PL211654B1 - Przeciwciało skierowane przeciwko NGF do zastosowania w leczeniu bólu pooperacyjnego, zastosowanie tego przeciwciała do wytwarzania leku do leczenia bólu pooperacyjnego i kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało skierowane przeciwko NGF do zastosowania w leczeniu bólu pooperacyjnego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało skierowane przeciwko NGF do zastosowania w leczeniu bólu pooperacyjnego, zastosowanie tego przeciwciała do wytwarzania leku do leczenia bólu pooperacyjnego i kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało skierowane przeciwko NGF do zastosowania w leczeniu bólu pooperacyjnego.

Czynnik wzrostu nerwów (NGF) był pierwszą zidentyfikowaną neurotrofiną i dobrze scharakteryzowano jego rolę w rozwoju i przeżywalności zarówno nerwów obwodowych jak i ośrodkowych. Wykazano, że NGF jest czynnikiem o decydującym znaczeniu dla przeżywalności i utrzymania przy życiu w trakcie rozwoju obwodowych nerwów współczulnych i embrionalnych nerwów czuciowych i neuronów cholinergicznych części podstawnej przodomózgowia (Smeyne, i in., Nature 368:246-249 (1994); Crowley, i in., Cell 76:1001-1011 (1994)). NGF aktywuje ekspresję neuropeptydów w nerwach czuciowych (Lindsay, i in., Nature 337:362-364 (1989)) a w jego aktywności pośredniczą dwa różne związane z błoną receptory, receptorowej kinazy tyrozynowej TrkA i receptor p75, który jest pokrewny strukturalnie z innymi receptorami z rodziny receptorów czynnika martwicy nowotworu (Chao, i in., Science 232:518-521 (1986)).

Oprócz działania na układ nerwowy, co raz częściej NGF wiąże się z procesami zachodzącymi poza układem nerwowym. Przykładowo, wykazano, że podawany egzogennie NGF zwiększa przepuszczalność naczyń (Otten i in., Eur. J. Pharmacol 106:199-201,(1984)) nasila odpowiedzi immunologiczne limfocytów T i B (Otten i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10059-10063,(1989)), indukuje różnicowanie limfocytów i proliferację komórek tucznych i prowadzi do uwolnienia rozpuszczalnych sygnałów biologicznych z komórek tucznych (Matsuda i in., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6508-6512 (1988); Pearce i in., J. Physiol. 372:379-393 (1986); Bischoff i in., Blood 79:2662-2669 (1992); Horigome i in., J. Biol. Chem. 268:14881-14887 (1993)). Chociaż wykazano, że egzogennie podawany NGF może wykazywać wszystkie te efekty, należy zwrócić uwagę, że rzadko tylko stwierdzano, że endogenny NGF pełni istotną rolę w którymkolwiek spośród tych procesów in vivo (Torcia i in., Cell. 85(3):345-56 (1996)). Dlatego nie jest jasne jaki byłby efekt, jeżeli jakikolwiek, hamowania aktywności biologicznej endogennego NGF.

NGF wytwarza wiele typów komórek, w tym komórki tuczne (Leon i in., Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:3739-3743 (1994)), limfocyty B (Torcia i in., Cell 85:345-356 (1996), keratynocyty (Di Marco i in., J. Biol. Chem. 268:22838-22846)), komórki mięśni gładkich (Ueyama i in., J. Hypertens. 11:1061-1065 (1993)), fibroblasty (Lindholm i in., Eur. J.Neurosci. 2:795-801 (1990)), komórki nabłonka oskrzeli (Kassel i in., Clin, Exp. Allergy 31:1432-40 (2001)), komórki mezangium nerek (Steiner i in., Am. J. Physiol 261:F792-798 (1991)) i miotubule mięśni szkieletowych (Schwartz i in., J Photochem, Photobiol B 66:195-200 (2002)). Wystąpienie receptorów NGF stwierdzono na wielu różnych typach komórek poza układem nerwowym. Przykładowo, wystąpienie TrkA stwierdzono na ludzkich monocytach, limfocytach B i T oraz komórkach tucznych.

Związek pomiędzy zwiększonym poziomem NGF a różnymi stanami zapalnymi obserwowano u czł owieka jak również w kilku modelach zwierzę cych. Obejmują one systemowy toczeń rumieniowaty (Bracci-Laudiero i in., Neuroreport 4:563-565 (1993)), stwardnienie rozsiane (Bracci-Laudiero i in., Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)), łuszczycę (Raychaudhuri i in., Acta Derm. Venereal. 78:84-86 (1998)), zapalenie stawów (Falcimi i in., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)), śródmiąższowe zapalenie pęcherza (Okrągły i in., J. Urology 161:438-441 (1991)) i astmę (Braun i in., Eur. J Immunol. 28:3240-3251 (1998)).

Konsekwentnie, podwyższony poziom NGF w tkankach obwodowych wiąże się z zapaleniem i obserwowano go w wielu postaciach zapalenia stawów. W błonie maziowej pacjentów dotkniętych reumatoidalnym zapaleniem stawów licznie występuje NGF podczas gdy w błonie maziowej, która nie jest objęta zapaleniem, jak stwierdzono, NGF nie jest wykrywalny (Aloe i in., Arch Rheum. 35:351-355 (1992)). Podobne wyniki obserwowano u szczurów z wywołanym doświadczalnie reumatoidalnym zapaleniem stawów (Aloe i in., Clin. Exp. Rheumatol. 10:203-204 (1992)). Podwyższony poziom NGF opisano u transgenicznych artretycznych myszy wraz ze wzrostem liczby komórek tucznych. (Aloe i in., Int.J.Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143 (1993)).

Podanie egzogennego NGF prowadzi do zwiększenia bólu i wrażliwości na ból. Ilustruje to fakt, że zastrzyk NGF prowadzi do istotnego nasilenia bólu i wrażliwości na ból zarówno w modelach zwierzęcych (Amann i in., Pain 64, 323-329 (1996); Andreev i in., Pain 63, 109-115 (1995)) jak i u człowieka (Dyck i in., Neurology 48, 501-505 (1997); Petty i in., Annals Neural. 36, 244-246 (1994)). Wydaje

PL 211 654 B1 się, że NGF działa przez wiele mechanizmów obejmujących indukowanie neurotrofiny BDNF (Apfel i in., Mol Cell. Neurosci. 7(2), 134-142 (1996); Michael i in., J. Neurosci 17, 8476-8490 (1997)), co z kolei prowadzi do zmian w przetwarzaniu sygnał u bólowego w rdzeniu krę gowym (Hains i in., Neurosci Lett. 320(3), 125-8(2002); Miletic i in., Neurosci Lett. 319(3), 137-40 (2002); Thompson i in., Proc Natl Acad Sci USA 96(14), 7714-8 (1999)), indukuje zmiany w połączeniach obwodowych i ośrodkowych nerwów czuciowych i innych przenoszą cych informację bólową nerwach w rdzeniu kręgowym (Lewin i in., European Journal of Neuroscience 6,1903-1912 (1994); Thompson i in., Pain 62,219-231 (1995)), indukuje zmiany we wzroście aksonów (Lindsay RM, J Neurosci. 8(7), 2394-405 (1988)) indukuje ekspresję receptora bradykininy (Peterson i in., Neuroscience 83:161-168 (1998)), indukuje zmiany w ekspresji genów odpowiedzialnych za aktywację i przewodnictwo nerwowe, takich jak geny kanałów jonowych (Boettger i in., Brain 125(Pt2), 252-63 (2002); Kerr i in., Neuroreport 12(14), 3077-8 (2001); Gould i in., Brain Res 854(1-2), 19-29 (2000)), aktywuje receptor VR1 związany z bólem (Chuang i in., Nature 411 (6840), 957-62 (2001) i wywołujące patologiczne zmiany w mięśniach (Foster i in., J Pathol 197(2), 245-55 (2002)). Wiele spośród tych zmian zachodzi bezpośrednio w nerwach czuciowych przenoszących informację bólową i najwidoczniej nie zależą one od towarzyszącego zapalenia. Ponadto, istnieją co najmniej dwa inne typy komórek, o których wiadomo, że wrażliwe są na NGF i że mogą być zaangażowane w zmiany odczuwania lub wrażliwości na ból. Pierwszy typ, komórki tuczne, jak doniesiono, reaguje na NGF degranulacją (Yan i in., Clin. Sci. (Land) 80:565-569 (1991)) lub w innych badaniach, wywołuje lub zwiększa produkcję lub uwalnianie mediatorów we współdziałaniu z innymi środkami (Pearce i Thompson, J. Physiol. 372:379-393 (1986), Kawamoto i in., J. Immunol 168:6412-6419 (2002)). U szczura wyraź nie wykazano, ż e w odpowiedziach bólowych, w których bierze udział NGF, pośredniczą co najmniej w pewnym stopniu komórki tuczne (Lewin i in., Eur. J. Neurosci. 6:1903-1912 (1994), Woolf i in., J. Neurosci. 16:2716-2723 (1996) chociaż potencjalne znaczenie tego u ludzi pozostaje do wykazania. Wiadomo także, że główne nerwy współczulne są wrażliwe na NGF i również powiązane są z sygnalizacją bólową (Aley i in., Neuroscience 71:1083-1090 (1996)). Jasne jest, że usunięcie nerwów współczulnych modyfikuje przeczulicę bólową obserwowaną normalnie w odpowiedzi na leczenie z zastosowaniem NGF (Woolf i in., J. Neurosci. 16:2716-2723 (1996)).

U 23 mln pacjentów każ dego roku dokonuje się zabiegów chirurgicznych. Ból dotyczy zazwyczaj otoczenia miejsca objętego zabiegiem chirurgicznym. Ból pooperacyjny może mieć dwa ważne aspekty kliniczne, mianowicie ból spoczynkowy lub ból występujący, gdy pacjent się nie porusza oraz ból mechaniczny nasilany poprzez ruch (kaszel/kichanie, wstawanie z łóżka, fizjoterapia itp.). Głównym problemem dotyczącym zwalczania bólu pooperacyjnego w przypadku większego zabiegu operacyjnego jest to, że obecnie stosowane leki wykazują wiele różnych istotnych działań niepożądanych opóźniających wyzdrowienie, przedłużających hospitalizację oraz narażających pewne podatne grupy pacjentów na ryzyko poważnych powikłań. Ból pooperacyjny lub ból występujący po zabiegu operacyjnym lub uszkodzeniu urazowym jest poważnym i często niedającym się zwalczyć problemem medycznym.

Istnieją dwie ogólne kategorie lekarstw do leczenia bólu, przy czym obie mają wady. Pierwsza kategoria obejmuje niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSAID), które stosuje się do leczenia łagodnego lub umiarkowanego bólu lecz których zastosowania terapeutyczne ograniczają działania niepożądane na układ pokarmowy, takie jak nadżerka śluzówki żołądka, tworzenie się wrzodu trawiennego lub zapalenie dwunastnicy i okrężnicy. NSAID także mogą powodować toksyczność względem nerek przy przedłużonym stosowaniu a następnie nie są bardzo skuteczne w leczeniu bólu związanego lub będącego wynikiem pewnych schorzeń, obejmując ból pooperacyjny. Druga kategoria obejmuje morfinę i opioidy pokrewne, które stosuje się w leczeniu umiarkowanego do silnego bólu, lecz których zastosowanie terapeutyczne ograniczają działania niepożądane, takie jak uspokojenie polekowe, dezorientacja, zaparcie, depresja oddechowa, kolka nerkowa, tolerancja w przypadku przedłużonego stosowania i ryzyko uzależnienia, Z tego też względu potrzebne są związki przydatne w leczeniu bólu o mniejszych efektach ubocznych lub bez efektów ubocznych.

Ból często dzieli się na kategorie bólu „zapalnego, „neuropatycznego lub „trzewnego lecz te tradycyjne ogólne nazwy mają naturalne wady. Zakładają one podobieństwo mechanizmów lub identyczność wszystkich źródeł bólu w jednej spośród tych bardzo ogólnych kategorii. Właściwie, istnieje wiele różnych typów bólu zapalnego oraz źródeł bólu, które nie są ani typu zapalnego ani neuropatycznego. Dalej, typy bólu o elemencie zapalnym i/lub które tradycyjnie nazywane są „zapalnym nie oznaczają, że do stanu bólowego nie przyczyniają się inne aspekty fizjologiczne. Przykładowo, nazwy

PL 211 654 B1 zarówno zapalenia kości i stawów jak i śródmiąższowego zapalenia pęcherza oznaczałyby czyste stany zapalne, odpowiednio stawów lub pęcherza moczowego lecz jasne jest, że ból związany z tymi dwoma schorzeniami ma zupełnie różny mechanizm. Świadczą o tym różne efekty stosowanych typów lekarstw przeciwbólowych w zależności od tych typów bólu. U większości pacjentów z zapaleniem kości i stawów stosowanie NSAID skutecznie uśmierza ból (co najmniej początkowo). Jednakże stosowanie NSAID jest całkowicie nieskuteczne w przypadku śródmiąższowego zapalenia pęcherza.

Ból pooperacyjny (zamiennie: ból w następstwie nacięcia) traktowany jest często jako odmiana bólu zapalnego. Chociaż składową bólu pooperacyjnego może być element „zapalny to wyraźnie zaangażowane są dodatkowe mechanizmy. Przykładowo, podczas zabiegu operacyjnego lub innego uszkodzenia dochodzi do przecięcia lub rozdarcia układu naczyniowego i nerwów. Nie zdarza się to w tkance objętej jedynie stanem zapalnym. Jasne jest, ż e przecięcie nerwu może spowodować aktywność, którą postrzega się jako bolesną. Ponadto, odcięcie naczyń krwionośnych doprowadza do tkanki, już względnie niedokrwionej, dodatkowy bodziec bólowy co nie ma miejsca przy samym stanie zapalnym.

O róż nych mechanizmach zaangaż owanych w ból wywoł ywany zabiegiem chirurgicznym lub uszkodzeniem, w porównaniu z zapaleniem, świadczy przykładowo różna farmakologia oraz stanowiące ich podstawę anatomiczne elementy uśmierzania bólu w tych obu warunkach. Yamamoto i in., (Brian Res. 909(1-2):138-144 (2001)) wykazali, że hamowanie N-acetylo-alfa-związanej kwaśnej dipeptydazy (NAALADaza) powoduje wyraźne zmniejszenie bólu mechanicznego, towarzyszącego bodźcowi zapalnemu iniekcji karageniny. Jednakże, w równoległych doświadczeniach, w których NAALADazę identycznie hamowano po nacięciu, nie uzyskano osłabienia bólu mechanicznego. Obserwacje te wykazują, że biochemia lub farmakologia bólu pooperacyjnego różni się od biochemii lub farmakologii bólu zapalnego. Struktury anatomiczne istotne w modulowaniu odczuwania bólu również badano w przypadku bólu w następstwie zabiegu chirurgicznego jak i w innych stanach bólowych (Pogatzki i in., Anesthesiology, 96(5): 1153-1160 (maj 2002)). Impulsy zstępujące dla pnia mózgu, dokładniej przedniego przyśrodkowego rdzenia przedłużonego, są ważnymi modulatorami wtórnej przeczulicy bólowej w ogólnym bólu zapalnym, neuropatycznym i trzewnym. Po uszkodzeniu obszaru pnia mózgu nie zaobserwowano zmiany w żadnej odpowiedzi bólowej badanej po nacięciu. Te wyniki wskazują, że pierwotnej i wtórnej przeczulicy bólowej po nacięciu nie modulują impulsy zstępujące ze strony RMM. Brak udziału zstępującego działania pośredniczącego ze strony RMM na wtórną przeczulicę bólową po nacięciu mięśnia brzuchatego łydki potwierdza stwierdzenie, że w bólu wywołanym nacięciem brały udział inne mechanizmy niż w bólu zapalnym i neuropatycznym. Oprócz oczywistych różnic pomiędzy bólem w następstwie zabiegu chirurgicznego lub uszkodzenia a bólem zapalnym, trzewnym lub neuropatycznym, wyniki te wykazują, że mechanizmy zaangażowane w ból pooperacyjny (lub ból wywołany uszkodzeniem) są zdecydowanie różne od innych mechanizmów dla innych typów bólu. Dalej, użyteczności konkretnej farmakologicznej (lub innej) interwencji w leczeniu bólu pooperacyjnego nie można przewidzieć badając środek farmakologiczny lub interwencję na modelach bólu zapalnego, trzewnego lub neuropatycznego.

Zanikanie bólu w spoczynku i utrzymywanie się bólu przy aktywności i w odpowiedzi na bodźce mechaniczne w miejscu zranienia występują także u pacjentów po zabiegu operacyjnym. (Moiniche i in., Acta Anaesthesiol. Scand. 41: 785-9 (1997)). Wyniki badań sugerują, że informacja o bólu w spoczynku i bólu wywoł anym spowodowanym nacię ciami przenosi się prawdopodobnie przez róż ne populacje włókien aferentnych i/lub różne receptory. Dostępnych jest kilka leków istotnie zmniejszających ból związany z kaszlem i ruchem po zabiegu operacyjnym, innych niż stosowane miejscowo środki znieczulające do hamowania tych wywołanych odpowiedzi.

Wykazano, że wcześniejsze podanie środka do znieczulenia miejscowego w celu zapobieżenia bólowi podczas eksperymentalnego nacięcia hamuje początkowo ból i pierwotną mechaniczną przeczulicę bólową. Ból z nacięcia również zanika, gdy po uszkodzeniu wstrzyknie się lidokainę. Jednakże, z chwilą wygaśnięcia działania środka do znieczulenia miejscowego powraca pierwotna przeczulica bólowa. U pacjentów iniekcje środka do znieczulenia miejscowego podobnie wykonane przed zabiegiem operacyjnym zmniejszają ból w przybliżeniu jak iniekcje wykonane po zabiegu operacyjnym. (Moiniche i in., Anesthesiology 96:725-41 (2002)).

Wyniki badań klinicznych na wolontariuszach oraz przedklinicznego modelu nacięcia potwierdzają, że podawanie środka do znieczulenia miejscowego przed lub po nacięciu jest w zasadzie równoważne. Aktywacja ośrodkowych nerwów przewodzących ból podczas nacięcia i sensybilizacja nie są konieczne do zachowań bólowych w kilka dni później. Raczej, w przypadku nacięć, dla zwiększonej

PL 211 654 B1 wrażliwości nerwów ośrodkowych oraz bólu niezbędny jest stały dopływ bodźców do ośrodka nerwowego z miejsca nacięcia. Po ustąpieniu efektu działania jakiegokolwiek środka przeciwbólowego podanego przed nacięciem rana chirurgiczna może wznowić sensybilizację i odnowić odpowiedzi bólowe (Pogatzki i in., J Neurophysiol 87:721 (2002)).

Zmapowano także obszar objęty przeczulica bólową (w tym strefa nieuszkodzona) spowodowaną nacięciami. Wtórna przeczulica bólowa (przeczulica bólowa poza obszarem uszkodzenia) świadczy o zwiększonej wrażliwości ośrodkowego układu nerwowego, tj. uwrażliwienia ośrodkowego układu nerwowego. Wskazano, że obszar zaczerwienienia skóry wokół urazu lub zaczerwienienia (prawdopodobnie w wyniku odruchów aksonowych) w wyniku nacięcia różni się od obszaru objętego przeczulicą bólową. W przeciwieństwie do bólu w spoczynku i pierwotnej mechanicznej przeczulicy bólowej nigdy nie uzyskano dużego obszaru przeczulicy bólowej gdy przed nacięciem podano przez iniekcję środek do znieczulenia miejscowego. Ponadto, po nacięciu efektu tego nie można było uzyskać przy pomocy iniekcji środka do znieczulenia miejscowego.

U pacjentów po zabiegu operacyjnym, w pewnych przypadkach, pewne zabiegi znacznie ograniczają obszar przeczulicy bólowej lecz nie modyfikują istotnie klinicznych wskaźników bólu pooperacyjnego (ocena bólu i zużycie opioidów). Wykazano, że zmniejszenie obszaru objętego przeczulicą bólową po wycięciu okrężnicy nie powodowało istotnego zmniejszenia ostrego bólu lecz wiązało się ze zmniejszeniem liczby pacjentów, u których rozwinął się ból resztkowy nawet do 6 miesięcy po wycięciu okrężnicy (De Kock, i in., Pain 92:373-80 (2001)).

Opisano zastosowanie przeciwciał anty-NGF w leczeniu przewlekłego bólu trzewnego (WO 01/78698). Brennan i in. wspomnieli o stosowaniu immunoadhezyny TrkA w modelu bólu pooperacyjnego u szczura, Society for Neuroscience Abstracts 24(1-2) 880 (1998).

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało skierowane przeciwko NGF do zastosowania w leczeniu bólu pooperacyjnego a korzystnie w tłumieniu lub łagodzeniu bólu spoczynkowego, także bólu spoczynkowego bólu wywołanego mechanicznie. Przeciwciało jest korzystnie przeciwciałem ludzkim lub humanizowanym. Przeciwciało według wynalazku łączy się z ludzkim NGF, korzystnie z ludzkim NGF z powinowactwem wiązania około 0,1 nM, a korzystnie 2-22 pM.

Przeciwciało to łączy się z epitopem NGF zawierającym jedną lub więcej spośród reszt: K32, K34 i E35 w regionie zmiennym 1 (aminokwasy 23-35) hNGF, reszty F79 i T81 w regionie zmiennym 4 (aminokwasy 81-88) hNGF, reszty H84 i K88 w regionie zmiennym 4, reszta R103 pomiędzy regionem zmiennym 5 (aminokwasy 94-98) hNGF i C-końcem (aminokwasy 111-118) hNGF, reszta E11 w regionie pre-zmiennym 1 (aminokwasy 10-23) hNGF, Y52 pomiędzy regionem zmiennym 2 (aminokwasy 40-49) hNGF i regionem zmiennym 3 (aminokwasy 59-66) hNGF, reszty L112 i S113 w C-końcu hNGF, reszty R59 i R69 w regionie zmiennym 3 hNGF lub reszty V18, V20, i G23 w regionie prezmiennym 1 hNGF.

Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko NGF do wytwarzania leku do leczenia bólu pooperacyjnego.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu bólu pooperacyjnego zawierająca przeciwciało skierowane przeciwko NGF oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

Wynalazek ten opiera się na stwierdzeniu, że antagoniści NGF skutecznie oddziałują na ból pooperacyjny.

