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Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Marcomycin Die vorliegende
Erfindung betrifft die Herstellung und Gewinnung eines bestimmten, neuartigen antibiotisch
wirkenden Mittels, das der Einfachheit halber mit dem willkürlichen Namen »Marcornvcin«
bezeichnet wird.
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Das Molekulargewicht beträgt etwa 436, wie aus Titrationswerten errechnet,
pK'a-Werte etwa 7,20 und 8,95, die in 66°,7'oiger wäßriger Dimethylformamidlösung
bestimmt wurden. Sie schmilzt unter Zersetzung in einem Bereich von etwa 160 bis
180°C; in Lösungsmitteln, wie Äther, Chloroform, Äthylenchlorid, Hexan und Benzol,
ist sie verhältnismäßig unlöslich, in Wasser ist sie löslich, und in organischen
Lösungsmitteln, wie Äthanol, Methanol, Dimethylformamid und Eisessig, ist sie verhältnismäßig
löslich; sie reagiert schwach basisch und kann mit Säuren Salze bilden; in wäßrigen
Lösungen ist sie in einem p11-Bereich von etwa pH 1 bis etwa pH 10 beständig; sie
hat folgende prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff = 46,40 0/" Wasserstoff
= 7,48 °/a, Stickstoff = 6,82 °/a und, mit Abweichung, Sauerstoff = 39,30 °/o; empirische
Formel: C"H3008N2; in wäßriger Lösung zeigt sie keine Absorption im ultravioletten
Bereich; in Mineralöl erwärmt, zeigt sie eine Infrarotabsorption mit folgenden,
voneinander unterscheidbaren Banden: 3,03, 6,01, 6,12, 6,24, 6,34, 8,10, 8,72, 9,30,
9,63 und 11,25 Mikron (vgl. die Zeichnung).
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Die Herstellung erfolgt derart, daß man unter aeroben Bedingungen
in einem Nährmedium, das von Schimmelpilzen assimilierbare Quellen von Kohlehydrat,
Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, einen Marcomycin erzeugenden Stamm
des Streptomyces hygroscopicus züchtet, bis durch diesen Organismus in diesem Nährboden
eine wesentliche antibiotische Aktivität erzeugt ist.
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Die Marcomycinbase ist ein nicht kristalliner, farbloser Feststoff,
der in Wasser sehr gut löslich und in Lösungsmitteln, wie Äthanol, Methanol, Dimethylformamid,
Eisessig u. dgl., relativ löslich ist. In Lösungsmitteln, wie Äther, Chloroform,
Äthylenchlorid, Hexan, Benzol u. dgl., ist er relativ unlöslich. Er schmilzt unter
Zersetzung in einem nicht genau abgegrenzten Bereich zwischen etwa 160 und 180°C.
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Marcomycin ist schwach basisch, was daher zu rühren scheint, daß im
Molekül eine oder mehrere Aminogruppen vorhanden sind. Marcomycin bildet mit den
üblichen Säuren Salze. So ist es z. B. einfach, das Hydrochlorid, Sulfat, Phosphat,
Maleat und ähnliche Salze zu gewinnen. Solche Salze sind im allgemeinen völlig wasserlöslich.
Marcomycin bildet auch mit hochmolekularen Säuren Salze oder satzähnliche Komplexe,
wie z. B. mit p-(p'-Oxyphenylazo)-benzol-sulfonsäure, Methylorange u. dgl. Diese
Salze oder Komplexe sind in Wasser relativ unlöslich.
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Das Antibiotikum scheint in wäßriger Lösung in einem p$-Bereich von
etwa pg 1 bis p$ 10 beständig Marcomycin entfaltet eine antibiotische Wirksamkeit
gegen bestimmte grampositive und gramnegative Mikroorganismen, wie Staphylococcus
aureus, Mycobacterium tuberculosis (H 37 RV), Staphylococcus (widerstandsfähig gegen
Streptomycin), Bacillus subtilis, Mycobacterium phlei, Mycobacterium tuberculosis
(607), Mycobacterium avium, Salmonella gallinarium, Escherichia coli, Aerobacter
aerogenes und Klebsiella pneumoniae. Wird es oral, z. B. in Kapseln, Tabletten oder
als ein Diätbestandteil verabreicht, so wirkt Marcomycin gegen tierische Parasiten,
wie Amöben, Fadenwürmer, Oxyuren, Lungenwürmer, Strongyles und Strongyloiden.
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Wegen der Unsicherheit der Klassifizierungsuntersuchungen der Actinomycesgruppe
der Organismen treten bei der Klassifizierung jedes neuentdeckten Organismus einige
Zweifel auf. Jedoch scheinen die Organismen, die nach den Feststellungen das Marcomycin
zu erzeugen vermögen, am meisten dem Actinomyceten, Streptomyces hygroscopicus,
einem zuerst von Jensen in Proc. Linn. Soc., New South Wales, 56, S. 345 bis 370
(1931), beschriebenen Organismus, zu ähneln. Die drei Stämme der bei der Herstellung
von Marcomycin verwendeten Organismen wurden bei »The Cuiture Collection of the
Northern Regional Research Laboratories at Peoria, Illinois«, ständig hinterlegt
und erhielten die Kulturnummern N RRL 2387, NRRL 2388 und NRRL 2389. Die drei Stämme
wurden aus Bodenproben aus Marion County, Indiana, aus Saunders County, Nebraska
und aus Vigo County, Indiana, isoliert. Das Isolierungsverfahren
bestand
darin, daß man eine stark verdünnte Bodenprobe auf Nähragar schichtete, diese Schicht
so lange inkubierte, bis das Wachstum des Organismus sichergestellt war, und daß
man dann einzelne Kolonien des Organismus mit einer sterilen Platinöse abnahm.
