BG106460A

BG106460A - Използване на доцетаксел за лечение на хепатоцелуларен карцином

Info

Publication number: BG106460A
Application number: BG06460A
Authority: BG
Inventors: Chin-Wen Chi; Heng-Liang Lin; Tsung-Yun Liu; Wing-Yiu Lui; Gar-Yang Chau
Original assignee: Aventis Pharma S.A.
Priority date: 1999-08-31
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2002-09-30
Also published as: ME00624B; IL147489A0; NZ517604A; ES2218223T3; AU777583B2; HRP20020171A2; JP4866522B2; CN1372466A; HU228861B1; US20030158249A1; CA2382294C; HUP0203197A3; ZA200201408B; SI1214061T1; DE60011794D1; ATE269700T1; AU7516800A; EE200200087A; KR100670416B1; EP1214061A2

Abstract

Изобретението се отнася до използване на доцетаксел или на негов хидрат при получаването на лекарствено средство за лечение на хепатоцелуларен карцином.

Description

ИЗПОЛЗУВАНЕ НА ДОЦЕТАКСЕЛ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ХЕПАТОЦЕЛУЛАРЕН КАРЦИНОМ

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Това изобретение се отнася до лечение на хепатоцелуларен карцином.

ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Хепатоцелуларният карцином (НСС) е един от най-общите ракови заболявания в страните от Южна Азия и Африка. В Тайван, НСС е главната причина за смъртност при пациенти от мъжки пол с раково заболяване. Степента на преживяемост от НСС е много ниска. Това се дължи главно на липсата на ефективни лечения. Лъчевото лечение и химиотерапията не са доказали, че са задоволителни; хирургията е най-ефективното лечение за НСС. Обаче, хирургията е подходяща само за пациенти с малки тумори, податливи на резекция.

В последно време, антимитотични лекарства, такива като паклитаксел, се оказаха с подновен интерес. Паклитаксел беше изолиран по оригинален начин от кората на тисовото дърво.

Антитуморният ефект на паклитаксел е известен от 1971 година. Паклитакселът инхибира деленето на туморните клетки, като действува на микротубуларната система. Анализите in vitro, използуващи туморни клетки, разкриха, че паклитакселът задържа клетките главно във G2/M фазата от клетъчния цикъл (Schiff РВ and Horwitz SB, Proc. Natl. Acad. Sci 77, 1561 - 1565, 1980). Нови изследвания показват, че паклитакселът е ефективен срещу различни злокачествени туморни клетки, такива като мозъчни тумори, рак на стомаха и рак на простатата, рак на ©гърдата, меланома и рак на яйчниците.

Обаче, паклитаксел не е ефективен срещу хепатоцелуларен карцином. За фаза II на клинични изследвания на паклитаксел за НСС пациенти се докладва в Britiah Journal of Cancer, 78 (1), 34-39, 1998. Този раздел заключава, че паклитаксел няма значителен противо-раков ефект при пациенти с НСС.

Както е обяснено по-горе, за цитотоксичния ефект на паклитаксел е установено, че зависи от клетъчния цикъл, като задържането на клетъчния цикъл се появява главно във G2/M фазата. Обаче, понастоящем се установи, че доцетаксел може ♦ да упражни цитотоксичност в НСС клетки, не-зависеща от клетъчния цикъл. Това показва, че цитотоксичният ефект върху НСС клетки се постига посредством механизъм, различен от този на паклитаксел. Освен това, активността in vitro на доцетаксел срещу НСС клетки е значително по-висока от тази на паклитаксел при концентрации от порядъка на до 1 μΜ. Имайки предвид високата цитотоксична природа на таксоиди, повишена активност при ниска концентрация подсказва, че доцетаксел, за разлика от паклитаксел, трябва да има практическо приложение при клинично лечение на хепатоцелуларен карцином.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Имайки предвид всичко това, настоящето изобретение предоставя използуването на доцетаксел, или на негов хидрат, при получаването на лекарствено средство за използуване при лечението на хепатоцелуларен карцином.

Също така предоставя метод за лечение на пациенти, страдащи от хепатоцелуларен карцином, който метод се състои в приложение върху посочените пациенти на ефективно количество от доцетаксел, или на негов хидрат. Изобретението също така предоставя метод за подобряване състоянието на пациенти, страдащи от хепатоцелуларен карцином, който метод се състои в приложение върху посочените пациенти на ефективно количество от доцетаксел, или на негов хидрат.

