SK286378B6 - Použitie kompozície, ktorej účinnou zložkou je docetaxel alebo jeho hydrát, na prípravu liečiva na použitie na liečenie hepatocelulárneho karcinómu - Google Patents

Abstract

Opísané je použitie kompozície, ktorej účinnou zložkou je docetaxel alebo jeho hydrát, na prípravu liečiva na liečenie hepatocelulárneho karcinómu.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka liečenia hepatocelulámeho karcinómu.

Doterajší stav techniky

Hepatocelulámy karcinóm (HCC) je v juhovýchodnej Ázii a v afrických krajinách jedna z najobvyklejších rakovín. V Taiwane je hepatocelulámy karcinóm hlavnou príčinou úmrtia u mužských pacientov trpiacich rakovinou. Miera prežitia pacientov s hepatocelulárnym karcinómom je veľmi nízka. Je to spôsobené predovšetkým nedostatkom účinnej liečby. Pri ožarovaní a chemoterapii sa až doteraz nepreukázalo, že sú uspokojivé; najúčinnejšou liečbou pre hepatocelulámy karcinóm je liečba chirurgická. Chirurgická liečba je však vhodná len pre pacientov s malým resekovateľných nádorom.

Nedávno sa obnovil záujem o antimitotické liečivá, ako je paclitaxel. Paclitaxel sa pôvodne izoloval z kôry tisu. Protinádorový účinok paclitaxelu je známy od roku 1971. Paclitaxel inhibuje delenie nádorových buniek pomocou svojho pôsobenia na mikrotubulámy aparát. Analýzy in vitro s použitím nádorových buniek ukázali, že paclitaxel zastavuje bunky hlavne v G2/M fáze bunkového cyklu (Schiff PB a Horwitz SB, Proc. Natl. Acad. Sci 77, 1561-1565, 1980). Nedávne štúdie ukázali, že paclitaxel je účinný proti rozličným zhubným nádorovým bunkám, ako sú bunky mozgových nádorov, rakoviny žalúdka a prostaty, rakoviny prsníkov, melanómu a rakoviny vaječníkov.

Ale paclitaxel nie je účinný proti hepatocelulámemu karcinómu. V British Joumal of Cancer, 78 (1), 3439, 1998 je opísaná fáza II klinickej štúdie paclitaxelu na pacientoch s hepatocelulárnym karcinómom. Záverom tohto článku je, že paclitaxel nemá viditeľné protinádorové účinky u pacientov s hepatocelulárnym karcinómom.

Ako bolo už vysvetlené, zistilo sa, že cytotoxický účinok paclitaxelu je závislý od bunkového cyklu, a že k zastaveniu bunkového cyklu dochádza hlavne v G2/M fáze. Teraz sa však zistilo, že pri docetaxeli je možné dosiahnuť cytotoxicitu pri bunkách hepatocelulámeho karcinómu nezávisle od bunkového cyklu. Naznačuje to, že cytotoxický účinok docetaxelu na bunky hepatocelulámeho karcinómu sa dosiahne pomocou iného mechanizmu ako pri paclitaxele. In vitro účinnosť docetaxelu na bunky hepatocelulámeho karcinómu je ďalej viditeľne vyššia ako účinnosť paclitaxelu v koncentráciách až do 1 pmol. Vzhľadom na vysokú cytotoxickú povahu taxoidov ukazuje zvýšená účinnosť pri nízkej koncentrácii, že docetaxel, na rozdiel od paclitaxelu, je možné použiť v praxi na klinické liečenie hepatocelulámeho karcinómu.

Podstata vynálezu

Predložený vynález pojednáva preto o použití docetaxolu alebo jeho hydrátu, na prípravu liečiva na použitie na liečenie hepatocelulámeho karcinómu.

Predložený vynález sa ďalej týka tiež spôsobu liečenia pacienta trpiaceho hepatocelulárnym karcinómom, ktorý zahŕňa podávanie účinného množstva docetaxelu alebo jeho hydrátu, uvedenému pacientovi. Predložený vynález tiež pojednáva o spôsobe zlepšovania stavu pacienta trpiaceho hepatocelulárnym karcinómom, ktorý zahŕňa podávame účinného množstva docetaxelu alebo jeho hydrátu, uvedenému pacientovi.

