y sale aire del cuerpo. Las vfas respiratorias pulmonares comprenden aquellas partes del tracto respiratorio a traves de las que pasa el aire durante la respiracion.

La expresion "obstruccion de las vfas respiratorias" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier reduccion anormal del flujo de aire. La resistencia al flujo de aire puede producirse en cualquier sitio en las vfas respiratorias desde las vfas respiratorias superiores a los bronquios terminales.

La expresion "enfermedad de las vfas respiratorias" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una enfermedad que afecta a los tubos (vfas respiratorias) que transportan oxfgeno y otros gases de entrada y salida de los pulmones. Entre las enfermedades de las vfas respiratorias se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), incluyendo asma, enfisema y bronquitis cronica.

La expresion "enfermedad de los tejidos pulmonares" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una enfermedad que afecta a la estructura del tejido pulmonar, p.ej., el intersticio pulmonar. La cicatrizacion o inflamacion del tejido pulmonar impide que los pulmones se expandan por completo ("enfermedad pulmonar restrictiva"). Tambien provoca que los pulmones sean menos capaces de incorporar oxfgeno (oxigenacion) y de liberar dioxido de carbono. Entre los ejemplos de enfermedades del tejido pulmonar se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI), la lesion pulmonar aguda (LPA), la fibrosis pulmonar inducida por radiacion y una condicion fibrotica asociada al trasplante pulmonar. La sarcoidosis es una enfermedad en la que se produce hinchazon (inflamacion) de los ganglios linfaticos, pulmones, tngado, ojos, piel u otros tejidos.

La expresion "intersticio del pulmon" o "intersticio pulmonar" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a una zona situada entre el epitelio del espacio aereo y el mesotelio pleural en el pulmon. Las fibras de las protemas matriciales, el colageno y la elastina, son los componentes principales del intersticio pulmonar. La funcion primaria de estas fibras es formar un andamiaje mecanico que mantiene la integridad estructural durante la ventilacion.

La expresion "zona de superficie accesible" o "ZSA" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una zona superficial de una biomolecula que esta expuesta a solvente. La expresion "superficie accesible por solvente" o "SAS" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un porcentaje de la superficie de un residuo dado que es accesible al solvente. Se calcula como la proporcion entre ZSA de un residuo en la estructura tridimensional y la SAS maxima de su conformacion peptfdica extendida.

Las expresiones "residuo aminoacido" o "aminoacido" o "residuo" se utilizan intercambiablemente para referirse a un aminoacido que se incorpora en una protema, un polipeptido o un peptido, incluyendo, aunque sin limitacion, un aminoacido natural y analogos conocidos de aminoacidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a la de los aminoacidos naturales. Los aminoacidos pueden ser L-aminoacidos o D-aminoacidos. Un aminoacido puede ser sustituido por un aminoacido sintetico, que se altera para incrementar la semivida del peptido, para incrementar la potencial del peptido o para incrementar la biodisponibilidad del peptido.

En la presente memoria predominantemente se utiliza la denominacion de una sola letra de los aminoacidos. Tal como es bien conocido por el experto en la materia, tales denominaciones de una sola letra son las siguientes:

A es alanina; C es cistema; D es acido aspartico; E es acido glutamico; F es fenilalanina; G es glicina; H es histidina; I es isoleucina; K es leucina; L es leucina; M es metionina; N es asparagina; P es prolina; Q es glutamina; R es arginina; S es serina; T es treonina; V es valina; W es triptofano e Y es tirosina.

Lo siguiente representa grupos de aminoacidos que son sustituciones conservadoras de uno respecto a otro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Acido aspartico (D), Acido glutamico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

Tal como se utilizan en la presente memoria, las formas singulares "un", "una", "el" o "la" incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a un "polipeptido" es a uno o mas polipeptidos.

El termino "adicion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la insercion de una o mas bases, o de uno o mas amionacidos, en una secuencia.

El termino "administrar" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a dispensar, suministrar, aplicar, proporcionar, repartir o contribuir. Los terminos "administrar" o "administracion" se utilizan intercambiablemente e incluyen la administracion in vivo, ademas de la administracion directamente en tejido ex vivo. Generalmente, las composiciones pueden administrarse sistemicamente por via oral, bucal, parenteral, topica, mediante inhalacion o insuflado (es decir, por la boca o la nariz), o rectalmente en formulaciones de dosis unitaria que contienen los portadores, adyuvantes y vehmulos farmaceuticamente aceptables no toxicos convencionales segun se desee, o pueden administrarse localmente por medios tales como, aunque sin limitacion, inyeccion, implantacion, injertacion, aplicacion topica o por via parenteral. La administracion adicional puede llevarse a cabo, por ejemplo, por via intravenosa, pericardica, oral, mediante implante, por via transmucosal, transdermica, topica, intramuscular, subcutanea, intraperitoneal, intratecal, intralinfatica, intralesional o epidural. La administracion puede llevarse a cabo, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces, y/o durante uno o mas periodos prolongados.

La expresion "reaccion alergica" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una reaccion de hipersensibilidad del sistema inmunologico. Las reacciones alergicas se producen frente a sustancias ambientales normalmente inocuas conocidas como alergenos; estas reacciones son adquiridas, predecibles y rapidas. La reaccion alergica se caracteriza por la activacion excesiva de determinados globulos blancos denominados mastocitos y basofilos por un tipo de anticuerpo conocido como IgE, que resultan en una respuesta inflamatoria extrema. Entre las reacciones alergicas comunes se incluyen eccema, urticaria, rinitis alergica, ataques de asma, alergias alimentarias y reacciones al veneno de insectos picadores, tales como avispas y abejas.

La expresion "a-actina de musculo liso" o "a-SMA" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una protema actina, alfa-actina-2 (ACTA2, tambien conocida como actina o actina de musculo liso aortica) aislada por primera vez en las celulas de musculo liso vasculares. Las actinas son protemas altamente conservadas que se expresan en todas las celulas eucarioticas. Los filamentos de actina forman parte del citoesqueleto y desempenan funciones esenciales en la regulacion de la forma y movimiento celulares. Se han identificado seis isotipos de actina diferentes en las celulas de mairnfero. Cada una esta codificada por un gen separado y se expresa de una manera regulada en el desarrollo y espedfica del tejido. Las actinas citoplasmaticas alfa y beta se expresan en una amplia diversidad de celulas, mientras que la expresion de las actinas alfa esqueletica, alfa cardiaca, alfa vascular y gamma enterica esta mas restringida a tipos especializados de celulas musculares. El gen de la actina alfa de musculo liso es uno de los pocos genes cuya expresion esta relativamente restringida a las celulas de musculo liso vascular aunque actualmente se utiliza mas comunmente como marcador de la formacion de miofibroblastos. La expresion de actina alfa de musculo liso esta regulada por hormonas y la proliferacion celular y resulta alterada por condiciones patologicas, incluyendo la transformacion oncogenica y la ateroesclerosis.

El termino "alveolo" o "alveolos" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una estructura anatomica que presenta la forma de una cavidad hueca. Los alveolos pulmonares, presentes en el pulmon, son salientes esfericos de los sitios respiratorios de intercambio gaseoso con la sangre. Los alveolos contienen algunas fibras de colageno y elasticas. Las fibras elasticas permiten que los alveolos se estiren al llenarse de aire al inspirar. A continuacion, recuperan su forma durante la espiracion a fin de expulsar el aire rico en dioxido de carbono.

El termino "bleomicina" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un antibiotico glucopeptido producido por la bacteria Streptomyces verticillus. Funciona induciendo roturas en la cadena de ADN e inhibiendo la incorporacion de timidina en la cadena de ADN. La complicacion mas grave de la bleomicina es la fibrosis pulmonar y el deterioro de la funcion pulmonar.

La expresion "lavado broncoalveolar" o "LBA" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un procedimiento medico en el que se pasa un broncoscopio por la boca o nariz hacia el interior de los pulmones y se arroja un chorro de lfquido en una zona pequena del pulmon y seguidamente se recolectar para su examen. El LBA tfpicamente se lleva a cabo para diagnosticar enfermedades pulmonares. Comunmente se utiliza el LBA para diagnosticar infecciones en personas con problemas del sistema inmunologico, neumoma en personas bajo ventilacion mecanica, algunos tipos de cancer pulmonar y cicatrizacion del pulmon (enfermedad pulmonar intersticial). LBA es la manera mas comun de muestrear los componentes del lfquido de revestimiento epitelial (LRE) y para determinar la composicion de protemas de las vfas respiratorias pulmonares y con frecuencia se utiliza en investigacion inmunologica como medio de muestreo de celulas o niveles de patogeno en el pulmon.

El termino "portador" y la expresion "portador farmaceutico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un agente o vehuculo inerte farmaceuticamente aceptable para administrar uno o mas agentes activos en un sujeto y con frecuencia se denomina "excipiente". El portador (farmaceutico) debe ser de pureza suficientemente elevada y de toxicidad suficientemente baja para que resulte adecuado para la administracion en el sujeto bajo tratamiento. El portador (farmaceutico) ademas debe mantener la estabilidad y biodisponibilidad del agente activo, p.ej. un polipeptido de la invencion descrita. El portador (farmaceutico) puede ser lfquido o solido y se selecciona, considerando la manera planificada de administracion, para proporcionar el volumen, consistencia, etc. deseados en combinacion con un agente activo y otros componentes de una composicion dada. El portador (farmaceutico) puede ser, aunque sin limitacion, un agente de union (p.ej., almidon de mafz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil-metilcelulosa, etc.), un agente de carga (p.ej., lactosa y otros azucares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos, hidrogenofosfato de calcio, etc.), un lubricante (p.ej., estearato de magnesio, talco, sflice, dioxido de silicio coloidal, acido estearico, estearatos metalicos, aceites vegetales hidrogenados, almidon de mafz, polietilenglicoles, benzoato sodico, acetato sodico, etc.), un desintegrante (p.ej., almidon, glicolado de almidon sodico, etc.) o un agente humectante (p.ej., laurilsulfato sodico, etc.). Entre otros portadores (farmaceuticos) adecuados para las composiciones de la invencion descrita se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatinas, amilosas, estearatos de magnesio, talcos, acidos silfcicos, parafinas viscosas, hidroximetilcelulosas, polivinilpirrolidonas y similares. Las composiciones destinadas a la administracion parenteral de un polipeptido de la invencion descrita pueden incluir portadores (farmaceuticos), tales como soluciones acuosas esteriles, soluciones no acuosas en solventes comunes, tales como alcoholes, o soluciones del polipeptido en una base aceite lfquida.

El termino "colageno" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo de protemas naturales presentes en musculo y tejidos conectivos de los mairnferos. Es el componente principal del tejido conectivo y es la protema mas abundante en los marnfferos, constituyendo aproximadamente 25% a 35% del contenido de protemas del cuerpo completo. El colageno, en forma de fibrillas alargadas, se encuentra mayoritariamente en tejidos fibrosos, tales como tendon, ligamento y piel, y tambien es abundante en cornea, cartflago, hueso, vasos sangumeos, tracto digestivo y discos intervertebrales. Hasta hoy, se han identificado 29 tipos de colageno y mas de 90% del colageno corporal es de tipo I (piel, tendones, vascular, ligamentos, organos, hueso), de tipo II (cartflago), de tipo III (reticulado (componente principal de las fibras reticulares) y de tipo IV (que forma las bases de la membrana basal celular).

El termino "condicion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una diversidad de estados de salud y pretende incluir trastornos o enfermedades causados por cualquier mecanismo, trastorno o lesion subyacente.

El termino "citoquina", que se refiere a sustancias proteicas solubles pequenas secretadas por celulas que pueden presentar una diversidad de efectos sobre otras celulas, se utiliza genericamente para referirse a muchas moleculas de senalizacion, incluyendo, aunque sin limitacion, linfoquinas, interleuquinas y quimioquinas. Las citoquinas median en muchas funciones fisiologicas importantes, incluyendo el crecimiento, el desarrollo, la cicatrizacion de heridas y la respuesta inmunologica. Actuan mediante union a sus receptores espedficos celulares situados en la membrana celular que permiten que se inicie una clara cascada de transduccion de senales en la celula, que eventualmente conducira a cambios bioqmmicos y fenotfpicos en las celulas diana. Generalmente, las citoquinas actuan localmente, aunque se ha encontrado que algunas presentan efectos inmunomoduladores sistemicos, con efectos pleiotropicos autocrinos, paracrinos y endocrinos similares a los de las hormonas. Entre ellas se incluyen las citoquinas de tipo I, que comprenden muchas de las interleuquinas, asf como varios factores de crecimiento hematopoyetico; citoquinas de tipo II, incluyendo los interferones y la interleuquina-10; las moleculas relacionadas con el factor de necrosis tumoral ("TNF"), incluyendo TNF-a y linfotoxina; elementos de la superfamilia de inmunoglobulinas, incluyendo la interleuquina-1 ("IL-1" y las quimioquinas, una familia de moleculas que desempenan un papel crucial en una amplia diversidad de funciones inmunologicas e inflamatorias. La misma citoquina puede presentar efectos diferentes sobre una celula dependiendo del estado de la celula. Las citoquinas con frecuencia regulan la expresion e inducen cascadas de otras citoquinas.

Los terminos "enfermedad" y "trastorno", tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a un deterioro de la salud o una condicion de funcionamiento anormal, con independencia de la causa (sea hereditaria, ambiental, dietetica, infecciosa, debida a traumatismo o de otro tipo). Entre los trastornos puede incluirse, por ejemplo, aunque sin limitarse a ellos, enfermedades inflamatorias y fibroticas, fibrosis, lesion pulmonar aguda, fibrosis inducida por radiacion, rechazo del trasplante, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), choque endotoxico, enfermedad inflamatoria localizada, enfermedad cardiovascular ateroesclerotica, enfermedad de Alzheimer, enfermedades oncologicas, isquemia neural, enfermedades autoinmunologicas del tejido conectivo y sistemicas, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, lupus eritematoso sistemico (LES), smdrome de Sjogren, escleroderma, vasculitis, hiperplasia intimal, estenosis, restenosis, aterosclerosis, tumores y metastasis de celulas de musculo liso, espasmo de musculo liso, angina, angina de Prinzmetal, isquemia, ictus, bradicardia, hipertension, hipertrofia cardiaca, insuficiencia renal, ictus, hipertension pulmonar, asma, toxemia del embarazo, trabajo de parto prematuro, preeclampsia, eclampsia, enfermedad o fenomeno de Raynaud, uremia hemolttica, fisura anal, acalasia, impotencia, migrana, lesion muscular isquemica asociada a espasmo de musculo liso, vasculopatfa, bradiarritmia, insuficiencia cardiaca congestiva, miocardio aturdido, hipertension pulmonar, disfuncion diastolica, gliosis (proliferacion de astrocitos, y puede incluir la deposicion de matriz extracelular (MEC), la deposicion en zonas danadas del sistema nervioso central), enfermedad pulmonar obstructiva cronica (es decir, enfermedades del tracto respiratorio caracterizadas por la obstruccion o limitacion de las vfas respiratorias; incluye, aunque sin limitarse a ellas, bronquitis cronica, enfisema y asma cronico), osteopenia, disfuncion endotelial, inflamacion, artritis degenerativa, espondilitis anquilosante, enfermedad de Guillain-Barre, enfermedad infecciosa, sepsis, choque endotoxemico, soriasis, enteritis por radiacion, cirrosis, fibrosis intersticial, fibrosis pulmonar (incluyendo la fibrosis pulmonar idiopatica), colitis, apendicitis, gastritis, laringitis, meningitis, pancreatitis, otitis, dano por reperfusion, lesion cerebral traumatica, lesion de la medula espinal, neuropatia periferica, esclerosis multiple, alergia, enfermedades cardiometabolicas, obesidad, diabetes mellitus de tipo II, diabetes mellitus de tipo I y NASH/cirrosis.

El termino "dominio" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una region de una protema con una estructura y funcion terciaria caractensticas y a cualquiera de las subunidades tridimensionales de una protema que juntas constituyen su estructura terciaria formada mediante plegamiento de su cadena peptfdica lineal.

La expresion "dominio terapeutico" (tambien denominado "DT") tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un peptido, segmento o variante de peptido, o derivado del mismo, con identidad sustancial respecto al peptido KALARQLGVAA (SEC ID n° 2) o segmento del mismo. Los dominios terapeuticos por sf mismos generalmente no son capaces de penetrar en la membrana plasmatica de las celulas de mairnfero. Una vez dentro de la celula, los dominios terapeuticos pueden inhibir la actividad de quinasa de un grupo espedfico de quinasas.

La expresion "peptido penetrante de la celula" (tambien denominado "PPC", "dominio de transduccion de protema", "DTP", "peptido troyano", "secuencia de translocacion membranal" y "protema permeable celular") tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una clase de peptidos generalmente capaces de penetrar en la membrana plasmatica de las celulas de mamffero. Se refiere ademas a un peptido, segmento de peptido, o variante o derivado del mismo, con identidad sustancial respecto al peptido YARAAARQARA (SEC ID n° 11), o un segmento funcional del mismo, y a un peptido, segmento de peptido o variante o derivado del mismo, que es funcionalmente equivalente a SEC ID n° 11. Los PPC generalmente presentan una longitud de 10 a 16 aminoacidos y son capaces de transportar compuestos de muchos tipos y pesos moleculares a traves de las celulas de mamffero. Tales compuestos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, moleculas efectoras, tales como protemas, ADN, peptidos conjugados, oligonucleotidos y partroulas pequenas, tales como liposomas. Los PPC unidos o fusionados qmmicamente a otras protemas ("protemas de fusion") todavfa son capaces de penetrar en la membrana plasmatica y entrar en las celulas.

La expresion "matriz extracelular" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un andamiaje en el medio externo de una celula con la que interactua la celula mediante receptores de superficie celular espedficos. La matriz extracelular esta compuesta de una malla entrelazada de protemas fibrosas y glucosaminoglucanos (GAG). Entre los ejemplos de protemas fibrosas observados en la matriz extracelular se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, colageno, elastina, fibronectina y laminina. Entre los ejemplos de GAG observados en la matriz extracelular se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, proteoglicanos (p.ej., sulfato de heparina), sulfato de condroitina, sulfato de queratina y polisacarido no proteoglicano (p.ej., acido hialuronico). El termino "proteoglicano" se refiere a un grupo de glucoprotemas que contienen una protema nuclear a la que se unen uno o mas glucosaminoglicanos. La matriz extracelular sirve a muchas funciones, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, proporcionar soporte y anclaje a las celulas, segregar un tejido de otro tejido y regular la comunicacion intracelular.

Las expresiones "equivalente funcional" o "funcionalmente equivalente" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a sustancias, moleculas, polinucleotidos, protemas, peptidos o polipeptidos que presentan efectos o usos similares o identicos. Un polipeptido funcionalmente equivalente al polipeptido YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1), por ejemplo, puede presentar una actividad biologica, p.ej., una actividad inhibidora, parametros cineticos, inhibicion salina, actividad dependiente de un cofactor y/o un tamano unitario funcional que es sustancialmente similar o identico al del polipeptido expresado de SEC ID n° 1.

Entre los ejemplos de polipeptidos funcionalmente equivalentes a YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1) se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un polipeptido de secuencia de aminoacidos FAKLAARLYRKALARQLGVAA (SEC ID n° 3), un polipeptido de secuencia de aminoacidos KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA (SEC ID n° 4), un polipeptido de secuencia de aminoacidos YARAAARQARAKALARQLAVA (SEC ID n° 5), un polipeptido de secuencia de aminoacidos YARAAARQARAKALARQLGVA (SEC ID n° 6), y un polipeptido de secuencia de aminoacidos HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA (SEC ID n° 7).

El peptido MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) de secuencia de aminoacidos YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1) descrito en la presente invencion comprende una protema de fusion en la que un peptido penetrante de la celula (PPC: YARAAARQARA, SEC ID n° 11) se encuentra operablemente unido a un dominio terapeutico (KALARQLGVAA, SEC ID n° 2) con el fin de potenciar la eficacia terapeutica.

Entre los ejemplos de polipeptidos funcionalmente equivalentes al dominio terapeutico (DT: KALARQLGVAA, SEC ID n° 2) del polipeptido YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1) se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un polipeptido de secuencia de aminoacidos KALARQLAVA (SEC ID n° 8), un polipeptido de secuencia de aminoacidos KALARQLGVA (SEC ID n° 9), y un polipeptido de secuencia de aminoacidos KALARQLGVAA (SEC ID n° 10).

Entre los ejemplos de polipeptidos funcionalmente equivalentes al peptido penetrante de la celula (PPC: YARAAARQARA, SEC ID n° 11) del polipeptido YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1) se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un polipeptido de secuencia de aminoacidos WLRRIKAWLRRIKA (SEC ID n° 12), un polipeptido de secuencia de aminoacidos WLRRIKA (SEC ID n° 13), un polipeptido de secuencia de aminoacidos YGRKKRRQRRR (SEC ID n° 14), un polipeptido de secuencia de aminoacidos WLRRIKAWLRRI (SEC ID n° 15), un polipeptido de secuencia de aminoacidos FAKLAARLYR (SEC ID n° 16), un polipeptido de secuencia de aminoacidos KAFAKLAARLYR (SEC ID n° 17), y un polipeptido de secuencia de aminoacidos HRRIKAWLKKI (SEC ID n° 18).

El termino "endogeno" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que crece o se origina en el interior o se deriva internamente.