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Die vorstehend genannten drei Stämme unterscheiden sich, wie man durch
gelegentliche Beobachtung erkennen kann, in ihrer Erscheinungsform und zeichnen
sich aus durch ihre Fähigkeit, unter geeigneten Züchtungsbedingungen Marcomycin
zu erzeugen. Einige charakteristische Merkmale deuten darauf hin, daß sie alle der
Art S. hygroscopicus angehören. Die folgenden Absätze enthalten ausführliche klassifizierende
Studien der vorstehend genannten, Marcomycin erzeugenden Actinomycetesstämme. Die
Untersuchungen erfolgten nach den gewöhnlich bei der Klassifizierung von Actinomycetes
angewendeten Verfahren. Die unter Verwendung von Kohlenstoff und Stickstoff durchgeführten
Teste erfolgten nach den Verfahren von Pridham und Gottlieb, J. Bact., 56, S. 107
bis 114 (1948). Als Grundlage der übrigen Versuche und Charakterisierungen dienten
die Publikationen von Waksman, Soil Sci., 8, S. 71 bis 215 (1919), Jensen, Soil
Sci., 30, S. 59 bis 77 (l930), und Conn, N. Y. Agr. Axp. Sta. Tech. Buhl., 60, S.
1 bis 25 (1917). Die meisten Farbbezeichnungen erfolgten nach dem System von Ridgway,
»Color Standards and Color Nomenclaturea (1912). Wird dieses System angewendet,
so ist der Anfangsbuchstabe der Farbe groß geschrieben.
| Tabelle I |
| Mikroskopische Morphologie |
| NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389 |
| Synthetisches Agar |
| Diese Kultur bildet ein typisches, Wie NRRL 2387. Wie NRRL
2387. |
| stark verzweigtes, ausgestrecktes, |
| vegetatives Mycel, aus dem ein sich |
| verzweigendes Luftmycel empor- |
| wächst. Luftsporen in schmalen, |
| dichten Spiralen entstehen auf kur- |
| zen, verzweigten Conidiophoren. Bei |
| Reifung der Kultur bedecken dichte, |
| mit einem Luftgewebe verflochtene |
| Sporenbüschel die Kulturoberfläche. |
| Mikroskopisch betrachtet, weisen |
| die einzelnen Sporen - ob frei oder |
| in spiralförmigen Ketten - eine |
| typische geometrische Form auf. |
| Ihre Kontur ist annähernd quadra- |
| tisch bis rechteckig, aber die Zell- |
| oberfläche, die der Außenseite der |
| spiralförmigen Kette zugewandt ist |
| oder war, ist länger als die der |
| Innenseite der Spirale zugekehrte |
| Oberfläche und sieht daher aus wie |
| ein »Schlußsteina. Diese charakte- |
| ristische Form weisen die freien |
| Sporen auf. Nach einer etwa 2wöchi- |
| gen Inkubation erscheinen in großer |
| Anzahl in dem Luftmycel entweder |
| am Ende oder längs des Körpers |
| der einzelnen Gewebe, kugelförmige |
| lichtbrechende Körper. Diese Körper |
| haben eine sehr unterschiedliche |
| Größe, aber sie besitzen im all- |
| gemeinen die mehrfache Größe des |
| Durchmessers eines einzelnen Gewe- |
| bes. Es handelt sich anscheinend |
| dabei nicht um zellförmige Struk- |
| turen, sondern um Kügelchen einer |
| flüssigen Ausscheidung. |
| Andere Nährböden |
| Charakteristische Spiralen bildeten Wie NRRL 2387, jedoch fand
man Spiralen bildeten sich wie bei NRRL |
| sich auch auf Agar-Nährböden aus in 32 Tage alten Kulturen
keine 2387. Kugelförmige Körper fand |
| Glukose-Asparagin, aus Emersons Kügelchen auf Glukose-Asparagin,
man auf Glukose-Asparagin und |
| Stärke und aus apfelsaurem Calcium. auf apfelsaurem Calcium,
noch auf Stärkeagar, nicht aber auf apfel- |
| In 32 Tage lang inkubierten Kul- Emersons Agar. Stärkeagar
wurde saurem Calcium noch auf Emersons |
| turen fand man kugelförmige Körper nicht getestet. Agar. |
| auf Glukose-Asparagin und auf apfel- |
| saurem Calcium, nicht aber auf |
| Stärke und Emersons Agar. |
| Tabelle II |
| Züchtungscharakteristika |
| NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389 |
| Synthetisches Agar |
| In das Medium mischt man eine Wie NRRL 2387, nur daB die Pig-
Wie NRRL 2387, nur daB das zu- |
| mäßige Menge farbloses, vegetatives mentierung des Luftmycels
nicht erst Blaß- bis Dunkel-Quäker-Gelb- |
| Mycel zusammen mit einer mäßigen gesprenkelt, sondern gleichmäßig
lichgraueLuftmycelfast kohlschwarz |
| Menge grauweißgesprenkelten Luft- grau ist und in 2 bis 4 Wochen
fast wird. Spuren von gründlichem, los- |
| mycel, das, farblich gesehen, von kohlschwarz wird. Auch dehnt
sich lichem Pigment. |
| einem blassen Mausgrau im unter- die Kultur etwas mehr aus,
und die |
| sten Teil bis zu Mausgrau an der Einbuchtung der Oberfläche
ist et- |
| Spitze des Schrägnährbodens reicht was weiter verbreitet. |
| und dabei einige schwarze Stellen |
| am Streifenrand besitzt. Sporogene |
| Schicht auf der Wachstumsfläche, |
| pulvrig; unter dem Mikroskop er- |
| kennt man Sporen in sehr großer |
| Menge. Mikroskopisch sichtbare Ein- |
| buchtung der Oberfläche der Sporen- |
| schale in der Nähe des Wachstums- |
| randes, besonders an dunkelgefärb- |
| ten Stellen; das Auftreten von Aus- |
| höhlungen läuft parallel mit dem |
| Verschwinden von Ausscheidungs- |
| tröpfchen ähnlicher Größe, die frü- |
| her während des Wachstums ausge- |
| schieden wurden. Kein lösliches |
| Pigment. |
| Glukose-Asparagin-Agar |
| Durchgrabendes vegetatives Mycel, Wie NRRL 2387, aber das Luftmy-
Wie NRRL 2387, jedoch ist die |
| farblos, in reichlicher Menge zu- cel ist schwerer, die gleichmäßig
Unterseite der Kultur auf Grund |
| gegen. Das Luftmycel ist ziemlich graue Farbe wird in 2 bis
4 Wochen von Spuren von löslichem Pigment |
| dünn; das weiße Untenliegende, das kohlschwarz und feucht.