Доцетакселът е известно съединение. Той има формулата

Методи за получаването на доцетаксел са описани в ЕР-А-253738 и ЕР-А-336841.

Доцетаксел може да се използува, например, в безводна форма, или под формата на хидрат. Така, както се използуват тук, референциите за доцетаксел включват референциите за неговите хидрати.

Хидрати на доцетаксел могат да се получат чрез разтваряне на безводен доцетаксел в органичен разтворител, такъв като ацетон, етанол, ацетонитрил, или Ν,Ν-диметилформамид, и чрез прекристализиране на доцетаксел хидрат, като така полученият разтвор се излива във вода. Доцетаксел хидрат е характерно дихидрат, трихидрат, или тетрахидрат. По-специално, за трихидрата е установено, че е особено стабилен, и поради това доцетаксел трихидрата е предпочитан. Доцетаксел трихидрат може да се получи посредством метода, описан в ©ЕР-А-770070.

Доцетаксел е неочаквано активен срещу хепатоцелуларни карциноми. По-специално, той може да се използува за лечение на чернодробни карциномни клетки, фиброламелозни разновидности, и смесени хепатоцелуларни холангиокарциноми.

Съгласно настоящето изобретение, доцетаксел може да се прилага чрез който и да е конвенционален начин за приложение на доцетаксел. Така, например, той може да се прилага парентерално. Характерно, той се прилага интравенозно, за предпочитане чрез интравенозно инфузиране.

Съгласно настоящето изобретение, характерно за лекарствена форма на доцетаксел за приложение, е, че се приготвя като фармацевтично приемлив състав, съдържащ доцетаксел и фармацевтично приемлив носител, или разредител. Подходящите носители и разредители включват среди от не-токсични разтворители и суспензии, например, стерилна водна среда. За предпочитане, съставите са под формата на водни разтвори или суспензии, например, разтвори подходящи за инжектиране, или за Инфузиране, които могат да съдържат емулгиращи средства, оцветители, консерванти, или стабилизатори.

Фармацевтичните състави, подходящи за парентерално приложение включват стерилни водни, или не-водни разтвори, или суспензии. Подходящите не-водни разтвори и суспензии включват разтвори в природни растителни масла, такива като маслинено масло, сусамово масло, или нефт, или в инжектируеми органични естери, такива като етил олеат. Подходящите стерилни водни разтвори включват разтвори на доцетаксел във вода. Характерно, pH на стерилни водни разтвори, подходящи за парентерално приложение, се регулира по подходящ начин. Освен това, такива стерилни водни разтвори обикновенно се правят изотонични с достатъчно количество натриев хлорид, или глюкоза. Особено предпочитано е, разтвори, подходящи за приложение чрез инфузиране да имат pH подобно на това на кръвта, и се правят изотонични.

Стерилизирането може да се осъществи чрез нагряване, или чрез други начини, които не влияят неблагоприятно върху състава.

Фармацевтичните състави, съдържащи доцетаксел, подходящи за използуване съгласно настоящето изобретение, могат, също така, да съдържат повърхностно активно вещество. Предпочитани повърхностно активни вещества са полисорбати, полиоксиетилен гликолови естери, и естер-етери на полиетилен гликол и рицинови масла. Примери за подходящи повърхностно активни вещества и за фармацевтични състави, съдържащи повърхностно активни вещества, могат да се намерят в AU-A-666859.

Доцетаксел може също така да се приготвя като лекарствена форма за използуване съгласно настоящето изобретение, като лиофилизйран състав. Такива лиофилизирани състави имат добра физична и химична стабилност, и поради това могат да се съхраняват на склад в продължение на продължителни периоди от време. Лиофилизирани състави, съдържащи доцетаксел могат да се получат чрез лиофилизиране на воден разтвор на доцетаксел чрез стандартни техники. Те могат, освен това, да съдържат увеличаващи обема средства, такива като лактоза. Те могат, също така, да съдържат средства, редуциращи тоничността, такива като захари и полимери. Примери за подходящи средства, редуциращи тоничността, включват • глюкоза, декстроза и манитол и полимери, например, поливинилпиролидон.

