PL41785B1 - - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania no¬ wego antybiotyku. Antybiotyk ten, który dalej nazwany jest spiraimycyna, otrzymuje sie na drodze fermentacji z kultury specjalnego, poni¬ zej opisanego mikroorganizmu. Dotychczas nie mozna jep bylo otrzymac w postaci krystalicz¬ nej. Jako zasada stanowi ona bialy, bezposta¬ ciowy proszek; jej addycyjne sole z kwasami, np. siarczan i chlorowodorek, mozna wyosobnic w postaci stalej. Rozpuszcza sie ona w chloro¬ formie, w rozpuszczalnikach chlorowanych, al¬ koholach, heksanie, benzenie, ketonach, octanie etylowym i amylowym. Siarczan jest rozpusz¬ czalny w wodzie i nizszych alifatycznych alko¬ holach jak metanol, etanol, butanol. Analiza elementarna zasady wykazuje, ze zawiera ona tylko takie pierwiastki jak wegiel, wodór, tlen i azot; liczne analizy, które zostaly przeprowa¬ dzone na próbkach zasady daly nastepujace wartosci: wegiel wodór tlen azot 60,0 — 61,0Vo 8,9 — 9,4°/o 25,5 — 27,0*/o 3,3 — 3,6°/o Stosujac metode przeciwpradowego rozdzie¬ lania i urzadzenie Graig'a (Journal of Biologi- cal Chemistry, 155 1944 str. 519), przy zastoso¬ waniu cykloheksanu i wodnego roztworu spira- mycyny, który zawieral 1% fosforanu diwusodo- wegb mozna stwierdzic obecnosc trzech sklad¬ ników. Te trzy skladniki wydaja sie bardzo po¬ dobne do siebie pod wzgledem skladu, wlasci¬ wosci chemicznych i dzialania bakteriobójczego.Ciezar czasteczkowy zasady obliczony z obo¬ jetnego równowaznika albo przez okreslenie jo¬ nów siarczanowych w siarcaanie wynosi <400)n doJ450)n.Z oznaczenia ciezaru czasteczkowego sposo¬ bem Rasta wynika, ze n = 2. Zawartosc azotu równiez miesci sie w tych granicach, co wska-zuje na to, ze caly a^ot jest zasadowy. Zasada daje negaitywme próby w nastepujacych reak¬ cjach: yr reakcji Sakageucl^a, w reakcji Mo- lish'a, w reakcji ninhyflrynowej, w reakcji nin- hydronowej po kwasnej hydrolizie, w reakcji z roetoworem Fehlinga, w reakcja biuretowej, w reakcji soli zelazawej maltolu, w reakcji soli zelazawej maltolu po alkalicznej hydrolizie.Z mocnymi, stezonymi kwasami daje zasada zabarwienie c^erwano-fioletowe. Zasada jest optycznie czynna, a jej roztwory w chlorofor¬ mie albo w alkoholu etylowym sa lewoskretne (C = 2% w etanolu) dla szczególnie czystego produktu.Jej widmo absorpcyjne (roztwory w alkoholu etylowym) wykazuje w ultrafiolecie jedyne ma¬ ksimum przy 231 m\x (E {^ = 346 dla szcze- [L] ^ 72° golnie czystej próbki) przez co rózni sie ona od erytromycyny (280 mj*) i od karbomycyny (240 mpi), do których jest podobna w swoim dzialaniu bakteriobójczym. Rózni sie ona od tych dwóch antybiotyków tym, ze bakterie uod¬ pornione na dzialanie spiramycyny zachowuja czesciowa wrazliwosc na dzialanie erytromycyny i karbomycyny. Spiramycyna dziala szczególnie na bakterie Gram — dodatnie, jest jednak mniej aktywna w stosunku do bakterii Gram — ujem¬ nych; wykazuje ona pewne dzialanie na myco bakterie. Dziala ona bardzo skutecznie na bak¬ terie anaerobowe, a szczególnie na Clostridium septicum i Clostridium histolytioum. W poniz¬ szej tabeli przedstawiono obraz dzialania bak¬ teriobójczego czesciowo oczyszczonej próbki, przy czym dzialanie to oznaczono w srodowisku cieklym.Tabela I Szczepy bakteryjne Ewentualna odpornosc Wyleganie Aktywnosc micg/cm8 