PL58131B1 - - Google Patents

Description

19.IX.1963 Francja 58131 Opublikowano: 10.11.1970 KI. 30 h, 6 MKP C 12 d Wlasciciel patentu: Rhóne — Poulenc S.A., Paryz (Francja) Sposób wytwarzania nowego antybiotyku Wynalazek dotyczy wytwarzania nowego anty¬ biotyku, okreslanego w dalszej czesci opisu nume¬ rem 11.837 R.P. Ten nowy produkt ma specjalne znaczenie ze wzgledu na swa silna aktywnosc bak¬ teriobójcza w stosunku do bakterii Gram-dodat- nich. Otrzymuje sie go ze srodowisk hodowli sztucz- cznej mikroorganizmu opisanego dokladnie poni¬ zej, a nalezacego do grupy Streptomyces i ozna¬ czonego przez „Streptomyces vividans DS 9466" (NRRD 3087).Antybiotyk 11.837 R.P. latwo rozpuszcza sie w wodzie, rozpuszcza sie w metanolu, pirydynie, kwasie octowym, dwumetyloformamidzie, slabo lub nie rozpuszcza sie w etanolu, acetonie, chlorofor¬ mie oraz n-hekisanie.W roztworze wodnym antybiotyk 11.837 R.P. jest bardzo trwaly przy wartosci pH = 5—10 (po 2 ty¬ godniach przechowywania w temperaturze 37°C za¬ chowuje co najmniej 90°/o swej aktywnosci), jest srednio trwaly przy wartosci pH = 4 (w ciagu 2 ty¬ godni w temperaturze 37°C traci 30% aktywnosci), a stosunkowo nietrwaly jest przy wartosci pH = 2 (utrata 70°/o swej aktywnosci w ciagu 6 dni w temperaturze" 37°C).Antybiotyk 11.837 R.P. daje negatywne próby w nastepujacych reakcjach: w reakcji biuretowej, w reakcji chlorku zelazowego, w reakcji ninhydry- nowej. Pozytywne próby daje w nastepujacych reakcjach: w reakcji ninhydrynowej po hydrolizie kwasowej, w reakcji dwuazowahia, w reakcji 10 15 25 30 ksantoproteinowej, w reakcji z azotanem srebrowo- -amonowym (watpliwa przed hydroliza i bardzo wyrazna po hydrolizie kwasowej), w reakcji floro- glucyny, w reakcji karbazolu, w reakcji z nadman¬ ganianem potasowym, w reakcji Benedicfa po hy-' drolizie kwasowej. Antybiotyk ten zabarwia na po¬ maranczowo stezony kwas siarkowy, a na kolor bladorózowy stezony ikwas solny.Antybiotyk 11.837 R.P. jest mocnym kwasem, którego równowaznik kwasowy oznaczony za po¬ moca potencjometrycznego miareczkowania roz¬ tworem wodorotlenku sodowego wynosi 600 (pKa = 4,1). Ciezar czasteczkowy antybiotyku jest wyzszy od 5.000 poniewaz nie dializuje przez blo¬ ne z regenerowanej celulozy.Antybiotyk 11.837 R.P. zawiera wegiel, wodór, tlen, azot i fosfor. Jego sklad elementarny wypro¬ wadzony na podstawie analizy jego soli sodowej jest zblizony do nastepujacego: C = 46,9% H = 7,9% O = 39,2% N = 3,9% P = 2,22%.Charakteryzuje sie on nastepujacymi wlasciwo¬ sciami fizycznymi: Wyglad: proszek bezpostaciowy bialy Temperatura topnienia: nie ma wyraznego topnie¬ nia, rozklad nastepuje przy 160°C Widmo w podczerwieni (oznaczenia wykonano na pastylkach z KBr) przedstawiono na zalaczonym wykresie fig. 1, na którym na osi odcietych zna¬ czono dlugosci fal w mikronach (skala nizsza). Na wyzszej skali na osi odcietych oznaczono liczbe 5813158131 falowa w cm—i, a na osi rzednych wielkosc tran¬ smisji wyrazona w procentach.W tablicy I podano glówne pasma absorpcyjne w podczerwieni dla tego produktu.Tablica I tF — absorpcja bardzo silna F — „ silna m — „ srednia f — •' „ slaba ep — „ przegiecie 3360 tF 2930 F 1720 F 1630 tF 1564 m 1550 F 1430 1400 1380 1330 1164 m 1 1125 ep 1100 m 1068 tF 1040 tF 968 m ep 950 m ep 890 f F 860 f m 800 f 1222 f " ' t - Sól sodowa antybiotyku 11.837 R.P. ma nastepuja¬ cy sklad elementarny: C = 45,0% H = 7,4% O = 37,6% N = 3,72% P = 2,16% Na = 4,15%.Charakteryzuje sie ona nastepujacymi wlasci¬ wosciami fizycznymi: Wyglad: proszek bezpostaciowy praktycznie bialy Skrecalnosc: (a)2^ = 6° ± 1 (c = 0,6 woda) Widmo w ultrafiolecie: (oznaczenie'wykonano wy¬ chodzac z roztworu zawierajacego 30 mg tej soli w 1 1 wody).Koniec absorpcji: 7i% E^cm = 30 przy 220 mix E 1 cm 3,5 przy 257 m\x Widmo w podczerwieni (oznaczenie wykonano na pastylkach z KBr) przedstawiono na zalaczonym wykresie fig. 2, na którym na osi odcietych ozna¬ czono dlugosci fal w mikronach (skala nizsza). Na wyzszej skali osi odcietych oznaczono liczbe falo¬ wa w cm—1, a na osi rzednych wielkosc transmisji wyrazona w procentach.W tablicy II podano glówne pasma absorpcyjne w podczerwieni dla tego produktu.Tablica II ok. 3400 tF 2910 F 1730 tF 1547 m 1525 F 1430 ep 1378 F 1330 m 1238 m 1160 m 1100 m 1062 tF 1042 ep 1030 ep 972 m 947 m 890 f 860 f tF — F — m — f — ep — absorpcja „ i „ „ bardzo silna silna srednia slaba : przegiecie Aktywnosc bakteriostatyczna antybiotyku 11.837 R.P. w stosunku do bakterii okreslono za pomoca jednej z metod rozcienczania, stosowanych do tego celu. Dla kazdego rodzaju bakterii okreslono naj¬ mniejsze stezenie substancji, która w okreslonych warunkach, wstrzymuje calkowicie dajacy sie za¬ uwazyc rozwój w odpowiednim bulionie — pozyw¬ ce. Wyniki róznych Oznaczen podano w przytoczo¬ nej ponizej tablicy III, w której minimalne steze¬ nia bakteriostatyczne wyrazone sa w mikrogra- mach substancji na cm3 badanego srodowiska.Z tych róznych oznaczen wynika, ze antybiotyk 11.837 R.P, oddzlalowuje glównie na bakterie Gram- -dodatoie. Zwlaszcza dziala on silnie na Strepto- coccus hemolyticus. Stosunkowo slabo dziala na 10 15 35 55 bakterie Gram-ujemne, aczkolwiek na mikroorga¬ nizmy Neisseria catarrhalis, Neisseria gonorrhaeae i Brucella abortus bovis dziala dosyc znacznie. Nie wykazuje on zadnego uodpornienia sprzezonego z nastepujacymi antybiotykami: penicylina, strepto¬ mycyna, tetracyklina, chloramfenikolem, spiramy- cyna, karbomycyna, erytromycyna, pristynahiycy- na