El termino "endotelio" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una delgada capa de celulas que reviste la superficie interior de los vasos sangumeos, formando una interfaz entre la sangre circulante en el lumen y el resto de la pared vascular. Las celulas endoteliales que revisten todo el sistema circulatorio, desde el corazon hasta el capilar mas pequeno. Estas celulas reducen la turbulencia del flujo de sangre permitiendo que el lfquido sea bombeado mas lejos.

El termino "eosinofilos" o "granulocitos eosinofilos" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a globulos blancos responsables de combatir los parasitos multicelulares y determinadas infecciones en los vertebrados. Son granulocitos que se desarrollan durante la hematopoyesis en la medula osea antes de migrar hacia la sangre. Junto con los mastocitos, tambien controlan mecanismos asociados a alergia y asma. Tras la activacion, los eosinofilos ejercen diversas funciones, incluyendo: (1) produccion de protemas de granulos cationicos y su liberacion mediante degranulacion, (2) produccion de especies de oxfgeno reactivo, tales como, superoxido, peroxido e hipobromito (acido hipobromoso, que es producida preferentemente por la peroxidasa de los eosinofilos), (3) produccion de mediadores lipfdicos, tales como eicosanoides de las familias de leucotrienos y prostaglandinas, (4) produccion de factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento transformante (TGF-p), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en ingles) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y (5) produccion de citoquinas, tales como IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13 y TNF-a.

El termino "epitelio" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un tejido compuesto de celulas que revisten las cavidades y superficies de estructuras en todo el cuerpo. La superficie basal del epitelio se encuentra orientada hacia el tejido conectivo subyacente y las dos capas estan separadas por una membrana basal.

El termino "extravasacion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al movimiento de componentes celulares de la sangre desde los capilares a los tejidos que los circundan (diapedesis). En el caso de la metastasis maligna del cancer, se refiere a celulas de cancer que salen de los capilares y entran en organos.

El termino "exudacion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un proceso por el que un lfquido del sistema circulatorio pasa a traves de las paredes de los vasos sangumeos al interior de lesiones o zonas de inflamacion. Los exudados sangumeos contienen algunas o todas las protemas plasmaticas, globulos blancos, plaquetas y globulos rojos.

El termino "fibrina" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una protema fibrosa que participa en la coagulacion de la sangre. Es una protema fibrilar que se polimeriza para formar una "malla" que forma un tapon hemostatico o coagulo (junto con las plaquetas) sobre un sitio de herida. La fibrina participa en la transduccion de senales, la coagulacion de la sangre, la activacion de las plaquetas y la polimerizacion de las protemas.

El termino "fibroblasto" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una celula del tejido conectivo que produce y secreta las protemas de la matriz extracelular, incluyendo, aunque sin limitacion, el colageno. Los fibroblastos, el tipo celular mas comun presente en los tejidos conectivos, desempena un papel importante en la cicatrizacion de heridas. Al igual que otras celulas del tejido conectivo, los fibroblastos se derivan del mesenquima primitivo (un tipo de tejido conectivo laxo derivado de las tres capas germinales y situado en los embriones). En determinadas situaciones, las celulas epiteliales pueden dar lugar a fibroblastos, un proceso denominado transicion epitelial-mesenquimatosa. Los fibroblastos y fibrocitos son dos estados de las mismas celulas, siendo las primeras el estado activado, y el segundo, el estado menos activo, implicado en el mantenimiento y metabolismo de los tejidos, donde ocasionalmente se utilizan ambos terminos intercambiablemente.

El termino "miofibroblastos" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a fibroblastos en zonas de lesion que presentan algunas caracteristicas de musculo liso, tales como las propiedades contractiles y fibras, y se cree que producen, temporalmente, colageno de tipo III. Aunque existen muchas maneras posibles de desarrollo de los miofibroblastos, los miofibroblastos son celulas que presentan una diferenciacion intermedia entre fibroblastos y celulas de musculo liso. En muchos organos, como el tngado, el pulmon y el rinon, se encuentran implicadas principalmente en la fibrosis. En los tejidos de la lesion, estan implicados en el fortalecimiento de la lesion (mediante deposicion de fibras extracelulares de colageno) y despues en la contraccion de la herida (mediante contraccion intracelular y alineacion concomitante de las fibras de colageno mediante traccion mediada por integrina de los haces de colageno).

El termino "fibronectina"tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una glucoprotema de matriz extracelular de elevado peso molecular (~440 kDa) que se une a protemas receptores de matriz de superficie celular transmembranales ("integrinas") y a componentes de la matriz extracelular, tales como colageno, fibrina y proteoglicanos de sulfato de heparan (p.ej., sindecanos). La fibronectina existe en forma de un dfmero, que consiste en dos monomeros practicamente identicos unidos mediante una pareja de enlaces disulfuro. Existen multiples isoformas de la fibronectina. La fibronectina plasmatica es soluble y circula en la sangre y otros lfquidos corporales, donde se cree que potencia la coagulacion sangumea, la cicatrizacion de heridas y la fagocitosis. Las demas isoformas se ensamblan sobre la superficie de las celulas y son depositadas en la matriz extracelular como fibrillas de fibronectina altamente insolubles. Las fibrillas de fibronectina que se forman sobre o proximas a la superficie de los fibroblastos habitualmente se alinean con fibras de estres de actina intracelular contiguas, las cuales estimulan el ensamblaje de las moleculas de fibronectina secretadas, formando fibrillas, e influyen sobre la orientacion de las fibrillas. La fibronectina desempena un papel importante en la adhesion celular, crecimiento celular, migracion celular y diferenciacion celular y resulta importante para procesos tales como la cicatrizacion de heridas y el desarrollo embrionario.

El termino "fibrosis" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la formacion o desarrollo de tejido conectivo fibroso en exceso en un organo o tejido como resultado de la lesion o inflamacion de una parte o de la interferencia con su suministro sangumeo. Puede ser una consecuencia de la respuesta de cicatrizacion normal que conduce a una cicatriz, un proceso reactivo anormal o sin causacion conocida o entendida.

El termino "inhalacion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al acto de aspirar hacia el interior con la respiracion un vapor medicado.

El termino "insuflado" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al acto de administrar aire, un gas o unos polvos bajo presion en una cavidad o camara del cuerpo. Por ejemplo, el insuflado nasal se refiere al acto de administrar aire, un gas o unos polvos bajo presion por la nariz.

La expresion "dispositivo de administracion por inhalacion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una maquina/aparato o componente que produce gotas pequenas o un aerosol a partir de una formulacion de aerosol lfquida o de polvos secos y que se utiliza para la administracion por la boca con el fin de conseguir la administracion pulmonar de un farmaco, p.ej., en solucion, polvos y similares. Entre los ejemplos de dispositivo de administracion por inhalacion se incluye, aunque sin limitarse a ellos, un nebulizador, un inhalador de dosis medida y un inhalador de polvos secos (IPS)

El termino "nebulizador" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un dispositivo utilizado para administrar medicacion lfquida en forma de una niebla inhalada en los pulmones.

La expresion "inhalador de dosis medida", "IDM" o "inhalador" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un dispositivo manual presurizado que utiliza propelentes para administrar una cantidad espedfica de medicina ("dosis medida") en los pulmones de un paciente. El termino "propelente" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un material que se utiliza para expulsar una sustancialmente, habitualmente mediante presion de un gas, a traves de una boquilla convergente, divergente. La presion puede ser de un gas comprimido, o de u ngas producido mediante una reaccion qrnmica. El material de expulsion puede ser un gas, lfquido, plasma o, antes de la reaccion qrnmica, un solido, lfquido o gel. Los propelentes utilizados en los inhaladores de dosis medida presurizados son gases licuados, tradicionalmente clorofluorocarburos (CFC) y crecientemente, hidrofluoroalcanos (HFA). Entre los propelentes adecuados se incluyen, por ejemplo, un clorofluorocarburo (CFC), tal como triclorofluorometano (tambien denominado propelente 11), diclorodifluorometano (tambien denominado propelente 12) y 1,2-dicloro-1,1,2,2-tetrafluoroetano (tambien denominado propelente 114), un hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo (HFC), tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (tambien denominado propelente 134a, HFC-134a o HFA-134a) y 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (tambien denominado propelente 227, HFC-227 o HFA-227), dioxido de carbono, eter dimetflico, butano, propano o mezclas de los mismos. En otras realizaciones, el propelente incluye un clorofluorocarburo, un hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo o mezclas de los mismos. En otras realizaciones, se utiliza un hidrofluorocarburo como el propelente. En otras realizaciones, se utiliza HFC-227 y/o HFC-134a como propelente.

La expresion "inhalador de polvos secos" o "IPS" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un dispositivo similar a un inhalador de dosis medida, pero en el que el farmaco se encuentra en forma de polvos. El paciente exhala profundamente, se aplica la boquilla en la boca y seguidamente aspira rapidamente los polvos. Los inhaladores de polvos secos no requieren la temporizacion y coordinacion que son necesarios con las MID.

El termino "partmulas" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un constituyente extremadamente pequeno (p.ej., nanopartmulas, micropartmulas o, en algunos casos, mas grandes) dentro de los cuales, o sobre los cuales, se encuentra la composicion tal como se describe en la presente memoria.

Las expresiones "fibrosis pulmonar", "fibrosis pulmonar idiopatica" y "alveolisis fibrosante criptogenica" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a un componente mayor de la enfermedad pulmonar intersticial caracterizada por la proliferacion anormal de los fibroblastos y la deposicion de protemas de la matriz extracelular que remodelan la estructura normal del tejido pulmonar y comprometen su funcion. Las lesiones caractensticas de la fibrosis pulmonar idiopatica son los focos de fibroblastos. Estos sitios muestran una replicacion vigorosa de las celulas mesenquimatosas y una deposicion exuberante de matriz extracelular nueva.

Las expresiones "loci fibroticos" o "focos fibroticos" tal como se utilizan en la presente memoria intercambiablemente se refieren a una localizacion espedfica en un tejido formado o desarrollado por tejido fibroso excesivo.

La expresion "protema de fusion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una protema o polipeptido construido mediante la combinacion de multiples dominios de protema o polipeptidos con el fin de crear un unico polipeptido o protema con propiedades funcionales derivadas de cada una de las protemas o polipeptidos originales. La creacion de una protema de fusion puede llevarse a cabo ligando o enlazando operativamente dos secuencias de nucleotidos diferentes que codifican cada dominio de protema o polipeptido mediante tecnologfa de ADN recombinante, creando de esta manera una nueva secuencia polinucleotida que codifica la protema de fusion deseada. Alternativamente, puede crearse una protema de fusion mediante la union qmmica de los dominios de protema deseados.

El termino "idiopatico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que aparece espontaneamente o que procede de una causa oscura o desconocida.

El termino "inflamacion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al proceso fisiologico por el que los tejidos vascularizados responden a la lesion. Ver, p.ej., FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 4a ed., William E. Paul, ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia (1999), en 1051-1053, incorporada en la presente memoria como referencia. Durante el proceso inflamatorio, las celulas participates en la destoxificacion y reparacion son movilizadas al sitio de compromiso por mediadores inflamatorios. La inflamacion con frecuencia se caracteriza por una fuerte infiltracion de leucocitos en el sitio de inflamacion, en particular neutrofilos (celulas polimorfonucleares). Estas celulas fomentan el dano en los tejidos mediante la liberacion de sustancias toxicas en la pared vascular o en tejido no lesionado. Tradicionalmente, la inflamacion se ha dividido en respuestas agudas y respuestas cronicas.

La expresion "inflamacion aguda" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la respuesta relativamente uniforme rapida, corta (minutos a dfas) frente a la lesion aguda, caracterizada por acumulaciones de lfquido, protemas plasmaticas y leucocitos neutrofilos. Entre los ejemplos de agentes perjudiciales que causan inflamacion aguda se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, patogenos (p.ej., bacterias, virus, parasitos), cuerpos foraneos de origen exogeno (p.ej., amianto) o endogeno (p.ej., cristales de urato, complejos inmunologicos) y agentes ffsicos (p.ej., quemaduras) o qmmicos (p.ej., causticos).

La expresion "inflamacion cronica" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la inflamacion de duracion mas larga y que presenta un final vago e indefinido. La inflamacion cronica empieza dominar cuando persiste la inflamacion aguda, mediante la eliminacion completa del agente inflamatorio inicial (p.ej., el tabaquismo de cigarrillos) o como consecuencia de multiples sucesos agudos que se producen en el mismo sitio. La inflamacion cronica, que incluye el flujo de entrada de linfocitos y macrofagos y el crecimiento de fibroblastos, puede resultar en tejido cicatricial en sitios de actividad inflamatoria prolongada o repetida.

La expresion "mediadores inflamatorios" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a los mediadores moleculares de los procesos inflamatorio e inmunologico. Estas moleculas difundibles solubles actuan tanto localmente en el sitio del dano e infeccion del tejido como en sitios mas distantes. Algunos mediadores inflamatorios resultan activados por el proceso inflamatorio, mientras que otros son sintetizados y/o liberados a partir de fuentes celulares en respuesta a la inflamacion aguda o por otros mediadores inflamatorios solubles; todavfa otros muestran propiedades antiinflamatorias. Entre los ejemplos de mediadores inflamatorios de la respuesta inflamatoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, proteasas plasmaticas, complemento, quininas, protemas de coagulacion y fibrinolfticas, mediadores lipfdicos, prostaglandinas, leucotrienos, factor activador de plaquetas (FAP), peptidos, hormonas (incluyendo hormonas esteroideas, tales como glucocorticoides) y aminas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, histamina, serotonina y neuropeptidos, y citoquinas proinflamatorias, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, interleuquina-1-beta (IL-1p), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-8 (IL-8), factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a), interferon-gamma (IF-y), interleuquina-12 (IL-12) e interleuquina-17 (IL-17).

Entre los mediadores proinflamatorios, es conocido que IL-1, IL-6 y TNF-a activan hepatocitos en una respuesta de etapa aguda, sintetizando protemas de etapa aguda que activan el complemento. El complemento es un sistema de protemas plasmaticas que interactuan con patogenos para marcarlos para la destruccion por fagocitos. Las protemas del complemento pueden ser activadas directamente por patogenos o indirectamente por anticuerpos unidos a patogenos, conduciendo a una cascada de reacciones que se producen sobre la superficie de los patogenos y generan componentes activos con diversas funciones efectoras. IL-1, IL-6 y TNF-a tambien activan el endotelio de la medula osea, movilizando neutrofilos, y funcionan como pirogenos endogenos, elevando la temperatura corporal, que ayuda a eliminar infecciones del cuerpo. Un ejemplo mayor de las citoquinas es la accion sobre el hipotalamo, alterando la regulacion de la temperatura corporal, y sobre las celulas musculares y adiposas, estimulando el catabolismo de las celulas musculares y adiposas para elevar la temperatura corporal. A temperaturas elevadas, se reduce la replicacion bacteriana y vmica, mientras que el sistema inmunologico adaptativo funciona mas eficientemente.

La expresion "factor de necrosis tumoral" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una citoquina producida por globulos blancos en respuesta a un antigeno o infeccion, que induce necrosis (muerte) de celulas tumorales y posee un amplio abanico de acciones proinflamatorias. El factor de necrosis tumoral tambien es una citoquina multifuncional con efectos sobre el metabolismo de los lfpidos, la coagulacion, la resistencia a la insulina y la funcion de las celulas endoteliales que revisten los vasos sangumeos.

El termino "interleuquina (IL)" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una citoquina de una clase de protemas relacionadas homologamente que se observo por primera vez que eran secretadas por leucocitos y actuaban sobre los mismos. Desde entonces se ha encontrado que las interleuquinas son producidas por una amplia diversidad de celulas corporales. Las interleuquinas regulan el crecimiento, diferenciacion y motilidad celular, y estimulan respuestas inmunologicas, tales como la inflamacion. Entre los ejemplos de interleuquinas se incluyen interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-1p (IL-1p), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-8 (IL-8), interleuquina-12 (IL-12) e interleuquina-17 (IL-17).

Los terminos "inhibiendo", "inhibir" o "inhibicion" se utilizan en la presente memoria para referirse a reducir la cantidad o tasa de un proceso, a detener el proceso por completo, o a reducir, limitar o bloquear la accion o funcion del mismo. La inhibicion puede incluir una reduccion o decremento de la cantidad, tasa, accion, funcion o proceso de una sustancia en por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98%, o por lo menos 99%.

El termino "inhibidor" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una segunda molecula que se une a una primera molecula, reduciendo de esta manera la actividad de la primera molecula. Los inhibidores enzimaticos son moleculas que se unen a enzimas, reduciendo de esta manera la actividad enzimatica. La union de un inhibidor puede detener la entrada de un sustrato en el sitio activo del enzima y/o dificultar la catalisis de la reaccion por parte del enzima. La union del inhibidor es reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles habitualmente reaccionan con el enzima y lo modifican qmmicamente, por ejemplo mediante la modificacion de residuos aminoacidos clave necesarios para la actividad enzimatica. En contraste, los inhibidores reversibles se unen no covalentemente y producen diferentes tipos de inhibicion dependiendo de si estos inhibidores se unen al enzima, al complejo de enzimasustrato o a ambos. Los inhibidores enzimaticos con frecuencia se evaluan para su especificidad y potencia.

El termino "lesion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un dano o perjuicio a una estructura o funcion del cuerpo causado por un agente o fuerza externo, que puede ser ffsico o qrnmico.

El termino "aislado" se utiliza en la presente memoria para referirse a un material, tal como, aunque sin limitacion, un acido nucleico, peptido, polipeptido o protema, que: (1) se encuentra sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompanan o interactuan con el mismo tal como se encuentra en su medio natural. Las expresiones "sustancialmente libre" o "esencialmente libre" se utilizan en la presente memoria para referirse a considerable o significativamente libre de, o mas de aproximadamente 95% libre de, o mas de aproximadamente 99% libre de tales componentes. El material aislado opcionalmente comprende material que no se observa junto con el material en su medio natural, o (2) en el caso de que el material se encuentre en su medio natural, material que ha sido alterado sinteticamente (no naturalmente) mediante intervencion humana deliberada para formar una composicion y/o que ha sido introducido en una localizacion en la celula (p.ej., genoma u organulo subcelular) no nativo para un material observado en ese medio. La alteracion para rendir el material sintetico puede llevarse a cabo en el material en su estado natural o extrafdo de su estado natural. Por ejemplo, un acido nucleico natural se convierte en un acido nucleico aislado en el caso de que sea alterado o de que se transcriba a partir de ADN que ha sido alterado, mediante intervencion humana realizada dentro de la celula a partir de la que se origina. Ver, por ejemplo, Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, patente US n° 5.565.350; In Vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling et al., PCT/US93/03868, cada una incorporada en la presente memoria como referencia en su totalidad. De manera similar, un acido nucleico natural (por ejemplo, un promotor) se convierte en aislado en el caso de que se introduzca por medios no naturales en un locus del genoma no nativo a dicho acido nucleico. Los acidos nucleicos que son "aislados" tal como se define en la presente memoria tambien se denominan acidos nucleicos "heterologos".

El termino "quinasa" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un tipo de enzima que transfiere grupos fosfato desde moleculas donantes de alta energfa a moleculas o sustratos diana espedficos. Entre los grupos donantes de alta energfa pueden incluirse, aunque sin limitacion, ATP.

El termino "leucocito" o "globulo blanco (GB)" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un tipo de celula inmunologica. La mayona de leucocitos se generan en la medula osea y se encuentran en la sangre y tejido linfatico. Los leucocitos ayudan al cuerpo a combatir infecciones y otras enfermedades. Los granulocitos, monocitos y linfocitos son leucocitos.

El termino "linfocitos" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a globulos blancos (leucocitos) pequenos que desempenan un gran papel en la defensa del cuerpo frente a enfermedades. Existen dos tipos principales de linfocito: celulas B y celulas T. Las celulas B generan anticuerpos que atacan las bacterias y toxinas, mientras que las celulas T mismas atacan celulas corporales que han sido dominadas por virus o que se han vuelto cancerosas. Los linfocitos secretan productos (linfoquinas) que modulan las actividades funcionales de muchos otros tipos de celulas y con frecuencia se encuentran presentes en sitios de inflamacion cronica.

El termino "macrofago" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un tipo de globulo blanco que circunda y mata microorganismos, elimina celulas muertas y estimula la accion de otras celulas del sistema inmunologico. Tras digerir un patogeno, un macrofago presenta un antfgeno (una molecula, con mas frecuencia una protema observada sobre la superficie del patogeno, utilizada por el sistema inmunologico para la identificacion) del patogeno a la celula T ayudante correspondiente. La presentacion se lleva a cabo mediante su integracion en la membrana celular y mostrandola unida a una molecula del CMH de clase II, indicando a otros globulos blancos que el macrofago no es un patogeno, a pesar de presentar antfgenos sobre su superficie. Eventualmente, la presentacion de antfgeno resulta en la produccion de anticuerpos que se unen a los antfgenos de los patogenos, facilitando la adhesion de los macrofagos a su membrana celular y la fagocitosis.

La expresion "celula mesenquimatosa" o "mesenquima" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una celula derivada de las tres capas germinales, que puede desarrollarse en tejido conectivo, hueso, carfflago, el sistema linfatico y el sistema circulatorio.

La expresion "quinasa MK2" o "MK2" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (tambien denominada "MAPKAPK2", "MAPKAP-K2" o "MK2"), que es un miembro de la familia de serina/proteasa (Ser/Thr) protema quinasas.

La expresion "diametro aerodinamico de la mediana de la masa" o "DAMM" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la mediana de la distribucion de masas de partmula en suspension en el aire con respecto al diametro aerodinamico. Las DAMM habitualmente se acompanan de la desviacion estandar geometrica (g o sigma-g), que caracteriza la variabilidad de la distribucion de tamanos de partmula.