Chamoisfarben. Das Luftmycel ist |
| Mausgrau überwachsen ist, wird dünn, in der Mitte des Streifens |
| Dunkel - Quäker - Gelblichgrau bis weiß und dicker und dunkel
entlang |
| fast schwarz. Das Luftmycel ist der Ränder. Die Bereiche von
weiß |
| dünn und zunächst mit Ausschei- (in der Mitte) bis Mausgrau
(an der |
| dungströpfchen übersät, an deren Spitze) werden in 2 bis 4
Wochen |
| Stelle später Einbuchtungen er- Rußig-Schwarz und feucht. |
| scheinen; die Oberfläche wird stumpf |
| und feucht. Spuren von bräun- |
| lichem, löslichem Pigment. |
| Agar aus apfelsaurem Calcium |
| Mäßige Menge vegetativen Gewäch- Wie NRRL 2387, jedoch entwickelt
Wie NRRL 2387, aber lösliches Hell- |
| ses, Unterseite Rötlich-Lederfarben. sich das Luftmycel spät,
wird Blaß- Rötlich-Zimtfarbenes Pigment, Luft- |
| Mäßige Menge weißes Luftmycel, Quäker-Gelblichgrau, schließlich
mycel flach, weiß; der Hell-Quäker- |
| das bei Reife gesprenkelte Gebilde feucht, schwarz. Im untersten
Teil Gelblichgraue Überwuchs erscheint |
| mit Kügelchen von Dunkel-Maus- des Schrägnährbodens aufrechter,
spät, wird nach 2- bis 4wöchiger |
| grauem und etwas Rußig-Schwarzem in Kolonien vorhandener Wachs-
Inkubation schwarz und feucht. |
| Gewächs entwickelt. Oberfläche un- tumstyp ohne Sporen. Knopfförmiger,
in Kolonien vorhan- |
| eben, kolonieförmig, Sporenbildung dener Wuchs ohne Sporen
wie bei |
| gering bis mäßig, besonders am An- NRRL 2387 im untersten Teil
des |
| fang. Aus dem Nährboden unlösliche Schrägnährbodens. |
| Salze entfernt. Rötlich-Lederfarbe- |
| nes, lösliches Pigment. |
| Emersons Agar |
| Gutes Wachstum von vegetativem Wie NRRL 2387, jedoch wird das
Wie NRRL 2387, jedoch ist die |
| Mycel, Unterseite Isabellenfarben. Hell-Quäker-Gelblichgraue
Luft- Unterseite des vegetativen Gewäch- |
| Luftmycel reichlich vorhanden, mycel in 2 bis 4 Wochen schwarz
ses Orange-Rötlichbraun, bis zu ge- |
| weiB, wird Mausgrau und Dunkel- und feucht, mit Ausnahme des
un- brannter Sienna dunkelnd. Junges |
| Quäker-Gelblichgrau mit Büscheln teren Endes des Schrägnährbodens,
weißes Luftmycel wird Dunkel-Quä- |
| von winzigem, winzigem, Überwuchs. weißem, Lösliches kolonieför-
hell- wo Das das Gewächs Gewächs ist stark transparent runzelig und ist. ker-Gelblichgrau,
schwarz. Das Gewächs schließlich ist runzelig, stumpf- |
| braunes Pigment. gefurcht. faltig. Das lösliche Mahagonierote |
| Pigment erhält nach 28 Tagen die |
| Farbe gebrannter Sienna. |
| NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389 |
| Nähragar |
| Mäßige Menge von farblosem vege- Wie NRRL 2387. Wie NRRL 2387. |
| tativem Wuchs und weißem Luft- |
| mycel. Das Medium dunkelt allge- |
| mein ein wenig, aber das Pigment |
| ist zu schwach, um die Färbung zu |
| charakterisieren. |
| Glukose-Nähragar |
| Das Wachstum ist ähnlich dem, das Wachstum wie auf Emersons
Agar, Wachstum wie auf Emersons Agar, |
| man auf Emersons Agar erzielt, aber noch reichlicheres Luftmycel.
jedoch das Luftmycel runzelig, dünn, |
| doch etwas weniger reichlich. Das Die gesamte Oberfläche des
Ge- weiß (fast durchscheinend), wobei |
| Luftmycel, pulvrig, weiß und Maus- wächses möglicherweise schwarz;
in der Nähe des unteren Endes des |
| grau, wird mit Ausnahme der weißen sehr wenig weißer Überwuchs.
Lös- Schrägnährbodens etwas Quäker- |
| Randgebiete und von etwas weißen, liches Pigment schwachbraun
oder Gelblichgraue Färbung auftritt. Lös- |
| kolonieförmigen Überwuchs einheit- fehlend. liches Pigment
hat nach 28 Tagen |
| lich Mausgrau. Hellbraunes, lös- fast die Farbe gebrannter
Sienna. |
| liches Pigment. |
| Stärke-Agar |
| Mäßige Menge vegetativen Gewäch- Wie NRRL 2387, aber nicht
ge- Art des Gewächses und der Pigmen- |
| ses mit gutem Wachstum des Luft- sprenkelt; die Pigmentierung
des tierung ähneln NRRL 2387, aber |
| mycels; letzteres gesprenkelt weiß Luftmycels ist in allen
Stadien ein- an der Spitze der Schrägbodenkultur |
| und anfangs Mausgraue Schattie- heitlich, die Farbveränderungen
er- befindet sich eine kleine Menge von |
| rungen, bei fortgesetzter Inkubation folgen aber in der gleichen
Reihen- orange-rosafarbenem Pigment. Ge- |
| nachdunkelnd, graue Stellen werden folge (weiß nach Mausgrau
bis wächs kräftiger und einheitlicher |
| allmählich schwarz. schwarz) Gewächs wird möglicher- als das
von NRRL 2387, möglicher- |
| Kleine Tröpfchen von früh erzeugter weise durchweg schwarz.