i nowobiocyna. Wyniki róznych oznaczen dzia¬ lania stezen bakteriostatycznych antybiotyku 11.837 R.P. na rózne szczepy stafylokokowe, wykazujace odpornosc na jeden lub kilka antybiotyków wy¬ mienionych powyzej podano w tabeli IV, w której stezenia bakteriostatyczne odnosza sie do trzech szczepów stafylokokowych, czulych na te wszyst¬ kie antybiotyki i podanych w tablicy III., Tablica III Staphylococcus aureus, szczep 209 P-ATCC 6538 P Staphylococcus aureus, szczep 133 (Instytut Pasteura) Staphylococcus aureus, szczep Smith Sarcina lutea — ATCC 9341 Streptococcus faecalis — ATCC 9790 Streptococcus viridans (Instytut Pasteura)| Streptococcus pyogenes hemolyticus (szczep Dig 7, Instytut Pasteura) Neisseria gonorrhaeae (A 50 — Instytut Pasteura) Diplccoccus pneumoniae (szczep Til, Instytut Pasteura) Bacillus subtilis — ATCC 6633 Bacillus cereus — ATCC 6630 Mycobacterium species — ATCC 607 Mycobacterium para-smegmatis (A 75 — Lausanne) Escherichia coli — ATCC 9637 Shigella dysenteriae — Shiga L, (Instytut Pasteura) Salmonella paratyphi A (Lacasse, Instytut Pasteura) Salmonella schottmuelleri (paratyphi B) Fougenc (Instytut Pasteura) Proteus vulgaris — A 244 Klebsiella pneumoniae — ATCC 10.031 Pseudomonas aeruginosa (szczep Bass — Instytut Pasteura) Brucella bronchiseptica (CN — 387 Wellcome Instytut) Brucella abortus bovis B 19 Pasteurella multocida (A 125, Instytut Pasteura) Treponema Reitera 0,15 0,15 0,35 150 50 0,6 0,005 1,25 0,03 3 0,03 35 65 35 40 55 30 165 60 40 9 2,5 1,5 2058131 Tablica IV Badane szczepy (Staphylococcus aureus) — szczep 209 P-ATCC 6538 P (s) — szczep 209 P uodporniony na .spira- mycyne — szczep 209 P uodporniony na karbomy- cyne — szczep 209 P uodporniony na pristyna- mycyne — szczep 209 P uodporniony na nowobio- cyne — szczep 133 (Instytut Pasteura) (s) — szczep Smith (s) — szczep B3 (odporny na penicyline i streptomycyne) — szczep Hbl (odporny na penicyline i te- v tracykline) — szczep Beaujon 3 (odporny na penicy¬ line, na Streptomycyne, na teracy- kline i na chloramfenikol) — szczep MB I (odporny na penicyline i na erytromycyne) — szczep Lavault (odporny na penicyli¬ ne, na erytromycyne i na spiramy- cyne CO i c^cbsr S"BS ,*J +j w 23 "co o S-a « 0,15 0,2 0,15 0,25 04 0,15 0,35 0,2 0,3 0,3 0,1 0,1 Aktywnosc antybakteryjna antybiotyku 11.837 R.P. zostala stwierdzona „in vivo" na zwierzetach, poddawanych badaniom laboratoryjnym zakazo¬ nych eksperymentalnie bakteriami takimi jak streptokoki, pneumokoki, stafylokoki i Neisseria (N. meningitidis). Antybiotyk ten jest zwlaszcza skuteczny u myszy przy podawaniu pozajelitowym, przy czym skutecznosc przy podawaniu dozylnym jest 2 razy silniejsza, niz przy podawaniu podskór¬ nym/Dzialanie jego jest bardzo dlugie, dzieki cze¬ mu jest on bardzo dobrym srodkiem zapobiegaw¬ czym. Dzialanie zapobiegawcze wykazano wobec zakazen stafylokokami i streptokokami u myszy.Tak na przyklad dawka 250 mg/kg, podawana do¬ zylnie antybiotyk 11.837 R.P. zabezpiecza wszystkie myszy przed infekcja pozajelitowa streptokokiem nastepujaca w 56 dni po jednorazowym przyjeciu tego srodka. Przy takiej samej dawce (250 mg/kg), lecz podawanej podskórnie, benzatyna — penicy¬ lina G zabezpiecza myszy tylko w ciagu 24 go¬ dzin.Toksycznosc antybiotyku 11.837 R.P. badano glównie u myszy. Dawka smiertelna 50% lub DL50 okreslano przez podawanie produktu podskórnie i dozylnie.DL50 = 1,7 g/kg podskórnie DL30 = 1,5 g/kg dozylnie Wyniki te wskazuja, ze produkt jest bardzo malo toksyczny. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6 Organizm, wytwarzajacy antybiotyk 11.837 R.P. nalezy do gatunku Streptomyces i okreslany jest nazwa „Streptomyces viridans DS 0466". Jest on zdeponowany w laboratorium NRRD w Peorii 111.Stany* Zjednoczone Ameryki pod numerem „NRRL 3087".Organizm ten zostal wyosobniony z próbki zie¬ mi pobranej kolo Madras w Indiach.Sposób wyosobnienia jego jest nastepujacy: z po¬ branej ziemi tworzy sie zawiesine w destylowanej, wyjalowionej wodzie, po czym zawiesine rozcien¬ cza do uzyskania róznych stezen. Z kazdego roz¬ cienczenia mala objetosc rozprowadza sie na plyt¬ kach Petri'ego, zawierajacych pozywke z agaru.Po kilkudniowym okresie inkubacji w tempera¬ turze 26°C kolonie mikroorganizmów, które chce sie wyosobnic zaszczepia sie na agarze — pozywce, skosnie ustawionym w celu otrzymania wiekszych ilosci mikroorganizmów.Przy zastosowaniu klasyfikacji Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (VII wydanie 1#57) dla gatunku Streptomyces, a takze klasyfikacji i opisów wskazanych przez S.A. Waksman'a w „The Actinomycetes" (The Williams and Wilkins Com¬ pany, Baltimore, 1961) stwierdzono, ze cechy morfo¬ logiczne organizmu wytwarzajacego antybiotyk 11.837 R.P. odpowiadaja tym, które podano dla Streptomyces viridans. Dlatego tez organizm, wy¬ twarzajacy antybiotyk 111.837 R.P., uznano jako na¬ lezacy do tego gatunku i nazwano go Streptomy¬ ces viridans DS 9466.W tablicy V przeprowadzono porównanie cech szczepu Streptomyces viridans DS 9466 z gatun¬ kiem Streptomyces viridans, okreslonym w „Ber- gey's Manual of Determinative Bacteriology" (VII wydanie 1957) (The Williams and Wilkins Compa¬ ny, Baltimore). Porównanie to wskazuje wyraznie, ze organizm wytwarzajacy antybiotyk 11.837 R.P. wykazuje cechy odpowiadajace cechom Streptomy¬ ces viridans, a istniejace pewne male róznice przy¬ pisywane sa jedynie róznym szczepom tego same¬ go gatunku.Streptomyces viridans DS' 9466 posiada wlasci¬ wosc