staphy i» »» » »» aureus 209 P »» » »» »» Bs 2700 R16 Hb Beaujon 3 16 godz. w temp. 37° Penicylina-Streptomycyna „ „ „ Streptotrycyna-Streptomy- cyna-neomycyna „ ,, ,, CMorotertjracyMina-oksytetra cyklina „ „ „ Chlorotetracyklina-okisy- tetra-cyklina-chloroamfe- nikol-penicylina-strepto- mycyna 16 godz. w temp. 37° Klebs. pneumoniae ATCC 9997 Bac. cereus ATCC 6630 Micro, citreus Sarc. lutea ATTCC 9341 Strept. faecaMs Strept faecalis ATCC 9790 Strept hemolyticus Strept yindans Diplo. pneumoniae Neisseria catarrhaMs Mycobact. Sp. ATCC 607 i* i , NR ,, ti ii SR Corynebact pseudodiphtericum Bac. subtilis ATCC 6633 Brucella bronchiseptica CN-387 Bac. mycoides Mycobact. phlei Mycobact parasmegmatis Gaff. tetragenia Neomycyna Streptomycyna 1,4 3,5 1,6 1,6 1,6 ,, 16 40 16 ,, i* tt 40 ,, ii tt ii 16 ,, »» 40 , ,, j 16 , 28° 37° 28° 37° „ „ »» »» ii ii 37° », 11 ii 11 it 11 *i it 37* , ii 28° 37° » a ii 37° 33,0 2,7 5,1 0,8 1,0 1,0 0,6 3,1 0,2 10,3 85,0 38,0 38,0 3,5 3,75 75,0 2,3 33,0 166,0 0,8 — 2 —Spirymycyna podawana m vivO myszy za- równo doustnie jak i podskórnie jest bardzo skuteczna w malych ilosciach maksymalnie do¬ puszczalnych dawek przy infekcjach wywola¬ nych streptokokami, pneumokokami staphyleko- kamu Okazalo sie, ze jest ona Skuteczna jako sro¬ dek przeciw malarii przy zakazeniu myszy P. Berghei. Wykazuje ona takze dzialanie lecz¬ nicze i zapobiegawcze przy zakazeniach myszy tyfusem. Jej toksycznosc dla myszy jest bardzo mala: mysz znosi ja dobrze w dawce doustnej 5 g/kg. Dawka smiertelnia (DL50) dla 50°/o zwie¬ rzat wynosi przy stosowaniu podskórnym 1,5— 2,5 g/kg, a przy stosowaniu dozylnym 0,15— 0,25 g/kg.Organizm, który wytwarza nowy wedlug wy¬ nalazku antybiotyk jest pewnym rodzajem z gatunku Streptomyces i jest oznaczony poni¬ zej jako „S. 3486"' albo „Streptomyces 3486" (jak równiez jego odmiany).Mikroorganizm ten wyosobniono z próbki zie¬ mi, która pochodzila z pola z okolic Perronne w departaraeaicie Somme (Francja). Sposób wy¬ osobnienia jest nastepujacy: Próbke ziemi zawieszono w sterylnej destylo¬ wanej wodzie, zawiesine rozcienczono, po czym mala czesc tej zawiesiny rozpostarto na plytce Petri'ego z agarem jako pozywka. Po 7-mio dniowym okresie wylegania w 28°C pobrano kolonie Streptomyces 3486 za pomoca drucika platynowego do zaszczepienia agaru, jako po¬ zywki, umieszczonego w skosnie ustawionych próbkach w celu otrzymania wiekszych ilosci mikroorganizmu.Ten szczep Streptomyces 3486 zlozono w la¬ boratorium w Northern Regional Research La- boratory (NRRL), Peoria 5 Illinois, USA pod nazwa NRRL 2420.Przy zastosowaniu klasyfikacji Bergeys'a „Ma¬ nual of determinative Bacteriology" (VI wyda¬ nie 1949) dla gatunku Streptomyces mozna ten orgamizm uwazac za pokrewny Streptomyces giriseolus, który najpierw zostal opisany przez Waksmana pod nazwa Aotinomyces 96 (Soil Science 8,121 (1919). Jak sie ponizej okaze miedzy Streptomyces 3486 a mikroorganizmem opisanym przez Waksmana istnieja pewne rózmice, tak ze te dwa mikroorganizmy nie mozna zaszeregowac do tego samego rodzaju.Niektóre wlasciwosci Streptomyces 3486, szcze¬ gólnie wytwarzanie brunatnego pigmentu w sro¬ dowisku syntetycznym i na ziemniakach mogly¬ by pozwolic na zaszeregowanie go w poblizu Streptomyces fimiearius. Wytwarzanie pigmen¬ tu przez