El termino "modular" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a regular, alterar, adaptar o ajustar a una determina medida o proporcion.

El termino "monocito" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un tipo de celula inmunologica que se produce en la medula osea y que viaja por la sangre a los tejidos en el cuerpo, en donde se convierte en un macrofago. Un monocito es un tipo de globulo blanco y un tipo de fagocito.

El termino "neutrofilos" o "neutrofilos polimorfonucleares (PMN)" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al tipo mas abundante de globulo blanco en los mairnferos, que forma una parte esencial del sistema inmunologico innato. Forman parte de la familia de celulas polimorfonucleares (PMN) junto con los basofilos y eosinofilos. Los neutrofilos normalmente se encuentran en el torrente sangumeo. Durante la etapa inicial (aguda) de la inflamacion, en particular como resultado de la infeccion bacteriana y algunos canceres, los neutrofilos son uno de los primeros respondedores de entre las celulas inflamatorias, migrando hacia el sitio de la inflamacion. Migran por los vasos sangumeos, y despues por el tejido intersticial, siguiendo senales qmmicas tales como la interleuquina-8 (IL-8) y C5a en un proceso denominado quimiotaxis, el movimiento dirigido de una celula o parte movil a lo largo de un gradiente de concentracion qmmica hacia condiciones ambientales que considera atractivas y/o alejandose de medios que encuentra repelentes.

La expresion "sujeto de control sano normal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un sujeto que no manifiesta smtomas u otra evidencia clmica de enfermedad de las vfas respiratorias o tejidos pulmonares.

La expresion "acido nucleico" se utiliza en la presente memoria para referirse a un polfmero desoxirribonucleotido o ribonucleotido en forma de cadena sencilla o de doble cadena, y a menos que se encuentre limitado de otro modo, comprende analogos conocidos con la naturaleza esencial de los nucleotidos naturales en el aspecto de que se hibridan con acidos nucleicos de cadena sencilla de una manera similar a los nucleotidos naturales (p.ej.., los acidos peptido-nucleicos).

El termino "nucleotido" se utiliza en la presente memoria para referirse a un compuesto qmmico que consiste en una base heterodclica, un azucar y uno o mas grupos fosfato. En los nucleotidos mas comunes, la base es un derivado de purina o pirimidina, y el azucar es la pentosa desoxirribosa o ribosa. Los nucleotidos son los monomeros de los acidos nucleicos, uniendose tres o mas entre sf con el fin de formar un acido nucleico. Los nucleotidos son las unidades estructurales del ARN, ADN y varios cofactores, incluyendo, aunque sin limitacion, CoA, FAD, DMN, NAD y NADP. Entre las purinas se incluyen adenina (A) y guanina (G); entre las pirimidinas se incluyen citosina (C), timidina (T) y uracilo (U).

Las expresiones siguientes se utilizan en la presente memoria para describir las relaciones de secuencia entre dos o mas acidos nucleicos o polinucleotidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparacion", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia", y (e) "identidad sustancial".

(a) La expresion "secuencia de referencia" se refiere a una secuencia utilizada como base para la comparacion entre secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subgrupo o la totalidad de una secuencia especificada, por ejemplo, como segmento de un ADNc de longitud completa o secuencia genica, o el ADNc o secuencia genica completa.

(b) La expresion "ventana de comparacion" se refiere a un segmento contiguo y especificado de una secuencia polinucleotida, en la que la secuencia polinucleotida puede compararse con una secuencia de referencia y en la que la parte de la secuencia polinucleotida en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineacion optima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparacion presenta una longitud de por lo menos 20 nucleotidos contiguos y opcionalmente puede presentar una longitud de por lo menos 30 nucleotidos contiguos, de por lo menos 40 nucleotidos contiguos, de por lo menos 50 nucleotidos contiguos, de por lo menos 100 nucleotidos contiguos, o mas largo. El experto en la materia entendera que para evitar una similitud elevada a una secuencia de referencia debido a la inclusion de huecos en la secuencia polinucleotida, tfpicamente se introduce una penalizacion de hueco y se resta del numero de emparejamientos.

Los metodos de alineacion de secuencias para la comparacion son bien conocidos de la tecnica. La alineacion optima de secuencias para la comparacion puede llevarse a cabo mediante el algoritmo de homologfas locales de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981); mediante el algoritmo de alineacion de homologfas de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970), mediante el metodo de busqueda de similitudes de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988); mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos, incluyendo, aunque sin limitacion: CLUSTAL en el programa Pc/Gene de Intelligenetics, Mountain View, Calif.; GAP, Be STFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., USA; el programa CLUSTAL esta bien descrito en Higgins y Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-65 (1992), and Pearson, et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994). La familia BLAST de programas, que puede utilizarse para busquedas de similitud de secuencias, incluye: BLASTN para secuencias de nucleotidos problema en base de datos de secuencias de nucleotidos; BLASTX para secuencias de nucleotidos problema en base de datos de secuencias de protemas; BLASTP para secuencias de protema problema en base de datos de secuencias de protema; TBLASTN para secuencias de protema problema en base de datos de secuencias de nucleotidos, y TBLASTX para secuencias de nucleotidos problema en base de datos de secuencias de nucleotidos. Ver Current Protocols in Molecular Biology, capftulo 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).

A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencias proporcionados en la presente memoria se refieren al valor obtenido utilizando el paquete BLAST 2.0 de programas utilizando parametros por defecto. Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). El software para llevar a cabo los analisis de BLAST se encuentra disponible publicamente, p.ej. a traves de la informacion del National for Biotechnology Este algoritmo implica identificar en primer lugar las parejas de secuencias de alta puntuacion (PAP) mediante la identificacion de palabras cortas de longitud W en la secuencia de pregunta que corresponden o satisfacen alguna puntuacion umbral T de valor positivo estando alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina umbral de puntuacion de palabra vecina (Altschul et al., supra). Estos resultados iniciales de palabras vecinas actuan como semillas para iniciar busquedas de PAP mas largas que las contengan. A continuacion, los resultados de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como pueda incrementarse la puntuacion acumulada de alineacion. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleotidos, los parametros M (puntuacion de premio para una pareja de residuos correspondientes, siempre >0) y N (puntuacion de penalizacion para residuos no correspondientes, siempre <0). Para las secuencias de aminoacidos, se utiliza una matriz de puntuacion para calcular la puntuacion acumulada. La extension de resultados de palabra en cada direccion se detiene cuando: la puntuacion acumulada de alineacion cae en una cantidad X respecto al valor maximo alcanzado; la puntuacion acumulada va a cero o menos debido a la acumulacion de una o mas alineaciones de residuos de puntuaciones negativas, o se alcanza el final de cualquiera de las dos secuencias. Los parametros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineacion. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) utiliza como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, un valor esperado (E) de 100, M=5, N=-4 y una comparacion de ambas cadenas. Para secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP utiliza como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 3, un valor esperado (E) de 10, y la matriz de puntuaciones BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

Ademas de calcular el porcentaje de identidad de secuencias, el algoritmo BLAST tambien lleva a cabo un analisis estadfstico de la similitud entre dos secuencias (ver, p.ej., Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma mas pequena (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad de que una correspondencia entre dos secuencias de nucleotidos o de aminoacidos se produzca por azar. Las busquedas de BLAST suponen que las protemas pueden modelarse como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas protemas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias que pueden sertramos homopolimericos, repeticiones de periodo corto, o regiones enriquecidas en uno o mas aminoacidos. Tales regiones de baja complejidad pueden alinearse entre protemas no relacionadas, aunque otras regiones de las protemas sean totalmente diferentes. Pueden utilizarse varios programas de filtracion de baja complejidad para reducir tales alineaciones de baja complejidad. Por ejemplo, los filtros de baja complejidad SEG (Wooten y Federhen, Comput. Chem., 17:149-163 (1993)) y XNU (Claverie and States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993)) pueden utilizarse solos o en combinacion.

(c) La expresion "identidad de secuencias" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de acidos nucleicos o polipeptfdicas se utiliza en la presente memoria para referirse a los residuos en las dos secuencias que son iguales al alinearse para correspondencia maxima a lo largo de una ventana de comparacion espedfica. En el caso de que se utilice el porcentaje de identidad de secuencias en referencia a protemas, se reconoce que las posiciones de residuos que no son identicas con frecuencia difieren en sustituciones de aminoacidos conservadoras, es decir, donde se sustituyen residuos aminoacidos por otros residuos aminoacidos con propiedades qmmicas similares (p.ej., carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no cambian las propiedades funcionales de la molecula. Donde las secuencias difieran en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencias puede ajustarse a mayor para corregir la naturaleza conservadora de la sustitucion. Las secuencias que difieren por tales sustituciones conservadoras se afirma que presentan "similitud de secuencias" o "similitud". Los metodos para llevar a cabo dicho ajuste son bien conocidos por el experto en la materia. Tfpicamente ello implica puntuar una sustitucion conservadora como parcial y no como una no correspondencia completa, incrementando de esta manera el porcentaje de identidad de secuencias. De esta manera, por ejemplo, donde un aminoacido identico reciba una puntuacion de 1 y una sustitucion no conservadora reciba una puntuacion de cero, una sustitucion conservadora recibe una puntacion de entre cero y 1. La puntacion de las sustituciones conservadoras se calcula, p.ej., segun el algoritmo de Meyers y Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4:11-17 (1988) p.ej. tal como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., USA).

(d) La expresion "porcentaje de identidad de secuencias" se utiliza en la presente memoria para referirse al valor determinado mediante la comparacion de dos secuencias alineadas optimamente en una ventana de comparacion, en la que la parte de la secuencia polinucleotida en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineacion optima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el numero de posiciones en las que se observa una base de acidos nucleicos o residuo aminoacido identico en ambas secuencias, rindiendo el numero de posiciones correspondientes, dividiendo el numero de posiciones correspondientes por el numero total de posiciones en la ventana de comparacion y multiplicando el numero por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias.

(e) La expresion "identidad sustancial" de secuencias polinucleotidas se refiere a que un polinucleotido comprende una secuencia que presenta una identidad de secuencias de por lo menos 70%, de por lo menos 80%, de por lo menos 90% y de por lo menos 95% en comparacion con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineacion descrito utilizando parametros estandares. El experto en la materia reconocera que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de protemas codificadas por dos secuencias de nucleotidos considerando la degeneracion de los codones, la similitud de los aminoacidos, el posicionamiento del marco de lectura y similares. La identidad sustancial de las secuencias de aminoacidos con estos fines normalmente se refiere a una identidad de secuencia de por lo menos 60%, o de por lo menos 70%, de por lo menos 80%, de por lo menos 90% o de por lo menos 95%. Otra indicacion de que las secuencias de nucleotidos son sustancialmente identicas es que las dos moleculas se hibridan entre sf bajo condiciones restrictivas. Sin embargo, los acidos nucleicos que no se hibridan entre sf bajo condiciones restrictivas todavfa son sustancialmente identicos si los polipeptidos que codifican son sustancialmente identicos. Ello puede ocurrir, p.ej., al crear una copia de un acido nucleico utilizando la degeneracion de codones maxima permitida por el codigo genetico. Una indicacion de que dos secuencias de acidos nucleicos son sustancialmente identicas es que el polipeptido que codifica el primer acido nucleico presenta reactividad inmunologica cruzada con el polipeptido codificado por el segundo acido nucleico.

La expresion "operativamente ligado" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al ligamiento en el que dos o mas dominios de protema o polipeptidos estan ligados o combinados mediante tecnologfa de ADN recombinante o reaccion qrnmica de manera que cada dominio de protema o polipeptido de la protema de fusion resultante conserva su funcion original. Por ejemplo, la SEC ID n° 1 esta construido ligando operativamente un peptido penetrante de celulas (SEC ID n° 11) con un dominio terapeutico (SEC ID n° 2), creando de esta manera un peptido de fusion que posee tanto la funcion penetrante de celulas de la SEC ID n° 11 como la funcion inhibidora de quinasa de la SEC ID n° 2.

El termino "parenquima" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un tejido animal que constituye la parte esencial de un organo en contraposicion a tejido conectivo o vasos sangumeos. El termino "parenquimatoso" se refiere a relativo al parenquima de un organo.

El termino "parenteral" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la introduccion en el cuerpo mediante una inyeccion (es decir, administracion mediante inyeccion), incluyendo, por ejemplo, por via subcutanea (es decir, una inyeccion bajo la piel), intramuscular (es decir, una inyeccion en un musculo), intravenosa (es decir, una inyeccion en una vena), intratecal (es decir, una inyeccion en el espacio en torno a la medula espinal o bajo la membrana aracnoide del cerebro), inyeccion intrasternal o tecnicas de infusion, e incluyendo la inyeccion intraperitoneal o la infusion en la cavidad corporal (p.ej., el peritoneo). Una composicion administrada por via parenteral se administra utilizando una aguja, p.ej., una aguja quirurgica, u otro dispositivo de acceso corporal. La expresion "aguja quirurgica", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier dispositivo de acceso adaptado para la administracion de composiciones Uquidas (es decir, capaces de fluir) en una estructura anatomica seleccionada. Las preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables esteriles, pueden formularse segun la tecnica conocida, utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspension adecuados.

El termino "particulado" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a partmulas finas de materia solida o lfquida suspendidas en un gas o lfquido.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "portador farmaceuticamente aceptable" se refiere a cualquier portador sustancialmente no toxico utilizable convencionalmente para la administracion de farmaceuticos en los que el polipeptido aislado de la presente invencion se mantiene estable y biodisponible. El portador farmaceuticamente aceptable debe ser de pureza suficientemente elevada y de toxicidad suficientemente baja para que resulte adecuado para la administracion en el mairnfero bajo tratamiento. Debe mantener ademas la estabilidad y biodisponibilidad del agente activo. El portador farmaceuticamente aceptable puede ser lfquido o solido y se selecciona, considerando la manera planificada de administracion, para proporcionar el volumen, consistencia, etc. deseados en combinacion con un agente activo y otros componentes de una composicion dada.

La expresion "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que, dentro del alcance del criterio medico razonable, resultan adecuadas para la utilizacion en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin toxicidad, irritacion, respuesta alergica y similares excesivos, y acordes con una proporcion de beneficio/riesgo razonable.

Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protema" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a un polfmero de residuos aminoacidos. Los terminos se aplican a polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos aminoacidos son analogos qmmicos artificiales de un aminoacido natural correspondiente, asf como polfmeros de aminoacidos naturales. La naturaleza esencial de tales analogos de aminoacidos naturales es que, al incorporarlos en una protema, dicha protema es espedficamente reactiva con anticuerpos inducidos contra la misma protema pero consistentes completamente de aminoacidos naturales.

Los terminos "polipeptido" y "protema" tambien se utilizan en la presente memoria en su sentido mas amplio para referirse a una secuencia de subunidades aminoacidos, analogos de aminoacidos o peptidomimeticos. Las subunidades se unen mediante enlaces peptfdicos, excepto en donde se indique lo contrario. Los polipeptidos descritos en la presente memoria pueden sintetizarse qmmicamente o expresarse recombinantemente. Los polipeptidos de la invencion descrita tambien pueden sintetizarse qmmicamente. Los polipeptidos sinteticos, preparados utilizando tecnicas bien conocidas de fase solida, fase lfquida o tecnicas de condensacion de peptidos, o cualquier combinacion de los mismos, pueden incluir aminoacidos naturales y no naturales. Los aminoacidos utilizados para la smtesis de peptidos pueden ser estandares Boc (N-a-t-butiloxicarbonilo protegido con N-a-amino) en resina con los protocolos estandares de desproteccion, neutralizacion, acoplamiento y lavado del procedimiento de fase solida original de Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154), o los aminoacidos 9-fluorenilmetoxicarbonilo protegidos con N-a-amino labiles frente a bases, descritos por primera vez por Carpino y Han (1972, J. Org. Chem.

37:3403-3409). Pueden obtenerse aminoacidos protegidos tanto con Fmoc como con Boc N-a-amino, de Sigma, Cambridge Research Biochemical, o de otras compares qmmicas que resulten familiares al experto en la materia. Ademas, pueden sintetizarse polipeptidos con otros grupos protectores N-a que resulten familiares al experto en la materia. La smtesis peptfdica en fase solida puede llevarse a cabo mediante tecnicas que resulten familiares para el experto en la materia y proporcionadas en, por ejemplo, Stewart y Young, 1984, Solid Phase Synthesis, segunda edicion, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.; Fields y Noble, 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214, o utilizando sintetizadores automatizados. Los polipeptidos de la invencion pueden comprender D-aminoacidos (que son resistentes a las proteasas espedficas de L-aminoacidos in vivo), una combinacion de D-aminoacidos y L-aminoacidos, y diversos aminoacidos "de diseno" (p.ej., p-metil-aminoacidos, C-a-metil-aminoacidos y N-ametilaminoacidos, etc.) para proporcionar propiedades especiales. Entre los aminoacidos sinteticos se incluyen la ornitina para la lisina, y la norleucina para la leucina o la isoleucina. Ademas, los polipeptidos pueden presentar enlaces peptidomimeticos, tales como enlaces ester, para preparar peptidos con propiedades nuevas. Por ejemplo, puede generarse un peptido que incorpore un enlace peptfdico reducido, es decir, R1-CH²-NH-R2, donde R1 y R2 son residuos o secuencias de aminoacidos. Puede introducirse un enlace peptfdico reducido como subunidad dipeptido. Tal polipeptido sena resistente a la actividad de proteasa y poseena una semivida in vivo prolongada. De acuerdo con lo anterior, estos terminos se aplican a polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos aminoacidos son analogos qmmicos artificiales de un aminoacido natural correspondiente, asf como polfmeros de aminoacidos naturales. La naturaleza esencial de tales analogos de aminoacidos naturales es que, al incorporarlos en una protema, dicha protema es espedficamente reactiva con anticuerpos inducidos contra la misma protema pero consistentes completamente de aminoacidos naturales.

Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protema" tambien incluyen modificaciones, entre las que se encuentran, aunque sin limitarse a ellas, la glucosilacion, la union de lfpidos, la sulfatacion, la gamma-carboxilacion de residuos de acido glutamico, la hidroxilacion y la ADP-ribosilacion. Se apreciara que es bien conocido y tal como se indica posteriormente, que los polipeptidos pueden no ser completamente lineales. Por ejemplo, los polipeptidos pueden ser ramificados como resultado de la ubiquitinacion, y pueden ser circulares, con o sin ramificacion, generalmente como resultado de sucesos post-traduccionales, incluyendo sucesos de procesamiento naturales y sucesos producidos por la manipulacion humana que no se producen naturalmente. Los polipeptidos circulares, ramificados y circulares ramificados pueden sintetizarse mediante un procedimiento natural no de traduccion y tambien mediante metodos completamente sinteticos. En algunas realizaciones, el peptido presenta cualquier longitud o tamano.

El termino "proenzima" o "zimogeno" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un precursor enzimatico inactivo. Un zimogeno requiere un cambio bioqmmico (tal como una reaccion de hidrolisis que revela el sitio activo, o la modificacion de la configuracion para revelar el sitio activo) para que se convierta en un enzima activo. El cambio bioqmmico habitualmente se produce en un lisosoma, donde una parte espedfica del enzima precursor es cortada con el fin de activarlo. La cadena de aminoacidos que es liberada con la activacion se denomina peptido de activacion.

El termino "proliferacion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la expansion de una poblacion de celulas mediante la division continua de celulas individuales en celulas hija identicas.

La expresion "intersticio pulmonar" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al tejido y espacio en torno a los sacos aereos de los pulmones.

La expresion "alveolo pulmonar" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una estructura anatomica que presenta la forma de una cavidad hueca. Los alveolos se localizan en la zona respiratoria de los pulmones, en el extremo distal de los conductos alveolares y auriculas, formando el punto terminal del tracto respiratorio. Los alveolos pulmonares son salientes esfericos de los sitios respiratorios de intercambio gaseoso con la sangre y solo se observan en los pulmones de los mairnferos. La membrana alveolar es la superficie de intercambio gaseoso. La sangre transporta dioxido de carbono del resto del cuerpo para la liberacion en los alveolos, y el oxfgeno en los alveolos es incorporado por la sangre en los vasos sangmneos alveolares, para el transporte a todas las celulas en el cuerpo. Los alveolos contienen algunas fibras de colageno y elasticas. Las fibras elasticas permiten que los alveolos se estiren al llenarse de aire al inspirar. A continuacion, recuperan su forma durante la espiracion a fin de expulsar el aire rico en dioxido de carbono. Existen tres tipos celulares alveolares principales en la pared alveolar, (1) celulas alveolares escamosas que forman la estructura de la pared alveolar, (2) celulas alveolares grandes que secretan surfactante pulmonar para reducir la tension superficial del agua y permitir la separacion de la membrana, incrementando de esta manera la capacidad de intercambio de gases, (3) macrofagos que destruyen los patogenos foraneos, tales como bacterias.

El termino "similar" se utiliza intercambiablemente con terminos analogos, comparables o similares, es decir que presentan rasgos o caracteristicas en comun.

El termino "solucion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una mezcla homogenea de dos o mas sustancias. Frecuentemente, aunque no necesariamente, es un lfquido. En una solucion, las moleculas del soluto (o sustancia disuelta) estan distribuidas uniformemente entre las del solvente.

Los terminos "soluto" y "solubilidad" se refieren a la propiedad de ser susceptible de disolverse en un lfquido espedfico (solvente). El termino "insoluble" se refiere a la propiedad de un material que presenta una solubilidad minima o limitada en un solvente espedfico. En una solucion, las moleculas del soluto (o sustancia disuelta) estan distribuidas uniformemente entre las del solvente.

La expresion "fibra de estres" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una estructura de orden elevado en celulas que consisten en filamentos de actina, protemas entrecruzantes (protemas que unen a dos o mas filamentos entre sf) y motoras de miosina II. La actina es una protema globular (~43 kDa) que polimeriza y forma una estructura de filamentos ordenados que presenta dos protofilamentos que se entrelazan entre sf formando un unico "filamento de actina" tambien conocido como "microfilamento". Las motoras de miosina en las fibras de estres de mueven, haciendo deslizarse los filamentos de actina unos respecto a otros, de manera que la fibra pueda contraerse. Con el fin de que la contraccion genere fuerzas, las fibras deben anclarse a algo. Las fibras de estres pueden anclarse a la membrana celular y frecuentemente los sitios en donde se produce este anclaje tambien se conectan a estructuras fuera de la celula (la matriz o algun otro sustrato). Estos sitios de conexion se denominan adhesiones focales. Resultan necesarias muchas protemas para la produccion y mantenimiento correctos de la adhesion focal. La contraccion contra estos sustratos externos fijos es lo que permite que la fuerza generada por las motoras de miosina y el crecimiento y reorganizacion de filamentos mueva y cambie la forma de la celula.

El termino "suspension" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una dispersion (mezcla) en la que se combina una especie finamente dividida con otra especie, estando la primera tan finamente dividida y mezclada que no sedimenta con rapidez. En la vida cotidiana, las suspensiones mas comunes son las de solidos en lfquido.

Los terminos "sujeto", "individuo" y "paciente" se utilizan intercambiablemente para referirse a un miembro de una especie animal de origen marnffero, incluyendo, aunque sin limitacion, un raton, una rata, un gato, una cabra, una oveja, un caballo, un hamster, un huron, un ornitorrinco, un cerdo, un perro, un cobaya, un conejo y un primate, tal como, por ejemplo, un mono, simio o ser humano.

La expresion "sujeto que necesita de dicho tratamiento" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un paciente que sufre de una enfermedad, trastorno, condicion o proceso patologico. En algunas realizaciones, la expresion "sujeto que necesita de dicho tratamiento" tambien se utiliza para referirse a un paciente que: (i) recibira la administracion de por lo menos un polipeptido de la invencion, (ii) recibe por lo menos un polipeptido de la invencion, o (iii) ha recibido por lo menos un polipeptido de la invencion, a menos que el contexto y uso de la expresion indique lo contrario.

El termino "sustitucion" se utiliza en la presente memoria para referirse a una situacion en la que se intercambia una base o bases por otra base o bases en una secuencia de ADN. Las sustituciones pueden ser sustituciones sinonimas o sustituciones no sinonimas. Tal como se utiliza en la presente memoria, "sustituciones sinonimas" se refiere a sustituciones de una base por otra en un exon de un gen codificante de una protema, de manera que la secuencia de aminoacidos producida no resulte modificada. La expresion "sustituciones no sinonimas" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a sustituciones de una base por otra en un exon de un gen codificante de una protema, de manera que la secuencia de aminoacidos producida resulte modificada.

Las expresiones "cantidad terapeutica", una "cantidad eficaz", o "cantidad farmaceuticamente eficaz" de un agente activo se utilizan intercambiablemente para referirse a una cantidad que resulta suficiente para proporcionar el beneficio de tratamiento deseado. Por ejemplo, la "cantidad terapeutica" de una composicion inhibidora de quinasa de la invencion descrita incluye, aunque sin limitacion, una cantidad suficiente: (1) para eliminar o reducir el tamano de por lo menos un locus fibrotico, o (2) para reducir la tasa de deposicion de matriz extracelular, incluyendo colageno y fibronectina, en los intersticios en los pulmones de un paciente de fibrosis pulmonar. El termino comprende ademas una cantidad suficiente para suprimir o aliviar por lo menos un smtoma de un paciente de fibrosis pulmonar, en el que el smtoma incluye, aunque sin limitarse a ellos, saturacion de oxfgeno, disnea (dificultad para respirar), tos no productiva (referida a la expulsion ruidosa subita de aire de los pulmones que puede estar causada por irritacion o inflamacion y que no elimina esputo del tracto respiratorio), hipocratismo digital (una desfiguracion de los dedos, que adquieren una apariencia bulbosa) y crepitaciones (sonido crepitante en los pulmones durante la inhalacion, ocasionalmente denominadas estertores o crepitaciones).

Una cantidad eficaz de un agente activo que puede utilizarse segun la invencion descrita generalmente se encuentra comprendida entre generalmente aproximadamente 0,001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 g/kg de peso corporal. Sin embargo, los niveles de dosis se basan en una diversidad de factores, incluyendo el tipo de lesion, la edad, peso, sexo, condicion medica del paciente, la severidad de la condicion, la via y frecuencia de administracion y el agente activo particular utilizado. De esta manera, el regimen de administracion puede variar ampliamente, pero puede ser determinado rutinariamente por el medico utilizando metodos estandares.

El termino "tratar" o "tratamiento" incluye anular, sustancialmente inhibir, retrasar o revertir el avance de una enfermedad, condicion o trastorno, sustancialmente aliviando los smtomas clmicos o esteticos de una condicion, sustancialmente evitando la aparicion de smtomas clmicos o esteticos de una enfermedad, condicion o trastorno, y proteger de smtomas perjudiciales o molestos. El tratamiento se refiere ademas a conseguir uno o mas de los siguientes: (a) reducir la severidad del trastorno, (b) limitar el desarrollo de smtomas caractensticos del trastorno o trastornos bajo tratamiento, (c) limitar el agravamiento de los smtomas caractensticos del trastorno o trastornos bajo tratamiento, (d) limitar la recurrencia del trastorno o trastornos en pacientes que previamente han experimentado el trastorno o trastornos, y (e) limitar la recurrencia de smtomas en pacientes que anteriormente eran asintomaticos para el trastorno o trastornos.

Los terminos "variantes", "mutantes" y "derivados" se utilizan en la presente memoria para referirse a secuencias de nucleotidos o polipeptfdicas con identidad sustancial respecto a una secuencia de nucleotidos o polipeptfdica de referencia. Las diferencias en las secuencias pueden ser el resultado de cambios, naturales o de diseno, de secuencia o estructura. Pueden producirse cambios naturales durante el curso de la replicacion o duplicacion normal en la naturaleza de la secuencia de acidos nucleicos particular. Pueden disenarse e introducirse espedficamente cambios disenados en la secuencia con fines espedficos. Tales cambios espedficos pueden llevarse a cabo in vitro utilizando una diversidad de tecnicas de mutagenesis. Tales variantes de secuencia generadas espedficamente pueden denominarse "mutantes" o "derivados" de la secuencia original.

El experto en la materia puede producir variantes polipeptfdicas del polipeptido YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1) que presenten una o multiples sustituciones, deleciones, adiciones o reemplazos de aminoacidos, pero que sean funcionalmente equivalentes a la SEC ID n° 1. Estas variantes pueden incluir, entre otros: (a) variantes en las que uno o mas residuos aminoacidos se sustituyen por aminoacidos conservadores o no conservadores, (b) variantes en las que se anaden uno o mas aminoacidos, (c) variantes en las que por lo menos un aminoacido incluye un grupo sustituyente, (d) variantes en las que residuos aminoacidos de una especie se sustituyen por el residuo correspondiente en otra especie, en posiciones conservadas o no conservadas, y (d) variantes en las que se fusiona una protema diana con otro peptido o polipeptido, tal como una pareja de fusion, una etiqueta proteica u otra fraccion qrnmica, que puede proporcionar propiedades utiles a la protema diana, por ejemplo, un epftopo para un anticuerpo.

Las tecnicas para obtener tales variantes, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, tecnicas geneticas (supresiones,

deleciones, mutaciones, etc.), qmmicas y enzimaticas, son conocidas por el experto en la materia. Tal como se utiliza

en la presente memoria, el termino "mutacion" se refiere a un cambio de la secuencia de ADN dentro de un gen o

cromosoma de un organismo que resulta en la creacion de un nuevo caracter o rasgo no presente en el tipo parental,

o el proceso por el que se produce tal cambio en un cromosoma, mediante una alteracion de la secuencia de

nucleotidos del ADN codificante de un gen o mediante un cambio en la organizacion ffsica de un cromosoma. Son tres

mecanismos de mutacion, la sustitucion (intercambio de un par de bases por otro), la adicion (la insercion de una o

mas bases en una secuencia) y la delecion (perdida de una o mas pares de bases).

El termino "vehmulo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una sustancia que facilita la utilizacion de

un farmaco u otro material que se mezcla con el mismo.

La expresion "cicatrizacion de heridas" o "reparacion de heridas" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere

generalmente al proceso natural del cuerpo de reparacion de tejidos despues de un traumatismo. Al recibir un individuo

una herida, tiene lugar jun conjunto de complejos sucesos bioqmmicos para reparar el dano, incluyendo la hemostasis,

la inflamacion, la proliferacion y el remodelado.

I. Composiciones: peptidos terapeuticos para prevenir o tratar enfermedades caracterizadas por la

proliferacion aberrante de fibroblastos y la deposicion de colageno

Segun un aspecto, tal como se define en la reivindicacion 1, la invencion descrita proporciona una composicion

farmaceutica para la utilizacion en el tratamiento de una enfermedad, condicion o proceso caracterizado por la

proliferacion aberrante de fibroblastos y la deposicion de matriz extracelular en un tejido de un sujeto,

en el que la composicion farmaceutica comprende una cantidad terapeutica de un polipeptido de secuencia de

aminoacidos YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1) o un equivalente funcional del mismo, y un portador

farmaceuticamente aceptable del mismo, y en el que la cantidad terapeutica resulta eficaz para reducir la proliferacion

de fibroblastos y la deposicion de matriz extracelular en el tejido del sujeto.

Segun otra realizacion, el tejido es un tejido pulmonar.

Segun otra realizacion, la enfermedad o la condicion se caracteriza ademas por una inflamacion en el tejido.

Segun otra realizacion, la inflamacion es una inflamacion aguda o una inflamacion cronica.

Segun otra realizacion, la inflamacion esta mediada por como mmimo una citoquina seleccionada del grupo que

consiste en factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a), interleuquina-6 (IL-6) e interleuquina-1p (IL-1p).

Segun otra realizacion, la proliferacion aberrante de fibroblastos y la deposicion de matriz extracelular en el tejido se

caracterizan por una actividad aberrante de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno

(MK2) en el tejido en comparacion con la actividad de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada

por mitogeno (MK2) en el tejido de un sujeto de control sano normal.

Segun otra realizacion, la proliferacion aberrante de fibroblastos y la deposicion de matriz extracelular en el tejido se

pone de manifiesto en una cantidad o distribucion de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por

mitogeno (MK2) activada (fosforilada) en el tejido en comparacion con la cantidad o distribucion de protema quinasa

2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2) en el tejido de un sujeto de control sano normal.

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe una actividad de quinasa de una quinasa seleccionada del

grupo indicado en la Tabla 1, en la presente memoria.

Segun otra realizacion, dicha inhibicion puede, por ejemplo, resultar eficaz para reducir la proliferacion de fibroblastos,

la deposicion de matriz extracelular o una combinacion de los mismos en el tejido del sujeto.

Segun otra realizacion, dicha inhibicion puede, por ejemplo, resultar eficaz para reducir por lo menos una patologfa

seleccionada del grupo que consiste en una deposicion aberrante de una protema de la matriz extracelular en un

intersticio pulmonar, una estimulacion aberrante de la proliferacion de los fibroblastos en el pulmon, una induccion

aberrante de la diferenciacion de los miofibroblastos y una estimulacion aberrante de la union de los miofibroblastos a

la matriz extracelular, en comparacion con un sujeto de control sano normal.

Segun algunas realizaciones, los perfiles de inhibicion de los inhibidores MMI in vivo dependen de las dosis, vfas de

administracion y tipos celulares que responden a los inhibidores.

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 50% de la actividad de quinasa de la quinasa. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la quinasa. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 75% de la actividad de quinasa de la quinasa. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 80% de la actividad de quinasa de la quinasa.

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 85% de la actividad de quinasa de la quinasa. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 90% de la actividad de quinasa de la quinasa. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 95% de la actividad de quinasa de la quinasa.

Segun algunas realizaciones, la composicion farmaceutica inhibe una actividad de quinasa de protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (quinasa MK2). Segun algunas otras realizaciones, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 50% de la actividad de quinasa de la quinasa MK2. Segun algunas otras realizaciones, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la quinasa MK2. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 75% de la actividad de quinasa de la quinasa MK2. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 80% de la actividad de quinasa de la quinasa MK2. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 85% de la actividad de quinasa de la quinasa MK2. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 90% de la actividad de quinasa de la quinasa MK2. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 95% de la actividad de quinasa de la quinasa MK2.

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe una actividad de quinasa de protema quinasa 3 activada por protema quinasa activada por mitogeno (quinasa MK3). Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 50% de la actividad de quinasa de la quinasa MK3. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la quinasa MK3. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 70% de la actividad de quinasa de la quinasa MK3. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 75% de la actividad de quinasa de la quinasa MK3. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 80% de la actividad de quinasa de la quinasa MK3. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 85% de la actividad de quinasa de la quinasa MK3. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 90% de la actividad de quinasa de la quinasa MK3. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 95% de la actividad de quinasa de la quinasa MK3.

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe una actividad de quinasa de la protema quinasa I dependiente de calcio/calmodulina (CaMKI). Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe ademas por lo menos 50% de la actividad de quinasa de la protema quinasa I dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKI). Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe ademas por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la protema quinasa I dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKI). Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe ademas por lo menos 70% de la actividad de quinasa de la protema quinasa I dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKI). Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe ademas por lo menos 75% de la actividad de quinasa de la protema quinasa I dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKI). Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe ademas por lo menos 80% de la actividad de quinasa de la protema quinasa I dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKI). Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe ademas por lo menos 85% de la actividad de quinasa de la protema quinasa I dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKI). Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe ademas por lo menos 90% de la actividad de quinasa de la protema quinasa I dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKI). Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe ademas por lo menos 95% de la actividad de quinasa de la protema quinasa I dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKI).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe una actividad de quinasa de receptores del factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB). Segun otra realizacion, el farmaceutico inhibe ademas por lo menos 50% de la actividad de quinasa de receptores del factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB). Segun otra realizacion, el farmaceutico inhibe ademas por lo menos 65% de la actividad de quinasa de receptores del factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB). Segun otra realizacion, el farmaceutico inhibe ademas por lo menos 70% de la actividad de quinasa de receptores del factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB). Segun otra realizacion, el farmaceutico inhibe ademas por lo menos 75% de la actividad de quinasa de receptores del factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe una actividad de quinasa de protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2) y una actividad de quinasa de protema quinasa 3 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK3).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe una actividad de quinasa de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2) y una actividad de quinasa de protema quinasa I dependiente de calcio/calmodulina (CaMKI).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe una actividad de quinasa de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2) y una actividad de quinasa de receptores del factor de crecimiento BDNF/NT-3.

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe una actividad de quinasa de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2), una actividad de quinasa de protema quinasa 3 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK3), una actividad de quinasa de protema quinasa I dependiente de calcio/calmodulina (CaMKI) y una actividad de quinasa de receptores de factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe una actividad de quinasa de protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2), una actividad de quinasa de protema quinasa I dependiente de calcio/calmodulina (CaMKI) y una actividad de quinasa de receptores de factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la protema quinasa 3 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK3).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la protema quinasa I dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKI).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 65% de la actividad de quinasa de receptores del factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 65% de la actividad de quinasa de protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2) y por lo menos 65% de la actividad de quinasa de protema quinasa 3 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK3).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2) y por lo menos 65% de la actividad de quinasa de protema quinasa I dependiente de calcio/calmodulina (CaMKI).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2) y por lo menos 65% de la actividad de quinasa de receptores del factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2), por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la protema quinasa 3 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK3), por lo menos 65% de la actividad de quinasa de la protema quinasa I dependiente de calcio/calmodulina (CaMKI) y por lo menos 65% de la actividad de quinasa de los receptores del factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe la actividad de quinasa de por lo menos una quinasa seleccionada del grupo de MK2, MK3, CaMKI, TrkB, sin inhibir sustancialmente la actividad de otra u otras quinasas seleccionadas del grupo restante indicado en la Tabla 1, en la presente memoria.

Segun algunas realizaciones, los perfiles de inhibicion de los inhibidores MMI in vivo dependen de las dosis, vfas de administracion y tipos celulares que responden a los inhibidores.

Segun dicha realizacion, la composicion farmaceutica inhibe menos de 50% de la actividad de quinasa de la otra quinasa o quinasas seleccionadas. Segun dicha realizacion, la composicion farmaceutica inhibe menos de 65% de la actividad de quinasa de la otra quinasa o quinasas seleccionadas. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe menos de 50% de la actividad de quinasa de la otra quinasa o quinasas seleccionadas. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe menos de 40% de la actividad de quinasa de la otra quinasa o quinasas seleccionadas. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe menos de 20% de la actividad de quinasa de la otra quinasa o quinasas seleccionadas. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe menos de 15% de la actividad de quinasa de la otra quinasa o quinasas seleccionadas. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe menos de 10% de la actividad de quinasa de la otra quinasa o quinasas seleccionadas. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe menos de 5% de la actividad de quinasa de la otra quinasa o quinasas seleccionadas. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica incrementa la actividad de quinasa de las otras quinasas seleccionadas.

Segun las realizaciones del parrafo inmediatamente anterior, la otra u otras quinasas seleccionadas que no resultan sustancialmente inhibidas se seleccionan de lgrupo de protema quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKII, incluyendo su subunidad CaMKII8), protooncogen serina/treonina-protema quinasa (PIM-1), sarcoma celular (c-SRC), tirosina quinasa de bazo (SYK), tirosina quinasa de C-src (CSK) y receptor de factor 1 de crecimiento similar a insulina (IGF-1R).

Segun algunas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende ademas por lo menos un agente terapeutico adicional.

Segun algunas de tales realizaciones, el agente terapeutico adicional se selecciona del grupo que consiste en colagenos de tipo V bovinos purificados (p.ej., IW-001, ImmuneWorks, United Therapeutics), antagonistas de receptores de IL-13 (p.ej., QAX576; Novartis), inhibidores de protema tirosina quinasa (p.ej., imatinib (Gleevec®); Craig Daniels/Novartis), antagonistas de receptores endoteliales (p.ej., ACT-064992 (macitentan); Actelion), antagonistas de receptor dual de endotelina (p.ej., bosentan (Tracleer®); Actelion), analogos de prostaciclina (iloprost inhalado (p.ej., Ventavis®); Actelion), anticuerpos monoclonales anti-CTGF (p.ej., FG-3019), antagonistas de receptores de endotelina (A-selectivo) (p.ej., ambrisentan (Letairis®), Gilead), AB0024 (Arresto), anticuerpos monoclonales de protema 2 de tipo lisil oxidasa (LOXL2) (p.ej., GS-6624 (anteriormente AB0024); Gilead), inhibidores de quinasa N-terminal de c-Jun (JNK) (p.ej., CC-930; Celgene), pirfenidona (p.ej., Esbriet® (InterMune), Pirespa® (Shionogi)), IFN-Ylb (p.ej., Actimmune®; InterMune), anticuerpos humanos IgG4 pan-neutralizadores contra las tres isoformas de TGF-p (p.ej., GC1008; Genzyme), inhibidores de activacion de TGF-p (p.ej., Stromedix (STX-100)), protema pentraxina-2 humana recombinante (rhPTX-2) (p.ej., PRM151; Promedior), anticuerpos biespedficos de IL4/IL13 (p.ej., SAR156597; Sanofi), anticuerpos monoclonales humanizados con diana en integrina avp6 (BIBF 1120; Boehringer Ingelheim), N-acetilcistema (Zambon SpA), Sildenafilo (Viagra®;), antagonistas de TNF (p.ej., etanercept (Enbrel®); Pfizer), glucocorticoides (p.ej., prednisona, budesonido, furoato de mometasona, propionato de fluticasona y furoato de fluticasona), broncodilatadores (p.ej., modificadores de leucotrieno (p.ej., Montelukast (SINGUAIR®)), broncodilatadores anticolinergicos (p.ej., bromuro de ipratropio y tiotropio), short-acting agonistas p2 de accion corta (p.ej., mesilato de isoetarina (Bronkometer®), adrenalina, salbutanol/albuterol y terbutalina),agonistas p2 de accion prolongada (p.ej., salmeterol, formoterol, indecaterol (Onbrez®), y una combinacion de los mismos.

Segun algunas otras realizaciones, el agente terapeutico adicional comprende un broncodilatador, incluyendo, aunque sin limitacion, un modificador de leucotrieno, un broncodilatador anticolinergico, un agonista p2 o una combinacion de los mismos.

Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional comprende un corticoesteroide que incluye, aunque sin limitarse a ellos, prednisona, budesonida, mometasona, beclemetasona o una combinacion de los mismos.

Segun algunas otras realizaciones, el agente terapeutico adicional es un agente antiinflamatorio.

Segun algunas de tales realizaciones, el agente antiinflamatorio es un agente antiinflamatorio no esteroideo. La expresion "agente antiinflamatorio no esteroideo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un grupo grande de agentes que son similares a la aspirina en su accion, incluyendo, aunque sin limitacion, ibuprofeno (Advil®), naproxeno sodio (Aleve®) y acetaminofeno (Tylenol®). Entre los ejemplos adicionales de agentes antiinflamatonos no esteroideos que son utilizables en el contexto de la invencion descrita se incluyen, aunque sin limitacion, oxicams, tales como piroxicam, isoxicam, tenoxicam, sudoxicam, y CP-14,304; disalcid, benorilato, trilisato, safapryn, solprin, diflunisal, y fendosal; derivados de acido acetico, tales como diclofenac, fenclofenac, indometacina, sulindac, tolmetina, isoxepac, furofenac, tiopinac, zidometacina, acematacina, fentiazac, zomepirac, clindanac, oxepinac, felbinac, y ketorolac; fenamatos, tales como los acidos mefenamico, meclofenamico, flufenamico, niflumico, y tolfenamico; derivados del acido propionico, tales como benoxaprofeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, fenoprofeno, fenbufeno, indopropfeno, pirprofeno, carprofeno, oxaprozina, pranoprofeno, miroprofeno, tioxaprofeno, suprofeno, alminoprofeno, y tiaprofenico; pirazolas, tales como fenilbutazona, oxifenbutazona, feprazona, azapropazona y trimetazona. Tambien pueden utilizarse mezclas de estos agentes antiinflamatonos no esteroideos, asf como las sales y esteres dermatologicamente aceptables de estos agentes. Por ejemplo, etofenamato, un derivado del acido flufenamico, resulta particular util para la aplicacion topica.

Segun otra realizacion, el agente antiinflamatorio no esteroideo comprende factor p3 de crecimiento transformante (TGF-p3), un agente anti-factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a) o una combinacion de los mismos.

Segun otra realizacion, el agente antiinflamatorio es un agente antiinflamatorio no esteroideo. La expresion "agente antiinflamatorio no esteroideo", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquiera de numerosos compuestos que contienen un sistema de 4 anillos de 17 carbonos e incluye los esteroles, diversas hormonas (como esteroides anabolicos) y glucosidos. Entre los ejemplos representativos de farmacos antiinflamatorios esteroideos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, corticosteroides tales como hidrocortisona, hidroxiltriamcinolona, alfa-metil dexametasona, dexametasona-fosfato, dipropionatos de beclometasona, valerato de clobetasol, desonido, desoximetasona, acetato de desoxicorticosterona, dexametasona, diclorisona, valerato de diflucortolona, fluadrenolona, acetonido de fluclorolona, pivalato de flumetasona, acetonido de fluosinolona, fluocinonido, butilesteres de flucortina, fluocortolona, acetato de fluprednideno (fluprednilideno), flurandrenolona, halcinonido, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, metilprednisolona, acetonido de triamcinolona, cortisona, cortodoxona, flucetonido, fludrocortisona, diacetato de difluorosona, fluradrenolona, fludrocortisona, diacetato de diflorosona, acetonido de fluradrenolona, medrisona, amcinafel, amcinafido, betametasona y la cantidad de ajuste de sus esteres, cloroprednisona, acetato de clorprednisona, clocortelona, clescinolona, diclorisona, diflurprednato, flucloronido, flunisolido, fluorometalona, fluperolona, fluprednisolona, valerato de hidrocortisona, ciclopentilpropionato de hidrocortisona, hidrocortamato, meprednisona, parametasona, prednisolona, prednisona, dipropionato de beclometasona, triamcinolona, y mezclas de los mismos.

Segun otra realizacion, el agente antiinflamatorio esteroideo comprende por lo menos un corticoesteroide seleccionado del grupo que consiste en prednisona, budesonida, mometasona, beclemetasona y una combinacion de los mismos.

Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional comprende xantina o derivado de xantina, tal como metilxantina.

Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional comprende un inhibidor de elastasa de neutrofilo.

Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional es por lo menos un inhibidor de elastasa de neutrofilo, incluyendo, aunque sin limitacion, ICI 200355, ONO-5046, MR-889, L-694,458, CE-1037, GW-311616, TEI-8362, ONO-6818, AE-3763, FK-706, ICI-200,880, ZD-0892, ZD-8321, y una combinacion de los mismos.

Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional comprende por lo menos un inhibidor de fosfodiesterasa, incluyendo, aunque sin limitacion, inhibidor de fosfodiesterasa 4. Entre los ejemplos de inhibidores de fosfodiesterasa 4 se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, roflumilast, cilomilast o una combinacion de los mismos.

Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional es un agente analgesico. Segun algunas realizaciones, el agente analgesico alivia el dolor mediante la elevacion del umbral del dolor sin alterar la conciencia o alterar otras modalidades sensoriales. Segun algunas de tales realizaciones, el agente analgesico es un analgesico no opioide. Los "analgesicos no opioides" son sustancias naturales o sinteticas que reducen el dolor pero no son analgesicos de opioides. Entre los ejemplos de analgesicos no opioides se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, etodolac, indometacina, sulindac, tolmetina, nabumetona, piroxicam, acetaminofeno, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ketoprofeno, naproxeno, naproxeno sodio, oxaprozina, aspirina, trisalicilato de colina y magnesio, diflunisal, acido meclofenamico, acido mefenamico y fenilbutazona. Segun algunas otras realizaciones, el analgesico es un analgesico opioide. Los "analgesicos opioides", "opioides" o "analgesicos narcoticos" son sustancias naturales o sinteticas que se unen a receptores de opiode en el sistema nervioso central, produciendo una accion agonista. Entre los ejemplos de analgesicos opioides se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, codema, fentanilo, hidromorfona, levorfanol, meperidina, metadona, morfina, oxicodona, oximorfona, propoxifeno, buprenorfina, butorfanol, dezocina, nalbufina y pentazocina.

Segun otra realizacion, el agente terapeutico adicional es un agente antiinfeccioso. Segun otra realizacion, el agente antiinfeccioso es un agente antibiotico. La expresion "agente antibiotico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquiera de un grupo de sustancias qmmicas con la capacidad de inhibir el crecimiento o de destruir bacterias y otros microorganismos, utilizado principalmente en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Entre los ejemplos de agentes antibioticos se incluyen, aunque si limitarse a ellos, penicilina G, meticilina, nafcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, ampicilina, amoxicilina, ticarcilina, carbenicilina, mezlociclina, azlocilina, piperacilina, imipenem, aztreonam, cefalotina, cefaclor, cefoxitina, cefuroxima, cefonicid, cefmetazola, cefotetan, cefprozilo, loracarbef, cefetamet, cefoperazona, cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona, cinoxacina, doxiciclina, minociclina, tetraciclina, amikacina, gentamicina, canamicina, netilmicina, tobramicina, estreptomicina, azitromicina, claritromicina, eritromicina, estolato de eritromicina, etilsuccinato de eritromicina, glucoheptonato de eritromicina, lactobionato de eritromicina, estearato de eritromicina, vancomicina, teicoplanina, cloranfenicol, clindamicina, trimetoprim, sulfametoxazola, nitrofurantoma, rifampina, mupirocina, metronidazol, cefalexina, roxitromicina, co-amoxiclavulanato, combinaciones de piperacilina y tazobactam, y sus diversas sales, acidos, bases y otros derivados. Entre los agentes antibioticos antibacterianos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, penicilinas, cefalosporinas, carbacefems, cefamicinas, carbapenems, monobactamos, aminoglucosidos, glucopeptidos, quinolonas, tetraciclinas, macrolidos y fluoroquinolonas.

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe la inflamacion que se produce en un pulmon del sujeto. Segun otra realizacion, la inflamacion es una inflamacion aguda. Segun otra realizacion, la inflamacion es una inflamacion cronica. Segun otra realizacion, la inflamacion esta mediada por el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a). Segun otra realizacion, la inflamacion esta mediada por la inteleuquina-6 (IL-6). Segun otra realizacion, la inflamacion esta mediada por la interlequina-1p (IL-1p).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica modula la cantidad de factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a) en el pulmon, en comparacion con un control. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica modula la cantidad de interleuquina-6 (lL-6) en el pulmon, en comparacion con un control. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica modula la cantidad de interleuquina-1p (IL-1p) en el pulmon, en comparacion con un control.

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe la actividad de la protema 1 de choque termico de 27 kDa (HSPB1). Segun otra realizacion, la actividad de HSPB1 inhibida por la composicion farmaceutica es una induccion aberrante de la proliferacion de los fibroblastos. Segun otra realizacion, la actividad de HSPB1 inhibida por la composicion farmaceutica es una induccion aberrante de la diferenciacion de los miofibroblastos. Segun otra realizacion, la actividad de HSPB1 inhibida por la composicion farmaceutica es una deposicion de una protema de la matriz extracelular en un intersticio pulmonar. Segun otra realizacion, la protema de matriz extracelular es el colageno. Segun otra realizacion, la actividad de HSPB1 inhibida por la composicion farmaceutica es una estimulacion de la formacion de loci fibroticos. Segun otra realizacion, la actividad de HSPB1 inhibida por la composicion farmaceutica es un incremento de la actividad contractil de los miofibroblastos. Segun otra realizacion, la actividad de HSPB1 inhibida por la composicion farmaceutica es una estimulacion de la union de los miofibroblastos a la matriz extracelular.

Segun algunas otras realizaciones, la cantidad terapeutica del peptido inhibidor terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,00001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,1 mg/kg (o 100 pg/kg) de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 70 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 90 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 90 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 70 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,001 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,00001 mg/kg de peso corporal.

Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 1 jg /kgM a y 25 jg /k g ^ a . Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 1 |jg/kg/dfa y 2 jg /k g ^ a . Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 2 jg/kg/dfa y 3 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 3 jg/kg/dfa y 4 jg /kgM a. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 4 jg/kg/dfa y 5 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 5 jg/kg/dfa y 6 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 6 jg/kg/dfa y 7 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 7 jg/kg/dfa y 8 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 8 jg/kg/dfa y 9 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 9 jg/kg/dfa y 10 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 1 jg/kg/dfa y 5 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 5 jg/kg/dfa y 10 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 10 jg/kg/dfa y 15 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 15 jg/kg/dfa y 20 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 25 jg/kg/dfa y 30 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 30 jg/kg/dfa y 35 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 35 jg/kg/dfa y 40 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 40 jg/kg/dfa y 45 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 45 jg/kg/dfa y 50 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 50 jg/kg/dfa y 55 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 55 jg/kg/dfa y 60 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 60 jg/kg/dfa y 65 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 65 jg/kg/dfa y 70jg/kgM a. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 70 jg/kg/dfa y 75 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 80 jg/kg/dfa y 85 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 85 jg/kg/dfa y 90 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 90 jg/kg/dfa y 95 jg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 95 jg/kg/dfa y 100 jg/kg/dfa.

Segun otra realizacion, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es 1 jg/kg/dfa.

Segun otra realizacion, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es 2 jg/kg/dfa.

Segun otra realizacion, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es 5 jg/kg/dfa.

Segun otra realizacion, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es 10 jg/kg/dfa.

Segun algunas realizaciones, el polipeptido de la invencion comprende D-aminoacidos (que son resistentes a las proteasas espedficas de L-aminoacidos in vivo), una combinacion de D-aminoacidos y L-aminoacidos, y diversos aminoacidos "de diseno" (p.ej., p-metil-aminoacidos, C-a-metil-aminoacidos y N-a-metilaminoacidos, etc.) para proporcionar propiedades especiales. Entre los ejemplos de sustituciones de aminoacidos sinteticos se incluyen ornitina en lugar de lisina, y norleucina en lugar de leucina o isoleucina.

Segun algunas realizaciones, el polipeptido puede unirse a otros compuestos para estimular una semivida in vivo incrementada, tal como polietilenglicol o dextrano. Dicho enlace puede ser covalente o no covalente, tal como entendera el experto en la materia. Segun algunas otras realizaciones, el polipeptido puede encapsularse en una micela, tal como una micela realizada en poli(etilenglicol)-bloque-poli(polipropilenglicol) o poli(etilenglicol)-bloquepolilactido. Sesgun algunas otras realizaciones, el polipeptido puede encapsularse en nanopartfculas o micropartfculas degradables compuestas de poliesteres degradables, incluyendo, aunque sin limitacion, acido polilactico, poliglicolido y policaprolactona.

Segun otra realizacion, el polipeptido puede prepararse en una forma solida (incluyendo granulos, polvos o supositorios) o en una forma lfquida (p.ej., soluciones, suspensiones o emulsiones).

Segun otra realizacion, las composiciones de la invencion descrita pueden encontrarse en forma de unos polvos secos dispersables para la administracion mediante inhalacion o insuflado (por la boca o por la nariz, respectivamente). Las composiciones de polvos secos pueden prepararse mediante procedimientos conocidos de la tecnica, tales como la liofilizacion y molienda en molinos de chorro, tal como se da a conocer en la publicacion de patente internacional n° WO91/16038, y tal como se da a conocer en la patente US n° 6.921.527, la exposicion de la cual se incorpora como referencia. La composicion de la invencion descrita se introduce en un receptaculo de dosis adecuado en una cantidad suficiente para proporcionar a un sujeto un tratamiento de dosis unitaria. El receptaculo de dosis es uno que cabe dentro de un dispositivo de inhalacion adecuado para permitir la aerosolizacion de la composicion de polvos secos mediante dispersion en un flujo de gas para formar un aerosol, seguido de la captura del aerosol producido de esta manera, en una camara con una boquilla unida para la posterior inhalacion por un sujeto que necesita de tratamiento. Dicho receptaculo de dosis incluye cualquier recipiente que incluye la composicion conocida de la tecnica, tal como capsulas de gelatina o plastico con una parte extrafble que permite dirigir un flujo de gas (p.ej., aire) hacia el interior del recipiente para dispersar la composicion de polvos secos. Tales recipientes estan ejemplificados por los mostrados en la patente US n° 4.227.522; patente US n°. 4.192.309 y patente US n° 4.105.027. Entre los recipientes adecuados se incluyen ademas los utilizados junto con el inhalador de polvos de la marca Ventolin® Rotohaler de Glaxo o el inhalador de polvos de la marca Spinhaler® de Fison. Otro recipiente de dosis unitaria adecuado que proporciona una barrera de humedad superior se forma a partir de una lamina de plastico y hoja de aluminio. Los polvos de base farmaceutica se utilizan para llenar en peso o en volumen la depresion en la lamina formable y se sellan hermeticamente con una lamina de cubierta de aluminio-plastico. Dicho recipiente para la utilizacion con un dispositivo de inhalacion de polvos se describe en la patente US n° 4.778.054 y se utiliza con el Diskhaler® de Glaxo (patentes US n° 4.627.432; n° 4.811.731 y n° 5.035.237). La totalidad de dichas referencias se incorpora como referencia en su totalidad en la presente memoria.

Segun otra realizacion, el portador de la composicion de la invencion descrita incluye un agente de liberacion, tal como un portador de liberacion sostenida o de liberacion retardada. En tales realizaciones, el portador puede ser cualquier material capaz de liberacion sostenida o retardada del polipeptido para proporcionar una administracion mas eficiente, p.ej. resultante en una dosis menos frecuente y/o reducida del polipeptido, mejorando la facilidad de manipulacion, y prolongando o retardando los efectos sobre enfermedades, trastornos, condiciones, smdromes y similares, tratados, prevenidos o estimulados. Entre los ejemplos no limitativos de tales portadores se incluyen liposomas, microesponjas, microesferas o microcapsulas de polfmeros naturales y sinteticos, y similares. Los liposomas pueden formarse a partir de una diversidad de fosfolfpidos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, colesterol, estearilaminas o fosfatidilcolinas.

Los metodos para la smtesis y preparacion de peptidos pequenos son bien conocidos de la tecnica y se dan a conocer en, por ejemplo, las patentes US n° 5.352.461; n° 5.503.852; n° 6.071.497; n° 6.331.318; n° 6.428.771 y la publicacion de patente US n° 2006/0040953. Las patentes US n° 6.444.226 y n° 6.652.885 describen la preparacion y provision de micropartfculas de dicetopiperazinas en suspension acuosa a las que se anade una solucion de agente activo con el fin de unir el agente activo a la partfcula. Estas patentes describen ademas un metodo de eliminacion de un medio lfquido mediante liofilizacion, rindiendo micropartfculas que comprenden un agente activo. La alteracion de las condiciones del solvente de dicha suspension para estimular la union del agente activo a la partfcula se da a conocer en las solicitudes de patentes US n° 60/717.524, n° 11/532.063 y n° 11/532.065; patente US n° 6.440.463 y solicitudes de patente US n° 11/210,709 y n° 11/208.087. Cada una de dichas patentes y solicitudes de patente se incorpora como referencia en la presente memoria.

En algunas realizaciones, MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) y sus equivalentes funcionales de la presente invencion puede secarse mediante un metodo de secado por pulverizacion, tal como se da a conocer en, por ejemplo, la solicitud de patente US n° 11/678.046 (incorporada como referencia en la presente memoria).

En todavfa otra realizacion, el polipeptido de la invencion puede aplicarse en una diversidad de soluciones. Una formulacion adecuada es esteril, disuelve cantidades suficientes de los polipeptidos y no resulta perjudicial para la aplicacion propuesta. Por ejemplo, las composiciones de la invencion descrita pueden formularse como suspensiones acuosas, en las que el ingrediente o ingredientes activos estan en mezcla con excipientes adecuados para la preparacion de suspensiones acuosas.

Entre tales excipientes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agentes de suspension (p.ej., carboximetil celulosa sodica, metilcelulosa, hidroxi-propilmetilcelulosa, alginato sodico, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia), agentes de dispersion o humectantes, incluyendo un fosfatido natural (p.ej., lecitina), o productos de condensacion de un oxido de alquileno con acidos grasos (p.ej., estearato de polioxietileno), o productos de condensacion de oxido de etileno con alcoholes alifaticos de cadena larga (p.ej., heptadecaetil-enoxicetanol) o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y un hexitol (p.ej., monooleato de polioxietilensorbitol), o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y antudridos de hexitol (p.ej., monooleato de polietilen-sorbitan).

Las composiciones de la invencion descrita tambien pueden formularse como suspensiones aceitosas mediante la suspension del ingrediente activo en un aceite vegetal (p.ej., aceite de araquis, aceite de oliva, aceite de sesamo o aceite de coco) o en un aceite mineral (p.ej., parafina lfquida). Las suspensiones aceitosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abeja, parafina dura o alcohol cetflico).

Las composiciones de la invencion descrita tambien pueden formularse en forma de polvos dispersables y granulos adecuados para la preparacion de una suspension acuosa mediante la adicion de agua. El ingrediente activo en tales polvos y granulos se proporciona en mezcla con un agente dispersante o humectante, agente de suspension y uno o mas conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspension adecuados se ejemplifican mediante los ya indicados anteriormente. Tambien pueden encontrarse presentes excipientes adicionales.

Segun algunas realizaciones, los polvos secos se producen mediante un procedimiento de secado por pulverizacion.

Segun algunas otras realizaciones, los polvos secos se producen mediante micronizacion.

Segun otra realizacion, los polvos secos comprenden micropartfculas con un diametro aerodinamico de la mediana de la masa (DAMM) de entre 1 y 5 micrometros.

Segun otra realizacion, los polvos secos comprenden micropartfculas con un diametro aerodinamico de la mediana de la masa (DAMM) de aproximadamente 2 micrometros.

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica se empaqueta en un dispositivo de inhalacion, incluyendo, por ejemplo, aunque sin limitacion, un nebulizador, un inhalador de dosis medida (IDM) y un inhalador de polvos secos (IPS).

Segun algunas otras realizaciones, la composicion farmaceutica es un lfquido para la administracion aerosolizada utilizando un nebulizador. Segun algunas de tales realizaciones, el caudal de la composicion farmaceutica es de por lo menos 0,3 ml/min y la composicion farmaceutica se administra como partroulas de 2 mm, con distribucion hasta los alveolos mas profundos.

Las composiciones de la invencion descrita tambien pueden presentar la forma de una emulsion. Una emulsion es un sistema de dos fases preparado mediante la combinacion de dos portadores lfquidos inmiscibles, uno de los cuales se distribuye uniformemente en la totalidad del otro y consiste en globulos que presentan diametros iguales o superiores a los de las partroulas coloidales mas grandes. El tamano del globulo resulta cntico y debe ser tal, que el sistema alcance la maxima estabilidad. Habitualmente, la separacion de las dos fases no se producira a menos que se incorpore una tercera sustancia, un agente emulsionante. De esta manera, una emulsion basica contiene por lo menos tres componentes, los dos portadores lfquidos inmiscibles y el agente emulsionante, asf como el ingrediente activo. La mayona de emulsiones incorporan una fase acuosa en una fase no acuosa (o viceversa). Sin embargo, resulta posible preparar emulsiones que son basicamente no acuosas, por ejemplo, surfactantes anionicos y cationicos del sistema inmiscible no acuoso de glicerina y aceite de oliva. De esta manera, las composiciones de la invencion pueden encontrarse en forma de una emulsion de aceite-en-agua. La fase aceitosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo aceite de oliva o aceite de araquis, o un aceite mineral, por ejemplo parafina lfquida o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo goma acacia o goma tragacanto, fosfatidos naturales, por ejemplo soja, lectina y esteres o esteres parciales derivados de acidos grasos y anhfdridos de hexitol, por ejemplo monooleato de sorbitan, y productos de condensacion de dichos esteres parciales con oxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilen-sorbitan.

Segun algunas realizaciones, el polipeptido de la invencion descrita se sintetiza qmmicamente. Dicho polipeptido sintetico, preparados utilizando tecnicas bien conocidas de fase solida, fase lfquida o tecnicas de condensacion de peptidos, o cualquier combinacion de los mismos, puede incluir aminoacidos naturales y no naturales. Los aminoacidos utilizados para la srntesis de peptidos pueden ser estandares Boc (N-a-t-butiloxicarbonilo protegido con N-a-amino) en resina con los protocolos estandares de desproteccion, neutralizacion, acoplamiento y lavado del procedimiento de fase solida original de Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154), o los aminoacidos 9-fluorenilmetoxicarbonilo protegidos con N-a-amino labiles frente a bases, descritos por primera vez por Carpino y Han (1972, J. Org. Chem.