Docetaxel je známa zlúčenina. Jej vzorec je nasledovný:

Vo vzorci í-Bu znamená ŕerc-butyl,

Bz znamená benzoyl,

Ac znamená acetyl.

Spôsoby prípravy docetaxelu sú opísané v EP-A-253738 a EP-A-336841.

Docetaxel je možné použiť napríklad v bezvodej forme alebo ako hydrát. V rámci tohto vynálezu zmienka o docetaxele zahŕňa tiež jeho hydráty.

Hydráty docetaxelu je možné pripraviť rozpustením bezvodého docetaxelu v organickom rozpúšťadle, ako je acetón, etanol, acetonitril alebo Ν,Ν-dimetylformamid, a rekryštalizáciou hydrátu docetaxelu pridaním takto získaného roztoku k vode. Hydrátom docetaxelu je typicky dihydrát, trihydrát alebo tetrahydrát. Najmä o trihydráte sa zistilo, že je zvlášť stabilný, a preto je trihydrát docetaxelu výhodný. Trihydrát docetaxelu je možné pripraviť pomocou postupov opísaných v EP-A-770070.

Docetaxel je neočakávane účinný proti hepatocelulámym karcinómom. Je ho možné použiť najmä na liečenie karcinómov z pečeňových buniek, fíbrolamelämych variantov a zmiešaných hepatocelulámych choiangiokarcinómov.

Podľa predloženého vynálezu je možné docetaxel podávať ľubovoľnou z obvyklých ciest známych na podávanie docetaxelu. Preto je ho možné podávať napríklad parenterálne. Typicky sa podáva intravenózne, výhodne prostredníctvom intravenóznej infúzie.

Podľa predloženého vynálezu je docetaxel pripravený na podávanie vo forme farmaceutický prijateľnej kompozície obsahujúcej docetaxel a farmaceutický prijateľný nosič alebo riedidlo. Medzi vhodné nosiče a riedidlá patria netoxické rozpúšťadlá a suspenzné prostriedky, napríklad sterilný vodný prostriedok. Výhodne sú tieto kompozície vo forme vodných roztokov alebo suspenzii, napríklad roztokov vhodných na injekčné alebo infuzne podávanie, ktoré môžu obsahovať emulgátory, farbivá, konzervačné prostriedky alebo stabilizátory.

Medzi farmaceutické kompozície vhodné na parenterálne podávanie patria sterilné vodné alebo iné ako vodné roztoky alebo suspenzie. Vhodné sterilné, iné ako vodné roztoky a suspenzie zahŕňajú roztoky a suspenzie v prírodných rastlinných olejoch, ako sú olivový olej, sezamový olej alebo vazelínový olej, alebo injikovateľné organické estery, ako je etyloleát. Vhodné sterilné vodné roztoky zahŕňajú roztoky docetaxelu vo vode. Typicky sa pH sterilných vodných roztokov vhodných na parenterálne podávanie vhodne upravuje. Ďalej sú tieto sterilné vodné roztoky všeobecne upravované na izotonické, napríklad pomocou dostatočného množstva chloridu sodného alebo glukózy. Je zvlášť výhodné, keď majú roztoky vhodné na infuzne podávanie podobné pH ako pH krvi a keď sú pripravené ako izotonické.

Sterilizáciu je možné uskutočniť pomocou zahriatia alebo ľubovoľným iným spôsobom, ktorý nemá škodlivé účinky na kompozíciu.

Farmaceutické kompozície obsahujúce docetaxel, vhodné na použitie podľa predloženého vynálezu môžu ďalej obsahovať surfaktant. Výhodnými surfaktantmi sú polysorbáty, estery polyoxyetylénglykolu a esterétery polyetylénglykolu a ricínových olejov. Príklady vhodných surfaktantov a farmaceutických kompozícií obsahujúcich surfaktantyje možné nájsť v AU-A-666859.