Sttfeptotóytees 3486 jest w tych dfwóoh przypadkach bardzo niewielkie. Rózni sie on po¬ za tym od Streptomyces fimacarius szeregiem irmych wlasciwosci.W koncu szczep Streptomyces 3486 wykazal w czasie prac nad jego identyfikacja ztotitimi* wlasciwosci. Ponizszy opis podaje jego najczes¬ ciej wystepujace wlasciwosci.Morfologia mikroskopowa.Szczep Streptomyces 9486 podczas hodowania na agarze Czapka z klukoza wytwarza rozga¬ lezione nitki. W warunkach sprzyjajacych ho¬ dowli mozna szybko zaobserwowac tworzenie sie lancuchów zarodników, które sa przyczepione do nitek glównych pojedynczo lub zbiorowo w drzewiastych rozgalezieniach. Nitki zarodni¬ ków moga byc zakrzywione, srubowe albo nie¬ regularnie skrecone.W katach miedzy nitkami zarodników znajdu¬ ja sie czesto elementy niesegmentowe W posta¬ ci srub z licznymi zamknietymi spiralawt. Za¬ rodniki maja naogól rózny ksztalt, od krótkiego owalnego do okraglego.Postac kolonii.Pojedyncze hodowle zarodnikowe na agarze z asparagina dajja kolonie okragle, których wiel¬ kosc moze sie zmieniac w zaleznosci od stopnia rozwoju. W przypadku gestej hodowli kolonie sa male, okragle, pólkuliste i moga w pewnych przypadkach wykazywac mniej lub wiecej wy¬ razne centralne wglebienia. Tworzenie sie za¬ rodników jest szybkie i na ogól rozciaga sie na cala kolonie albo na jej obwód z tendencja tworzenia wokól kolonii drzewiastych rozga¬ lezien. Zabarwienie poczatkowo bialej napo¬ wietrznej grzybni w momencie wytwarzania za¬ rodników przechodzi w szare.W przypadku kiedy kolonie nie sa zbyt licz¬ ne, ksztalt ich moze sie zmieniac, jednak naj¬ czesciej wyglad takiej kolonii jest okragly i ko¬ lonia moze osiagnac srednice do 10 mm.Zóltawa wegetatywna grzybnia ma postrze- piione brzegi i posiada wzdluz promieni glebo¬ kie faldy i liczne w^pólsrodkowe wybrzuszenia, przy czym na ogól w srodlku kolonii powstaje wglebienie. Wzdluz fald wystepuja rysy, szcze¬ gólnie w srodku kolonii, dzieki którym widac wegetatywna grzybnie od strony dolnej. Po¬ czatkowo biala grzybnia napowietrzna (bardzo lekko zabarwiona na kolor jasno-zólto-rózowy) w momencie tworzenia zarodników bardzo szyb¬ ko staje sie szara. To tworzenie sie zarodników moze nastapic bardzo intensywnie na zewnetrz¬ nej czesci kolonii. - 3 _Warunki hodowlane — wlasciwosci bioche^ mierne.Warunki hodowli i reakcje biochemiczne przedstawiono w ponizszej tabeli. Zastosowa¬ ne srodowiska hodowlane zostaly przygotowa¬ ne przewaznie wedlug ujawnionych danych przez S. A. Waksmana w „The Aotinomycetes" (1950, Chroniica Bdtanica Company, Waldhaim Mas; USA; strona 193—197).Dane okreslone dla róznych srodowisk poda¬ ne w „The Acltinomycetes,, zostaly zachowane.Tabela II Cechy charakterystyczne hodowli Srodowisko Grzybnia wegetatywna Grzybnia napowietrzna tworzenie sie zarodników exo pigment (zabarwienie) Agar syntetyczny Zóltawa do szarawej biala, w momencie szybkie (srodowisko Czapika Nr 1) Agar syntetyczny z glukoza rozwija sie prawie wy¬ lacznie pod powierzch¬ nia, wzrost na po¬ wierzchni ogranicza sie prawie calkowicie do grzybni napowietrznej Zóltawa do pomaran¬ czowej tworzenia sie zarodni¬ ków przechodzi w sza¬ ra bialo-zóltawa Agar z asparagi- Zóltawa — postrzepio¬ na Nr 3 na biala Agar z jableza- nem wapniowym Szybki rozwój, podobnie jak na pozywce