TW589180B - New use of docetaxel for treating hepatoma - Google Patents

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589180 A7 _____ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（1) 本發明係關於肝細胞癌之治療。 肝細胞癌（HCC)爲在東南亞與非洲國家中最常見癌症之一 。在台灣’ HCC爲男性癌症病患之主要死亡原因。HCC病 患之存活率極低。這主要是由於缺乏有效治療。照射與化 學療法目前爲止尚未說實是令人滿意的；手術是HCC之最 有效治療。但是，手術只適合具有小的可切除腫瘤之病患。 最近，抗有絲分裂藥物，譬如巴克利塔索，已受到再度 關切。巴克利塔索最初係單離自紫杉樹之樹皮。自1971年 起已知曉巴克利塔索之抗腫瘤作用。巴克利塔索係藉其對 於微官組裝之作用’抑制腫瘤細胞分裂。使用腫瘤細胞之 活體外分析，已發現巴克利塔索遏制細胞主要是在細胞週 期之 G2/M 階段（Schiff PB 與 Horwitz SB，Proc. Natl· Acad. Sci 77, 1561- 1565, 1980)。最近研究已証實巴克利塔索可有效抵抗各種惡 性腫瘤細胞，譬如腦部腫瘤、胃與前列腺癌、乳癌、黑色 素瘤及卵巢癌。 仏疋，巴克利塔索並未有效地抵抗肝細胞癌。巴克利塔 索對於HCC病患之第π期臨床試驗，係報告於英國癌症期 刊，78(1)，34-39, 1998中。該論文推斷巴克利塔索在Η(χ病患 中沒有顯著抗癌作用。 正如上文所解釋者，已發現巴克利塔索之細胞毒作用， 係爲細胞週期依存性，其中細胞週期遏制主要是發生在 G2/M階段。但是，目前已發現多希塔索可在HCC細胞中達 成非細胞週期依存之細胞毒性。這表示多希塔索對於HCC 細胞之細胞毒作用，係藉由與巴克利塔索不同之機制達成 -4- (請先閱讀背面之注意 •項HI寫 本頁) 裝 ·

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 589180 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（3 ) 由將如此獲得之溶液添加至水中，使多希塔索水合物再結 晶而製成。多希塔索水合物典型上爲二水合物、三水合物 或四水合物。特定言之，已發現三水合物特別安定，因此 夕希i合索三水合物係爲較佳的。多希塔索三水合物可藉由 詳述於EP-A-770070中之方法製成。 夕希％索係令人意外地具有抵抗肝細胞癌之活性。特定 吕 其可用以治療肝臟細胞癌、纖維層變種及混合之肝 細胞膽管癌。 於本發明中，多希塔索可藉$知用於多希塔索投藥之任 何習用途徑進行投藥。因此，其可以例如非經腸方式投藥 典型上，其係以靜脈内方式投藥，較佳係藉靜脈内灌注。 方；本發明中’多希塔索典型上係經調配成含有多希塔索 及藥學上可接受載劑或稀釋劑之藥學上可接受之組合物， 以供投藥。適當載劑與稀釋劑包括無毒性溶劑與懸浮媒質 ’例如無菌水性媒質。此等組合物較佳係採用水溶液或懸 浮f形式，例如適合注射或灌注之溶液，其可含有乳化劑 、著色劑、防腐劑或安定劑。 適合非經腸投藥之醫藥組合物，包括無菌水性或非水性 溶液或懸浮液。適當無菌非水性溶液與懸浮液，包括在夭 然植物油中之溶液與懸浮液，譬如橄梗油、芝麻油或液體 石％油，或在可注射有機酉旨類中，譬如油酸乙酷。適當無 菌水：液包括多希塔索在水中之溶液。典型上，適合非經 腸投藥之無菌水溶液之pH値，係經適當地調整。再者，通 常係使此種無菌水溶液成爲等張性 守浓Κ例如使用足量氣化鈉 ---：---r--------裝--- (請先閱讀背面之注意事項HI寫本頁) . -丨線·