Docetaxel je tiež možné na použitie podľa predloženého vynálezu pripraviť ako lyofylizovanú kompozíciu. Tieto lyofylizované kompozície majú dobrú ľyzikálnu a chemickú stabilitu, a je ich preto možné skladovať dlhý čas. Lyofylizované kompozície obsahujúce docetaxel je možné pripraviť lyofylizáciou vodného roztoku docetaxelu štandardnými postupmi. Ďalej môžu obsahovať napučiavacie činidlá, ako je laktóza. Tiež môžu obsahovať činidlá upravujúce tonicitu, ako sú cukry a polyméry. Medzi príklady vhodných činidiel upravujúcich tonicitu patrí glukóza, dextróza, manitol a polyméry, napríklad polyvinylpyrolidón.

Lyofylizované kompozície je možné pred použitím znova rozpustiť v ľubovoľnom zlúčiteľnom a farmaceutický prijateľnom injikovateľnom prostriedku. Lyofylizát je možné výhodne obnoviť pomocou dvakrát destilovanej vody injekčného stupňa čistoty, v objeme, ktorý zodpovedá počiatočnému objemu roztoku určeného na lyoľylizáciu.

Farmaceutická kompozícia obsahujúca docetaxel, vhodná na použitie podľa predloženého vynálezu, obsahuje typicky aspoň 0,01 % hmotn. terapeuticky účinného produktu. Všeobecne obsahuje farmaceutická kompozícia od 0,01 do 1000 mg, výhodne od 0,1 do 500 mg, terapeuticky účinného produktu.

Roztok vhodný na intravenóznu injekciu obsahuje výhodne od 38 do 42, výhodnejšie asi 40 mg/ml účinného produktu. Typicky sú tieto roztoky poskytované v ampulkách obsahujúcich 20 mg alebo 80 mg účinného produktu.

Roztok vhodný na infúziu obsahuje výhodne od 0,1 do 11, výhodne od 0,1 do 10, výhodnejšie od 0,3 do 0,9 mg/ml účinného produktu.

Terapeutická liečba pomocou docetaxelu podľa predloženého vynálezu sa môže uskutočňovať súčasne s ďalšími terapeutickými liečbami, ktoré zahŕňajú liečby inými antineoplastickými liečivami, monoklonálnymi protilátkami, imunoterapiu alebo rádioterapiu, alebo liečby modifikátormi biologickej odozvy. Medzi vhodné modifikátory biologickej odozvy patria lymfokíny a cytokíny, ako sú interleukíny, interferóny (cc, β alebo δ) a TNF. Ďalšie chemoterapeutické činidlá, ktoré sú použiteľné na liečenie porúch spôsobených abnormálnou bunkovou proliferáciou, zahŕňajú alkylačné činidlá, ako sú mechlóretamin, cyklofosfamid, melfalán a chlórambucil, alkylsulfonáty, ako je busulfán, nitrózomočoviny, ako sú carmustín, lomustín, semustín a streptozocín, triazény, ako je dacarbazín, antimetabolity, ako sú analógy kyseliny listovej, napríklad metotrexát, pyrimidínové analógy, ako sú fluóruracil a cytarabín, purínové analógy, ako sú merkaptopurín a tioguanín, prírodné produkty, napríklad vinea alkaloidy, ako sú vinblastín, vineristín a vindesín, epipodopylotoxíny, ako sú etoposid a teniposid, antibiotiká, ako sú dactinomycín, daunorubicín, doxorubicín, bleomycín, plicamycín a mitomycín, enzýmy, ako je L-asparagináza, rozličné činidlá, ako sú koordinačné komplexy platiny, napríklad cisplatina, substituované močoviny, ako je hydroxymočovina, metylhydrazinové deriváty, ako je procarbazín, adrenokortikálne supresanty, ako sú hydrazín a aminoglutetimid, hormóny a antagonisty, ako sú adrenokortikosteroidy, ako je prednison, progestíny, ako sú hydroxyprogesteróncaproát, metoxyprogesterónacetát a megestrolacetát, estrogény, ako sú dietylstilbestrol a etynylestradiol, antiestrogény, ako je tamoxifen a androgény, ako sú testosterónpropionát a fluoxymesterón.