syn¬ tetycznej Nr 1 wolniejsze szarawe szare z lekka tendencja do koloru zólto¬ zielonego, moze tworzyc na brzegach kolonii drze¬ wiaste rozga- lezienia b. slabe bra- ztowo-zóltawe bardzo slabe, brazowo- czerwonawe slabe, brazo- wo-zólte brak zabar¬ wienia Agar z tyrozyna Prawie nie rozwija sie -— (Nr 4) Gdukoza-bulion Wzrost umiarkowany bardzo slabo rozwi- (Nr 16) zóltawa nieta Pepton^agar-bu- bursztytnowo-zólta Uon (Nr 5) Pepiton-glukoza- zóltawa agar na brzegach kultury biale slabo rozwinieta, bia¬ lawa istnieje lub nie istnieje w zaleznosci od kultury zóltawo-szare o ile istnieje brak zabar¬ wienia bursztynówo- zólta, slabe albo brak za¬ barwienia zólto^brazo- we, slabe albo bez za¬ barwienia slabe brazo- wo-zóltawe albo bez za¬ barwienia — 4 —Srodowisko Grzybnia wegetatywna Grzybnia napowietrzna tworzenie sie zarodników exo pdgmeot (zabarwienie) Srodowisko Emersona Ziemniaki zólto-po do zólto-brazowej jasna do ciemino-bira- zowej w zaleznosci od kultury biala, na brzegach kultury bardzo roz¬ winieta powierzchnia o wy¬ gladzie proszku z od¬ cieniem szarym istnieje lub nie istnieje w zaleznosci od kultury zólta- wo^szare o ile istnieje istnieje lub nie istnieje w zaleznosci od kultury, szarawe slabe brazo- wo-zóltawe albo bez za¬ barwienia rózne, slabo brazowe do brazowo-czer- wonego, moze zabarwic ziem^ niaki i wode na dnie rurki Wlasciwosci biochemiczne.Mleko w temperaturze 26°C: hodowla two^ rzy blonke. Czesciowa peptonizacja w ciagu 1 miesiaca, bez widocznej koagulacji. Strefa speptonizowana moze przybierac zabarwienie brunatno-pomaranczowe albo czerwonawe. Na mleku z czerwienia bromokrezolowa: pH nie¬ zmienione albo w zaleznosci od kultury prze¬ chodzi w zakres alkaliczny.Mleko w temperaturze 37°C: rozwój slabszy.Zdarza sie wystepowanie klaczków, czesciowa peptonizacja.Zelatyna (sklad nr 7 i 8 wedlug Waksmana): srednie uplynnienie. Zóltawa blonka i zóltawe klaczki w czesci uplynnionej- Zabarwienie: zmienne, brunatno-pomaranczo¬ we, slabe w czesci uplynmionej, silniejsze w srodowisku glukozy.Azotyny: redukcja azotanów do azotynów nastepuje w srodowisku syntetycznym (w obec¬ nosci sacharozy). W srodowisku organicznym reakcje na azotyny sa ujemne.Zastosowanie róznych zródel wegla", doswiad¬ czenia te zostaly przeprowadzone przy zasto¬ sowaniu metody Pridham'a i Gottliba (J. Bact. 56, 107—114 (1948).Substancje, które mozna korzystnie stosowac: gliceryna, arabinoza, glukoza, lewuloza, man- noza, laktoza, ramnoza, galaktoza, skrobia, man¬ nit.Rzadziej stosowane substancje (hodowle do¬ brze lecz wolniej rozwijajace siie) albo niere¬ gularnie stosowane substancje: ksyloza, sacha¬ roza, maltoza, inozyt.Substancje nie nadajace sie do stosowania: rafinoza, erytryt, dulcyt, sorbit Porównanie miedzy S. gtriseolus i S. 3486: ponizsza tabela podaje pewne wlasciwosci, z której widoczne sa wspólne lub rózne cechy opisanego przez Waksmana szczepu S. gtriseolus i szczepu wytwarzajacego spiramycyne.Tabela III Streptomyces griseolus Szczep S. 3486 Morfologia mikroskopowa Me zauwazono postaci spiralnych, zarodniki owalne do kulistych przewaga szarej grzybni napo¬ wietrznej, pigment nierozpuszczal¬ ny pigment brazowy, slaby lub brak uplynnia, zóltawa blonka Agar syntetyczny Glukoza-bulion Zelatyna Ziemniaki Mleko Azotany Pigment kremowy do czarnego, ziemniak brazowieje koaguluje, peptonizuje redukuje do azotynów tworzenie slabego braz. pigmentu obecne formy spiralne; zarodniki owalne lub kuliste przewaga szarej grzybni napo¬ wietrznej, bardzo slaby zólto-bra- zowy pigment pigment bursztynowo-zólty lub brak uplynnia; slabo zólto-brazowy pig¬ ment jasno do ciemno brazowego, ziem¬ niak zabarwia sie na brazowo przy 26°C: peptonizuje bez wi-. docznej koagulacji redukuje do azotynów jbworzenie slabego zóltawego do brazowego pigmentuWedlug jednego ze sposobów wedlug wyna¬ lazku spiramycyne wytwarza sie w ten spo¬ sób, ze wodny osrodek z pozywka zaszczepia sie kultura szczepu S. 3466, nastepnie przeprowa¬ dza sie fermentacje aerobowa i wytworzona w ten sposób spiramycyne oddziela od srodo* wiska hodowlanego. Srodowisko hodowlane za¬ wiera takze opisany juz w literaturze antybio¬ tyk (Cosar, Ninet, Pinnert, Preud'homme, C. R. 234) 1488 (1952), który nazwano kongocydyna (Desjpois i Ninet, 6, Infternationaler Mikrofodo- logischer Kongres, Rajssunti delie Communica- zLoni, tom I, str. 162 (1953).Kongocydyna nie posiada tych samych cie¬ kawych wlasciwosci co spiramycyna i moze byc wyodrebniona w postaci krystalicznej. Rozdzie¬ lenie tych dwóch antybiotyków mozna latwo przeprowadzic jak to opisano ponizej.Hodowle S. 3486 mozna prowadzic na drodze fermentacji powierzchniowej; przewaznie jed¬ nak lepiej jest prowadzic proces fermentacji na drodze podpowierzchniowej.Fermentacje mozna prowadzic, w szczegól¬ nosci wedlug nastepujacego schematu: Hodowla na agarze Hodowla w erlenmeyerkach wstrzasanych Poaiew w zbiorniku fermentacyjnym * Hodowla produkcyjna w zbiornikach fermen-; tacyjnych.Srodowisko z pozywka zawiera jak w innych srodowiskach w których hoduje sie inne grzyb¬ ki w celu otrzymania antybiotyków, zródlo we¬ gla przyswajalnego, organiczne lub nieorga¬ niczne zródlo azotu przyswajalnego, pewne so¬ le mineralne jak fosforany i slady róznych me¬ tali, które normalnie znajduja sie jako zanie¬ czyszczenia w pozostalych skladnikach srodo¬ wiska.Jako zródlo wegla przyswajalnego mozna stosowac tluszcze ("oleje roslinne lub zwierzece), rózne poliole (gliceryne) i korzystnie przyswa¬ jalne we^owodany jak awykla skrobie, skro¬ bie rozpuszczalna, cukier jak sacharoze, gluko¬ ze, maltoze i dekstroze i inne weglowodany roz¬ puszczalne lub tylko czesciowo rozpuszczalne w wodzie jak alkoholo-cukry.Jako odpowiednie zródlo azotu przyswajalne¬ go mozna stosowac liczne substancje jak ami¬ nokwasy, shydfolizowana lub nieshydrolizowa- na kazeina, macfeke rybna, make sojowa, ekstrak¬ ty miesne, pazosteloscc z ekstrakcji watroby, roz¬ puszczalne skladniki wywaru gorzelnianego tak zwane distillets solubles, ekstrakty albo autoli- zaty drozdzowe i rózne inne substancje pocho¬ dzenia roslinnego lub zwierzecego, zawieraja¬ ce azot Jako zródlo azotu mozna dodac do sno- dowiiska takze substancje chemiczne, jak mocz¬ nik, azotany albo sole amonowe.Stwierdzono, ze namok kukurydziany z po¬ wodu zawartych w nim duzych ilosci substan¬ cji organicznych i nieorganiioznych jest dobrym srodkiem pomocniczym dla srodowiska fermen¬ tacyjnego. Korzystne jest takze dodawanie do srodowiska zasadniczych soli mineralnych, jak soli sodowych, np. chlorku, soli wapniowych, np. weglanu itd.PH srodowiska