A7 B7 五、 發明說明（4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 或葡萄糖。適合藉灌注投藥之溶液，特佳係具有類似血液 <pH値，且被製成等張性。 、滅菌可藉由加熱’或藉任何其他不會不利地影嚮組合物 之方式進行。 適用於本發明之含有多希塔索之醫藥組合物，可進—步 包含界面活性劑。較佳界面活性劑爲聚花楸酸酯，聚氧乙 二醇醋類，及聚乙二醇之醋-醚類，以及萬麻油類。適當 界面活性劑，及含有界面活性劑之醫藥组合物，其實例可 參閲 AU-A-666859。 多希塔索亦可經調配成凍乾組合物，以供使用於本發明 中。此種凍乾组合物具有良好物理與化學安定性，因此可 長時期儲：。含有多希塔索之;東乾組合物，可藉標準技術 使户希丨合索之水落液凍乾而製成。其可進—步包含膨鬆 化劑，譬如乳糖。*亦可包含張力調整劑，譬如糖：聚： 體。適當張力調整劑之實例，包括葡萄糖、右旋糖及甘露 西于，以及聚合體，例如聚乙烯基四氫吡咯酮。 凍乾組合物可於使用時，再溶解於任何可相容且藥學上 可接受之可注射媒質中。凍乾物可有利地溶於注射級再蒸 餾水中，其體積相當於被凍乾溶液之最初體積。 適用於本發明之含有多希塔索之醫藥組合物，典型上含 有土少0.01重量。/。具治療活性之產物。一般而言，醫藥组 合物係含有0·01至1000毫克，較佳爲〇丨至5〇〇毫克具治療活 性t產物。 適於靜脈内注射之溶液，較佳係含有38至42，更佳爲約 ---:------------^ —— (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) . -丨線. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 五、發明說明（5 ) (請先閱讀背面之注意事項ml寫本頁) :¾克/¾升之活性產物。典型上，此種溶液係提供在本 百2〇耄克或80毫克活性產物之小玻瓶中。 口 通於准 >王之溶液，較佳係含有…至丨丨，較佳爲〇1至仞， 更佳爲0.3至〇·9毫克/毫升之活性產物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 根據本發明具有多希塔索之治療處理劑，可與其他治療 處里同時進行，包括具有其他抗腫瘤藥物、單株抗體、 免疫療法或射線療法或生物回應改變劑之處理劑。適當生 物回應改芰劑’包括淋巴細胞活素與細胞活素，譬如間白 =球活素，干擾素（α、卢或d)一及_。可用於治療由於異 ^、、’田胞増殖所致病症之其他化學治療劑，包括烷基化劑， 例如氮介末類，譬如氮齐、環磷醯胺、苯丙胺酸氮芥及苯 I氮y| ，㉘酸坑g旨類，譬如白血福恩（busui如1)，亞硝基 脲類，譬如亞硝基脲氮齐、環己亞硝脲、赛氮芥及鏈黴亞 硝基素，二氮烯類，譬如氮烯咪胺，抗代謝物，譬如葉酸 類似物，例如胺甲蝶呤，嘧啶類似物，譬如氟脲嘧啶與阿 糖胞苷’嘌呤類似物，譬如巯基嘌呤與硫基烏嘌呤，天然 產物，例如長春花植物鹼，譬如長春花鹼、長春新鹼及長 ί ί匕素，表鬼臼脂素，譬如衣托糖^㈣叩⑽此）與天尼^， ^生，f、’ 如達克丁霉素、道諾紅菌素、多克索紅菌素、 博采霉素、普利卡霉素及絲裂霉素，酵素，譬如L_天冬醯 胺酶各種作用劑’譬如銘之配位錯合物，例如順氣胺銷 ’經取代之脲類，譬如羥基脲，甲基肼衍生物，譬如甲基 $胖’同上腺皮質抑制劑，譬如米托坦㈣姐匀與胺基導 眠能（aminoglutethimide)，激素與拮抗劑，譬如腎上腺皮質類 ______________ _ 8 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) " A7 B7 五、發明說明（6 =例如潑尼松，黃體製劑，譬如己酸幾孕酮、醋酸甲 乳基孕酮及醋酸甲地料酮，雌激素，譬如二乙基己㈣ 二 =基雌二醇，抗雌激素，譬如他摩西吩(―㈣， 及雄竑素，譬如丙酸睪酮與氟羥甲睪酮。 與環嶙醯胺、5-氟尿❹、衣㈣答（et〇p〇side)、威諸賓