Stärke weise durchweg schwarz. Stärke |
| Ausscheidung. Oberfläche des Ge- wird hydrolysiert. (Hydrolysierungs-
wird hydrolysiert (Hydrolysierungs- |
| wächses bei Reife mikroskopisch zone 28 mm groß). zone > 20
mm groß). |
| sichtbar aasgefurcht. Spuren von |
| grünlichem löslichem Pigment. Stär- |
| ke wird hydrolysiert (Hydrolysie- |
| rungszone 21 mm groß). |
| Kartoffelpropfen |
| Wachstum variierbar in nachgebil- Wie NRRL 2387, Wuchs und
Spo- Wie NRRL 2387, Luftmycel jedoch |
| deten Röhren. Gutes vegetatives renbildung jedoch weniger reich-
Mausgrau, Unterseite des Gewächses |
| Wachstum, aufrecht, uneben und lich; Luftmycel, soweit vorhanden,
da, wo dieses am Glas haftet, |
| gespalten. Reichliches Wachstum farblos oder weiß, schwarz.
In Wasser lösliches Pig- |
| von Luftmycel, weißgrau gespren- ment unter dem Propfen, Zimtfarbe |
| kelt, das graue Pigment farblich dem wird Weinrot-Rötlichbraun. |
| Blaß-Quäker-Gelblichgrau ähnlich. |
| Luftmycel aufrecht, pulvrig, bis zu |
| einem gewissen Grade eingebuchtet. |
| Pfropfen dunkelte. |
| Gelatine (25° C) |
| Schwaches, amorphes, farbloses Wie NRRL 2387, aber die Verflüssi-
Wie NRRL 2387, aber die Verflüssi- |
| Wachstum. Verflüssigung sehr ver- gang ist nach 28 Tagen etwas
we- gang ist nach 28 Tagen vollständig. |
| zögert, beginnt etwa nach 20 Tagen, niger vollständig. |
| ist aber erst nach 28 Tagen annä- |
| hernd vollständig. Kein lösliches |
| Pigment. |
| Lackmusmilch (30° C) |
| Wachstumsring mit dünner Kruste Wie NRRL 2387, aber mit schwere-
Wie NRRL 2387; p$-Endwert 7,6. |
| aus weißem Luftmycel. Hydrolyse rem Wachstumsring. pg-Endwert |
| ohne Koagulierung, fast vollständig 7,6. |
| in 6 Tagen, vollständig in 9 Tagen, |
| alkalisch (p$-Endwert 7,5). |
| NRRL 2387 NRRL 2388 NRRL 2389 |
| Lackmusmilch (37@ C) |
| Bläulich-purpurfarbener Wachs- Wie NRRL 2387, jedoch ähnelt
der Wie NRRL 2387. |
| tumsring mit weißem Luftmycel. Wachstumsring farblich dem Maha- |
| Rasche Hydrolyse, der manchmal gonierot. |
| eine leichte Gerinnung vorausgeht. |
| Reaktion ist alkalisch. |
| Nährlösung |
| Wuchs schwach, submers,flaumartig, Wie NRRL 2387, Wuchs aber
noch Wie NRRL 2387. |
| anhaftend. Kein lösliches Pigment. schwächer. |
| Glukose-Nährlösung |
| Gutes Wachstum, meistenteils sub- Wie NRRL 2387, der Wuchs
ist aber Wie NRRL 2387. |
| mers, weich, anhaftend; sehr wenig etwas schwächer. |
| schwimmende Kolonien. Kein lös- |
| liches Pigment. |
| Tyrosin-Nährlösung |
| Einige weiße, schwimmende Kolo- Wie NRRL 2387. Wie NRRL 2387. |
| nien mit etwas flaumigem, amor- |
| phem, submersem Gewächs. Kein |
| lösliches Pigment. |
| Cellulosestreifen |
| Cellulose verwendet, jedoch kein Wie NRRL 2387, aber gute Ent-
Wie NRRL 2387, aber gute Ent- |
| reichliches Wachstum. I Wicklung. I Wicklung. |
| Tabelle IIl, IV und V enthält die Ergebnisse der an
30 S = außergewöhnlich gute Sporenbildung; |
| den Organismenstämmen durchgeführten Verwendbar- et = etwas; |
| keitsversuche. Der Kürze wegen sind in den Tabellen BLP = braunes,
lösliches Pigment; |
| folgende Symbole angewendet: OLP = orangefarbenes, lösliches
Pigment; |
| = Wachstum und Verwendbarkeit; BOP = bräunlich-orangefarbenes
Pigment; |
| - = kein Wachstum, keine Verwendbarkeit; 35 G -- gutes Wachstum. |
| = begrenztes Wachstum, wahrscheinlich geringe |
| Verwendbarkeit; |
| Tabelle III |
| Verwendbarkeit von Kohlenstoffquellen zur Förderung des Wachstums |
| Substrat NRRL 2387 I NRRL 2388 NRRL 2389 |
| r, (+) Arabinose ....... . ........ + + (S) |
| 1, (+) Xylose .................. + - |
| i |
| Rhamnose ............... + - |
| Fruktose ................ + (S, et BLP) (S, et BLP) -r- (S,
BOP) |
| I, ( @-) Galaktose ............... -r- + |
| Glukose ................. + (S, et BLP) = (S) |
| r, (+) Mannose ................ + (S, et BLP) - (S, et BLP)
+ (S, et BLP) |
| Cellobiose....................... - (S, et BLP) ,- (S, et BLP)
+ (S, OLP) |
| r, (-@-) Laktose ................. + |
| v (+) Maltose .................. + (S) + (S) + (S) |
| Sukrose ........................ - - - |
| I, (+) Raffinose ................ + + |
| Inulin.......................... - - - |
| Mannit ........................ + (S) + (S) + (S) |
| Dulcit ......................... - - - |
| I, (-) Sorbit .................. - - - |
| Inosit.......................... + + |
| Salicin ......................... + (BOP) + (BOP) + (BOP) |
| Dextrin ........................ + (S, et BLP) + (S, et BLP)
+ (S, BLP) |
| Stärke ......................... + (S, et BLP) i + (S, et BLP)
+ (S, BLP) |