Ból pooperacyjny (nazywany na przemian „bólem po nacięciu lub „bólem pourazowym) jest łagodzony przez podawanie antagonisty czynnika wzrostu nerwów (NGF). Wykazano, że zgodnie z wynalazkiem antagoniś ci NGF mogą hamować lub blokować ból pooperacyjny, w tym ból w nastę pstwie zabiegu operacyjnego lub nacięcia lub urazu w wyniku zranienia.

Opisano zmniejszanie częstości występowania ataków bólu pooperacyjnego, łagodzenia bólu pooperacyjnego, uśmierzania bólu pooperacyjnego i/lub opóźniania nasilania się lub intensyfikowania bólu pooperacyjnego u pacjenta, przy czym podawano w skutecznej ilości antagonistę NGF.

Ujawniono sposoby podwyższania progu ból u pacjenta obejmujące podawanie w skutecznej ilości antagonisty NGF oraz sposoby przyśpieszania u pacjenta w trakcie rekonwalescencji po zabiegu operacyjnym i/lub uszkodzeniu wywołanym urazem w wyniku zranienia, obejmujące podawanie w skutecznej iloś ci antagonisty NGF.

W niektórych przypadkach tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega bólowi spoczynkowemu czy tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega bólowi wywołanemu mechanicznie (w tym bólowi spowodowanemu ruchem) a nawet tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega bólowi o podłożu termicznym. Tłumi się, łagodzi i/lub

PL 211 654 B1 zapobiega bólowi wywołanemu mechanicznie przez podawanie przeciwciała anty-NGF. Ból spoczynkowy tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega przez podawanie przeciwciała anty-NGF. Ból o podłożu termicznym tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega się mu przez podawanie przeciwciała anty-NGF. Tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega się allodynii (tj. nasilonej odpowiedzi [nasilonemu odczuciu bólu] na normalnie niebólowy bodziec)) i/lub tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega przeczulicy bólowej (tj. nasilonej odpowiedzi na normalnie bólowy lub nieprzyjemny bodziec).

Allodynia i/lub przeczulica bólowa ma naturę termiczną lub mechaniczną (dotykową) lub bólu spoczynkowego. Ból oznacza też ból przewlekły. Ból związany jest z miejscem nacięcia, zranienia lub urazu i/lub sąsiaduje z lub jest w pobliżu miejsca nacięcia, zranienia i/lub urazu.

Antagonistą NGF odpowiednim do zastosowania jest dowolny środek, który może bezpośrednio lub pośrednio zmniejszyć aktywność biologiczną NGF. Antagonista NGF (np. przeciwciało) łączy się (oddziałuje fizycznie) z NGF, łączy się z receptorem NGF (takim jak receptor TrkA i/lub p75), i/lub zmniejsza (hamuje i/lub blokuje) sygnalizację w dół od receptora NGF (np. inhibitory sygnalizacji poprzez kinazę). Zgodnie z tym, antagonista NGF łączy się (oddziałuje fizycznie) z NGF lub antagonista NGF łączy się z receptorem NGF (takim jak receptor TrkA i/lub p75).

Antagonista NGF może zmniejszać (hamować i/lub blokować) sygnalizację w dół od receptora NGF (np. inhibitory sygnalizacji poprzez kinazę). Antagonista NGF hamuje (zmniejsza) przykładowo syntezę i/lub uwalnianie NGF. Antagonista NGF jest antagonistą NGF nie będącym immunoadhezyną TrkA (tj. jest inny niż immunoadhezyna TrkA). Antagonista NGF może być inny niż przeciwciało antyNGF czy inny niż immunoadhezyna TrkA i inny niż przeciwciało anty-NGF. Antagonista NGF może łączyć się z NGF (takim jak hNGF) i w niewielkim stopniu z pokrewnymi neurotrofinami, jak np. NT-3, NT4/5, i/lub BDNF, Antagonista NGF wybrany jest spośród takich jak: przeciwciało anty-NGF, antysensowna cząsteczka ukierunkowana na NGF (w tym antysensowna cząsteczka ukierunkowana na kwas nukleinowy kodujący NGF), antysensowna cząsteczka ukierunkowana na receptor NGF (taki jak TrkA i/lub p75) (w tym antysensowna cząsteczka ukierunkowana na kwas nukleinowy kodujący receptor NGF), związek hamujący NGF, analog strukturalny NGF, dominujący-negatywny mutant receptora TrkA i/lub p75 który łączy się z NGF, przeciwciało anty-TrkA, przeciwciało anty-p75 i inhibitor kinazy.

Antagonistą NGF jest też przeciwciało anty-NGF lub przeciwciało anty-NGF jest humanizowane (jak np. przeciwciało E3). W niektórych przypadkach przeciwciałem anty-NGF jest przeciwciało E3 lub przeciwciało anty-NGF zawiera jeden lub więcej ODR przeciwciała E3 (jak np. jeden, dwa, trzy, cztery, pięć, lub, w niektórych rozwiązaniach, wszystkie sześć CDR z E3). Przeciwciało jest korzystnie przeciwciałem ludzkim lub przeciwciało anty-NGF zawiera sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przedstawioną w tablicy 1 (SEQ ID No:1) i sekwencję aminokwasową regionu zmiennego lekkiego łańcucha przedstawioną w tablicy 2 (SEQ ID No:2). Przeciwciało zawierać może zmodyfikowany region stały, taki jak region stały będący immunologicznie obojętny, np. nie zapoczątkowuje on lizy przy udziale dopełniacza lub nie stymuluje cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), Region stały może być zmodyfikowany według opisu w Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624, GB99/01441 i/lub UK98099518.

Antagonista NGF może łączyć się z NGF lub łączy się specyficznie z NGF (takim jak ludzki NGF). Przeciwciało może łączyć się z tym samym epitopem 6 NGF co przeciwciało wybrane spośród takich mysie przeciwciała monoklonalne: Mab 911, MAb 912 i MAb 938 (Hongo i in., Hybridoma 19:215-227 (2000)).

W niektórych przypadkach antagonista NGF łączy się z receptorem TrkA. Antagonistą NGF może być przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu NGF (anty-hNGF) zdolne do wiązania hNGF i skutecznie hamujące wiązanie hNGF z ludzkim TrkA (hTrkA) i/lub skutecznie hamujące aktywację ludzkiego receptora TrkA.

Powinowactwo wiązania przeciwciała anty-NGF z NGF (takiego jak hNGF) może wynosić około 0,10 do około 1,0 nM, około 0,10 nM do około 0,80 nM, około 0,15 do około 0,75 nM i około 0,18 do około 0,72 nM. Przykładowo, powinowactwo wiązania wynosi pomiędzy około 2 pM i 22 pM, a korzystnie powinowactwo wiązania wynosi około 10 nM, na przykład poniżej 10 nM. W innych przykładach powinowactwo wiązania wynosi około 0,1 nM lub około 0,07 nM, poniżej 0,1 nM lub 0,07 nM, a takż e powinowactwo wiązania może mieć wartość dowolną spoś ród okoł o 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM lub 50 pM do wartości dowolnej spośród 2 pM, 5 pM, 10 pM, 15 pM, 20 pM, lub 40 pM. W niektórych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania może mieć wartość dowolną spośród około 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM lub 50 pM lub poniżej około 50 pM. Dobrze znane w dziedzinie powinowactwo wiązania wyrazić można jako KD lub stałą dysocjacji a zwiększone powinowactwo wiązania odpowiada obniżonej KD. Powinowactwo wiązania mysiego przeciwciała moPL 211 654 B1 noklonalnego 911 anty-NGF (Kongo i in., Hybridoma 19:215-227 (2000) do ludzkiego NGF wynosi około 10 nM a powinowactwo wiązania humanizowanego przeciwciała E3 anty-NGF do ludzkiego NGF wynosi około 0,07 nM.

Antagonistę NGF można podawać przed, podczas, i/lub po zabiegu operacyjnym, nacięciu i/lub zranieniu powodującym lub związanym z bólem pooperacyjnym. Antagonistę NGF podaje się przykładowo przed zabiegiem operacyjnym, nacięciem lub zranieniem. Antagonistę NGF można podawać dowolnymi sposobami znanymi w dziedzinie, obejmującymi podawanie: doustne, dożylne, podskórne, dotętnicze, domięśniowe, dosercowe, dordzeniowe, do klatki piersiowej, dootrzewnowe, dokomorowe, podjęzykowe i/lub przezskórne. Antagonistą NGF jest przykładowo przeciwciało anty-NGF a podawanie obejmuje jeden lub więcej spośród takich sposobów jak: podawanie dożylne, podskórne, poprzez inhalację, dotętnicze, domięśniowe, dosercowe, dokomorowe i dootrzewnowe. Podawanie może być systemowe, np. dożylne lub miejscowe.

W niektórych sytuacjach antagonistę NGF podaje się w dawce okoł o 0,1 do 10 mg/kg masy ciała a w innych rozwiązaniach, antagonistę NGF podaje się w dawce około 0,3 do 2,0 mg/kg masy ciała.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna stosowana w leczeniu i/lub do zapobiegania bólowi pooperacyjnemu zawierająca w skutecznej ilości antagonistę czynnika wzrostu nerwów (NGF), w połączeniu z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami.

Opisano także zestaw do stosowania w którejkolwiek z metod. Taki zestaw może zawierać dowolnych antagonistów NGF, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Zestaw może też zawierać instrukcję stosowania antagonisty NGF w dowolnej metodzie.

Opis rysunków

Fig. 1 przedstawia wykres oceny kumulacyjnej bólu spoczynkowego uzyskanej na 24 godziny przed zabiegiem operacyjnym („dane wyjściowe), 2 godziny po zabiegu operacyjnym („po zabiegu operacyjnym) oraz 1 i 2 dni po zabiegu operacyjnym. „Kontrola oznacza wyniki dla grupy, której nie podano przeciwciała anty-NGF a „911 oznacza wyniki dla zwierząt, którym podano 35 mg/kg przeciwciała 911 anty-NGF (zwanego także „Mab 911). Kongo i in., Hybridoma 19:215-227 (2000). Zastosowanie przeciwciała anty-NGF znacznie zmniejszało pooperacyjny ból spoczynkowy.

Fig. 2 przedstawia wykres oceny bólu termicznego (przeczulica bólowa) uzyskanej 24 godziny przed zabiegiem operacyjnym („dane wyjściowe), 4 godziny po zabiegu operacyjnym („po zabiegu operacyjnym) i 1 i 2 dni po zabiegu operacyjnym. „Kontrola oznacza wyniki dla grupy, której nie podano przeciwciała anty-NGF a „911 oznacza wyniki dla zwierząt, którym podano 35 mg/kg przeciwciała 911 anty-NGF. Zastosowanie przeciwciała anty-NGF znacznie zmniejszało termiczną przeczulicę bólową po zabiegu operacyjnym.

Fig. 3 przedstawia wykres oceny bólu mechanicznego (przeczulica bólowa) w odpowiedzi na stymulację mechaniczną uzyskaną 24 godziny przed zabiegiem operacyjnym („dane wyjściowe), 3 godziny po zabiegu operacyjnym („po zabiegu operacyjnym) oraz 1, 2 i 3 dni po zabiegu operacyjnym. „Kontrola oznacza wyniki dla grupy, której nie podano przeciwciała anty-NGF a „911 oznacza wyniki dla zwierząt, którym podano przeciwciało 911 anty-NGF. Podanie 7 mg/kg przeciwciała antyNGF zmniejszało ból wywołany mechanicznie przez zabieg chirurgiczny.

Fig. 4 przedstawia wykres oceny bólu spoczynkowego uzyskanej 24 godziny po zabiegu operacyjnym, świadczący o tym, że humanizowane przeciwciało E3 anty-NGF w dawce 0,02 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,6 mg/kg, lub 1 mg/kg zmniejszało ból. „* wskazuje różnicę istotną statystycznie (p<0,5) w porównaniu z kontrolą negatywną .

Fig. 5 przedstawia wykres oceny bólu spoczynkowego uzyskanej 24 godziny po zabiegu operacyjnym i świadczy o tym, że humanizowane przeciwciało E3 anty-NGF w dawce 0,5 mg/kg, po wstrzyknięciu dwie godziny po zabiegu operacyjnym, znacznie (p<0,005) zmniejszało ból spoczynkowy.

Fig. 6 przedstawia wykres oceny bólu spoczynkowego uzyskanej 24 godziny po zabiegu operacyjnym i świadczy o tym, że przeciwciało 911 anty-NGF w dawce 5 mg/kg, po wstrzyknięciu 14 dni przed zabiegiem operacyjnym, znacznie zmniejszało ból spoczynkowy (p<0,02).

Fig. 7 przedstawia wykres oceny bólu spoczynkowego uzyskanej 24 godziny po zabiegu operacyjnym i świadczy o tym, że przeciwciało 911 anty-NGF w dawce 5 mg/kg, po wstrzyknięciu 21 dni przed zabiegiem operacyjnym, znacznie zmniejszało ból spoczynkowy.

Fig. 8 przedstawia wykres udziału nienaruszonych ran występujących po nacięciu i potraktowaniu solanką, 1 mg/kg przeciwciałem 911 anty-NGF lub kontrolą pozytywną, ketorolakiem. Udział nienaruszonych ran po potraktowaniu przeciwciałem 911 anty-NGF nie różni się od udziału nienaruszonych ran po potraktowaniu solanką (kontrola negatywna). Zatem, potraktowanie przeciwciałem anty-NGF

PL 211 654 B1 nie miało wpływu na gojenie się ran. Natomiast, u zwierząt którym podano NSAID ketorolak (kontrola pozytywna) obserwowano znacznie zmniejszony udział nienaruszonych ran.

Fig. 9 przedstawia wykres wskazujący, że podanie drobnocząsteczkowego antagonisty NGF, K252a, istotnie (p<0,005) zmniejszało ból spoczynkowy po zabiegu operacyjnym, gdy oceny dokonywano trzy godziny („3H-P-tmt) po zastosowaniu K252a. „IH-P-tmt oznacza 1 godzinę po podaniu K525a.

Fig. 10 przedstawia wykres, na którym porównano wynik zastosowania przeciwciała 911 antyNGF oraz przeciwciała kontrolnego o dopasowanym izotypie. U zwierząt, którym podano przeciwciało anty-NGF (911) w dawce 1 mg/kg, obserwowano istotne zmniejszenie bólu spoczynkowego (p<0,05).

Natomiast, u zwierząt, którym podano przeciwciało kontrolne o dopasowanym izotypie przeciwko białku amnesiac drozofili w dawce 1 mg/kg obserwowano normalne poziomy bólu spoczynkowego. Doświadczenie wykazało, że działanie przeciwbólowe przeciwciała anty-NGF było specyficzne.

Wynalazek ten opiera się na stwierdzeniu, że w celu zapobiegania i/lub leczenia bólu pooperacyjnego można podawać in vivo w terapeutycznie skutecznej ilości antagonistę NGF, takiego jak przeciwciało monoklonalne anty-NGF. Uprzednio, ból pooperacyjny leczono opioidowymi środkami przeciwbólowymi stosowanymi w wysokich dawkach. Środki te wykazywały działania niepożądane, takie jak zmniejszona perystaltyka żołądka, uspokojenie polekowe, depresja oddechowa i kolka nerkowa. Inne środki przeciwbólowe, takie jak NSAID, są względnie nieskuteczne w leczeniu tego typu bólu. Wiadomo też, że pewne NSAID hamują gojenie się ran.

Opisano też sposoby zapobiegania lub leczenia bólu pooperacyjnego u pacjenta (w tym ssaka, zarówno człowieka jak i innych zwierząt) obejmujące podawanie w skutecznej ilości antagonisty NGF takiego jak przeciwciało anty-NGF, na przykład przeciwciało monoklonalne anty-ludzki NGF (anty-hNGF).

Opisano sposoby łagodzenia, opóźniania nasilania i/lub zapobiegania intensyfikacji bólu pooperacyjnego obejmujące podawanie pacjentowi w skutecznej ilości antagonisty NGF.

Ból spoczynkowy tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega, a w niektórych rozwiązaniach, tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega bólowi wywołanemu mechanicznie (taki jak ból wywołany ruchem lub inną stymulacją mechaniczną lub dotykową). W pewnym rozwiązaniu, tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega bólowi wywołanemu stymulacją termiczną. W niektórych rozwiązaniach, ból wywołany mechanicznie tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega przez podawanie przeciwciała anty-NGF. W niektórych rozwiązaniach, ból spoczynkowy tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega przez podawanie przeciwciała anty-NGF. W pewnym rozwiązaniu, ból o podłożu termicznym tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega przez podawanie przeciwciała anty-NGF. W niektórych rozwiązaniach, tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega allodynii, a w niektórych rozwiązaniach tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega przeczulicy bólowej. W jeszcze innych rozwiązaniach, allodynia i/lub przeczulica bólowa ma naturę termiczną lub mechaniczną (dotykową), lub bólu spoczynkowego. W niektórych rozwiązaniach, ból oznacza ból przewlekły. W innych rozwiązaniach, ból związany jest z miejscem nacięcia, zranienia lub urazu, i/lub sąsiaduje z lub pobliżem jednego lub więcej miejsc nacięcia, zranienia, i/lub urazu.

Przedmiotem wynalazku są także kompozycje farmaceutyczne do zastosowania w leczeniu bólu pooperacyjnego zawierające antagonistę NGF, takiego jak przeciwciało anty-NGF, na przykład przeciwciało monoklonalne anty-NGF. Przeciwciało anty-NGF może skutecznie hamować wiązanie NGF z jego receptorem/receptorami TrkA i/lub p75 i/lub skutecznie zapobiegać aktywacji przez NGF jego receptora TrkA i/lub p75.

W praktycznym zastosowaniu wynalazku bę dzie się wykorzystywać , jeś li nie wskazano tego inaczej, znane w dziedzinie, typowe techniki biologii molekularnej (w tym techniki rekombinacyjne), mikrobiologii, biologii komórki, biochemii i immunologii. Takie techniki przedstawiono dokładnie w literaturze, takiej jak, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie (Sambrook, i in., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (red. M.J. Gait, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (red. J.E. Cellis, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (red. R.I. Freshney, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather i P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Methods (red. A. Doile, J.B. Griffiths, i D.G. Newell, 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (red. D.M. Weir i CC. Blackwell); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (red. J.M. Miller i M.P. Calos, 1987); Current Protocols in Molecular Biology (red. P.M. Ausubel, i in., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (red. Mullis, i in., 1994); Current Protocols in Immunology (red. J.E. Coligan i in., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley

PL 211 654 B1 and Sons, 1999); Immunobiology (CA. Janeway i P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (red. D. Catty., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (red. P. Shepherd i C. Dean, Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow i D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Antibodies (red. M. Zanetti i J.D. Capra, Harwood Academic Publishers, 1995).

Termin „przeciwciało (stosowany zamiennie z liczbą mnogą) oznacza immunoglobulinę zdolną do specyficznego związania się z cząsteczką docelową, taką jak węglowodan, polinukleotyd, lipid, polipeptyd itp., przez co najmniej jedno miejsce rozpoznające antygen, zlokalizowane w regionie zmiennym immunoglobuliny. Stosowany tu termin obejmuje nie tylko nienaruszone przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne lecz także ich fragmenty (takie jak Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jednołańcuchowe (ScFv), ich formy zmutowane, białka fuzyjne zawierające część przeciwciała, humanizowane przeciwciała, chimeryczne przeciwciała, liniowe przeciwciała o podwójnej swoistości, jednołańcuchowe przeciwciała, przeciwciała wielospecyficzne (np. przeciwciała dwuspecyficzne) i każdą inną immunoglobulinę o zmodyfikowanej konfiguracji zawierającą miejsce rozpoznające antygen o wymaganej specyficzności. Termin przeciwciało obejmuje przeciwciało dowolnej klasy, takie jak IgG, IgA, lub IgM (lub ich podklas) i nie musi to być przeciwciało z żadnej konkretnej klasy. Zależnie od sekwencji aminokwasowej stałej domeny ciężkich łańcuchów przeciwciała immunoglobuliny można zakwalifikować do różnych klas. Jest pięć głównych klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM a kilka spośród nich można następnie podzielić na podklasy (izotypy) np. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Domeny stały łańcucha ciężkiego odpowiadające za różne klasy immunoglobulin nazwano odpowiednio alfa, delta, epsilon, gamma i mu. Budowa podjednostek i konfiguracje przestrzenne różnych klas immunoglobulin są dobrze znane.

Termin „przeciwciało monoklonalne oznacza homogeniczną populację przeciwciał, przy czym przeciwciało monoklonalne zbudowane jest z aminokwasów (występujących i nie występujących w przyrodzie) zaangażowanych w selektywne wiązanie antygenu. Populacja przeciwciał monoklonalnych jest wysoko specyficzna ponieważ ukierunkowana jest przeciwko jednemu miejscu antygenu. Termin „przeciwciało monoklonalne obejmuje nie tylko nienaruszone przeciwciała monoklonalne i przeciwciała monoklonalne o pełnej długości lecz także ich fragmenty (takie jak Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jednołańcuchowe (ScFv), ich formy zmutowane, białka fuzyjne zawierające część przeciwciała, humanizowane przeciwciała monoklonalne, chimeryczne przeciwciała monoklonalne i każdą inną immunoglobulinę o zmodyfikowanej konfiguracji zawierającą miejsce rozpoznające antygen o wymaganej specyficzności i zdolności do łączenia się z antygenem. W zamierzeniu źródło przeciwciał lub sposób, w który zostały uzyskane (np. dzięki hybrydomie, selekcji fagowej, ekspresji po zrekombinowaniu, zwierzętom transgenicznym itp.) nie stanowią ograniczenia.

Termin przeciwciała „humanizowane dotyczy cząsteczki posiadającej miejsce wiążące antygen pochodzące w zasadzie z immunoglobuliny od gatunku innego niż człowiek a pozostała struktura immunoglobuliny oparta jest o budowę i/lub sekwencję ludzkiej immunoglobuliny. Miejsce wiążące antygen może obejmować całkowicie zmienne domeny połączone ze stałymi domenami lub tylko regiony determinujące dopasowanie (CDR) włączone w odpowiednie obszary zrębowe domen zmiennych. Miejsca wiążące antygeny mogą być typu dzikiego lub mogą być zmodyfikowane dzięki jednej lub więcej substytucjom aminokwasowym, np. zmodyfikowane tak, aby bardziej przypominały ludzką immunoglobulinę. Pewne formy humanizowanych przeciwciał zachowują wszystkie sekwencje CDR (np. humanizowane mysie przeciwciało zawierające wszystkie 6 CDR mysie przeciwciała). Inne formy humanizowanych przeciwciał posiadają jeden lub więcej CDR (1, 2, 3, 4, 5, 6) zmienionych w stosunku do oryginalnego przeciwciała.