I (Γ )或胺甲蝶吟之共同治療，係爲較佳的，因可達成 寺化合物與多希塔索間之增效作用。再者，2_甲氧雌二 ㈣於抵抗肝細胞癌具有活性，1已發現在老鼠中每日治 療1個月後，係爲良好容許的职auber等人，癌症研究，57 81_ 86 =97)。因此’與2_甲氧雌二醇之共心療，亦爲較佳的 ’特別是當需要慢性治療時。 :本發明中，多希塔索係在允許治療肝細胞癌之劑量下 投藥一 U量會根據投藥途徑及病患之身體特徵而改變。 C田d里I括對於治療由於異常細胞增殖之病症，於治療 上有政（里。多希塔索可按爲獲得所要治療效果所需要之 次數進行投藥。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ，用於治療人類之多希塔索之典型劑量，爲5〇至15〇，較佳 馬60至100，更佳爲約獅毫克多希塔索/平方米之病患皮 膚表面積β當多希塔索藉灌注投藥時，灌注速率典型上爲 每J f 1至200 ’車父佳爲約1〇〇宅克/平方米之多希塔索。 上述劑量可按需要重複。典型上，其係以每日或每週方 式重=較佳爲每3週重複一次。例如，多希塔索可以靜 脈内准王’在約100毫克/平方米之劑量下投H ,每3週歷 經1小時。 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐 589180 A7 ___— —__B7____ 五、發明說明（7 ) 下述實例係説明本發明。 實例 物料與方t 除非另有指出，否則所使用之方法爲標準生物化學技術 。所使用之細胞系均爲市購可得。 細胞培養 下文詳述之實驗，係涉及人類肝細胞瘤細胞系Hep3B (ATCC 名稱 HB 8064)、HepG2 (ATCC 名稱册 8〇65)及 ，以及老鼠肝細胞瘤細胞系Hega 1_6。將此等細胞在含有1〇 %牛胎兒血清（Hyclone)、0.01毫克/毫升健大霉素&〇lmM 非必須胺基酸之DMEM(GIBCO，BRL)中培養。細胞係在(:^培 養器中，於37°C下，使用5% 0)2與95%過濾空氣進行生長。 藥物處理 在下文詳述之實驗中，係將上述肝細胞瘤細胞以不同濃 度之巴克利塔索（0.001-10 "M)及多希塔索（0.001-10 βΜ)處理24 小時及72小時。使巴克利塔索溶於二甲亞颯（DMS〇)中，並 使多希塔索溶於乙醇中，作爲儲備溶液。媒液之最後濃度 係低於0.1%。 細胞存活力研究：MTT檢測 使細胞在96井細胞培養簇（COSTAR)中，於4xl04細胞/毫 升之密度下培養。在藥物處理24小時或72小時後，將培養 基拋棄，並以含有MTT (0.456毫克/毫升；溴化3·[4,5-二曱基 4唑-2-基]-2,5-二苯基-四銼）之等體積（1〇〇微升）新培養基置 換，及在37°C下培養1.5小時。細胞存活力係藉由比色計比 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ——：---Γ--------裝—— (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) -i-rOJI .