Лиофилизпраният състав може да се разтвори отново, когато ще се използува, в която и да е съвместима, и фармацевтично приемлива инжекционна среда. Лиофилизатът може много благоприятно да се разтвори в двойно дестилирана вода за инжекции, в обем, еквивалентен на началния обем на разтвора, който е лиофилизиран.

Фармацевтичен състав, съдържащ доцетаксел, подходящ за използуване съгласно настоящето изобретение, характерно ф съдържа най-малко 0,01 % тегловно терапевтично активен продукт. Обикновенно, фармацевтичният състав съдържа от 0,01 до 1000 mg, за предпочитане от 0,1 до 500 mg, терапевтично активен продукт.

За предпочитане, разтвор, подходящ за интравенозно инжектиране съдържа от 38 до 42, по-предпочитано приблизително 40 mg/ml активен продукт. Характерно, такива разтвори се предоставят в ампули, съдържащи 20 mg, или 80 mg терапевтично активен продукт.

За предпочитане, разтвор, подходящ за инфузиране съдържа от 0,1 до 11, за предпочитане от 0,1 до 10, по-предпочитано от 0,3 до 0,9 mg/ml активен продукт.

Терапевтичното третиране с доцетаксел съгласно настоящето изобретение може да се осъществи конкурентно с други терапевтични третирания, включващи лечение с други антинеопластични лекарствени средства, моноклонални антибиотици, имунотерапия, или лъчева терапия, или средства, модифициращи биологичния отговор. Подходящите средства, променящи био-логичния отговор включват лимфокини и цитокини, такива като интерлевкини, ентерферони (α, β, или δ) и TNF. Други химио-терапевтични средства, които се използуват при лечение на заболявания, дължащи се на ненормалното пролифериране на клетката, включват алкилиращи средства, например, nitrogen mustards, такива като мехлоретамин, циклофосфамид, мелфалан и хлорамбуцил, алкил сулфонати, такива като бусулфан, нитрозауреаз, такива като кармустин, ломустин, семустин и стрептозоцин, триазени, такива като дакарбазин, антиметаболити, такива като аналози на фолиева киселина, например, метотрексат, пиримидинови аналози, такива като флуорурацил и цитарабин, пуринови аналози, такива като меркаптопурин и тиогуанин, природни продукти, например, vinca алкалоиди, такива като винбластин, винкристин, и виндезин, епиподофилотоксини, такива като етопозид и тенипозид, антибиотици, такива като дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, блеомицин, пликамицин и митомицин, ензими, такива като L-аспарагиназа, различни средства, такива като координационни комплекси на платина, например, циспл£7йна, замес-тени карбамиди, такива като хидроксикарбамид, метилхидразинови производни, такива

като прокарбазин, адренокортикал супресанти, такива като митотан и аминоглутетимид, хормони и антагонисти, такива като адренокортикостероиди, такива като преднизон, прогестини, такива като хидроксипрогестерон капроат, метоксипрогестерон ацетат и мегестрол ацетат, естрогени, такива като диетилстилбоестрол и етинил-естрадиол, антиестрогени, такива като тамоксифен, и андроге-ни, такива като тестостерон пропионат и флуоксиместерон.

Конкурентно лечение с циклофосфамид, 5-флуорурацил, атопозид, винорелбин, или метотрексат се предпочита, като може да се осъществи синергизъм между тези съединения и доцетаксел. Освен това, 2-метоксиестрадиол е активно средство срещу хепатоцелуларни карциноми, и се установи, че се понася добре след 1 месец ежедневно лечение при мишки (Klauber et al., Cancer Research, 57, 81-86,1997).

Конкурентно лечение c 2-метоксиестрадиол поради това е също така предпочитано, по-специално, когато се изисква хронично лечение.

Съгласно настоящето изобретение, доцетаксел се прилага при единична форма за еднократно дозиране, която позволява лечението на хепатоцелуларен карцином. Единичната форма за еднократно дозиране варира, в зависимост от начина на приложение, и от физическите характеристики на пациента. Подходящите единични форми за еднократно дозиране включват тези, които са терапевтично ефективни за лечението на заболявания, дължащи се на ненормалното пролифериране на клетките. Доцетаксел може да се прилага толкова често, колкото е необходимо, за да се получи желания терапевтичен ефект.

