PL212612B1

PL212612B1 - Zastosowanie docetakselu do leczenia raka watrobowokomórkowego

Info

Publication number: PL212612B1
Application number: PL353198A
Authority: PL
Inventors: Chin-Wen Chi; Heng-Liang Lin; Tsung-Yun Liu; Wing-Yiu Lui; Gar-Yang Chau
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 1999-08-31
Filing date: 2000-08-29
Publication date: 2012-10-31
Also published as: HUP0203197A3; HK1048944A1; NO20020829L; DE60011794T2; CZ2002739A3; EA004804B1; NO328527B1; ZA200201408B; IL147489A; GB9920548D0; JP2003508427A; MEP7809A; HRP20020171A2; EA200200313A1; US20030158249A1; MXPA02002041A; BG65913B1; WO2001015675A2; DK1214061T3; EP1214061A2

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy leczenia raka wątrobowokomórkowego. Rak wątrobowokomórkowy (pierwotny rak wątroby, HCC) jest jednym z najpowszechniej występujących raków w południowo-wschodnich krajach azjatyckich i w krajach afrykańskich. Na Tajwanie, HCC jest wiodącą przyczyną śmierci mężczyzn chorych na raka. Współczynnik przeżycia chorych na HCC jest bardzo niski. Powodem tego jest głównie brak skutecznego leczenia. Napromienianie i chemioterapia nie okazały się skuteczne w wystarczającym stopniu; najskuteczniejszym sposobem leczenia jest chirurgia. Jednakże, chirurgię można wykorzystać jedynie u chorych z niewielkimi, dającymi się wyciąć guzami.

Obecnie, zainteresowanie wzbudziły ponownie leki antymitotyczne, takie jak paklitaksel. Paklitaksel pierwotnie wyodrębniono z kory cisa. Przeciwrakowe działanie paklitakselu znane jest już od 1971 roku. Paklitaksel hamuje podział komórek nowotworowych przez oddziaływanie na formowanie się mikrotubuli. Wyniki in vitro analiz dokonywanych z udziałem komórek nowotworowych potwierdziły, że paklitaksel zatrzymuje właściwe funkcjonowanie komórki głównie w fazie G2/M cyklu komórkowego [P.B.Schiff i S.B. Horwitz, Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 1561 - 1565 (1980)]. Współczesne badania wykazały, że paklitaksel oddziaływuje skutecznie na różne komórki nowotworów złośliwych, takich jak rak mózgu, rak żołądka i rak prostaty, rak sutka, czerniak i rak jajnika.

Jednakże, paklitaksel nie jest skuteczny w przypadku raka wątrobowokomórkowego. W British Journal of Cancer, 78(1), 34-39 (1998), doniesiono o badaniach klinicznych fazy II. W artykule tym konkluduje się, że paklitaksel nie wywiera żadnego wyraźnego działania przeciwrakowego u chorych na HCC.

Jak to objaśniono powyżej, zostało już stwierdzone, że efekt cytotoksycznego działania paklitakselu zależy od cyklu komórkowego, przy czym cykl ten ulega zahamowaniu głównie w fazie G2/M. Jednakże, obecnie stwierdzono, że niezależną od cyklu komórkowego cytotoksyczność względem komórek HCC można osiągnąć za pomocą docetakselu. Fakt ten wskazuje na to, że wywierane na komórki HCC działanie cytotoksyczne docetakselu osiągane jest na zasadzie mechanizmu innego niż mechanizm działania paklitakcelu. Następnie, aktywność docetakselu in vitro skierowana przeciw komórkom HCC jest znacząco silniejsza od aktywności paklitakselu w stężeniach do 1 μΜ. Jeżeli weźmie się pod uwagę wysoce cytotoksyczny charakter taksoidów, to zwiększona aktywność docetakselu przy niskich jego stężeniach sugeruje, że docetaksel, inaczej niż ma to miejsce w przypadku paklitakselu, znajdzie praktyczne zastosowanie w leczeniu raka wątrobowokomórkowego.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie docetakselu lub jego hydratu do wytwarzania kompozycji do leczenia raka wątrobowokomórkowego.