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589180 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（8 ) 較法測定，其方式是在570毫微米吸收波長下，自微板讀 取器（SPECTRA MAX250)讀取 OD 値。 其結果係示於圖1中，其中實心圓圈表示處理後24小時 之數據，而空心圓圈表示處理後72小時之數據。數據爲得 自三次獨立實驗之重複試樣平均之平均値士標準誤差。 破化普羅匹定（Propidium Iodide) (PI)排阻檢測 使細胞在5-平方公分燒瓶（CORNING)上生長，並以如上文 詳述之巴克利塔索與多希塔索處理。然後，添加碘化普羅 匹定（10微克/毫升），於37°C T培養15分鐘。然後，在採 集黏連細胞之前，收集培養基。收集懸浮與黏連之細胞， 並以500微升PBS再懸浮，供如下文詳述之流動細胞計數法 分析使用。藉FSC-SSC選通，移除碎屑信號。 DNA含量之流動細胞計數分析 將溶解用緩衝劑（0.5 % Triton X-100、0.2微克/毫升 Na2EDTA.2H20及1%牛血清白蛋白，在PBS中）添力口至細胞丸 粒中，然後使其留在冰上15分鐘。接著將預先冷卻至-20°C 之100%甲醇，添加至該混合物中，然後在300克重力下離 心5分鐘。拋棄上層清液，並將細胞丸粒以PBS洗滌。經洗 滌之丸粒以DNA染色溶液（50微克/毫升碘化普羅匹定與 5 kunitz /毫升RNase A)在4°C下於黑暗中染色30分鐘。使用如 下文詳述之Becton Dickinson FACSCalibur流動細胞計數器，度 量各細胞之DNA含量。 流動細胞計數法 將細胞（10000)在Becton Dickinson FACSCalibur流動細胞計數器 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ---^---^--------裝--- (請先閱讀背面之注意事項H寫本頁) 一5J.

589180 A7 B7 五、發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 烊鵪 > 忝ij^Aw #1翁Jl衅茚~14粦^萍+ ^ e+^^l+詾爷溆咖。孝r替δΒ赛鉍隖24-72V— - it 雒伞锔13砷靼词 ~^烊今豸-和补^^ts-^rg·^^

Hep G2 24、Ji 72 Hep3B 24、h 岑 72、Ji HA22T/VGB 24 二> 罢 72、ji ttcpa 1-6 24、Ji 72 二 i 93.m3bo 62.95±5.6 67·20±4.4 27.79±1.3 s.65+7.6 slilb sbi.l 85.71+60066.71+7.2 56.58fc8.7 43.79±11.7 13.27i4.3 7735±11.7 63.50±4b52.28屮 4,1 57ο?7·9 8·09£2,3 113 9408IU 8.6 40o3±7.8OJ4,24&.3 92.58fel.3 9338±32.5 49U2&3 94.861+1.3 85.49+1.2 81.24±3.2 610619.6 厶oosb 27.42db800 93.8a±lp7 57.41±6.8 57.39:t4.3 36ccl±14.7 36.25Ϊ3.5 2P25H-14.4 98.66±9.0 38.7U11.2 40.79i5.0 55.44±5.6 2 L24i〇.4 22.03±3 J 94,45卜一.9 8335±7.2 8L88&/7 77.18±1.4 43·94±3·4 38‘90dh4,2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

0QJ 口^洤祆玲9M)P1 1 001 分却祆玲9M)P1 1 ---：---Γ----! 裝 i I (請先閱讀背面之注意事項 11^寫本頁) >1 訂.

589180 A7 B7 五、發明說明（12) DNA碎裂電泳分析 ---：---：--------* 裝--- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) DNA碎表汗估係根據Herrmaim等人核酸研究，22, 5506-5507, 1994之方法。 簡a之’係將HEP G2細胞（2xl07)以上文詳述之巴克利塔 索與多希塔索處理72小時，並離心。將如此獲得之細胞丸 粒以 NP-40 溶胞緩衝劑（1〇/〇NP_40 在 2〇mMEDTA 中，5〇mMTris_ HC1 ’ pH 7.5)再懸浮。在細胞溶解數秒後，收集（5分鐘，在 1600克重力下）上層清液。以相同溶胞緩衝劑重複此萃取。 將SDS (最後濃度爲1% )與RNasej泰加（最後濃度爲2.5微克/ 微升）至上層清液中，並於56°C下培養2小時，接著以蛋白 酶K (2.5微克/微升）在37°C下煮解2小時。然後，在loo%乙 醇沉殿之前’將混合物添加至1〇 Μ醋酸铵中，於_2〇°C下歷 經30分鐘。藉離心（1〇分鐘，在12000克重力下）收集dna， 接著在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。