| Natriumacetat .................. -r - + |
| Natriumcitrat .................. - + + |
| Natriumformiat ................ äpfelsaures Natrium
............. + + + |
| Natriumsalizylat ................ - - - |
| Natriumsuccinat................ . - '-, + |
| Natriumtartrat.................. - - +_ |
| Asparagin ...................... + + + |
| Tabelle IV |
| Verwendung von Stickstoffquellen zur Förderung des Wachstums |
| Substrat NRRL 2387 I NRRL 2388 I NRRL 2389 |
| Ammoniumsulfat ................ + (S, et BLP) + (S,
et BLP) + (S, BOP) |
| Asparagin ...................... + (S, et BLP) + (S,
et BLP) + (S, et BLP) |
| Natriumnitrat .................. + (et BLP) + + |
| Tabelle V |
| Reduktion von Nitraten zu Nitriten |
| Kohlenstoffquelle NRRL 2387 NRRL 2388 |
| NRRL 2389 |
| Wachstum Nitrittest Wachstum Nitrittest Wachstum Nitrittest |
| Glycerin ............. G - G + G + |
| Glukose ............. G - G Spur G + |
| Sukrose.............. G - G -f- G + |
| Stärke .............. G - G - G - |
Wie vorstehend ausgeführt, können die Stämme NRRL 2387, NRRL 2388 und NRRL 2389
in den Nährmedien zwecks Herstellung wirksamer antibiotischer Mittel gezüchtet werden.
Als Nährmedium kann irgend eines einer Anzahl von Medien verwendet werden, da, wie
aus den vorstehend beschriebenen V erwendbarkeitsversuchen hervorgeht, die Organismen
viele Energiequellen verwerten können. Jedoch werden aus Gründen der Wirtschaftlichkeit
der Herstellung, der maximalen Ausbeute und der Leichtigkeit der Isolierung der
Antibiotika bestimmte Nährmedien bevorzugt. So ist z. B. die zur Zeit im Nährmedium
bevorzugte Kohlehydratquelle Glukose. Andere Quellen, die mitverwendet werden können,
sind Stärke, Saccharose, Dextrin, Melasse u. dgl. Die bevorzugten Stickstoffquellen
sind gequollener Mais, Sojabohnenmehl und in Brennereien anfallende Rückstände der
Getreidegärung; andere verwendbare Quellen sind Kasein, Gemische aus Aminosäuren,
Peptone (sowohl aus Fleisch als auch Soja) u. dgl. Es können auch anorganische Stickstoffquellen,
wie Nitrate oder Ammoniumsalze, verwendet werden.
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Zu den anorganischen Nährsalzen, die dem Nährboden zugesetzt werden
können, gehören die gewöhnlichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Calcium-, Phosphat-,
Chlorid-, Sulfationen und ähnliche Ionen zu erzeugen vermögen.
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Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer :Mikroorganismen
notwendig ist, so sollten auch dem Nährboden zum Wachstum der erfindungsgemäß verwendeten
Aktinomycetes wichtige Spurenelemente beigegeben werden. Solche Spurenelemente sind
gewöhnlich als Verunreinigungen zugeführt, die mit der Zugabe der anderen Bestandteile
in den Nährboden gelangen.
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Die Organismenstämme, die zur Erzeugung des Marcomycins verwendet
wurden, sind leicht zu züchten, und sie sind, was die Wachstumsbedingungen anbetrifft,
sehr viel weniger empfindlich als viele andere Actinomycetes. So entwickelt sich
z. B. dieser Organismus in zahlreichen Nährmedien mit sehr unterschiedlichem pH-Wert.
Es empfiehlt sich jedoch, vor der Impfung mit dem Organismus dafür zu sorgen, daß
der p.-Wert des Nährmediums zwischen 6,0 und 7,5, vorzugsweise bei etwa 6,5 liegt.
Wie man bei anderen Actinomycetes beobachtet hat, wird der Nährboden im Laufe der
Wachstumszeit des Organismus, während der das Antibiotikum erzeugt wird, allmählich
alkalisch. Er kann eine Basizität von etwa pH 7,2 bis etwa pH 8,0 oder mehr erreichen,
wobei der endgültige pH-Wert mindestens teilweise vom anfänglichen pH-Wert des Nährmediux,
von den darin enthaltenen Puffersubstanzen und vcKl der Zeitspanne, die man den
Organismus wachsen läßt, abhängt.
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Wie es sich bei der Erzeugung anderer Antibiotika in großen Mengen
empfiehlt, so wendet man vorzugsweise auch bei der Erzeugung großer Mengen an Marcomycin
submerse, aerobe Kulturbedingungen an. Bei der Heestellung begrenzter Mengen des
Antibiotikums kann man mit Schüttelkolben- und Oberflächenkulturen in Flasche arbeiten.
Will man aber große Materialmengen erzeuge, so empfiehlt sich eine submerse aerobe
Kultur in Tanks. Wird die Herstellung in großen Tanks durchgeführt, so verwendet
man - wie allgemein bekannt ist - für die Impfung vorzugsweise die vegetative Form
des Organismus, um eine ausgesprochene Verzögerung in der Erzeugung des Antibiotikums
und die damit verbundene unwirksame Inbetriebnahme der Vorrichtung zu vermeiden.