вии»м им

Характерната доза доцетаксел за лечение на човек е от 50 до 150, за предпочитане 60 до 100, по-предпочитано приблизително 100 mg доцетаксел/m² от повърхността на кожата на пациента. Когато доцетаксел се прилага чрез инфузиране, скоростта на инфузиране е характерно от 1 до 200, за предпочитане приблизително 100 mg/m² доцетаксел на час.

Горната доза може да се повтори, ако е необходимо. Характерно, тя се повтаря през дни, или през седмици. За предпочитане, тя се повтаря на всеки 3 седмици. Например, доцетаксел може да се прилага в доза от приблизително 100 mg/m² като интравенозно инфузиране в продължение на 1 час на всеки 3 седмици.

Следващите примери илюстрират изобретението.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Материали и методи

С изключение на случаите, когато се посочва друго, използуваните методи са стандартни биохимични техники. Всичките използувани клетъчни линии са достъпни чрез търговската мрежа.

Клетъчна култура

Подробно изложените експерименти по-долу обхващат човешки хепатома клетъчни линии НерЗВ (АТСС означение НВ 8064), HepG2 (АТСС означение НВ 8065), и НА22Т/ VGH, и миша хепатома клетъчна линия Нера 1-6. Тези клетки се култивират в DMEM (GIBCO, BRL), съдържаща 10 % серум от говежди зародиш (Hyclone), 0,01 mg/ml гентамицин и 0,1 mM не-есенциална амино киселина. Клетките прорастват в СО₂ инкубатор при 37°С, с 5 % СО₂ и 95 % филтриран въздух.

Третиране с лекарствени средства

В подробно изложените експерименти по-долу, на горните хепатома клетки се действува с различни концентрации на паклитаксел (0,001 - 10 μΜ) и доцетаксел (0,001 - 10 μΜ) в продължение на 24 часа и на 72 часа. Паклитаксел се разтваря в диметилсулфоксид (DMSO), а доцетаксел се разтваря в етанол като разтвори за съхранение на склад. Крайната концентрация на вехикулума е по-ниска от 0,1 %.

Изследване жизнеспособността на клетките: МТТ изследване

Клетките се култивират в 96 ямков грозд от клетъчна култура (COSTAR) при плътност 4 х 10⁴ клетки/ml. След третиране с лекарствено средство в продължение на 24 часа, или на 72 часа, средата се отстранява и се замества с равен обем (100 μΙ) пресно приготвена среда, съдържаща МТТ (0,456 mg/ml; 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразол бромид) и се инкубира в продължение на 1,5 час при 37°С. След това пресно приготвената среда се отстранява, и се прибавят 100 μΙ DMSO. Жизнеспособността на клетките се определя чрез колориметрично сравнение с отчитане OD стойности от устройство за отчитане на микроблюда (SPECTRA МАХ 250) при абсорбционна дължина на малната 570 nm.

Резултатите са показани на фигура 1, където запълнените кръгове представляват данни след третиране в продължение на 24 часа, а свободните кръгове представляват данни след третиране в продължение на 72 часа. Данните са средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност от двойните проби на три независими експерименти.

Изследване за изключване на пропидиев йодид (PI)

Клетките растат на 5-ст² флакони (CPRNING) и им се действува с паклитаксел и доцетаксел, както е описано по-горе. След това се прибавя пропидиев йодид (10 pg/ml) в продължение на 15 минути инкубиране при 37°С. След това средата се прибира преди събирането на полепналите клетки. И суспендираните, и прикрепените клетки се събират, и се суспендират отново с 500 μΙ PBS за струен цитометричен анализ, както е описано по-долу. Разложени сигнали се отстраняват чрез FSC-SSC събиране.