W niektórych przypadkach reszty regionu zrębowego (FR) lub inne reszty ludzkiej immunoglobuliny zastąpiono odpowiednimi resztami pochodzenia innego niż ludzkie. Ponadto, humanizowane przeciwciała mogą zawierać reszty nie występujące w przeciwciele biorcy lub w przeciwciele dawcy.

Termin „czynnik wzrostu nerwów i „NGF odnosi się do czynnika wzrostu nerwów i jego wariantów zachowujących co najmniej część aktywności NGF. NGF obejmuje natywną sekwencję NGF wszystkich gatunków ssaków, w tym człowieka, psa, kota, konia lub bydła.

„Receptor NGF oznacza polipeptyd wiązany lub aktywowany przez NGF. Receptory NGF obejmują receptor TrkA i receptor p75 z dowolnego gatunku ssaka, w tym, między innymi, człowieka, psa, kota, konia, naczelnego lub bydła.

Termin „antagonista NGF oznacza dowolną cząsteczkę blokującą, tłumiącą lub zmniejszającą (w tym znacznie) aktywność biologiczną NGF, w tym szlaki transdukcji sygnału w dół, w których po10

PL 211 654 B1 średniczy sygnalizacja NGF, taką jak wiązanie z receptorem i/lub wywołanie odpowiedzi komórkowej na NGF. Termin „antagonista nie sugeruje żadnego specyficznego mechanizmu biologicznego działania i w zamierzeniu obejmuje i dotyczy wszystkich możliwych farmakologicznych, fizjologicznych i biochemicznych oddziaływań z NGF, bezpośrednich lub poś rednich lub oddziaływania z NGF, jego receptorem lub przez inny mechanizm oraz jego rezultatów, które można osiągnąć stosując wiele różnych i chemicznie różniących się kompozycji. Przykłady antagonistów NGF obejmują między innymi, takie jak przeciwciało anty-NGF, antysensowna cząsteczka ukierunkowana na NGF (w tym antysensowna cząsteczka ukierunkowana na kwas nukleinowy kodujący NGF), związek hamujący NGF, analog strukturalny NGF, dominująca-negatywna mutacja receptora TrkA, która powoduje jego łączenie się z NGF, immunoadhezyna TrkA, przeciwciało anty-TrkA, przeciwciało anty-p75 i inhibitor kinazy. Termin „antagonista obejmuje wszystkie uprzednio zidentyfikowane terminy, nazwy, stany funkcjonalne oraz właściwości, dzięki którym sam NGF, aktywność biologiczna NGF (w tym, między innymi, jego zdolność do pośredniczenia w dowolnym aspekcie bólu pooperacyjnego) lub rezultaty aktywności biologicznej, są w dowolnym znaczącym stopniu w istotnej mierze zniesione, zmniejszone lub zneutralizowane. Antagonista NGF (np. przeciwciało) łączy się (fizycznie oddziaływuje) z NGF, łączy się z receptorem NGF (takim jak receptor TrkA i/lub p75), zmniejsza (hamuje i/lub blokuje) sygnalizację w dół od receptora NGF i/lub hamuje (zmniejsza) syntezę , produkcję lub uwalnianie NGF. W innych przypadkach antagonista NGF łączy się z NGF i zapobiega dimeryzacji TrkA i/lub autofosforylacji receptora TrkA. Antagonista NGF może hamować lub zmniejszać syntezę i/lub produkcję (uwalnianie) NGF. Przykłady typów antagonistów NGF są podane.

Stosowany tu termin „przeciwciało anty-NGF oznacza przeciwciało mogące się łączyć z NGF i hamujące aktywność biologiczną NGF i/lub szlak(i) transdukcji sygnału w dół, w których poś redniczy sygnalizacja NGF.

Termin „immunoadhezyna TrkA oznacza rozpuszczalną chimeryczną cząsteczkę zawierającą fragment receptora TrkA, np. pozakomórkową domenę receptora TrkA oraz sekwencję immunoglobuliny, zachowującą specyficzność wiązania receptora TrkA.

Termin „aktywność biologiczna NGF na ogół odnosi się do zdolności do łączenia się z receptorami NGF i/lub aktywowania szlaków sygnalizacyjnych receptora NGF. Bez ograniczenia, aktywność biologiczna tyczy się którejkolwiek jednej lub więcej aktywności spośród takich jak: zdolność do łączenia się z receptorem NGF (takim jak p75 i/lub TrkA), zdolność do wspomagania dimeryzacji i/lub autofosforylacji receptora TrkA, zdolność do aktywowania szlaku sygnalizacyjnego receptora NGF, zdolność do wspomagania różnicowania komórek, proliferacji, przeżywalności, wzrostu i innych zmian w fizjologii komórki, obejmują cych (w przypadku nerwów, w tym nerwu ukł adu obwodowego i oś rodkowego) zmianę w morfologii neuronu, powstawaniu synaps, funkcjonowaniu synaps, uwalnianiu neuroprzekaźników i/lub neuropeptydów i regeneracji po uszkodzeniu oraz zdolność do pośredniczenia w reakcji bólowej po zabiegu pooperacyjnym.

Stosowany tu termin „epitop dotyczy miejsc wiążących dla przeciwciał (monoklonalnych lub poliklonalnych) na antygenach białkowych.

Stosowany tu termin „leczenie oznacza podejście mające na celu otrzymanie korzystnych lub pożądanych wyników klinicznych, co obejmuje między innymi jeden lub więcej wyników spośród takich jak: poprawę w dowolnym aspekcie bólu obejmującą zmniejszenie stanu zaawansowania, złagodzenie jednego lub więcej objawów związanych z bólem pooperacyjnym obejmujących dowolny aspekt bólu pooperacyjnego (takiego jak ból spoczynkowy i/lub ból wywołany mechanicznie, skrócenie czas trwania bólu i/lub zmniejszenie wrażliwości lub podatności na ból).

Termin „skuteczna ilość oznacza ilość wystarczającą do uzyskania korzystnych lub pożądanych wyników klinicznych obejmujących złagodzenie lub zmniejszenie bólu. Skuteczna ilość antagonisty NGF oznacza ilość wystarczającą do leczenia, złagodzenia, zmniejszenia intensywności lub zapobieżenia bólowi pooperacyjnemu. Lek w „skutecznej ilości może zmniejszyć ból w spoczynku (ból spoczynkowy) lub ból wywołany mechanicznie (w tym ból w następstwie ruchu lub oba) i można go podawać przed, podczas i/lub po nacięciu, przecięciu, rozerwaniu lub uszkodzeniu. „Skuteczna ilość oznacza ilość leku, która wystarcza do opóźnienia nasilenia bólu pooperacyjnego.

Termin „zmniejszenie częstości występowania bólu oznacza każde zmniejszenie stanu zaawansowania (które może obejmować zmniejszenie zapotrzebowania i/lub ilości (np. kontaktu z) innych leków i/lub terapii stosowanych na ogół w tych warunkach, obejmujących np. opiaty), czasu trwania, i/lub częstotliwości ataków bólu (w tym, np. opóźnienie nadejścia lub wydłużenie czasu do pojawienia się bólu pooperacyjnego u pacjenta). Fachowcy w dziedzinie rozumieją, że u pacjentów

PL 211 654 B1 może być różna odpowiedź na leczenie, i, jako taki, np. „sposób zmniejszania częstości występowania ataków bólu pooperacyjnego u pacjenta oznacza podawanie opisanego tu antagonisty NGF w oparciu o rozsądne założenie, że podawanie to może prawdopodobnie doprowadzić do zmniejszenia częstości występowania bólu u tego konkretnego pacjenta.

Termin „łagodzenie bólu pooperacyjnego lub jednego lub więcej objawów bólu pooperacyjnego oznacza zmniejszenie lub złagodzenie jednego lub więcej objawów bólu pooperacyjnego w porównaniu z sytuacją bez podawania antagonisty NGF. „Łagodzenie także obejmuje zmniejszenie lub skrócenie czasu trwania objawu.

„Uśmierzanie bólu pooperacyjnego lub jednego lub więcej objawów bólu pooperacyjnego oznacza zmniejszenie zakresu jednego lub więcej niepożądanych objawów klinicznych bólu pooperacyjnego u pacjenta lub populacji pacjentów, którym podano antagonistę NGF zgodnie z wynalazkiem.

Stosowany tu termin „opóźnianie nasilenia bólu pooperacyjnego oznacza przesunięcie w czasie, wstrzymywanie, spowolnienie, powstrzymywanie, ustalenie, i/lub odroczenie nasilenia bólu pooperacyjnego. Długość okresu opóźnienia może być różna, zależnie od historii choroby i/lub leczonego pacjenta. Fachowcy w dziedzinie będą świadomi, że wystarczające lub znaczące opóźnienie może w rezultacie obejmować zapobieganie, tak, aby u pacjenta nie pojawił się ból pooperacyjny. Sposób „opóźniający nasilenie objawu oznacza sposób zmniejszający prawdopodobieństwo wywoływania objawu w danym przedziale czasowym i/lub zmniejszający zakres objawów w danym przedziale czasowym, w porównaniu z sytuacją bez zastosowania tego sposobu. Takie porównania bazują typowo na badaniach klinicznych, z zastosowaniem statystycznie istotnej liczby pacjentów.

Termin „nasilenie lub „rozwój bólu pooperacyjnego oznacza objawy początkowe i/lub późniejszy rozwój zaburzenia. Nasilenie bólu pooperacyjnego można wykryć i oszacować stosując standardowe techniki kliniczne dobrze znane w dziedzinie. Jednakże, nasilenie odnosi się także do rozwoju, który może być niewykrywalny. Nasilenie lub rozwój odnoszą się do przebiegu objawów biologicznych. „Nasilenie obejmuje wystąpienie, nawrót oraz początek.„Początek lub „wystąpienie bólu pooperacyjnego obejmują początek reakcji bólowej i/lub nawrót.

Termin „pacjent oznacza kręgowca, korzystnie ssaka, korzystniej człowieka. Ssaki oznaczają, między innymi, zwierzęta gospodarskie, zwierzęta sportowe, zwierzęta domowe, naczelne, konie, psy, koty, myszy i szczury.

„Ból pooperacyjny (zamiennie z terminem „ból po nacięciu lub „ból pourazowy) odnosi się do bólu wynikającego lub spowodowanego urazem zewnętrznym, takim jak przecięcie, nakłucie, nacięcie, rozerwanie lub zranienie tkanki pacjenta (w tym bólu wywołanego wszystkimi metodami chirurgicznymi, inwazyjnymi lub nieinwazyjnymi). „Ból pooperacyjny nie obejmuje bólu występującego bez zewnętrznego urazu fizycznego i może oznaczać ból wewnętrzny lub zewnętrzny a zranienie, przecięcie, uraz, rozerwanie lub nacięcie może wystąpić przypadkowo (jak w przypadku urazu w wyniku zranienia) lub może być wywołane celowo (jak w przypadku nacięcia chirurgicznego). Stosowany tu termin „ból obejmuje odbieranie bodźców bólowych i odczuwanie bólu a ból można oszacować obiektywnie i subiektywnie, stosując skale bólu i inne metody dobrze znane w dziedzinie. Ból pooperacyjny obejmuje allodynię (tj. nasiloną odpowiedź na normalnie niebólowy bodziec) i przeczulicę bólową (tj. nasiloną odpowiedź na normalnie szkodliwy lub nieprzyjemny bodziec), który z kolei może mieć naturę termiczną lub mechaniczną (dotykową). Ból charakteryzuje się wrażliwością termiczną, wrażliwością mechaniczną i/lub bólem spoczynkowym. Ból pooperacyjny obejmuje ból wywołany mechanicznie lub ból spoczynkowy. Jak dobrze wiadomo w tej dziedzinie ból może być pierwotny lub wtórny.

„Ból spoczynkowy odnosi się do bólu występującego nawet jeśli osobnik jest w spoczynku w przeciwieństwie do np. bólu występującego gdy osobnik porusza się lub poddaje się innym bodźcom mechanicznym (np. uderzanie lub kłucie).

„Ból wywołany mechanicznie (zamiennie z terminem ból mechanosensoryczny) oznacza ból indukowany przez bodziec mechaniczny, taki jak przyłożenie masy do powierzchni, bodziec dotykowy oraz stymulacja wywołana lub związana z ruchem (w tym kaszel, przesunięcie masy itp.).

Rekonwalescencja po zabiegu operacyjnym, urazie lub zranieniu jest „przyśpieszona gdy poprawie ulega aspekt rekonwalescencji po zabiegu operacyjnym, urazie lub zranieniu (w porównaniu z rekonwalescencją po zabiegu operacyjnym, urazie lub zranieniu bez podawania antagonisty NGF). Przykładowo, występowanie i/lub intensywność działań niepożądanych (takich jak działania niepożądane związane z zastosowaniem typowych środków uśmierzających ból (np. opioidu) w porównaniu z występowaniem i/lub intensywnością takich działań niepożądanych bez antagonisty NGF, moż na ograniczyć i/lub wyeliminować stosując antagonistę NGF. Przyśpieszenie to można uzyskać podając

PL 211 654 B1 antagonistę NGF i nie trzeba dodawać, że takie porównanie (podawanie antagonisty NGF w porównaniu z brakiem podawania) musi być prowadzone i dowiedzione dla każdego danego osobnika.

W opisanych metodach odniesienie do antagonisty NGF obejmuje także kompozycje zawierające jeden lub więcej spośród tych środków. Te kompozycje mogą zawierać dalej odpowiednie rozczynniki, takie jak farmaceutycznie dopuszczalne rozczynniki (nośniki) obejmujące bufory, które są dobrze znane w dziedzinie.

Sposoby zapobiegania lub leczenia bólu pooperacyjnego

Rozwiązanie według wynalazku przydatne jest w leczeniu, opóźnianiu nasilania i/lub zapobieganiu bólu pooperacyjnego u pacjentów obejmujących wszystkie ssaki, zarówno człowieka jak i inne zwierzęta. Ponadto, rozwiązanie według wynalazku przydatne jest dla pacjentów z przerwaniem ciągłości tkanki, takim jak przecięcie, nakłucie lub rozerwanie, wewnętrznym lub zewnętrznym. Takie przerwanie ciągłości może wystąpić przypadkowo jak w przypadku urazu w wyniku zranienia lub może być wywołane celowo jak w przypadku zabiegu operacyjnego.

Opisano sposoby leczenia bólu pooperacyjnego u pacjenta obejmujące podawanie w skutecznej ilości antagonisty NGF, takiego jak przeciwciało anty-NGF. W niektórych przypadkach ból pooperacyjny obejmuje jedną lub więcej spośród reakcji bólowych takich jak: allodynia, przeczulica bólowa, ból wywołany mechanicznie, ból o podłożu termicznym, ból wywołany mechanicznie lub ból spoczynkowy. Ból pooperacyjny może obejmować ból wywołany mechanicznie i/lub ból spoczynkowy. Twórcy wynalazku zaobserwowali np. że przeciwciała anty-NGF łagodzą oba przypadki. W innych sytuacjach ból pooperacyjny obejmuje ból spoczynkowy. Ból może być pierwotny i/lub wtórny. Poza tym tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega allodynii a także tłumi się, łagodzi i/lub zapobiega przeczulicy bólowej. Allodynia i/lub przeczulica bólowa mają naturę termiczną lub mechaniczną (dotykową) (lub obie) lub bólu spoczynkowego. Ból związany jest z miejscem nacięcia, zranienia lub urazu i/lub sąsiaduje z lub pobliską okolicą jednego lub więcej miejsc nacięcia, zranienia, i/lub urazu.

Antagonistę NGF, takie jak przeciwciało anty-NGF, podaje się przed zabiegiem operacyjnym (przed aktywnością, która spowoduje prawdopodobnie uraz zewnętrzny i/lub zranienie). Przykładowo, antagonistę NGF można podawać na 30 minut, 1 godzinę, 5 godzin, 10 godzin, 15 godzin, 24 godziny lub nawet dłużej, jak np. 1 dzień, kilka dni lub nawet tydzień, dwa tygodnie, trzy tygodnie lub dłużej przed aktywnością grożącą urazem, zranieniem lub nacięciem lub przed operacją (np. powodującą uraz, zranienie lub nacięcie). W innych przypadkach antagonistę NGF podaje się podczas i/lub po zabiegu operacyjnym lub aktywności, która prawdopodobnie spowoduje uraz zewnętrzny lub zranienie. Antagonistę NGF podaje się 1 godzinę, 2 godziny, 3 godziny, 4 godziny, 6 godzin, 8 godzin, 12 godzin, 24 godziny, 30 godzin, 36 godzin lub dłużej, po zabiegu operacyjnym, zranieniu lub urazie.

Stosowany tu termin „podnoszenie progu bólu odnosi się do zmniejszania, ograniczania i/lub minimalizacji bólu związanego z zabiegiem operacyjnym, nacięciem, urazem lub zranieniem (w tym zmniejszonym, ograniczonym i/lub zminimalizowanym subiektywnym odczuciu bólu).

Omówiono też sposoby przyśpieszania rekonwalescencji po zabiegu operacyjnym (jak również przyśpieszenia rekonwalescencji po zranieniu, urazie uszkodzeniu i/lub nacięciu).

Wiadomo, że chociaż odniesienia dotyczą na ogół leczenia lub zapobiegania bólowi pooperacyjnemu, antagonistę NGF można podawać przed zdarzeniem lub stanem(ami) o zwiększonym ryzyku wystąpienia urazu zewnętrznego (takim jak uderzenie), uszkodzeniem lub zranieniem. Dla fachowca w dziedzinie zrozumiałe jest, że zdarzenie lub stan o zwiększonym ryzyku urazu zewnętrznego, uszkodzenia lub zranienia obejmuje niebezpieczne zajęcia, walkę i/lub aktywność sportową.

Diagnoza lub ocena bólu są dobrze znane w dziedzinie. Oceny można dokonać bazując na ocenie obiektywnej, takiej jak obserwacja zachowania jak np. reakcja na bodźce, wyrazy twarzy itp. Oceny można także dokonać bazując na ocenach subiektywnych, takich jak scharakteryzowanie bólu przez pacjenta z zastosowaniem różnych skali bólu [np. Katz i in., Surg Clin North Am. (1999) 79 (2):231-52; Caraceni i in. J Pain Symptom Manage (2002) 23 (3) :239-55].

Ulgę w bólu może także charakteryzować przebieg uśmierzania bólu. Zgodnie z tym, w niektórych rozwiązaniach, ulgę w bólu obserwuje się subiektywnie lub obiektywnie po 1, 2 lub po kilku godzinach (a w niektórych rozwiązaniach, osiąga ona maksymalna wartość po około 12-18 godzinach).

W innym przypadku ulgę w bólu obserwuje się subiektywnie lub obiektywnie 24, 36, 48, 60, 72 lub więcej godzin po zabiegu operacyjnym (lub zdarzeniu związanym ze zranieniem lub urazem).

Antagoniści NGF

W rozwiązaniu według wynalazku zastosowano antagonistę NGF, który oznacza dowolną cząsteczkę blokującą, tłumiącą lub zmniejszającą (w tym znacznie) aktywność biologiczną NGF, w tym

PL 211 654 B1 szlaki transdukcji sygnału w dół, w których pośredniczy sygnalizacja NGF, taką jak wiązanie z receptorem i/lub wywołanie odpowiedzi komórkowej na NGF. Termin „antagonista nie sugeruje żadnego specyficznego mechanizmu biologicznego działania i w zamierzeniu obejmuje i dotyczy wszystkich możliwych farmakologicznych, fizjologicznych i biochemicznych oddziaływań z NGF oraz jego rezultatów, które można osiągnąć stosując wiele różnych i chemicznie różniących się, kompozycji. Przykłady antagonistów NGF obejmują między innymi, takie jak przeciwciało anty-NGF, antysensowna cząsteczka ukierunkowana na NGF (w tym antysensowna cząsteczka ukierunkowana na kwas nukleinowy kodujący NGF), antysensowna cząsteczka ukierunkowana na receptor NGF (taki jak receptor TrkA i/lub p75) (w tym antysensowna cząsteczka ukierunkowana na kwas nukleinowy kodujący TrkA i/lub p75), związek hamujący NGF, analog strukturalny NGF, dominująca-negatywna mutacja receptora TrkA, która powoduje jego łączenie się z NGF, immunoadhezyna TrkA, przeciwciało anty-TrkA, przeciwciało anty-p75 i inhibitor kinazy. Dla tego wynalazku zrozumiałe będzie, że termin „antagonista obejmuje wszystkie uprzednio zidentyfikowane terminy, nazwy, stany funkcjonalne oraz właściwości, dzięki którym sam NGF, aktywność biologiczna NGF (w tym między innymi jego zdolność do pośredniczenia w dowolnym aspekcie bólu pooperacyjnego) lub rezultaty aktywności biologicznej, są w dowolnym znaczącym stopniu w istotnej mierze zniesione, zmniejszone, lub zneutralizowane. Antagonista NGF (np. przeciwciało) łączy się (fizycznie oddziaływuje) z NGF, łączy się z receptorem NGF (takim jak receptor TrkA i/lub p75) i/lub zmniejsza (hamuje i/lub blokuje) sygnalizację w dół od receptora NGF.

W niektórych rozwią zaniach antagonista NGF łączy się (oddział uje fizycznie) z NGF lub antagonista NGF łączy się z receptorem NGF (takim jak receptor TrkA lub p75). W jeszcze innych rozwiązaniach antagonista NGF zmniejsza (hamuje i/lub blokuje) sygnalizację w dół od receptora NGF (np. inhibitory sygnalizacji przez kinazę) lub antagonista NGF hamuje (zmniejsza) syntezę i/lub uwalnianie NGF czy antagonistą NGF jest antagonista NGF, nie będący immunoadhezyną TrkA (tj. inny niż immunoadhezyna TrkA).

Antagonistą NGF może być inny niż przeciwciało anty-NGF lub inny niż immunoadhezyna TrkA i inny niż przeciwciał o anty-NGF. Antagonista NGF moż e łączyć się z NGF (takim jak hNGF) i w niewielkim stopniu łączyć się z pokrewnymi neurotrofinami, jak np. NT-3, NT4/5, i/lub BDNF. W niektórych sytuacjach antagonista NGF nie jest związany ze szkodliwą odpowiedzią immunologiczną.