Korzystnie jako hydrat docetakselu stosuje się trihydrat docetakselu.

Korzystnie wytworzona kompozycja jest przeznaczona do podawania pozajelitowego.

Korzystnie wytworzona kompozycja jest odpowiednia do stosowania dootrzewnowego, podskórnego, dożylnego, domięśniowego lub domostkowego, przy czym zawiera związek aktywny w ilości od 38 do 42 mg/ml.

Korzystnie wytworzona kompozycja nadaje się do stosowania jako wlew, przy czym zawiera związek aktywny w ilości od 0,1 do 11 mg/ml.

Docetaksel jest znanym związkiem o wzorze:

Sposoby wytwarzania doceakselu opisano w dokumentach patentowych EP-A-253738 i EP-A336841.

Docetakselu można używać, na przykład, w postaci bezwodnej lub w postaci hydratu. W niniejszym opisie, odniesienia dotyczące docetakselu obejmują swym zakresem także hydraty docetakselu.

Hydraty docetakselu można wytworzyć za pomocą rozpuszczenia bezwodnego docetakselu w rozpuszczalniku organicznym, takim jak aceton, etanol, acetonitryl lub N,N-dimetyloformamid, a następnie wykrystalizowania hydratu docetakselu za pomocą wprowadzenia wody do otrzymanego

PL 212 612 B1 roztworu. Typowo, hydratem docetakselu jest dihydrat, trihydrat lub tetrahydrat docetakselu. Stwierdzono, że zwłaszcza trihydrat okazuje się szczególnie trwały i dlatego uważa się go za korzystny. Trihydrat docetakselu można wytworzyć z wykorzystaniem sposobów opisanych w dokumencie patentowym EP-770070.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że docetaksel wykazuje aktywność skierowaną przeciw rakowi wątrobowokomórkowemu. W szczególności, można go używać do leczenia raka wątrobowokomórkowego, odmian fibrolamelarnych i mieszanych raków wątrobowokomórkowych/dróg żółciowych.

Według niniejszego wynalazku, docetaksel można podawać jakąkolwiek znaną drogą podawania, znaną ze stosowania docetakselu. I tak, na przykład, można go podawać pozajelitowo. Typowo, stosuje się go dożylnie, korzystnie metodą wlewu dożylnego.

Według niniejszego wynalazku, docetaksel typowo formułuje się w postacie do podawania jako farmaceutycznie dozwolone kompozycje zawierające docetaksel i farmaceutycznie dozwolony nośnik lub rozcieńczalnik. Do odpowiednich nośników i rozcieńczalników należą nietoksyczne rozpuszczalniki i podłoża zawieszające, na przykład jałowe podłoż a wodne. Korzystnie, kompozycje te mają postać wodnych roztworów lub zawiesin, takich jak, na przykład, roztwory nadające się do wstrzykiwań lub wlewów, które mogą zawierać także emulgatory, barwniki, konserwanty lub stabilizatory.

Do kompozycji farmaceutycznych odpowiednich do stosowania pozajelitowego należą jałowe wodne lub niewodne roztwory lub zawiesiny. Do odpowiednich jałowych niewodnych roztworów i zawiesin należą roztwory i zawiesiny w naturalnych olejach roślinnych, takich jak oliwa, olej sezamowy lub parafina płynna, albo w dających się wstrzykiwać estrach organicznych, takich jak oleinian etylu. Do odpowiednich jałowych roztworów wodnych należą roztwory docetakselu w wodzie. Typowo, pH jałowych roztworów wodnych nadających się do podawania drogą pozajelitową ustala się odpowiednio do sytuacji. Następnie, takim jałowym roztworom wodnym nadaje się izotoniczność, na przykład za pomocą wprowadzenia chlorku sodu lub glukozy w dostatecznej ilości. Szczególnie korzystnie, wartość pH roztworów nadających się do podawania we wlewie jest podobna do wartości pH krwi i są one izotoniczne.