Струен цитометричен анализ за ДНК съдържание

Лизиращ буфер (0,5 % Triton Х-100, 0,2 pg/ml

Na₂EDTA.2H₂O, и 1 % говежди серуен албумин в PBS) се прибавя към клетъчните топчета, които след това се поставят в лед за 15 минути. След това към сместа се прибавя 100 % метанол предварително охладен до -20°С, която след това се центрофугира при 300 хд в продължение на 5 минути. Супернатантата се отстранява и клетъчните топчици се промиват с PBS. Промитите топчици се оцветяват с разтвор за оцветяване на ДНК (50 pg/ml пропидиев йодид и 5 kunitz/ml RNa3a А) в продължение на 30 минути при 4°С на тъмно. ДНК съдържанието на всяка клетка се измерва, използувайки Becton Dickinson FACSCalibur flow cytometer (струен цитометър), както е посочено по-долу.

Струен цитометричен анализ

Клетки (10000) се анализират с Becton Dickinson FACSCalibur flow cytometer (струен цитометър), използувайки аргон-йон лазер (15 mWatt), с енергия на бомбардиращия лъч 488 nm. За PI изключващо изследване, червена флуоресценция се събира посредством 585 nm филтър, и остатъци от клетъчни сигнали се отстраняват чрез FSC-SSC пропускане. Натрупват се данни и се анализират, използувайки FACS/CELLQuest софтуер на Power Macintosh 7600/120 компютър. Апоптозни (apoptotic) клетки и клетки в специфични фази на цикъла се определят чрез Mod Fit LT софтуер.

Резултатите от струйния цитометричен анализ са показани на таблици 1 и 2, и на фигура 2. Таблица 1 дава фигури за пермеабилитет на клетъчна мембрана на хепатома клетки, след третиране с паклитаксел и доцетаксел. Таблица 2 дава подробно проценти на апоптозни (apoptotic) (sub-G0/G1) клетки, открити след третиране с паклитаксел и доцетаксел. Фигура 2 показва ДНК хистограмен анализ, даващ подробно ефекта от паклитаксел и доцетаксел върху прогресирането на клетъчен цикъл.

Таблица 1

Пермеабилитет на клетъчна мембрана на хепатома клетки след лечение с паклитаксел и доцетаксел

	Паклитаксел (μΜ)	Доцетаксел (μΜ)
0,01	0,1	1	0,01	0,1	1
Hep G2 24 час 72 час	93,63±1,1 56,58±28,7	85,71±6,8 43,79+11,7	66,71 ±7,2 13,27±4,3	94,86±1,3 61,06±9,6	85,49±1,2 40,03±9,0	81,24+3,2 27,42±8,8
Hep ЗВ 24 час 72 час	77,35±11,7 57,00±7,9	63,50±4,0 8,09±0,3	52,28±4,1 1,90±0,3	93,80±10,7 36,81±14,7	57,41+6,8 36,25±13,5	57,39+4,3 20,25±14,4
НА22Т/ VGH 24 час 72 час	94,08±18,6 92,58±21,3	40,03±7,8 93,38±32,5	34,24±8,3 49,32±8,3	98,66±9,0 55,44±5,6	38,71±11,2 21,24±0,4	40,79±5,0 22,03±3,1
Нера 1-6 24 час 72 час	93,17±3,8 62,95±5,6	67,20±4,4 27,79±1,3	62,65±7,6 15,51±1,0	94,45±1,9 77,18±1,4	83,35±7,2 43,94±3,4	81,88±8,7 38,90±4,2

Данните са средни ± стандартна грешка на средно от двойни проби на най-малко три независими експеримента. На клетките се действува с лекарствени средства в продължение на 24 - 72 часа, и пермеабилитета на мембраната се измерва чрез струен цитометричен анализ с изключване на пропидий в жизнеспособни хепатома клетки. Данните са процент клетки с цялостна клетъчна мембрана, сравнени с контролата.

i

Таблица 2

Апоптоза индуцирана от паклитаксел и доцетаксел

	Паклитаксел (тМ)	Доцетаксел (тМ)
0,01	0,1	1	0,01	0,1	1
Hep G2 24 час 72 час				45,24 42,45	38,77 42,44	28,33 56,66
Hep ЗВ 24 час 72 час		38,37	47,01	59,14 64,12	58,67 81,66	65,74 79,33
НА22Т/ VGH 24 час 72 час		0	0	41,75 56,64	18,61 58,61	22,94 60,98
Нера 1-6 24 час 72 час	24,02	55,64 N/A	64,38 N/A	32,81 31,25	50,76 53,95	53,80 62,49

Фигурите са % на апоптозни (sub-G0/G1) клетки, съгласно определянето чрез струен цитометричен анализ.