Výhodná je súčasná liečba cyklofosfamidom, 5-íluóruracilom, etoposidom, vinorelbinom alebo metotraxátom, alebo je možné dosiahnuť synergický účinok medzi týmito zlúčeninami a docetaxolom. Ďalšou účinnou látkou proti hepatocelulámemu karcinómu je 2-metoxyestradiol, o ktorom sa zistilo, že sa pri myšiach dobre znášal počas jedného mesiaca dennej liečby (Klauber a kol., Cancer Research, 57, 81-86, 1997). Preto je tiež vhodná súčasná liečba 2-metoxyestradiolom, najmä ak je žiaduca chronická liečba.

Podľa predloženého vynálezu sa docetaxel podáva v dávke, ktorá dovoľuje liečenie hepatocelulámeho karcinómu. Dávka sa líši v závislosti od cesty podávania a fyzikálnych vlastností pacienta. Medzi vhodné dávky patria dávky, ktoré sú terapeuticky účinné na liečbu porúch spôsobených abnormálnou bunkovou proliferáciou. Docetaxel je možné podávať tak často, ako je potrebné na dosiahnutie požadovaného terapeutického účinku.

Typická dávka docetaxelu na liečenie ľudí sa pohybuje od 50 do 150, výhodne od 60 do 100, výhodnejšie asi 100 mg docetaxelu na m² povrchu kože pacienta. Ak sa docetaxel podáva infúzne, pohybuje sa rýchlosť infúzie typicky od 1 do 200, výhodne asi 100 mg/m¹ docetaxelu za hodinu.

Skôr uvedené dávky je možné opakovať podľa potreby. Typicky sa opakujú denne alebo týždenne. Výhodne sa opakujú každé tri týždne. Docetaxel je napríklad možné podávať v dávke asi 100 mg/m² prostredníctvom intravenóznej infúzie počas 1 hodiny každé tri týždne.

Nasledujúci príklad uskutočnenia vynálezu slúži na ilustráciu predloženého vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 Výsledky štúdie životaschopnosti buniek - MTT analýzy

Obr. 2 Histogramy DNA analýzy opisujúce účinok paclitaxelu a docetaxelu na progresiu bunkového cyklu

Obr. 3 Výsledky elektroforetickej analýzy fragmentárne DNA

Príklady uskutočnenia vynálezu

Látky a metódy

Ak nie je uvedené inak, sú použitými metódami štandardné biochemické postupy. Všetky použité bunkové línie sú komerčne dostupné.

Bunkové kultúry

V podrobne opísaných pokusoch sa použili ľudské, hepatómové bunkové línie Hep3B (ATCC označenie HB 8064), HepG2 (ATCC označenie HB 8065) a HA22T/VGH, a myšie hepatómové bunkové línie Hepa 1 6. Tieto bunky sa kultivovali v Dulbeccom modifikovanom Eaglovom médiu (Gibco, BRL), obsahujúcom 10 % fetálne teľacie sérum (Hyclone), 0,01 mg/ml gentamycínu a 0,1 mmol neesenciálnej aminokyseliny. Bunky sa kultivovali v CO₂ inkubátore pri 37 °C, s 5 % CO₂ a 95 % filtrovaného vzduchu.

Pôsobenie liečiv

V rámci podrobne opísaného pokusu sa skôr uvedené hepatómové bunky podrobili rôznym koncentráciám paclitaxelu (0,001-10 μιηοΐ) a docetaxelu (0,001-10 pmol) na 24 hodín a 72 hodín. Paclitaxel sa rozpustil v dimetylsulfoxide (DMSO) a docetaxel sa rozpustil v etanole v podobe zásobných roztokov. Výsledná koncentrácia vehikula predstavovala menej ako 0,1 %.