doprowadza sie przed stery¬ lizacja do odczynu obojetnego, korzystnie do wartosci miedzy 6—7. FermentaBR prowadzi sie w temperaturze 24—28°C, korzystnie w 26°C.Rozwój hodowli produkcyjnej nie jest bardzo szybki; mozna jednak uwazac go za ukonczony po trzech lub czterech dniach. Glównymi cha¬ rakterystycznymi cechami procesu fermentacji jest poczatkowe obnizenie watrtoscti pH do oko¬ lo 6,4, a pózniej po okolo 30 godzinach wzrost wartosci pH do okolo 7,5, a czasem i wyzej.Wydaje sie, ze ten wzrost wartosci pH zbiega sie z zakonczeniem zuzycia glukozy.Aktywnosc antybiotyczna, która wywoluje spi¬ ramycyna wzrasta regularnie od poczatku fer¬ mentacji. Jakkolwiek napowietrzanie nie jest czynnikiem krytycznym i moze zmieniac sie w szerokich granicach korzystne jest doprowa¬ dzanie powietrza w ilosci 0,5—2 litrów na litr bulionu na minute.Spiramycyne mozna wyosobnic z cieczy fer¬ mentacyjnej rozmaitymi sposobami. Sposób, który dotychczas okazal sie korzystny, polega na ekstrakcji za pomoca rozpuszczalnika. Moz¬ na stosowac rozpuszczalnik, który pozestawia w srodowisku fermentacyjnym substancje, two¬ rzace sie równoczesnie podczas fermentacji jak np. kongocydyne. Mozna takze stosowac roz¬ puszczalnik, który wyekstrahuje czesc tych za¬ nieczyszczen, które mozna usunac w czasie dal¬ szej przeróbki. Ekstrakcja ta nastepuje po prze¬ saczeniu plynu fermentacyjnego w obecnosci po¬ mocniczych srodków filtrujacych przy pH = 7—9. Brzy pH = 8—11, korzystnie przy pH = 9 prowadzi sie ekstrakcje rozpuszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda, który nalezy do grupy alkoholi szczególnie butanolu, alifatycznych ke¬ tonów np. ketonu metyloetyflowego, ketonu me- ryiaiaobutylowego, alifatycznych chlorowcowe- giowodorów, np. (chloroformu), aromatycznych weglowodorów np. benzenu i estrów np. octanu etylowego albo amylowego. Otrzymany w ten sposób roztwór ekstrahuje sie nastepnie woda — q —o odczynie kwasnym (przy pH ponizej 4 korzy¬ stnie przy pH = 2^3), wodny eikistcrart zageszcza sie i ekstrahuje pnzy pH = 9 za pomoca chlo¬ roformu albo benzenu. Otrzymany ekstrakt na¬ stepnie zageszcza sie, odwadnia doprowadza za pomoca kwasu siarkowego do pH = 5 i wytra¬ ca eterem siarczan antybiotyku.Pierwszy organiczny ekstrakt mozna równiez zagescic, ekstrahowac woda przy pH = 2 i ten wodny roztwór traiktowac jak podano wyzej.Otrzymany w ten sposób surowy siarczan moz¬ na nastepnie oczyscic przez nastepujaca po tym ekstrakcje rozpuszczalnikami organicznymi lub woda albo chromatograficznie.Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej istote wynalazku, nliie ograniczajac go przy tym. Do¬ wolnie wybrana jednostka jest najmniejsza ilosc okreslonego oczyszczonego produktu, która roz¬ puszczona w 1 cm8 odpowiedniego srodowiska hodowlanego niie dopuszcza do rozwoju Staphy- lococcus aureus (szczep F.-D.