Daher ist es angebracht, durch Impfung einer verhältnismäßig kleinen Menge des Nährbodens
mit den Sporen der Organismen zuerst ein vegetatives Inokulum zu erzeugen und dann,
wenn ein junges, aktives, vegetatives Inokulum mit Sicherheit entstanden ist, dieses
unter aseptischen Bedingungen in die großen Tanks zu bringen. Der Nährboden, in
dem das vegetative Inokulum erzeugt wird, kann der gleiche oder ein anderer als
der zur Erzeugung der Antibiotika verwendete Nährboden sein.
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Die Organismen entwickeln sich gut bei Temperaturen zwischen etwa
25 und etwa 32- C. Die optimale Erzeugung an Antibiotikum scheint dann stattzufinden,
wenn die Temperatur des Nährbodens zwischen etwa 26 bis 30° C gehalten wird.
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Wie es bei der Erzeugung von Antibiotika in submersen Kulturen üblich
ist, wird auch hier keimfreie Luft durch den Nährboden geblasen. Um ein wirksames
Wachstum des Organismus und eine reichliche Erzeugung d Antibiotikums zu gewährleisten,
sollte das bei der Herstellung von Marcomycin im Tank angewendete Luftvolumen vorzugsweise
mindestens 0,1 Volumen Luft in der Minute pro Volumen Nährboden betragen. Ein wirkungsvolleres
Wachstum und reichlichere Erzeugung an Antibiotikum werden dann erreicht, wenn das
verwendete Luftvolumen mindestens 1 Volumen Luft in der Minute pro Volumen Nährboden
beträgt. Die Geschwindigkeit der Erzeugung von Marcomycin und die Stärke der antibiotischen
Aktivität im Nährboden kann während der @@'achstumszeit des Mikroorganismus leicht
dadurch verfolgt werden, daß man Proben des Nä,brbodens
hinsichtlich
ihrer antibiotischen Aktivität gegen solche Organismen, die als empfänglich für
das Antibiotikum gelten, wie z. B. Bacillus subtilis, untersucht. Der Bioversuch
kann durch die Standard-Trübungsmessungs- oder "Cup-plate;:-Verfahren oder durch
die Papierscheibenprobe auf Agarschichten durchgeführt werden.
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Bei Anwendung von submersen, aeroben Kulturen oder von Schüttelkolbenkulturen
findet die maximale Erzeugung von Antibiotika nach Impfung des Nährbodens im allgemeinen
innerhalb von etwa 2 bis 5 Tagen, bei Oberflächenkulturen innerhalb von etwa 5 bis
10 Tagen statt.
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Das Marcomycin kann durch Extraktions- und Adsorptionsverfahren aus
dem Nährboden gewonnen und von anderen, eventuell vorhandenen Substanzen getrennt
werden. Wegen der sehr großen Löslichkeit des Marcomycins in wäßriger Lösung und
des infolgedessen ungünstigen Verteilungsverhältnisses des Antibiotikums in organischwäßrigen
Lösungsgemischen, sind verhältnismäßig große Mengen an organischen Extraktionsmitteln
erforderlich. Daher ist es angebracht, die filtrierte Nährlösung vor der Extraktion
mit einem stark löslichen, anorganischen Salz, z. B. mit Ammoniumsulfat, zu sättigen,
um einen besseren Verteilungskoeffizienten für das Extraktionslösungsmittel zu erzielen.
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Die extrahierten, antibiotisch wirkenden Substanzen, die sich nun
in dem organischen Lösungsmittel, das vorzugsweise aus einem niedrigeren Alkohol,
wie Propanol, Butanol usw., besteht, befinden, können daraus als Rohprodukt durch
Verdampfung des Lösungsmittels im Vakuum gewonnen werden. Das auf diese Weise erhaltene,
relativ rohe Material wird durch Ausfällung aus geeigneten Lösungsmitteln, durch
Chromatographie oder durch Gegenstromextraktion gereinigt.
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Gegenwärtig gewinnt man das Marcomycin vorzugsweise durch Adsorptionsverfahren,
da dadurch der Verbrauch an verhältnismäßig großen Mengen von Lösungsmitteln, die
bei Anwendung von Extraktionsverfahren erforderlich sind, ausgeschaltet wird. Das
hier zur Trennung der Antibiotika von der filtrierten Nährlösung bevorzugte Adsorptionsmittel
ist Kohlenstoff. Die auf das Adsorptionsmittel fixierte antibiotische Substanz wird
durch übliches Eluieren, wobei ein wäßriges organisches Lösungsmittel verwendet
wird, gewonnen. Für die Gewinnung des Marcomycins werden saure Ionenaustauscherharze
verwendet, wie z. B. ein Kationenaustauscher, der aus einem Mischpolymeren aus Methylacrylat
und Divinylbenzol besteht und funktionelle Hydroxylgruppen aufweist. Ein solcher
Kationenaustauscher ist z. B. das im Handel unter der Handelsbezeichnung "IRC-50«
erhältliche Produkt. Die Abtrennung des Marcomycins von anderen Antibiotika wird
leicht dadurch erzielt, daß man lonenaustauscherharze verwendet und den basischen
Charakter des Marcomycins ausnutzt. So können Lösungen, die Antibiotika einschließlich
Marcomycin enthalten, der Reihe nach der Behandlung mit sauren und basischen Ionenaustauschern
und einer anschließenden Eluierung des Marcomycins aus den sauren Harzen unterzogen
werden. Jeder Fachmann wird erkennen, daß verschiedene Kombinationen und Modifikationen
der obengenannten Verfahren bei der Isolierung und Reinigung des neuen, erfindungsgemäßen
Antibiotikums angewendet werden können.