Štúdie životaschopnosti buniek: MTT analýza

Bunky sa kultivovali na 96 jamkovej doske na bunkovú kultiváciu (Costar) v hustote predstavujúcej 4x10⁴ buniek/ml. Po pôsobení liečiv počas 24 hodín alebo 72 hodín sa médium odstránilo a nahradilo zodpovedajúcim objemom (100 μΐ) čerstvého média obsahujúceho MTT (0,456 mg/ml; 3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid) a nasledovne inkubovalo počas 1,5-hodiny pri 37 °C. Potom sa odstránilo čerstvé médium a pridalo sa 100 μΐ DMSO. Životaschopnosť buniek sa stanovila pomocou kolorimetrického porovnávania odpočítaním hodnôt optickej denzity (OD) z mikrodoskového čítacieho zariadenia (Spectra MAX 250) pri absorbčnej vlnovej dĺžke predstavujúcej 570 nm.

Výsledky sú znázornené na obrázku 1, na ktorom plné kruhy predstavujú dáta nasledujúce po liečbe po4 čas 24 hodín a prázdne kruhy predstavujú dáta nasledujúce po liečbe počas 72 hodín. Dáta sú priemery ± štandardná odchýlka priemeru zo zdvojených vzoriek troch nezávislých pokusov.

Propídiumjodidová (PI) vylučovacia analýza

Bunky sa kultivovali na 5 cm² miskách (Coming) a podrobili paclitaxelu a docetaxelu, ako je opísané. Potom sa pridal propídiumjodid (10 pg/'ml) a bunky sa inkubovali počas 15 minút pri 37 °C. Potom sa ešte pred odobratím spojených buniek odstránilo médium odobrali sa tak suspendované ako aj spojené bunky a potom sa resuspendovali 500 μΐ fosfátom pufrovaného roztoku chloridu sodného (PBS) na prietokovú cytometrickú analýzu, ako je opísané. Zvyškové signály sa odstránili pomocou FSC-SSC.

Prietoková cytometrická analýza obsahu DNA

Lytický pufor (0,5 % Triton X-100, 0,2 pg/ml Na₂EDTA.2H₂O a 1 % bovinného sérového albumínu v PBS) sa pridal k bunkovým peletám, ktoré sa potom nechali na ľade 15 minút. Potom sa k zmesi pridal 100 % metanol predchladený na -20 °C a zmes sa potom odstred’ovala pri 300 x g počas 5 minút. Supematant sa odstránil a bunkové pelety sa premyli pomocou PBS. Premyté pelety sa potom zafarbili roztokom farbiacim DNA (50 pg/ml propídiumjodídu a 5 kunitz/ml RNázy A) počas 30 minút pri 4 °C v tme. Obsah DNA v každej z buniek sa stanovil pomocou prietokového cytometra Becton Dickinson FACSCalibur, ako je opísané.

Prietoková cytometria

Bunky (10 000) sa analyzovali pomocou prietokového cytometra Becton Dickinson FACSCalibur s použitím argónového-iónového lasera (15 mW) s dopadajúcim lúčom 488 nm. Pre PI vylučovaciu analýzu sa zhromažďovala červená fluorescencia pomocou 585 nm filtra a zvyškové bunkové signály sa odstránili pomocou FSC-SSC. Dáta sa získali a analyzovali s použitím softvéru FACS/CELLQuest na počítači Power Macintosh 7600/120. Apoptotické bunky a bunky v špecifických fázach cyklu sa stanovili pomocou softvéru ModFit LT.

Výsledky prietokovej cytometrie sú uvedené v tabuľkách 1 a 2 a na obrázku 2. Tabuľka 1 uvádza hodnoty permeability bunkovej membrány hepatómových buniek, nasledujúce po pôsobení paclitaxelu a docetaxelu. Tabuľka 2 uvádza percentuálne podiely apoptických (sub-GO-Gl) buniek, zistené po pôsobení paclitaxelu a docetaxelu. Obrázok 2 zobrazuje histogramy DNA analýzy opisujúce účinok paclitaxelu a docetaxelu na progresiu bunkového cyklu.