Przeciwciało anty-NGF jest humanizowane (jak np. przeciwciało E3) lub przeciwciałem anty-NGF jest przeciwciało E3 a w innych rozwiązaniach, przeciwciało anty-NGF zawiera jeden lub więcej CDR przeciwciała E3 (jak np. 1, 2, 3, 4, 5 lub nawet wszystkie 6 CDR z E3). W innych przypadkach przeciwciało jest przeciwciałem ludzkim. W jeszcze innych przypadkach przeciwciało anty-NGF zawiera sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przedstawioną w tablicy 1 (SEQ ID nr 1) i sekwencję aminokwasową regionu zmiennego lekkiego łańcucha przedstawioną w tablicy 2 (SEQ ID nr 2). W jeszcze innych przypadkach przeciwciał o zawiera zmodyfikowany region stały, taki jak region stały będący immunologicznie obojętny, np. nie zapoczątkowuje on lizy przy udziale dopełniacza lub nie stymuluje cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). W innych przypadkach region stały zmodyfikowano jak opisano w Eur. J. Immunol. (1999) 2 9:2 613-2624, GB99/01441 i UK98099518.

Przeciwciała anty-NGF

W niektórych rozwiązaniach według wynalazku, antagonista NGF obejmuje przeciwciało anty-NGF. Przeciwciało anty-NGF powinno wykazywać którąkolwiek jedną lub więcej spośród takich właściwości jak: (a) łączenie się z NGF; (b) hamowanie aktywności biologicznej NGF lub szlaków transdukcji sygnału w dół, w których pośredniczy sygnalizacja NGF; (c) zapobieganie, łagodzenie, lub leczenie dowolnego aspektu bólu pooperacyjnego; (d) blokowanie lub zmniejszanie aktywacji receptora NGF (w tym dimeryzacji i/lub autofosforylacji receptora TrkA); (e) zwiększanie klirensu NGF; (f) hamowanie (zmniejszanie) syntezy, produkcji lub uwalniania NGF; (g) przyśpieszanie rekonwalescencji po zabiegu operacyjnym, zranieniu lub urazie.

Przeciwciała anty-NGF są znane w dziedzinie, np. WO 01/78698, WO 01/64247, US5844092, US5877016 i US6153189, Hongo i in., Hybridoma, 19:215-227 (2000); Cell Molec. Biol. 13:559-568 (1993), GenBank U39608, U39609, LI7078 lub LI7077.

W niektórych przypadkach przeciwciało anty-NGF jest humanizowanym mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-NGF zwanym przeciwciałem „E3, zawierającym region stały łańcucha ciężkiego ludzkiego IgG2a z następującymi mutacjami: A330P331 do S330S331 (numeracja aminokwasów w odniesieniu do sekwencji IgG2a typu dzikiego, Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624); region stały

PL 211 654 B1 ludzkiego lekkiego łańcucha kappa i zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha pokazane w tablicach 1 i 2.

Tablica 1: region zmienny łańcucha ciężkiego

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWTRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNS

AVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVS (SEQ ID NO:1).

Tablica 2: region zmienny łańcucha lekkiego

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSR

FSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRT (SEQ ID

NO:2) .

Poniższe polinukleotydy kodujące region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmienny lekkiego łańcucha zdeponowano w ATCC 8 stycznia 2003

Materiał		Nr dostępowy ATCC	Dane o depozycie
Wektor Eb.911.3E	region V lekkiego łańcucha E3	PTA-4893	8 styczeń 2003
Wektor Eb.pur.911.3E	region V lekkiego łańcucha E3	PTA-4894	8 styczeń 2003
Wektor Db.911.3E	region V łańcucha ciężkiego E3	PTA-4895	8 styczeń 2003

Wektor Eb.911.3E jest polinukleotydem kodującym region zmienny lekkiego łańcucha przedstawiony w tablicy 2, wektor Eb.pur.911.3E jest polinukleotydem kodującym region zmienny lekkiego łańcucha przedstawiony w tablicy 2 a wektor Db.911.3E jest polinukleotydem kodującym region zmienny łańcucha ciężkiego przedstawiony w tablicy 1.

W innym rozwiązaniu, przeciwciało anty-NGF zawiera jeden lub więcej CDR przeciwciała E3 (jak np. 1, 2, 3, 4, 5 lub w niektórych rozwiązaniach, wszystkie 6 CDR z E3). Sposób określania regionów CDR jest dobrze znany w dziedzinie.

Przeciwciała przydatne według wynalazku mogą obejmować przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, fragmenty przeciwciał (np. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc itp.), chimeryczne przeciwciała, przeciwciała dwuspecyficzne, przeciwciała będące heterokoniugatami, jednołańcuchowe (ScFv), ich formy zmutowane, białka fuzyjne zawierające część przeciwciała, humanizowane przeciwciała i każ d ą inną immunoglobulinę o zmodyfikowanej konfiguracji zawierają c ą miejsce rozpoznają ce antygen o wymaganej specyficzności, obejmujące warianty przeciwciał o różnej glikozylacji, warianty przeciwciał o różnej sekwencji aminokwasowej oraz kowalencyjnie zmodyfikowane przeciwciała. Przeciwciała mogą być przeciwciałami mysimi, szczurzymi, ludzkimi lub o każdym innym pochodzeniu (w tym przeciwciała chimeryczne lub humanizowane). Według wynalazku przeciwciało reaguje z NGF tak, że hamuje NGF i/lub szlaki transdukcji sygnału w dół, w których pośredniczy sygnalizacja NGF.

W jednym rozwią zaniu, przeciwciał o jest ludzkim przeciwciałem rozpoznają cym jeden lub wię cej epitopów na ludzkim NGF. W innym rozwiązaniu, przeciwciało jest mysim lub szczurzym przeciwciałem rozpoznającym jeden lub więcej epitopów na ludzkim NGF. W innym rozwiązaniu, przeciwciało rozpoznaje jeden lub więcej epitopów na NGF wybranym z grupy obejmującej NGF: naczelnego, psa, kota, konia, i bydła. W innych rozwiązaniach, przeciwciało zawiera zmodyfikowany region stały, taki jak region stały będący immunologicznie obojętny, np. nie zapoczątkowuje on lizy przy udziale dopełniacza, lub nie stymuluje cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC). Aktywność ADCC można oszacować stosując metody ujawnione w opisie US 5500362. W innych rozwiązaniach, region stały zmodyfikowano jak opisano w Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624, GB99/01441 i/lub UK98099518.

PL 211 654 B1

Powinowactwo wiązania przeciwciała anty-NGF z NGF (takiego jak hNGF) może wynosić około 0,10 do około 0,80 nM, około 0,15 do około 0,75 nM i około 0,18 do około 0,72 nM. W jednym rozwiązaniu, powinowactwo wiązania wynosi pomiędzy około 2 pM i 22 pM. W pewnym rozwiązaniu, powinowactwo wiązania wynosi około 10 nM. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi poniżej około 10 nM. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi około 0,1 nM lub około 0,07 nM. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi poniżej około 0,1 nM, lub poniżej około 0,07 nM. W innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania ma wartość dowolną spośród około 100 nM, około 50 nM, około 10 nM, około 1 nM, około 500 pM, około 100 pM, lub około 50 pM do wartości dowolnej spośród około 2 pM, około 5 pM, około 10 pM, około 15 pM, około 20 pM, lub około 40 pM. W niektórych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania ma wartość dowolną spośród około 100 nM, około 50 nM, około 10 nM, około 1 nM, około 500 pM, około 100 pM, lub około 50 pM, lub poniżej około 50 pM. W niektórych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi poniżej wartości dowolnej spośród około 100 nM, około 50 nM, około 10 nM, około 1 nM, około 500 pM, około 100 pM, lub około 50 pM. W jeszcze innych rozwiązaniach, powinowactwo wiązania wynosi około 2 pM, około 5 pM, około 10 pM, około 15 pM, około 20 pM, około 40 pM, lub powyżej około 40 pM.

Jednym sposobem określania powinowactwa wiązania przeciwciał do NGF jest ocena powinowactwa wiązania jednofunkcyjnych fragmentów przeciwciał Fab. W celu uzyskania jednofunkcyjnych fragmentów Fab, przeciwciało (np. IgG) można pociąć papaina lub uzyskać ekspresję po zrekombinowaniu. Powinowactwo fragmentów Fab przeciwciał anty-NGF można określić metodą rezonansu plazmonów powierzchniowych (BIAcore3000^TM układ rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR), BIAcore, INC, Piscaway NJ). Czipy CMS można aktywować chlorowodorkiem N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) i N-hydroksysukcynoimidem (NHS) zgodnie z instrukcjami producenta. Ludzki NGF (lub dowolny inny NGF) można rozcieńczyć 10 mM octanem sodu pH 4,0 i wstrzykiwać nad aktywowanym chipem w stężeniu 0,005 mg/ml. Stosując zmienny czas przepływu przez osobne kanały chipa, można osiągnąć dwa zakresy gęstości antygenu: 100-200 jednostek odpowiedzi (RU) dla szczegółowych badań kinetyki i 500-600 RU dla testów klasyfikujących. Chip można zablokować stosując etanoloaminę. Badania regeneracyjne wykazały, że mieszanina buforu do wymywania Pierce (produkt nr 21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) i 4 M NaCl (2:1) skutecznie usuwa związany Fab przy jednoczesnym zachowaniu aktywności hNGF na chipie przez ponad 200 iniekcji. W testach zastosowano bufor BIAcore HBSEP (0,01M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3mM EDTA,

0,005% surfaktant P29). Rozcieńczenia seryjne (0,1-10x określona KD) oczyszczonych próbek Fab wstrzykiwano przez 1 minutę przy 100 μΐ/minutę i umożliwiono dysocjację aż przez 2 godziny. Stężenia białek Fab określono metodą ELISA i/lub elektroforezą SDS-PAGE stosując jako standard Fab w znanym stężeniu (co określono analizą aminokwasową). Kinetyczne szybkości asocjacji (kon) i szybkości dysocjacji (koff) otrzymano jednocześnie dopasowując dane do modelu wiązania Langmuira 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) stosując program BIAevaluation. Wartości stałej równowagi reakcji dysocjacji (KD) obliczono jako koff/kon. Protokół jest odpowiedni do zastosowania w określaniu powinowactwa wiązania przeciwciał do dowolnego NGF, w tym NGF człowieka, NGF innego kręgowca (w niektórych rozwiązaniach, ssaka) (takich jak NGF myszy, NGF szczura, NGF naczelnego), jak również do zastosowania z innymi neurotrofinami, takimi jak pokrewne neurotrofiny NTS, NT4/5 i/lub BDNF.

W niektórych rozwiązaniach, przeciwciało łączy się z ludzkim NGF, i w niewielkim stopniu łączy się z NGF innych kręgowców (w pewnym rozwiązaniu, ssaka). W niektórych rozwiązaniach, przeciwciało łączy się z ludzkim NGF jak również z jednym lub więcej NGF innych kręgowców (w niektórych rozwiązaniach, ssaka). W jeszcze innych rozwiązaniach, przeciwciało łączy się z NGF i nieznacznie wiąże się krzyżowo z innymi neurotrofinami (takimi jak pokrewne neurotrofiny, NTS, NT4/5, i/lub BDNF). W niektórych rozwiązaniach, przeciwciało łączy się z NGF jak również co najmniej jedną inną neurotrofiną. W niektórych rozwiązaniach, przeciwciało łączy się z NGF ssaków, takich jak koń lub pies, lecz w niewielkim stopniu łączy się z NGF innych ssaków.

Epitop(y) mogą być ciągłe lub nieciągłe. W jednym rozwiązaniu, przeciwciało łączy się w zasadzie z tymi samymi epitopami hNGF co przeciwciało wybrane z grupy obejmującej MAb 911, MAb 912, i MAb 938 jak opisano w: Kongo i in., Hybridoma, 19:215-227 (2000). W innym rozwiązaniu, przeciwciało łączy się w zasadzie z tym samym epitopem hNGF co MAb 911. W jeszcze innym rozwiązaniu, przeciwciało łączy się w zasadzie z tym samym epitopem co MAb 909. Kongo i in., powyżej. Przykładowo, epitop może zawierać jedną lub więcej spośród reszt: K32, K34 i E35 w regionie zmiennym 1 (aminokwasy 23-35) hNGF; reszt F79 i T81 w regionie zmiennym 4 (aminokwasy 81-88) hNGF; reszt

PL 211 654 B1

H84 i K88 w regionie zmiennym 4; resztę R103 pomiędzy regionem zmiennym 5 (aminokwasy 94-98) hNGF i C-końcem (aminokwasy 111-118) hNGF; resztę E11 w regionie pre-zmiennym 1 (aminokwasy 10-23) hNGF; Y52 pomiędzy regionem zmiennym 2 (aminokwasy 40-49) hNGF i regionem zmiennym 3 (aminokwasy 59-66) hNGF; reszty L112 i S113 w C-końcu hNGF; reszty R59 i R69 w regionie zmiennym 3 hNGF; lub reszty V18, V20, i G23 w regionie pre-zmiennym 1 hNGF. Ponadto, epitop może zawierać jeden lub więcej region zmienny 1, region zmienny 3, region zmienny 4, region zmienny 5, region N-końca, i/lub C-koniec hNGF. W jeszcze innym rozwiązaniu, przeciwciało znacznie zmniejsza dostęp rozpuszczalnika do reszty R103 hNGF. Zrozumiałe jest, że chociaż epitopy opisane powyżej odnoszą się do ludzkiego NGF, fachowiec może porównać sekwencję ludzkiego NGF z NGF innych gatunków i zidentyfikować przypuszczalne odpowiedniki tych epitopów.

W jednym aspekcie, przeciwciała (np. ludzkie, humanizowane, mysie, chimeryczne) hamujące NGF można uzyskać stosując immunogeny o pełnej lub częściowej sekwencji NGF. Zgodnie z innym aspektem, można zastosować zawierającą immunogen komórkę, w której dochodzi do nadmiernej ekspresji NGF. Innym przykładem immunogenu, który można zastosować jest białko NGF obejmujące NGF pełnej długości lub część białka NGF.

Przeciwciała anty-NGF można uzyskać stosując dowolną metodę znaną w dziedzinie. Droga i harmonogram immunizacji zwierzę cia gospodarza odpowiadają na ogół ustalonym i typowym technikom do stymulacji i produkcji przeciwciał, opisanych tu poniżej. Ogólne techniki produkcji ludzkich i mysich przeciwciał są znane w dziedzinie i tu opisane.

Rozpatruje się, czy można manipulować dowolnym ssakiem w tym ludźmi lub pochodzącymi od nich komórkami produkującymi przeciwciała tak, aby służyły za podstawę do produkcji ssaczych, w tym ludzkich, linii komórkowych typu hybrydomy. Typowo, zwierzę ciu gospodarzowi wstrzykuje się dootrzewnowe, domięśniowo, doustnie, podskórnie, do spodniej strony stopy, i/lub doskórnie immunogenen w ilości takiej jak to tu opisano.

Hybrydomy można wytworzyć z limfocytów i unieśmiertelnionych komórek szpiczaka stosując ogólną technikę hybrydyzacji komórek somatycznych Kohlera, B. i Milsteina, C. (1975) Nature 256:495-497 lub zmodyfikowaną przez Bucka, D. W., i in., In Vitro, 18:377-381 (1982). Dostępne linie szpiczaka, obejmujące między innymi X63-Ag8.653 i te z Salk Institute, Cell Distribution Centrum, San Diego, Calif., USA, można stosować w hybrydyzacji. Generalnie, technika obejmuje fuzję komórek szpiczaka z komórkami limfoidalnymi z zastosowaniem fuzogenu takiego jak glikol polietylenowy, lub metodą elektryczną dobrze znaną fachowcom w dziedzinie. Po połączeniu komórki oddziela się od medium fuzyjnego i hoduje w pożywce do hodowli selekcyjnej, takiej jak hypoksantyna-aminopteryna-tymidyna (HAT), w celu wyeliminowania niezhybrydyzowanych komórek wyjściowych. Do hodowli hybrydom wydzielających przeciwciała monoklonalne można stosować dowolne opisane tu pożywki, z dodatkiem surowicy lub bez. Alternatywnie do techniki fuzji komórek, w celu wytworzenia przeciwciał monoklonalnych anty-NGF według wynalazku można zastosować unieśmiertelnione limfocyty B EBV. Jeśli to pożądane hybrydomy się namnaża i klonuje a supernatanty bada się pod kątem aktywności antyimmunogowej stosując typowe testy immunologiczne (np. test radioimmunologiczny, enzymatyczny test immunologiczny lub fluorescencyjny test immunologiczny).

Hybrydomy, które można stosować jako źródło przeciwciał obejmują wszystkie pochodne, komórki potomne hybrydom wyjściowych produkujące przeciwciała monoklonalne specyficzne względem NGF lub jego części.

Hybrydomy wytwarzające takie przeciwciała można hodować in vitro lub in vivo przy zastosowaniu znanych metod. Przeciwciała monoklonalne można wydzielić z pożywek hodowlanych lub płynów ustrojowych, posługując się typowymi metodami oczyszczania immunoglobulin, takimi jak wytrącanie przy zastosowaniu siarczanu amoniowego, elektroforeza w żelu, dializa, chromatografia i ultrafiltracja, jeśli to pożądane. Niepożądaną aktywność, jeśli występuje, można usunąć, np. przepuszczając preparat przez adsorbenty wykonane z immunogenu przyłączonego do fazy stałej i eluując lub uwalniając pożądane przeciwciała od immunogenu. Immunizacja zwierzęcia gospodarza ludzkim NGF lub fragmentem zawierającym docelową sekwencję aminokwasową sprzężoną z białkiem immunogennym dla gatunków immunizowanych, np. hemocjaniną Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin), albuminą osocza, tyroglobuliną bydlęcą, lub sojowym inhibitorem trypsyny z zastosowaniem środka dwufunkcyjnego lub derywatyzującego, np. maleinianobenzoilosulfosukcynoimidu (sprzęganie przez reszty cysteinowe), N-hydroksysukcynoimidu (przez reszty lizynowe), glutaraldehydu, bezwodnika kwasu bursztynowego, SOCI2 lub R1N=C=NR, w którym R i R1 oznaczają różne grupy alkilowe, może dać w rezultacie populację przeciwciał (np. przeciwciał monoklonalnych).

PL 211 654 B1

Jeśli to pożądane, interesujące przeciwciało anty-NGF (monoklonalne lub poliklonalne) można zsekwencjonować a sekwencję polinukleotydową można następnie wklonować w wektor w celu ekspresji lub namnożenia. Sekwencję kodującą interesujące przeciwciało można utrzymywać w wektorze w komórce gospodarzu a komórkę gospodarza mo ż na dalej namnaż a ć i zamrozić do zastosowania w przyszł o ś ci. Alternatywnie, sekwencję polinukleotydową moż na poddać manipulacji genetycznej w celu „zhumanizowania przeciwciała lub zwię kszenia powinowactwa lub innych wł a ś ciwoś ci przeciwciał. Przykładowo, region stały można tak zaprojektować aby bardziej przypominał ludzkie regiony stałe w celu uniknięcia odpowiedzi immunologicznej w przypadku zastosowania przeciwciała w próbach klinicznych i w leczeniu ludzi. Pożądane może być, aby tak manipulować sekwencją przeciwciał, aby uzyskać większe powinowactwo względem NGF i większą efektywność hamowania NGF. Dla fachowca w dziedzinie będzie oczywiste, że w polinukleotydach przeciwciała anty-NGF można dokonać jednej lub więcej zmian i nadal zachować jego zdolność do wiązania NGF.

Są cztery ogólne etapy humanizowania przeciwciała monoklonalnego. Są to: (1) określanie nukleotydu i przewidywanej sekwencji aminokwasowej domen zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego wyjściowego przeciwciała (2) zaprojektowanie humanizowanego przeciwciała, zadecydowanie, który region zrębowy przeciwciała zastosować w procesie humanizowania (3) zastosowanie współczesnych metodologii/technik humanizowania i (4) transfekcja i ekspresja humanizowanego przeciwciała [np.US4816567, US5807715, US5866692, US6331415, US5530101, US5693761, US5693762, US5585089 i US6180370].

Opisano wiele „humanizowanych cząsteczek przeciwciał zawierających miejsce wiążące antygen od immunoglobulin pochodzących od innych gatunków niż człowiek, w tym chimeryczne przeciwciała posiadające niezmodyfikowane lub zmodyfikowane regiony V od gryzonia i ich przyłączone regiony determinujące dopasowanie (CDR) skondensowane z ludzkimi domenami stałymi. Patrz, np. Winter i in. Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio i in. Proc. Nat. Acad. Set. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw i in. J Immunol. 138:4534-4538 (1987) i Brown i in. Cancer Res. 47:3577- 3583 (1987). W innych pozycjach literatury opisano CDR do gryzoni przeszczepione na ludzki podtrzymujący region zrębowy (FR) przed fuzją z odpowiednią domeną stałą ludzkiego przeciwciała [np. Riechmann i in. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen i in. Science 239:1534-1536 (1988), i Jones i in. Nature 321:522-525 (1986)].

W innych publikacjach literatury opisano CDR od gryzoni wsparty przez „opakowane przy zastosowaniu technik rekombinacyjnych obszary zrębowe od gryzonia [np. EP 0519596]. Te „humanizowane cząsteczki zaprojektowano tak, aby zminimalizować niepożądaną odpowiedź immunologiczną przeciwko przeciwciałom gryzoniom anty-człowiek, co ogranicza czas trwania i skuteczność zastosowania terapeutycznego tych grup u ludzi. Przykładowo, region stały przeciwciała można tak zaprojektować, aby był on immunologicznie obojętny (np. nie zapoczątkowywał lizy z udziałem dopełniacza) [np. GB99/01441, UK98099518]. Inne metody humanizowania przeciwciał, które także można zastosować opisali Daugherty i in., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991) oraz ujawniono w US6180377, US6054297, US5997867, US5866692, US6210671, US6350861 i WO 01/27160].

W jeszcze innym alternatywnym rozwiązaniu, całkowicie ludzkie przeciwciała można otrzymać stosując dostępne w handlu myszy zmodyfikowane tak, aby dochodziło u nich do ekspresji specyficznych białek ludzkich immunoglobulin.