Wyjałowienia można dokonać przez ogrzewanie, albo w jakikolwiek inny sposób, nie oddziaływujący szkodliwie na daną kompozycję.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające docetaksel, nadające się do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem, mogą także zawierać środek powierzchniowo czynny. Korzystnymi środkami powierzchniowo czynnymi są polisorbaty, estry glikolu polioksyetylenowego i estry-etery glikolu polietylenowego, oraz oleje rącznikowe. Przykłady odpowiednich środków powierzchniowo czynnych i kompozycji farmaceutycznych zawierają cych ś rodki powierzchniowo czynne moż na znaleźć w dokumencie patentowym AU 666859.

Docetaksel można także formułować według niniejszego wynalazku, z przeznaczeniem do stosowania, w postać kompozycji zliofilizowanej. Tego rodzaju kompozycje zliofilizowane wykazują dobrą trwałość fizyczną i chemiczną, dzięki czemu można je przechowywać przez długi czas. Kompozycje zliofilizowane zawierające docetaksel można wytworzyć za pomocą zliofilizowania wodnego roztworu docetakselu w zwykły sposób. Mogą one zawierać także domieszki balastowe, takie jak laktoza. Mogą one również zawierać środki nadające właściwą toniczność, takie jak cukry i polimery. Do przykładowych środków nadających właściwą toniczność należą: glukoza (dekstroza) i mannitol oraz polimery, takie jak, na przykład poliwinylopirolidon.

Kompozycję zliofilizowaną można ponownie rozpuścić tuż przed użyciem w dowolnym, zgodnym, farmaceutycznie dozwolonym i dającym się wstrzykiwać podłożu. Korzystnie, liofilizat można przyjąć po rozpuszczeniu go w podwójnie destylowanej wodzie do wstrzykiwań, w objętości równoważnej pierwotnej objętości roztworu poddawanego liofilizacji.

Zawierająca docetaksel kompozycja farmaceutyczna, nadająca się do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem, typowo zawiera co najmniej 0,01% wagowych substancji terapeutycznie aktywnej. Na ogół, kompozycja farmaceutyczna zawiera substancję terapeutycznie aktywną w ilości mieszczącej się w zakresie od 0,01 do 1000 mg, korzystnie od 0,1 do 500 mg.

Korzystnie, roztwór nadający się do wstrzykiwań dożylnych zawiera substancję aktywną w ilości mieszczącej się w zakresie od 38 do 42 mg/ml, korzystniej w ilości wynoszącej około 40 mg/ml. Typowo, roztwory takie umieszczone są w fiolkach zawierających 20 mg lub 80 mg substancji aktywnej.

Korzystnie, roztwór nadający się do wlewów zawiera substancję aktywną w ilości mieszczącej się w zakresie od 0,1 do 11 mg/ml, korzystnie od 0,1 do 10 mg/ml, a korzystniej od 0,3 do 0,9 mg/ml.

Zabiegów terapeutycznych z udziałem docetakselu można dokonać sposobem według wynalazku jednocześnie z leczeniem prowadzonym przy użyciu innych leków przeciwnowotworowych,

PL 212 612 B1 przeciwciał monoklonalnych, razem z immunoterapią lub radioterapią, albo z udziałem modyfikatorów odpowiedzi biologicznej. Do odpowiednich modyfikatorów odpowiedzi biologicznej należą limfokiny i cytokiny, takie jak interleukiny, interferony (α, β lub δ) i TNF. Do innych ś rodków chemioterapeutycznych, użytecznych w leczeniu zaburzeń wynikających z nienormalnej proliferacji komórek, należą środki działające alkilująco, na przykład pochodne iperytu azotowego, takie jak mechloretamina, cyklofosfamid, mefalan i chlorambucyl, sulfoniany alkilowe, takie jak busulfan, pochodne nitrozomocznika, takie jak karmustyna, lomustyna, semustyna i streptozocyna, triazeny, takie jak dekarbazyna, antymetabolity, takie jak analogi kwasu foliowego, na przykład metotreksat, analogi pirymidyny, takie jak fluorouracyl i cytarbina, analogi puryny, takie jak merkaptopuryna i tioguanina, produkty naturalne, na przykład alkaloidy Catharanthus (Vinca), takie jak winblastyna, winkrystyna i windezyna, pochodne epipodofilotoksyny, takie jak etopozyd i tenipozyd, antybiotyki, takie jak daktynomycyna, daunorubicyna, doksorubicyna, bleomycyna, plikamycyna i mitomycyna, enzymy, takie jak L-asparaginaza, różne środki, takie jak koordynacyjne kompleksy platyny, na przykład cysplatyna, pochodne mocznika, takie jak hydroksykarbamid, pochodne metylohydrazyny, takie jak prokarbazyna, supresory adrenokortykowe, takie jak mitotan i aminoglutetimid, hormony i antagony, takie jak adrenokortykosteroidy, takie jak prednizon, progestyny, takie jak heksanian hydroksyprogesteronu, octan metoksyprogesteronu i octan megestrolu, estrogeny, takie jak dietylstylbestrol i etynyloestradiol, antyestrogeny, takie jak tamoksyfen oraz androgeny, takie jak propionian testosteronu i fluoksymesteron.