Анализ чрез електрофорезе на ДНК фрагментиране

Определянето на ДНК фрагментиране е съгласно метода на herrman et al, Nucleic Acids Res., 22, 5506-5507,1994.

Накратко, на клетки HEP G2 (2 x 10⁷) се действува в продължение на 72 часа с паклитаксел и доцетаксел, както е описано по-горе, и се центрофугират. Така получените клетъчни топчета се суспендират повторно в NP-40 лизиращ буфер (1 % NP-40 в 20 mM EDTA, 50 тМ Tris-HCI, pH 7,5). След лизиране на клетките в продължение на някалко секунди, супернатантите се събират (5 минути на 1600 х д). Екстрахирането се повтаря със същия лизиращ буфер. Към супернатантите се прибавят SDS (крайна концентрация 1 %) и RNa3a (крайна концентрация 2,5 pg/μΙ), и се инкубират в продължение на 2 часа при 56°С, последвано от усвояване с протеиназа К (2,5 pg/μΙ) в продължение на 2 часа при 37°С. След това смесите се прибавят към 10 М амониев ацетат преди утаяване със ф

100 % етанол в продължение на 30 минути при -20°С . ДНК се събира чрез центрофугиране (10 минути при 1200 х д), последвано от електрофореза на 1,5 % агарозен гел.

Резултатите са показани на фигура 3. На фигура 3, М е 100 базисна двойка маркер. Lane 1 показва средна контрола. Lanes 2 и 3 показват средно третирани с паклитаксел (0,1 и 1 μΜ) групи. Lanes 4 и 5 показват средно третирани с доцетаксел (0,1 и 1 μΜ) групи.

Ф Резултати

Изследване жизнеспособността на клетките

Фигура 1 показва зависещият от дозата ефект на паклитаксел и доцетаксел върху жизнеспособността на клетките при хепатома клетъчни линии (Hep G2, Hep ЗВ, НА22Т/ VGH и Нера 1-6). Както се вижда на фигура 1, доцетаксел упражнява понижаване на жизнеспособността при 0,01 и 0,1 μΜ почти във всички случаи.

При Hep G2 клетки, клетъчната жизнеспособност показва тенденция на понижение след третиране с паклитаксел, или доцетаксел. Жизнеспособността на Hep G2 клетки е 61,81 % и 39,45 % спрямо контролата за групи с пакпитаксел (10 μΜ) на 24 и 72 час, съответно. За третирани с доцетаксел Hep G2 клетки, максимално редуциране на жизнеспособността се наблюдава при 1 μΜ доцетаксел, не се установява по-нататъшно понижаване на жизнеспособността при 10 μΜ доцетаксел. За третирани с 1 μΜ доцетаксел клетки жизнеспособността е 65,03 % и 48,99 % на 24 и 72 час, съответно.

За Hep ЗВ клетки, трябва да се отбележи, че значително редуциране на жизнеспособността (37,06 %) се наблюдава след третиране с 0,01 μΜ доцетаксел в продължение на 72 часа.

При третирани с доцетаксел Нера 1-6 клетки, максималната цитотоксичност (65,34 % и 30,71 %) се установява при групи третирани с 1 μΜ доцетаксел на 24 и 72 час, съответно.

Анализ за изключване на пропидиев йодид (ΡΙ)

Таблица 1 показва, че мембранният пермеабилитет на Hep G2 клетки и Нер ЗВ клетки след третиране с пакпитаксел и доцетаксел е зависим от дозата и от времето.

За HA22TA/GH клетки, по-малко повишаване на мембранния пермеабилитет се наблюдава след третиране с пакпитаксел (0,01 - 1 μΜ) в продължение на 72 часа, в сравнение с това на групите с доцетаксел. Трябва да се отбележи, че само 55,44 % от клетките имат цялостни мембрани след третиране с 0,01 μΜ доцетаксел в продължение на 72 часа, докато, след същата доза паклитаксел, 92,58 % от третираните клетки имат имат цялостни мембрани.

tWoMfei

Анализ на клетъчен цикъл

Фигура 2 показва, че при Hep G2 клетки, третирани с 1 μΜ паклитаксел в продължение на 24 часа се достига до явно задържане на G2/M фазата. Подобни ДНК хистограми се наблюдават на 72 час след третирането.