W celu wytworzenia humanizowanych lub ludzkich przeciwciał można także zastosować zwierzęta transgeniczne zaprojektowane w celu wytwarzania bardziej pożądanych (np. całkowicie ludzkich przeciwciał) lub dla silniejszej odpowiedzi immunologicznej. Rezultatem tej technologii są np. Kenomouse^TM firmy Abgenix, Inc. (Fremont, CA) i HuMAb-Mouse^® i TC Mouse^TM firmy Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

Alternatywnie, przeciwciała można wytworzyć przy zastosowaniu technik rekombinacyjnych i uzyskać ich ekspresję stosując dowolną metodę znaną w dziedzinie. W innym alternatywnym rozwiązaniu, przeciwciała można wytworzyć przy zastosowaniu technik rekombinacyjnych dzięki prezentacji fagowej [US5565332, US5580717, US5733743 i US6265150 i Winter i in., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)]. Alternatywnie, prezentację fagową (McCafferty i in., Nature 348:552-553 (1990)) można stosować w celu wytworzenia ludzkich przeciwciał i fragmentów przeciwciał in vitro, z repertuaru zmiennych (V) domen genu immunoglobuliny nieimmunizowanych dawców. Zgodnie z tą techniką, geny domeny V przeciwciał klonuje się w ramce do genu głównego lub mniejszego białka osłonki bakteriofaga filamentowego, takiego jak M13 lub fd, i uzyskuje ich prezentacje w postaci funkcjonalnych fragmentów przeciwciał na powierzchni cząstki faga. Ponieważ cząstka filamentowa zawiera kopię

PL 211 654 B1 jednoniciowego DNA genomu faga, selekcje w oparciu o funkcjonalne właściwości przeciwciał także dają gen kodujący przeciwciało wykazujące te właściwości. Zatem, fag naśladuje pewne właściwości limfocyta B. Prezentację fagową można zrealizować w różnych formatach; artykuły przeglądowe, patrz, np. Johnson, Kevin S. i Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Do prezentacji fagowej można zastosować kilka źródeł segmentów genu V. Clackson i in., Nature 352:624-628 (1991) wydzielili szereg przeciwciał anty-oksazolon z małej losowej biblioteki kombinatorycznej genów V pochodzących ze śledzion immunizowanych myszy. Posługując się nieimmunizowanymi ludzkimi dawcami można skonstruować repertuar genów V a przeciwciała przeciwko szeregu antygenom (w tym własnym antygenom) można wydzielić posługując się następującymi technikami opisanymi w: Mark i in., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) lub Griffith i in., EMBO J. 12:725-734 (1993). W naturalnej odpowiedzi immunologicznej, w genach przeciwciał z dużą szybkością gromadzą się mutacje (hipermutacja somatyczna). Niektóre z tych zmian nadadzą większe powinowactwo, a limfocyty B posiadające immunoglobulinę powierzchniową o wysokim powinowactwie namnażają się w sposób preferencyjny i róż nicują w trakcie kolejnego naraż enia na antygen. Stosując technikę znaną jako „tasowanie łańcucha można naśladować proces naturalny. Marks, i in., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). W tej metodzie, powinowactwo „pierwotnych ludzkich przeciwciał otrzymanych w wyniku prezentacji fagowej można ulepszyć zastępując kolejno geny regionu V ciężkiego i lekkiego łańcucha repertuarem naturalnie występujących wariantów genów domen V otrzymanych od nieimmunizowanych dawców. Technika ta umożliwia produkcję przeciwciał i fragmentów przeciwciał o powinowactwie w zakresie pM-nM. Strategię otrzymywania bardzo duż ego repertuaru przeciwciał fagowych (znaną także jako „matkę wszystkich bibliotek) opisali: Waterhouse i in., Nucl Acids. Res. 21:2265-2266 (1993). W celu uzyskania ludzkich przeciwciał z przeciwciał gryzoni można także zastosować tasowanie genu, gdy powinowactwo ludzkiego przeciwciała jest podobne do powinowactwa i specyficzności wyjściowego przeciwciała gryzonia. Zgodnie z tą metodą, która nosi także nazwę „piętnowania epitopu, gen domeny V ciężkiego lub lekkiego łańcucha przeciwciał gryzoni otrzymanych w wyniku prezentacji fagowej zastąpiono repertuarem ludzkich genów domeny V, tworząc chimery gryzonioludzkie. Wybór antygenu prowadzi do wydzielenia ludzkich regionów zmiennych zdolnych do przywrócenia funkcji miejscom wiążącym antygen, tj., epitop decyduje o (napiętnowuje) wybór partnera wiązania. Gdy proces powtarza się w celu wymienienia pozostałej domeny V gryzonia, otrzymuje się ludzkie przeciwciało (WO 93/06213, publ. 1 kwietnia 1993). W odróżnieniu od tradycyjnego humanizowania przeciwciał gryzoni przez wszczepianie CDR, technika ta daje całkowicie ludzkie przeciwciała, bez elementu zrębowego lub reszt CDR pochodzących od gryzonia.

Jasne jest, że chociaż powyższe omówienie odnosi się do humanizowanych przeciwciał, ogólne zasady omówione tu są odpowiednie do dopasowania przeciwciał do zastosowania, np. u psów, kotów, naczelnych, koni i bydła. Dalej, jasne jest, że jeden lub więcej aspektów opisanego tu humanizowania przeciwciała można połączyć z, np. wszczepianiem CDR, mutacją w elemencie zrębowym i mutacją CDR.

Przeciwciała można wytworzyć przy zastosowaniu technik rekombinacyjnych izolując na początku przeciwciała i komórki produkujące przeciwciało od zwierząt gospodarzy, otrzymując sekwencję genu, i posługując się sekwencją genu do uzyskania ekspresji przeciwciała, przy zastosowaniu technik rekombinacyjnych, w komórkach gospodarzach (np. komórki CHO). Inną metodą, którą można zastosować jest ekspresja sekwencji przeciwciała w roślinach (np. tytoniu) lub w transgenicznym mleku. Sposoby ekspresji przeciwciał przy zastosowaniu technik rekombinacyjnych w roślinach lub mleku zostały opisane. Patrz, np. Peeters, i in. Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. i D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65 (1995); i Pollock, i in., J Immunol Methods 231:147 (1999). Sposoby wytwarzania pochodnych przeciwciał, np. przeciwciał humanizowanych, jednołańcuchowych itp. są znane w dziedzinie.

Testy immunologiczne i techniki sortowania przy zastosowaniu cytometrii przepływowej takie jak sortowanie fluorescencyjnie wzbudzonych komórek (FACS) można także stosować do izolowania przeciwciał specyficznych względem NGF.

Przeciwciała można związać z wieloma różnymi nośnikami. Nośniki mogą być aktywne i/lub obojętne. Przykłady dobrze znanych nośników obejmują polipropylen, polistyren, polietylen, dekstran, nylon, amylazy, szkło, naturalne i zmodyfikowane celulozy, poliakrylamidy, agarozy i magnetyt. Dla celów wynalazku nośnik może być rozpuszczalny lub nierozpuszczalny. Fachowcy w dziedzinie będą znać inne odpowiednie nośniki do wiązania przeciwciała, lub będą zdolni takie zidentyfikować, stosując rutynowe techniki doświadczalne.

PL 211 654 B1

DNA kodujący przeciwciała monoklonalne można łatwo wyizolować i zsekwencjonować stosując typowe metody (np. posługując się sondami oligonukleotydowymi zdolnymi do specyficznego wiązania się z genami kodującymi ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciał monoklonalnych). Komórki hybrydomy są korzystnym źródłem takiego DNA. Z chwilą wydzielenia, DNA można umieścić w wektorach ekspresyjnych (takich jak wektory ekspresyjne ujawnione w zgłoszeniu WO 87/04462), którymi dalej transfekuje się komórki gospodarzy, takie jak komórki E. coli, małpie komórki COS, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), lub komórki szpiczaka, które normalnie nie produkują białka immunoglobuliny, dając syntezę przeciwciał monoklonalnych w rekombinowanych komórkach gospodarzach. Patrz, np. zgłoszenie WO nr 87/04462. DNA można także zmodyfikować, np. podstawiając sekwencję kodującą domeny stałe ludzkiego ciężkiego i lekkiego łańcucha zamiast homologicznych sekwencji mysich, Morrison i in., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984), lub kowalencyjnie łącząc sekwencję kodującą immunoglobulinę z całością lub częścią sekwencji kodującej polipeptydu nieimmunoglobulinowego. W ten sposób wytwarza się tu „chimeryczne lub „hybrydowe przeciwciała wiążące specyficznie przeciwciała monoklonalne anty-NGF.

Przeciwciała anty-NGF można scharakteryzować stosując metody dobrze znane w dziedzinie. Przykładowo, jedna metoda polega na identyfikacji epitopu, z którym się one łączą, lub na „mapowaniu epitopu. Istnieje wiele metod znanych w dziedzinie mapowania i charakteryzowania położenia epitopów na białkach, obejmujące wyjaśnienie budowy krystalicznej kompleksu przeciwciało-antygen, testy kompetycji, testy ekspresji fragmentu genu, i testy z zastosowaniem peptydu syntetycznego, jak opisano, np. w rozdziale 11, Harlow i Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. Jako dodatkowy przykład, mapowanie epitopu można stosować w celu określenia sekwencji, z którą łączy się przeciwciało anty-NGF. Środki do mapowania epitopu są dostępne w handlu z różnych źródeł, np. Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). Epitop może być liniowym epitopem, składającym się z pojedynczego odcinka aminokwasów, lub epitopem konformacyjnym powstałym wskutek przestrzennych oddziaływań aminokwasów, które nie koniecznie mogą budować pojedynczy odcinek. Peptydy o zmiennej długości (np. o długości co najmniej 4-6 aminokwasów) moż na wydzielić lub zsyntetyzować (np. przy zastosowaniu technik rekombinacyjnych) i zastosować w testach wiązania z przeciwciałem anty-NGF.

W innym przykładzie epitop, z którym łączy się przeciwciało anty-NGF można okreś lić metodą systematycznego klasyfikowania stosując peptydy na bazie zachodzących za siebie sekwencji pochodzące od sekwencji NGF i oceniając wiązanie z przeciwciałem anty-NGF. Zgodnie z testami ekspresji fragmentu genu, fragmentuje się otwartą ramkę odczytu kodującą NGF losowo lub z zastosowaniem specyficznych konstruktów genetycznych i określa się reaktywność ulegających ekspresji fragmentów NGF z badanym przeciwciałem. Fragmenty genu można, np. wytwarzać metodą PCR i następnie transkrybować i przepisywać na białko in vitro, wraz z radioaktywnymi aminokwasami. Wiązanie przeciwciał ze znakowanymi radioaktywnie fragmentami NGF określa się później metodą immunoprecypitacji i elektroforezy w żelu. Niektóre epitopy można także zidentyfikować stosując duże biblioteki losowych sekwencji peptydów prezentowanych na powierzchni cząstek faga (biblioteki fagowe). Alternatywnie, określoną bibliotekę zachodzących na siebie fragmentów peptydów można badać pod kątem wiązania z przeciwciałem testowym w prostych testach wiązania. Jako dodatkowy przykład, mutagenezę domeny wiążącej antygen, doświadczenia z zamianą domen i mutagenezą przez substytucję nukleotydów dla uzyskania kodonów alaniny (alaninę scanning mutagenesis) można przeprowadzić w celu zidentyfikowania reszt wymaganych, wystarczają cych, i/lub koniecznych do wią zania z epitopem. Przykładowo, doświadczenia z zamianą domen można przeprowadzić stosując zmutowany NGF, w którym różne fragmenty polipeptydu NGF zastąpiono (wymieniono) sekwencjami ze ściśle spokrewnionego, lecz antygenowe różnego białka (takiego jak inne białko z rodziny neurotrofin). Przy ocenie wiązania przeciwciał ze zmutowanym NGF, można oszacować znaczenie konkretnego fragmentu NGF dla wiązania z przeciwciałem.

Jeszcze inna metoda, którą można stosować do charakteryzowania przeciwciała anty-NGF polega na zastosowaniu testów kompetycji z innymi przeciwciałami, o których wiadomo, że łączą się z tym samym antygenem, tj., róż nymi fragmentami NGF, w celu okreś lenia czy przeciwciał o anty-NGF łączy się z tym samym epitopem co inne przeciwciała. Testy kompetycji są dobrze znane fachowcom w dziedzinie. Przykładowe przeciwciała, które można zastosować w testach kompetycji według wynalazku obejmują MAb 911, 912,938, jak opisano w: Kongo, i in., Hybridoma 19:215-227 (2000).

PL 211 654 B1

Inny antagoniści NGF

Można stosować antagonistów NGF innych niż przeciwciała anty-NGF. W niektórych rozwiązaniach według wynalazku, antagonista NGF obejmuje co najmniej jedną cząsteczkę antysensowną zdolną do blokowania lub zmniejszenia ekspresji funkcjonalnego NGF. Sekwencje nukleotydowe NGF są znane i łatwo dostępne w publicznych bazach danych [np. Borsani i in., Nuc. Acids Res. 1990,18,4020, numer dostępu NM 002506; Ullrich i in., Nature 303:821-825 (1983)]. Jest sprawą rutynową przygotowanie antysensownej cząsteczki oligonukleotydu, która łączyłaby się specyficznie z mRNA NGF bez reakcji krzyż owej z innymi polinukleotydami. Przykładowe miejsca docelowe obejmują między innymi kodon inicjacyjny, obszary regulatorowe 5', sekwencję kodującą i nieulegający translacji region 3'. W niektórych rozwiązaniach, oligonukleotydy mają długość 10 do 100 nukleotydów, około długość 15 do 50 nukleotydów, długość około 18 do 25 nukleotydów, lub więcej. Oligonukleotydy mogą zawierać modyfikacje w łańcuchu głównym, takie jak np. wiązania tiofosforanowe i modyfikacje cukru 2'-O, dobrze znane w dziedzinie. Przykładowe czą steczki antysensowne obejmują cząsteczki antysensowne NGF ujawnione w US20010046959, także http://www.rna-tec.com/repair.htm.

W innych rozwiązaniach, antagonista NGF obejmuje co najmniej jedną cząsteczkę antysensowna zdolną do blokowania lub zmniejszenia ekspresji funkcjonalnego receptora NGF (takiego jak TrkA i/lub p75). Woolf i in., J. Neuroscie (2001) 21 (3):1047-55; Taglialetela i in., J Neurochem (1996) 66(5): 1826-35. Sekwencje nukleotydowe TrkA i p75 są znane i łatwo osiągalne w dostępnych publicznie baz danych.

Alternatywnie, można zmniejszyć ekspresję i/lub uwalnianie NGF stosując unieczynnianie genu, morfolinooligonukleotydy, RNAi lub Rybozymy, metody, które są dobrze znane w dziedzinie [http://www.macalester.edu/~montgomery/RNAi.html;

http://pub32.ezboard.com/fmorpholinosfrm19.showMessage?topicI

D=6.topie; http://www.highveld.com/ribozyme.html].

W innych rozwią zaniach, antagonista NGF obejmuje co najmniej jeden zwią zek hamują cy NGF. Stosowany tu termin „związek hamujący NGF odnosi się do związku innego niż przeciwciało anty-NGF, który bezpośrednio lub pośrednio zmniejsza, hamuje, neutralizuje lub znosi aktywność biologiczną NGF. Związek hamujący NGF powinien wykazywać którąkolwiek jedną lub więcej spośród takich właściwości jak: (a) łączenie się z NGF; (b) hamowanie aktywności biologicznej NGF lub szlaków transdukcji sygnału w dół, w których pośredniczy sygnalizacja NGF; (c) zapobieganie, łagodzenie lub leczenie dowolnego aspektu bólu pooperacyjnego; (d) blokowanie lub zmniejszanie aktywacji receptora NGF (w tym dimeryzacja i/lub autofosforylacja receptora TrkA); (e) zwiększanie klirensu NGF; (f) hamowanie (zmniejszanie) syntezy, produkcji lub uwalniania NGF; (g) przyspieszanie rekonwalescencji po zabiegu operacyjnym. Przykładowe związki hamujące NGF obejmują drobnocząsteczkowe inhibitory NGF ujawnione w US20010046959; związki hamujące wiązanie NGF z p75, ujawnione w WO 00/69829, zwią zki hamujące wią zanie NGF z TrkA i/lub p75, ujawnione w WO 98/17278. Dodatkowe przykłady związków hamujących NGF obejmują związki opisane w WO02/17914 i WO 02/20479 i w opisach patentowych US5342942, US6127401 i US6359130. Dalsze przykładowe związki hamujące NGF obejmują związki będące konkurencyjnymi inhibitorami NGF [US 6291247]. Ponadto, fachowiec w dziedzinie może przygotować inne drobnocząsteczkowe związki hamujące NGF.

W niektórych rozwiązaniach, związek hamują cy NGF łączy się z NGF. Przykładowe miejsca docelowe (wiązania) obejmują między innymi część NGF łączącą się z receptorem TrkA i/lub p75, i fragmenty NGF, które sąsiadują z regionem wiążącym receptor i które odpowiadają, w części, za prawidłowy kształt przestrzenny części wiążącej receptora. W innym rozwiązaniu, związek hamujący NGF łączy się z receptorem NGF (takim jak TrkA i/lub p75) i hamuje aktywność biologiczną NGF. Przykładowe miejsca docelowe obejmują te fragmenty TrkA i/lub p75, które łączą się z NGF.

W rozwiązaniu dotyczącym małych cząsteczek, mało cząsteczka może mieć masę cząsteczkową około 100 do 20000 daltonów, 500 do 15000 daltonów lub 1000 do 10000 daltonów. Biblioteki małych cząsteczek są dostępne w handlu. Małe cząsteczki można podawać stosując dowolne metody znane w dziedzinie, w tym takie jak inhalacja, podawanie dootrzewnowe, dożylne, domięśniowe, podskórne, dooponowe, dokomorowe, doustne, dojelitowe, pozajelitowe, donosowe, lub doskórne. Na ogół, gdy NGF-antagonista według wynalazku jest małą cząsteczką, będzie się go podawać w iloś ci 0,1 do 300 mg/kg masy ciał a pacjenta podzielonej na jedną do trzech lub wię cej dawek. Dla dorosłego pacjenta o prawidłowej masie, można podawać dawki w zakresie od 1 mg do 5 g na dawkę.

PL 211 654 B1

W innych rozwią zaniach, antagonista NGF obejmuje co najmniej jeden analog strukturalny NGF. „Analogi strukturalne NGF według wynalazku oznaczają związki o podobnej 3-wymiarowej budowie w części NGF i łączące się z receptorem NGF w warunkach fizjologicznych in vitro lub in vivo, w którym wią zanie co najmniej częściowo hamuje aktywność biologiczną NGF. W jednym rozwiązaniu, analog strukturalny NGF łączy się z receptorem TrkA i/lub p75. Przykładowe analogi strukturalne NGF obejmują między innymi bicykliczne peptydy ujawnione w WO 97/15593, bicykliczne peptydy ujawnione w US 6291247; cykliczne związki ujawnione w US6017878 i pochodzące od NGF peptydy ujawnione w zgłoszeniu WO 89/09225. Odpowiednie analogi strukturalne NGF można także zaprojektować i zsyntetyzować poprzez modelowanie molekularne wiązania z receptorem NGF, np. sposobem ujawnionym w WO 98/06048. Analogi strukturalne NGF mogą być monomerami lub dimerami/oligomerami w dowolnej pożądanej kombinacji tych samych lub różnych struktur z uzyskaniem lepszego powinowactwa i efektów biologicznych.

W innych rozwią zaniach, przedmiotem wynalazku jest antagonista NGF obejmują cy co najmniej jedną dominującą-negatywną mutację receptora TrkA i/lub p75. Fachowiec w dziedzinie może przygotować dominujących-negatywnych mutantów, np. receptora TrkA tak, aby receptor łączył się z NGF a zatem działający jako „zlew wyłapujący NGF. Dominujące-negatywne mutanty, jednakże, nie bę dą jednak posiadać normalnej aktywności biologicznej receptora TrkA po związaniu z NGF. Przykładowe mutanty z dominującą mutacją negatywną obejmują między innymi mutanty opisane w: Li i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 10884; Eide i in., J. Neurosci. 1996, 16, 3123; Liu i in., J. Neurosci 1997, 17, 8749; Klein i in., Cell 1990, 61, 647; Valenzuela i in., Neuron 1993,10,963; Tsoulfas i in., Neuron 1993,10,975; i Lamballe i in., EMBO J. 1993, 12, 3083. Dominujące-negatywne mutanty można podawać w formie białka lub w postaci of wektora ekspresyjnego tak, aby dominujący negatywny mutant, np. zmutowany receptor TrkA, ulegał ekspresji in vivo. Białko lub wektor ekspresyjny można podawać stosując dowolne metody znane w dziedzinie, takie jak podawanie dootrzewnowe, dożylne, domięśniowe, podskórne, dooponowe, dokomorowe, doustne, dojelitowe, pozajelitowe, donosowe, doskórne lub inhalacyjne. Przykładowo, podawanie wektorów ekspresyjnych obejmuje podawanie miejscowe lub systemowe, w tym zastrzyk, podawanie doustne, zastosowanie armatki genowej lub podawanie przez cewnik oraz podawanie miejscowe. Fachowiec w dziedzinie zna sposoby podawania wektorów ekspresyjnych z uzyskaniem ekspresji egzogennego białka in vivo [US6436908, US6413942 i US6376471].

Zastosować można także ukierunkowane dostarczanie kompozycji terapeutycznych zawierających antysensowny polinukleotyd, wektor ekspresyjny, lub subgenomowe polinukleotydy. Techniki dostarczania DNA za pośrednictwem receptora opisano np. w: Findeis i in., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou i in., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (red. J.A. Wolff) (1994); Wu i in., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu i in., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke i in., Proc. Natl Acad. Sci USA (1990) 87:3655; Wu i in., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Kompozycje terapeutyczne zawierające polinukleotyd podaje się w zakresie około 100 ng do około 200 mg

DNA do podawania miejscowego w procedurze terapii genowej. W niektórych rozwiązaniach, zakresy stężeń około 500 ng do około 50 mg, około 1 μg do około 2 mg, około 5 μg do około 500 μg, i około 20 μg do około 100 μg DNA lub więcej zastosować można także w procedurze terapii genowej. Terapeutyczne polinukleotydy i polipeptydy według wynalazku można dostarczać stosując nośniki genowe. Nośnik genowy może być pochodzenia wirusowego lub niewirusowego (Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Humań Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Humań Gene Therapy (1995) 1:185; i Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). Ekspresję tych sekwencji kodujących można wywołać stosując endogenne ssacze lub heterologiczne promotory i/lub sekwencje wzmacniające. Ekspresja sekwencji kodującej może być konstytutywna lub regulowana.