Tabuľka 1

Permeabilita bunkovej membrány hepatómových buniek po pôsobení paclitaxelu a docetaxelu

	Paclitaxel (μηιοί)	Docetaxel (pmol)
0,01	θ,ι	1	0,01	0,1	1
Hep G2 24 h	93,63±1,1	85,71+6,8	66,71±7,2	94,86±1,3	85,49±1,2	81,24±3,2
72 h	56,58±28,7	43,79±11,7	13,27±4,3	61,06+9,6	40,03±9,0	27,42±8,8
Hep 3B 24 h	77,35±11,7	63,50±4,0	52,28±4,1	93,80+10,7	57,41+6,8	57,39+4,3
72 h	57,00+7,9	8,09±2,3	l,90±0,3	36,81+14,7	36,25+13,5	20,25+14,4
HA22T/VGH 24 h	94,08±18,6	40,03+7,8	34,24±8,3	98,66±9,0	38,71±11,2	40,79±5,0
72 h	92,58±21,3	93,38±32,5	49,32±8,3	55,44±5,6	21,24±0,4	22,03+3,1
Hepa 1-6 24 h	93,17±3,8	67,20±4,4	62,65±7,6	94,45±1,9	83,35±7,2	81,88±8,7
72 h	62,95±5,6	27,79±1,3	15,51+1,0	77,18±1,4	43,94±3,4	38,90+4,2

Dáta sú priemery ± štandardná odchýlka priemeru zo zdvojených vzoriek aspoň troch nezávislých pokusov. Bunky sa podrobili pôsobeniu liečiv počas 24 - 72 hodín a permeabilita membrány sa merala pomocou prietokovej cytometrickej analýzy propídiovej exklúzie pri životaschopných bunkách. Dáta predstavujú percentuálny podiel buniek s neporušenou bunkovou membránou vztiahnutý na kontrolu.

Tabuľka 2

Paclitaxelom a docetaxelom indukovaná apoptóza

	Paclitaxel (mmol) 0,01 0,1 1	Docetaxel (mmol) 0,01 0,1 1
Hep G2 24 h 72 h Hep 3B 24 h 72 h HA22T/ 24 h VGH 72 h Hepa 1-6 24 h 72 h	24,02	38,37 0 55,64 N/A	47,01 0 64,38 N/A	45.24 42,45 59,14 64,12 41,75 56,64 52,81 31.25	38,77 42,44 58,67 81,66 18,61 58,61 50,76 53,95	28.33 56,66 65,74 79.33 22,94 60,98 53,80 62,49

N/A znamená nezistené.

Údaje predstavujú percentuálny podiel apoptotických (sub-GO/Gl) buniek, ako sa stanovilo prietokovou cytometriou.

Elektroforetická analýza fragmentácie DNA

Odhad fragmentácie DNA sa uskutočnil podľa metódy opísanej v Herrmann a kol., Nucleic Acids Res., 22, 5506-5507, 1994.

Stručne sa bunky HEP G2 (2x10⁷) podrobili počas 72 hodín pôsobeniu paclitaxelu a docetaxelu, ako je opísané a potom odstreďovali. Takto získané bunkové pelety sa resuspendovali lytickým pufrom NP-40 (1 % NP-40 v 20 mmol EDTA, 50 mmol Tris-HCl, pH 7,5). Po prebehnutí lýzy buniek v priebehu niekoľkých málo sekúnd sa zhromaždili supematanty (5 minút pri 1600 x g). Extrakcia sa opakovala s rovnakým lytickým pufrom. Potom sa k supernatantom pridali SDS (výsledná koncentrácia 1 %) a RNáza (výsledná koncentrácia 2,5 pg/μΐ) a všetko sa inkubovalo počas 2 hodín pri 56 °C, čo bolo nasledované trávením pomocou proteinázy K (2,5 pg/μΐ) počas 2 hodín pri 37 °C. Potom sa zmesi pridali k 10 M amóniumacetátu, a to pred precipitáciou pomocou 100 % etanolu počas 30 minút pri -20 °C. DNA sa zhromaždila pomocou odstreďovania (10 minút pri 12 000 x g), nasledovaného elektroforézou na 1,5 % agarózovom géli.