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Marcomycin kann im Gemisch mit Hygromycin aus dem für seine Erzeugung
verwendeten Nährmedium in mehr oder weniger gereinigter Form gewonnen «erden. Ein
solches Gemisch kann als Zusatz zu tierischem Futter od. dgl. verwendet «erden,
um die wertvollen Wirkungen der beiden Antibiotika auszunutzen. Die vorliegende
Erfindung wird ferner durch die folgenden speziellen Beispiele veranschaulicht Beispiel
1 Eine Sporenkultur des Stammes NRRL 2387 des Streptomyces hygroscopicus wird dadurch
erzeugt, daß man den Organismus auf einem sich wie folgt zusammensetzenden Agar-Schrägnährboden
züchtet: Stärke......................... 20 g Asparagin ..................... 1
g Rindfleischextrakt .............. 3 g Agar .......................... 20
g genügend Wasser, um auf ........ 1 1 aufzufüllen Der Schrägnährboden wird
mit Sporen geimpft und etwa 5 Tage lang bei etwa 26° C inkubiert. Die mit Sporen
versetzte Kultur wird mit einer kleinen Wassermenge bedeckt, und der Schrägnährboden
wird vorsichtig abgeschabt, um die Sporen zu lockern und eine wäßrige Sporensuspension
zu erhalten.
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Eine Sporensuspension des Stammes NRRL 2387, die man auf die beschriebene
Weise erhielt, wird zur Impfung von 1500 ccm eines keimfreien vegetativen Wachstumsmediums
der folgenden Zusammensetzung verwendet Glukose........................ 15 g Sojabohnenmehl
................ 15 g fester gequollener Mais .......... 5 g Natriumchlorid
............ . . ... 5 g Calciumcarbonat ...... . . .
....... 2,5 g genügend Wasser, um auf ....... 1 1 aufzufüllen Man
läßt das geimpfte Medium in einer 6-1-Flasche unter ständigem Schütteln 48 Stunden
lang bei einer Temperatur von 28° C wachsen, damit sich die vegetative Form dieses
Organismus bildet. Das vegetative Inokulum wird dann zur Impfung eines sterilen
Kulturmediums für die Produktion der folgenden Zusammensetzung (Prozentsätze sind
auf Gewichts-Volumen-Basis angegeben) verwendet: Glukose .............. 3,0°/o Sojabohnenmehl
....... 2,50 I0 fester gequollener Mais 0,5°,i0 Calciumcarbonat ...... 0,201,
Natriumchlorid .... . . . 0,50/0
Wasser, ausreichend, um 662 1 Lösung
zu ergeben Das geimpfte Nährmedium, das in einem 9461 fassenden Gärbottich enthalten
ist, wird auf einer Temperatur von etwa 28° C gehalten, während der Gärung gerührt
und mit keimfreier Luft in einer Menge von etwa 1 Volumen Luft in der Minute pro
Volumen Nährboden behandelt. Die Gärung läßt man während einer Zeitspanne von 100
Stunden fortschreiten, während der sich der pH-Wert des Nährbodens allmählich von
etwa p. 6,2 auf etwa pH 7,0 erhöht. Am Ende der Gärungszeit kann die antibiotische
Aktivität im Nährboden auf die übliche Weise bestimmt werden. Eine auf diese Weise
erhaltene Gärungsbrühe enthält etwa 200 g Marcomycin, wie durch Papierscheibenprobe
unter Verwendung von B. subtilis als Versuchsorganismus festgestellt wurde. Die
filtrierte Nährlösung läßt man mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 cm3 pro Minute
über eine 101,6 . 863,6 mm große Säule laufen, die ein Kationenaustauschharz (das
zuvor mit Natriumhydroxyd gewaschen wurde, um es in den N atriumzyklus einzuschalten)
aus einem Mischpolymeren aus Methylacrylat und Divinylbenzol mit funktionellen Hydroxylgruppen
enthält. Nachdem die gesamte Nährlösung durch die Säule hindurchgelaufen ist, wird
die Säule so lange mit entionisiertem Wasser
gewaschen, bis die
auslaufende Flüssigkeit im wesentlichen farblos ist. Die Säule wird dann mit etwa
55 10,1 n-Salzsäure eluiert, wonach die auslaufende Flüssigkeit farblos ist und
der pH-Wert etwa 1,5 beträgt. Das Säureeluat wird unter Verwendung von 10° oigem
wäßrigem Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 6,9 gebracht und auf ein kleines
Volumen konzentriert. Das konzentrierte Eluat wird gefroren und aus gefrorenem Zustand
getrocknet. Der Rückstand wird in 29 1 entionisiertem Wasser aufgenommen und filtriert.
Der Niederschlag wird verworfen. Das Filtrat bringt man auf einen pH-Wert von etwa
10,5, fügt 2,9 kg Aktivkohle hinzu und rührt das Gemisch etwa 1 Stunde lang bei
Zimmertemperatur. Die Kohle wird abfiltriert und der Filterkuchen durch Aufschlämmung
in etwa 14,51 entionisiertem Wasser unter Rühren etwa 30 Minuten lang gewaschen.
Die Aufschlämmung wird filtriert und das Waschen durch Aufschlämmung wiederholt.
Die Filtrate werden verworfen. Der Filterkuchen aus der aktivierten Kohle, auf der
das Marcomycin adsorbiert ist, wird unter etwa 1stündigem Umrühren bei Zimmertemperatur
mit etwa 14,5 1 eines Gemisches aus 1,45 1 konzentriertem Ammoniak, 4,35 1 Wasser
und 8,7 1 Aceton eluiert. Das Eluat wird abfiltriert und die Eluierung unter Verwendung
der gleichen Menge des Gemisches aus Ammoniak, Aceton und Wasser wiederholt. Die
Eluate werden kombiniert und durch Verdampfung im Vakuum um auf etwa 550 ccm konzentriert.