Korzystne jest współleczenie przy użyciu cyklofosfamidu, 5-fluorouracylu, etopozydu, winorelbiny lub metotreksatu, ponieważ między tymi związkami a docetakselem może dojść do synergizmu. Następnie, okazuje się, że 2-metoksyestradiol wykazuje aktywność w stosunku do raków wątrobowokomórkowych i stwierdzono, że po upływie miesiąca codziennego podawania myszom jest dobrze tolerowany [Klauber i in., Cancer Research, 57, 81-86 (1997)]. Dlatego, korzystne jest jednoczesne leczenie z udziałem 2-metoksyestradiolu, zwłaszcza w tych przypadkach, kiedy potrzebne jest leczenie przewlekłe.

Według niniejszego wynalazku, docetaksel stosowany jest z przyjęciem takiego reżymu dawkowania, który umożliwia leczenie raka wątrobowokomórkowego. Dawkowanie zmienia się w zależności od drogi podawania i fizycznej charakterystyki pacjenta. Odpowiednim dawkowaniem jest dawkowanie terapeutycznie skuteczne, jeśli chodzi o leczenie zaburzeń wynikających z nienormalnej proliferacji komórek. Docetaksel można podawać tak często, jak tylko jest to niezbędne dla uzyskania pożądanego efektu terapeutycznego.

Typowa dawka docetakselu w przypadku leczenia ludzi mieści się w zakresie od 50 do 150 mg docetakselu/m² powierzchni skóry chorego, korzystnie w zakresie od 60 do 100 mg/m², a korzystniej wynosi około 100 mg/m². Gdy docetaksel podawany jest we wlewie, szybkość wlewu typowo mieści się w zakresie od 1 do 200 mg docetakselu/m²/h i korzystnie wynosi około 100 mg/m²/h.

Powyższą dawkę można, w miarę potrzeby, powtarzać. Typowo, powtarza się ją codziennie lub cotygodniowo. Korzystnie powtarza się ją co 3 tygodnie. I tak, na przykład, docetaksel można podawać w dawce wynoszącej około 100 mg/m² we wlewie dożylnym w ciągu godziny co 3 tygodnie.

Wynalazek objaśnia następujący przykład.

P r z y k ł a d

Materiały i metody.

Jeżeli tego inaczej nie zaznaczono, stosowane tu metody są to typowe techniki biochemiczne. Użyte linie komórek są handlowo dostępne.

Hodowla komórkowa.

Wyszczególnione poniżej eksperymenty przeprowadzono z udziałem ludzkich komórek wątrobiaka linii Hep 3B (ATCC HB 8064), Hep G2 (ATCC HB 8065) i HA22T/VGH, oraz mysich komórek wątrobiaka linii Hepa 1-6. Komórki te hodowano w DMEM (GIBCO, BRL) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone), 0,01 mg/ml gentamycyny i 0,1 mM aminokwasów egzogennych. Komórki rosły w inkubatorze z CO2, w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2 i 95% przefiltrowanego powietrza.

Poddanie działaniu leku.