Výsledky sú zobrazené na obrázku 3. Na obrázku 3 znamená M marker obsahujúci 100 párov zásad. Dráha 1 ukazuje médiovú kontrolu. Dráhy 2 a 3 ukazujú priemer skupín podrobených pôsobeniu paclitaxelu (0,1 a 1 pmol). Dráhy 4 a 5 ukazujú priemer skupín podrobených pôsobeniu docetaxelu (0,1 a 1 pmol).

Výsledky

Štúdie životaschopnosti buniek

Obrázok 1 ukazuje od dávky závislý účinok paclitaxelu a docetaxelu na životaschopnosť buniek pri hepatómových bunkových líniách (Hep G2, Hep 3B, HA22T/VGH a Hepa 1-6). Ako je zrejmé z obrázka 1, docetaxel dosiahol v takmer každom prípade pokles životaschopnosti pri 0,01 a 0,1 pmol.

Pri bunkách Hep G2 mala životaschopnosť buniek po pôsobení paclitaxelu alebo docetaxelu klesajúci trend. Životaschopnosť buniek Hep G2 predstavovala 61,81 % a 39,45 % kontroly pri skupinách podrobených pôsobeniu paclitaxelu (10 pmol) počas 24 resp. 72 hodín. Pri bunkách Hep G2 podrobených pôsobeniu docetaxelu sa pozoroval maximálny pokles životaschopnosti pri 1 Ltmol docetaxelu, pri 10 pmol docetaxelu sa už nezaznamenal ďalší pokles životaschopnosti. Životaschopnosť predstavovala 65,03 % a 48,99 % pri bunkách podrobených pôsobeniu 1 μ mol docetaxelu počas 24 resp. 72 hodín.

Pri bunkách Hep 3B stojí za zmienku to, že viditeľný pokles životaschopnosti (37,06 %) sa pozoroval po pôsobení 1 pmol docetaxelu počas 72 hodín.

Pri bunkách Hepa 1-6 podrobených pôsobeniu docetaxelu sa pozorovala maximálna cytotoxicita (65,34 % a 30,71 %) pri skupinách podrobených pôsobeniu 1 μιηοΐ docetaxelu počas 24 resp. 72 hodín.

Propídiumjodidová vylučovacia analýza

Tabuľka 1 ukazuje, že permeabilita membrány buniek Hep G2 a buniek Hep 3B, nasledujúca po pôsobení paclitaxelu a docetaxelu, bola závislá od dávky a času.

Pri bunkách HA22T/VGH sa pozoroval menší vzostup permeability membrány po pôsobení paclitaxelu (0,01-1 pmol) počas 72 hodín, v porovnaní so skupinami podrobenými pôsobeniu docetaxelu. Za zmienku stojí, že len pri 55,44 % buniek boli membrány po pôsobení 0,01 pmol docetaxelu počas 72 hodín neporušené, ale po pôsobení rovnakej dávky paclitaxelu boli membrány neporušené pri 92,58 % buniek.

Analýza bunkového cyklu

Obrázok 2 ukazuje, že výsledkom pôsobenia 1 pmol paclitaxelu na bunky Hep G2 počas 24 hodín je zrejmé zastavenie vo fáze G2/M. Podobné DNA histogramy sa pozorovali po 72 hodinovej expozícii.

Ako ukazuje tabuľka 2, apoptotické bunky (sub-GO/Gl) sa pozorovali po pôsobení 0,001 pmol, 0,01 pmol, 0,1 timol a 1 pmol docetaxelu počas 24 hodín s percentuálnymi podielmi apoptotických buniek predstavujúcimi 31,02 %, 45,24 %, 38,77 % resp. 28,33 %. Po 72 hodinách pôsobenia docetaxelu (0,001-1 pmol) predstavovali percentuálne podiely 21,92 %, 42,45 %, 42,44 % resp. 56,66 %.