Unter Rühren fügt man dem konzentrierten Rückstand 3,51 Aceton hinzu. Eine gummiartige
Masse, bestehend aus Marcomycin, fällt aus und haftet an den Wänden und am Boden
des Gefäßes. Die darüber befindliche Flüssigkeit wird von dem Gummi abdekantiert
und die Masse in einer minimalen :Menge absoluten Methanols aufgelöst. Die Methanollösung
wird dann langsam unter Rühren in 9 1 Äther gegossen, worauf sich ein Niederschlag
aus Marcomy cin bildet. Das überstehende Methanol-Äther-Gemisch wird von dem Niederschlag
abgegossen und der Niederschlag dann dreimal mit Äther gewaschen, wobei man den
Äther nach jedem Waschen von dem Niederschlag abgießt. Durch Verdampfung des anhaftenden
Äthers im Vakuum wird der Niederschlag getrocknet. Auf diese Weise erhält man etwa
144 g Marcomycin, das die vorstehend aufgeführten Eigenschaften aufweist.
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Da das Marcomycin hautreizend wirkt, müssen bei der Handhabung des
trockenen Pulvers Schutzmaßnahmen ergriffen werden.
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Durch Umsetzung äquivalenter Mengen des Marcomycins und der entsprechenden
Säur3 in einer geeigneten inerten Lösung kann man saure Salze des Marcomycins herstellen.
Nach Ausfällung des Salzes und anschließende Filtration und Trocknung erhält man
das Salz in fester Form.
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Man behandelt eine Lösung aus etwa 250 mg Marcomycin in etwa 3 ccm
Methanol mit 0,3 ccm konzentrierter Schwefelsäure. Es bildet sich sofort ein weißer
amorpher Niederschlag, der abfiltriert und mit einer kleinen Menge Äther gewaschen
wird. Der amorphe Feststoff ist das schwefelsaure Salz von Marcomycin.
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Marcomycinsulfat ist eine amorphe weiße Substanz. V ird diese in entweder
sauren oder alkalischen wäßrigen Lesungen gelöst und hinsichtlich der Lichtabsorption
im ultravioletten Bereich untersucht, so stellt man nur eine al'";emeine niedrige
Absorptionsintensität fest. Aus der elr':trometrischen Titration des Marcomvcinsulfates
in 66°; Eiger wäßriger Dimethylformamidlösung geht hervor, daß die pK'a-Werte 7,2
und 8,9 betragen, wobei der anfängliche pH-Wert 2,4 beträgt. Wie man aus den Titrationswerten
errechnet hat, beträgt das Molekulargewicht etwa 532.
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Um Marcomycindihy drochlorid herzustellen, löst man 0,5 g Marcomycin
in 20 cm3 Methanol auf und fügt 0,3 cm3 konzentrierte Salzsäure hinzu. Das Gemisch
wird so lange erwärmt, bis es homogen ist. Dann fügt man bis zum Beginn der Ausfällung
Äther hinzu. Nach anschließender Abkühlung scheidet sich das Marcomycindihydrochlorid
als weißer amorpher Niederschlag ab. Dieser Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther
gewaschen und getrocknet. Eine zusätzliche Reinigung kann durch Wiederauflösung
des Salzes in einer minimalen Menge warmen Methanols und durch Ausfällung mit Äther
erfolgen. Marcomycindihydrochlorid ist eine weiße amorphe Substanz, die in Wasser
löslich ist und unter Zersetzung bei etwa 170 bis 175` C schmilzt.
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Einer Lösung aus 4 g Marcomycin in 50 ml Wasser fügt man tropfenweise
so lange eine gesättigte wäßrige Lösung aus p-(p'-Oxyphenylazo)-benzolsulfonsäure
hinzu, bis die Ausfällung beendet ist. Der entstandene kristalline Niederschlag
wird abfiltriert. Nach Umkristallisation aus Alkohol - Wasser schmilzt das auf diese
Weise gewonnene Salz unter Zersetzung bei etwa 220 bis 230° C. Das so hergestellte
p-(p'-Oxyphenylazo)-benzolsulfonat von Marcomycin enthält pro Mol Marcomycin 2 Mol
p-(p'-Oxyphenylazo)-benzolsulfonsäure.
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Behandelt man wäßrige Lösungen aus Marcomycin mit Lösungen aus Phosphor-Wolframsäure,
Methylorange oder Reinickes Salz, so bilden sich Niederschläge, die zur Gewinnung
von Marcomycin aus Lösungen verwendet werden können. Das Antibiotikum kann man aus
diesen Niederschlägen gewinnen, indem man diese zwecks Spaltung des komplexen Salzes
mit einem Überschuß an wäßrigem Alkali behandelt und dieser Behandlung die bereits
genannten Extraktions- und Gewinnungsverfahren folgen läßt. Beispiel 2 37,81 Gärlösung,
die man nach dem im Beispiel l dargelegten Verfahren herstellte, werden auf einen
pH-Wert von 4,0 eingestellt und zur Entfernung des Mycels geschleudert. Die überstehende
Flüssigkeit stellt man dann auf einen pH-Wert von 8,0 ein und gießt die Flüssigkeit
über eine 101,6 - 457,2 mm große Säule, die Aktivkohle enthält. Die in der Gärlösung
vorhandenen antibiotisch wirkenden Substanzen werden dadurch auf der Kohle adsorbiert.
Nach Durchfluß der gesamten Gärlösung durch die Säule entfernt man mit Hilfe eines
Gemisches, das zu gleichen Teilen aus Aceton und 0,02 n-Salzsäure besteht, die Antibiotika
aus der Säule. Sind im wesentlichen alle antibiotisch wirkenden Substanzen entfernt
- was aus einer mikrobiologischen Untersuchung des Eluats hervorgeht -, wird das
Eluat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhält einen Rückstand aus Marcomycin
zusammen mit anderen antibiotisch wirkenden Substanzen, die der Streptomyce&.
Organismus hervorgebracht haben kann. Das Gemisch eignet sich als Zusatz für tierisches
Futter, das als wurmtötendes Mittel zugegeben wird.