37:3403-3409). Pueden obtenerse aminoacidos protegidos tanto con Fmoc como con Boc N-a-amino, de Sigma, Cambridge Research Biochemical, o de otras comparuas qrnmicas que resulten familiares al experto en la materia. Ademas, puede sintetizarse el polipeptido con otros grupos protectores N-a que resulten familiares al experto en la materia. La smtesis peptidica en fase solida puede llevarse a cabo mediante tecnicas que resulten familiares para el experto en la materia y proporcionadas en, por ejemplo, Stewart y Young, 1984, Solid Phase Synthesis, segunda edicion, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.; Fields y Noble, 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214, o utilizando sintetizadores automatizados, cada uno incorporado como referencia en su totalidad en la presente memoria.

Segun otra realizacion, la fibrosis pulmonar se caracteriza por una actividad anormal de la protema 1 de choque termico de 27 kDa (HSPB1) en un pulmon del sujeto en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la actividad normal de HSPB1 es una deposicion aberrante de una protema de la matriz extracelular en un intersticio pulmonar del sujeto en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la protema de matriz extracelular es el colageno. Segun otra realizacion, la actividad anormal de HSPB1 es una estimulacion aberrante de la proliferacion de fibroblastos en el pulmon en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la actividad anormal de HSPB1 es una induccion aberrante de la proliferacion de miofibroblastos en el pulmon en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la actividad anormal de HSPB1 es una induccion estimulacion de la formacion de focos fibroticos en el pulmon en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la actividad anormal de HSPB1 es un incremento de la actividad contractil de los miofibroblastos en el pulmon en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la actividad anormal de HSPB1 es una estimulacion aberrante de la union de los miofibroblastos a la matriz extracelular en el pulmon en comparacion con un sujeto de control sano normal.

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe la inflamacion que se produce en un pulmon del sujeto. Segun otra realizacion, la inflamacion es una inflamacion aguda. Segun otra realizacion, la inflamacion es una inflamacion cronica. Segun otra realizacion, la inflamacion esta mediada por el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a). Segun otra realizacion, la inflamacion esta mediada por la interlequina-1p (IL-1p). Segun otra realizacion, la inflamacion esta mediada por la inteleuquina-6 (IL-6).

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica modula la cantidad de factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a) en el pulmon del sujeto, en comparacion con un control. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica modula la cantidad de interleuquina-1p (IL-1p) en el pulmon del sujeto, en comparacion con un control. Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica modula la cantidad de interleuquina-6 (lL-6) en el pulmon del sujeto, en comparacion con un control.

Segun otra realizacion, la composicion farmaceutica inhibe la actividad anormal de HSPB1 en comparacion con un sujeto de control sano normal en un pulmon del sujeto. Segun otra realizacion, la actividad anormal de HSPB1 es una deposicion aberrante de una protema de la matriz extracelular en un intersticio pulmonar del sujeto en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la protema de matriz extracelular es el colageno. Segun otra realizacion, la actividad anormal de HSPB1 es una estimulacion aberrante de la proliferacion de fibroblastos en el pulmon en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la actividad anormal de HSPB1 es una induccion aberrante de la diferenciacion de fibroblastos en miofibroblastos en el pulmon en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la actividad anormal de HSPB1 es una estimulacion aberrante de la formacion de focos fibroticos en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la actividad anormal de HSPB1 es un incremento aberrante de la actividad contractil de los miofibroblastos en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la actividad contractil de los miofibroblastos se caracteriza por un nivel elevado de alfa-actina de musculo liso (a-SMA) en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la actividad contractil de los miofibroblastos se caracteriza por incrementos en la formacion de las fibras de estres en comparacion con un sujeto de control sano normal. Segun otra realizacion, la actividad anormal de HSPB1 es una estimulacion aberrante de la union de los miofibroblastos a la matriz extracelular en comparacion con un sujeto de control sano normal.

Segun otra realizacion, la etapa de administracion puede realizarse sistemicamente, por via oral, bucal, parenteral, topica, mediante inhalacion, mediante insuflado, o por via rectal, o puede producirse localmente por medios tales como, aunque sin limitarse a ellos, inyeccion, implantacion, injertacion, aplicacion topica o por via parenteral. Puede llevarse a cabo la administracion adicional, por ejemplo por via intravenosa, transmucosal, transdermica, intramuscular, subcutanea, intratraqueal (incluyendo mediante inhalacion pulmonar), intraperitoneal, intratecal, intralinfatica, intralesional o epidural. La administracion puede llevarse a cabo, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces, y/o durante uno o mas periodos prolongados como dosis unitarias individuales o en forma de un regimen de tratamiento que comprende multiples dosis unitarias de multiples farmacos y/o sustancias.

Segun algunas otras realizaciones, la etapa de administracion se produce de una vez como una dosis individual. Segun algunas otras realizaciones, la etapa de administracion se lleva a cabo como pluralidad de dosis durante un periodo de tiempo. Segun algunas de tales realizaciones, el periodo de tiempo es un dfa, una semana, un mes, un ano o multiplos de los mismos. Segun algunas realizaciones, la etapa de administracion se lleva a cabo diariamente durante un periodo de por lo menos una semana. Segun algunas realizaciones, la etapa de administracion se lleva a cabo diariamente durante un periodo de por lo menos un mes. Segun algunas realizaciones, la etapa de administracion se lleva a cabo diariamente durante un periodo de por lo menos dos meses. Segun algunas realizaciones, la etapa de administracion se lleva a cabo diariamente durante un periodo de por lo menos un ano. Segun otra realizacion, la etapa de administracion se lleva a cabo por lo menos una vez al mes. Segun otra realizacion, la etapa de administracion se lleva a cabo por lo menos una vez a la semana. Segun otra realizacion, la etapa de administracion se lleva a cabo por lo menos una vez al dfa.

Segun algunas otras realizaciones, la cantidad terapeutica de la composicion farmaceutica se administra mediante un dispositivo de inhalacion. Entre los ejemplos del dispositivo de inhalacion que puede utilizarse para administrar la composicion farmaceutica se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un nebulizador, un inhalador de dosis medida (IDM), un inhalador de polvos secos (IPS) y un nebulizador de polvos secos.

Segun otra realizacion, los polvos secos comprenden micropartfculas con un diametro aerodinamico de la mediana de la masa (DAMM) de entre 1 y 5 micrometros. Segun otra realizacion, los polvos secos comprenden micropartfculas con un diametro aerodinamico de la mediana de la masa (DAMM) de aproximadamente 2 micrometros.

Segun algunas otras realizaciones, la cantidad terapeutica del peptido inhibidor terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,00001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,1 mg/kg (o 100 pg/kg) de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 70 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 90 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 90 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 70 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,001 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso corporal. Segun otra realizacion, la cantidad terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es una cantidad de entre aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 0,00001 mg/kg de peso corporal.

Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 1 pg/kgMa y 25 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 1 pg/kg/dfa y 2 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 2 pg/kg/dfa y 3 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 3 pg/kg/dfa y 4 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 4 pg/kg/dfa y 5 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 5 pg/kg/dfa y 6 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 6 pg/kg/dfa y 7 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 7 pg/kg/dfa y 8 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 8 pg/kg/dfa y 9 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 9 pg/kg/dfa y 10 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 1 pg/kg/dfa y 5 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 5 pg/kg/dfa y 10 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 10 pg/kg/dfa y 15 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 15 pg/kg/dfa y 20 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 25 pg/kg/dfa y 30 pg/kg/dfa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 30 pg/kgMa y 35 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 35 pg/kgMa y 40 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 40 pg/kgMa y 45 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 45 pg/kgMa y 50 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 50 pg/kgMa y 55 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 55 pg/kgMa y 60 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 60 pg/kgMa y 65 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 65 pg/kgMa y 70 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 70 pg/kgMa y 75 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 80 pg/kgMa y 85 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 85 pg/kgMa y 90 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 90 pg/kgMa y 95 pg/kgMa. Segun algunas otras realizaciones, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica se encuentra comprendida entre 95 pg/kgMa y 100 pg/kgMa.

Segun otra realizacion, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es 1 pg/kgMa.

Segun otra realizacion, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es 2 pg/kgMa.

Segun otra realizacion, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es 5 jg/kgM a.

Segun otra realizacion, la dosis terapeutica del peptido inhibitorio terapeutico de la composicion farmaceutica es 10 jg/kgM a.

Dentro de la presente solicitud, a menos que se indique lo contrario, las tecnicas utilizadas pueden encontrarse en cualquiera de entre varias referencias bien conocidas, tales como: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" en: Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2a ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), y Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), la totalidad de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia.

A menos que se indique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comunmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invencion. Aunque tambien pueden utilizarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la practica o ensayo de la invencion descrita, a continuacion se describen metodos y materiales preferentes.

En donde se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta las decimas de unidad del lfmite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los lfmites superior e inferior de dicho intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en dicho intervalo indicado se encuentra comprendido dentro de la invencion. Los lfmites superior e inferior de dichos intervalos mas pequenos pueden incluirse independientemente en los intervalos mas pequenos tambien se encuentran comprendidos dentro de la invencion, sujetos a cualquier lfmite espedficamente excluido en el intervalo indicado. Donde el intervalo indicado incluya uno o ambos lfmites, los intervalos que excluyan cualquiera de los lfmites o ambos lfmites incluidos tambien se encuentran incluidos en la invencion.

Debe indicarse ademas que, tal como se utiliza en la memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” o “la” incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria presentan el mismo significado.

Las publicaciones comentadas en la presente memoria se proporcionan unicamente para su exposicion antes de la fecha de presentacion de la presente solicitud. Nada en la presente memoria debe interpretarse como una admision de que la invencion descrita no posee el derecho de anteceder a dicha exposicion en virtud de invencion anterior. Ademas, las fechas de publicacion pueden ser diferentes de las fechas de publicacion reales, que pueden requerir una confirmacion independiente.

EJEMPLOS

Los ejemplos a continuacion se proporcionan a fin de proporcionar al experto ordinario en la materia una exposicion y descripcion completas de como realizar y utilizar la invencion descrita, y no pretenden limitar el alcance de los que los inventores consideran su invencion ni pretenden representar que los experimentos, posteriormente, son todos o los unicos experimentos llevados a cabo. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precision con respecto a los numeros utilizados (p.ej., cantidades, temperatura, etc.), aunque deben considerarse algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso; el peso molecular es peso molecular medio; la temperatura se expresa en grados centfgrados y la presion es igual o aproximadamente igual a la presion atmosferica.

I. Materiales y metodos

Desarrollo del farmaco MMI-0100

Para la produccion segun buenas practicas de fabricacion (BPF) de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1), se transfirio aproximadamente 1 kg de resina Fmoc-Ala-Wang a un recipiente de reaccion de smtesis en fase solida de vidrio de 50 l dotado de un agitador mecanico. Se dejo que la resina se hinchase en dimetilformamida (MDF) durante como mmimo (CM) 2 horas antes de drenar el DMF. A continuacion, las perlas de resina se lavaron mediante enjuagues consecutivos de DMF. El grupo protector N-terminal (es decir, Fmoc) se elimino (etapa de desbloqueo) mediante tratamiento con piperidina al 20% en DMF y la resina se lavo con DMF. El siguiente aminoacido en la secuencia se acoplo en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y diisopropilcarbodiimida (DIC). Generalmente, se utilizaron 2,5 a 3,5 equivalentes molares de Fmoc-aminoacido (Fmoc-AA) a la escala de smtesis para el acoplamiento. Se disolvio Fmoc-AA en DMF y se activo mediante la adicion de HOBt y DIC. Se monitorizo el completado de cada acoplamiento mediante la prueba de ninhidrina. En el caso de que el acoplamiento fuese incompleto, se llevo a cabo un segundo acoplamiento con el mismo aminoacido mediante la utilizacion del metodo de anlddrido simetrico. Generalmente, para el acoplamiento se utilizaron 3,0 a 6,0 equivalentes molares de Fmoc-AA a la escala de smtesis. El Fmoc-AA se disolvio en diclorometano (DCM) y un volumen mmimo de DMF y se activo mediante la adicion de DIC en una proporcion molar de Fmoc-AA/DIC=1,0/0,5. Tras completar la secuencia completa del peptido, se enjuago la resina peptfdica a fondo con lavados sucesivos de DMF y MeOH. A continuacion, se seco la resina bajo vado durante CM 3 horas. La recuperacion tfpica de la resina peptfdica seca total era de aproximadamente 2.800 gramos, representando un rendimiento de resina peptfdica de ~ 65%.

Aproximadamente 370 a 500 gramos de resina peptfdica seguidamente se transfirieron a una botella de vidrio convenientemente dimensionado y dotada de una barra de agitacion magnetica. El matraz que contema la resina peptfdica se enfrio en un bano de hielo/agua o en una nevera durante no mas de 30 minutos. El coctel de acido trifluoroacetico (TFA) (una mezcla de TFA, TIS y agua en una proporcion de 95 ml: 2,5 ml: 2,5 ml) se preenfrio en un bano de hielo/agua durante no mas de 30 minutos. Se anadieron a este recipiente aproximadamente 8 a 12 ml de coctel de corte de TFA por gramo de resina. Tan pronto como se agrupo la resina peptfdica y el coctel de TFA, se retiro el bano de hielo/agua y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas. A continuacion, la mezcla de reaccion se filtro a traves de un filtro de vidrio grueso y la resina se lavo dos veces con 0,5 a 1,0 ml de TFA por gramo de resina en cada lavado. Se recolecto el filtrado agrupado y se descarto la resina. A continuacion, se anadio el filtrado a eter preenfriado en una nevera durante menos de 30 minutos, en una proporcion de 1 ml de filtrado por cada 10 ml de eter, para precipitar el peptido cortado. La mezcla de peptido-eter se equilibro a temperatura ambiente durante no mas de 30 minutos. El peptido precipitado se recolecto sobre un filtro de vidrio del medio. El precipitado se lavo a fondo con eter fno tres veces, utilizando suficiente eter para por lo menos cubrir todo el precipitado sobre el filtro. A continuacion, se eluyo el eter a traves del mismo filtro de vidrio del medio. El peptido en bruto se transfirio a una botella de plastico y se introdujo en un desecador conectado a una bomba de vado mecanica para el secado durante no mas de 12 horas. Tras el secado, el peptido en bruto se almaceno a 5 ± 3°C. El procedimiento de corte se repitio multiples veces hasta el corte de toda la resina peptfdica. Una recuperacion por lotes tfpica de peptido en bruto seco total es de aproximadamente 1.250 gramos, representando un rendimiento de corte de aproximadamente 110%.

El peptido en bruto procedente del corte se preparo para la purificacion mediante cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en ingles) mediante disolucion del peptido en tampon para HPLC a una concentracion final del peptido en bruto de 20 mg/ml. Se filtro la solucion de peptido a traves de una membrana de filtracion de vidrio de 1 pm y se cargo en una columna de fase inversa C18, que se opero mediante un sistema de HPLC preparativa. La columna se lavo y se equilibro. Se utilizo un gradiente lineal para eluir el peptido en bruto de la columna. Tras cada purificacion de producto en bruto, se analizaron las fracciones mediante un sistema de HPLC analftica utilizando una columna Kromasil C18, 5 pm, 100 A 4,6 x 250 mm. Las fracciones generadas a partir de la purificacion inicial se agruparon basandose en la pureza del HPLC y un perfil de impurezas de cada fraccion. Los conjuntos de peptidos se almacenaron a 2-8°C hasta el procesamiento posterior. Se repitio este procesamiento hasta la purificacion de todo el peptido en bruto a traves de la columna de HPLC y cumplir los criterios de pureza del Grupo principal. Se llevo a cabo un intercambio salino con sal acetato mediante HPLC. La solucion peptfdica final se filtro a traves de un filtro de 0,22 pm y se cargo en un liofilizador de bandejas. El peptido se precongelo a -40°C durante no mas de 720 minutos antes de iniciar el ciclo de liofilizacion. La liofilizacion requiere aproximadamente 5 dfas. De las etapas de purificacion y liofilizacion resulto un rendimiento final de aproximadamente 50% a 55%.

Determinacion radiometrica de IC ⁵⁰

Se estimo el valor de IC⁵⁰ a partir de una curva de 10 puntos de diluciones semilogantmicas. El peptido se suministro en dimetilsulfoxido (DMSO). Espedficamente, se incubo MK2 recombinante humano (h) (5 a 10 mU) con 3-glicerofosfato sodico 50 mM (pH=7,5), EGTA 0,1 mM, 30 pM de peptido de sustrato (KKl Nr TLSVA, SEC ID n° 21), acetato de magnesio 10 mM y y-33P-ATP 90 pM (volumen final: 25 pl) durante 40 minutos a temperatura ambiente. A continuacion, se detuvo la reaccion con acido fosforico al 3%. Se aplicaron puntos de 10 pl de dicha mezcla en un Filtermat P30 y se lavaron tres veces durante cinco minutos con acido fosforico 75 mM y una vez con metanol. Finalmente, la membrana se seco y se utilizo un contador de centelleo. Se selecciono una concentracion de ATP a menos de 15 pM de la Km aparente para ATP, ya que Hayess y Benndorf (Biochem. Pharmacol., 1997, 53(9): 1239­ 47) han demostrado que el mecanismo de su peptido inhibidor original (es decir, el peptido KKKALNRQLGVAA, SEC ID n° 22) no era competitivo con la union del ATP.

Ademas de determinar el valor de IC⁵⁰ para MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1), se sometio a ensayo la actividad inhibidora contra 266 quinasas humanas utilizando el servicio IC⁵⁰ Profiler Express de Millipore (Millipore, Billerica, MA).

Para el analisis de especificidad, se utilizaron 100 pM de cada MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1), MMI-0200 (YARAAARQARAKALNRQLGVA; SEC ID n° 19), MMI-0300 (FAKLAARLYRKALARQLGVAA; SEC ID n° 3), MMI-0400 (KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA; SEC ID n° 4) y MMI-0500 (HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA; SEC ID n° 7) disueltos en dimetilsulfoxido (DMSO). Se selecciono la concentracion de 100 pM debido a que esta concentracion inhibfa la formacion de adhesion en un estudio in vivo (tal como se da a conocer en la solicitud de patente US n° 12/582.516, presentada el 20 de octubre de 2009, el contenido de la cual se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad). Cada medicion de actividad de quinasa se llevo a cabo por duplicado.

Histoqmmica e inmunohistoquimica

Se genero un modelo en raton de fibrosis pulmonar mediante la administracion de 0,025 U de bleomicina/PBS por via intratraqueal en ratones C57BL/6. Se administro MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) o MMI-0200 (YARAAARQARAKALNRQLGVA; SEC ID n° 19) (a las dosis de 50 pg/kg, 75 pg/kg y 100 pg/kg al d^a) diariamente desde el dfa 7 posterior a la lesion con bleomicina (para el analisis de la etapa postinflamatoria/prefibrotica; un modelo de prevencion) o el d^a 14 posterior a la lesion con bleomicina (para el analisis de la etapa postfibrotica; modelo de tratamiento) por via intraperitoneal o mediante nebulizacion, hasta el dfa 21 o 28 posterior a la administracion de bleomicina. A los 21 dfas de la administracion de bleomicina (para el modelo de prevencion) o a los 28 dfas de la administracion de bleomicina (para el modelo de tratamiento), se sacrificaron con una inyeccion de pentobarbital sodico (120 mg/kg) y se abrio la cavidad toracica. Se ligo el conducto principal bronquial derecho y se extirpo el pulmon derecho. Se canulo la traquea y se perfundio el pulmon izquierdo con paraformaldelmdo al 4% a una presion de H²O de 21 cm. A continuacion, los bloques de tejido se incluyeron en parafina y se prepararon secciones de 4 mm para la tincion. Se tineron secciones de cada animal con hematoxilina y eosina (H+E) para visualizar las celulas o con tincion tricromica de Masson para destacar la deposicion de colageno. Tras la incubacion, las secciones se lavaron con acido acetico al 0,2%, se deshidrataron mediante inmersion en alcohol al 95% y se clarificaron con xileno (3-4 veces) en una placa de tincion. Las secciones tenidas se montaron en un portaobjetos de vidrio etiquetado con medio de montaje organico.

II. Resultados

Ejemplo 1. IC ⁵⁰ y especificidad de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1).

Se determino el valor de IC⁵⁰ (concentraciones inhibidoras semimaximas) para el peptido inhibidor de MK2 (MMI-0100, YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1)) utilizando el IC⁵⁰ Profiler Express Service de Millipore. Este ensayo cuantitativo mide cuanto inhibidor resulta necesario para inhibir 50% de un proceso o componente biologico dado de un proceso (es decir, un enzima, celula o receptor celular) [IC⁵⁰]. Espedficamente, en estos ensayos, un sustrato cargado positivamente se fosforilo con un grupo fosfato radiomarcado de un ATP en el caso de que la quinasa no resulte inhibida por un peptido inhibidor. A continuacion, el sustrato cargado positivamente se atrajo a una membrana de filtracion cargada negativamente, se cuantifico con un contador de centelleo y se comparo con un control de 100% de actividad.

Se seleccionaron concentraciones de ATP a 15 pM de la Km aparente para ATP ya que una concentracion de ATP proxima a la Km puede permitir que las quinasas presenten la misma cantidad relativa de actividad de fosforilacion. La IC⁵⁰ de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) se determino que era 22 pM.

Ademas de determinar la IC⁵⁰ del compuesto, se evaluo la especificidad de los peptidos inhibidores de MK2 mediante el examen de las actividades de la totalidad de las 266 quinasas humanas disponibles para someterlas a ensayo en el servicio de perfilado de quinasas de Millipore (Tabla ¹ ). Para el analisis, se determinaron las quinasas inhibidas en mas de 65% por MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1); MMI-0200 (YARAAARQARAKALNRQLGVA; SEC ID n° 19), MMI-0300 (FAKLAARLYRKALARQLGVAA; SEC ID n° 3); MMI-0400 (KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA; SEC ID n° 4) y MMI-0500 (HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA; SEC ID n° 7).

Tal como se muestra en la Tabla 1, a 100 pM, los peptidos inhibidores de MK2, MMI-0100 (SEC ID n° 1), MMI-0200 (SEC ID n° 19), MMI-0300 (SEC ID n° 3), MMI-0400 (SEC ID n° 4) y MMI-0500 (SEC ID n° 5) inhibieron un grupo espedfico de quinasas y mostraron una inhibicion fuera de la diana de la quinasa muy limitada. Mas espedficamente, los peptidos inhibidores de MK2, MMI-0100 (SEC ID n° 1), MMI-0200 (SEC ID n° 19), MMI-0300 (SEC ID n° 3), MMI-0400 (SEC ID n° 4) y MMI-0500 (SEC ID n° 5) inhibieron in vitro mas de 65% de las actividades de quinasa de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2), de la protema quinasa 3 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK3), de la protema quinasa I dependiente de calcio/calmodulina (CaMKI, protema quinasa espedfica de serina/treonina) y receptores de factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB, tirosina quinasa).

Tabla 1. Ensayo de perfilado de quinasas

Ejemplo 2. Formulacion de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) y sus equivalentes funcionales

Segun algunas realizaciones, MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) y sus equivalentes funcionales se formulan como polvos liofilizados mediante secado por pulverizacion, micronizacion (p.ej., molienda de chorro) o como formulacion lfquida para la nebulizacion.

Secado por pulverizacion

En algunas realizaciones, se utiliza el secado por pulverizacion para preparar MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) y sus equivalentes funcionales en consideracion de los factores siguientes:

(a) las protemas y peptidos tienden a la desnaturalizacion; es decir, la disrupcion de las estructuras terciarias y, en ocasiones, secundarias;

(b) la desnaturalizacion puede ser reversible o irreversible y puede estar causada por una diversidad de condiciones, tales como el incremento de temperature, la reduccion de la temperature, los extremos de pH, la adicion de solventes, la presion y la desnaturalizacion por cizalla (aplicable a la micronizacion);

(c) las protemas desnaturalizadas son menos activas y no terapeuticas, en ocasiones completamente inactivas; (d) el secado por pulverizacion es capaz de convertir estas moleculas grandes amorfas en partfculas esfericas discretas con una distribucion espedfica de tamanos de partrnula controlada por los parametros de procesamiento; las partrnulas secadas por pulverizacion pueden ser muy esfericas, de forma de donut y tipicamente son huecas, referidas a partmulas >5 pm todavfa pueden ser respirables, aunque resistentes a los mecanismos de lavado en los pulmones, y

(e) el secado por pulverizacion, con o sin excipientes, generalmente mejora la estabilidad de las protemas.

Se evalua una formulacion liofilizada de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) y sus equivalentes funcionales para sinergia potencial con el procedimiento de secado por pulverizacion (p.ej., la correspondencia de niveles optimos de humedad/concentraciones de tampon/pH, seleccion de excipiente y similares) para garantizar la proteccion de la estabilidad peptfdica.

Las tandas de secado por pulverizacion iniciales presentan como objetivo los criterios de aceptacion mutuamente acordados a fin de definir los parametros del procedimiento para el funcionamiento del secado por pulverizacion. Para un producto de inhalacion, el tamano de partrnula se considera un criterio importante. Para la deposicion alveolar en la region de interes (tipo II), diametros aerodinamicos de la mediana de la masa (DAMM) de 1 a 5 micrometres generalmente se aceptan como adecuados para la deposicion periferica en los espacios alveolares (Heyder J. Proc. Am. Thorac. Soc. 1(4): 315-320, 2004; incorporada como referencia en la presente memoria). Otros estudios han sugerido que los DAMM de 1 a 3 micrometres son un tamano de partmula diana inicial deseable para el procedimiento de secado por pulverizacion. Debido a que la diana de bioespacio probable para MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) es la region alveolar, inicialmente se utiliza como diana un DAMM en el rango de aproximadamente ² micrometres para garantizar la deposicion en el espacio alveolar.

Entre los criterios de aceptacion se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, (1) tamano de partrnula (es decir, D⁹⁰ de aproximadamente 2 pm); (2) niveles de humedad (es decir, humedad inferior a 3% p/p); (3) densidad de los polvos, y (4) apariencia superficial (esferica, rugosa, toroidal).

Se llevo a cabo un experimento de diseno del procedimiento con el fin de optimizar los parametros del procedimiento de secado por pulverizacion, incluyendo, por ejemplo, aunque sin limitacion, (¹ ) la presion de entrada y la temperatura de secado, (2) la concentracion de la carga de alimentacion y tasa de alimentacion, y (3) proporcion de peptido/excipiente (los excipientes son, por ejemplo, sales tampon y un monosacarido).

Ejemplo 3. Produccion de lotes de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) para la evaluacion continua del rendimiento de aerosoles

Se llevaron a cabo 2-3 tandas de secado por pulverizacion a los parametros de procedimiento definidos que se han indicado anteriormente, a fin de generar material para la evaluacion del rendimiento del aerosol.

Los polvos secos por pulverizacion resultan muy adecuados para la administracion desde un inhalador, por ejemplo, sin limitacion un inhalador MicroDose. MicroDose rutinariamente consigue tanto una elevada dosis emitida y una fraccion y dosis elevadas de partfculas finas con este enfoque de formulacion, tanto para mezclas puras como mezclas co-secadas por pulverizacion. Se muestran rendimientos ejemplares de aerosoles de insulina seca por pulverizacion en las figuras 1 y 2.

Aunque la micronizacion seca es un metodo de produccion de polvos preferente para moleculas pequenas para la administracion pulmonar, en contraste con el secado por pulverizacion, es un metodo estresante, que utiliza elevadas fuerzas de cizalla. Debido a que la utilizacion de elevadas fuerzas de cizalla puede conducir a la fracturacion de protemas y peptidos, la micronizacion seca no se utiliza rutinariamente para moleculas grandes. Ademas, si los tamanos de dosis son pequenos, se requieren agentes de carga para mejorar la fluidez y permitir una medicion precisa de los polvos durante las operaciones de llenado. El excipiente primario y uno de los unicos excipientes aprobados para la administracion pulmonar con este fin es la lactosa, que puede requerir su ensayo para compatibilidad qrnmica con MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) o sus equivalentes funcionales, ya que la lactosa es incompatible con determinados peptidos.

El procedimiento de micronizacion es bastante sencillo y bien conocido de la tecnica. Brevemente, se someten polvos secos liofilizados de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) y sus equivalentes funcionales a etapas de molienda hasta alcanzar la distribucion prescrita diana de tamanos de partfcula (es decir, MMAD, D10, D50, D90). Estos polvos micronizados puros se someten a ensayo para potencia para garantizar su actividad posterior a la micronizacion, optimizada para la administracion desde el inhalador, y su estabilidad qrnmica y ffsica sometida a ensayo en el envase primario (blister termosellado). A continuacion, los polvos puros se mezclan con una seleccion priorizada de grados de lactosa pulmonar aprobados hasta una diana, se someten a ensayo para la homogeneidad de la mezcla y se someten a los mismos ensayos de optimizacion del inhalador y de estabilidad.

Inhalador de polvos secos (IPS) MicroDose

Segun alguna realizacion, MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) y sus equivalentes funcionales pueden administrarse utilizando un inhalador de polvos secos (IPS). Por ejemplo, el inhalador de polvos secos (IPS) MicroDose presenta un generador de aerosol activado piezoelectricamente accionado por la respiracion y consigue una elevada eficiencia de administracion pulmonar independiente del caudal y volumen de inhalacion del paciente. Al contrario que los IPS 'pasivos', que requieren una inhalacion fuerte y vigorosa del orden de 40 a 60 litros por minuto (LPM) de flujo para una administracion pulmonar eficaz, no existe ninguna maniobra respiratoria requerida para el IPS MicroDose, ya que puede administrar eficazmente en un abanico muy amplio de caudales desde tan solo 10 LPM hasta un flujo de 90 LPM, con un rendimiento equivalente (ver ejemplos de rendimiento en las figuras 3 y 4).

Segun algunas otras realizaciones, MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) y sus equivalentes funcionales pueden administrarse utilizando una aplicacion respiratoria tidal, tal como un 'nebulizador de polvos secos' (NPS). El NPS administra dosis de polvos secos sincronizados con la respiracion tidal de inhalacion con induccion de tan solo 2 litros por minuto (LPM), flujos pico esperados de entre 5 y 15 LPM y volumenes tidales de tan solo 30 ml, que son condiciones mucho mas diffciles que las esperables con pacientes adultos de IPS. Este nuevo NPS ha completado con exito su segundo ensayo clmico en adultos, completandose su primer estudio en noviembre de 2011. Estos resultados son accesibles mediante Internet en la direccion "clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01489306?spons=Microdose&rank=1."

El sistema inhalador electronico MicroDose es una formulacion extremadamente flexible, puede administrar con precision y eficiencia tanto las modalidades de formulacion anteriores con eficiencia particularmente elevada con productos farmaceuticos secados por pulverizacion y ha demostrado su capacidad de rendimiento con mas de 30 moleculas pequenas y grandes. La insulina seca por pulverizacion en el envase primario, por ejemplo, presenta una duracion de por lo menos 18 meses. Se muestran ejemplos de rendimiento de administracion de peptidos secados por pulverizacion y de moleculas pequenas micronizadas en las figuras 5 a 8.

Respecto al efecto de la formulacion de polvos secos sobre las membranas pulmonares, p.ej., sensibilizacion, la administracion de polvos secos, especialmente a cargas de polvos bajas (<4-5 mg) es improbable que afecte a las membranas pulmonares o que provoque sensibilizacion (tos, etc.) a menos que esta sea una propiedad intrmseca de la molecula activa (que no ha sido observada en estudios animales por los presentes inventores). Se seleccionan los excipientes ya aprobados para el uso pulmonar con excelente biocompatibilidad pulmonar y que se encuentran presentes en cantidades muy bajas (es dedr, rango de pocos mg). Por ejemplo, el manitol a cantidades bajas no es probable que presente un efecto.

Nebulizacion liquida

Alternativamente, MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) o sus equivalentes funcionales pueden administrarse mediante nebulizacion Kquida. Estudios preclmicos anteriores han mostrado que MMl-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC iD n° 1) puede administrarse en roedores mediante un sistema nebulizdaor AeroGen® adaptado para el uso animal.

Con el fin de producir espedficamente la capacidad de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) de ser dirigido para impactar positivamente sobre el pulmon comprometido, en los experimentos de eficacia en el modelo animal con bleomicina, se aerosolizo eficazmente una solucion de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1). La administracion pulmonar local de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) se llevo a cabo mediante un dispositivo nebulizador para roedores disenado y fabricado por Aerogen® (www.aerogen.com). El nebulizador de microbomba de laboratorio Aeroneb® utiliza una tecnologfa de aerosolizacion de alta eficiencia para la utilizacion en la investigacion preclfnica de aerosoles y estudios de inhalacion, proporcionando una valiosa asociacion entre la etapa preclmica y el desarrollo clmico del producto. El caudal era >0,3 ml/min y estaba disenado para administrar partfculas de 2 mm de tamano, con distribucion hasta los alveolos mas profundos. La eficacia de Mm I-0100 nebulizado (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) y la incorporacion celular en todo el pulmon ha sido demostrada en el modelo en raton con bleomicina de fibrosis pulmonar (ver la figura 16). La administracion inhalada clmicamente relevante localizada resulta tan eficaz como las inyecciones sistemicas convencionales en la atenuacion de la activacion de MK2.

Ejemplo 4. El nivel de MK2 activado se encuentra incrementado en lesiones fibroticas de pulmones de pacientes con fibrosis pulmonar idiopatica (FPI)

La protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MAPK) (MK2) resulta activada con el estres producido por p38MAPK-a y p. Estas dos isoformas de p38MAPK se unen a un motivo de anclaje basico en el extremo carboxi-terminal de MK2, que posteriormente fosforila sus sitios reguladores. Como consecuencia de la activacion, se exporta MK2 del nucleo al citoplasma y cotransporta p38 MAPK activo a su compartimiento. MK2 estabiliza la localizacion de p38MAPK y resulta esencial para la diferenciacion, migracion y produccion de citoquinas (Kotlyarov A., Mol. Cell Biol. 22(13): 4827-4835, 2002).

Por lo tanto, con el fin d eexaminar si la ruta de senalizacion de p38MAPK-MK2 resulta activada en los pulmones afectados por FPI, se tineron secciones de pulmon obtenidas de pacientes normales y de FPI, con un anticuerpo fosfoespedfico contra una forma activada de MK2 (anti-fosfo-Thr334-MAPKAPK2). Se inmunotineron tejidos de pulmon normal y de pulmon con FPI utilizando DAB y el nucleo se contratino con hematoxilina. Tal como se muestra en la figura 9, se observo una expresion incrementada de MK2 activado en las celulas en los focos fibroticos procedentes de explantes de tejido pulmonar derivados de pacientes con FPi en comparacion con el tejido de biopsia de pulmon normal (izquierda). Esos resultados sugieren que la formacion de fibrosis en los pulmones de los pacientes de FPI se caracteriza por la activacion aberrante de la ruta de senalizacion de p38MAPK-MK2.

Ejemplo 5. La administracion nebulizada y sistemica de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) protege frente a la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones.

Una de las caractensticas distintivas de la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI) es la activacion de las celulas mesenquimatosas y la deposicion exuberante de matriz, espedficamente de colageno. La acumulacion resultante de colageno en el pulmon puede medirse mediante tecnicas tanto histologicas como bioqmmicas, mas notablemente a partir de la acumulacion de hidroxiprolina, que se deriva practicamente en su totalidad de colageno en el pulmon y, de esta manera, sirve como variable sustitutiva del contenido de colageno en el pulmon completo (Umezawa H. et al., Cancer 20(5):891-895, 1967).

Por lo tanto, se evaluo la eficacia terapeutica del peptido MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) sobre el tratamiento de la fibrosis pulmonar utilizando un modelo de raton de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina mediante la administracion del peptido MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) sistemicamente (via intraperitoneal) o local (mediante administracion nebulizada) durante la profilaxis o etapa prefibrotica (es decir, la administracion de farmaco iniciada el dfa 7 despues de la lesion por bleomicina, ver la figura 10) y mediante la medicion de los niveles de colageno como indices de fibrosis en el raton con bleomicina.

Brevemente, se indujeron loci fibroticos en los pulmones de los ratones mediante la administracion intratraqueal de aproximadamente 0,025 U de bleomicina (disueltos en PBS) en ratones C57BL/6. Con el fin de examinar la eficacia de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) en el tratamiento de los pulmones lesionados con bleomicina en la etapa de profilaxis/prefibrotica, se administro diariamente un control (PBS) o MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1), por via intraperitoneal o mediante nebulizacion a partir del dfa 7 despues de la administracion de bleomicina (cuando cede la inflamacion y se activan los mecanismos fibroticos) hasta el dfa 21 despues de la administracion de bleomicina (cuando se observa un nivel significativo de fibrosis) (figura 10). El dfa 21 despues de la administracion de bleomicina, tejidos pulmonares procedentes de ratones con bleomicina tratados con Mm I-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) o un control (PBS) se aislaron, se fijaron, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones para la tincion. Brevemente, se sacrificaron los ratones con una inyeccion de pentobarbital sodico (120 mg/kg) y se abrio la cavidad toracica. Se ligo el conducto principal bronquial derecho y se extirpo el pulmon derecho. Se canulo la traquea y se perfundio el pulmon izquierdo con paraformaldehfdo al 4% a una presion de H²O de 21 cm. A continuacion, los bloques de tejido se incluyeron en parafina y se prepararon secciones de 4 mm y se tineron con hematoxilina y eosina (H+E, para el examen patologico) o tricroirtia de Masson (para la tincion del colageno).

Tal como se muestra en la figura 11, las secciones de pulmon procedentes de ratones tratados con PBS mostraban estructuras pulmonares (PN) y de las vfas respiratorias (VR) normales. En contraste, las secciones pulmonares procedentes de ratones con bleomicina (el dfa 21) revelaron una estructura estrechada de las vfas respiratorias (VR) con formacion de focos fibroticos (FF) (panel superior; tincion de hematoxilina y eosina (H+E) y una acumulacion incrementada de colageno (flechas en el panel inferior; tincion tricromica de Masson) en tejidos de pulmon, que recuerdan a las observadas en pacientes de FPI. Administracion de MMI-0100 (YArAa ARQARAKAlA r QLGv Aa ; SEC ID n° 1), mediante nebulizacion o por via intraperitoneal; sin embargo, redujo significativamente el desarrollo de loci fibroticos (panel superior, MMI-0100 (NEB) y MMI-0100 (IP)) y una acumulacion reducida de colageno (panel inferior, MMI-0100(NEB) y MMI-0100(IP)) en los pulmones de los ratones con bleomicina.

A continuacion, se analizaron cuantitativamente los niveles totales de colageno en los pulmones de los ratones lesionados con bleomicina (figura 12) mediante el calculo de un factor de conversion constante (7,5) para el colageno a partir de las concentraciones de hidroxiprolina (Neuman R. y Logan M, J Biol Chem., 186(2):549-56, 1950, incorporada como referencia. Tal como se muestra en la figura 12, la administracion tanto nebulizada (BLEO+NEBULIZADO) como sistemica (BLEO+IP) de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) durante la etapa postinflamatoria/prefibrotica redujo significativamente la deposicion de colageno en comparacion con el control de bleomicina.

Ejemplo 6. Datos de respuesta a dosis de inhibidores peptidicos de MK2 en el modelo de prevencion de fibrosis pulmonar idiopatica

A continuacion, se examino el efecto de dosis crecientes de inhibidores peptidicos de MK2 sobre la deposicion de colageno in vivo utilizando el modelo en raton con bleomicina de fibrosis pulmonar idiopatica (modelo de prevencion). Brevemente, se sometieron ratones C57-BL/6 a lesion con bleomicina el dfa 0. A partir del dfa 7 y continuando hasta el dfa 21, se administraron en ratones 25, 50 o 75 pg/kg de MMI-0100 (YARAAa Rq ARAKALAr QlGVAA; SEC ID n° 1) o MMI-0200 (YARAAARQARAKALNRQLGVA; Sec ID n° 19) diariamente mediante inyeccion intraperitoneal (IP). Tal como se muestra en la figura 13, la tincion tricromica de azul de Masson revelo una reduccion de los niveles de colageno en el pulmon en los ratones lesionados con bleomicina tratados con MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1), sugiriendo que MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) puede proteger de la fibrosis en los pulmones debido a la lesion con bleomicina de una manera dependiente de la dosis. Estos datos sugieren que m M i-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) conserva su potencial como compuesto fibroprotector incluso a dosis mas altas.

En contraste, el tratamiento de los ratones lesionados con bleomicina con MMI-0200 (YARAAARQARAKALNRQLGVA; SEC ID n° 19) no redujo sino que, por el contrario, incremento la deposicion de colageno en el pulmon a las dosis sometidas a ensayo. Sin embargo, este resultado es consistente con un estudio anterior con ratones con desactivacion de MK2 y fibroblastos embrionarios de raton (FER) MK2-/-, en los que se habfa anulado completamente la actividad de MK2, que mostraron un fenotipo de fibrosis agravada (Liu et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 37: 507-517, 2007).

Sin respaldo teorico, estos resultados sugieren que: (1) los peptidos inhibidores de MK2 de la invencion descrita pueden mostrar un espectro de actividades de inhibicion de un grupo espedfico de quinasas; (2) MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) y MMI-0200 (YARAAARQARAKALNRQLGVA; SEC ID n° 19) puede inhibir MK2 y otras quinasas diferencialmente, lo que, dependiendo de la dosis aplicada, contribuye a este espectro de actividades inhibidoras; (3) la formacion y/o migracion de miofibroblastos tambien podna ser una parte de la etapa de reparacion de la fibrosis y no del dano activo, y (4) resulta necesario, por lo tanto, un determinado nivel de actividad de MK2 para que se produzca dicho proceso (Liu et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 37: 507-517, 2007).

Ademas, los peptidos inhibidores de MK2 de la invencion descrita se derivaron del sitio de union a sustrato de MK2 posterior a HSPB1 diana. Por lo tanto, pueden inhibir competitivamente la actividad de quinasa de MK2 sobre HSPB1. Sin respaldo teorico, los efectos diferenciales de MMI-0200 (YARAAARQARAKALNRQLGVA; SEC ID n° 19) sobre la fibrosis pueden atribuirse a sus diferencias de secuencia, su homologfa respecto a los sitos de union de HSPB1, su inhibicion diferencial de la actividad de quinasa de MK2 sobre un sitio de union de protema diana diferente, o una combinacion de los mismos.

Ejemplo 7. La administracion de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) bloquea eficazmente la activacion sistemica de celulas T en el modelo de prevencion de la fibrosis pulmonar idiopatica.