Výsledkom pôsobenia 0,1 pmol alebo 1 pmol paclitaxelu počas 24 hodín bola pri bunkách Hep 3B zástava vo fáze G2/M a výsledkom inkubácie s 0,1 pmol alebo 1 pmol paclitaxelu počas 72 hodín bolo zvýšenie percentuálnych podielov buniek v sub-GO/Gl na 38,37 % resp. 47,01 %. Oproti tomu pôsobenie 0,01 pmol, 0,1 pmol alebo 1 pmol docetaxelu na bunky Hep 3B počas 24 hodín alebo 72 hodín viedlo k vysokým podielom populácií sub-GO/Gl a to vo výške 59,14 %, 58,69 % a 65,74 % po 24 hodinách a 64,12 %, 81,66 % a 79,33 % po 72 hodinách.

Pri bunkách HA22T/VGH boli zvyšujúce sa koncentrácie paclitaxelu (0,001 pmol až 1 pmol) v súlade so zvýšenými percentuálnymi podielmi buniek vo fáze G2/M po 24 hodinách. Po 72 hodinách pôsobenia 0,1 pmol alebo 1 pmol paclitaxelu sa pri skupinách týchto buniek nepozorovala viditeľná populácia subGO/Gl. Oproti tomu je zreteľné, že pri bunkách HA22T/VGH podrobených pôsobeniu 0,01 pmol docetaxelu počas 24 hodín je výsledkom vyšší percentuálny podiel sub-GO/Gl (41,75 %) ako pri skupinách podrobených pôsobeniu 0,1 pmol (18,61 %) alebo 1 pmol (22,94 %) docetaxelu. V prípade, ak sa bunky podrobili pôsobeniu docetaxelu počas 72 hodín, zistili sa viditeľné percentuálne podiely sub-GO/Gl pri bunkách HA22T/VGH podrobených pôsobeniu 0,01 pmol (56,64 %), 0,1 pmol (58,61 %) a 1 pmol (60,98 %) docetaxelu.

Pri bunkách Hepa 1-6 viedlo pôsobenie paclitaxelu (0,01, 0,1 alebo 1 pmol) počas 24 hodín k zvýšenej tvorbe populácií sub-GO/Gl (24,02 %, 55,64 % resp. 64,38 %), pričom zástava vo fáze G2./M sa pozorovala pri skupinách podrobených pôsobeniu 0,1 pmol a 1 pmol paclitaxelu. Ak sa bunky Hepa 1-6 podrobili pôsobeniu 0,1 pmol a 1 pmol paclitaxelu počas 72 hodín, bola väčšina buniek mŕtva a nebol zrejmý stupeň bunkového cyklu. Pôsobenie docetaxelu (0,01, 0,1 a 1 pmol) na bunky Hepa 1-6 viedlo k tvorbe buniek subGO/Gl (52,81 %, 50,76 % a 53,8 % po 24 hodinách resp. 31,25 %, 53,95 % a 62,49 % po 72 hodinách).

Analýza fragmentácie DNA

Obrázok 3 ukazuje, že pôsobenie paclitaxelu (0,1 a 1 pmol) a docetaxelu (0,1 a 1 pmol) indukuje pri bunkách Hep G2 fŕagmentáciu DNA.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie kompozície, ktorej účinnou zložkou je docetaxel alebo jeho hydrát, na prípravu liečiva na použitie na liečenie hepatocelulámeho karcinómu.
2. 2. Použitie kompozície podľa nároku 1, kde uvedeným hydrátom je trihydrát.
3. 3. Použitie kompozície podľa nároku 1 alebo 2 na prípravu liečiva v parenterálnej forme na použitie na liečenie hepatocelulámeho karcinómu.
4. 4. Použitie kompozície podľa nároku 3, na prípravu liečiva vo forme infúzie s obsahom od 0,1 do 11 mg/ml účinnej látky na použitie na liečenie hepatocelulámeho karcinómu.

   6 výkresov