W wyszczególnionych poniż ej eksperymentach, powyższe komórki wą trobiaka poddawano działaniu paklitakselu i docetakselu w różnych stężeniach (0,001 - 10 μΜ), w ciągu 24 i 72 godzin. Roztworami podstawowymi były: roztwór paklitakcelu w sulfotlenku dimetylowym (DMSO) i roztwór docetakselu w etanolu. Końcowe stężenie vehiculum wynosiło nie więcej niż 0,1%.

Badanie żywotności komórek: test MTT.

Hodowlę komórek prowadzono na 96-studzienkowym klasterze do hodowli komórek (COSTAR) przy gęstości wynoszącej 4 x 10⁴ komórek/ml. Po działaniu lekiem w ciągu 24 i 72 godzin, podłoże

PL 212 612 B1 usunięto i zastąpiono taką samą (100 ąl) objętością świeżego podłoża zawierającego 0,456 mg/ml MTT [bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego], po czym komórki dalej inkubowano w ciągu 1,5 godziny w temperaturze 37°C. Następnie, to świeże podłoże usunięto i dodano 100 μl DMSO. Żywotność komórek oznaczono metodą kolorymetrycznego porównania przez odczytanie wartości OD z czytnika mikropłytek do miareczkowania (SPECTRA MAX 250) przy absorpcji światła o długości fali 570 nm.

Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 1, na której kółka pełne przedstawiają dane uzyskane po 24 godzinach, a kółka puste przedstawiają dane uzyskane po 72 godzinach działania leku. Dane oznaczają średnią ± błąd standardowy średniej dla próbek równoległych z trzech niezależnych eksperymentów.

Badanie ekskluzji jodku propidium (PI).

Hodowlę komórek prowadzono w 5 cm² butelkach (CORNING) i poddawano działaniu paklitakselu i docetakselu w sposób powyżej opisany. Następnie, dodano 10 μg/ml jodku propidium i inkubację kontynuowano w ciągu 15 minut w temperaturze 37°C, po czym zebrano podłoże, a potem przywarte komórki. Tak zawieszone jak i przywarte komórki zebrano i ponownie zawieszono w 500 μl PBS w celu przeprowadzenia analizy metodą cytometrii przepływowej sposobem poniżej opisanym. Sygnały pochodzące od uszkodzonej tkanki usunięto przez obramkowanie z zastosowaniem FSC-SSC.

Analiza zawartości DNA metodą cytometrii przepływowej.

Do osadu komórek dodano bufor do lizy (0,5% Triton X-100, 0,2 μg/ml Na₂EDTAżH₂O i 1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS) i osad komórek pozostawiono na 15 minut na lodzie. Następnie, dodano 100% metanol uprzednio oziębiony do temperatury -20°C i całość wirowano przy 300 x g w ciągu 5 minut. Powstały supernatant odrzucono i osad komórek przemyto PBS. Przemyty osad barwiono przy użyciu roztworu do barwienia DNA (50 μg/ml jodku propidium i 5 kunitz/ml RNazy A) w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C, bez dostępu światła. Zawartość DNA każdej komórki mierzono przy użyciu cytometru przepływowego Becton Dickinson FACSCalibur, jak to opisano poniżej.

Cytometria przepływowa.

Komórki (10000) analizowano przy pomocy cytometru przepływowego Becton Dickinson FACSCalibur, z zastosowaniem lasera argonowego (15 mW) z wiązką padającą przy 488 nm. Dla badania ekskluzji PI, zebrano czerwoną fluorescencję przy użyciu filtra 585 nm, a sygnały uszkodzonej tkanki usunięto przez obramkowanie z zastosowaniem FCS-SSC. Dane zarejestrowano i poddano analizie z wykorzystaniem oprogramowania FACS/CELLQuest na komputerze Power Macintosh 7600/120. Komórki apoptotyczne i komórki w specyficznych fazach cyklu oznaczano z wykorzystaniem oprogramowania ModFit LT.

Otrzymane wyniki cytometrii przepływowej przedstawiono w poniższych tabelach 1 i 2 oraz na fig. 2. W tabeli 1 zamieszczono dane odnoszące się do przepuszczalności błony komórkowej komórek wątrobiaka po potraktowaniu paklitakselem i docetakselem. W tabeli 2 wyszczególniono procenty komórek apoptotycznych (sub-G0/G1) po potraktowaniu paklitakselem i docetakselem. Na fig. 2 pokazano wyniki analizy w formie histogramów DNA, pokazującej szczegółowo wpływ oddziaływania paklitakselu i docetakselu na przebieg cyklu komórkowego.

T a b e l a 1

Przepuszczalność błony komórkowej komórek wątrobiaka po potraktowaniu paklitakselem i docetakselem

	Paklitaksel (ąM)	Docetaksel (ąM)
0,01	0,1	1	0,01	0,1	1
HEP G2
24 h	93,63±1,	85,71 ±6,8	66,71 ±7,2	94,86±1,3	85,49±1,2	81,24±3,2
72 h	56,58±28,7	43,79±11,7	13,27± 4,3	61,06±9,6	40,03±9,0	27,42±8,8
Hep 3B
24 h	77,35±11,7	63,50±4,0	52,28±4,1	93,80±10,7	57,41 ±6,8	57,39±4,3
72 h	57,00±7,9	8,09±2,3	1,90±0,3	36,81 ±14,7	36,25±13,5	20,25±14,4
HA 22T/VGH
24 h	94,08±18,6	40,03±7,8	34,24±8,3	98,66±9,0	38,71 ±11,2	40,79±5,0
72 h	92,58±21,3	93,38±32,5	49,32±8,3	55,44±5,6	21,24±0,4	22,03±3,1
Hepa 1-6
24 h	93,17±3,8	67,20±4,4	62,65±7,6	94,45±1,9	83,35±7,2	81,88±8,7
72 h	62,95±5,6	27,79±1,3	15,51 ± 1,0	77,18±1,4	43,94±3,4	38,90±4,2

PL 212 612 B1

Dane zawarte w powyższej tabeli oznaczają średnią ± standardowy błąd średniej dla próbek równoległych z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Komórki poddawano działaniu leków w ciągu 24 - 72 godzin i analizowano przepuszczalność błony metodą cytometrii przepływowej przez pomiar ekskluzji propidium w żywotnych komórkach wątrobiaka. Dane stanowią procent komórek z nienaruszoną bł oną komórkową w porównaniu z kontrolą .

T a b e l a 2

Apoptoza wywoływana paklitakselem i docetakselem

	Paklitaksel (mM)	Docetaksel (mM)
0,01	0,1		0,01	0,1	1
Hep G2 24 h				45,24	38,77	28,33
72 h				42,45	42,44	56,66
Hep 3B 24 h				59,14	58,67	65,74
72 h		38,37	47,01	64,12	81,66	79,33
HA22T/VGH
24 h				41,75	18,61	22,94
72 h		0	0	56,64	58,61	60,98
Hepa 1-6 24 h	24,02	55,64	64,38	52,81	50,76	53,80
72 h		N/A	N/A	31,25	53,95	62,49

Uwaga:

W powyższej tabeli użyto następującego skrótu:

N/A = brak działania (przyp. tłumacza)

Dane zawarte w powyższej tabeli stanowią procent komórek apoptotycznych (sub-G0/G1) według oznaczenia metodą cytometrii przepływowej.

Analiza fragmentacji DNA metodą elektroforetyczną

Oceny fragmentacji DNA dokonano zgodnie z metodą Hermanna i in. [Nucleic Acids Res., 22,

5506 - 5507 (1994)].

W skrócie, komórki HEP G2 (2 x 10⁷) poddawano w ciągu 72 h działaniu paklitakselu i docetakselu sposobem wyżej opisanym, po czym odwirowano. Tak otrzymane osady komórek ponownie zawieszono w buforze do lizy NP-40 (1% NP-40 w 20 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5). Po kilkusekundowej lizie komórek, zebrano supernatanty (5 minut, 1600 x g). Ekstrakcję powtórzono przy użyciu takiego samego buforu do lizy. Następnie, do supernatantów wprowadzono SDS (końcowe stężenie 1%) i RNazę (końcowe stężenie 2,5 μg/μl) i całość inkubowano w ciągu 2 godzin w temperaturze 56°C. Następnie przeprowadzono trawienie z udziałem proteinazy K (2,5 μg/μl) w ciągu 2 godzin, w temperaturze 37°C. Następnie, utworzone tak mieszaniny wprowadzono do 10 M octanu amonu, a potem do 100% etanolu w celu wytrącenia, w ciągu 30 minut, w temperaturze -20°C. DNA zebrano za pomocą odwirowania (10 minut, 12000 x g), a następnie elektroforezy na 1,5% żelu agarozowym.

Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 3. Na fig. 3, M oznacza marker o 100 parach zasad. Ścieżka 1 pokazuje podłoże kontrolne. Ścieżki 2 i 3 uwidaczniają grupy leczone paklitakselem (0,1 i 1 μM), a ścieżki 4 i 5 uwidaczniają grupy leczone docetakselem (0,1 i 1 μM).

Wyniki

Badanie żywotności komórek.

Fig. 1 przedstawia zależny od dawki wpływ paklitakselu i docetakselu na żywotność komórek w liniach komórek wątrobiaka (Hep G2, Hep 3B, HA22T/VGH i Hepa 1-6). Jak widać to na fig. 1, przy użyciu docetakselu w stężeniu 0,01 i 0,1 μM uzyskiwano prawie za każdym razem zmniejszenie żywotności.

W przypadku komórek Hep G2 żywotność komórek, po potraktowaniu paklitakselem i docetakselem, przejawiała tendencję zniżkową. Żywotność komórek Hep G2 wynosiła 61,81% i 39,45% kontroli dla grup leczonych paklitakselem (10 μM) po 24 i 72 godzinach. W przypadku komórek Hep G2 traktowanych docetakselem, maksymalne obniżenie żywotności obserwowano przy 1 μM docetakselu;

PL 212 612 B1 przy 10 μΜ docetakselu nie stwierdzono dalszego zmniejszenia żywotności. Żywotność wynosiła 65,03% i 48,99% dla komórek traktowanych docetakselem po, odpowiednio, 24 i 72 godzinach.

Jeśli chodzi o komórki Hep B3, godne uwagi jest to, że po ich traktowaniu docetakselem w stężeniu 0,01 w ciągu 72 godzin stwierdzono znaczne zmniejszenie żywotności (37,06%).

W przypadku komórek Hepa 1-6 poddanych działaniu docetakselu w stężeniu 1 μM, stwierdzono maksymalną cytotoksyczność dla grup po 24 i 72 godzinach wynoszącą, odpowiednio, 65,34% i 30,71%.

Badanie ekskluzji jodku propidium (PI).

Dane zamieszczone w tabeli 1 pokazują, że przepuszczalność błon komórek Hep G2 i Hep 3B po traktowaniu paklitakselem i docetakselem była zależna i od dawki i od czasu.

W przypadku komórek HA22T/VGH, zaobserwowano wzrost przepuszczalności błony po trwającym 72 godziny działaniu paklitakselem (0,01 - 1 μM) mniejszy, niż wzrost przepuszczalności przy porównawczym podziałaniu docetakselem. Godne uwagi jest to, że jedynie 55,44% komórek miało po upływie 72-godzinnym działaniu docetakselem w stężeniu 0,01 μM błony nienaruszone, podczas gdy w przypadku paklitakselu użytego w tej samej dawce nienaruszone błony stwierdzono u 92,58% komórek.

Analiza cyklu komórkowego.

Fig. 2 pokazuje, że komórki Hep G2 poddawane działaniu paklitakselu w stężeniu 1 μM w ciągu 24 godzin w sposób oczywisty wykazały zatrzymanie cyklu na etapie fazy G2/M. Podobne histogramy DNA zarejestrowano po upływie ekspozycji 72-godzinnej.

Jak to uwidoczniono w tabeli 2, po działaniu docetakselem w stężeniu 0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM i 1 μM w ciągu 24 godzin stwierdzono występowanie komórek apoptotycznych (sub-G0/G1), przy czym procent komórek apoptotycznych wynosił, odpowiednio, 31,02%, 45,24%, 38,77% i 28,33%. Po działaniu docetakselem w stężeniu od 0,001 do 1 μM w ciągu 72 godzin, procent komórek apoptotycznych wynosił, odpowiednio, 21,92%, 42,45%, 42,44% i 56,66%.

W przypadku komórek Hep 3B, traktowanie poklitakselem w stężeniu 0,1 μM lub 1 μM w ciągu 24 godzin prowadziło do zatrzymania cyklu na etapie fazy G2/M, a inkubacja z 0,1 μM lub 1 μM paklitakselu w ciągu 72 godzin prowadziła do wzrostu procentu sub-G0/G1 do, odpowiednio, 38,37% lub 47,01%. W przeciwieństwie do tego, działanie na komórki Hep 3B 0,01 μM, 0,1 μM lub 1 μM docetakselu w ciągu 24 godzin lub 72 godzin powodowało zaistnienie wysokiego poziomu populacji sub-G0/G1, a mianowicie, odpowiednio, 59,14%, 58,69% i 65,74% dla 24 godzin i 64,12%, 81,66% i 79,33% dla 72 godzin.

W przypadku komórek HA22T/VGH, podwyższenie stężenia paklitakselu (od 0,001 μM do 1 μM) korelowało ze zwiększonym procentem komórek G2/M po upływie 24 godzin. W przypadku grup traktowanych paklitakselem w stężeniu 0,1 μM lub 1 μM, w ciągu 72 godzin, nie stwierdzono istnienia żadnej znaczniejszej populacji sub-G0/G1. W przeciwieństwie do tego, widać wyraźnie, że w przypadku komórek HA22T/VGH traktowanych 0,01 μM docetakselu w ciągu 24 godzin występują w wyższym procencie populacje sub-G0/G1 (a mianowicie 41,75%), niż w grupach poddanych działaniu docetakselu w stężeniu 0,1 μM (18,61%) lub 1 μM (22,94%). W przypadku traktowania komórek HA22T/VGH docetakselem w ciągu 72 godzin, w komórkach takich stwierdzono wyraźny procent sub-G0/G1 dla stężenia 0,01 μM (56,64%), 0,1 μM (58,61%) i 1 μM (60,98%).

W przypadku komórek Hepa 1-6, wynikiem działania paklitakselu (0,01, 0,1 lub 1 μM) w ciągu 24 godzin było wzmożenie tworzenia się populacji sub-G0/G1 (odpowiednio, 24,02%, 55,64% lub 64,38%), przy czym zatrzymanie cyklu na etapie fazy G2/M stwierdzono w grupach traktowanych 0,1 μM i 1 μM paklitakselu. W przypadku traktowania komórek Hepa 1-6 paklitakselem w stężeniu 0,1 μm i 1 μM w ciągu 72 godzin, większość komórek była martwa i nie obserwowano żadnego oczywistego profilu cyklu komórkowego. Wynikiem działania na komórki Hepa 1-6 docetakselem (0,01 μM, 0,1 μM i 1 μM) było utworzenie się komórek sub-G0/G1 (odpowiednio, 52,81%, 50,76% i 53,8% w przypadku ekspozycji 24-godzinnej i 31,25%, 53,95% i 62,49% w przypadku ekspozycji 72-godzinnej).

Analiza fragmentacji DNA.

Fig. 3 pokazuje, że obróbka z udziałem paklitakselu (0,1 i 1 μM) i docetakselu (0,1 i 1 μM) indukowała fragmentację DNA w komórkach Hep G2.

Claims

1. Zastosowanie docetakselu lub jego hydratu do wytwarzania kompozycji do leczenia raka wątrobowokomórkowego.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że jako hydrat docetakselu stosuje się trihydrat docetakselu.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że wytworzona kompozycja jest przeznaczona do podawania pozajelitowego.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że wytworzona kompozycja jest odpowiednia do stosowania dootrzewnowego, podskórnego, dożylnego, domięśniowego lub domostkowego, przy czym zawiera związek aktywny w ilości od 38 do 42 mg/ml.

5. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że wytworzona kompozycja nadaje się do stosowania jako wlew, przy czym zawiera związek aktywny w ilości od 0,1 do 11 mg/ml.