Wektory na bazie wirusa służące do dostarczania pożądanego polinukleotydu i ekspresji w pożądanej komórce są dobrze znane w dziedzinie. Przykładowe nośniki na bazie wirusa obejmują między innymi rekombinowane retrowirusy (WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, US5219740 i US4777127, UK2200651 i EP 0345242), wektory na bazie wirusa alfa (np. wektory na bazie wirusa Sindbis, wirusa Semliki forest virus (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), wirusa Ross River virus (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) i wirusa wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), i wektory na bazie wirusa zależnego od adenowirusów (AAV) (np. WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984 i WO 95/00655). Zastosować można także oddawanie DNA połączonego z zabitym adenowirusem, jak to opisano w: Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147.

PL 211 654 B1

Zastosować można także nośniki i metody niewirusowe, obejmujące, między innymi, zastosowanie polikationowego skondensowanego DNA związanego lub niezwiązanego z samym zabitym adenowirusem (np. Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); DNA związanego z ligandem (patrz, np. Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); komórki eukariotyczne jako nośniki (US5814482, WO 95/07994, WO 96/17072,WO 95/30763 i WO 97/42338) i zobojętnienie ładunku kwasu nukleinowego lub fuzję z błonami komórkowymi. Zastosować można także nagi DNA. Przykładowe metody wprowadzenia nagiego DNA ujawniono w WO 90/11092 i US 5580859. Liposomy, które mogą działać jako nośniki genu ujawniono w US 5422120, WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 i EP 0524968. Dodatkowe podej ś cia opisano w: Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411, i w Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581.

Jasne jest także, że wektor ekspresyjny można stosować do bezpośredniej ekspresji dowolnych spośród opisanych tu antagonistów NGF na bazie białka (np. przeciwciało anty-NGF, immunoadhezyna TrkA itp.). Przykładowo, w dziedzinie znane są inne fragmenty receptora TrkA zdolne do blokowania (od częściowego do całkowitego blokowania) NGF i/lub aktywności biologicznej NGF.

W innym rozwią zaniu, antagonista NGF obejmuje co najmniej jedną immunoadhezynę TrkA. Stosowane tu immunoadhezyny TrkA oznaczają rozpuszczalne chimeryczne cząsteczki zawierające pozakomórkową domenę receptora TrkA oraz sekwencję immunoglobuliny, zachowujące specyficzność wiązania receptora TrkA (w znacznej mierze zachowującą specyficzność wiązania receptora TrkA) i zdolne do wiązania NGF.

Immunoadhezyny TrkA są znane w dziedzinie, i stwierdzono, że blokują wiązanie NGF z receptorem TrkA [US6153189]. Brennan i in. wspomnieli o stosowaniu immunoadhezyny TrkA w modelu bólu pooperacyjnego u szczura. Patrz, Society for Neuroscience Abstracts 24(1-2) 880 (1998). W jednym rozwią zaniu, immunoadhezyna TrkA zawiera połączoną sekwencję aminokwasową receptora TrkA (lub jego część) z pozakomórkowej domeny TrkA zdolnej do wiązania NGF (w niektórych rozwiązaniach, sekwencję aminokwasową w znacznej mierze zachowującą specyficzność wiązania receptora TrkA) i sekwencję immunoglobulinę. W niektórych rozwiązaniach, receptor TrkA ma sekwencję ludzkiego receptora TrkA i połączony jest z sekwencją stałej domeny immunoglobuliny. W innych rozwią zaniach, sekwencja stał ej domeny immunoglobuliny jest sekwencją domeny stał ej łańcucha ciężkiego immunoglobuliny. W innych rozwiązaniach, połączenie dwóch zespołów ciężki łańcuch immunoglobuliny - receptor TrkA (np. poprzez wiązanie kowalencyjne przez wiązanie(a) disiarczkowe) daje w rezultacie homodimeryczną strukturę podobną do immunoglobuliny. Lekki łańcuch immunoglobuliny można dalej związać z jedną lub obydwoma chimerami receptor TrkA-immunoglobulina w połączony wiązaniem disiarczkowym dimer uzyskując homotrimeryczną lub homotetrameryczną strukturę. Przykłady odpowiednich immunoadhezyn TrkA obejmują te ujawnione w US6153189.

W innym rozwiązaniu, antagonista NGF obejmuje co najmniej jedno przeciwciało anty-TrkA zdolne do blokowania, tłumienia, zmiany, i/lub zmniejszenia oddziaływania fizycznego NGF z receptorem TrkA i/lub sygnalizację w dół od receptora, dzięki czemu zmniejsza się i/lub blokowana jest aktywność biologiczna NGF. Przeciwciała anty-TrkA są znane w dziedzinie. Przykładowe przeciwciała anty-TrkA obejmują te ujawnione w WO 97/21732, WO 00/73344, WO 02/15924 i US 20010046959.

W innym rozwiązaniu, antagonista NGF obejmuje co najmniej jedno przeciwciał o anty-p75 zdolne do blokowania, tłumienia i/lub zmniejszania oddziaływania fizycznego NGF z receptorem p75 i/lub sygnalizacji w dół od receptora, dzięki czemu zmniejsza się i/lub blokowana jest aktywność biologiczna NGF.

W innym rozwią zaniu, antagonista NGF obejmuje co najmniej jeden inhibitor kinazy zdolny do hamowania w dół sygnalizacji kinazowej związanej z aktywnością receptora TrkA i/lub p75. Przykładowym inhibitorem kinazy jest K252a lub K252b, które są znane w dziedzinie i opisane w: Knusel i in., J.Neurochem. 59:715-722 (1992); Knusel i in., J. Neurochemistry 57:955-962 (1991); Koizumi i in., J. Neuroscience 8:715-721 (1988); Hirata i in., Chemical Abstracts 111:728, XP00204135, patrz skrót i 12 Collective Chemical Substance Index, strona 34237, karta 3 (5-7), 55-60, 66-69), strona 34238, karta 1 (41-44), karta 2 (25-27, 32-33), strona 3423, karta 3 (48-50, 52-53) i US 6306849.

Oczekuje się, że gdyby klinicyści poszukiwali antagonistów NGF zidentyfikowaliby wiele innych ich kategorii.

Identyfikacja antagonistów NGF

Przeciwciała anty-NGF i innych antagonistów NGF można zidentyfikować lub scharakteryzować stosując metody znane w dziedzinie, dzięki czemu można wykryć i/lub ocenić zmniejszenie, poprawę, lub neutralizację aktywności biologicznej NGF. Przykładowo, test aktywacji kinazy receptorowej

PL 211 654 B1 (KIRA) ujawniony w opisach patentowych US 5766863 i US5891650, można stosować do identyfikacji antagonistów NGF. Test typu ELISA jest odpowiedni do jakościowej lub ilościowej oceny aktywacji kinazy przez określenie autofosforylacji domeny kinazy receptorowej białkowej kinazy tyrozynowej (nazwanej poniżej „rPTK), np. receptora TrkA, jak również w celu identyfikacji i charakteryzacji potencjalnych antagonistów wybranych rPTK, np. TrkA. Pierwszy etap testu obejmuje fosforylację domeny kinazy kinazy receptorowej, np. receptora TrkA, przy czym receptor występuje w błonie komórkowej komórki eukariotycznej. Receptorem może być endogenny receptor lub kwas nukleinowy kodujący receptor, lub konstrukt receptorowy, którymi można transformować komórkę. Typowo, pierwszą fazę stałą (np. studzienkę pierwszej płytki testowej) powleka się zasadniczo homogeniczną populacją takich komórek (zazwyczaj ssaczą linią komórkową) tak, aby komórki przylgnęły do fazy stałej. Często, komórki są typu przylegającego i tym samym przylegają naturalnie do pierwszej fazy stałej. Jeśli zastosowano „konstrukt receptorowy, wówczas zazwyczaj zawiera on połączoną kinazę receptorową i polipeptyd flagowy. Polipeptyd flagowy rozpoznawany jest przez ś rodek wychwytują cy, czę sto przeciwciało wychwytujące, w części testu z wykorzystaniem metody ELISA. Potem, razem z NGF, dodaje się do studzienek z przyczepionymi komórkami, analit, taki jak przypuszczalne przeciwciało anty-NGF lub inny antagonista NGF, tak, aby receptor kinazy tyrozynowej (np. receptor TrkA) poddany był działaniu (lub kontaktował się z) NGF i analitem. Test umożliwia identyfikację przeciwciał (lub innych antagonistów NGF) hamujących aktywację TrkA poprzez jego ligand NGF. Po ekspozycji na NGF i analit, przyczepione komórki rozpuszcza się stosując bufor do lizy (zawierający rozpuszczający detergent) i ł agodnie miesza, tym samym uwalniają c lizat komórkowy, który bezpoś rednio moż na poddać testowi ELISA stanowiącemu część tego testu, bez potrzeby zatężania lub klarowania lizatu komórkowego.

Tak wytworzony lizat komórkowy można dalej poddać testowi ELISA. W pierwszym etapie testu ELISA, drugą fazę stałą (zazwyczaj studzienkę płytki do mikromiareczkowania dla testu ELISA) powleka się środkiem wychwytującym (często przeciwciałem wychwytującym), który łączy się specyficznie z receptorem kinazy tyrozynowej, lub, w przypadku konstruktu receptorowego, z polipeptydem flagowym. Powlekanie drugiej fazy stałej prowadzi się tak, aby środek wychwytujący przylgnął do drugiej fazy stałej. Środkiem wychwytującym jest na ogół przeciwciało monoklonalne, lecz, jak opisano tu w przykładach, można takż e stosować przeciwciała poliklonalne. Tak otrzymany lizat komórkowy traktuje się lub kontaktuje z przylegającym środkiem wychwytującym tak, aby receptor lub konstrukt receptorowy przylgnął (lub został wychwycony przez) drugą fazę stałą. Dalej przeprowadza się etap przemywania, tak, aby aby usunąć niezwiązany lizat komórkowy, z pozostawieniem wychwyconego receptora lub konstruktu receptorowego. Przyczepiony lub wychwycony receptor lub konstrukt receptorowy następnie traktuje się, lub kontaktuje z przeciwciałem anty-fosfotyrozyna identyfikującym fosforylowane reszty tyrozynowe receptorowej kinazy tyrozynowej. W jednym rozwiązaniu, przeciwciało anty-fosfotyrozyna sprzężone jest (bezpośrednio lub pośrednio) z enzymem katalizującym zmianę zabarwienia nieradioaktywnego barwnego odczynnika. Zgodnie z tym, fosforylację receptora można określić obserwując późniejszą zmianę zabarwienia odczynnika. Enzym może być związany z przeciwciałem anty-fosfotyrozyna bezpośrednio lub z przeciwciałem anty-fosfotyrozyna można połączyć cząsteczkę koniugującą (np. biotynę) a enzym może dalej wiązać się z przeciwciałem antyfosfotyrozyna poprzez cząsteczkę koniugującą. Na koniec, określa się związanie przeciwciała antyfosfotyrozyna z wychwyconym receptorem lub konstruktem receptorowym, np. badając zmianę zabarwienia barwnego odczynnika.

Antagonistów NGF można także zidentyfikować inkubując badany środek z NGF i monitorując którąkolwiek jedną lub więcej spośród takich właściwości jak: (a) wiązanie z NGF; (b) hamowanie aktywności biologicznej NGF lub szlaków transdukcji sygnału w dół, w których pośredniczy sygnalizacja NGF; (c) hamowanie, blokowanie lub zmniejszanie aktywacji receptora NGF (w tym dimeryzacji i/lub autofosforylacji TrkA); (d) zwiększanie klirensu NGF; (e) leczenie lub zapobieganie dowolnemu aspektowi bólu pooperacyjnego; (f) hamowanie (zmniejszanie) syntezy, produkcji lub uwalniania NGF; (g) przyśpieszenie rekonwalescencji po zabiegu operacyjnym. W niektórych rozwiązaniach, antagonistę NGF identyfikuje się przez inkubację badanego środka z NGF i monitorując wiązanie i towarzyszące temu zmniejszenie lub neutralizację aktywności biologicznej NGF. Test wiązania można przeprowadzić z zastosowaniem oczyszczonego(nych) polipeptydu(ów) NGF, lub komórek naturalnie eksprymujących, lub transfekowanych tak, aby eksprymowały polipeptyd(y) NGF. W jednym rozwiązaniu, test wiązania jest kompetycyjnym testem wiązania, za pomocą, którego określa się zdolność przypuszczalnego przeciwciała do współzawodniczenia ze znanym antagonistą NGF o wiązanie z NGF. Test można przeprowadzić w różnych formatach, w tym w formacie ELISA. W innych rozwiązaniach,

PL 211 654 B1 antagonistę NGF identyfikuje się inkubując badany środek z NGF i monitorując towarzyszące temu hamowanie dimeryzacji i/lub autofosforylacji receptora TrkA.

Po początkowej identyfikacji, aktywność badanego antagonisty anty-NGF można dalej potwierdzić i udoskonalić posługując się testami biologicznymi, o których wiadomo, że służą do testowania konkretnych aktywności biologicznych.

Alternatywnie, testy biologiczne można stosować w celu bezpośredniego oszacowania badanych cząsteczek. Przykładowo, NGF sprzyja wielu morfologicznie rozpoznawalnym zmianom we wrażliwych komórkach. Obejmują one między innymi wzmacnianie różnicowania komórek PC 12 i nasilenie wyrastania z tych komórek neurytów (Urfer i in., Blochem. 36:4775-4781 (1997); Tsoulfas i in., Neuron 10:975-990 (1993)), nasilenie odrostu neurytów z eksplantów wrażliwych zwojów czuciowych i współczulnych (Levi-Montalcini, R. i Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol Rev. 48, 534-569,1968) i zwiększenie przeżywalności nerwów zależnych od NGF, takich jak nerwy korzenia grzbietowego zwoju embrionalnego, zwoju trójdzielnego, lub zwoju współczulnego (np. Chun & Patterson, Dev. Biol. 75:705-711, (1977); Buchman & Davies, Development 118:989-1001, (1993). Zatem, test hamowania aktywności biologicznej NGF wiąże się z hodowaniem komórek wrażliwych na NGF z NGF wraz z analitem, takim jak przypuszczalne przeciwciało anty-NGF i przypuszczalny antagonista NGF. Po odpowiednim czasie zbada się odpowiedź komórkową (różnicowanie komórek, odrost neurytów lub przeżywalność komórek).

Zdolność przypuszczalnego antagonisty NGF do blokowania lub neutralizowania aktywności biologicznej NGF można także oszacować monitorując zdolność badanego środka do hamowania przeżywalności, w której pośredniczy NGF, w teście biologicznym przeżywalności embrionalnych korzeni grzbietowych zwojów szczura jak opisano w: Kongo i in., Hybridoma 19:215-227 (2000).

Kompozycje farmaceutyczne

Kompozycje farmaceutyczne zawierają w skutecznej ilości antagonistę NGF (takiego jak przeciwciało anty-NGF) i, w niektórych rozwiązaniach, zawierają dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny rozczynnik. Kompozycja zawiera antagonistę NGF. W innym rozwiązaniu, kompozycja zawiera jednego lub więcej antagonistów NGF. W innym rozwiązaniu, kompozycja zawiera jeden lub więcej antagonistów NGF wybranych spośród takich jak którykolwiek jeden lub więcej spośród takich jak: antagonista (np. przeciwciało) łączące się (oddziałujące fizycznie) z NGF, antagonista łączący się z receptorem NGF (takim jak receptor TrkA i/lub p75), i antagonista zmniejszający (hamujący i/lub blokujący) sygnalizację w dół od receptora NGF. W jeszcze innych rozwiązaniach, kompozycja zawiera dowolnego antagonistę NGF nie immunoadhezynę TrkA (tj. innego niż immunoadhezyna TrkA). W innych rozwiązaniach, kompozycja zawiera dowolnego antagonistę NGF innego niż przeciwciało anty-NGF. W jeszcze innych rozwiązaniach, kompozycja zawiera dowolnego antagonistę NGF innego niż immunoadhezyna TrkA i innego niż przeciwciało anty-NGF. W innych rozwiązaniach, antagonista NGF hamuje (zmniejsza) syntezę, produkcję lub uwalnianie NGF. W niektórych rozwiązaniach, antagonista NGF łączy się z NGF i nieznacznie reaguje krzyżowo z pokrewnymi neurotrofinami (takimi jak NTS, NT4/5, i/lub BDNF). W niektórych rozwiązaniach, antagonista NGF nie jest związany ze szkodliwą odpowiedzią immunologiczną. W niektórych rozwiązaniach, antagonista NGF jest wybrany z grupy obejmującej przeciwciało anty-NGF, antysensowną cząsteczkę ukierunkowaną na NGF (w tym antysensowna cząsteczkę ukierunkowaną na kwas nukleinowy kodujący NGF), antysensowna cząsteczkę ukierunkowana na receptor NGF (taki jak TrkA i/lub p75), związek hamujący NGF, analog strukturalny NGF, dominującą-negatywnę mutację receptora TrkA, która powoduje jego łączenie się z NGF, immunoadhezynę TrkA, przeciwciało anty-TrkA, przeciwciało anty-p75 i inhibitor kinazy. W innym rozwiązaniu, antagonistą NGF jest przeciwciało anty-NGF. W innych rozwiązaniach, przeciwciało anty-NGF rozpoznaje ludzki NGF. W niektórych rozwiązaniach, przeciwciało anty-NGF jest przeciwciałem ludzkim. W jeszcze innych rozwiązaniach, przeciwciało anty-NGF jest humanizowane (jak np. opisane tu przeciwciało E3). W jeszcze innym rozwiązaniu, przeciwciało anty-NGF zawiera region stały nieinicjujący niepożądanej lub szkodliwej odpowiedzi immunologicznej, takiej jak liza z udziałem przeciwciał lub ADCC. W innych rozwiązaniach, przeciwciało anty-NGF zawiera jeden lub więcej CDR przeciwciała E3 (jak np. jeden, dwa, trzy, cztery, pięć, lub, w niektórych rozwiązaniach, wszystkie sześć CDR z E3).

Zrozumiałe jest, że kompozycje mogą zawierać więcej niż jednego antagonistę NGF. Przykładowo, kompozycja może zawierać więcej niż jednego antagonistę z klasy antagonistów NGF (np. mieszaninę przeciwciał anty-NGF rozpoznających różne epitopy NGF), jak również antagonistów z różnych klas antagonistów NGF (np. przeciwciało anty-NGF i związek hamujący NGF). Inne przykłaPL 211 654 B1 dowe kompozycje zawierają więcej niż jedno przeciwciało anty-NGF rozpoznające taki sam epitop(y), różne typy przeciwciał anty-NGF łączących się z różnymi epitopami NGF lub różne związki hamujące NGF.

Kompozycja do zastosowania według wynalazku może zawierać farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, rozczynniki, lub stabilizatory (Remington: The Science and Practice of Pharmacy wyd. 20 (2000) Lippincott Williams i Wilkins, red. K. E. Hoover), w postaci liofilizowanych preparatów lub roztworów wodnych. Dopuszczalne nośniki, rozczynniki lub stabilizatory są nietoksyczne dla biorców w danych dawkach i stężeniach i mogą zawierać bufory, takie jak fosforan, cytrynian i inne kwasy organiczne, antyutleniacze obejmujące kwas askorbinowy i metioninę, środki konserwujące (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamoniowy, chlorek heksametonium, chlorek benzalkoniowy, chlorek diizobutylofenoksyetoksyetylodimetylobenzyloamoniowy, alkohol fenolowy, butylowy lub benzylowy, alkiloparabeny, takie jak metylo- lub propyloparaben, katechol, rezorcynę, cykloheksanol, 3-pentanol i m-krezol), polipeptydy o małej masie cząsteczkowej (mniej niż około 10 reszt), białka, takie jak albumina osocza, żelatyna lub immunoglobuliny, hydrofilowe polimery takie jak poliwinylopirolidon, aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina lub lizyna, monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany obejmujące glukozę, mannozę, lub dekstrany, środki chelatujące takie jak EDTA, cukry, takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol, tworzące sól przeciwjony takie jak jony sodu, kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko) i/lub surfaktanty niejonowe, takie jak TWEEN^TM, PLURONICS™ lub glikol polietylenowy (PEG). Farmaceutycznie dopuszczalne rozczynniki opisano poniżej. Antagonistę NGF i jego kompozycje zastosować można także w połączeniu z innymi środkami służącymi do zwiększenia i/lub uzupełnienia skuteczności środków.

Opisano także zestawy do zastosowania błyskawicznie. Zestawy obejmują jeden lub więcej pojemników zawierających antagonistę NGF (takiego jak humanizowane przeciwciało E3) a w niektórych rozwiązaniach, zawiera dodatkowo instrukcje stosowania. W niektórych rozwiązaniach, antagonistą NGF jest dowolny antagonista NGF. Zestaw może zawierać antagonistę NGF niebędącego immunoadhezyną TrkA (tj. inny niż immunoadhezyna TrkA). Zestaw może zawierać antagonistę NGF innego niż przeciwciało anty-NGF lub dowolnego antagonistę NGF innego niż immunoadhezyna TrkA i innego niż przeciwciało anty-NGF. Zestaw może też zawierać przeciwciało anty-NGF (np. przeciwciało E3) lub przeciwciało anty-NGF zawierające jeden lub więcej CDR z przeciwciała E3 (jak np. 1, 2, 3, 4, 5 lub wszystkie 6 CDR z E3). W niektórych przypadkach instrukcje zawierają opis podawania antagonisty NGF w leczeniu, łagodzeniu lub zapobieganiu bólowi pooperacyjnemu. Zestaw może dalej zawierać opis wybierania osobnika odpowiedniego do leczenia na bazie identyfikacji czy osobnik ten cierpi z powodu bólu pooperacyjnego lub czy osobnik jest nim zagrożony. Instrukcja może zawierać opis zastosowania antagonisty NGF w leczeniu, zapobieganiu i/lub łagodzeniu bólu pooperacyjnego. Instrukcje zawierają także opis stosowania antagonisty NGF u pacjenta zagrożonego bólem pooperacyjnym.