Както е показано на таблица 2, апоптозни клетки (sub-G0/G1) се откриват след третиране с 0,001 μΜ, 0,01 μΜ, 0,1 μΜ и 1 μΜ доцетаксел в продължение на 24 часа с апоптозни проценти 31,02 %, 45,24 %, 38,77 % и 28,33 %, съответно. На 72 час след третиране с доцетаксел (0,001 - 1 μΜ), апоптозните

V проценти са 21,92 %, 42,45 %, 42,44 % и 56,66 %, съответно.

При Hep ЗВ клетки, третиране с 0,1 μΜ, или 1 μΜ паклитаксел в продължение на 24 часа води до задържане при G2/M и инкубиране с 0,1 μΜ, или 1 μΜ паклитаксел в продължение на 72 часа води до повишаване на sub-G0/G1 процентите до 38,37 %, или 47,01 %, съответно. Противно на това, третирани с 0,1 μΜ, 0,1 μΜ, или 1 μΜ доцетаксел Hep ЗВ клетки в продължение на 24 часа, или на 72 часа, дават достигане на високи нива на sub-G0/G1 популации с 59,14 %, 58,69 % и 65,74 % за 24 ® часа, и 64,12 %, 81,66 % и 79,33 % за 72 часа.

При HA22T/VGH клетки, повишаването на концентрациите на паклитаксел (0,001 μΜ до 0,1 μΜ) е във функционална зависимост с повишениото процентно съдържание на G2/M клетки на 24 час. Не се наблюдава значителна sub-G0/G1 популация в групите, третирани с 0,1 μΜ, или 1 μΜ паклитаксел на 72 час. Противно на това, знаменателно е, че третирани с 0,01 μΜ доцетаксел клетки HA22T/VGH на 24 час имат по-високо sub-G0/G1 процентно съдържание (41,75 %), отколкото 0,1 μΜ (18,61 %), или 1 μΜ (22,94 %) групите с доцетаксел.

Когато на клетките се действува с доцетаксел в продължение на 72 часа, значителни sub-G0/G1 процентни съдържания се откриват в HA22T/VGH клетки, третирани с доцетаксел 0,01 μΜ (56,64 %), 0,1 μΜ (58,61 %) и 1 μΜ (60,98 %).

За Нера 1-6 клетки, третиране с паклитаксел (0,01, 0,1, или 1 μΜ) в продължение на 24 часа води до повишаване на формирането на sub-G0/G1 популации (24,02 %, 55,64 %, или 64,38 %, съответно), и се наблюдава задържане на G2/M фазата в групите, третирани с 0,1 μΜ и 1 μΜ паклитаксел. Когато на Нера 1-6 клетки се действува с 0,1 μΜ и 1 μΜ паклитаксел в продължение на 72 часа, по-голямата част от клетките умират, и няма явен профил на клетъчния цикъл. Третирането на Нера 1-6 клетки с доцетаксел (0,01 μΜ, 0,1 μΜ и 1 μΜ) води до формиране на sub-G0/G1 клетки (52,8 %, 50,76 % и 53,8 % на 24 час, и 31,25 %, 53,95 % и 62,49 % на 72 час, съответно).

Анализ на ДНК фрагментиране

Фигура 3 показва, че третиране с паклитаксел (0,1 μΜ и 1 μΜ) и доцетаксел (0,1 μΜ и 1 μΜ) индуцират ДНК фрагментиране в Hep G2 клетки.

Claims

Патентни претенции

1. Състав за използване при лечението на хепатоцелуларен карцином включващ, като активен компонент, доцетаксел или негов хидрат.
2. Състав съгласно претенция 1, където β хидратът е трихидрат.
3. Състав съгласно претенция 1 или 2, който е за парентерално прилагане.
4. Състав съгласно претенция 3, който е подходящ за интраперитоенеално, подкожно, интравенозно или интрастернално приложение и съдържа от 38 до 42 mg/ml активно съединение.
5. Състав съгласно претенция 3, който е подходящ за прилагане чрез инфузия и съдържа от 0.1 до 11 mg/ml активно съединение.