wytwarzania w pewnych srodowiskach ho¬ dowlanych, zwlaszcza w srodowisku Bennettfa zie¬ lonego rozpuszczonego pigmentu, który na poczatku jego wytwarzania i wówczas, gdy wytworzony jest juz w ilosci wystarczajacej, ma intensywne szma¬ ragdowozielone zabarwienie. To wytwarzanie pig¬ mentu zielonoszmaragdowego jest dosyc nieregular¬ ne i zalezy zwlaszcza od stopnia posiewu mikro¬ organizmu w srodowiskach, w których wytwarza sie pigment. Obecnosc ziemi sprzyja wytwarzaniu pigmentu. Zielonoszmaragdowe zabarwienie sub- stratu ulega zmianie. W miare starzenia sie ho¬ dowli, w zaleznosci od srodowiska hodowlanego i od ilosci wytwarzanego pigmentu kolor substratu zmienia sie na zielono-czarniawy lub zielono-bru- natny lub brazowo-szarawy.S8131 T a ib 1 i c a V Wzrost wege¬ tatyw¬ ny Grzyb¬ nia na¬ powie¬ trzna Streptomyces viridans (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Wydanie VII, str. 758—759) Zelaty¬ na Agar Agar synte¬ tyczny Kolonie zielone do koloru bru- natno-zielonego Ciemnoszara za¬ barwiona na oliwkowo lub kolor szarozie¬ lony, aksamitna, pokrywa cala kolonie. Sporo- fory dlugie, tworzace spira¬ le. Spory walco¬ wate Przejscie w stan ciekly szybkie Wzrost kolonii koloru brazowo- zielonego Tworzenie sie rozpuszczalnego pigmentu brazo¬ wego Kolonie zielone Wytwarzanie zielonego roz¬ puszczalnego pigmentu Streptomyces viridans DS 9466 Grzybnia wegetatywna] zóltoszarawa do zóltego ostrego lub zóltobru- natnego. W niektórych osrodkach zabarwia sie| na zielono przechodzac w kolor brazowo-zie- lony lub zielono-czar- niawy w strefach, gdzie wytwarza sie zielony rozpuszczalny pigment Jasno-szara do ciemna- szarego, w postaci pro¬ szku, dobrze rozwinie ta, sporofory dlugie, monopody, których fra gmenty koncowe sta¬ nowia lancuchy podat ne do tworzenia roz¬ galezien wzdluz ich glównego pnia. Lancu cny spor wygiete lub tworzace krótkie spi¬ rale. Spory walcowate Przejscie w stan ciekly umiarkowane Wzrost wegetatywny zólty lub brunatnawy do brunatno-zielonego zaleznie od srodowiska.Brak rozpuszczalnego pigmentu lub brunat¬ nawy; ponadto produk¬ cja rozpuszczalnego zielonego pigmentu mniej lub wiecej regu larna Grzybnia wegetatywna zóltawa do brunatnej, zabarwiajaca sie na zielono z wytwarza¬ niem sie zielonego, roz¬ puszczalnego pigmentu.Brak pigmentu roz¬ puszczalnego lub zólta¬ wy do brunatnawego, najczesciej malo inten¬ sywny. W niektórych! przypadkach wytwarza sie zielony rozpuszczal¬ ny pigment w malych ilosciach (agar z glice- 15 20 30 35 40 £0 55 60 65 8 c.d. tablicy V 10 Mleko Sacha¬ roza Skro¬ bia Celulo¬ za Azo¬ tyny Wlasci¬ wosci antago- nisty- czne | Strepitomyces viridans (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, . Wydanie VII, str. 758—759) \ koagulacja i szybka pepto- nizacja iszyka inwersja szybka hydroliza wzrost ograni¬ czony aktywnie wy¬ tworzone z azo-* tanów brak Streptomyces viridans DS 9466 ryny i asparagina, agar ze skrobia Waksman) lub obficiej (agar Czap¬ ka z gliceryna); za¬ uwazono, ze w tym ostatnim przypadku wplyw wywiera obec¬ nosc ziemi.Peptonizacja powolna, nie poprzedzona koa¬ gulacja w temperatu¬ rze 25°C, ze slaba koa¬ gulacja w temperaturze 37°C malo stosowana dosc szybka hydroliza wzrost dodatni szybko i silnie wytwo¬ rzone z azotanów wytwarza antybiotyk 11.837 R.P.Streptomyces viridans DS 9466 stanowi ustrój zarodnikowy, napowietrzny, barwy szarej dosyc ciemnej, dobrze rozwijajacy sie w zwyklych sro¬ dowiskach hodowlanych, a zwlaszcza w srodowisku Bennetfa. Tworzy on spory walcowate o szero* kosci 0,7—0,9 \x i dlugosci 1,3—1,5 M-. Jego sporo¬ fory sa monopodialne. Tworza one dosyc czesto ustrój rozgaleziony o skomplikowanej budowie.Niektóre nitki sporonosne maja jeden lancuch spor, lecz czesto nitka napowietrzna zakonczona jest pekiem kilku nitek sporonosnych, najczesciej 2—4, umieszczonych w tym samym punkcie na koncu nitki. Jedna lub kilka nitek umieszczonych na koncu nitki glównej moga ewentualnie dzielic sie z kolei w swej czesci koncowej, aby tworzyc takze nowe grupy o 2—4 lancuchach spor. Wzdluz dlugosci nitki glównej i nitek drugorzednych mozna czesto zaobserwowac powstale rozgalezienia, badz jednej samej nitki sporonosnej, zakonczonej jed¬ nym lancuchem spor, badz jednej nitki zakonczo¬ nej kilkoma lancuchami spor, umieszczonymi w jej punkcie koncowym, badz czasami 2 lub 3 nit-9 kami sporonosnymi, umieszczonymi w tym samym punkcie, które posiadaja lub nie maja rozgalezien koncowych. Lancuchy spor sa wygiete o konców¬ kach po prostu wygietych, albo zwijaja sie zakre¬ slajac jeden lub dwa zwoje spiralne, które tworza spirale na ogól otwarte.Cechy hodowlane i wlasciwosci biochemiczne Streptomyces viridans DS 9466 zostaly zbadane na pozywkach agarowych i bulionach — pozywkach, zwykle stosowanych do okreslania wygladu szcze¬ pów Streptomyces. Dokonane obserwacje podano na zalaczonej tablicy VI.Dokladne dane dotycza hodowli po 2—4 ty¬ godniach inkubacji w temperaturze 26°C, dopro¬ wadzonych do dobrego stanu rozwojowego. Wiek¬ szosc zastosowanych srodowisk hodowlanych zo¬ stala przygotowana wedlug danych zawartych w „The Actinomycetes" S. A. Waksman strona 193— 197, Chronica Botanica Company, Waltham Mass.U.S.A. 1950 i w przypadku tym podano litere W z odpowiednim numerem z „The Actinomycetes".Sklad srodowisk hodowlanych lub odpowiednie odnosniki literaturowe dla tablicy VI podano w ponizszym zestawieniu: A — K. L. Jones — Journal of Bacteriology, 57, 142 (1949) B — A. M. Williams i E. Mc CO¥ — Applied Microbiology, I 307 (1953) C — GRUNDY i inni — Antibiotics and Chem, 2, 401 (1952) D — 0,5% peptonu, 0,3% ekstraktu miesnego, 0,5% tyrozyny i 2% agaru E — sole nieorganiczne, skrobia z agarem — T. G.PRIDHAM i inni, Antibiotics Annual, 1956— 1957, strony 947—953.F — odpowiada przepisowi W — 1, w którym 30 g sacharozy zastapiono przez 15 g gliceryny G — „Zelatyna czysta" wytworzona wedlug wska¬ zówek z „Manual of Methods for Pure Cul- •ture Study of Bacteria" — Society of Ame¬ rican Bacteriologists, Geneva, N. Y. -1150 -18.H — Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria — Society of American Bacterio¬ logists, Geneva, N. Y. 1150 -18.I — Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria — Society of American Bacterio¬ logists, Geneva, N. Y. 1150 -19.J — odpowiada przepisowi W —18, w którym usu¬ nieto sacharoze i zastapiono ja malymi pa¬ skami bibuly, zanurzonymi czesciowo w cieczy.K — odciagane mleko w proszku, rekonstytuowane wedlug wskazówek producenta.L — H. D. TRESNER i F. DANGA — Journal of Bacteriology, 76, 239—244 (1958).Wedlug Pridham'a i Gottliefra — (J. of Bact. 56, 107—114, 1948), przy hodowli Streptomyces vi- ridans DS 9466 odpowiednim zródlem wegla sa nastepujace skladniki: ksyloza, arabinoza, ramno.- za, glukoza, galaktoza, lewuloza, mannoza, lakto¬ za, maltoza, trehaloza, celobioza, dekstryna, skro¬ bia, inulina, erytryt, adonit, dulcyt, sorbit; w mniejszym stopniu nadaje sie sacharoza, gdyz roz¬ wój hodowli jest slaby i powolny, prawie zaden po 10 dniach i pozwala jedynie na ograniczony roz¬ wój w ciagu miesiaca. 10 Sposób wytwarzania antybiotyku 11.837 R.P. po¬ lega zasadniczo na hodowaniu Streptomyces vi- ridans DS 9466 (NRRL 3087) lub jego mutantów w odpowiednim srodowisku odzywczym i warunkach 5 aerobowych i na nastepnym wyosobnieniu anty¬ biotyku, wytworzonego w czasie tej hodowli.Szczep Streptomyces viridans DS 9466 mozna hodowac stosujac kazda metode hodowli aerobo- wej, powierzchniowej lub podpowierzchniowej, io przy czym ta ostatnia . jest korzystniejsza ze wzgledu na wygode. Do tegb celu stosuje sie róz¬ nego rodzaju aparature, uzywana powszechnie w przemysle fermentacyjnym. Mozna stosowac zwlaszcza nastepujacy tok operacji: Streptomyces 15 wiridans DS 9466 — produkt wyjsciowy.Hodowla na agarze Hodowla w kolbie wstrzasanej Hodowla posiewu w zbiorniku fermentacyjnym Hodowla produkcyjna w zbiorniku fermentacyjnym 20 Srodowisko fermentacyjne powinno zasadniczo zawierac zródlo przyswajalnego wegla i azotu, skladniki mineralne i ewentualnie czynniki wply¬ wajace na wzrost, przy czym wszystkie te sklad¬ niki mozna wprowadzac w postaci okresjbnych 25 substancji lub mieszanin zlozonych, jakie wystepu-, ja w substancjach biologicznych róznego pochodze¬ nia.Jako zródlo przyswajalnego wegla mozna stoso¬ wac weglowodany takie jak glukoza, sacharoza, 30 laktoza, dekstryny, skrobie, melasy lub inne sub¬ stancje weglowodorowe, jak alkoholo-cukry; np. mannit lub niektóre kwasy organiczne takie, jak kwas mlekowy, cytrynowy, winowy. Niektóre ole*- je pochodzenia zwierzecego lub roslinnego, jak olej 35 smalcowy lub olej - sojowy moga z korzyscia, za¬ stapic te rózne zródla weglowodorowe lub moga byc tez do nich dodane.Odpowiednie zródla przyswajalnego azotu sa bardzo róznorodne. Moga to byc bardzo proste 40 substancje chemiczne jak: azotany, nieorganiczne i organiczne sole amonowe, mocznik, aminokwasy.Mozna je takze wprowadzac poprzez substancje zlozone, zawierajace glównie azot w postaci pro- teidów jak: kazeina, albumina, mleko, gluten i ich 45 produkty hydrolizy, maka sojowa, maka z orzesz¬ ków ziemnych, maczka rybna, ekstrakty miesne, drozdze, ,.distillers solubles" (rozpuszczalne pozo¬ stalosci z destylacji spirytusu zbozowego), namok kukurydziany. 50 Niektóre sposród dodawanych skladników nie¬ organicznych takie, jak fosforany metali alkalicz¬ nych lub metali ziem "alkalicznych albo weglany wapnia i magnezu, moga dzialac jako mieszaniny buforowe lub neutralizujace. 55 Inne skladniki takie, jak chlorki i siarczany me¬ tali alkalicznych i ziem alkalicznych wplywaja na ustalenie równowagi jonowej koniecznej dla roz¬ woju szczepu Streptomyces viridans DS 9466 i do wytworzenia antybiotyku. Inne zwiazki nieorga- 60 niczne jak sole cynku, kobaltu, zelaza, miedzi i manganu dzialaja zwlaszcza jako aktywatory re¬ akcji przemiany materii szczepu Streptomyces vi- ridans DS 9466.Wartosc pH srodowiska fermentacyjnego przy 65 rozpoczeciu hodowli winna wynosic 6,0^7,8, ko-58131 11 TablicaVI 12 Srodowisko hodowlane 1 Agar Ben- nettfa' (A) Agar z mal- zoza i tryp- tonem (B) Agar 1Emerson'a (W-2& Agar Iz glukoza i peptonem (W-7) Agar Iz pozywka (W-5) Agar Iz glukoza li asparagina (W-2) Agar z gliceryna i asparagina (W-3) Agar zjablczanem wapniowym Krainsky'e- go (C) Agar z tyrozyna (D) Agar ze skrobia (W-ll) Agair ze skrobia Pridhama(E) Stopien rozwoju 2 dobry dobry sredni sredni slaby sredni umiar¬ kowa¬ ny dobry dobry umiar¬ kowa¬ ny dobry Grzybnia wegetatywna lub grzybnia podsta¬ wowa 3 l grzybnia podstawowa zólto-szarawa, zabar¬ wiajaca sie na kolor brazowo-zielony w miejscach, gdzie wy¬ twarza sie rozpusz¬ czalny pigment zielony grzybnia podstawowa brazowo-zólta, szara¬ wa brunatno-zólta jasna dobrze rozwinieta jasno-zólta, dosyc do¬ brze rozwinieta zólto-szarawa jasna, rozwój umiarkowany zólto zywy do zólto- brazowego zólto-brunatnawa, z nieregularnym sladem zielonawym grzybnia podstawowa w kolorze zólto-szara- wym, jasna grzybnia podstawowa brazowo-zólta grzybnia podstawowa szaro-zielonawa do ciemno-brazowo-zielo- nej grzybnia podstawowa zólto-szarawa, jasna Wyglad grzybni napowietrznej (obejmujacy calosc grzybni napowietrznej i aporulacji) 4 jasno szara do ciemno szarej dobrze rozwi¬ nieta bialawa do szarej bialawa, slady bialawa, bardzo umiarkowany nie ma nie ma pod ko¬ niec dwóch ty¬ godni, w hodow¬ lach starszych rozwój umiarko- kowany bialawy do szarego bialo-szarawa do jasnego sza¬ rawego, rozwój bardzo umiarko¬ wany biala do jasno¬ szarego bialawa, umiar¬ kowanie rozwi¬ nieta bialawa do sza¬ rej, umiarkowa¬ nie rozwinieta szara jasna, do- i syc dobrze roz¬ winieta Rozpuszczalny pigment 5 zielony, wskutek sta¬ rzenia staje sie szaro- zielonawy do brazowo- zielonego bardzo ciem¬ nego az do czarniawe¬ go, zaleznie od wytwo¬ rzonej ilosci szaro-brazowy malo intensywny brak zóltawy malo inten¬ sywny brak brak w ciagu 2 ty¬ godni. Po miesiacu szarawy do szaro-zie- lonawego w malej ilo¬ sci szaro-brazowy malo intensywny, przewaz¬ nie wytwarzany w malej ilosci zielona- wy do szaro-zielonego brak lub wytwarzany z opóznieniem, szara¬ wy malo intensywny brazowo-zólty zielono-szarawy do szaro-zielonawego brak Obserwacje i wlasciwosci biochemiczne 6 wytwarzaniu pigmentu roz¬ puszczalnego zielonego sprzyja obecnosc ziemi " * rozpuszczanie jablczanu wap¬ niowego dobre rozpusz¬ czanie tyrozyny umiarkowana hydroliza skro¬ bi58131 13 14 c.d. tablicy VI 1 1 Agar syn¬ tetyczny Czapka z gliceryna (F) Hodowla Ina kartoflu |(W-27) Zelatyna czysta 12% (G) Bulion- pozywka z azotanem (HJ Bulion Iz glukoza li azotanem [Dimmick'a |(i) Syntetyczny bulion Czapka z celuloza (j) Mleko odtluszczone a) o tempe¬ raturze 26° (k) b) o tempe¬ raturze 37° 1 2 dobry dosyc dobry sredni dobry umiar¬ kowa¬ ny dosc dobry dobry dosc dobry 1 3 grzybnia podstawowa jasna zólto-brazowa jasna do brazowo-zól- tej, ciemniejsza w ko¬ lorze ciemino-brazowo- zielonym w miejscach wytwarzania sie pig¬ mentu zielonego, roz¬ puszczalnego grzybnia wegetatywna brazowo-zólto-zielo- nawa do zielonej b. ciemnej, w miare sta¬ rzenia staje sie bra- zowo-czarniawa hodowla na powierz¬ chni ograniczona do poziomu inokulacji, grzybnia podstawowa zólta obraczka bialawa na powierzchni slaba obraczka i zmet¬ nienie bardzo umiar¬ kowanie rozpostarte na powierzchni bialo-szarawa do zól¬ tawej jasnej obraczka dobrze roz¬ winieta zóltawa, bar¬ dzo blada obraczka srednio roz¬ winieta, jasno-zólta do jasnej, brazowo- zóltej 1 * bialawa do sza¬ rej bialawa do jas¬ no szarej Rozwój umiar¬ kowany bialawa do sza¬ rawej Rozwój umiar¬ kowany Rozwój bardzo ograniczony, bialawa brak lub biala¬ wa, slady szara, dobrze rozwinieta na calej czesci pa¬ pieru wynurzo¬ nej z bulionu brak, wzglednie slady bialawe brak, wzglednie slady bialawe 1 5 j asno-zólto-brazowy do brazowo-zóltego, jasnego, po dodaniu ziemi do srodowisko wytwarza sie zielony rozpuszczalny pig¬ ment, który w trakcie starzenia staje sie brazowo-szarawy do brazowo-zielonego, bardzo ciemnego pra¬ wie czarniawego wytwarzany z opóz¬ nieniem, obfity, zielo¬ ny, bardzo ciemny przechodzacy w czar¬ no-zielonawy, przeni¬ ka przez caly karto¬ fel wytwarzanie opóznio¬ ne nie wystepuje.Brak po 2 tygodniach po miesiacu jasno- zóltawy brak zólty, bardzo blady brak 1 " _ 6 obecnosc ziemi sprzyja wyraznie wytwarzaniu w tym srodowisku pigmentu zielo¬ nego, rozpusz¬ czalnego Przejscie zelatyn ny w stan ciekly, lecz stosunkowo powolne, w ciagu miesiaca niezu¬ pelne reakcja azotyno- wa silnie dodat¬ nia bardzo silnie do¬ datnia reakcja azotyriowa reakcja azotyno- wa silnie dodat¬ nia W ciagu 2 tygod¬ ni wyglad mleka niezmieniony, po¬ tem powolna petonizacja, pra¬ wie calkowita pod koniec mie¬ siaca rozwoju ho¬ dowli, nie ma koagulacji, pH przechodriiod 6,3 do 7,2—7,4 w cia¬ gu miesiaca, w ciagu 2 tygodni wyglad mleka niezmieniony, po uplywie 3—4 ty-15 58131 c.d. ta'blicy VI 16 1 1 Srodowisko Tresner'ai Dange'a (L) 2 3 4 5 - 6 godni hodowli lekka koagulacja z poczatkiem peptonizacji. pH z 6,3 przechodzi w 5,9—6,1 w cia¬ gu miesiaca Nie wytwarza sie H2S rzystnie 6,5—7,5. Optymalna temperatura dla fer¬ mentacji jest 25°—28°C, lecz zadowalajacy rozwój hodowli produkcyjnej uzyskuje sie juz w tempera¬ turze 23—3i5°C. Stopien napowietrzania srodowiska fermentacyjnego moze sie wahac w dosc szero¬ kich granicach. Stwierdzono jednak, ze szczegól¬ nie korzystne jest doprowadzanie powietrza w ilosci 0,3—2 litrów na litr bulionu na minute. Naj¬ lepsza wydajnosc antybiotyku uzyskuje sie po 4— 7 dniach rozwoju hodowli, przy czym czas ten za¬ lezy zasadniczo od zastosowanego srodowiska.Z powyzszego wynika, ze ogólne warunki ho¬ dowli Streptomyces viridans DS 9466 dla wytwa¬ rzania antybiotyku 11.837 R.P. moga zmieniac sie w dosc znacznym stopniu w zaleznosci od potrzeb.Antybiotyk 11.837 R.P. mozna wyosobnic z brzeczki fermentacyjnej róznymi sposobami: Brzeczke fermentacyjna mozna przesaczyc przy wartosci pH = 7 lub wyzszej, lecz w tych warun¬ kach znaczna czesc aktywnej substancji pozostaje w placku filtracyjnym, z którego nalezy nastepnie wyekstrahowac produkt czynny. Korzystniej jest wiec przesaczyc brzeczke przy wartosci pH ponizej 5, a najkorzystniej przy wartosci pH okolo 3, bo¬ wiem w tych warunkach substancja czynna po¬ zostaje w placku filtracyjnym, skad mozna ja wy¬ ekstrahowac przy wartosci pH = 3—7, za pomoca wody, zawierajacej alkohol o niskim ciezarze czasteczkowym, taki jak metanol, etanol lub pro- panol, albo za pomoca mieszaniny niskoczasteczko- wych alkoholi alifatycznych zawierajacych do 6 atomów wegla, przy czym najodpowiedniejsza mieszanina stanowi normalny butanol + metanol w stosunku objetosciowym 2:1 lub 3:1. Mozna takze brzeczke fermentacyjna przepuscic przez ko¬ lumne, zawierajaca zywice jonitowa, typu silnego anionitu, a nastepnie eluowac za pomoca rozpusz¬ czalnika wodinoaflJkohoilowego, takiego jak wodny roztwór metanolu, zawierajacy elektrolit.Surowy produkt mozna wyosobnic z podanych powyzej roztworów alkoholowych lub wodno-alko- holowych przez zageszczenie roztworu do malej objetosci. Zageszczenia takiego dokonuje sie do¬ godnie w temperaturze ponizej 40°C pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Przez oziebienie i (lub) przez dodanie slabego rozpuszczalnika dla antybiotyku 1L837 R.P., takiego jak: keton, eter, ester, rozpusz¬ czalnik chlorowany, benzen lub heksan, wytraca sie surowy antybiotyk. Jezeli antybiotyk znajduje sie w przesaczu brzeczki hodowlanej, to roztwór ten ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem nie mieszaja- 10 15 20 30 35 40 45 50 cym sie z woda, takim jak alkohol alifatyczny o 4—5 atomach wegla. Nastepnie postepuje sie jak podano powyzej: zageszcza sie do malej objetosci i wytraca.Antybiotyk 11.837 R.P. mozna nastepnie oczyscic przez zwiazanie go na zywicy jonitowej o charakte¬ rze silnego anionitu i nastepnie wyeluowanie za pomoca roztworu wodnoalkoholowego, zawieraja¬ cego elektrolit taki jak kwas solny lub chlorek so¬ dowy, amonowy, potasowy, wapniowy lub magne¬ zowy, w ilosci 5—50 g na litr eluatu. Nastepnie eluat zageszcza sie do malej objetosci w tempera¬ turze ponizej 40°C pod zmniejszonym cisnieniem i koncentrat poddaje dializie w przeciwpradzie wody destylowanej przy zastosowaniu przepony z • celulozy renerowanej. Sole nieorganiczne i rózne zanieczyszczenia przechodza z woda, a antybiotyk 11.837 R.P. pozostaje w calosci w roztworze po dializie. Roztwór ten zageszcza sie azeotropowo do bardzo malej objetosci przez dodanie butanolu pad zmniejszonym cisnieniem. Antybiotyk oczyszczony wytraca sie z wodnego koncentratu za pomoca mie¬ szaniny rozpuszczalników, takiej jak aceton i izo- propanol ewentualnie z dodatkiem eteru lub tlenku izopropylu, w takich ilosciach, aby nie nastapilo wydzielenie sie mieszaniny z fazy wodnej, przy czym korzystnymi mieszaninami sa aceton-izopro- panol (4:1 objetosciowo) i aceton-izopropanol-eter (1:1:1 objetosciowo).Mozna takze antybiotyk poddac innemu oczysz¬ czaniu, które polega na zmieszaniu wodnego roz¬ tworu antybiotyku 11.837 R.P. z zywica jonitowa o charakterze silnego kationitu az do osiagniecia stalej wartosci pH w granicach 2—3. Nastepnie wyciag przemywa sie rozpuszczalnikiem nie mie¬ szajacym sie z woda, takim jak alkohol alifatycz¬ ny 0 4_5 atomach wegla lub ester na przyklad octan etylowy, lub mieszanina tych rozpuszczal¬ ników. Korzystnie operacje prowadzi sie za pomo¬ ca mieszaniny równych objetosci normalnego bu¬ tanolu i octanu etylu. Warstwe wodna zageszcza sie do 1/1000, dodaje butanolu i zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem przy ciaglym dodawa¬ niu butanolu. Antybiotyk 11.837 R.P. oczyszczony otrzymuje sie przez dodanie slabego rozpuszczal¬ nika antybiotyku, takiego jak heksan, odwirowa¬ nie, przemycie i wysuszenie.Oczywistym jest, ze opisane metody mozna sto¬ sowac kolejno w dowolnym porzadku lub powta¬ rzac kilkakrotnie zaleznie od wymagan technolo-58131 17 gicznych przy otrzymywaniu antybiotyku 11.837 R.P.Ponizsze przyklady nie ograniczajac wynalazku wyjasniaja jak mozna stosowac go w praktyce.W przykladach tych aktywnosc oznaczono za po¬ moca testu biologicznego metoda dyfuzji, stosujac jako wskaznik Bacillus subtilis i odnoszac rezulta¬ ty do wzorca czystego antybiotyku 11.837 R.P.Aktywnosc ta okreslana jest w jednostkach (u) na 1 mg w przypadku produktów stalych i w jed¬ nostkach (u) na 1 cm3 w przypadku roztworów (jednostka ta okresla najmniejsza ilosc produktu, który po rozpuszczeniu w 1 cm3 odpowiedniego sro¬ dowiska hodowlanego, wstrzymuje wzrost Staphy- lococcus aureus 209 P w okreslonych warunkach).Przyklad I. Do zbiornika fermentacyjnego o pojemnosci 170 litrów wprowadza sie: namok kukurydziany 4,800 kg glukoze uwodniona 2,400 kg chlorek sodowy 0,600 kg siarczan magnezowy 0,120 kg woda do 100 litrów Po dojpcrowadzeniu pH mieszaniny do wartosci 7,15 za pomoca 575 cm3 stezonego roztworu wodo¬ rotlenku sodowego (d = 1,33) dodaje sie jeszcze 0r600 kg weglanu wapniowego.Nastepnie srodowisko hodowlane sterylizuje sie w ciagu 40 minut przez wprowadzenie za pomoca belkotki pary o temperaturze 122°C. Po oziebieniu objetosc bulionu wynosi 120 litrów, a wartosc pH = 7,15. Nastepnie srodowisko obsiewa sie 200 cm3 kultury szczepu Streptomyces viridans DS 9466, znajdujacej sie we wstrzasanej erlenmeyerce.Hodowla rozwija sie w temperaturze 26QC w ciagu 28 godzin przy wstrzasaniu i napowietrzaniu wy¬ jalowionym powietrzem i wówczas nadaje sie do obsiewu hodowli produkcyjnej.Hodowla produkcyjna odbywa sie w zbiorniku fermentacyjnym o pojemnosci 350 litrów, zalado¬ wanym nastepujacymi substancjami: ~ maczka sojowa 8 kg „tBistdjlles' saluibles 1 kg (rozpuszczalne pozostalosci 2 destylacji spirytusu zbozowego) skrobia 3 kg olejsojowy 3 litry weglan wapniowy 2 kg chloreksodowy 2 kg uwodniony chlorek kobaltawy (6HzO) 4 g wodado 180 litrów Srodowisko o wartosci pH = 7,05 sterylizuje sie w ciagu 40 minut przez doprowadzanie za pomoca belkotki pary o temperaturze 122°C. Po oziebieniu objetosc bulionu wynosi 200 litrów, a wartosc pH=7,15. Wówczas obsiewa sie go 20 litrami ho¬ dowli poprzedniej ze zbiornika fermentacyjnego 170 litrowego. Hodowla odbywa sie w temperaturze 26—27°C w ciagu 138 godzin przy wstrzasaniu i napowietrzaniu powietrzem wyjalowionym. War¬ tosc pH srodowiska wynosi wówczas 7,90, a obje¬ tosc brzeczki 180 litrów. Ilosc antybiotyku w tej brzeczce fermentacyjnej wynosi 4515 u/cm3.Przyklad II. Hodowla z posiewu odbywa sie w zbiorniku fermentacyjnym 170 litrowym w wa¬ runkach podanych w przykladzie I. 18 Hodowla produkcyjna odbywa sie w zbiorniku fermentacyjnym 350 litrowym, zawierajacym na¬ stepujace substancje: namok kukurydziany q kg 5 skrobia 2 kg olejsojowy 3 Htry uwodniony chlorek kobaltawy (6 H20) 4 g wodado ' 175 litrów Po doprowadzeniu pH mieszaniny do wartosci 10 5,90 za pomoca 380 cm3 stezonego roztworu wodo¬ rotlenku sodowego (d = 1,33) dodaje sie Jeszcze 1 kg weglanu wapnia.Mieszanine sterylizuje sie w ciagu 40 minut przez wprowadzanie przy pomocy belkotki pary o tempe- 15 raturze 122°C. Po oziebieniu srodowisko hodowla¬ ne uzupelnia sie przez dodanie wyjalowionego roz¬ tworu skladajacego sie z: siarczanu amonowego 0,4 kg wodydo 5 litrów 20 Wtedy objetosc bulionu wynosi 200 litrów, a war¬ tosc pH = 6,80. Obsiewa sie go 20 litrami hodowli ze zbiornika fermentacyjnego 170 litrowego. Ho¬ dowla odbywa sie w temperaturze 26—27°C w cia¬ gu 144 godzin przy wstrzasaniu i napowietrzaniu 25 wyjalowionym powietrzem. Koncowa wartosc pH srodowiska wynosi 8,40, a objetosc brzeczki fer¬ mentacyjnej 185 litrów. Ilosc antybiotyku w brzecz¬ ce fermentacyjnej wynosi 3550 u/cm3.Przyklad III. 200 litrów brzeczki fermenta¬ cyjnej o aktywnosci 2855 u/cm3 przy wartosci on pH = 8,4 doprowadza sie w kadzi zaopatrzonej w mieszadlo do wartosci pH = 3 przez dodanie 5 n roztworu kwasu solnego. Nastepnie dodaje sie 12 kg pomocniczego srodka filtracyjnego. Mieszanine przesacza sie przez prase filtracyjna, a placek fil- 35 tracyjny przemywa 60 litrami wody wodociagowej.Przesacz i wode z przemycia, praktycznie nie¬ aktywne odrzuca sie do scieków. Z placka filtra¬ cyjnego tworzy sie zawiesine w 150 litrach mie¬ szaniny butanolu (2 objetosci) i metanolu (1 obje¬ tosc) w trakcie mieszania. Wartosc pH mieszaniny doprowadza sie wówczas do 6 przez dodanie 10 n roztworu wodorotlenku sodowego. Mieszanie kon¬ tynuuje sie w ciagu 30 minut, po czym papke prze¬ sacza sie przez prase filtracyjna.Przesacz zachowuje sie, a placek filtracyjny przemywa 30 litrami mieszaniny butanolu i me¬ tanolu opisanej powyzej. Calosc przesaczu i cieczy z przemycia (185 litrów) ma aktywnosc 2075 u/cm8. 50 Placek filtracyjny odrzuca sie. Przesacz alkoholo¬ wy zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem (20 mm Hg) w temperaturze 35°C do objetosci 2 litrów.Wytracony w czasie zageszczania antybiotyk od- 55 dziela sie przez odsaczenie, przemywa acetonem i -suszy w suszarce pod próznia (5 mm Hg). Otrzy¬ muje sie 254 g szarozielonego produktu o aktywno¬ sci 1Q25 u/mg.Przyklad IV. 375 litrów brzeczki hodowlanej 60 o wartosci pH = 7,9 przesiewa sie w celu usuniecia najwiekszych czasteczek. W kadzi w trakcie mie¬ szania doprowadza sie wartosc pH do 7 za pomo¬ ca 5 n kwasu solnego, po czym dodaje 22,5 litrów zywicy Dowex 1X2 traktowanej chlorkami. Mie- 65 szanie konltynuuje sie w ciagu 2 godzin. Nastep- 40 4558131 19 nie mieszanine przesiewa sie przez sito drgajace.Zywica pozostaje na sicie, a wyekstrahowana brzeczke odrzuca sie. Potem zywice laduje sie do kolumny i przemywa kolejno 50 litrami wodnego 5% roztworu chlorku sodowego, a nastepnie 10 li¬ trami wody. Przemyta zywice odwadnia sie przez wprowadzenie 20 litrów metanolu. Eluowania do¬ konuje sie za pomoca roztworu metanolowego, za¬ wierajacego 20% wody i 2,8% chlorku amonowego.Eluaty zbiera sie po 10 litrów. Trzy pierwsze frak¬ cje z eluowania zawieraja 98% aktywnego produktu wyeluowanego. Laczy sie je i zageszcza pod zmniej¬ szonym cisnieniem (20 mm Hg) az do objetosci 3 litrów. Roztwór zageszczony o aktywnosci 92,950 u/cm3 i gestosci"= 1,057 dializuje sie w ciagu 48 godzin w przeciwpradzie wody destylowanej przy zastosowaniu przepony z celofanu. Po tym okre¬ sie objetosc roztworu wynosi 4,7 litra, a gestosc 1,025. Roztwór zageszcza sie pod zmniejszonym ci¬ snieniem (5 mm Hg) do objetosci 300 cm3 po czym poddaje liofilizacji. Otrzymuje sie 48 g suro¬ wego produktu o aktywnosci 6530 u/mg.Przyklad V. 250 g surowego antybiotyku wy¬ tworzonego sposobem wedlug przykladu III roz¬ puszcza sie w 4 litrach wody o wartosci pH = 8.Wodny roztwór przesacza sie, po czym przepusz¬ cza przez kolumne, zawierajaca 2,7 litrów zywicy jonitowej Dowex 1 X 2 (w cyklu chlorowym), a od¬ ciek odrzuca sie. Zywice przemywa sie 2,5 litrami wody,, a nastepnie 2,5 litrami mieszaniny metano¬ lu i wody (80:20 objetosciowo). Na koniec antybio¬ tyk eluuje sie 10 litrami mieszaniny metanolu i wody (80:20 . objetosc/objetosc), zawierajacej 7,5 *g/l chlorku potasowego.Eluat zageszcza sie do 400 cm3 pod zmniejszonym cisnieniem (20 mm Hg) w temperaturze ponizej 40°C. Koncentrat dializuje sie w ciagu 24 godzin w przeciwpradzie wody destylowanej przy zastosowa¬ niu przepony z regenerowanej celulozy w celu usu¬ niecia soli nieorganicznych oraz róznych zanieczysz¬ czen organicznych.Roztwór po dializie, zawierajacy cala substancje aktywna z eluatu (650 cm3) zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem (20 mm Hg) do objetosci 125 cm3.Do otrzymanego koncentratu dodaje sie 20 obje¬ tosci mieszaniny z eteru, acetonu i izopropanolu (10 : 10 : 10 objetosciowo), co powoduje wytracenie sie antybiotyku. Po odsaczeniu go, przemyciu aceto¬ nem i wysuszeniu w ciagu jednej nocy w tempera¬ turze 35°C pod cisnieniem 2 mm Hg otrzymuje sie 8,25 g jasnoibrazowego proszku o aktywnosci 24.600 u/mg.Przyklad VI. 7,9 g proszku otrzymanego w przykladzie V rozpuszcza sie w 790 cm3 warstwy ciezszej wydzielonej z mieszaniny n — butanolu, octanu etylu i wody (10 : 10 : 20 objetosciowo) i mie¬ sza az do uzyskania stalej wartosci pH=2,l z zy¬ wica Amberlite IR 120 (w cyklu kwasowym), do¬ dawana w malych ilosciach (50 cm3 w calosci). Zy¬ wice odsacza sie, a otrzymany roztwór przemywa dwukrotnie 790 cm3 warstwy lzejszej, wydzielo¬ nej z powyzej podanej mieszaniny. Ciecze z prze¬ mycia z kolei ekstrahuje sie ponownie taka sama objetoscia warstwyciezszej. 65 20 15 20 25 30 35 45 50 55 60 Ciecze warstwy ciezszej laczy sie, zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem (20 mm Hg) do objetosci 15 cm3. Do otrzymanego wodnego koncentratu do¬ daje sie 20 objetosci mieszaniny metanolu i eteru. (4 : 6 objetosciowo).- Antybiotyk wytraca sie i z pierwszego rzutu uzyskuje sie 3,05 g o aktywnosci 18.300 u/mg.Przesacz zageszcza sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem (20 mm Hg) do objetosci 100 cm3. Nastepnie dodaje sie 320 cm8 metanolu i 35 cm8 normalnego butanolu. Zageszcza sie do objetosci 15 cm8 pod zmniejszonym cisnieniem (20 mm Hg) w tempera¬ turze ponizej 40°C. Po dodaniu 15 objetosci n-hek- sanu, odwirowaniu, przemyciu heksanem i wysusze¬ niu w ciagu nocy w temperaturze 35°C pod cisnie¬ niem 2 mm Hg, otrzymuje sie 1,78 g oczyszczonego antybiotyku o aktywnosci 36,000 u/mg.Ciecze warstw lzejszych laczy sie i zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem (20 mm Hg) do objetosci okolo 70 cm3. Przez dodanie 15 objetosci heksanu wydziela sie 1/5 g brazowego proszku o aktywnosci 17.200 u/mg.Przyklad VII. 542 mg antybiotyku wytworzo¬ nego w przykladzie VI o aktywnosci 36.000 u/mg rozpuszcza sie w 20 cms wody. Wartosc pH, która po tym rozpuszczeniu wynosi 2,3 doprowadza sie do 6,85 za pomoca 8,9 cm8 0,1 n Na OH i obojetny roz¬ twór liofilizuje. Otrzymuje sie 565 mg soli sodowej antybiotyku, której roztwór wodny wykazuje mak¬ simum absorpcji w ultrafiolecie przy 256,5 mu E 1% 1 cm = 106. Jej sklad elementarny jest na¬ stepujacy: C = 47,4% H = 7,07% O = 35,3% (z róznicy) N = 5,01% P = 1,84% Na = 3,4%.Przyklad VIII. 50 g antybiotyku, wytworzo¬ nego sposobem wedlug przykladu V rozpuszcza sie w 500 cm8 wody destylowanej. Roztwór dializuje sie w ciagu nocy za pomoca 40 litrów wody desty¬ lowanej przy zastosowaniu przepony z celulozy re¬ generowanej.Po dializie do roztworu antybiotyku dodaje sie 1 objetosc n-propanolu i mieszanine wprowadza do górnej czesci kolumny, zaladowanej w kierunku od dolu do góry weglem granulowanym, uprzednio przemytym rozcienczonym kwasem solnym, 75 g, zywica Amberlite IR 120 (cykl H) 125 cm3, weglem granulowanym tego samego rodzaju co powyzej w ilosci 500 g.Po przepuszczeniu roztworu antybiotyku przez kolumne, przeprowadza sie eluowanie za pomoca mieszaniny n-propanolu i wody (50 : 50 objetoscio¬ wo). Frakcje zawierajace substancje aktywna (7 litrów) laczy sie, zobojetnia do wartosci pH — 7 za pomoca 1 normalnego roztworu wodorotlenku sodu i zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze ponizej 40°C do objetosci 140 cm8.Koncentrat dializuje sie w ciagu 24 godzin w przeciwpradzie czterokrotnie po 10 litrów wody de¬ stylowanej, a nastepnie z dodatkiem 1 objetosci n-propanolu.Nastepnie wytraca sie antybiotyk przez dodanie 10 objetosci acetonu. Po jego oddzieleniu i wysusze¬ niu otrzymuje sie 23,5 g antybiotyku w postaci soli sodowej o aktywnosci 42.400 u/mg.58131 21 Przyklad IX. 22 g antybiotyku wytworzonego wedlug przykladu VIII rozpuszcza sie w 110 cm3 wody, po czym do roztworu dodaje 110 cm3 n-propa- nolu i mieszanine przepuszcza przez kolumne za¬ wierajaca 100 cm3 tlenku glinowego uprzednio przemytego o wartosci pH = 4. Eluowanie przepro¬ wadza sie za pomoca mieszaniny n-propanolu z woda (50 :50 objetosciowo). Frakcje, zawierajace substancje aktywna, laczy sie (430 cm3), zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze po¬ nizej 40°C do objetosci 100 cm3, koncentrat dializuje w ciagu nocy w przeciwpradzie 10 litrów wody de¬ stylowanej. Do dializatu dodaje sie 1 objetosc n-propanolu i wytraca aktywna zasade 10 obje- tosciami acetonu. Otrzymuje sie 12 g oczyszczonego antybiotyku w postaci soli sodowej o aktywnosci 44.000 u/mg, którego dane charakterystyczne sa na¬ stepujace: 10 22 37,6% (z róznicy) N = 3,72% C = 45,0% H = 7,4% O = P = 2,16% Na = 4,15%. 22 (a)— ^r + 6o + i (c =Q6% _ woda) Widmo w ultrafiolecie: koniec absorpcji: m^iE * 1 cm 220 257 30 3,5 PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego antybiotyku 11.837 R. P. znamienny tym, ze szczep Streptomyces viri- dans DS 9466 (NRRL 3087), hoduje sie w srodowisku odzywczym i w warunkach aerobowych, po czym wytworzony w toku tej hodowli antybiotyk wyosab- nia za pomoca klasycznych metod ekstrakcji i oczyszczania. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 4000 • V ' P" 3000 S- 1 / . - A f\] - - - 2000 -1 - -1 - - ^ - \ 1500 . - - II- 1200 100C i i ¦ 000 fioo 700 cm"1 -¦—' • 1

1. . 1 1 1 \* 10 11 12 13 14 15 mikronów 15 mlkroncw^ PL