Instrukcje dotyczące stosowania antagonisty NGF na ogół obejmują informację na temat dawkowania, harmonogramu dawkowania i podawania. Pojemniki mogą być pojemnikami dla dawek jednostkowych, opakowaniami zbiorczymi (np. opakowaniami wielodawkowymi) lub dla poddawek jednostkowych. Instrukcje dostarczane w zestawach obejmują typowo instrukcje na naklejce lub wkładce do produktu (np. kartce papieru dołączonej do zestawu) lecz instrukcje odczytywane przez maszyny (np. instrukcje przenoszone na magnetycznym lub optycznym dysku do przechowywania danych) są także dopuszczalne.

Naklejka lub wkładka do produktu wskazują, że kompozycję stosuje się do leczenia, łagodzenia i/lub zapobiegania bólowi pooperacyjnemu. Instrukcje mogą dotyczyć zastosowania każdej spośród opisanych tu metod.

Zestawy nadają się do pakowania. Odpowiednie opakowanie obejmuje, między innymi, fiolki, butelki, słoiki, opakowanie elastyczne (np. szczelnie zamykany Mylar lub torebki plastikowe) itp. Rozważa się także opakowania do zastosowania w połączeniu ze specyficznym urządzeniem, takim jak inhalator, urządzenie do podawania donosowego (np. rozpylacz aerozolu) lub urządzenie do wlewu, takie jak minipompa. W skład zestawu może wchodzić sterylny port wejścia (np. pojemnikiem może być worek z roztworem do podawania dożylnego lub fiolka z zatyczką, którą może przebić igła do zastrzyków podskórnych). Pojemnik może być także zaopatrzony w sterylny port wejścia (np. pojemnikiem może być worek z roztworem do podawania dożylnego lub fiolka z zatyczką, którą może przebić igła do zastrzyków podskórnych). Co najmniej jedną substancją czynną w kompozycji jest antagonista NGF, taki jak przeciwciało anty-NGF. Pojemnik może zawierać dalej drugą farmaceutycznie czynną substancję.

PL 211 654 B1

Zestawy mogą zawierać ewentualnie dodatkowe składniki takie jak bufory oraz informację dotyczącą interpretacji. Normalnie, zestaw zawiera pojemnik i naklejkę lub wkładkę(i) do produktu na pojemniku lub doczepione do niego.

Podawanie antagonisty NGF oraz ocena terapii

Antagonistę NGF można podawać pacjentowi dowolnym odpowiednim sposobem. Przykładowo, antagonistę NGF można podawać doustnie, dożylnie, podjęzykowo, podskórnie, dotętniczo, wewnątrzmaziówkowo, dopęcherzowo (jak np. poprzez pęcherz), domięśniowo, do mięśnia sercowego, do klatki piersiowej, dootrzewnowo, dokomorowo, podjęzykowo, inhalacyjnie, za pomocą czopka i przezskórnie. Można je podawać doustnie, np. w postaci tabletek, tabletek do rozgryzania, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, wafli, lizaków, gumy do żucia itp wytworzonych metodami znanymi w dziedzinie. Dla fachowca w dziedzinie będzie oczywiste, że opisane tu przykłady nie mają w zamierzeniu oczywiste, że opisane tu przykłady nie mają w zamierzeniu stanowić ograniczenia lecz ilustrują dostępne techniki.

Zgodnie z tym, w niektórych rozwiązaniach, antagonistę NGF, takiego jak przeciwciało antyNGF, podaje się pacjentowi zgodnie ze znanymi metodami, takimi jak podawanie dożylne, np. w bolusie lub jako ciągły wlew przez pewien okres czasu, domięśniowo, dootrzewnowo, do płynu mózgowerdzeniowego, podskórnie, dostawowo, wewnątrzmaziówkowo, dooponowo, doustnie, wziewnie lub miejscowo. Przydatne do podawania są dostępne w handlu nebulizatory do preparatów płynnych, obejmujące nebulizatory dyszowe i nebulizatory ultradźwiękowe. Preparaty płynne można rozpylać bezpośrednio a liofilizowany proszek można rozpylać po rozpuszczeniu. Alternatywnie, antagonistę NGF można przeprowadzić w postać aerozolu stosując preparat fluorokarbonowy i inhalator podający odmierzone dawki, lub wdychać w postaci liofilizowanego i zmielonego proszku.

W jednym rozwią zaniu, antagonistę NGF podaje się poprzez miejscowo-specyficzne lub ukierunkowane techniki dostarczania. Przykłady miejscowo-specyficznych lub ukierunkowanych technik dostarczania obejmują różne wszczepialne źródła dające kontrolowane uwalnianie antagonisty NGF lub cewniki do dostarczania miejscowego, takie jak cewniki infuzyjne, cewnik zakładany na stałe lub zgłębnik igłowy, przeszczepy syntetyczne, otoczki przydankowe, połączenia omijające i stenty lub inne wszczepialne urządzenia, miejscowo-specyficzne nośniki, zastrzyk bezpośredni lub podanie bezpośrednie np. WO 00/53211 i opis patentowy US 5981568.

Różne preparaty antagonisty NGF (takiego jak przeciwciało anty-NGF) można stosować do podawania. W niektórych rozwiązaniach, antagonistę NGF można podawać samego. W niektórych rozwiązaniach, antagonistą NGF jest przeciwciało anty-NGF, i może występować w różnych preparatach obejmujących preparaty zawierające farmaceutycznie dopuszczalny rozczynnik. Farmaceutycznie dopuszczalne rozczynniki są znane w dziedzinie, i są to względnie obojętne substancje ułatwiające podawanie farmakologicznie skutecznej substancji. Przykładowo, rozczynnik może nadać postać lub konsystencję, lub działać jako rozcieńczalnik. Odpowiednie rozczynniki obejmują między innymi środki stabilizujące, zwilżające i emulgujące, sole zmieniające osmolarność, środki opłaszczające, bufory, i środki wzmacniające przenikanie przez skórę . Rozczynniki jak również preparaty do parenteralnego i nieparenteralnego dostarczania leku przedstawiono w: Remington, The Science and Practice of Pharmacy wyd. 20 Mack Publishing (2000).

W niektórych rozwiązaniach, te ś rodki komponuje się do podawania w zastrzyku (np. dootrzewnowym, dożylnym, podskórnym, domięśniowym itp.). Zgodnie z tym, środki te można połączyć z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozczynnikami, takimi jak solanka, roztwór Ringera, roztwór dekstrozy itp. Konkretny reżim dawkowania, tj. dawka, czas podawania i powtarzanie dawkowania, będzie zależał od konkretnego pacjenta i historii jego choroby.

Przeciwciało anty-NGF można podawać stosując dowolną odpowiednią metodę, obejmującą zastrzyk (np. dootrzewnowy, dożylny, podskórny, domięśniowy itp.). Przeciwciała anty-NGF można także podawać przez inhalację.

Na ogół, do podawania przeciwciał anty-NGF, początkową dawką może być około 2 mg/kg. Dla celów tego wynalazku, typowa dzienna dawka może mieścić się w zakresie od każdego około 3 pg/kg do 30 pg/kg do 300 pg/kg do 3 mg/kg, do 30 mg/kg do 100 mg/kg lub więcej, zależnie od czynników wymienionych. W przypadku aplikacji powtarzanych przez kilka dni lub dłużej, zależnie od schorzenia, leczenie przedłuża się aż do wystąpienia pożądanego hamowania objawów lub aż do osiągnięcia wystarczającego poziomu terapeutycznego do zmniejszenia bólu pooperacyjnego. Przykładowy reżim dawkowania obejmuje podawanie początkowej dawki około 2 mg/kg, po czym dawki podtrzymującej około 1 mg/kg przeciwciała anty-NGF co tydzień lub dawki podtrzymującej około 1 mg/kg co każdy

PL 211 654 B1 kolejny tydzień. Jednakże, przydatne mogą być inne reżimy dawkowania, zależnie od wzoru rozpadu farmakokinetycznego jaki chce osiągnąć lekarz leczący. Przykładowo, rozważa się dawkowanie od jednego do czterech razy na tydzień. Postęp leczenia można łatwo monitorować stosując typowe techniki i testy. Reżim dawkowania (w tym stosowany (i) antagonista(ści) NGF) może zmieniać się w czasie.

Na ogół, gdy nie jest to przeciwciało, antagonistę NGF można (w niektórych rozwiązaniach) podawać w ilości około 0,1 do 300 mg/kg masy ciała pacjenta podzielonej na jedną do trzech dawek, lub jak to tu ujawniono. W niektórych rozwiązaniach, w przypadku dorosłego pacjenta o prawidłowej masie ciała, można stosować dawki w zakresie od około 0,3 do 5,00 mg/kg. Konkretny reżim dawkowania, tj., dawka, czas podawania i powtarzanie dawkowania, będzie zależał od konkretnego pacjenta i historii jego choroby, jak również właściwoś ci konkretnych środków (takich jak okres półtrwania środka, i inne względy dobrze znane w dziedzinie).

Dla celów tego wynalazku, odpowiednie dawkowanie antagonisty NGF będzie zależało od zastosowanego antagonisty(ów) NGF (lub jego (ich) kompozycji), typu i stanu zaawansowania leczonego bólu, tego czy środek podaje się zapobiegawczo czy terapeutycznie, poprzedniego leczenia, historii klinicznej pacjenta i reakcji na środek, oraz uznania leczącego lekarza. Typowo, klinicysta będzie stosować antagonistę NGF, takiego jak przeciwciało anty-NGF, aż dawkowanie osiągnie pożądany wynik.

Do określenia dawkowania na ogół przyczynią się względy empiryczne, takie jak okres półtrwania. Przykładowo, przeciwciała kompatybilne z ludzkim układem immunologicznym, takie jak humanizowane przeciwciała lub całkowicie ludzkie przeciwciała, można stosować do przedłużenia okresu półtrwania przeciwciała oraz do zapobieżenia zaatakowania przeciwciała przez układ immunologiczny gospodarza.

Częstotliwość podawania można określić i uregulować w trakcie leczenia, na ogół, lecz nie koniecznie, na bazie leczenia i/lub hamowania i/lub łagodzenia i/lub opóźnienia ataku bólu. Alternatywnie, odpowiednie mogą być preparaty o przedłużonym ciągłym uwalnianiu antagonisty NGF i/lub opioidu przeciwbólowego. W dziedzinie znane są różne preparaty i urządzenia do uzyskiwania przedłużonego uwalniania.

W jednym rozwiązaniu, dawki dla antagonisty NGF można określić empirycznie u osób, którym, do zwalczenia bólu, podano raz lub więcej razy antagonistę NGF. Pacjentom podaje się antagonistę NGF, np. przeciwciała anty-NGF, w rosnących dawkach, w połączeniu z opioidem przeciwbólowym. Aby ocenić efektywność leczenia, można posłużyć się wskaźnikiem bólu.

Podawanie antagonisty NGF może być ciągłe lub przerywane, zależnie np. od stanu fizjologicznego przyjmującego, tego czy cel podawania jest terapeutyczny lub profilaktyczny, i innych czynników znanych praktykującym fachowcom. Antagonistę NGF można podawać w zasadzie w sposób ciągły przez określony uprzednio okres czasu lub w szeregu oddzielnych dawek, np. albo przed; podczas; lub po ataku bólu; przed i po; podczas i po; przed i podczas; lub przed, podczas, i po ataku bólu. Przykładowo, lek można podać przed, podczas i/lub po zranieniu, nacięciu, urazie, zabiegu operacyjnym, i każdym innym zdarzeniu, które prawdopodobnie spowoduje ból pooperacyjny.

W niektórych rozwiązaniach, może występować więcej niż jeden antagonista NGF taki jak przeciwciało. Antagonista może być taki sam lub inny. Występować może co najmniej jeden, co najmniej dwa, co najmniej trzy, co najmniej cztery, co najmniej pięć różnych antagonistów NGF. Na ogół ci antagoniści NGF wykazują działanie uzupełniające, nieupośledzające innych. Antagonistów NGF stosować można także w połączeniu z innymi środkami służącymi do zwiększenia i/lub uzupełnienia skuteczności środków.

Preparaty terapeutyczne antagonisty NGF (takiego jak przeciwciało) stosowane zgodnie z wynalazkiem wytwarza się do przechowywania mieszając przeciwciało o pożądanym stopniu czystości z ewentualnymi farmaceutycznie dopuszczalnymi noś nikami, rozczynnikami lub stabilizatorami (Remington, The Science and Practice of Pharmacy wyd. 20 Mack Publishing (2000)), w postaci liofilizowanych preparatów lub roztworów wodnych. Dopuszczalne nośniki, rozczynniki lub stabilizatory są nietoksyczne dla biorców w stosowanych dawkach i stężeniach i mogą zawierać bufory, takie jak fosforan, cytrynian i inne kwasy organiczne, sole takie jak chlorek sodu, antyutleniacze obejmujące kwas askorbinowy i metioninę, środki konserwujące (takie jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamoniowy, chlorek heksametonium, chlorek benzalkoniowy, chlorek diizobutylofenoksyetoksyetylodimetylobenzyloamoniowy, alkohol fenolowy, butylowy lub benzylowy, alkiloparabeny, takie jak metylo- lub propyloparaben, katechol, rezorcynę, cykloheksanol, 3-pentanol, i m-krezol), polipeptydy o małej ma28

PL 211 654 B1 sie cząsteczkowej (mniej niż około 10 reszt), białka, takie jak albumina osocza, żelatyna, lub immunoglobuliny, hydrofilowe polimery takie jak poliwinylopirolidon, aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina lub lizyna, monosacharydy, disacharydy i inne węglowodany obejmujące glukozę, mannozę lub dekstryny, środki chelatujące takie jak EDTA, cukry takie jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol, tworzące sól przeciwjony takie jak jony sodu, kompleksy metali (np, kompleksy Zn-białko) i/lub surfaktanty niejonowe, takie jak TWEEN™ PLURONICS™ lub glikol polietylenowy (PEG).

Liposomy zawierające antagonistę NGF (takiego jak przeciwciało) wytwarza się metodami znanymi w dziedzinie: Epstein i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang i in., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980) i US4485045 i US4544545. Liposomy o wydłużonym czasie cyrkulacji ujawniono w opisie patentowym US5013556, Szczególnie przydatne liposomy można wytwarzać odparowując fazę odwróconą z kompozycją lipidową zawierającą fosfatydylocholinę, cholesterol i polioksyetylenowaną fosfatydyloetanoloaminę (PEG-PE), Liposomy wytłacza się przez filtry o określonym wymiarze porów uzyskując liposomy o pożądanej średnicy.

Aktywne składniki można także zamknąć w mikrokapsułkach wytworzonych, np. technikami koacerwacji lub polimeryzacji międzyfazowej, np. w odpowiednio mikrokapsułkach z hydroksymetylocelulozy lub żelatyny i poli-(metakrylanu metylu), w koloidalnych systemach dostarczania leku (np. liposomach, mikrokulkach albuminowych, mikroemulsjach, nanocząsteczkach i nanokapsułkach) lub w makroemulsjach. Takie techniki ujawniono w: Remington, The Science and Practice of Pharmacy wyd. 20 Mack Publishing (2000).

Wytworzyć można preparaty o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne matryce ze stałych hydrofobowych polimerów zawierające przeciwciało, które to matryce mają postać kształtowanych wyrobów, np. filmów, lub mikrokapsułek.

Przykłady matryc o przedłużonym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele (np. poli(2-hydroksyetylometakrylan), lub poli(alkohol winylowy)), polilaktydy (US 3773919), kopolimery kwasu L-glutaminowego i 7-etylo-L-glutaminianu, niedegradujący octan etylenowinylu, degradujące kopolimery kwas mlekowy-kwas glikolowy takie jak LUPRON DEPOT™ (mikrokulki do wstrzykiwania składające się z kopolimeru kwas mlekowy-kwas glikolowy kwas i octanu leuprolidu), octanoizomaślan sacharozy i kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy.

Preparaty do stosowania in vivo muszą być jałowe. Można to łatwo uzyskać, np. filtrując przez sterylne membrany filtrujące. Kompozycje terapeutyczne przeciwciała anty-NGF umieszcza się na ogół w pojemniku ze sterylnym portem wejścia, np. w worku z roztworem do podawania dożylnego lub fiolce z zatyczką, którą może przebić igła do zastrzyków podskórnych.

Kompozycje według wynalazku mogą występować w jednostkowych postaciach dawkowania, takich jak tabletki, pigułki, kapsułki, proszki, granulki, roztwory lub zawiesiny, lub czopki, do podawania doustnego, pozajelitowego lub doodbytniczego lub podawania wziewnego lub do wdmuchiwania.

Przy wytwarzaniu kompozycji stałych takich jak tabletki, główną substancję czynną miesza się z nośnikiem farmaceutycznym, np. typowymi składnikami do tabletkowania, takimi jak skrobia kukurydziana, laktoza, sacharoza, sorbitol, talk, kwas stearynowy, stearynian magnezu, difosforan wapnia lub gumy i innymi rozcieńczalnikami farmaceutycznymi, np. wodą, z wytworzeniem stałej kompozycji wstępnej zawierającej związek według wynalazku w homogenicznej mieszaninie lub jego nietoksyczną farmaceutycznie dopuszczalną sól. Pod określeniem tych kompozycji wstępnych jako homogeniczne, rozumie się, że substancja czynna rozprasza się równomiernie w kompozycji tak, że kompozycję można łatwo podzielić na równie skuteczne jednostkowe postacie dawkowania, takie jak tabletki, pigułki i kapsułki. Stałą kompozycję wstępną dzieli się dalej na jednostkowe postacie dawkowania zawierające od 0,1 do około 500 mg substancji czynnej według wynalazku. Tabletki lub pigułki z nowej kompozycji można powlekać lub inaczej otoczyć uzyskując postać dawkowania o korzystnym przedłużonym działaniu. Przykładowo, tabletka lub pigułka może składać się z wewnętrznej warstwy dozującej i zewnętrznej warstwy dozującej, gdzie druga stanowi otoczkę pierwszej. Obie mogą być rozdzielone warstwą dojelitową, która ma zapobiec rozpadowi w żołądku i umożliwić przejście składnika z warstwy wewnę trznej, przeniknię cie w stanie nienaruszonym do dwunastnicy lub opóź nić uwalnianie. Do tych warstw lub otoczek dojelitowych można użyć rozmaitych materiałów, takie substancje obejmującą wiele kwasów polimerycznych i mieszanin kwasów polimerycznych z takimi substancjami jak szelak, alkohol cetylowy i octan celulozy.

PL 211 654 B1

Odpowiednie substancje powierzchniowo-czynne obejmują, w szczególności, środki niejonowe, takie jak polioksyetylenosorbitany (np. Tween™ 20, 40, 60, 80 lub 85) i inne sorbitany (np. Span^TM 20, 40, 60, 80 lub 85). Kompozycje z substancją powierzchniowo czynną będą dogodnie zawierać pomiędzy 0,05 i 5% substancji powierzchniowo czynnej lub pomiędzy 0,1 i 2,5%. Należy rozumieć, że można dodawać inne składniki, np. mannitol lub inne farmaceutycznie dopuszczalne rozczynniki, jeśli to konieczne.

Odpowiednie emulsje można wytworzyć stosując dostępne w handlu emulsje tłuszczowe, takie jak Intralipid^TM, Liposyn^TM Infonutrol^TM, Lipofundin^TM, Lipiphysan^TM. Substancja czynna może być rozpuszczona w emulsji kompozycji jako premix lub alternatywnie może być rozpuszczona w oleju (np. olej sojowy, olej szafranowy, olej z nasion bawełny, olej sezamowy, olej kukurydziany lub olej migdałowy) a właściwą emulsję uzyskuje się po zmieszaniu z fosfolipidem (np. fosfolipidy jajka, fosfolipidy sojowe lub lecytyna sojowa) i wodą. Należy rozumieć, że dla uzyskania właściwej toniczności emulsji można dodawać inne składniki, np. glicerol lub glukozę. Odpowiednie emulsje będą typowo zawierać do 20% oleju, np. pomiędzy 5 i 20%. Emulsja tłuszczowa może zawierać kropelki tłuszczu pomiędzy 0,1 i 1,0 pm, szczególnie 0,1 i 0,5 pm, a zakres jej pH może wynosić 5,5 do 8,0.

Kompozycje w postaci emulsji obejmują te wytworzone przez zmieszanie antagonisty czynnika wzrostu nerwów z Intralipid'em^TM lub jego składnikami (olej sojowy, fosfolipidy jajka, glicerol i woda).

Kompozycje do inhalacji lub wdmuchiwania obejmują roztwory i zawiesiny w farmaceutycznie dopuszczalnych, wodnych lub organicznych rozpuszczalnikach lub ich mieszaninach oraz proszki. Kompozycje płynne lub stałe mogą zawierać odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne rozczynniki, jak przedstawiono powyżej. Kompozycje podaje się doustnie lub donosowo dla uzyskania efektu miejscowego lub ogólnoustrojowego. Kompozycje w korzystnych sterylnych farmaceutycznie dopuszczalnych rozpuszczalnikach można rozpylać przez zastosowanie gazów.

Rozpylone roztwory można wdychać bezpośrednio z urządzenia do nebulizacji lub urządzenie do nebulizacji może być połączone z maską na twarz, namiotem lub aparatem oddechowym w sposób przerywany wytwarzając nadciśnienie.

Z urządzenia, które odpowiednio podaje preparat (w tym doustnie lub donosowo) można podawać kompozycje w postaci roztworu, zawiesiny lub proszku.

Skuteczność leczenia można oszacować metodami dobrze znanymi w dziedzinie.

P r z y k ł a d y

Przedmiot wynalazku zilustrowano w przykładach wykonania.

P r z y k ł a d 1

Przeciwciało monoklonalne Anty-NGF jest skuteczne w leczeniu bólu pooperacyjnego

Aby ocenić skuteczność leczenia przeciwciałem 911 anty-NGF (mysie przeciwciało monoklonalne posłużono się modelem bólu naśladującym ból po operacji chirurgicznej [Hongo, i in., Hybridoma 19:215-227 (2000)]. Każde doświadczenie przeprowadzono na grupie 16 zwierząt (n=8 na grupę). Przeciwciało anty-NGF wstrzykiwano dootrzewnowo (i.p.) w różnych stężeniach (35 lub 7 miligramów na kilogram) na doświadczenie, 15 godzin przed nacięciem. Grupie kontrolnej nie podawano przeciwciała lecz wstrzykiwano dootrzewnowo roztwór solanki.