-A. 209 P). Dla tego produktu wynosi ta ilosc 1 mikrogram.Przyklad I. Przygotowuje sie nastepujace srodOfwtLsko: namok kukurydziany (50% suchej substancji) 4,0% wagowo glukoza 2,0°/o weglan wapniowy 0,5% „ chlorek sodowy 0,5% „ siarczan magnezowy 0,1% „ 40 litrów tego srodowiska wprowadza sie do zbiornika fermentacyjnego o objetosci 75 litrów.Wartosc pH doprowadza sie do 7 i sterylizuje mteszandne przez 45 minut w 120°C. Po ochlo¬ dzeniu do 26°C zaszczepia sie podloze 250 cm3 kultury S. 3486, znajdujacej sie we wstrzasa¬ nej erlenmeyerce. Kulture napowietrza sie i miesza w zbiorniku fermentacyjnym przez 25 godzin i uzywa jej do zaszczepienia kultury produkcyjnej.Kulture produkcyjna doprowadza sie do zbior¬ nika fermentacyjnego o objetosci 350 litrów, który jest zaladowany 200 litrami mieszaniny o nastepujacym skladzie: glukoza 2,0% wagowo maczka sojowa 4,0% „ diatUlers solubles 0,5% chlorek sodowy 2,0% „ weglan wapniowy 1,0% „ pH przed sterylizacja wynosi 6,8.Rozwój hodowli produkcyjnej nie jest zbyt szybki, mozna go jednak uwazac za zakonczo¬ ny po 3—4 dniach w temperaturze 26°C przy na- powieitrzandu 12 m* powietrza na godzine i przy mieszaniu z szybkoscia 408 obrotów na minute.Na poczatku nastepuje spadek pH do 6,4, a na¬ stepnie po uplywie okolo 30 godzin pH wzra¬ sta do okolo 7,5. Po 4 dniach otrzymany pro-, dukt wykazuje aktywnosc 92 jednostek/cm3.Przyklad II* Do zbiornika fermentacyj¬ nego o objetosci 350 litrów wprowadza sie 200 litrów mieszaniny o nastepujacym skladzie; glukoza 1,0% wagowo namok kukurydziany (50% suchej substancji) 3,0% „ fosforan jednopotasowy 0,1% . „ siarczan magnezowy 0,1% . „ chlorek sodowy 2,0% „ weglan wapniowy 0,5% „ pH doprowadza sie do wartosci 7 za pomoca lugu sodowego i sterylizuje srodowisko przez 45 minut w temperaturze 120°G. Srodowisko oziebia sie do 26°G i zaszczepia jak w przy¬ kladzie I. Fermentacje prowadzi sie przy mie¬ szaniu i napowietrzaniu. Maksymalna aktyw¬ nosc uzyskuje sie po 60 godzinach, przy czym wynosi ona 129 jednostek/cm8.Przyklad III. Fermentacje przeprowadza sie jak w przykladzie II lecz zamiast glukozy stosuje sie 2% sacharozy a namok kukurydzia¬ ny w ilosci 2% wagowych. W warunkach tych maksymalna aktywnosc wynosi po 40 godzinach 90 jednostek/cm8.Przyklad IV. Do zbiornika fermentacyj¬ nego o objetosci 30 litrów wprowadza sie 15 li¬ trów mieszaniny o nastepujacym skladzie: glukoza 3 % wagowo autolizat drozdzowy 1,0% „ chlorek sodowy 2,0°/o „ siarczan magnezowy 0,1% „ fosforan jednopotasowy 0,1% „ weglan wapniowy 0,5% „ pH srodowiska doprowadza sie do 7 za po¬ moca lugu sodowego, a po sterylizacji i ozie¬ bieniu do 26°C zaszczepia sie srodowisko za po¬ moca 1 litra szczepionki kultury, która zostala wyhodowana w zbiorniku fermentacyjnym w uprzednio opisanym srodowisku z namokiem ku¬ kurydzianym. Po czterodniowej hodowli otrzy¬ muje sie 140 jednostek/cm8.Przyklad V. 210 litrów cieczy fermenta¬ cyjnej o pH = 8 zadaje sie 10 kg srodka po¬ mocniczego do saczenia (Supercel Hyflo) i saczy na prasie filtracyjnej.Placek filtracyjny przemywa sie 50 litrami wody, przesacz, który wynosi 230 litrów i zawie¬ ra 15,8 milionów jednostek alkaMzuje sie do pH = 9 za pomoca lugu sodowego i ekstrahuje 46 litrami ketonu metyloiizobutylowego. Roz-puszczaOnik oddziela sie, a faze wodna ekstra¬ huje powtórnie 23 litrami ketonu metyloizobu- tylowego. Po zdekantawaniu obydwa ekstrakty miesza sie i przemywa 6 litrami wody, o pH = 9. Antybiotyk zawaity w rozpuszczalniku ektra- huje sie woda w temperaturze 5°C, przy czym wartosc pH obniza sie do 3 przez dodanie 5°/«^wego roztworu kwasu fosforowego. Ektrak- cje te prowadzi sie z 8 Hiitrami wody, a nastep¬ nie trzykrotnie z 4 litrami wody; cala zawartosc antybiotyku przechodzi do fazy wodnej. Wodmy roztwór, który doprowadzono do pH = 6,5 za pomoca rozcienczonego lugu sodowego podgesz- cza sie w prózni, w temperaturze nie przekra¬ czajacej 35°C. Otrzymuje sie 1750 cm8 roztwo¬ ru, który zawiera 14,6 milionów jednostek. An¬ tybiotyk ekstrahuje sie z wodnego, alkalicznego o pH = 9 roztworu najpierw 1 litrem, nastep¬ nie dwa razy po 0,5 litra benzenu. Ekstrakt ben¬ zenowy podgeszcza sie w prózni, w temperatu¬ rze nie przekraczajacej 30°C, do objetosci 100 om8. Nastepnie dodaje sie 100 cm8 alkoholu n-butylowego i ustala pH do wartosci 5 przez dodanie roztworu 2 n kwasu siarkowego w bu¬ tanolu. Roztwór podgeszcza sie znowu do 100 cm8 i wytraca siairczan antybiotyku za po¬ moca 2 litrów eteru.Siairczan, który wypada w postaci bialego proszku odsacza sie, przemywa eterem i suszy.Otrzymuje sie 9,6 g siarczanu o zawartosci 1320 jednostek/mg co odpowiada 80°/o wydajnosci.Przyklad VI. 185 litrów cieczy fermen- t^cyjjinej saczy sie jak w przykladzie V. Prze¬ sacz w ilosci 155 litrów zawierajacy 12,4 milio¬ nów jednostek doprowadza sie do pH = 9 za pomoca 10%-wego roztworu lugu sodowego i ekstrahuje kolejno 40 litrami, a pózniej 20 li¬ trami n-butanolu. Polaczone ekstrakty butano- lowe podgeszcza sie w prózni do 10 litrów, przy czym temperattura nie przekracza 30°C.Boztwór butanolowy ekstrahuje sie kolejno 8 litrami wody, a pózniej dwukrotnie woda w Uosdi po 3'litry, pr^y czym pH obniza sie kwa¬ sem siarkowym do wartosci 2. Roztwór wodny, którego pH oprowadzono do 6,5 za pomoca roz¬ cienczonego lugu sodowego, podgeszcza sie w prózni do 1500 oms w temperaturze nie przekra¬ czajacej 30°C. Roztwór wodny zawiera 8 mi¬ lionów jednostek.Roztwór wodny zalkalizowany do pH = 9 ekstrahuje sie trzykrotnie chloroformem w ilos¬ ci po 700 om8. Ekstrakty chloroformowe pod- gejszcza sia w prózni i traktuje jak w przykla¬ dzie I.Otrzymuje sie 7,4 g antybiotyku w postaci siarczanu o zawartosci 746 jednostek/mg co od¬ powiada 44% wydajnosci.Przyklad VII. 30 g surowego siarczanu antybiotyku rozpuszcza sie w 700 cm8 wody.Wartosc pH ustala sie na 9 za pomoca lugu so¬ dowego i przeprowadza trzykrotnie ekstrakcje za pomoca benzenu w ilosci po 300 cm8. Pola¬ czone ekstrakty benzenowe przemywa sie 200 cm8 wody o pH = 9 i odparowuje roztwór do sucha w niskiej temperaturze.Otrzymuje sie 24,2 g zasady spiramycyny o zawartosci 2150 jednostek/mg. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego antybiotyku, zna¬ mienny tym, ze do jego wytwarzania stosuje sie szczepy grzybowe z grupy sti^tomycetów, zwlaszcza streptomyces 3486, przy czym proces wytwarzania prowadzi sie na drodze aerobowej bodowi szczepu streptomyces 3486, najkorzyst¬ niej sposobem podpoWierzchniowym w srodo¬ wisku zawierajacym przyswajalny wegiel, azot i sole mineralne do czasu wytworzenia przez ten mikroorganizm spiramycyny, która ekstra¬ huje sie z cieczy fermentacyjnej przy wartosci pH = 8—11 za pomoca rozpuszczaflnika nie mie¬ szajacego sie z woda i ewentualnie traktuje sie spiramycyne kwasem w celu wytworzenia jej soli odpowiadajacej temu kwasowi. Sociste des Usines Chimiaues Rh on e-Poulenc Zastepca: Kolegium Rzeczników Patentowych Wzór Jednoraz. CWD, zam. PL/Kef Cze*t. zam. 2978 12. 11. 58. 100 egz. Al pism. ki. 3. BIW.IOTBKAI Urzedu Potenlowet» PL