Estudios recientes subrayan el papel clave de los linfocitos T en la fibrosis inducida por bleomicina (Wilson, M. et al., The Journal of Experimental Medicine, 207(3): 535-552, 2010). Por lo tanto, con el fin de investigar el papel funcional de las celulas (pan) T esplenicas en los ratones lesionados con bleomicina tratados con MMI-0100 (YARAAARQARAKAlAr QLGVAA; SEC ID n° 1), se llevo a cabo la reaccion de linfocitos mixtos autologos (LMA) tal como se ha descrito anteriormente (Wilkes, D. et al., Journal of Leukocyte Biology, 64(5):578-586, 1998, incorporada como referencia en la presente memoria) Espedficamente, se examino en el ensayo la capacidad de las celulas presentadoras de antfgeno purificadas de C57BL/6 de inducir la proliferacion de linfocitos T de C57BL/6.

Se sometieron ratones C57-BL/6 a lesion con bleomicina el dfa 0. El dfa 7, en ratones se administraron 50 pg/kg de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) diariamente mediante inyeccion intraperitoneal (IP) o nebulizador (NEB) hasta el dfa 21. Se aislaron las celulas T esplenicas y se cultivaron solas o en presencia de celulas presentadoras de antigenos autologas (CPA procedentes de ratones C57-BL/6) o estimuladas con anticuerpos contra CD3 (a-CD3) durante 48 h. A continuacion, las celulas se marcaron radioactivamente con timidina tritiada, durante 16 h, y se evaluaron las tasas de proliferacion.

Tal como se muestra en la figura 14, las celulas T solas, con independencia del tratamiento, mostraron una capacidad proliferativa muy baja. Sin embargo, al cocultivar las celulas T con celulas presentadoras de antigeno autologas (es decir, CPA aisladas de ratones C57-BL/6), la capacidad proliferativa era significativamente mas alta para los ratones lesionados con bleomicina que para los ratones de control. Resulta interesante que la proliferacion de celulas T procedentes de ratones tratados con bleomicina observada en presencia de celulas presentadoras de antfgeno se redujo significativamente mediante la administracion sistemica de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1), aunque tal como se esperaba, no mediante el modo inhalado. Estos datos sugieren la supresion de la activacion de las celulas T esplenicas por MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) e indican que el inhibidor peptfdico de MK2 es fibroprotector.

Tambien se confirmo la viabilidad de las celulas T mediante la estimulacion de las celulas con anticuerpos contra a-CD3, un activador de celulas T policlonales. a-CD3 indujo una robusta proliferacion de las celulas con independencia del grupo de tratamiento. La respuesta proliferativa al activador policlonal sugiere que el inhibidor peptfdico MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) no afecta a las propiedades funcionales de las celulas T esplenicas y que no existe toxicidad con la administracion de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) a esta dosis particular. Ademas, la falta de respuesta de celulas T esplenicas a MMI-0100 nebulizado (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) sugiere que se produce poca distribucion sistemica con este modo de administracion del peptido.

Ejemplo 8. El tratamiento sistemico o nebulizado de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) protege los pulmones lesionados con bleomicina en la etapa postfibrotica

El modelo clasico de bleomicina, tal como se ilustra en la figura 10, se ha utilizado ampliamente en la literatura en la etapa prefibrotica para someter a ensayo la eficacia de cualquier intervencion. Debido a que la administracion tanto nebulizada como sistemica de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) protege significativamente el pulmon de la fibrosis inducida por bleomicina, el efecto de la administracion sistemica (intraperitoneal) o local (nebulizada) de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) en el tratamiento de pulmones lesionados con bleomicina se examino adicionalmente en la etapa postfibrotica, iniciando la intervencion farmacologica el dfa 14, un punto temporal en que los pulmones se encuentran significativamente fibrosados (figura 15) (Pottier, N. et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 176(11): 1098-1107, 2007; incorporada como referencia en la presente memoria). El rescate de los pulmones cicatrizados que se muestra en dicho modelo es clmicamente relevante, dado que los pulmones de los pacientes de FPI ya se encuentran cicatrizados en el momento del diagnostico.

Mas espedficamente, los loci fibroticos en los pulmones se indujeron mediante la administracion intratraqueal de aproximadamente 0,025 U de bleomicina (disueltos en PBS) en ratones C57BL/6. Con el fin de examinar la eficacia de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) en el tratamiento de pulmones lesionados con bleomicina en la etapa postfibrotica, se administro PBS (control) o MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1), en los ratones por via intraperitoneal o mediante nebulizacion diariamente desde el dfa 14 posterior a la administracion de bleomicina, hasta el dfa 28 posterior a la administracion de bleomicina. El dfa 28 despues de la administracion de bleomicina, tejidos pulmonares procedentes de ratones con bleomicina tratados con MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) o un control (PBS) se aislaron, se fijaron, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones para la tincion. Se sacrificaron los ratones con una inyeccion de pentobarbital sodico (120 mg/kg) y se abrio la cavidad toracica. Se ligo el conducto principal bronquial derecho y se extirpo el pulmon derecho. Se canulo la traquea y se perfundio el pulmon izquierdo con paraformaldeddo al 4% a una presion de H²O de 21 cm. A continuacion, los bloques de tejido se incluyeron en parafina y se prepararon secciones de 4 mm y se tineron con hematoxilina y eosina (H+E, para el examen patologico) o tricroirna de Masson (para la tincion del colageno).

Tal como se muestra en la figura 16, con independencia del modo de administracion del farmaco, es decir, si se administra por via intraperitoneal o se aplica localmente en el pulmon, el tratamiento de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) "rescato" los pulmones severamente cicatrizados. Se utilizo la evaluacion histologica para examinar la arquitectura pulmonar (tincion de hematoxilina y eosina (H+E), panel superior) y la distribucion del colageno (tincion tricromica de azul de Masson, panel inferior). Los resultados de la histoqmmica muestran que, mientras los pulmones lesionados con bleomicina se encuentran severamente cicatrizados, los ratones tratados con MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) presentan un parenquima pulmonar mas claro.

A continuacion, se determino cuantitativamente la deposicion del colageno mediante la utilizacion del ensayo estandar de hidroxiprolina con el pulmon izquierdo completo. Se evaluo la deposicion de colageno total (soluble e insoluble) mediante el analisis de las concentraciones de hidroxiprolina en pulmones murinos el dfa 28 posterior a la lesion con bleomicina. Se administro MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) a la dosis de 50 pg/kg mediante inyeccion intraperitoneal (IP) o nebulizador (NEB) desde el dfa 14 posterior a la lesion con bleomicina.

Tal como se muestra en la figura 17, el tratamiento de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) detuvo significativamente la progresion posterior de la deposicion del colageno, en comparacion con la lmea base, 28 dfas despues de la lesion con bleomicina y el inicio del tratamiento de MM-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1). Esto resulta significativo porque, aunque la literatura actual demuestra la profilaxis eficaz en el desarrollo del farmaco, en el diagnostico de los pacientes de FPI, hay fibrosis preexistente. Estos resultados tambien sugieren que MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) presenta el potencial de detener o retrasar eficazmente la progresion posterior de la enfermedad y mejorar la calidad de vida, y que el peptido MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1), en caso de utilizarse a una dosis mas alta y/o durante un periodo de tiempo mas largo, puede resultar en una mejora incluso mayor de la histologfa y fisiologfa pulmonares, y una menor fibrosis.

Ejemplo 9. La administracion sistemica o local de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) se correlaciona con un nivel reducido de MK2 activado en el modelo de raton con bleomicina de fibrosis pulmonar idiopatica.

Tal como se ha comentado anteriormente, una de las dianas principales de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) y sus equivalentes funcionales en el pulmon es la quinasa MK2, que induce respuestas inflamatorias y fibroticas en los pulmones afectados. Por lo tanto, con el fin de validar adicionalmente los efectos de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) in vivo, se examinaron los niveles de MK2 activado (phospho-Thr334-MAPKAPK2) en ratones lesionados con bleomicina no tratados, asf como en ratones tratados con MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1).

Brevemente, ratones C57-BL/6 se sometieron a lesion con bleomicina el dfa 0. El dfa 14, en ratones se administraron 50 pg/kg de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) diariamente mediante inyeccion intraperitoneal (IP) o nebulizador (NEB) hasta el dfa 28 posterior a la lesion con bleomicina. Se inmunotineron secciones de tejido pulmonar fijadas en formalina contra fosfo-Thr334 MK2. La tincion de control fue con anticuerpo IgG secundario biotinilado. Se utilizo peroxidasa de rabano picante conjugada con estreptavidina con 3,3'-diaminobencideno como sustrato y se contratineron los nucleos con hematoxilina. Mientras que los ratones con bleomicina mostraron un incremento visible de la presencia de MK2 activada (nodulos oscuros) si se dejaban sin tratar, mas particularmente en zonas de deposicion significativa de colageno, los ratones tratados con MMI-0100 mostraron una presencia de MK2 activada similar al tejido normal, con una distribucion concentrada en zonas perifericas de las vfas respiratorias y en los vasos sangumeos.

Tal como se muestra en la figura 18, con independencia del modo de administracion, es decir, administracion sistemica o local, en contraste con el control, la administracion de MMI-0100 nebulizado o intraperitoneal (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) estaba asociada a una tincion disminuida de fosfo-Thr334-MAPKAPK2 (forma activada de MK2) en el modelo en raton con bleomicina.

Ejemplo 10. MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° regula negativamente las citoquinas inflamatorias en el modelo de tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopatica

Un mecanismo potencial por el que MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) puede inhibir la formacion de fibrosis en el pulmon es mediante la reduccion de las concentraciones locales de citoquinas proinflamatorias y, de esta manera, impedir la atraccion de monocitos y el remodelado extracelular aberrante por macrofagos en el pulmon (p.ej., incremento de la deposicion de colageno, incremento de la adhesion y migracion celular, reduccion de la degradacion de la matriz). Para explorar esta posibilidad, se examino la capacidad del peptido MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) de inhibir la produccion de citoquinas proinflamatorias mediante la medicion de cambios en los niveles de interleuquina-6 (IL-6) y de factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a) tras el tratamiento con MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; s EC ID n° 1) por via intraperitoneal o mediante nebulizacion.

La interleuquina-6 (IL-6) es una citoquina multifuncional las acciones principales de la cual incluyen la potenciacion de la smtesis de inmunoglobulinas, la activacion de celulas T y la modulacion de la smtesis de protemas de fase aguda.

Es conocido que muchos tipos diferentes de celulas producen IL-6, incluyendo monocitos, macrofagos, celulas endoteliales y fibroblastos, y la expresion del gen de IL-6 en estas celulas se encuentra regulado por una diversidad de inductores. La interleuquina-1p (IL-1p) y el factor de necrosis tumoral (TNF-a) son dos inductores conocidos clave de expresion del gen de lL-6. Entre otros inductores se incluyen activadores de la protema quinasa C, el ionoforo de calcio A23187 y diversos agentes que causan la elevacion de los niveles intracelulares de AMP dclico (AMPc).

El factor de necrosis tumoral (TNF, tambien denominado TNF-a) es una citoquina que participa en la inflamacion sistemica y es un miembro de un grupo de citoquinas que estimula la reaccion de fase aguda. Los estudios han demostrado que TNF-a induce la expresion de IL-6 mediante tres rutas de senalizacion diferentes dentro de la celula, es decir, 1) la ruta de NF-kB, 2) la ruta de MAPK y 3) la ruta de senalizacion de muerte.

Tal como se muestra en la figura 20, la administracion de MMI-0100 intraperitoneal (BLEO+MMI-0100 (IP)) o nebulizado (BLEO+MMI-0100 (NEB)) (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) redujo significativamente el nivel plasmatico tanto de TNF-a (A, panel superior) como de IL-6 (B, panel inferior) en el modelo en raton con bleomicina de fibrosis pulmonar idiopatica.

Ejemplo 11. La administracion sistemica o local de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) bloquea eficazmente la acumulacion de miofibroblastos activados en pulmon murino que esta significativamente cicatrizado debido a la lesion con bleomicina

La caractenstica principal de la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI) es la acumulacion de miofibroblastos en lesiones fibroticas y la expresion de abundante actina alfa del musculo liso (a-SMA), un marcador de activacion de miofibroblastos. Ademas, los miofibroblastos activados son responsables en parte de la rigidez del parenquima pulmonar y del agravamiento de la funcion pulmonar.

Por lo tanto, el nivel de expresion de a-SMA en pulmones lesionados con bleomicina se evaluo en los pulmones de ratones lesionados con bleomicina tratados con MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) por via sistemica (mediante administracion intraperitoneal) o localmente (mediante nebulizacion). Tal como se muestra en la figura 21, el nivel de a-SMA se encontraba significativamente atenuado en pulmones tratados con MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) en comparacion con el nivel de a-SMA en pulmones lesionados con bleomicina no tratados.

Ejemplo 12. Estudios de respuesta a dosis de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) en la modulacion de la activacion de miofibroblastos inducida por TGF-P1 in vitro

Las caractensticas principales de la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI) son la presencia de celulas epiteliales atfpicas y apoptoticas, junto con miofibroblastos activados que secretan cantidades exuberantes de proternas de la matriz, incluyendo colagenos, fibronectina y metaloproteinasas de matriz (Horowitz, J and Thannickal, V., Treatments in Respiratory Medicine, 5(5):325-42, 2006). En los procesos normales de cicatrizacion de heridas, los miofibroblastos forman una matriz provisional como andamiaje temporal. La contraccion de la matriz provisional resulta en la posterior reepitelizacion y la eventual cicatrizacion de la herida. Sin embargo, en el caso de que los miofibroblastos activados sean resistentes a apoptosis, la deposicion de colageno exuberante resultante conduce a la estabilizacion de la matriz (Tomasek, J. et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 3(5): 349-63, 2002). El resultado final de la proliferacion, activacion y resistencia a apoptosis no controladas de los miofibroblastos da como resultado lesiones fibroticas con una matriz estabilidad debido a la deposicion del colageno y, de esta manera, la eventual distorsion de la arquitectura pulmonar (Yamashita, C. et al., The American Journal of Pathology, 179(4): 1733-45, 2011).

Por lo tanto, debido a que los fibroblastos son las celulas clave implicadas en la formacion de cicatriz, se evaluo el efecto de MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) sobre la activacion de los miofibroblastos mediante el examen de los niveles proteicos de actina a del musculo liso (a-SMA) y fibronectina en fibroblastos pulmonares fetales humanos en cultivo (celulas IMR-90) tratados con TGF-p. Tal como se muestra en las figuras 22 y 23, MMI-0100 (YARAAARQARAKALARQLGVAA; SEC ID n° 1) evito eficazmente la activacion de los miofibroblastos inducida por TGF-p de una manera dependiente e la dosis, tal como muestran las reducciones de los niveles de tanto la actina a del musculo liso (a-SMA) (figura 22) como de fibronectina (figura 23).

En contraste, MMI-0200 (YARAAARQARAKALNRQLGVA; SEC ID n° 19) a las dosis sometidas a ensayo no afecto a la activacion de los miofibroblastos mediada por TGF-p, tal como indica la ausencia de cambios en el nivel proteico de los marcadores de activacion de los miofibroblastos actina a del musculo liso (figura 21) y fibronectina (figura 23). Sin respaldo teorico, estos resultados sugieren que: (1) los peptidos inhibidores de MK2 de la invencion descrita pueden mostrar un espectro de actividades de inhibicion de un grupo espedfico de quinasas; (2) MMI-0100 (SEC ID n° 1) y MMI-0200 (SEC ID n° 19) puede inhibir MK2 y otras quinasas diferentemente, que, dependiendo de la dosis aplicada, contribuye a este espectro de actividades inhibidoras; (3) podnan existir rutas compensatorias que regulan la actina a del musculo liso; (4) la formacion y/o migracion de los miofibroblastos tambien podnan ser una parte de la etapa de reparacion de la fibrosis antes bien que de dano activo, y (5) resulta necesario un nivel determinado de actividad de MK2, por lo tanto, par que se produzca el proceso (Liu et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 37: 507-517, 2007).

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Composicion farmaceutica para la utilizacion en el tratamiento de fibrosis pulmonar en un sujeto que resulta de la administracion de bleomicina, una reaccion alergica, la inhalacion de partmulas ambientales, el tabaquismo, una infeccion bacteriana, una infeccion vmca, danos mecanicos en un pulmon del sujeto, rechazo del trasplante pulmonar, un trastorno autoinmunologico, un trastorno genetico, o una combinacion de los mismos, en donde la fibrosis pulmonar se caracteriza por como mmimo una patologfa seleccionada del grupo que consiste en una deposicion aberrante de una protema de la matriz extracelular en un intersticio pulmonar, una estimulacion aberrante de la proliferacion de fibroblastos en el pulmon, una induccion aberrante de la diferenciacion de los miofibroblastos en el pulmon y una estimulacion aberrante de la union de miofibroblastos a la matriz extracelular, en comparacion con un sujeto de control sano normal, en donde la composicion farmaceutica comprende:

(a) una cantidad terapeutica de un polipeptido de la secuencia de aminoacidos YARAAARQARAKALARQLGVAA (SEC ID n° 1) o un equivalente funcional del mismo seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido de secuencia de aminoacidos FAKLAARLYRKALARQLGVAA (SEC ID n° 3), un polipeptido de secuencia de aminoacidos KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA (SEC ID n° 4), y un polipeptido de secuencia de aminoacidos HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA (SEC ID n° 7) y (b) un portador farmaceuticamente aceptable,

en donde la cantidad terapeutica resulta eficaz

(1) para inhibir la actividad de quinasa de una quinasa seleccionada del grupo de una protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2), una protema quinasa 3 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK3), una protema quinasa I dependiente de calcio/calmodulina (CaMKI, protema quinasa espedfica de serina/treonina) y un receptor de factor de crecimiento BDNF/NT-3 (TrkB, tirosina quinasa) y

(2) para reducir la proliferacion de fibroblastos y la deposicion de matriz extracelular en los tejidos del sujeto.

2. Composicion farmaceutica para la utilizacion segun la reivindicacion 1, en donde:

(a) la fibrosis pulmonar se caracteriza ademas por una inflamacion del tejido pulmonar, o (b) la proliferacion aberrante de fibroblastos y la deposicion de matriz extracelular en el tejido se caracteriza por una actividad aberrante de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2) en el tejido en comparacion con la actividad de la protema quinasa 2 activada por protema quinasa activada por mitogeno (MK2) en el tejido de un sujeto de control sano normal.

3. Composicion farmaceutica para la utilizacion segun la reivindicacion 2, en donde la inflamacion esta mediada por como mmimo una citoquina seleccionada del grupo que consiste en factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a), interleuquina-6 (IL-6) e interleuquina-1p (IL-1p).

4. Composicion farmaceutica para la utilizacion segun cualquier reivindicacion anterior, en donde:

(a) la composicion farmaceutica se formula para la administracion por via intratraqueal, tal como mediante inhalacion pulmonar; por via parenteral, intravenosa o intraperitoneal, o

(b) la composicion farmaceutica comprende ademas por lo menos un agente terapeutico adicional.

5. Composicion farmaceutica para la utilizacion segun la reivindicacion 4, en donde el agente terapeutico adicional:

(a) es un glucocorticoide seleccionado del grupo que consiste en prednisona, budesonida, furoato de mometasona, propionato de fluticasona, furoato de fluticasona y una combinacion de los mismos, o (b) es un broncodilatador seleccionado del grupo que consiste en un modificador de leucotrieno, un broncodilatador anticolinergico, un agonista p2 de accion corta y un agonista p2 de accion prolongada, y una combinacion de los mismos, o

(c) se selecciona del grupo que consiste en un colageno de tipo V bovino purificado, un antagonista de receptor de IL-13, un inhibidor de protema tirosina quinasa, un antagonista de receptor endotelial, un antagonista dual de receptor de endotelina, un analogo de prostaciclina, un anticuerpo monoclonal anti-CTGF, un antagonista de receptor de endotelina (A-selectivo), AB0024, un anticuerpo monoclonal de tipo lisil oxidasa 2 (LOXL2), un inhibidor de quinasa N-terminal de c-Jun (JNK), pirfenidona, IFN-Y1b, un anticuerpo humano IgG4 pan-neutralizador contra la totalidad de las tres isoformas de TGF-p, un inhibidor de activacion de TGF-p, una protema pentraxina-2 humana recombinante (rhPTX-2), un anticuerpo biespedfico de IL-4/IL-13, un anticuerpo monoclonal humanizado con diana en la integrina avp6, N-acetilcistema, sildenafilo, un antagonista de factor de necrosis tumoral (TNF) (etanercept) y una combinacion de los mismos, o

(d) es un agente analgesico o un agente antiinfeccioso.

Composicion farmaceutica para la utilizacion segun cualquier reivindicacion anterior, en donde el portador se selecciona del grupo que consiste en un portador de liberacion controlada, un portador de liberacion retardada, un portador de liberacion sostenida y un portador de liberacion a largo plazo.

Composicion farmaceutica para la utilizacion segun cualquier reivindicacion anterior, en donde la cantidad terapeutica de la composicion farmaceutica se administra mediante un dispositivo de inhalacion seleccionado de un nebulizador, un inhalador de dosis medida (IDM), un inhalador de polvos secos (IPS) o un nebulizador de polvos secos.

Composicion farmaceutica para la utilizacion segun la reivindicacion 7, en donde la composicion farmaceutica se encuentra en forma de unos polvos secos que comprenden micropartfculas con un diametro aerodinamico de la mediana de la masa (DAMM) de entre 1 y 5 pm.