其結果示於圖3中。在圖3中，Μ爲1〇〇鹼基對標記物。 直行1顯示培養基對照組。直行2與3顯示平均巴克利塔索 (0.1與1 " Μ)處理組。直行4與5顯示平均多希塔索（〇」與j ⑽ 處理組。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 結果 細胞存活力研究 圖1顯示巴克利塔索與多希塔索在肝細胞瘤細胞系 (Hep G2, Hep 3Β，HA 22T/VGH 及 Hepa 1-6)中，對於細胞存活力之 劑量依存作用。正如圖1所顯見者，多希塔索係在0 〇1與 0·1 下，於幾乎每一情況中達成降低之存活力。 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 589180 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ____B7___ 五、發明說明（13) 於Hep G2細胞中，在以巴克利塔索或多希塔索處理後， 細胞存活力顯示降低之趨勢。Hep G2細胞之存活力，對巴 克利塔索（10 " M)組而言，在24與72小時下個別爲對照組之 61.81%與39.45%。對多希塔索處理之Hep G2細胞而言，存活 力之最大降低係在1 多希塔索下發現，在10 多希塔 索下發現存活力無進一步降低。對1 " Μ多希塔索處理之細 胞而言，在24與72小時下，存活力個別爲65.03%與48.99%。 在Hep 3Β細胞中，値得注意的是存活力之顯著降低（37 06 % )，係在0.01 多希塔索處理_72小時後發現。 在多希塔索處理之Hepa 1-6細胞中，最大細胞毒性（65.34% 與30.71 % )係在1 " Μ多希塔索處理組中，個別於24與72小 時下發現。 碘化普羅匹定（ΡΙ)排阻檢測 表1顯示在以巴克利塔索與多希塔索處理後，Hep G2細胞 與Hep 3B細胞之薄膜滲透性，係爲劑量與時間依存性。 對HA 22T/VGH細胞而言，當與多希塔索組比較時，在薄 膜滲透性上之較少增加，係於巴克利塔索（〇 〇μι "岣處理 72小時後發現。値仔注思的是，在〇 # μ多希塔索處理72 小時後，只有55.44%細胞具有完整薄膜，然而在相同劑量 之巴克利塔索之後，92.58%經處理之細胞具有完整薄膜。 細胞週期分析 圖2顯示1 " Μ巴克利塔索處理之Hep G2細胞，歷經％小 時，造成顯著之G2/M階段遏制。類似DNA頻率分佈圖表係 在曝露後72小時發現。 _____^16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4 X 297公------ i-TIIT--------裝—— (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂： 589180 A7 B7______ 五、發明說明（15) 索處理組中發現。當Hepa 1-6細胞以0·1 "Μ與1 "M巴克利塔 索處理72小時之時，大部份細胞均死亡，且無顯著細胞週 期形態。Hepa 1-6細胞之多希塔索處理01 "μ、0.1 "Μ及1 "M)會造成亞G0/G1細胞形成（個別在24小時下爲52.81 %、 50.76。/。及 53.8%，而在 72 小時下爲 31.25%、53.95% 及 62.49% )。 DNA碎裂分析 圖3顯示巴克利塔索（0.1與！ "M)與多希塔索⑼丨與！"峋處 理，會在Hep G2細胞中引致DNA碎裂。 ---：---；---------裝· f I (請先閱讀背面之注意事項mlic寫本頁) 舌丁 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制私 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱）

Claims (1)

1. 589180 木 第088115041號申請案 中文申請專利範圍替換本(93毛4月) 六、申請專利範圍 1. 一種用於治療肝細胞癌之醫藥組合物，其包含多希塔索 或其水合物作為活性成份。 2. 根據申請專利範圍第1項之醫藥组合物，其中水合物為 三水合物。 3. 根據申請專利範圍第1或2項之醫藥組合物，其係供非 經腸投藥用。 4. 根據申請專利範圍第3項之醫藥組合物，其適於腹膜 内、皮下、靜脈内、肌内或胸骨内投藥，並含有38至42 毫克/毫升之活性化合物。 5·根據申請專利範圍第3項之醫藥組合物，其適於藉灌注 投藥，並含有0.1至11毫克/毫升之活性化合物。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）