Zwierzęta. Samce szczurów Sprague Dawley o masie ciała pomiędzy 220-240 gram zakupiono z firmy Harlan (San Diego) zwierzęta aklimatyzowały się do zwierzętarni przez tydzień przed zabiegiem operacyjnym.

Zabieg operacyjny. Zabieg operacyjny wykonano na podstawie opisu Brennana, i in. Pain 64:493-501 (1996). Zwierzęta znieczulono 2% izofluranem w mieszaninie z powietrzem, którą podawano podczas zabiegu operacyjnego poprzez maseczkę na nos w kształcie stożka. Spodnią powierzchnię prawej tylnej łapy przemyto wacikiem nasączonym jodyną powidonową i wykonano 1-cm centralne podłużne nacięcie poprzez skórę i powięź, 0,5 cm wyjściowo od krawędzi pięty w kierunku palców stopy. Pomiarów dokonano linijką przy czym stopa była w pozycji zgiętej. Mięsień podeszwowy uniesiono stosując zakrzywione szczypczyki i podłużnie nacięto. Mięsień nacięto na całą jego głębokość, pomiędzy jego początkiem a przyczepem. Krwawienie kontrolowano w trakcie operacji stosując nacisk przez tampon z gazy. Ranę zamknięto dwoma szwami materacowymi (5-0 Ethilon Black, pojedyncze włókno). Szwy zawiązano 5-6 razy, przy czym pierwszy węzeł zaciśnięto luźno. Zranione miejsce pomalowano roztworem bacytracyny. Zwierzęta pozostawiono do obudzenia i odpoczynku w czystych klatkach na co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem testu behawioralnego.

PL 211 654 B1

Ocena bólu spoczynkowego. Aby ocenić ból w odniesieniu do przyrostu masy użyto kumulacyjnej oceny bólu. Zwierzęta umieszczono na plastikowej siatce (oczka: 8 mm²) w przezroczystych plastikowych klatkach na podwyższeniu na platformie (wysokość: 18) co umożliwiało obserwowanie spodniej strony ich łapek. Po 20 minutach aklimatyzacji, udźwig masy oszacowano na skali 0 do 2. Zero punktów przyznawano gdy łapka bielała lub naciskała na siatkę, wskazując na pełny udźwig masy. Jeden punkt przyznawano jeśli tylko skóra łapki dotykała siatki, bez zblednięcia lub wgniecenia skóry. Dwa punkty przyznawano jeśli zwierzę trzymało łapkę z dala od siatki. Wzdryganie łapy oceniano na 2 punkty jeśli szczur nadal był w spoczynku. Każde zwierzę obserwowano przez 1 minutę co 5 minut przez 30 minut. Aby ocenić ból w naciętej stopie zsumowano 6 wyników (0-12) otrzymanych w trakcie 1/2-godziny. Obliczono także częstość występowania oceny 2 i użyto do oceny częstości występowania silnego bólu lub pełnego chronienia łapki przez zwierzę. Każde zwierzę badano 24 godziny przed zabiegiem operacyjnym (wyjściowo) i 2 godziny, 24 godziny, 48 godzin i 72 godziny pozabiegu operacyjnym. Wyniki doświadczenia przedstawiono na fig. 1, gdzie podano kumulacyjną ocenę bólu spoczynkowego u zwierząt, którym podano mysie przeciwciało 911 anty-NGF w dawce 35 mg/kg. Te wyniki wskazują, że potraktowanie przeciwciałem anty-NGF znacznie zmniejszało pooperacyjny ból spoczynkowy. Udźwig masy był dobrym wskaźnikiem z jaką chęcią zwierzę posługiwało się kończyną a zatem stanowił skuteczną ocenę ulgi w bólu.

Ocena bólu mechanicznego wywołanego wykorzystując allodynię dotykową.

Allodynię dotykową zmierzono wykorzystując włosy Semmes-Weinstein von Frey (Stoelting, Wood Dale, IL). Zwierzęta umieszczono w klatkach z dnem w postaci plastikowej kratki 12 mm, umieszczonych na platformie (wysokość: 18) co umożliwiało dostęp do spodniej strony łapek. Przed rozpoczęciem doświadczenia zwierzęta przyzwyczajano do otoczenia (przez 1-2 dni poprzedniego tygodnia). Po 15 minutach aklimatyzacji, zbadano allodynię dotykową dotykając skórę, w środkowym i proksymalnym odcinku względem początku nacięcia na pięcie tylnej łapki zwierzęcia posługując się włosami von Frey'a z coraz większą siłą aż do uzyskania reakcji cofnięcia łapki. Zastosowano liczby von Frey'a 4,08 do 5,46; każda liczba odpowiada sile w gramach, jak opisano poniżej. Każdym z włosów von Frey'a dotykano powierzchni pod właściwym kątem, zginając włosy przez 2 sekundy lub aż do wystąpienia reakcji. Z chwilą uzyskania reakcji cofnięcia, łapkę testowano ponownie w dwóch próbach, zmniejszając nacisk włosów von Frey'a aż do chwili gdy nie uzyskiwano już żadnej reakcji.

Najmniejszą wielkość siły w gramach, wymaganą do wywołania odpowiedzi w trzech próbach, zarejestrowano jako próg cofnięcia. Największa siła 29 g, która spowodowała uniesienie łapki jak również wywoływała reakcję, stanowiła górną granicę. Jeśli nie obserwowano żadnej reakcji, wówczas do rejestracji stosowano włókno wstępujące „5,88. W ten sposób badano zarówno lewe jak i prawe łapki. Każde zwierzę badano 24 godziny przed zabiegiem operacyjnym (wyjściowo) i 2 godziny, 24 godziny, 48 godzin i 72 godzin po operacji. Allodynię dotykową badano po ocenie bólu spoczynkowego. Wyniki doświadczenia przedstawiono na fig. 3, gdzie podano kumulacyjną ocenę w odpowiedzi na stymulację mechaniczną u zwierząt, którym podano przeciwciało 911 anty-NGF w dawce 7 mg/kg. Te wyniki wskazują, że potraktowanie przeciwciałem anty-NGF zmniejszało ból pooperacyjny wywołany bodźcem mechanicznym.

Ocena termicznej przeczulicy bólowej.

Termiczną przeczulicę bólową oceniono za pomocą testu na podeszwach łapek szczura (Ugo Basile, Italy) według zmodyfikowanej metody Hargreaves'a, i in. (1988). Szczury przyzwyczajono do urządzenia składającego się z czterech osobnych boksów z pleksiglasu na uniesionym szklanym stole. Pod stołem umieszczono ruchome źródło promieniowania cieplnego i skupiono je na tylną łapkę. Kiedy zwierzę jest spokojne ale nie śpi, wciska się włącznik przy boksie kontrolnym, zaczyna pracować źródło promieniowania cieplnego i automatycznie mierzy się czas do chwili aż zwierzę cofnie łapkę od źródła. Ten czas do chwili cofnięcia łapki (PWL) określano za pomocą detektora światła wbudowanego w źródło promieniowania cieplnego, rejestrującego ruch łapki szczura jako zmianę w odbiciu promieni. Rejestrowano, w sekundach, czas do chwili cofnięcia łapki. Aby zapobiec uszkodzeniu tkanki urządzenie wyłączało się automatycznie po czasie 22,5 sekundy. Czas PWL mierzono trzy do czterech razy dla obu tylnych łapek każdego zwierzęcia, przy czym średnia z tych pomiarów stanowiła wartości wyjściowe dla prawych i lewych tylnych łapek. Wyniki przedstawiono jako stosunek oceny dla prawej łapki (operowanej) i lewej łapki. Urządzenie kalibrowano jeden raz (na początku badania) a intensywność ustawiono na 40 uzyskując normalny PWL około 6 sekund. Każde zwierzę badano 24 godziny przed zabiegiem operacyjnym (wyjściowo) i 3 godziny, 24 godziny, 48 godzin i 72 godziny po zabiegu. Oceny termicznej przeczulicy bólowej dokonano po ocenie allodynii dotykowej. WyPL 211 654 B1 niki doświadczenia przedstawiono na fig. 2, gdzie podano ocenę kumulacyjną dla zwierząt, którym podano przeciwciała anty-NGF 911 w dawce 35 mg/kg, w odpowiedzi na stymulację termiczną. Te wyniki wskazują, że potraktowanie przeciwciałem anty-NGF znacznie zmniejszyło termiczną przeczulicę bólową po zabiegu chirurgicznym.

P r z y k ł a d 2

Leczenie bólu pooperacyjnego z zastosowaniem humanizowanego przeciwciała anty-NGF i porównanie z leczeniem bólu pooperacyjnego z zastosowaniem opioidów

Wpływ humanizowanego przeciwciała anty-NGF, określanego jako E3, na ból pooperacyjny badano u zwierzęcym modelu bólu pooperacyjnego, tak jak to opisano w przykładzie 1. Przeciwciało E3 zawiera region stały łańcucha ciężkiego ludzkiego IgG2a z następującymi mutacjami: A330P331 do S330S331 (numeracja aminokwasów w odniesieniu do sekwencji IgG2a typu dzikiego, Eur, J. Immunol, (1999) 29:2613-2624), region stały ludzkiego lekkiego łańcucha kappa i zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha pokazane w tablicach 1 i 2,

Przeciwciało anty-NGF wstrzykiwano dootrzewnowo (i.p.) w różnych stężeniach (0, 004, 0,01, 0,02, 0,1, 0,6, i 1 mg na kilogram masy zwierzęcia) 15 godzin przed nacięciem. Zwierzęta z grupy stanowiącej kontrolę negatywną nie otrzymały przeciwciała lecz wstrzykiwano im dootrzewnowo roztwór solanki. Zwierzętom z grupy stanowiącej kontrolę pozytywną wstrzykiwano dootrzewnowo fentanyl w dawce 0,01 mg/kg, 30 minut przed testem, 24 godziny po zabiegu operacyjnym. Każda grupa doświadczalna liczyła 8 zwierząt (n=8 na grupę) dla każdego przypadku a grupa kontrolna liczyła 56 zwierząt. Zabieg operacyjny przeprowadzono i dokonane kumulacyjnej oceny bólu, tak jak to opisano w przykładzie 1, z tym wyjątkiem, że samce szczurów Sprague Dawley zakupiono z firmy Harlan (Wisconsin). Ból spoczynkowy oszacowano 24 godziny po zabiegu operacyjnym, tak jak to opisano w przykładzie 1.

Jak pokazano na fig. 4, humanizowane przeciwciało E3 anty-NGF, w dawce 0,02 mg/kg do 1 mg/kg, znacznie zmniejszało ból spoczynkowy (p < 0,05) po zabiegu operacyjnym. „* oznacza istotną różnicę w porównaniu z kontrolą (p < 0,05). Przeciwciało w dawce 0,02 mg/kg zmniejszało zachowanie bólowe co najmniej tak skutecznie jak fentanyl w dawce 0,01 mg/kg. Ta dawka fentanylu odpowiada 10-krotnej normalnej dawce silnego opioidu dla człowieka.

P r z y k ł a d 3

Przed- i pooperacyjne stosowanie przeciwciała anty-NGF w leczeniu bólu pooperacyjnego

Skuteczność przeciwciał anty-NGF w zmniejszaniu bólu pooperacyjnego podawanych po nacięciu badano na zwierzęcym modelu bólu pooperacyjnego opisanym w przykładzie 1, stosując samce szczurów Sprague Dawley zakupione z firmy Harlan (Wisconsin). Humanizowane przeciwciało antyNGF E3 (0,5 mg/kg) wstrzykiwano dożylnie (i.v.) dwie godziny po nacięciu. Zwierzęta z grupy kontrolnej nie otrzymały przeciwciała lecz wstrzykiwano im dożylnie roztwór solanki. Przeprowadzono operację i 24 godziny po zabiegu operacyjnym, dokonano kumulacyjnej oceny bólu spoczynkowego, tak jak to opisano w przykładzie 1. Jak pokazano na fig. 5, zastosowanie przeciwciała anty-NGF znacznie (p < 0,05) zmniejszyło ból spoczynkowy 24 godziny po nacięciu, gdy przeciwciało to podano 2 godziny po nacięciu. Wyniki te wskazują, że przeciwciało anty-NGF podawane po zabiegu operacyjnym skutecznie zmniejszało ból pooperacyjny.

Skuteczność przeciwciał anty-NGF w zmniejszaniu bólu pooperacyjnego po podaniu 14 dni lub 21 dni przed nacięciem badano na modelu zwierzęcym opisanym w przykładzie 1, stosując samce szczurów Sprague Dawley zakupione z firmy Harlan (Wisconsin). Mysie przeciwciało monoklonalne 911 anty-NGF wstrzykiwano dootrzewnowo w różnych stężeniach (1 mg/kg lub 5 mg/kg) 14 dni lub 21 dni przed nacięciem. Zwierzętom z grupy kontrolnej wstrzykiwano dootrzewnowo roztwór solanki. Przeprowadzono operację 24 godziny po zabiegu operacyjnym a ból spoczynkowy wyrażony jako kumulacyjną ocenę bólu oszacowano tak jak to opisano w przykładzie 1. Jak pokazano na fig. 6 i 7, przeciwciało 911 anty-NGF podawane 14 dni przed zabiegiem operacyjnym w dawce 5 mg/kg znacznie zmniejszało ból spoczynkowy oraz zmniejszało ból spoczynkowy gdy wstrzykiwano je 21 dni przed zabiegiem operacyjnym.

P r z y k ł a d 4

Potraktowanie przeciwciałem anty-NGF nie ma wpływu na gojenie się ran

W literaturze naukowej sugerowano, że podanie nadmiaru NGF może wspomagać gojenie się ran u zwierząt z cukrzycą (Matsuda i in. (1998) J. Exp Med 187 (3) : 297-30) oraz z wrzodami rogówki i skóry (Lambiase i in., (2003) Arch Ital Biol. 141 (2-3) : 141-8). Dla określenia czy zastosowanie prze32

PL 211 654 B1 ciwciał anty-NGF utrudniłoby gojenie się ran, u szczurów zbadano wpływ przeciwciał anty-NGF na gojenie się ran.

Samce szczurów Sprague-Dawley o masie 250-350 g zakupiono z firmy Harlan (Wisconsin) przeniesiono do zwierzętarni i aklimatyzowano przez co najmniej jeden tydzień. Zwierzęta znieczulono izofluranem, ogolono powierzchnię grzbietu (plecy) i oczyszczono gazikiem nasączonym jodyną powidonową a następnie alkoholem.

W ś rodkowej części pomiędzy łopatkami nacięto skórę na długości 2,5 cm. Krwawienie kontrolowano stosując nacisk tamponem z gazy. Ranę zamknięto czterema pojedynczymi szwami 4-0 Ethilon i zwierzęta pozostawiono do obudzenia. Zwierzęta podzielono później na trzy grupy: jedna grupa otrzymała jedną dawkę mysiego przeciwciała monoklonalnego 911 anty-NGF podczas zabiegu (1 mg/kg, dootrzewnowo), druga grupa, jako kontrola pozytywna, otrzymywała domięśniowo (IMO) ketorolak (5 mg/kg na dzień przez pięć dni od dnia zabiegu, a grupa kontrolna otrzymywała solankę (kontrola negatywna). Wiadomo, że ketorolak hamuje gojenie się ran. Haws i in. (1996) Ann Plast Surg. 37 (2) : 147-51; Gerstenfeld i in. (2003) J Ortop Res. 21 (4):670-5.

Codziennie badano i fotografowano powierzchnię nacięcia rozpoczynając w 1 dniu po zabiegu operacyjnym. Szwy usunięto 2 dnia po zabiegu operacyjnym.

Nacięcia oceniono jako „nienaruszone jeśli całe nacięcie pozostało zamknięte i „uszkodzone jeśli otworzyły się niektóre lub wszystkie nacięcia. Wyniki wyrażono jako udział ran nienaruszonych (tj. liczbę ran nienaruszonych podzieloną przez całkowitą liczbę ocenianych zwierząt).

Jak pokazano na fig. 8, gojenie się ran u zwierząt, którym podano przeciwciało 911 anty-NGF nie różniło się znacznie od gojenia u zwierząt, którym podano solankę. Zatem, terapia anty-NGF nie miała żadnego widocznego wpływu na gojenie się ran. Natomiast, u zwierząt otrzymujących ketorolak gojenie się ran było znacznie zahamowane w porównaniu ze zwierzętami, którym podawano solankę lub przeciwciało 911 anty-NGF (p < 0,0005).

Badano również wygląd histologiczny zagojonych ran u 3 szczurów, którym podano przeciwciało anty-NGF i 3 szczurów, którym podano solankę. 21 dni po nacięciu zwierzęta uśmiercono i próbkę skóry obejmującą powierzchnię nacięcia utrwalono w formalinie, zatopiono w parafinie i pocięto na skrawki w poprzek miejsca nacięcia. Skrawki te potraktowano przeciwciałem anty-NGF lub solanką barwioną hematoksyliną i eozyną i badał je patolog weterynaryjny niepoinformowany o przebiegu doświadczenia. W żadnej grupie szczurów nie zaobserwowano nieprawidłowości w gojeniu się ran.

P r z y k ł a d 5

Leczenie bólu pooperacyjnego z zastosowaniem drobnocząsteczkowego antagonisty NGF, K252a

Skuteczność antagonisty NGF K252a w leczeniu bólu pooperacyjnego badano w modelu nacięcia opisanym w przykładzie 1. Przygotowano roztwór 25 mg/ml K252a w DMSO.

Do 250 μΐ tego roztworu, dodano 3500 μΐ roztworu 45% cyklodekstryny i dobrze wymieszano. Później dodano 3750 μl solanki do uzyskania końcowego stężenia 0,8333 mg/ml K252a.

U zwierząt (otrzymanych według opisu w przykładzie 2) wykonano nacięcie i oszacowano ból spoczynkowy, tak jak to opisano w przykładzie 1. „Wyjściową kumulacyjną ocenę bólu spoczynkowego uzyskano 24 godziny po nacięciu. Później zwierzętom testowym wstrzykiwano dootrzewnowo K252a w dawce mg/kg, a zwierzętom kontrolnym wstrzykiwano roztwór rozczynnika (roztwór zawierający wszystkie składniki roztworu K252a z wyjątkiem K252a). Kumulacyjną ocenę bólu spoczynkowego uzyskano 1 godzinę po podaniu K252a lub rozczynnika (co oznaczono na figurze jako „1H-P-tmt) i 3 godziny po podaniu K252a lub rozczynnika (co oznaczono na figurze jako „3H-P-tmt) przy udziale eksperymentatora nie poinformowanego o przebiegu doświadczenia. Jak pokazano na fig. 9, zastosowanie K252a znacznie zmniejszało ból spoczynkowy (p<0,005) 3 godziny po podaniu, podczas gdy zastosowanie rozczynnika nie dało takiego rezultatu.

Wyniki te wskazują, że zastosowanie K252a zmniejszało ból spoczynkowy w takim samym zakresie jak przeciwciało anty-NGF w podobnych doświadczeniach.

P r z y k ł a d 6

Porównanie bólu pooperacyjnego u zwierząt, którym podano przeciwciało anty-NGF lub przeciwciało kontrolne o dopasowanym izotypie

By wykazać, że dla przeciwbólowego działania przeciwciał anty-NGF niezbędne jest hamowanie NGF, skuteczność mysiego przeciwciała 911 anty-NGF w leczeniu bólu pooperacyjnego porównano ze skutecznością kontrolnego mysiego przeciwciała o dopasowanym izotypie immunoreaktywnego względem białka amnesiac drozofili, w takiej samej dawce. Doświadczenie przeprowadzono tak jak

PL 211 654 B1 w przykładzie 1, z tym wyjątkiem, że szczury Sprague-Dawley zakupiono z firmy Harlan (Wisconsin). Szczurom podano dootrzewnowo przeciwciało 911 anty-NGF (co oznaczono na fig. jako „911) lub przeciwciało anty-amnesiac o dopasowanym izotypie (co oznaczono na figurze jako „amn ab) 15 godzin przed zabiegiem operacyjnym w dawce 1 mg/kg. 24 godziny po zabiegu operacyjnym, obserwator nie poinformowany o przebiegu doświadczenia na zwierzętach ocenił ból spoczynkowy (kumulacyjna ocena bólu). Jak pokazano na fig. 10, podanie przeciwciała 911 anty-NGF (p < 0,005) znacznie zmniejszało ból spoczynkowy w porównaniu ze zwierzętami, którym podano przeciwciało przeciwko białku amnesiac. Wyniki te wskazują, że działanie przeciwbólowe przeciwciała anty-NGF jest specyficzne.

Claims (11)

1. Przeciwciało skierowane przeciwko NGF do zastosowania w leczeniu bólu pooperacyjnego.

2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest stosowane w tłumieniu lub łagodzeniu bólu spoczynkowego.

3. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest stosowane w tłumieniu lub łagodzeniu bólu spoczynkowego bólu wywołanego mechanicznie.

4. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem ludzkim.

5. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym.

6. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienne tym, że przeciwciało łączy się z ludzkim NGF.

7. Przeciwciało według zastrz. 6, znamienne tym, że przeciwciało łączy się z ludzkim NGF z powinowactwem wiązania około 0,1 nM.

8. Przeciwciało według zastrz. 6, znamienne tym, że przeciwciało łączy się z ludzkim NGF z powinowactwem wiązania od około 2-22 pM.

9. Przeciwciało według zastrz. 8, znamienne tym, że przeciwciało łączy się z epitopem NGF zawierającym jedną lub więcej spośród reszt: K32, K34 i E35 w regionie zmiennym 1 (aminokwasy 23-35) hNGF, reszty F79 i T81 w regionie zmiennym 4 (aminokwasy 81-88) hNGF, reszty H84 i K88 w regionie zmiennym 4, reszta R103 pomiędzy regionem zmiennym 5 (aminokwasy 94-98) hNGF i C-końcem (aminokwasy 111-118) hNGF, reszta Eli w regionie pre-zmiennym 1 (aminokwasy 10-23) hNGF, Y52 pomiędzy regionem zmiennym 2 (aminokwasy 40-49) hNGF i regionem zmiennym 3 (aminokwasy 59-66) hNGF, reszty L112 i S113 w C-końcu hNGF, reszty R59 i R69 w regionie zmiennym 3 hNGF lub reszty V18, V20, i G23 w regionie pre-zmiennym 1 hNGF.

10. Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko NGF do wytwarzania leku do leczenia bólu pooperacyjnego.

11. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu bólu pooperacyjnego zawierająca przeciwciało skierowane przeciwko NGF oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik.