KR20050071559A - 신경성장인자 길항제를 투여함에 의한 수술-후 통증의치료방법 및 그를 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경성장인자(NGF)의 길항제를 투여함에 의한 수술 또는 절개로 인한 통증을 예방 또는 치료하기 위한 방법 및 조성물을 특징으로 한다. NGF 길항제는 hNGF와 결합할 수 있는 항-NGF(항-hNGF와 같은) 항체일 수 있다.

Description

신경성장인자 길항제를 투여함에 의한 수술-후 통증의 치료방법 및 그를 함유하는 조성물{METHODS FOR TREATING POST-SURGICAL PAIN BY ADMINISTERING A NERVE GROWTH FACTOR ANTAGONIST AND COMPOSITIONS CONTAINING THE SAME}

본 발명은 수술-후 통증의 예방, 개선, 또는 치료를 위한 신경성장인자(NGF) 길항제의 사용에 관한 것이다.

신경성장인자(NGF)는 최초로 확인된 뉴로트로핀이며, 말초 뉴런과 중추 뉴런의 발생 및 생존에서의 역할이 잘 특성화되어 있다. NGF는 말초 교감 및 배아 감각 뉴런과 기저 전뇌 콜린성 뉴런의 발생에서 중요한 생존 및 유지 인자인 것으로 나타났다(Smeyne, 등, Nature 368:246-249(1994); Crowley, 등, Cell 76:1001-1011 (1994)). NGF는 감각 뉴런에서 뉴로펩티드의 발현을 상향조절하는데(Lindsay, 등, Nature 337:362-364 (1989)), 그것의 활성은 두 가지 상이한 멤브레인-결합 수용체인 TrkA 티로신 키나제 수용체와 종양괴사인자 수용체 패밀리의 다른 멤버와 구조적으로 관련된 p75 수용체를 통해 매개된다(Chao 등, Science 232:518-521(1986)).

신경계통에서의 효과에 더하여 NGF는 신경계통 외부의 과정에도 더욱 연루되었다. 예를 들어, NGF는 혈관 투과성을 증진시키고(Otten, 등, Eur J Pharmacol. 106:199-201(1984)), T- 및 B-세포 면역반응을 증진시키고(Otten, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10059-10063(1989)), 림프구 분화와 비만세포 증식을 유도하고, 비만세포에서 가용성 생물학적 신호의 방출을 일으키는 것으로 나타났다(Matsuda, 등, Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:6508-6512(1988); Pearce, 등, J Physio. 372: 379-393(1986); Bischoff, 등, Blood 79:2662-2669(1992); Horigome, 등, J Biol. Chem. 268:14881-14887(1993)). 외인성으로 추가된 NGF는 이들 효과를 모두 가질 수 있는 것으로 알려졌지만, 내인성 NGF는 생체내에서 이들 과정 중 어느 것에서도 거의 중요하지 않은 것으로 나타난 것에 주목하는 것이 중요하다(Torcia 등, Cell. 85 (3):345-56(1996)). 따라서, 어떤 효과가 내인성 NGF의 생체활성을 억제하는지는 분명하지 않다.

NGF는 비만세포(Leon, 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:3739-3743(1994)), B-림프구(Torcia 등 Cell 85:345-356(1996), 각질세포(Di Marco 등, J Biol. Chem. 268:22838-22846), 평활근세포(Ueyama 등 J Hypertens. 11:1061-1065(1993)), 섬유모세포(Lindholm 등, Eu. I. Neuosci. 2:795-801(1990)), 기관지 상피세포(Kassel, 등, Clin, Exp. Allergy 31:1432-40(2001) ), 신장 혈관사이세포(Steiner, 등, Am. J Physiol. 261:F792-798(1991)) 및 골격근 근육대롱(Schwartz, 등, J Photochem, Photobiol. B 66:195-200(2002))을 포함하는 다양한 세포 종류들에 의해 생성된다. NGF 수용체는 신경계통 이외의 다양한 세포 종류에서 발견되었다. 예를 들어 TrkA는 사람 단구, T- 및 B-림프구 및 비만세포에서 발견되었다.

증가된 NGF 수준과 다양한 감염성 상태간의 관계가 사람 환자에서 뿐만 아니라 몇몇 동물 모델에서 관찰되었다. 이들은 전신홍반성루프스(Bracci-Laudiero 등 Neuroreport 4:563-565(1993)), 다발성 경화증(Bracci-Laudiero 등 Neurosci.Lett. 147:9-12(1992)), 건선(Raychaudhuri 등, Acta Derm. l'enereol. 78:84-86(1998)), 관절염(Falcimi, 등, Ann. Rheum. Dis. 55:745-748(1996)), 사이질방광염(Okragly, 등, J. Urology 161:438-441(1991)) 및 천식(Braun, 등, Eur. Jlmmunol. 28:3240-3251(1998))을 포함한다.

일관되게 말초 조직에서 NGF의 상승된 수준은 염증과 관련되며 많은 형태의 관절염에서 관찰되었다. 류마티스관절염에 걸린 환자의 활액막은 높은 수준의 NGF를 발현하며 염증이 없는 활액막에서는 NGF가 검출되지 않았다고 보고되었다(Aloe, 등, Arch. Rheum. 35:351-355(1992)). 유사한 결과가 류마티스관절염을 실험적으로 유발시킨 래트에서 나타났다(Aloe 등 Clin.Exp. Rheumatol. 10:203-204(1992)). NGF의 상승된 수준이 비만세포 수의 증가와 함께 관절염에 걸린 트랜스제닉 마우스에서 보고되었다(Aloe, 등, Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143(1993)).

외인성 NGF를 사용한 치료는 통증 및 통증 감수성의 증가를 가져온다. 이것은 NGF의 주사가 동물 모델(Amann, 등, Pain 64,323-329(1996); Andreev, 등, Pain 63, 109-115(1995)) 및 사람(Dyck, 등, Neurology 48, 501-505(1997); Petty, 등, Annals Neurol. 36, 244-246(1994))에서 통증 및 통증 감수성의 상당한 증가를 가져온다는 사실에 의해 예시된다. NGF는 뉴로트로핀 BDNF를 유도(Apfel, 등, Mol. Cell.Neurosci.7(2), 134-142(1996); Michael 등 J.Neurosci 17, 8476-8490(1997)) 한 다음 이어서 척수에서의 통증 신호 프로세싱을 변화(Hains, 등, Neurosci Lett. 320(3), 125-8(2002); Miletic 등 Neurosci Lett. 319(3), 137-40(2002); Thompson 등, Proc Natl Acad Sci USA 96(14), 7714-8(1999))시키는 메카니즘; 감각 뉴런 및 척수에 있는 다른 통증-전달 뉴런의 말초 및 중추 연결에 변화를 유도하는 메카니즘(Lewin, 등, European Journal of Neuroscience 6, 1903-1912(1994); Thompson, 등, Pain 62,219-231(1995)), 축삭 성장에 변화를 유도하는 메카니즘(Lindsay, RM, J Neurosci 8(7), 2394-405(1988)), 브라디키닌 수용체 발현을 유도하는 메카니즘(Peterson 등, Neuroscience 83:161-168(1998)), 이온 채널과 같은 신경 활성화 및 전도를 초래하는 유전자의 발현에 변화를 유도하는 메카니즘(Boettger, 등, Brain 125(Pt 2), 252-63(2002); Kerr, 등, Neuroreport 12(14), 3077-8(2001); Gould 등 Brain Res 854(1-2), 19-29(2000)), 통증 관련 수용체 VR1의 효능을 강화시키는 메카니즘(Chuang, 등, Nature 411(6840), 957-62(2001); 및 근육에 병리학적 변화를 일으키는 메카니즘(Foster, 등, J Pathol 197(2), 245-55(2002))을 포함하는 다수의 메카니즘에 의해 작용하는 것으로 밝혀졌다. 이들 변화의 대부분은 통증 전달 감각 뉴런에서 직접 발생하며 수반된 염증에는 의존하지 않는 것이 분명하다. 게다가, NGF에 반응한다고 알려진 통증 감각이나 감수성의 변화에 연루될 수 있는 적어도 두 가지의 다른 세포 종류가 있다. 이들 중 첫번째인 비만세포는 탈과립화와 함께 NGF에 반응하거나(Yan, 등, Clin. Sci.(Lond) 80:565-569(1991)), 다른 연구에서는 조절인자 생성을 일으키거나 감소시키고, 또는 다른 제제와 협력하여 방출한다(Pearce 및 Thompson, J.Physiol. 372:379-393(1986), Kawamoto 등 J Immunol. 168:6412-6419(2002))고 보고되었다. NGF 매개 통증 반응이 적어도 다소는 비만세포(Lewin 등 Eur. J Neurosci. 6:1903-1912(1994), Woolf 등 R Neurosci. 16:2716-2723 (1996) 에 의해 매개된다는 것이 래트에서 분명히 나타났으며, 이것의 잠재적 관련성은 사람에서도 여전히 나타나고 있다. 또, 일차 교감 뉴런도 NGF에 반응하며 통증 신호화에도 연루된다고 알려져 있다(Aley, 등, Neuroscience 71:1083-1090 (1996)). 교감신경분포의 제거가 NGF를 사용한 치료에 대한 반응에서 통상 보여지는 통각과민을 조절하는 것이 분명하다(Woolf 등 J Neurosci 16:2716-2723(1996)).

매년 2300만명의 환자들이 수술을 받고 있다. 통증은 보통 수술 부위의 근처에 국한된다. 수술-후 통증은 두 가지의 임상적으로 중요한 양태, 즉 휴식기의 통증, 또는 환자가 움직이지 않을 때 발생하는 통증과 움직임(기침/재채기, 침대에서 일어날 때, 물리치료 등)에 의해 악화되는 기계적인 통증을 가질 수 있다. 대수술에서 수술-후 통증 관리가 갖는 주된 문제는 현재 사용되는 약물이 회복을 지연시키고 입원기간을 연장시키고 어떤 취약한 환자군을 심각한 합병증의 위험에 처하게 하는 등의 여러 가지 두드러진 부작용을 가진다는 점이다. 수술-후 통증, 또는 수술이나 외상 후 발생하는 통증은 심각하며 주로 고치기 어려운 의학적 문제이다.

통증을 치료하는 약에는 일반적으로 두 가지 카테고리가 있는데, 이들은 모두 단점을 가진다. 첫번째 카테고리는 가벼운 통증이나 중간 정도의 통증을 치료하는데 사용되는 비스테로이드계 항염제(NSAID)를 포함하는데, 이들의 치료적 용도는 위 미란, 소화궤양의 형성 또는 십이지장 및 결장의 염증과 같은 바람직하지 않은 위장 효과에 의해 제한된다. NSAID는 또 오래 사용하면 신장 독성을 야기할 수 있고, 더 나아가 하기 설명된 대로 수술-후 통증을 포함하는 어떤 상태에 관련되거나 이들 상태로부터 생긴 통증을 치료하는데는 매우 비효과적이다. 두번째 카테고리는 중간 정도 통증 내지 심한 통증을 치료하는데 사용되는 모르핀 및 관련된 아편유사제들을 포함하는데, 이들의 치료적 용도는 진정작용, 혼돈, 변비, 호흡억제, 신장 급통증, 오랜 사용에 대한 내성 및 중독의 위험과 같은 바람직하지 않은 효과로 인해 제한된다. 따라서 부작용이 보다 적거나 전혀 없이 통증을 치료하는데 유용한 화합물이 필요하다.

통증은 주로 "염증성", "신경병증성", 또는 "내장성"으로 분류되지만, 이들 전통적인 일반적인 표지는 고유한 문제를 가진다. 이들은 상기한 매우 일반적인 카테고리 중 하나에 속한 통증의 모든 근원들 사이에 기계적 유사성이나 동일성을 내포한다. 사실은 많은 상이한 종류의 염증성 통증과 염증성이나 신경병증성이 아닌 통증의 근원들이 있다. 더 나아가, 염증성 성분을 가지고, 및/또는 종래대로 "염증성"이라고 칭해지는 통증의 종류가, 다른 생리학적 양태가 통증 상태에 기여하지 않는다는 것을 의미하는 것은 아니다. 예를 들어, 골관절염 및 사이질방광염은 그들의 명칭에 의해서 각각 관절 또는 방광의 무균 염증 상태로서 정의되지만, 이들 두 상태에 관련된 통증이 서로 기계적으로 아주 다르다는 것은 분명하다. 이것은 이들 종류의 통증과 관련하여 주어진 진통제 종류의 다양한 효과에 의해 나타난다. 골관절염을 가진 대다수의 환자는 NSAID를 사용하여 우수한 통증 완화(적어도 초기에는)를 얻는다. 그러나, NSAID 치료는 사이질방광염에는 완전히 비효과적이다.

수술-후 통증(절개-후 통증이라고도 함)은 주로 다양한 염증성 통증으로 간주된다. 수술-후 통증에 관한 "염증성" 성분이 있을 수 있으며, 분명히 추가의 메카니즘도 포함된다. 예를 들어, 수술이나 다른 상해 동안 혈관구조 및 신경은 절단되거나 열개된다. 이것은 염증만 생긴 조직에서는 일어나지 않는다. 신경의 절단이 아프다고 인식하게 되는 진행성 활성을 유발할 수 있음이 분명하다. 게다가, 절단된 혈관은 상대적으로 허혈성인 조직과, 또 염증만 있는 동안에는 존재하지 않는 통증 자극을 가져온다.

염증과 비교하여 수술 또는 상해-유발 통증에 연루된 상이한 메카니즘은 이 두 가지 상태에서의 통증 완화에 관한 다양한 약물학 및 근원적인 해부학적 기질에 의해 예시된다. 야마모토(Yamamoto) 등은(Brian Res. 909(1-2):138-144(2001)) 척수 N-아세틸-알파-연결 산성 디펩티다제(NAALADase)가 카라게난 주사의 염증성 자극을 수반하는 기계적 통증의 현저한 약화를 유발한다는 것을 밝혔다. 그러나, 절개 후 동일한 방식으로 NAALADase가 억제된 병행 실험에서는 기계적 통증의 약화가 없었다. 이들 관찰은 수술-후 통증의 기초를 이루는 생화학 또는 약물학이 염증성 통증의 기초를 이루는 것들과 구별된다는 것을 증명한다. 또, 통증 감각을 조절하는데 중요한 해부학적 구조가 수술-후 및 다른 통증 상태에서 시험되었다(Pogatzki 등 Snesthesiology, 96(5):1153-1160(2002.5)). 뇌줄기, 더 구체적으로는 위쪽 내측 수뇌에 대한 영향을 줄이는 것이 일반적인 염증성, 신경병증성 및 내장성 통증 상태에서의 이차 통각과민의 중요한 조절인자이다. 뇌줄기 영역이 손상되었을 때, 절개 후 측정된 어떤 통증 반응에서도 변화가 관찰되지 않았다. 이들 결과는 절개 후의 일차 및 이차 통각과민이 RMM으로부터의 영향을 축소시킴으로써 조절되지 않음을 나타낸다. 장딴지 절개 후 RMM에서 이차 통각과민까지의 촉진적 영향을 줄이는데 대한 기여가 없다는 것은, 절개-유발 통증이 염증성 및 신경병증성 통증과 비교하여 상이한 메카니즘을 포함했다는 견해를 지지한다. 수술-후 또는 상해-유발 통증의 염증성, 내장성 또는 신경병증성 통증과의 명백한 차이에 더하여, 이들 결과는 수술-후 통증(또는 상해-유발 통증)에 연루된 메카니즘이 다른 통증들과는 분명히 다르다는 것을 증명한다. 더 나아가, 수술-후 통증을 치료하는데 있어서 특정한 약물학적(또는 다른) 개입의 이용은 염증성, 내장성 또는 신경병증 통증 모델에서 약물학적 제제나 약물학적 개입을 시험함에 의해서는 예측될 수 없다.

또한, 휴식중의 통증의 소멸과 활동하고 있는 동안, 그리고 상처 부위의 기계적인 자극에 반응한 통증의 지속이 수술 후 환자에서 존재했다(Moiniche 등 Acta Anaesthesiol. Scand. 41:785-9(1997)). 연구들은 휴식중의 통증 및 절개에 의해 야기된 유발 통증이 상이한 들신경섬유 집단 및/또는 상이한 수용체들에 의해 전달되는 가능성을 지지한다. 이들 유발 반응을 억제하기 위해 국소마취제를 사용하는 것 이외에, 수술 후에 기침 및 움직임에 따른 통증을 현저히 줄이는 다소의 약물이 이용가능하다.

실험 절개 동안 통증을 차단하기 위해 국소마취제로 전치료하는 것은 진행중인 통증 및 일차 기계적 통각과민을 초기 예방한다는 것을 나타냈다. 또, 절개로 인한 통증은 상해 후 리도카인이 주사된 때 소멸한다. 그러나, 국소마취제의 효과가 약화됨에 따라 일차 통각과민이 회복된다. 환자에서 수술 전에 행해진 국소마취제 주사는 통증을 줄이기 위해 수술 후 행해진 주사와 대략 동일하다(Moiniche, 등, Anesthesiology 96:725-41(2002))

사람 지원자에서의 임상연구 실험과 임상전 절개 모델은 절개 전후의 국소마취제의 투여가 대략 동일하다는 것에 일치한다. 절개 및 민감화 동안의 중추 통증 전달 뉴런의 활성화가 수일 후의 통증 거동에 반드시 필요한 것은 아니다. 오히려 절개에 있어서 중추 뉴런의 증진된 반응성 및 통증은 절개로부터의 진행중인 구심성 자극을 필요로 한다. 어떤 절개 전 마취제 치료가 약화된 후에 수술 상처는 민감화를 다시 시작하고 통증 반응을 다시 생성할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Pogatzki 등 J Neurophysiol 87:721(2002))

또한, 절개에 의해 야기된 통각과민 부위(손상되지 않은 구역을 포함해서)는 지도화되어 있다. 이차 통각과민(손상된 부위 밖의 통각과민)은 중추신경계의 증진된 반응성, 즉 중추 민감화의 한 척도이다. 절개에 의해 야기된 발적 부위나 붉어진 부위(아마도 측삭 반사의 결과)는 통각과민 부위와 구별되었다는 것에 주목한다. 휴식중의 통증 및 일차 기계적 통각과민에 대립하는 것으로서, 국소마취제 주사가 절개 전에 행해졌을 때는 더 큰 통각과민 부위가 절대 발생하지 않았다. 더구나, 이것은 절개 후 국소마취제 주사에 의해서도 역전될 수 없었다. 수술 후 환자에서, 어떤 경우, 어떤 치료는 통각과민 부위를 아주 감소시키지만 수술-후 통증의 임상적 측정치(통증 점수 및 아편유사제 소비)는 많이 변경시키지 못한다. 결장절제 후 통각과민 부위를 감소시키는 것이 급성 통증을 많이 줄이지는 않았지만 결장절제 후 6개월 정도 지난후에도 잔류한 통증이 발생한 다수의 환자에서는 감소와 관련되었다는 것이 알려졌다(De Kock, 등, Pain 92:373-80(2001)).

만성 내장성 통증을 치료하기 위한 항-NGF 항체의 사용이 설명되었다. PCT 공보 No. WO 01/78698 참조. 브레난(Brennan) 등은 수술-후 통증의 래트 모델에서 TrkA 면역부착소의 투여를 보고한다. Society for Neuroscience Abstracts 24(1-2) 880(1998) 참조.

특허출원 및 공보를 포함한 여기 인용된 모든 참고자료는 그 전체가 참고자료로 포함된다.

도 1은 수술 24시간 전("베이스라인"), 수술 2시간 후("수술-후") 그리고 수술 후 1일과 2일에 평가한 누적된 휴식중 통증을 나타내는 그래프이다. "대조군"은 항-NGF 항체 치료를 하지 않은 것이며, "911"은 35mg/kg 항-NGF 항체 911("Mab 911"라고도 함)로 치료한 동물을 말한다. Hongo 등 Hybridoma 19:215-227(2000). 항-NGF 항체를 사용한 치료는 수술-후의 휴식중 통증을 상당히 감소시켰다.

도 2는 수술 24시간 전("베이스라인"), 수술 4시간 후("수술-후") 그리고 수술 후 1일 및 2일에 평가한 열 통증(통각과민)을 나타내는 그래프이다. "대조군"은 항-NGF 항체 치료를 하지 않은 것이며, "911"은 35mg/kg 항-NGF 항체 911로 치료한 동물을 말한다. 항-NGF 항체를 사용한 치료는 수술-후의 열 통각과민을 상당히 감소시켰다.

도 3은 수술 24시간 전("베이스라인"), 수술 3시간 후("수술-후") 그리고 수술 후 1일, 2일 및 3일에 평가한 기계적 자극에 대해 반응하는 기계적 통증(통각과민)을 나타내는 그래프이다. "대조군"은 항-NGF 치료를 하지 않은 것이며, "911"은 항-NGF 항체 911로 치료한 동물을 말한다. 7mg/kg 항-NGF 항체를 사용한 치료는 수술-후의 기계적으로 유발된 통증을 감소시켰다.

도 4는 수술 24시간 후에 평가한 휴식중 통증을 나타내는 그래프이며, 0.02 mg/kg, 0.1mg/kg, 0.6mg/kg 또는 1mg/kg의 사람화된 항-NGF 항체 E3를 사용한 치료가 통증을 감소시켰음을 보여준다. "*"는 음성 대조군과의 통계적으로 유의한 차이(p<0.5)를 나타낸다.

도 5는 수술 24시간 후에 평가한 휴식중 통증을 나타내는 그래프이며, 사람화된 항-NGF 항체 E3 0.5mg/kg를 수술 2시간 후에 주사한 치료가 휴식중의 통증을 유의하게(p<0.005) 감소시켰음을 보여준다.

도 6은 수술 24시간 후에 평가한 휴식중 통증을 나타내는 그래프이며, 항-NGF 항체 911 5mg/kg을 수술 14일 전에 주사한 치료가 휴식중의 통증을 유의하게(p <0.02) 감소시켰음을 보여준다.

도 7은 수술 24시간 후에 평가한 휴식중 통증을 나타내는 그래프이며, 항-NGF 항체 911 5mg/kg을 수술 12일 전에 주사한 치료가 휴식중의 통증을 감소시켰음을 보여준다.

도 8은 절개 및 식염수, 1mg/kg 항-NGF 항체 911, 또는 양성 대조군인 케토롤락을 사용한 치료 후 존재하는 무손상 상처의 비율을 나타내는 그래프이다. 항-NGF 항체 911을 사용한 치료 후에 무손상 상처의 비율은 식염수(음성 대조군)를 사용한 치료 후의 무손상 상처의 비율과 다르지 않았다. 이와 같이, 항-NGF 항체를 사용한 치료는 상처 치유에 대해 효과를 나타내지 않았다. 반대로, NSAID 케토롤락(양성 대조군)로 치료된 동물은 무손상 상처의 비율이 현저히 감소되었다.

도 9는 K252a를 사용한 치료 3시간 후("3H-P-tmt")에 평가했을 때 소분자 NGF 길항제인 K252a를 사용한 치료가 수술 후 휴식중 통증을 유의하게(p<0.005) 감소시켰음을 나타내는 그래프이다.

도 10은 항-NGF 항체인 911을 사용한 치료와 동형 일치된 대조군 항체를 사용한 치료를 비교한 그래프이다. 항-NGF 항체(911) 1mg/kg으로 치료된 동물은 휴식중 통증의 유의한 감소(p<0.05)를 나타냈다. 반대로, 초파리 기억상실 단백질에 대한 동형 일치된 대조군 항체 1mg/kg으로 치료된 동물은 정상 수준의 휴식중 통증을 나타냈다. 이 실험은 항-NGF 항체의 진통 효과가 특이적임을 증명했다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 항-NGF 모노클로날 항체와 같은 NGF 길항제의 치료적 유효량의 생체내 투여가 수술-후 통증을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다는 발견을 기초로 한다. 이전에 수술-후 통증은 고용량의 아편유사 진통제로 치료되었다. 이들 제제는 위운동의 감소, 진정작용, 호흡 억제 및 신장 급통증과 같은 바람직하지 않은 부작용을 일으킨다. NSAID 같은 다른 통증 제제는 이런 종류의 통증을 치료하는데는 비교적 성공적이지 못했다. 더구나, 어떤 NSAID는 상처 치유를 억제하는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 항-NGF 항체, 예를 들어 항-사람 NGF(항-hNGF) 모노클로날 항체와 같은 유효량의 NGF 길항제를 투여함에 의해 개체(포유동물, 사람 및 비-사람을 모두 포함함)에서 수술-후 통증을 예방 또는 치료하는 방법을 특징으로 한다.

다른 양태로서, 본 발명은 개체에 유효량의 NGF 길항제를 투여하는 것을 포함하는 수술-후 통증의 개선, 통증 진전의 지연 및/또는 통증 진행의 예방을 위한 방법을 제공한다.

어떤 구체예에서는 휴식중의 통증이 억제, 개선 및/또는 예방되고, 어떤 구체예에서는 기계적으로 유발된 통증(움직임이나 다른 기계적 또는 촉각적 자극으로 인한 통증을 포함함)이 억제, 개선 및/또는 예방된다. 어떤 구체예에서는 열 유발된 통증이 억제, 개선 및/또는 예방된다. 어떤 구체예에서 기계적으로 유발된 통증은 항-NGF 항체를 투여함에 의해 억제, 개선 및/또는 예방된다. 어떤 구체예에서 휴식중 통증은 항-NGF 항체를 투여함에 의해 억제, 개선 및/또는 예방된다. 어떤 구체예에서 열 유발된 통증은 항-NGF 항체를 투여함에 의해 억제, 개선 및/또는 예방된다. 어떤 구체예에서는 무해자극통증이 억제, 개선 및/또는 예방되고, 어떤 구체예에서는 통각과민이 억제, 개선 및/또는 예방된다. 더 이상의 구체예에서 무해자극통증 및/또는 통각과민은 자연적인 열 또는 기계적(촉각) 통증, 또는 휴식중의 통증이다. 어떤 구체예에서 통증은 만성 통증이다. 다른 구체예에서, 통증은 절개, 상처, 및/또는 외상의 부위에, 그에 인접한 곳 및/또는 그 근처인 곳과 관련된다.

또한, 본 발명은 본원에서 제공된 방법 중 어느 것에 사용하기 위한, 항-NGF 항체, 예를 들어 항-NGF 모노클로날 항체와 같은 NGF 길항제를 포함하는, 수술-후 통증을 치료하기 위한 조성물 및 키트를 특징으로 한다. 어떤 구체예에서, 항-NGF 항체는 NGF와 그것의 TrkA 및/또는 p75 수용체(들)의 결합을 효과적으로 억제하거나, 및/또는 NGF의 TrkA 및/또는 p75 수용체(들)의 활성화를 효과적으로 억제할 수 있다.

일반적인 기술

다른 지시가 없다면 본 발명의 실시에는 본 분야에 속한 분자생물학(재조합 기술을 포함함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학에 관한 종래의 기술들을 사용한다. 그러한 기술들은 아래의 문헌들에 충분히 설명된다.

정의

"항체"(복수형태로 사용되기도 한다)는 면역글로불린 분자의 가변영역에 위치한 적어도 하나의 항원인식부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 여기 설명된 이 용어는 완전한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 이들의 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄(ScFv), 이들의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화된 항체, 키메라 항체, 디아체, 선형 항체, 단쇄 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 2-특이적 항체), 그리고 필요한 특이성을 갖는 항원인식부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떤 다른 변형된 구조를 포함한다. 항체는 IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이들의 하위-부류)와 같은 어떤 부류의 항체와 어떤 특정한 부류에 속하지 않는 항체를 포함한다. 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라서 면역글로불린은 상이한 부류에 배정될 수 있다. 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5개 주요 부류로 나눠지며, 이들 중 몇 가지는 하위-부류(동형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2으로 더 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤라고 칭해진다. 면역글로불린의 상이한 부류들의 서브유닛 구조 및 3-차원 입체배치는 잘 공지되어 있다.

"모노클로날 항체"는 동종성 항체 집단을 말하며, 모노클로날 항체는 항원의 선택적 결합에 연루되는 아미노산(천연발생 및 비-천연발생)으로 이루어진다. 모노클로날 항체 집단은 고도로 특이적이며 단 하나의 항원 부위에 대해서만 지정된다. 용어 "모노클로날 항체"는 완전한 모노클로날 항체 및 전길이 모노클로날 항체 뿐만 아니라 이들의 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄(ScFv), 이들의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화된 모노클로날 항체, 키메라 모노클로날 항체, 및 항원과 결합하는데 필요한 특이성과 능력을 갖는 항원인식부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떤 다른 변형된 구조를 포함한다. 항체의 공급원이나 그것이 제조된 방식(예를 들어, 하이브리도마, 파지선택, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물 등에 의한)에 관하여 제한하는 것을 의도하지 않는다.

"사람화된" 항체는 비-사람 종들의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원결합부위를 가지면서 사람 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 면역글로불린 구조를 유지하고 있는 분자를 말한다. 항원결합부위는 불변 도메인 상에서 융합된 완전한 가변 도메인이나, 또는 가변 도메인 내의 적합한 프레임워크 영역 상에서 그래프트된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원결합부위는 야생형이거나, 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있는데, 예를 들어 사람 면역글로불린과 더욱 밀접하게 닮도록 변형될 수 있다. 어떤 형태의 사람화된 항체는 모든 CDR 서열을 간직한다(예를 들어, 마우스 항체로부터의 6개의 CDR을 전부 함유하는 사람화된 마우스 항체). 다른 형태의 사람화된 항체는 원 항체에 관하여 변형된 1개 이상의 CDR(1, 2, 3, 4, 5, 6개)를 가진다. 어떤 예에서, 프레임워크 영역(FR) 잔기 또는 사람 면역글로불린의 다른 잔기는 상응하는 비-사람 잔기로 대체된다. 또한, 사람화된 항체는 수용자 항체나 제공자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "신경성장인자" 및 "NGF"는 신경성장인자 및 NGF 활성의 적어도 일부를 보유한 이들의 변이체를 말한다. 본원에 사용된 NGF는 사람, 개과, 고양이과, 말과, 또는 소과를 포함하는 모든 포유동물 종들의 자생 서열 NGF를 포함한다.

"NGF 수용체"는 NGF에 의해 결합되거나 또는 활성화되는 폴리펩티드를 말한다. NGF 수용체는 제한은 없지만 사람, 개과, 고양이과, 말과, 영장류, 또는 소과를 포함하는 어떤 포유동물 종들의 TrkA 수용체 및 p75 수용체를 포함한다.

"NGF" 길항제는 NGF와 수용체의 결합 및/또는 NGF에 대한 세포 반응의 유도와 같은, NGF 신호화에 의해 매개되는 하류 경로를 포함하는, NGF 생물학적 활성을 차단, 억제 또는 감소(현저한 것을 포함한다)시키는 어떤 분자를 말한다.

용어 "길항제"는 어떤 생물학적 작용의 특이적 메카니즘도 내포하지 않으며, 직접적이든 간접적이든, 또는 NGF, 그것의 수용체, 또는 다른 메카니즘을 통한 상호작용이든 아니든, NGF와의 모든 가능한 약물학적, 생리학적, 및 생화학적 상호작용 및 여러 가지 상이한, 그리고 화학적으로 다른 조성물들에 의해 달성될 수 있는 결과를 명백히 포함하고 포괄하는 것으로 간주한다. 제한은 없지만, 전형적인 NGF 길항제는 항-NGF 항체, NGF에 대한 안티-센스 분자(NGF를 암호화하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함함), NGF 억제성 화합물, NGF 구조 유사체, NGF와 결합하는 TrkA 수용체의 도미넌트-네가티브 돌연변이, TrkA 면역부착소, 항-TrkA 항체, 항-p75 항체 및 키나제 억제인자를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "길항제"는 이전에 확인된 용어, 표제, 그리고 NGF 자체, NGF 생물학적 활성(제한은 없지만 수술-후 통증의 어떤 양태를 매개하는 능력을 포함) 또는 생물학적 활성의 결과가 어떤 의미 있는 정도로 실질적으로 무효화, 감소, 또는 중화되는 기능적 상태와 특징들을 모두 포함하는 것으로 명백히 이해될 것이다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제(예를 들어, 항체)는 NGF와 결합(물리적 상호작용)하고, NGF 수용체(TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체와 같은)와 결합하고, 하류 NGF 수용체 신호화를 감소(저해 및/또는 차단)시키고 및/또는 NGF 합성, 생성 또는 방출을 억제(감소)한다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NGF와 결합하며 TrkA 수용체 다이머화 및/또는 TrkA 자동인산화를 방지한다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 NGF 합성 및/또는 생성(방출)을 억제 또는 감소시킨다. NGF 길항제 종류의 예들이 본원에 제공된다.

본원에 사용된 "항-NGF 항체"는 NGF와 결합해서 NGF 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호화에 의해 매개되는 하류 경로(들)을 억제할 수 있는 항체를 말한다.

"TrkA 면역부착소"는 TrkA 수용체의 단편, 예를 들어 TrkA 수용체의 세포외 도메인과 면역글로불린 서열을 포함하는 가용성 키메라 분자를 말하며 이것은 TrkA 수용체의 결합 특이성을 유지하고 있다.

NGF의 "생물학적 활성"은 일반적으로 NGF 수용체에 결합하고 및/또는 NGF 수용체 신호화 경로를 활성화하는 능력을 말한다. 제한은 없지만, 생물학적 활성은 NGF 수용체(p75 및/또는 TrkA와 같은)와 결합하는 능력; TrkA 수용체 다이머화 및/또는 자동인산화를 촉진하는 능력; NGF 수용체 신호화 경로를 활성화하는 능력; 세포 분화, 증식, 생존, 성장, 및 신경 형태학, 시냅스 형성, 시냅스 기능, 신경전달 및/또는 뉴로펩티드 방출 및 손상 후 재생의 변화를 포함하여(뉴런의 경우 말초 및 중추 뉴런을 포함함) 세포 생리학에 다른 변화를 촉진하는 능력; 및 수술-후 통증을 매개하는 능력 중 어느 하나 이상을 포함한다.

용어 "에피토프"는 단백질 항원에 있는 항체(모노클로날 또는 폴리클로날)의 결합 부위를 말한다.

본원에 사용된 "치료"는 유리한 또는 바람직한 임상적 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해서, 제한은 없지만, 유리한 또는 바람직한 임상적 결과는 심한 정도의 감소를 포함하는 통증의 어떤 양태의 개선, 수술-후 통증의 어떤 양태(예를 들어, 휴식중 통증 및/또는 기계적 유발된 통증)를 포함하는 수술-후 통증에 관련된 하나 이상의 증상의 개선, 통증 지속기간의 단축, 및/또는 통증 감수성 또는 감각의 감소 중 하나 이상을 포함한다.

"유효량"은 통증의 개선 또는 감소를 포함하는 유리한 또는 바람직한 임상적 결과를 행하는데 충분한 양이다. 본 발명의 목적을 위해서, NGF 길항제의 유효량은 수술-후 통증의 치료, 개선, 통증 강도의 감소, 통증의 예방을 위해 충분한 양이다. 어떤 구체예에서, "유효량"은 휴식중 통증이나 기계적으로 유발된 통증(움직임 후의 통증을 포함) 또는 양쪽 모두를 감소시킬 수 있고, 그것은 절개, 절단, 열개 또는 상해 전에, 동안, 및/또는 후에 투여될 수 있다. 어떤 구체예에서, "유효량"은 수술-후 통증의 진전을 지연시키는데 충분한 양이다.

통증의 "발생 감소"는 심한 정도(예를 들어 아편제제를 포함하는 이런 상태에 일반적으로 사용되는 다른 약 및/또는 치료(예를 들어, 이들에 대한 노출)의 필요 및/또는 양의 감소를 포함할 수 있다), 지속기간, 및/또는 빈도(예를 들어, 개체에서 수술-후 통증까지의 시간의 지연 또는 증가를 포함한다)의 감소 중 어느 것을 의미한다. 당업자에게 이해되는 대로, 개체는 치료에 대한 그들의 반응에 있어서 다양할 수 있으며, 예를 들어 "개체에서 수술-후 통증의 발생을 감소시키는 방법"은 약물의 투여가 특정한 개체에서 통증 발생의 감소를 일으킬 수 있을 것이라는 합리적인 예상에 기초하여 여기 설명된 NGF 길항제를 투여하는 것을 반영한다.

수술-후 통증 또는 수술-후 통증의 하나 이상의 증상의 "개선"은 NGF 길항제를 투여하지 않았을 때와 비교하여 수술-후 통증의 하나 이상의 증상의 축소 또는 개선을 의미한다. "개선"은 또한 증상의 지속기간의 단축이나 감소를 포함한다.

수술-후 통증 또는 수술-후 통증의 하나 이상의 증상의 "완화"는 본 발명에 따르는 NGF 길항제로 치료된 개체 또는 개체의 집단에서 수술-후 통증의 하나 이상의 바람직하지 않은 임상적 징후의 범위의 축소를 의미한다.

본원에 설명된, 수술-후 통증의 진전의 "지연"은 수술-후 통증 진행의 유예, 방해, 늦춰짐, 저지, 안정, 및/또는 연기를 의미한다. 이런 지연은 병력 및/또는 치료될 개체에 따라서 다양한 길이의 시간일 수 있다. 당업자에게 자명한 대로 충분한 또는 현저한 지연은 개체가 수술-후 통증을 발생시키지 않는다는 점에서 사실상 예방을 포함할 수 있다. 증상의 진전을 "지연"시키는 방법은, 이 방법을 사용하지 않았을 때와 비교했을 때, 주어진 시간 프레임 내에 증상이 발생할 가능성을 감소시키거나 및/또는 주어진 시간 프레임 내에 증상의 범위를 감소시키는 방법이다. 그러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 수의 피험자를 사용한 임상연구를 기초로 한다.

수술-후 통증의 "진전" 또는 "진행"은 장애의 초기 징후 및/또는 뒤이은 진행을 의미한다. 수술-후 통증의 진전은 당업계에 잘 공지된 표준 임상기술을 사용하여 검출 및 평가될 수 있다. 그러나, 진전은 또한 검출될 수 없는 진행을 말하기도 한다. 본 발명의 목적을 위해서, 진전 또는 진행은 증상의 생물학적 경과과정을 말한다. "진전"은 발생, 재발, 및 개시를 포함한다. 본원에 사용된 수술-후 통증의 "개시" 또는 "발생"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다.

"개체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 사람이다. 포유동물은 제한은 없지만 사육용 동물, 경기용 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함한다.

"수술-후 통증"("절개-후 통증" 또는 "외상-후 통증"이라고도 함)은 개체의 조직의 절단, 관통, 절개, 열개, 또는 상처와 같은 외부의 외상으로부터 발생하는 또는 결과인 통증을 말한다(침습성 또는 비-침습성인 모든 수술과정으로부터 발생하는 것을 포함한다). 본원에 설명된 "수술-후 통증"은 외부의 물리적 외상 없이 발생하는 통증은 포함하지 않는다. 어떤 구체예에서, 수술-후 통증은 내부 또는 외부 통증이며, 상처, 절단, 외상, 열개 또는 절개는 우연히(외상성 상처) 또는 고의로(수술 절개) 일어날 수 있다. 본원에 사용된 "통증"은 통각 및 통증에 대한 감각을 포함하며, 통증은 통증 점수 및 본 분야에 잘 공지된 다른 방법을 사용하여 객관적으로 그리고 주관적으로 평가될 수 있다. 본원에 사용된 수술-후 통증은 무해자극통증(즉, 보통의 무해 자극에 대한 증가된 반응) 및 통각과민(즉, 보통의 유해 또는 불쾌한 자극에 대한 증가된 반응)을 포함하며, 이것은 차례로 자연적인 열 또는 기계적(촉각) 통증이 될 수 있다. 어떤 구체예에서, 통증은 열 감수성, 기계적 감수성 및/또는 휴식중 통증에 의해 특성화된다. 어떤 구체예에서 수술-후 통증은 기계적으로 유발된 통증이나 휴식중 통증을 포함한다. 다른 구체예에서 수술-후 통증은 휴식중 통증을 포함한다. 통증은 본 분야에 잘 공지된 대로 일차 또는 이차 통증일 수 있다.

"휴식중 통증"은 개채가 쉬고 있는 동안에도 발생하는 통증을 말하며, 예를 들어 개체가 움직이거나 다른 기계적인 자극(예를 들어, 찌르거나 누르는 것)을 받았을 때 발생하는 통증에 대립하는 것이다.

"기계적으로 유발된 통증"(기계지각성 통증이라고도 함)은 표면에 대한 중량의 적용, 촉각 자극, 및 움직임(기침, 중량의 이동 등)에 의해 야기되거나 그와 관련된 자극과 같은 기계적 자극에 의해 유발된 통증을 말한다.

수술, 외상 또는 상처로부터의 회복은 수술, 외상 또는 상처로부터의 회복의 양태가 개선될 때(NGF 길항제를 투여하지 않았을 때의 수술, 외상 또는 상처로부터의 회복과 비교하여) "증진"된다. 예를 들어, 바람직하지 않은 부작용(예를 들어, 종래의 통증 완화제(예를 들어, 아편유사제)의 사용과 관련된 부작용)의 존재 및/또는 강도는 NGF 길항제가 없을 때의 그러한 부작용의 존재 및/또는 강도와 비교하여 NGF 길항제의 존재하에서 감소 및/또는 제거될 수 있다. 이런 증진은 NGF 길항제의 투여에 의해 나타나는 것이며, 그러한 비교(NGF 길항제의 투여 대 비-투여)가 어떤 주어진 개체에 관하여 수행되고 증명되어야 한다는 것을 뜻하는 것은 아니다.

본 발명의 방법

본원에 설명된 모든 방법들과 관련하여, NGF 길항제에 대한 언급은 이들 제제 중 하나 이상을 포함하는 조성물도 포함한다. 이들 조성물은 본 분야에 잘 공지된 완충액을 포함하는 제약학적으로 허용되는 부형제(담체)와 같은 적합한 부형제를 더 포함할 수 있다. 본 발명은 단독으로 또는 다른 종래의 치료 방법과 병용하여 사용될 수 있다.

수술-후 통증의 예방 또는 치료 방법

본 발명은 사람과 비-사람의 모든 포유동물을 포함하는 개체에서 수술-후 통증의 치료, 진전의 지연 및/또는 예방에 유용하다. 더욱이, 본 발명은 내부든 외부든 조직에 절단, 관통 또는 열개의 절개 상처를 갖는 개체에서 유용하다. 그러한 절개 상처는 외상성 상처와 같이 우연히 또는 수술과 같이 고의로 발생할 수 있다.

따라서, 한 양태로서, 본 발명은 항-NGF 항체와 같은 NGF 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 개체에서 수술-후 통증을 치료하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 수술-후 통증은 무해자극통증, 통각과민, 기계적으로 유발된 통증, 열 유발 통증, 기계적으로 유발된 통증, 또는 휴식중 통증 중 하나 이상을 포함한다. 어떤 구체예에서, 수술-후 통증은 기계적으로 유발된 통증 및/또는 휴식중 통증을 포함한다. 우리는, 예를 들어 항-NGF 길항제가 이 두 양태를 모두 개선한다는 것을 관찰했다. 다른 구체예에서 수술-후 통증은 휴식중 통증을 포함한다. 통증은 일차 및/또는 이차 통증일 수 있다. 다른 구체예에서 무해자극통증이 억제, 개선 및/또는 예방되고, 어떤 구체예에서는 통각과민이 억제, 개선 및/또는 예방된다. 또 다른 구체예에서, 무해자극통증 및/또는 통각과민은 자연스런 열 또는 기계적(촉각) 통증(또는 둘 모두)이거나, 또는 휴식중 통증이다. 다른 구체예에서, 통증은 절개, 상처 또는 외상의 하나 이상의 부위(들), 인접한 곳 및/또는 근처이다.

다른 양태로서, 본 발명은 수술-후 통증의 진전 또는 진행을 예방, 개선 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

어떤 구체예에서, 항-NGF 항체와 같은 NGF 길항제는 수술 전에 투여된다(어떤 구체예에서는, 외부의 외상 및/또는 상처를 가져올 가능성이 있는 활동 전에). 예를 들어, NGF 길항제는 외상, 상처 또는 절개가 있을 활동 전이나 수술(어떤 구체예에서 외상, 상처 또는 절개를 가져올 가능성이 있는) 30분, 1시간, 5시간, 10시간, 15시간, 24시간 전이나 또는 그 이상의 시간 전에, 예를 들어 1일, 수일, 또는 1주, 2주, 3주, 또는 그 이상의 시간 전에 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 수술이나 외부의 외상 또는 상처를 가져올 가능성 있는 활동 중에 및/또는 후에 투여된다. 한 구체예에서, NGF 길항제는 수술, 상처 또는 외상 후 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 30시간, 36시간 또는 그 이상의 시간 후에 투여된다.

다른 양태로서, 본 발명은 통증 역치를 증가시키는 방법을 제공한다. 본원에 설명된 "통증 역치의 증가"는 수술, 절개, 외상 또는 상처와 관련된 통증의 감소, 축소 및/또는 최소화를 말한다(통증의 주관적 인식의 감소, 축소 및/또는 최소화를 포함한다).

또 다른 양태로서, 본 발명은 수술로부터의 회복을 증진시키는(뿐만 아니라 상처, 외상성 상해 및/또는 절개로부터의 회복을 증진시키는) 방법을 제공한다.

수술-후 통증을 치료 또는 예방하는데 관해 본원에서 일반적으로 언급되었지만, NGF 길항제는 외부의 외상(충돌과 같은), 상해 또는 상처의 증가된 위험이 있는 사건 또는 조건(들) 전에 투여될 수 있음이 인정된다. 당업자에게 이해되는 대로 외부의 외상, 상해 또는 상처의 증가된 위험이 있는 사건이나 조건은 위험한 직업, 싸움 및/또는 스포츠 활동을 포함한다.

통증의 진단 또는 평가는 본 분야에 잘 확립되어 있다. 평가는 자극에 대한 반응, 표정 등과 같은 행동의 관찰과 같은 객관적 측정을 기초로 수행될 수 있다. 평가는 또한 다양한 통증 점수를 사용한 통증의 환자 특성화와 같은 주관적 측정을 기초로 할 수 있다. 예를 들어, Katz 등, Surg Clin North Am. (1999) 79(2):231-52; Caraceni 등, J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55 참조.

또한, 통증 경감이 경감의 시간 과정에 의해 특성화될 수 있다. 따라서, 어떤 구체예에서 통증 경감은 1, 2 또는 수시간 후에 주관적으로 또는 객관적으로 관찰된다(그리고 어떤 구체예에서는 약 12 내지 18시간에서 최고이다). 다른 구체예에서, 통증 경감은 수술(또는 상처나 외상에 관련된 사건) 후 24, 36, 48, 60, 72시간 이상에서 주관적으로 또는 객관적으로 관찰된다.

NGF 길항제

본 발명의 방법은 NGF와 수용체의 결합 및/또는 NGF에 대한 세포 반응의 유도와 같은, NGF 신호화에 의해 매개되는 하류 경로를 포함하는, NGF 생물학적 활성을 차단, 억제 또는 감소(현저한 것을 포함한다)시키는 어떤 분자를 말하는 "NGF" 길항제를 사용한다. 용어 "길항제"는 어떤 생물학적 작용의 특이적 메카니즘도 내포하지 않으며, NGF와의 모든 가능한 약물학적, 생리학적, 및 생화학적 상호작용 및 여러 가지 상이한, 그리고 화학적으로 다른 조성물들에 의해 달성될 수 있는 결과를 명백히 포함하고 포괄하는 것으로 간주한다. 제한은 없지만, 전형적인 NGF 길항제는 항-NGF 항체, NGF에 대한 안티-센스 분자(NGF를 암호화하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함함), NGF 수용체(TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체와 같은)에 대한 안티-센스 분자(TrkA 및/또는 p75를 암호하하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함함), NGF 억제성 화합물, NGF 구조 유사체, NGF와 결합하는 TrkA 수용체의 도미넌트-네가티브 돌연변이, TrkA 면역부착소, 항-TrkA 항체, 항-p75 항체 및 키나제 억제인자를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서 용어 "길항제"는 이전에 확인된 용어, 표제, 그리고 NGF 자체, NGF 생물학적 활성(제한은 없지만 수술-후 통증의 어떤 양태를 매개하는 능력을 포함함) 또는 생물학적 활성의 결과가 어떤 의미 있는 정도로 실질적으로 무효화, 감소 또는 중화되는 기능적 상태와 특징들을 모두 포함하는 것으로 명백히 이해될 것이다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제(예를 들어, 항체)는 NGF와 결합(물리적으로 상호작용)하고, NGF 수용체(TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체와 같은)와 결합하고, 및/또는 하류 NGF 수용체 신호화를 감소(저해 및/또는 차단)시킨다. 따라서, 어떤 구체예에서 NGF 길항제는 NGF와 결합(물리적으로 상호작용)한다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 NGF 수용체(TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체와 같은)와 결합한다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 하류 NGF 수용체 신호화를 감소(저해 및/또는 차단)시킨다(예를 들어, 키나제 신호화의 억제인자). 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NGF 합성 및/또는 방출을 억제(감소)한다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 TrkA 면역부착소가 아닌(즉, TrkA 면역부착소 이외의 다른) NGF 길항제이다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 항-NGF 항체 이외의 다른 것이다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 TrkA 면역부착소 이외의 다른 것이며, 항-NGF 항체 이외의 다른 것이다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제는 NGF(hNGF와 같은)와 결합하고, NT-3, NT4/5, 및/또는 BDNF와 같은 관련된 뉴로트로핀과는 유의할 만하게 결합하지 않는다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제는 역면역반응과 관련되지 않는다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 사람화된다(본원에 설명된 항체 E3와 같이). 어떤 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체 E3(본원에 설명된 바와 같은)이다. 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 하나 이상의 CDR(들)을 포함한다(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 어떤 구체예에서는 E3로부터의 6개 CDR 전부). 다른 구체예에서 항체는 사람이다. 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 표 1에 나타낸 중쇄 가변영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1) 및 표 2에 나타낸 경쇄 가변영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 포함한다. 다른 구체예에서, 항체는 면역학적으로 불활성인 영역, 예를 들어 보체 매개 리시스(lysis)를 개시시키지 않거나 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는 불변영역과 같은 변형된 불변영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 불변영역은 Eur. J. Immunol.(1999) 29:2613-2624; PCT출원 No. PCT/GB99/ 01441; 및/또는 UK 특허출원 No. 9809951.8에 설명된 대로 변형된다.

항-NGF 항체

본 발명의 어떤 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체를 포함한다. 항-NGF 항체는 다음 특징들 중 하나 이상을 나타내야 한다: (a) NGF와 결합한다; (b) NGF 생물학적 활성 또는 NGF 신호화 기능에 의해 매개된 하류 경로를 억제한다; (c) 수술-후 통증의 어떤 양태를 예방, 개선 또는 치료한다; (d) NGF 수용체 활성화(TrkA 수용체 다이머화 및/또는 자동인산화를 포함함)를 차단 또는 감소시킨다; (e) NGF 클리어런스를 증가시킨다; (f) NGF 합성, 생성, 또는 방출을 억제(감소)한다; (g) 수술, 상처 또는 외상으로부터의 회복을 증진시킨다.

항-NGF 항체는 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 PCT 공보 No. WO 01/ 78698, WO 01/64247, U.S. 특허 Nos. 5,844,092, 5,877,016, 및 6,153,189; Hongo 등, Hybridoma, 19:215-227(2000); Cell. Molec. Biol. 13:559-568(1993); GenBank 기탁 Nos. U39608, U39609, LI 7078, 또는 L 17077를 참조한다.

어떤 구체예에서 항-NGF 항체는 항체 "E3"로 명명된 사람화된 마우스 항-NGF 모노클로날 항체이며, 이것은 돌연변이 A330P331에서 S330S331(야생형 IgG2a 서열을 참조하여 번호 매긴 아미노산; Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624 참조)를 함유하는 사람 중쇄 IgG2a 불변영역; 사람 경쇄 kappa 불변영역; 및 표 1과 2에 나타낸 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함한다.

중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역을 암호화하는 다음의 폴리뉴클레오티드가 2003년 1월 8일자로 ATCC에 기탁되었다.

벡터 Eb.911.3E는 표 2에 나타낸 경쇄 가변영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이고, 벡터 Eb.pur.911.3E는 표 2에 나타낸 경쇄 가변영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이고, 그리고 벡터 Db.911.3E는 표 1에 나타낸 중쇄 가변영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다.

다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 하나 이상의 CDR(들)을 포함한다(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 어떤 구체예에서는 E3의 6개 CDR 전부). CDR 영역의 측정은 본 분야의 범위 내이다.

본 발명에서 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 2-특이적 항체, 헤테로콘쥬게이트 항체, 단쇄(ScFv), 이들의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화된 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합 변성 항체를 포함하는 필요한 특이성을 갖는 항원인식부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떤 다른 변형된 구조를 포함한다. 항체는 뮤린, 래트, 사람, 또는 어떤 다른 기원일 수 있다(키메라 또는 사람화된 항체를 포함한다). 본 발명의 목적을 위해서, 항체는 NGF 및/또는 NGF 신호화 기능에 의해 매개된 하류 경로를 억제하는 방식으로 NGF와 반응한다. 한 구체예에서, 항체는 사람 NGF 상의 하나 이상의 에피토프를 인식하는 사람 항체이다. 다른 구체예에서, 항체는 사람 NGF 상의 하나 이상의 에피토프를 인식하는 마우스 또는 래트 항체이다. 다른 구체예에서, 항체는 영장류, 개과, 고양이과, 말과 및 소과로 구성되는 군으로부터 선택된 NGF 상의 하나 이상의 에피토프를 인식한다. 다른 구체예에서, 항체는 면역학적으로 불활성인 영역, 예를 들어 보체 매개 리시스를 개시시키지 않거나 또는 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는 불변영역과 같은 변형된 불변영역을 포함한다. ADCC 활성은 U.S. 특허 5,500,362에 개시된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 다른 구체예에서, 불변영역은 Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624; PCT 출원 No.PCT /GB99/01441; 및/또는 UK 특허출원 No. 9809951.8에 설명된 대로 변형된다.

NGF(hNGF 같은)에 대한 항-NGF 항체의 결합 친화성은 약 0.10 내지 약 0.80 nM, 약 0.15 내지 약 0.75nM 그리고 약 0.18nM 내지 약 0.72nM일 수 있다. 한 구체예에서, 결합 친화성은 약 2pM 내지 22pM이다. 어떤 구체예에서, 결합 친화성은 약 10nM이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 10nM 미만이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 0.1nM 또는 약 0.07nM이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 0.1nM 미만, 또는 약 0.07nM 미만이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 100nM, 약 50nM, 약 10nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 또는 약 50pM 중 어느 하나 내지는 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 또는 약 40pM 중 어느 하나이다. 어떤 구체예에서, 결합 친화성은 약 100nM, 약 50nM, 약 10nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 또는 약 50pM 중 어느 하나이거나, 또는 약 50pM 미만이다. 어떤 구체예에서, 결합 친화성은 약 100nM, 약 50nM, 약 10nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 또는 약 50pM 중 어느 하나 미만이다. 또 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 약 40pM, 또는 약 40pM 이상이다.

NGF에 대한 결합 친화성을 측정하는 한 방식은 항체의 1-작용성 Fab 단편의 결합친화성을 측정하는 것이다. 1-작용성 Fab 단편을 얻기 위해 항체(예를 들어, IgG)는 파파인을 사용하여 절단되거나 재조합 발현될 수 있다. 항체의 항-NGF Fab 단편의 친화성은 표면 플라즈몬 공명(BlAcore3000^TM 표면 플라즈몬 공명(SPR) 시스템, BIAcore, INC, 뉴저지 피스카웨이)에 의해 측정될 수 있다. CM5 칩이 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이니드 염산염(EDC)과 N-히드록시숙신아미드(NHS)로 활성화될 수 있다. 사람 NGF(또는 어떤 다른 NGF)가 10mM 아세트산 나트륨 pH 4.0으로 희석되고 0.005mg/mL의 농도로 활성화된 칩에 주입될 수 있다. 개별 칩 채널을 가로질러 다양한 유속을 사용하여 두 가지 범위의 항원 밀도가 달성된다: 상세한 키네틱 연구를 위한 100-200 반응단위(RU) 및 스크리닝 분석을 위한 500-600 RU. 칩은 에탄올아민으로 차단될 수 있다. 재생 연구는 Pierce 용리 완충액(제품 No. 21004, Pierce Biotechnology, 일리노이 락포드)과 4M NaCl의 혼합물(2:1)이 200회 주사에 걸쳐 칩상의 hNGF 활성을 유지하면서 결합된 Fab를 제거한다는 것을 나타낸다. HBS-EP 완충액(0.O1M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P29)가 BIAcore 분석용 러닝 완충액으로서 사용된다. 정제된 Fab 샘플의 연속 희석물(0.1-1Ox 추정된 KD)이 100㎕/분으로 1분동안 주입되고 2시간까지의 해리시간이 허락된다. Fab 단백질의 농도는 표준으로 기지 농도(아미노산 분석에 의해 측정)의 Fab를 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE에 의해 측정된다. BIA 평가 프로그램을 사용하여 데이타를 1:1 랑뮈르 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110)로 피팅함으로써 키네틱 결합속도(Kon)와 해리속도(Koff)가 얻어진다. 평형해리상수(KD) 값은 Koff/Kon으로서 계산된다. 이 프로토콜은 사람 NGF, 다른 척추동물(어떤 구체예에서 포유동물)의 NGF(예를 들어, 마우스 NGF, 래트 NGF, 영장류 NGF)를 포함하는 모든 NGF에 대한 항체의 결합 친화성을 측정하는데서 사용하기 적합할 뿐만 아니라 관련된 뉴로트로핀 NT3, NT4/5 및/또는 BDNF 같은 다른 뉴로트로핀과 함께 사용하는데도 적합하다.

어떤 구체예에서, 항체는 사람 NGF와 결합하고, 다른 척추동물 종들(어떤 구체예에서는 포유동물)로부터의 NGF와는 유의하게 결합하지 않는다. 어떤 구체예에서, 항체는 사람 NGF와 결합할 뿐만 아니라 다른 척추동물 종들(어떤 구체예에서는 포유동물)로부터의 하나 이상의 NGF와 결합한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 NGF와 결합하고, 다른 뉴로트로핀(예를 들어, 관련된 뉴로트로핀 NT3, NT4/5 및/또는 BDNF)과는 유의하게 교차반응하지 않는다. 어떤 구체예에서, 항체는 NGF 뿐만 아니라 적어도 하나의 다른 뉴로트로핀과 결합한다. 어떤 구체예에서, 항체는 말이나 개와 같은 포유동물 종의 NGF와 결합하지만, 다른 포유동물 종으로부터의 NGF와는 유의하게 결합하지 않는다.

에피토프(들)은 연속하거나 또는 비연속할 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 Hongo 등, Hybridoma, 19:215-227(2000)에 설명된 대로 MAb 911, MAb 912, 및 MAb 938로 구성된 군으로부터 선택된 항체와 동일한 hNGF 에피토프와 본질적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 항체는 MAb 911과 동일한 hNGF 에피토프와 본질적으로 결합한다(Hongo 등, 상동). 예를 들어, 에피토프는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: hNGF의 가변영역 1(아미노산 23-35)안의 잔기 K32, K34 및 E35; hNGF의 가변영역 4(아미노산 81-88)안의 잔기 F79 및 T81; 가변영역 4안의 잔기 H84 및 K88; hNGF의 가변영역 5(아미노산 94-98)와 hNGF의 C-말단(아미노산 111-118) 사이의 잔기 R103; hNGF의 전-가변영역 1(아미노산 10-23)안의 잔기 E11; hNGF의 가변영역 2(아미노산 40-49)와 hNGF의 가변영역 3(아미노산 59-66) 사이의 Y52; hNGF의 C-말단안의 잔기 L112 및 S113; hNGF의 가변영역 3안의 잔기 R59 및 R69; 또는 hNGF의 전-가변영역 1안의 잔기 V18, V20, 및 G23. 이에 더하여, 에피토프는 가변영역 1, 가변영역 3, 가변영역 4, 가변영역 5, N-말단 영역, 및/또는 hNGF의 C-말단 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체는 hNGF의 잔기 R103의 용매 접근성을 현저히 감소시킨다. 상기 설명된 에피토프는 사람 NGF에 관한 것이지만 당업자는 다른 종들의 NGF에 대해 사람 NGF의 구조를 정렬하고 이들 에피토프에 대한 대응물일 가능성을 확인할 수 있다는 것이 이해된다.

한 양태로서, NGF를 억제할 수 있는 항체(예를 들어, 사람, 사람화된, 마우스, 키메라)는 NGF의 전길이 또는 부분 서열을 발현하는 면역원을 사용하여 만들어질 수 있다. 다른 양태로서, NGF를 과발현하는 세포를 포함하는 면역원이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 면역원의 다른 예는 전길이 NGF를 함유하는 NGF 단백질 또는 이 NGF 단백질의 일부이다.

항-NGF 항체는 본 분야에 공지된 어떤 방법에 의해 만들어질 수 있다. 숙주 동물의 면역화 경로 및 일정은 일반적으로 항체 자극 및 생성에 대한 확립된 종래의 기술에 따르고 있으며 이는 본원에서 더 설명된다. 사람 및 마우스 항체의 생성에 대한 일반적인 기술은 본 분야에 공지되어 있으며 여기 설명된다.

사람을 포함하는 어떤 포유동물 피험자 또는 이들로부터의 항체 생성 세포는 사람을 포함하는 포유동물의 하이브리도마 셀라인의 생성을 위한 토대로서 사용하기 위해 조작될 수 있다. 전형적으로, 숙주 동물은 본원에 설명된 것을 포함하는 양의 면역원을 사용하여 복강내, 근육내, 경구, 피하, 족내, 및/또는 피내로 접종된다. 하이브리도마는 Kohler, B. 및 Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497의 또는 Buck, D. W. 등 In Vitro, 18:377-381(1982)에 의해 변형된 일반적인 체강 세포 혼성화 기술을 사용하여 림프구와 불멸화된 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. 제한은 없지만 X63-Ag8.653 및 Salk Institute, Cell Distribution Center(미국 캘리포니아 샌프란시스코)의 것들을 포함하는 입수가능한 골수종 세포가 혼성화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 이 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 푸소겐을 사용하거나 또는 당업자에게 잘 공지된 전기적 수단에 의해서 골수종 세포와 림프양 세포를 융합하는 것을 포함한다. 융합 후 세포는 융합 배지로부터 분리되고, 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT)와 같은 선택적 성장 배지에서 성장시켜 혼성화되지 않은 모세포를 제거한다. 혈청으로 보충되든 그렇지 않든 여기 설명된 배지 중 어느 것도 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는데 사용될 수 있다. 세포융합기술에 대한 다른 대안으로서 EBV 불멸화 B 세포를 사용하여 본 발명의 항-NGF 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. 하이브리도마는 확장되고 서브클로닝되며, 원한다면 상청액이 종래의 면역분석 과정(예를 들어, 방사성면역분석, 효소면역분석, 또는 형광면역분석)에 의해 항-면역원 활성에 대해 분석된다.

항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 모든 유도체, NGF에 특이적인 모노클로날 항체를 생성하는 모 하이브리도마의 자손 세포, 또는 이들의 부분을 포함한다.

그러한 항체를 생성하는 하이브리도마는 공지의 과정에 의해 시험관내 또는 생체내에서 성장될 수 있다. 모노클로날 항체는 원한다면 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 한외여과와 같은 종래의 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 분리될 수 있다. 원하지 않는 활성이 만일 존재한다면, 예를 들어 고체상 부착된 면역원으로 만들어진 흡착제 위에서 제조를 수행하고 원하는 항체를 면역원 밖으로 용리시키거나 방출함에 의해 제거될 수 있다. 2-작용성 또는 유도화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통해 콘쥬게이션), N-히드록시숙신이미드(리신 잔기를 통해), 글리타르알데히드, 무수숙신산, SOCl2 또는 R1N=C=NR(여기서 R 및 R1은 상이한 알킬기이다)를 사용한, 사람 NGF, 또는 면역화될 종들에 있는 면역원성인 단백질, 예를 들어 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 티로신 억제제에 콘쥬게이트된 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편을 갖는 숙주 동물의 면역화로 항체(예를 들어, 모노클로날 항체) 집단을 얻을 수 있다.

원한다면, 관심의 항-NGF 항체(모노클로날 또는 폴리클로날)가 서열화될 수 있으며, 다음에 폴리뉴클레오티드 서열이 발현이나 증식용 벡터로 클로닝될 수 있다. 관심의 항체를 암호화하는 서열은 숙주세포의 벡터안에 유지될 수 있고, 다음에 숙주세포는 앞으로의 사용을 위해서 팽창되고 냉동될 수 있다. 대안으로서, 폴리뉴클레오티드 서열이 항체를 "사람화"하고 친화성이나 항체의 다른 특징들을 개선하기 위한 유전 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 임상 시험 및 사람의 치료에 사용되는 경우 면역반응을 피하기 위해서 불변영역이 사람 불변영역과 더 유사하게 조작될 수 있다. NGF에 대한 더 큰 친화성과 NGF를 억제하는데 있어서의 더 큰 효과를 얻기 위해서 항체 서열을 유전적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 항-NGF 항체에 대해 만들어질 수 있으며 NGF에 대한 결합 친화성은 그대로 유지된다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.

모노클로날 항체를 사람화하는 4개의 일반적 단계가 있다: (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예상 아미노산 서열을 측정하는 단계, (2) 사람화된 항체의 디자인, 즉 사람화 과정 동안 사용할 항체 프레임워크 영역을 결정하는 단계, (3) 실제 사람화 방법/기술 단계, (4) 사람화된 항체의 트랜스펙션 및 발현 단계. 예를 들어, U.S. 특허 Nos. 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6, 331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; 및 6,180,370 참조.

설치류 또는 변성 설치류 V 영역과 사람 불변 도메인과 융합된 이들의 관련된 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 키메라 항체를 포함하여, 비-사람 면역글로불린으로부터 유래된 항원결합부위를 포함하는 많은 "사람화된" 항체 분자가 설명되어 있다. 예를 들어, Winter 등 Nature 349:293-299(1991), Lobuglio 등 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224(1989), Shaw 등 J lmmunol. 138:4534-4538(1987), 및 Brown 등 Cancer Res. 47:3577-3583(1987) 참조. 다른 참고자료는 적합한 사람 항체 불변 도메인과 융합하기 전에 사람의 지지 프레임워크 영역(FR)으로 그래프트된 설치류 CDR을 설명한다. 예를 들어, Riechmann 등, Nature, 332:323-327 (1988), Verhoeyen 등 Science 239:1534-1536(1988) 및 Jones 등 Nature 321:522-525(1986) 참조. 다른 참고자료는 재조합에 의해 덧대진 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지된 설치류 CDR을 설명한다. 예를 들어, 유럽특허공보 No. 0519596 참조. 이들 "사람화된" 분자는 사람 수용자에 있는 이들 부분의 지속기간 및 치료 적용의 효능을 제한하는 항-사람 항체 분자에 대한 원하지 않는 면역반응을 최소화하도록 디자인된다. 예를 들어, 항체 불변영역은 그것이 면역적으로 불활성이도록(예를 들어, 보체 리시스를 매개하지 않도록) 조작될 수 있다. 예를 들어, PCT 공보 No. PCT/ GB99/01441; UK 특허출원 No. 9809951.8 참조. 항체를 사람화하는 이용할 수 있는 다른 방법들이 Daugherty 등 Nucl. Acids Res. 19:2471-2476(1991) 및 U. S. 특허 Nos. 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 5,866,692; 6,210,671; 및 6,350,861; 그리고 PCT 공보 No. WO01/27160에 개시되어 있다.

또 다른 대안으로서, 특이적 사람 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수가능한 마우스를 사용함에 의해 완전한 사람 항체가 얻어질 수 있다. 또, 더 바람직하거나(예를 들어, 완전한 사람 항체) 또는 더 많은 설치류 면역반응을 생성하도록 디자인된 트랜스제닉 동물이 사람화된 또는 사람 항체의 발생을 위해 사용될 수 있다. 그러한 기술의 예들은 Abgenix, Inc.(캘리포니아 프레몬트)사의 XenomouseTM 및 Medarex, Inc.(뉴저지 프린스톤)사의 HuMAb-Mouse 및 TC MouseTM이다.

대안으로서 항체는 본 분야에 공지된 어떤 방법을 사용하여 재조합적으로 제조되고 발현될 수 있다. 다른 대안으로서 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, U.S. 특허 No. 5,565,332; 5,580,717; 5, 733,743; 및 6,265,150; 및 Winter 등, Annu. Rev. Immunol. 12:433-455(1994) 참조. 또는 달리, 파지 디스플레이 기술(McCafferty 등, Nature 348:552-553(1990))을 사용하여 비면역화된 제공자의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼터리로부터 시험관내에서 사람 항체 및 항체 단편들을 생성할 수 있다. 이 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자가 M13 또는 fd 같은 사상형 박테리오파지의 메이저 또는 마이너 코트 단백질 유전자로 인-프레임 클로닝되고, 파지 입자의 표면 위에 기능적 항체 단편으로 디스플레이된다. 사상형 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 이들 특성을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자의 선택을 가져온다. 따라서 파지는 B 세포 특성 중의 일부를 의태한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 예를 들어, Johnson Kevin S. 및 Chiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571(1993) 참조. V-유전자 세그먼트의 몇몇 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. Clackson 등, Nature 352:624-628(1991)은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 적은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체들의 다른 종류의 어레이를 분리했다. 비면역화된 사람 제공자의 V 유전자 레퍼토리가 구성될 수 있으며, 항원(자기-항원을 포함함)들의 다른 종류의 어레이에 대한 항체가 Mark 등 J Mol. Biol. 222:581-597(1991) 또는 Griffith 등 EMBO J. 12:725-734(1993)에 설명된 기술에 따라서 본질적으로 분리될 수 있다. 자연적 면역반응에서 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적한다(체세포 과돌연변이). 도입된 변화의 일부는 더 높은 친화성을 부여하고, 고-친화성 표면 면역글로불린을 디스플레이하는 B 세포가 우선적으로 복제되어 후속 항원 챌린지 동안 분화된다. 이런 자연적 과정은 "사슬 셔플링"으로 알려진 기술을 사용하여 모방될 수 있다(Marks, 등, Biol Techrzol. 10:779-783(1992)). 이 방법에서 파지 디스플레이에 의해 얻어진 "일차" 사람 항체의 친화성은 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 비면역화된 제공자로부터 얻어진 V 도메인 유전자의 천연발생 변이체(레퍼토리들)의 레퍼토리로 연속적으로 대체함에 의해서 개선될 수 있다. 이 기술은 pM 내지 nM 범위의 친화성을 갖는 항체 및 항체 단편의 생성을 허용한다. 매우 많은 파지 항체 레퍼토리("모든 라이브러리의 어머니"라고도 함)를 제조하기 위한 전략이 Waterhouse 등, Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)에 의해 설명되었다. 유전자 셔플링을 사용하여 설치류 항체로부터 사람 항체를 유도할 수 있으며, 여기서 사람 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화성 및 특이성을 가진다. "에피토프 임프린팅"이라고도 하는 이 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기술에 의해 얻어진 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자가 사람 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되며, 이로써 설치류-사람 키메라가 만들어진다. 항원에 대한 선택은 기능적 항원결합부위를 복원할 수 있는 사람 가변영역의 분리를 가져오는데, 즉 에피토프가 파트너의 선택을 좌우한다. 남아 있는 설치류 V 도메인을 대체하기 위해서 이 과정이 반복될 때 사람 항체가 얻어진다(PCT 공보 No. WO 93/06213, 1993. 4. 1. 공개 참조). 종래의 CDR 그래프팅에 의한 설치류 항체의 사람화와 달리, 이 기술은 설치류 기원의 프레임워크나 CDR 잔기를 갖지 않는 완벽한 사람 항체를 제공한다.

상기 논의는 사람화된 항체에 속하지만, 논의된 일반적인 원리는, 예를 들어 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에서 사용하는 주문제작 항체에 적용할 수 있음이 자명하다. 더 나아가, 여기 설명된 항체를 사람화하는 하나 이상의 양태는, 예를 들어 CDR 그래프팅, 프레임워크 돌연변이 및 CDR 돌연변이와 조합될 수 있음이 자명하다.

항체는 먼저 숙주 동물로부터 항체 및 항체 생성 세포를 분리한 다음 유전자 서열을 얻고 이 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포)에서 재조합적으로 항체를 발현함에 의해서 재조합적으로 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 식물(예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 밀크에서 항체 서열을 발현하는 것이다. 식물이나 밀크에서 재조합적으로 항체를 발현하는 방법은 개시되어 있다. 예를 들어, Peeters, 등, Vaccine 19:2756(2001); Lonberg, N. 및 D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65(1995); 및 Pollock, 등, Immunol Methods 231:147(1999) 참조. 항체의 유도체, 예를 들어 사람화된 항체, 단쇄 항체 등을 제조하는 방법이 본 분야에 공지되어 있다.

또, 면역분석 및 형광 활성화 세포 분리(FACS)와 같은 유세포분석 분리 기술을 사용하여 NGF에 특이적인 항체를 분리할 수 있다.

항체는 많은 상이한 캐리어에 결합될 수 있다. 캐리어는 활성 및/또는 불활성일 수 있다. 잘 공지된 캐리어의 예는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 천연 및 변성 셀룰로스, 폴리아클릴아미드, 아가로스 및 마그네타이트를 포함한다. 캐리어의 성질은 본 발명의 목적에 맞게 가용성이거나 불용성일 수 있다. 당업자는 항체를 결합시키기 위한 다른 적합한 캐리어를 알고 있거나, 또는 루틴한 실험을 사용하여 그러한 것을 확인할 수 있을 것이다.

모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 종래의 과정(예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는)을 사용하여 쉽게 분리되고 서열화된다. 하이브리도마 세포가 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 사용된다. 일단 분리되면 DNA는 발현 벡터(PCT 공보 No. WO 87/04462에 개시된 발현 벡터와 같은)안에 두어진 다음 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 E. coli 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 트랜스펙트되어 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성이 얻어진다. 예를 들어, PCT 공보 No. WO 87/04462 참조. 또, DNA는, 예를 들어 동종성 뮤린 서열 대신에 사람 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 코딩 서열로 치환함에 의해(Morrison 등, Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851(1984)), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴에 의해서 변형될 수 있다. 이 방식으로, 본원의 항-NGF 모노클로날 항체의 결합특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.

항-NGF 항체는 본 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 특성화될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 그것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 또는 "에피토프 맵핑"이다. 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑하거나 특성화하기 위한 본 분야에 공지된 많은 방법이 있으며, 이들은 항체-항원 복합체 결정 구조의 용해, 경쟁 분석, 유전자 단편 발현 분석 및 합성 펩티드-기초 분석을 포함하며, 이들은 예를 들어 Harlow 및 Lane의 Using Antibodies(a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 뉴욕, 1999)의 11장에 설명된다. 추가의 예로서, 에피토프 맵핑을 사용하여 항-NGF 항체가 결합하는 서열을 결정할 수도 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급원, 예를 들어 Pepscan Systems(네덜란드 피에이치 렐리스타드 8219 에델헤르트베그 15)로부터 상업적으로 입수가능하다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 아미노산의 단일 스트레치에 함유된 에피토프이거나, 또는 반드시 단일 스트레치에 함유되지 않을 수도 있는 아미노산의 3-차원 상호작용에 의해 형성된 입체구조적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이(예를 들어, 적어도 4-6개 아미노산 길이)의 펩티드가 분리되거나 합성(예를 들어, 재조합에 의해서)될 수 있으며, 항-NGF 항체와의 결합 분석에 사용된다. 다른 예에서, 항-NGF 항체가 결합하는 에피토프는, NGF 서열로부터 유래된 중복 펩티드를 사용하여 계통적으로 스크리닝하고 항-NGF 항체에 의한 결합을 측정하는데서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 분석에 따르면, NGF를 암호화하는 오픈리딩프레임이 무작위적으로 또는 특이적 유전자 구성물에 의해 단편화되고, 시험될 항체를 갖는 NGF의 발현된 단편의 반응성이 측정된다.

유전자 단편은, 예를 들어 PCR에 의해 제조된 다음, 방사성활성 아미노산의 존재하에 시험관내에서 단백질로 형질전환되고 변역될 수 있다. 다음에 항체와 방사성활성 표지된 NGF 단편의 결합이 면역침전과 겔 전기영동에 의해 측정된다. 또한, 어떤 에피토프는 파지 입자(파지 라이브러리)의 표면 위에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 큰 라이브러리를 사용하여 확인될 수 있다. 또는 달리, 중복 펩티드 단편의 한정된 라이브러리가 간단한 결합 분석으로 시험 항체와의 결합에 대해 시험될 수 있다. 추가의 예로서, 항원 결합 도메인의 돌연변이생성, 도메인 스와핑 실험 및 알라딘 스캐닝 돌연변이생성이 에피토프 결합에 필요한, 충분한 및/또는 필수적인 잔기를 확인하기 위해서 수행될 수 있다. 예를 들어, 도메인 스와핑 실험은 NGF 폴리펩티드의 다양한 단편이, 밀접하게 관련되지만 항원적으로는 별개인 단백질(뉴로트로핀 단백질 패밀리의 또 다른 구성원과 같은)로부터의 서열로 대체된 돌연변이 NGF를 사용하여 수행될 수 있다. 항체와 돌연변이 NGF의 결합을 평가함에 의해서, 항체 결합에 대한 특정한 NGF 단편의 중요성이 평가될 수 있다.

항-NGF 항체를 특성화하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 동일한 항원과 결합한다고 알려진 다른 항체, 즉 NGF에 대한 다양한 단편들을 사용하는 경쟁 분석을 사용하는 것이며, 이로써 항-NGF-항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 측정할 수 있다. 경쟁 분석은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 본 발명에서 경쟁 분석에 사용될 수 있는 항체의 예는 Hongo, 등 Hybridoma 19:215-227(2000)에 설명된 MAb 911, 912, 938을 포함한다.

다른 NGF 길항제

항-NGF 항체 이외의 다른 NGF 길항제가 사용될 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, NGF 길항제는 기능적 NGF의 발현을 차단 또는 감소시킬 수 있는 적어도 하나의 안티-센스 분자이다. NGF의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있으며 공개적으로 이용할 수 있는 데이타베이스로부터 쉽게 입수가능하다. 예를 들어, Borsani 등, Nuc. Acids Res. 1990, 18, 4020; Accession Number NM 002506; Ullrich 등, Nature 303:821-825(1983) 참조. 다른 폴리뉴클레오티드와의 교차-반응 없이 NGF mRNA와 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것이 일반적이다. 전형적인 표적화 부위는, 제한은 없지만 개시 코돈, 5' 조절 영역, 코딩 서열 및 3' 미번역 영역을 포함한다. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 100 뉴클레오티드 길이, 약 15 내지 50 뉴클레오티드 길이, 약 18 내지 25 뉴클레오티드 길이, 또는 그 이상의 길이이다. 올리고뉴클레오티드는 본 분야에 잘 공지된, 포스포로티오에이트 결합 및 2'-O 당 변형과 같은 백본 변형을 포함할 수 있다. 전형적인 안티센스 분자는 U.S. 공보 No. 20010046959에 설명된 NGF 안티센스 분자를 포함한다(http://www.ma-tec.com/repair.htm. 참조).

다른 구체예에서, NGF 길항제는 기능적 NGF 수용체(TrkA 및/또는 p75 같은)의 발현을 차단 또는 감소시킬 수 있는 적어도 하나의 안티-센스 분자를 포함한다. Woolf 등 J. Neuroscie (2001)21(3):1047-55; Taglialetela 등 J Neurochem (1996) 66(5):1826-35. TrkA 및 p75의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있으며, 공개적으로 이용할 수 있는 데이타베이스로부터 쉽게 입수가능하다.

또는 달리, NGF 발현 및/또는 방출 및/또는 NGF 수용체 발현은 유전자 녹다운, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, RNAi, 또는 리보짐, 본 분야에 잘 공지된 방법들을 사용하여 감소될 수 있다. 다음의 사이트를 참조한다.

http://www.macalester.edu/-montgomery/RNAi.html

http://pub32.ezboard.com/finorpholinosfrm19.showMessage?topicID=6.topic

http://www.highveld.com/ribozyme.html.

다른 구체예에서, NGF 길항제는 적어도 하나의 NGF 억제성 화합물을 포함한다. 본원에 사용된 "NGF 억제성 화합물"은 NGF 생물학적 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 감소, 억제, 중화 또는 제거하는 항-NGF 항체 이외의 다른 화합물을 말한다. NGF 억제성 화합물은 다음 특징들 중 어느 하나 이상을 나타내야 한다: (a) (a) NGF와 결합한다; (b) NGF 생물학적 활성 또는 NGF 신호화 기능에 의해 매개된 하류 경로를 억제한다; (c) 수술-후 통증의 어떤 양태를 예방, 개선 또는 치료한다; (d) NGF 수용체 활성화(TrkA 수용체 다이머화 및/또는 자동인산화를 포함함)를 차단 또는 감소시킨다; (e) NGF 클리어런스를 증가시킨다; (f) NGF 합성, 생성, 또는 방출을 억제(감소)한다; (g) 수술, 상처 또는 외상으로부터의 회복을 증진시킨다. 전형적인 NGF 억제성 화합물은 U. S. 공보 No. 20010046959에 설명된 소분자 NGF 억제제; PCT 공보 No.WO 00/69829에 설명된 p75와 결합하는 NGF를 억제하는 화합물; PCT 공보 No.WO 98/17278에 설명된 TrkA 및/또는 p75와 결합하는 NGF를 억제하는 화합물을 포함한다. NGF 억제성 화합물의 추가의 예는 PCT 공보 No. WO 02/ 17914 및 WO 02/20479, 그리고 U.S. 특허 No. 5,342,942; 6,127,401; 및 6,359,130에 설명된 화합물을 포함한다. 더 이상의 전형적인 NGF 억제성 화합물은 NGF의 경쟁 억제제인 화합물이다. U.S. 특허 No. 6,291,247 참조. 더 이상으로, 당업자는 다른 소분자 NGF 억제성 화합물을 제조할 수 있다.

어떤 구체예에서 NGF 억제성 화합물은 NGF와 결합한다. 전형적인 표적화(결합) 부위는, 제한은 없지만 TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체와 결합하는 NGF 부분, 및 수용체-결합 영역에 인접해 있고 수용체-결합 부분의 정확한 3-차원 모양을 일부 가져오는 NGF 부분들을 포함한다. 다른 구체예에서, NGF 억제성 화합물은 NGF 수용체(TrkA 및/또는 p75와 같은)와 결합하고 NGF 생물학적 활성을 억제한다. 전형적인 표적화 부위는 NGF와 결합하는 TrkA 및/또는 p75의 부분들이다.

소분자를 포함하는 구체예에서, 작은 분자는 100 내지 20,000달톤, 500 내지 15,000달톤 또는 1000 내지 10,000달톤 중 어떤 분자량을 가질 수 있다. 소분자의 라이브러리는 상업적으로 입수가능하다. 소분자는 흡입, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 경막내, 심실내, 경구, 장관내, 비경구, 비강내 또는 피내를 포함하는 본 분야에 공지된 어떤 수단을 사용하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 NGF 길항제가 소분자일 때, 그것은 1회 내지 3회 이상의 용량으로 나누어져 환자의 체중 kg 당 0.1 내지 300mg의 비율로 투여될 것이다. 정상 체중의 성인 환자에 대해서 용량 당 1mg 내지 5g의 용량 범위가 투여될 수 있다.

다른 구체예에서, NGF 길항제는 적어도 하나의 NGF 구조 유사체를 포함한다. 본 발명에서 "NGF 구조 유사체"는 NGF의 구조의 일부와 유사한 3-차원 구조를 가지며 시험관내 또는 생체내에서 생리학적인 조건하에서 NGF 수용체와 결합하는 화합물을 말하고, 이 경우 결합은 NGF 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 억제한다. 한 구체예에서, NGF 구조 유사체는 TrkA 및/또는 p75 수용체와 결합한다. 전형적인 NGF 구조 유사체는, 제한은 없지만 PCT 공보 No. WO 97/15593에 설명된 2-고리 펩티드; U.S. 특허 No. 6,291,247에 설명된 2-고리 펩티드; U.S. 특허 No. 6,017, 878에 설명된 고리 화합물; 및 PCT 공보 No. WO 89 /09225에 설명된 NGF-유도 펩티드를 포함한다. 또한, 적합한 NGF 구조 유사체가, 예를 들어 PCT 공보 No. WO 98/ 06048에 설명된 방법에 의해, NGF-수용체의 분자 모델링을 통해 디자인되고 합성될 수 있다. NGF 구조 유사체는 모노머이거나, 또는 개선된 친화성 및 생물학적 효과를 얻기 위해서 동일한 또는 상이한 구조들의 어떤 바람직학 조합의 형태로 다이머/올리고머일 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체의 적어도 하나의 도미넌트-네가티브 돌연변이를 포함하는 NGF 길항제를 제공한다. 당업자는, 예를 들어 TrkA 수용체의 도미넌트-네가티브 돌연변이를 제조할 수 있고, 이로써 이 수용체는 NGF와 결합하게 됨으로써 NGF를 포획하는 "싱크"로서 작용하게 된다. 그러나, 도미넌트-네가티브 돌연변이는 NGF와의 결합시 TrkA 수용체의 정상적인 생체활성을 갖지 않을 것이다. 전형적인 도미넌트-네가티브 돌연변이는, 제한은 없지만 다음의 참고자료에 설명된 돌연변이들을 포함한다: Li 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1998, 95, 10884; Eide 등, J. Neurosci. 1996, 16, 3123; Liu 등, J Neurosci 1997, 17, 8749; Klein 등, Cell 1990, 61, 647; Valenzuela 등, Neuron 1993, 10, 963; Tsoulfas 등, Neuron 1993, 10, 975; 및 Lamballe 등, EMBOJ 1993, 12, 3083, 이들은 모두 본원에 그 전체가 참고자료로서 포함된다. 도미넌트-네가티브 돌연변이는 단백질 형태나 발현 벡터의 형태로 투여될 수 있으며, 이로써 도미넌트-네가티브 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 TrKA 수용체가 생체내에서 발현된다. 단백질 또는 발현 벡터는 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 경막내, 심실내, 경구, 장관내, 비경구, 비강내, 피내, 또는 흡입에 의한 것과 같은 본 분야에 공지된 어떤 수단을 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터의 투여는 국부 또는 전신 투여를 포함하며, 이들은 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테테르 투여, 그리고 국소 투여를 포함한다. 당업자는 생체내에서 외인성 단백질의 발현을 얻기 위한 발현 벡터의 투여에 익숙하다. 예를 들어, U.S. 특허 No. 6,436,908; 6,413,942; 및 6,37 6,471 참조.

또한, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적 송달이 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 송달 기술은, 예를 들어 Findeis 등, Trends Biotechnol. (1993)11:202; Chiou 등, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J. A. Wolff 편저)(1994); Wu 등, J. Biol. Chem. (1988) 263:621 ; Wu 등, J BioL Chem. (1994) 269:542; Zenke 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1990) 87:3655; Wu 등, J. Biol. Chem. (1991) 266:338에 설명된다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 치료 프로토콜에서의 국소 투여에 대해 약 100ng 내지 200mg의 범위로 투여된다. 어떤 구체예에서, 약 500ng 내지 약 50mg, 약 1㎍ 내지 2mg, 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 그리고 약 20㎍ 내지 100㎍의 DNA 농도, 또는 그 이상의 농도가 유전자 치료 프로토콜 동안 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 송달 비히클을 사용하여 송달 수 있다. 유전자 송달 비히클은 바이러스 기원이거나 비-바이러스 기원일 수 있다(일반적으로, Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy(1995) 1:185; 및 Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148 참조). 그러한 코딩 서열의 발현은 내인성 포유동물 또는 이종성 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하여 유도될 수 있다.

원하는 폴리뉴클레오티드의 송달과 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기제 벡터는 본 분야에 잘 공지되어 있다. 전형적인 바이러스-기제 비히클은, 제한은 없지만 재조합 레트로바이러스(예를 들어, PCT 공보 No. WO 90/07936; WO 94/ 03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; U. S. 특허 No. 5,219,740 및 4,777,127; GB 특허 No. 2,200,651; 및 EP 특허 No. 0 345 242 참조), 알파바이러스-기제 벡터(예를 들어, Sindbis 바이러스 벡터, Semliki 포레스트 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), Ross River 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, PCT 공보 No. WO 94/12649, WO93/03769; WO93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/ 00655 참조)를 포함한다. 또한, Curiel, Hum. GeneTher.(1992) 3:147에 설명된 죽은 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 사용될 수 있다.

또한, 비-바이러스 송달 비히클 및 방법이 사용될 수 있으며, 이들은 제한은 없지만, 죽은 아데노바이러스에만 연결되거나 또는 연결되지 않은 다가양이온 축합된 DNA(예를 들어, Curiel, Hum. Gene Ther.(1992) 3:147 참조); 리간드-결합 DNA(예를 들어, Wu, J Biol. Chem.(1989) 264:16985 참조); 진핵세포 송달 비히클 세포(예를 들어, U. S. 특허 No. 5,814,482; PCT 공보 No. WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338 참조) 그리고 핵 전하 중화 또는 세포 멤브레인과의 융합을 포함한다. 또한, 네이키드 DNA가 사용될 수 있다. 전형적인 네이키드 DNA는 PCT 공보 No. WO 90/11092 및 U. S. 특허 No. 5,580,859에 설명된다. 유전자 송달 비히클로서 작용할 수 있는 리포좀은 U.S. 특허 No. 5,422,120; PCT 공보 No. WO95/13796; WO94/23697; WO 91/14445; 및 EP 특허 No. 0524968에 설명된다. 추가의 접근법이 Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 및 Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581에 설명된다.

발현 벡터는 본원에 설명된 단백질-기제 NGF 길항제 중 어느 것의 직접 발현에 사용될 수 있다는 것이 또한 자명하다(예를 들어, 항-NGF 항체, TrkA 면역부착소 등). 예를 들어, NGF 및/또는 NGF 생물학적 활성을 차단(부분 차단 내지는 완전 차단)할 수 있는 다른 TrkA 수용체 단편이 본 분야에 공지되어 있다.

다른 구체예에서, NGF 길항제는 적어도 하나의 TrkA 면역부착소를 포함한다. 본원에 사용된 TrkA 면역부착소는 TrkA 수용체의 세포외 도메인과 면역글로불린 서열을 포함하는 가용성 키메라 분자를 말하며, 이것은 TrkA 수용체의 결합 특이성을 보유하고(TrkA 수용체의 결합 특이성을 실질적으로 보유한다) NGF와 결합할 수 있다.

TrkA 면역부착소는 본 분야에 공지되어 있으며, NGF와 TrkA 수용체의 결합을 차단한다고 알려져 있다. 예를 들어, U.S. 특허 No. 6,153,189 참조. Brennan 등은 수술-후 통증의 래트 모델에서의 TrkA 면역부착소의 투여를 보고했다. Society for Neuroscience Abstracts 24(1-2) 880 (1998) 참조. 한 구체예에서, TrkA 면역부착소는 NGF와 결합할 수 있는 TrkA 세포외 도메인으로부터의 TrkA 수용체 아미노산 서열(또는 이들의 일부)(어떤 구체예에서는 TrkA 수용체의 결합 특이성을 실질적으로 보유하고 있는 아미노산 서열)과 면역글로불린 서열의 융합체를 포함한다. 어떤 구체예에서, TrkA 수용체는 사람 TrkA 수용체 서열이고, 융합체는 면역글로불린 불변 도메인 서열을 가진다. 다른 구체예에서, 면역글로불린 불변 도메인 서열은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 서열이다. 다른 구체예에서, 2개의 TrkA 수용체-면역글로불린 중쇄 융합체(예를 들어, 이황화결합(들)에 의한 공유결합을 통한)의 결합은 동종성 다이머 면역글로불린-유사 구조를 가져온다. 면역글로불린 경쇄가 이황화-결합 다이머에 있는 TrkA 수용체-면역글로불린 키메라 중 1개 또는 2개 모두와 더 결합될 수 있으며, 이로써 호모트리머 또는 호모테트라머 구조가 얻어진다. 적합한 TrkA 면역부착소의 예는 U.S. 특허 No. 6,153,189에 설명된 것들을 포함한다.

다른 구체예에서, NGF 길항제는 TrkA 수용체 및/또는 하류 신호화와 NGF 물리적 상호작용을 차단, 억제, 변경, 및/또는 감소시킬 수 있는 적어도 하나의 항-TrkA 항체를 포함하며, 이로써 NGF 생물학적 활성이 감소 및/또는 차단된다. 항-TrkA 항체는 본 분야에 공지되어 있다. 전형적인 항-TrkA 항체는 PCT 공보 No. WO 97/21732, WO 00/73344, WO 02/15924 및 U.S. 공보 No. 20010046959에 설명된 것들을 포함한다.

다른 구체예에서, NGF 길항제는 p75 수용체 및/또는 하류 신호화와 NGF 물리적 상호작용을 차단, 억제 및/또는 감소시킬 수 있는 적어도 하나의 항-p75 항체를 포함하며, 이로써 NGF 생물학적 활성이 감소 및/또는 차단된다.

다른 구체예에서, NGF 길항제는 TrkA 및/또는 p75 수용체 활성과 관련된 하류 키나제 신호화를 억제할 수 있는 적어도 하나의 키나제 억제제를 포함한다. 전형적인 키나제 억제제는 K252a 또는 K252b이며, 이들은 본 분야에 공지되어 있고, Knusel 등, J. Neurochem. 59:715-722(1992); Knusel 등, J Neurochemistry 57:955 -962(1991); Koizumi 등, J. Neuroscience 8:715-721(1988); Hirata 등, Chemical Abstracts 111:728, XP00204135, 요약 및 Collective Chemical Substance Index 12판 참조, p. 34237, c.3(5-7), (55-60, 66-69), p. 34238, c.1(41-44), c.2(25-27, 32-33), p.3423, c.3(48-50, 52-53); 및 U.S. 특허 No. 6,306,849에 설명된다.

임상의의 조사에 의해 많은 다른 카테고리의 NGF 길항제가 확인될 것이라고 예상된다.

NGF 길항제의 확인

항-NGF 항체 및 다른 NGF 길항제가 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 확인되거나 특성화될 수 있으며, 이로써 NGF 생물학적 활성의 감소, 개선, 또는 중화가 검출 및/또는 측정된다. 예를 들어, U.S. 특허 No. 5,766,863 및 5,891,650에 설명된 키나제 수용체 활성화(KIRA) 분석을 사용하여 NGF 길항제를 확인할 수 있다. 이 ELISA-타입 분석은 수용체 단백질 티로신 키나제(이후 "rPTK"라고 함), 예를 들어 TrkA 수용체의 키나제 도메인의 자동인산화를 측정함에 의해서 키나제 활성화를 정성적 또는 정량적 측정하는데 적합하며, 또한 선택된 rPTK, 예를 들어 TrkA의 잠재적 길항제를 확인 및 특성화에도 적합하다.

분석의 제 1 단계는 키나제 수용체, 예를 들어 TrkA 수용체의 키나제 도메인의 인산화를 포함하며, 여기서 수용체는 진핵세포의 세포막에 존재한다. 수용체는 내인성 수용체거나, 또는 이 수용체를 암호화하는 핵산, 또는 수용체 구성물이 세포로 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 제 1 고체상(예를 들어, 제 1 분석 플레이트의 웰)은 그러한 세포(통상 포유동물 셀라인)의 실질적으로 동종성 집단으로 코팅되어 이 세포들이 고체상에 부착된다. 주로 세포는 점착성이며 따라서 제 1 고체상에 자연적으로 부착한다. 만일 "수용체 구성물"이 사용된다면 그것은 통상 키나제 수용체와 플래그 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 플래그 폴리펩티드는 이 분석의 ELISA 부분에서 주로 포획 항체인 포획제에 의해 인식된다. 다음에, 후보 항-NGF 항체 또는 다른 NGF 길항제와 같은 분석물질이 NGF와 함께 부착 세포를 갖는 웰에 첨가되며, 이로써 티로신 키나제 수용체(예를 들어, TrkA 수용체)가 NGF와 분석물질에 노출(또는 접촉)된다. 이 분석은 그것의 리간드 NGF에 의해 TrkA의 활성화를 억제하는 항체(또는 다른 NGF 길항제)의 확인을 가능하게 한다. NGF와 분석물질에 노출된 다음 부착 세포는 리시스 완충액(이것은 가용성 세제를 가진다)을 사용하여 용해되고 부드럽게 교반되며, 이로써 세포 용해물을 농축이나 정화할 필요 없이 이 분석의 ELISA 부분을 직접 수행할 수 있는 세포 용해물이 나온다.

다음에, 이와 같이 제조된 세포 용해물은 이 분석의 ELISA 단계를 수행할 준비가 된다. ELISA 단계의 제 1 단계로서 제 2의 고체상(보통 ELISA 마이크로타이터 플레이트의 웰)이 티로신 키나제 수용체, 또는 수용체 구성물의 경우 플래그 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 포획제(주로 포획 항체)로 코팅된다. 제 2 고체상의 코팅은 포획제가 제 2 고체상에 부착되도록 수행된다. 포획제는 일반적으로 모노클로날 항체이지만, 본원의 실시예에 설명된 바와 같이 폴리클로날 항체도 사용될 수 있다. 다음에, 얻어진 세포 용해물이 부착된 포획제에 노출되거나 접촉되며, 이로써 수용체 또는 수용체 구성불이 제 2 고체상에 부착(또는 포획)된다. 다음에, 세척 단계를 수행하여 포획된 수용체나 수용체 구성물을 남긴 채로 결합되지 않은 세포 용해물을 제거한다. 다음에, 부착 또는 포획된 수용체 또는 수용체 구성물이 티로신 키나제 수용체에 있는 인산화된 티로신 잔기를 확인하는 항-포스포티로신 항체에 노출되거나 접촉된다. 한 구체예에서, 항-포스포티로신 항체는 비-방사성활성 착색 시약의 색 변화를 촉매하는 효소와 콘쥬게이트된다(직접적으로 또는 간접적으로). 따라서, 수용체의 인산화가 뒤이은 시약의 색 변화에 의해 측정될 수 있다. 효소는 항-포스포티로신 항체에 직접 결합될 수 있거나, 또는 콘쥬케이트 분자(예를 들어, 비오틴)이 항-포스포티로신 항체에 콘쥬게이트될 수 있고 이어서 효소가 콘쥬게이트 분자를 통해 항-포스포티로신 항체에 결합될 수 있다. 마지막으로, 항-포스포티로신 항체와 포획된 수용체나 수용체 구성물의 결합이, 예를 들어 착색 시약의 색 변화에 의해 측정된다.

또한, NGF 길항제는 후보 제제와 NGF를 함께 인큐베이션 하고 다음의 특징들 중 하나 이상을 모니터함에 의해서 확인될 수 있다: (a) NGF와 결합한다; (b) NGF 생물학적 활성 또는 NGF 신호화 기능에 의해 매개된 하류 경로를 억제한다; (c) 수술-후 통증의 어떤 양태를 예방, 개선 또는 치료한다; (d) NGF 수용체 활성화(TrkA 수용체 다이머화 및/또는 자동인산화를 포함함)를 차단 또는 감소시킨다; (e) NGF 클리어런스를 증가시킨다; (f) NGF 합성, 생성, 또는 방출을 억제(감소)한다; (g) 수술로부터의 회복을 증진시킨다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제는 NGF와 함께 후보 제제를 인큐베이션하고 결합 및 NGF의 생물학적 활성의 감소나 중화를 모니터함에 의해서 확인된다. 결합 분석은 정제된 NGF 폴리펩티드(들)을 사용하거나, NGF 폴리펩티드(들)을 자연적으로 발현하거나 발현하도록 트랜스펙트된 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 한 구체예에서 결합 분석은 경쟁 결합 분석이며, 이 경우 NGF 결합에 대한 기지의 NGF 길항제와 경쟁하는 후보 항체의 능력이 평가된다. 이 분석은 ELISA 포맷을 포함하는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 후보 화합물과 NGF를 함께 인큐베이션하고 TrkA 수용체 다이머화 및/또는 자동인산화의 억제를 모니터함에 의해서 확인된다.

초기 확인 후, 후보 항-NGF 길항제의 활성은 표적의 생물학적 활성을 시험하기 위해 공지된 생체분석법에 의해 더 확인되고 정제된다. 또는 달리, 생체분석법을 사용하여 후보를 직접 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, NGF는 반응성 세포에서 형태학적으로 인식가능한 많은 변화를 촉진한다. 이들은 제한은 없지만, PC12 세포의 분화 촉진 및 이들 세포로부터 신경돌기의 성장 증진(Urfer 등, Biochem. 36: 4775-4781(1997); Tsoulfas 등, Neuro 7 10:975-990(1993)), 반응성 감각 및 교감 신경절의 체외이식편으로부터 신경돌기의 파생 촉진(Levi-Montalcini, R. 및 Angel etti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48, 534-569, 1968) 그리고 배아 등쪽 뿌리 신경절, 삼차 신경절, 또는 교감 신경절 뉴런과 같은 NGF 의존성 뉴런의 생존 촉진(예를 들어, Chun & Patterson, Dev. Biol. 75:705-711, (1977); Buchman & Davies, Development 118:989-1001, (1993))을 포함한다. 따라서, NGF 생물학적 활성의 억제에 대한 분석은 NGF 반응성 세포를 후보 항-NGF 항체 및 후보 NGF 길항제와 같은 분석물질 및 NGF와 함께 배양하는 것을 수반한다. 적합한 시간 후 세포 반응이 분석될 것이다(세포 분화, 신경돌기 파생 또는 세포 생존).

또한, NGF의 생물학적 활성을 차단 또는 중화하는 후보 NGF 길항제의 능력이 Hongo 등, Hybridoma 19:215-227(2000)에 설명된 대로 배아 래트 등쪽 뿌리 신경절 생존 생체분석에서 NGF 매개 생존을 억제하는 후보 제제의 능력을 모니터함에 의해 평가될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 조성물

본 발명의 방법에 사용되는 조성물은 유효량의 NGF 길항제(항-NGF 항체와 같은)를 포함하며, 어떤 경우에는 제약학적으로 허용되는 부형제를 더 포함한다. 어떤 구체예에서 조성물은 본원에 설명된 방법 중 어느 것에서 사용된다. 그러한 조성물의 예와 제조 방법이 본원에 또한 설명된다. 한 구체예에서 조성물은 NGF 길항제를 포함한다. 다른 구체예에서 조성물은 하나 이상의 NGF 길항제를 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은 NGF와 결합(물리적으로 상호작용)하는 길항제(예를 들어, 항체), NGF 수용체(TrkA 및/또는 p75 수용체와 같은)와 결합하는 길항제 및 하류 NGF 수용체 신호화를 감소(저해 및/또는 차단)시키는 길항제 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 NGF 길항제를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 TrkA 면역부착소가 아닌(즉, TrkA 면역부착소 이외의 다른) 어떤 NGF 길항제를 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은 항-NGF 항체 이외의 다른 어떤 NGF 길항제를 포함한다. 또 다른 구체에에서, 조성물은 TrkA 면역부착소 이외의 다른 그리고 항-NGF 항체 이외의 다른 어떤 NGF 길항제를 포함한다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 NGF 합성, 생성 또는 방출을 억제(감소)한다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제는 NGF와 결합하며, 관련된 뉴로트로핀(NT3, NT4/5 및/또는 BDNF)과는 유의하게 교차반응하지 않는다. 어떤 구체예에서 NGF 길항제는 역면역반응과 관련되지 않는다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체, NGF에 대한 안티-센스 분자(NGF를 암호화하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함함), NGF 수용체(TrkA 및/또는 p75와 같은)에 대한 안티-센스 분자(NGF 수용체를 암호화하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함함), NGF 억제성 화합물, NGF 구조 유사체, NGF와 결합하는 TrkA 및/또는 p75 수용체의 도미넌트-네가티브 돌연변이, TrkA 면역부착소, 항-TrkA 항체, 항-p75 항체 및 키나제 억제인자로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 항-NGF 항체이다. 다른 구체예에서 항-NGF 항체는 사람 NGF를 인식한다. 어떤 구체예에서 항-NGF 항체는 사람이다. 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체-매개 리시스 또는 ADCC와 같은 원하지 않거나 바람직하지 않은 면역반응을 개시하지 않는 불변영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 하나 이상의 CDR(들)을 포함한다(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 어떤 구체예에서는 E3로부터의 6개 CDR 전부).

조성물은 하나 이상의 NGF 길항제를 포함할 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 조성물은 한 부류의 NGF 길항제에 속한 하나 이상의 구성원(예를 들어, 상이한 NGF 에피토프들을 인식하는 항-NGF 항체들의 혼합물), 및 상이한 부류의 NGF 길항제에 속한 구성원들(예를 들어, 항-NGF 항체 및 NGF 억제성 화합물)을 포함할 수 있다. 다른 전형적인 조성물은 동일한 에피토프(들)을 인식하는 하나 이상의 항-NGF 항체들, 상이한 NGF 에피토프와 결합하는 상이한 종의 항-NGF 항체들, 또는 상이한 NGF 억제성 화합물들을 포함한다.

본 발명에 사용되는 조성물은 동결건조 제제나 수용액의 형태로 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제를 더 포함할 수 있다(Remington: The Scien ce and Practice of Pharmacy 20판. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover.). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 그 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이트, 페놀, 부틸 또는 벤질알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈 같은 친수성 폴리머; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 착물화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨 같은 염-형성 카운터 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온계 계면활성제, 예를 들어 TWEEN ^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다. 제약학적으로 허용되는 부형제가 본원에 더 설명된다. NGF 길항제 및 이들의 조성물은 이 제제의 효능을 증진 및/또는 보완하는 작용을 하는 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다.

키트

또, 본 발명은 본 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 NGF 길항제(항체, 예를 들어 본원에 설명된 사람화된 항체 E3와 같은)를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하며, 어떤 구체예에서는 본원에 설명된 발명의 방법 중 어느 것에 따라 사용하기 위한 지침을 더 포함한다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제는 본원에 설명된 어떤 NGF 길항제이다. 또 다른 구체예에서, 키트는 TrkA 면역부착소가 아닌(즉, TrkA 면역부착소 이외의 다른) NGF 길항제를 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 항-NGF 항체 이외의 다른 NGF 길항제를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 키트는 TrKA 면역부착소 이외의 다른 그리고 항-NGF 항체 이외의 다른 어떤 NGF 길항제를 포함한다. 어떤 구체예에서, 키트는 항-NGF 항체(본원에 설명된 항체 E3와 같은)를 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 항체 E3의 하나 이상의 CDR(들)(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 어떤 구체예에서는 E3의 6개 CDR 전부)를 포함하는 항-NGF 항체를 포함한다. 어떤 구체예에서, 지침은 본원에 설명된 방법 중 어느 것에 따라서 수술-후 통증을 치료, 개선 또는 예방하기 위해 NGF 길항제를 투여하는 것에 대한 설명을 포함한다. 키트는 개체가 수술-후 통증을 가지는지 아니면 개체가 수술-후 통증의 위험이 있는지 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 것에 대한 설명을 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 지침은 수술-후 통증을 치료, 예방 및/또는 개선하기 위해 NGF 길항제를 투여하는 것에 대한 설명을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 지침은 수술-후 통증의 위험이 있는 개체에게 NGF 길항제를 투여하는 것에 대한 설명을 포함한다.

NGF 길항제의 사용과 관련된 지침은 일반적으로 투여량, 투약 일정, 및 의도된 치료에 맞는 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 포장(예를 들어, 다수-용량 포장) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공된 지침은 전형적으로 라벨 또는 포장 삽입물에 대한 서면 지침(예를 들어, 키트에 포함된 인쇄지)이지만, 기계로 읽을 수 있는 지침(예를 들어, 자기 또는 광 저장 디스크에 수록된 지침)도 허용된다.

라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 수술-후 통증을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용됨을 나타낸다. 지침은 본원에 설명된 방법 중 어느 것을 수행하기 위해서 제공될 수 있다.

본 발명의 키트는 적합하게 포장된 상태로 있다. 적합한 포장은, 제한은 없지만 바이알, 바틀, 병, 가요성 포장(예를 들어, 밀봉 마일라 또는 플라스틱백) 등을 포함한다. 또한, 특정한 장치, 예를 들어 흡입기, 비강투여장치(예를 들어, 분무기) 또는 주입장치, 예를 들어 미니펌프와 함께 사용하기 위한 포장도 고려된다. 키트는 멸균된 엑세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하주사바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액용의 백 또는 바이알일 수 있다). 또한, 용기가 멸균된 엑세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하주사바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액용의 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 NGF 길항제, 예를 들어 항-NGF 항체이다. 용기는 제 2의 제약학적 활성제를 더 포함할 수 있다.

키트는 선택적으로 완충액 및 해석 정보와 같은 추가 성분을 제공할 수 있다. 통상 키트는 용기 및 용기에 대한 또는 용기와 관련된 라벨 또는 포장 삽입물(들)을 포함한다.

NGF 길항제의 투여 및 치료 평가

NGF 길항제는 어떤 적합한 경로에 의해 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, NGF 길항제는 경구, 정맥내, 혀밑, 피하, 동맥내, 활막내, 혈관내(예를 들어, 방광을 통해), 근육내, 심장내, 흉막내, 복강내, 심실내, 혀밑 방식에 의해, 흡입에 의해, 좌약에 의해, 또는 경피 방식에 의해 투여될 수 있다. 이들은 경구적으로, 예를 들어 본 분야에 공인된 과정에 의해 제조된 정제, 트로우키, 캡슐, 엘리시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 롤리팝, 츄잉검 등의 형태로 투여된다. 본원에 설명된 예들은 제한하려는 의도는 없으며 이용가능한 기술을 예시한다는 것이 당업자에게 자명해야 한다.

따라서, 어떤 구체예에서, NGF 길항제, 예를 들어 항-NGF 항체는 정맥내 투여와 같은 공지된 방법에 따라서 개체에게 투여되며, 예를 들어 볼루스로서, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 동맥내, 활막내, 경막내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 어떤 시간 기간에 걸쳐 연속 주입함에 의해 투여된다. 제트 분무기 및 초음파 분무기를 포함하는 액체 제제에 알맞은 상업적으로 입수가능한 분무기가 투여에 유용하다. 액체 제제가 직접 분무될 수 있으며, 동결건조된 분말이 복원 후에 분무될 수 있다. 또는 달리, NGF 길항제는 불화탄소 제제와 계량 용량 흡입기를 사용하여 에어로졸로 만들 수 있거나, 또는 동결건조되고 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.

한 구체예에서, NGF 길항제는 부위-특이적 또는 표적화된 국소 송달 기술에 의해 투여된다. 부위-특이적 또는 표적화된 국소 송달 기술의 예는 다양한 이식형 저장소 NGF 길항제 공급원이나, 또는 국소 송달 카테테르, 예를 들어 주입 카테테르, 유치 카테테르, 또는 바늘 카테테르, 합성 이식편, 외부 싸개, 션트 및 스텐트 또는 다른 이식형 장치, 부위 특이적 캐리어, 직접 주사, 또는 직접 도포를 포함한다. 예를 들어, PCT 공보 No. WO 00/53211 및 U.S. 특허 No. 5,981,568 참조.

NGF 길항제(항-NGF 항체와 같은)의 다양한 제제들이 투여에 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서 NGF 길항제는 순수하게 투여될 수 있다. 어떤 구체예에서 NGF 길항제는 항-NGF를 포함하며, 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제제를 포함하는 다양한 제제일 수 있다. 제약학적으로 허용되는 부형제는 본 분야에 공지되어 있으며, 제약학적으로 효과적인 물질의 투여를 용이하게 하는 비교적 불활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태나 경도를 제공할 수 있거나, 또는 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는, 제한은 없지만 안정제, 습윤 및 유화제, 삼투성을 변화시키는 염, 캡슐화제, 완충액, 및 피부침투 증진제를 포함한다. 비경구 및 경구 약물 송달용의 부형제 및 제제가 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20판(Mack Publishing (2000))에 제시된다.

어떤 구체예에서, 이들 제제는 주사(예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)에 의해 투여에 알맞게 제조된다. 따라서, 이들 제제는 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 같은 제약학적으로 허용되는 비히클과 조합될 수 있다. 특정한 투약 섭생, 즉 용량, 시기 및 반복회수는 특정한 개체 및 그 개체의 병력에 의존할 것이다.

항-NGF 항체는 주사(예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)에 의한 것을 포함하여 어떤 적합한 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 또한, 항-NGF 항체는 본원에 설명된 대로 흡입에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 항-NGF 항체의 투여를 위해서, 초기 후보 제제의 용량은 약 2mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 전형적인 일일 용량은 상기 언급된 요인들에 따라서 3㎍/kg 내지 30㎍/kg 내지 300㎍/kg 내지 3mg/kg 내지 30mg/kg 내지 100mg/kg 또는 그 이상 중 어느 것의 범위일 수 있다. 상태에 따라 수일 또는 더 오랜 기간에 걸친 반복 투여에 대해서, 원하는 증상의 억제가 일어날 때까지 또는 수술-후 통증이 감소될 만큼 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료가 지속된다. 전형적인 투약 섭생은 약 2mg/kg의 초기 용량을 투여한 후, 항-NGF 항체 약 1mg/kg의 용량을 매주 유지하거나, 또는 격주로 약 1mg/kg의 용량을 유지한다. 그러나, 의사가 달성하기 원하는 약물동력학적 붕괴의 패턴에 따라서 다른 투약 섭생도 유용할 수 있다. 예를 들어, 주 당 1 내지 4회의 투약이 고려된다. 이 치료법의 진행과정은 종래의 기술과 분석에 의해 쉽게 모니터된다. 투약 섭생은(사용된 NGF 길항제(들)을 포함하는)은 시간이 지남에 따라 변할 수 있다.

일반적으로, NGF 길항제가 항체가 아닐 때, NGF 길항제는 (어떤 구체예에서) 1 내지 3회 용량으로 나누어져 환자의 체중 당 약 0.1 내지 300mg/kg의 비율로, 또는 본원에 개시된 대로 투여될 수 있다. 어떤 구체예에서, 보통 체중의 성인 환자에 대해서, 약 0.3 내지 5.00mg/kg의 용량 범위가 투여될 수 있다. 특정한 투약 섭생, 즉 용량, 시기 및 반복회수는 특정한 개체 및 이 개체의 병력, 그리고 각 제제의 특성(제제의 반감기, 및 본 분야에 잘 공지된 다른 고려사항과 같은)에 따를 것이다.

본 발명의 목적을 위해서, NGF 길항제의 적합한 용량은, 사용된 NGF 길항제(들)(또는 이들의 조성물), 제제가 예방 목적으로 투여되든 치료 목적으로 투여되든지 상관 없이 치료될 통증의 종류 및 심한 정도, 이전의 치료, 환자의 임상적 병력 및 제제에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다. 전형적으로, 임상의는 원하는 결과를 달성하는 투약량에 도달할 때까지 NGF 길항제, 예를 들어 항-NGF 항체를 투여할 것이다.

반감기와 같은 실험적 고려사항이 일반적으로 용량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 사람 면역 시스템과 양립할 수 있는 항체, 예를 들어 사람화된 항체나 완전한 사람 항체를 사용하여 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역 시스템에 의해 공격 받는 것을 방지할 수 있다. 투여의 빈도는 치료의 진행과정에 따라 결정 및 조절될 수 있으며, 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로 통증의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연을 토대로 한다. 또는 달리, 항-NGF 항체의 지속적인 연속 방출 제제가 적합할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 본 분야에 공지되어 있다.

한 구체예에서, NGF 길항제의 용량은 NGF 길항제(항체와 같은)를 1회 이상 투여 받은 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. 개체는 NGF 길항제, 예를 들어 항-NGF 항체의 증분 용량을 제공 받는다. NGF 길항제의 효능을 평가하기 위해서는 통증의 척도에 따를 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 NGF 길항제의 투여는, 예를 들어 투여가 치료적 목적인지 예방적 목적인지에 관계 없이 수용자의 생리학적 상태와 숙련된 의사에게 공지된 다른 요인들에 따라서 연속적 또는 간헐적일 수 있다. NGF 길항제의 투여(예를 들어, NGF 길항제가 항-NGF 항체인 경우)는 본질적으로 미리 선택된 시간 기간에 걸쳐 연속적으로 투여될 수 있거나, 또는 일련의 용량을 간격을 두어서, 예를 들어 통증 발생 전에, 동안에 또는 후에; 통증 발생 전에; 통증 발생 동안에; 통증 발생 전후 모두에; 통증 발생 동안과 후에; 통증 발생 전과 동안에; 또는 통증 발생 전에, 동안 및 후에 모두 투여될 수 있다. 투여는 상처, 절개, 외상, 수술, 및 수술-후 통증을 발생시킬 가능성이 있는 어떤 다른 사건 전에, 동안에 및/또는 후에 행해질 수 있다.

어떤 구체예에서, 하나 이상의 NGF 길항제, 예를 들어 항체가 존재할 수 있다. 길항제는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개의 상이한 NGF 길항제가 존재할 수 있다. 일반적으로 이들 NGF 길항제는 서로 부정적인 영향을 미치지 않는 보완적인 활성을 가진다. 또한, NGF 길항제는 제제의 효능을 증진 및/또는 보완하는 작용을 하는 다른 제제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명에 따라서 사용되는 NGF 길항제(항체와 같은)의 치료제는 원하는 정도의 순도를 갖는 항제와 선택적인 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20판(Mack Publishing(2000) )를 혼합함에 의해서, 동결건조 제제나 수용액의 형태로 저장에 알맞게 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이트, 페놀, 부틸 또는 벤질알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만의) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 착물화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨 같은 염-형성 카운터 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온계 계면활성제, 예를 들어 TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.

NGF 길항제(항체와 같은)를 함유하는 리포솜이 본 분야에 공지된 방법에 의해 제조되며, 이것은 Epstein 등 Proc.Natl.Acad. Sci. USA 82:3688(1985); Hwang, 등, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030(1980); 및 U. S. 특허 No. 4,485,045 및 4,544,545에 설명된다. 증진된 순환 시간을 갖는 리포솜이 U.S. 특허 No. 5,013, 556에 개시된다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)를 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 정해진 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포솜을 얻는다.

또한, 활성 성분은, 콜로이드상 약물 송달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀젼 중에서, 예를 들어 코아세르베이션 기술, 또는 계면중합에 의해서 제조된 마이크로캡슐에, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 그러한 기술은 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20판(Mack Publishing (2000))에 개시된다.

지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들어 필름이나 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(U.S. 특허 No. 3,773, 919), L-글루탐산과 7-에틸 L-글루타메이트의 코폴리머, 비-변성 에틸렌-비닐 아세테이트, 변성 락트산-글리콜산 코폴리머, 예를 들어 LUPRON DEPOT^TM(락트산 글리콜산 코폴리머와 로이프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어)을 포함한다.

생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이것은, 예를 들어 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 치료용 항-NGF 항체 조성물은 일반적으로 멸균 엑세스 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액용 백이나 바이알에 넣어진다.

본 발명에 따르는 조성물은 정제, 알약, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액 또는 좌약과 같은 단위 제형, 경구용, 비경구용 또는 직장 투여용의 단위 제형, 또는 흡입이나 취입에 의한 투여용의 단위 제형일 수 있다.

정제와 같은 고체 조성물을 제조하는데 있어서, 주된 활성 성분이 제약학적 담체, 예를 들어 종래의 정제화 성분, 예를 들어 콘스타치, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 다른 제약학적 희석제, 예를 들어 물과 혼합되어, 본 발명의 화합물 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 비독성 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고체 예비제제 조성물을 형성한다. 이들 예비제제 조성물이 균질하다고 말할 때, 그것은 활성 성분이 조성물 전체에 균일하게 분산되어 조성물이 정제, 알약 및 캡슐과 같은 동등하게 효과적인 단위 제형으로 다시 나눠질 수 있다는 의미이다. 다음에, 이 고체 예비제제 조성물은 본 발명의 활성 성분을 0.1 내지 약 500mg 함유하는 상기 설명된 타입의 단위 제형으로 다시 나눠진다. 이 신규한 조성물의 정제 또는 알약은 코팅되거나 그렇지 않으면 연장된 작용의 이점을 제공하는 제형을 제공하도록 조제된다. 예를 들어, 정제 또는 알약은 내부 투약 성분과 외부 투약 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자의 겉을 둘러싼 형태이다. 두 성분은 위에서의 붕해에 대항하도록 작용하고 내부 성분이 십이지장을 그대로 통과하거나 방출이 지연되도록 허락하는 장관층에 의해 분리될 수 있다. 그러한 장관층이나 코팅으로서 다양한 재료가 사용될 수 있으며, 그러한 재료는 많은 폴리머 산 및 셰랙, 세틸알콜 및 셀룰로스 아세테이트로서 폴리머 산과 그러한 재료의 혼합물을 포함한다.

적합한 표면활성제는, 특히 비-이온계 제제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌소르비탄(예를 들어, Tween^TM 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄(예를 들어, Span^TM 20, 40, 60, 80 또는 85)를 포함한다. 표면활성제를 갖는 조성물은 편리하게 0.05 내지 5% 표면활성제를 포함할 것이며, 이것은 0.1 내지 2.5%일 수도 있다. 필요하다면 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 제약학적으로 허용되는 부형제가 첨가될 수 있음이 자명할 것이다.

적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예를 들어 Intralipid ^TM, Liposyn^TM, Infonutrol^TM, Lipofundin^TM 및 Lipiphysan^TM을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분이 미리 혼합된 에멀젼 조성물에 용해되거나, 또는 활성 성분이 오일(예를 들어, 대두유, 해바라기유, 면실유, 참기름, 옥수수유 또는 아몬드기름)에 용해된 다음 인지질(예를 들어, 달걀 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴)과 물을 함께 혼합하여 에멀젼이 형성된다. 에멀젼의 등장성을 조절하기 위해 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있음이 자명할 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 20% 이하, 예를 들어 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0㎛, 특히 0.1 내지 0.5㎛의 지방 방울을 포함할 수 있으며, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 가진다.

에멀젼 조성물은 신경성장인자 길항제와 Intralipid^TM 또는 이들의 성분들(대두유, 달걀 인지질, 글리세롤 및 물)을 혼합함으로써 제조된 것들일 수 있다.

흡입 또는 취입용 조성물은 제약학적으로 허용되는 수성 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 중의 용액 및 현탁액, 그리고 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 제시된 적합한 제약학적으로 허용되는 부형제들을 함유할 수 있다. 어떤 구체예에서, 조성물은 국소 또는 전신 효과에 알맞은 경구 또는 비강 호흡기 경로에 의해 투여된다. 바람직하게 멸균된 제약학적으로 허용되는 용매 중의 조성물은 기체의 사용에 의해 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접 호흡될 수 있거나, 또는 분무 장치가 안면 보호구, 산소 텐트 또는 간헐적 양압 호흡기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 적합한 방식으로 제제를 송달하는 장치로부터 바람직하게는 경구 또는 비강 투여 방식으로 투여될 수 있다.

치료 효능이 본 분야에 잘 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.

발명의 개요

본 발명은 NGF의 길항제가 수술-후 통증을 치료하는데 효과적이라는 발견에 기초한다. 이 치료는 여기 설명된 수술-후 통증 중 하나 이상의 양태를 다룬다.

한 양태로서, 본 발명은 신경성장인자(NGF)의 길항제를 투여함에 의해 수술-후 통증("절개-후" 또는 "외상-후" 통증이라고도 한다)을 예방 또는 치료하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면 NGF 길항제는 수술로 인한 또는 절개나 외상성 상처로 인한 통증을 포함하는 수술-후 통증으로 인한 통증을 억제 또는 차단할 수 있는 것으로 나타났다.

다른 양태로서, 본 발명은 개체에서, 수술-후 통증 발생의 감소, 수술-후 통증의 개선, 수술-후 통증의 완화; 및/또는 수술-후 통증의 진전이나 진행의 지연을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 NGF 길항제를 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 유효량의 NGF 길항제를 투여하는 것을 포함하는 개체에서 통증 역치를 증가시키는 방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 유효량의 NGF 길항제를 투여하는 것을 포함하는 개체에서 수술 및/또는 상해-유발 외상성 상처로부터의 회복을 증진시키는 방법을 제공한다.

어떤 구체예에서는 휴식중의 통증이 억제, 개선 및/또는 예방되고, 어떤 구체예에서는 기계적으로 유발된 통증(움직임으로 인한 통증을 포함함)이 억제, 개선 및/또는 예방되며, 그리고 어떤 구체예에서는 열 유발된 통증이 억제, 개선 및/또는 예방된다. 어떤 구체예에서 기계적으로 유발된 통증은 항-NGF 항체를 투여함에 의해 억제, 개선 및/또는 예방된다. 어떤 구체예에서 휴식중의 통증은 항-NGF 항체를 투여함에 의해 억제, 개선 및/또는 예방된다. 어떤 구체예에서 열 유발된 통증은 항-NGF 항체를 투여함에 의해 억제, 개선 및/또는 예방된다. 어떤 구체예에서는, 무해자극통증(즉, 보통의 무해 자극에 대한 증가된 반응(즉, 증가된 유해감각))이 억제, 개선 및/또는 예방되고, 및/또는 통각과민(즉, 보통의 유해 또는 불쾌한 자극에 대한 증가된 반응)이 억제, 개선 및/또는 예방된다. 더 이상의 구체예에서 무해자극통증 및/또는 통각과민은 자연적인 열 또는 기계적(촉각) 통증, 또는 휴식중의 통증이다. 어떤 구체예에서 통증은 만성 통증이다. 다른 구체예에서 통증은 절개, 상처 또는 외상의 부위와 관련되거나, 및/또는 절개, 상처, 및/또는 외상의 부위에 인접하거나 근처인 곳과 관련된다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 적합한 NGF 길항제는 NGF 생물학적 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 어떤 제제이다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제(예를 들어, 항체)는 NGF와 결합(물리적으로 상호작용)하고, NGF 수용체(TrkA 수용체 및/또는 p75와 같은)에 결합하고, 및/또는 하류 NGF 수용체 신호화를 감소(저해 및/또는 차단)시킨다(예를 들어, 키나제 신호화 억제인자). 따라서, 어떤 구체예에서 NGF 길항제는 NGF와 결합(물리적으로 상호작용)한다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 NGF 수용체(TrkA 수용체 및/또는 p75)에 결합한다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 하류 NGF 수용체 신호화(예를 들어, 키나제 신호화의 억제인자)를 감소(저해 및/또는 차단)시킨다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NGF 합성 및/또는 방출을 억제(감소)한다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 TrkA 면역부착소가 아닌(즉, TrkA 면역부착소 이외의 다른) NGF 길항제이다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 항-NGF 항체 이외의 다른 것이다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 TrkA 면역부착소 이외의 다른 것이며, 항-NGF 항체 이외의 다른 것이다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제는 NGF(hNGF와 같은)와 결합하고, NT-3, NT4/5, 및/또는 BDNF와 같은 관련된 뉴로트로핀과는 유의할 만하게 결합하지 않는다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체, NGF에 대한 안티-센스 분자(NGF를 암호화하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함함), NGF 수용체(TrkA 및/또는 p75와 같은)에 대한 안티-센스 분자(NGF 수용체를 암호화하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함함), NGF 억제성 화합물, NGF 구조 유사체, NGF와 결합하는 TrkA 및/또는 p75 수용체의 도미넌트-네가티브 돌연변이, 항-TrkA 항체, 항-p75 항체 및 키나제 억제인자 중 어느 하나 이상으로부터 선택된다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 항-NGF 항체이다. 또 다른 구체예에서 항-NGF 항체는 사람화된다(본원에 설명된 항체 E3와 같이). 어떤 구체예에서 항-NGF 항체는 항체 E3(본원에 설명된 바와 같은)이다. 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 하나 이상의 CDR(들)을 포함한다(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 어떤 구체예에서는 E3로부터의 6개 CDR 전부). 다른 구체예에서 항체는 사람이다. 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 표 1에 나타낸 중쇄 가변영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1) 및 표 2에 나타낸 경쇄 가변영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 포함한다. 다른 구체예에서, 항체는 면역학적으로 불활성인 영역, 예를 들어 보체 매개 리시스(lysis)를 개시시키지 않거나 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는 불변영역과 같은 변형된 불변영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 불변영역은 Eur.J.Immunol. (1999)29:2613-2624; PCT 출원 No. PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허출원 No. 9809951.8에 설명된 대로 변형된다.

어떤 구체예에서 NGF 길항제는 NGF에 결합한다. 또 다른 구체예에서 NGF 길항제는 NGF(사람 NGF와 같은)와 특이적으로 결합하는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 마우스 모노클로날 항체인 Mab 911, MAb 912 및 MAb 938 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 항체와 동일한 NGF 에피토프 6과 본질적으로 결합한다(Hongo, 등, Hybridoma 19:215-227 (2000) 참조). 어떤 구체예에서 NGF 항체는 TrkA 수용체와 결합한다. NGF 길항제는 hNGF와 결합하여 hNGF와 사람 TrkA(hTrkA)의 결합을 효과적으로 억제하고 및/또는 사람 TrkA 수용체의 활성화를 효과적으로 억제할 수 있는 항-사람 NGF(항-hNGF) 모노클로날 항체일 수 있다.

NGF(hNGF와 같은)에 대한 항-NGF 항체의 결합 친화성은 약 0.10 내지 약 1.0 nM, 약 0.10nM 내지 약 0.80nM, 약 0.15 내지 약 0.75nM 그리고 약 0.18nM 내지 약 0.72nM일 수 있다. 한 구체예에서 결합 친화성은 약 2pM 내지 22pM이다. 어떤 구체예에서 결합 친화성은 약 10nM이다. 다른 구체예에서 결합 친화성은 약 10nM 미만이다. 다른 구체예에서 결합 친화성은 약 0.1nM 또는 약 0.07nM이다. 다른 구체예에서 결합 친화성은 약 0.1nM 미만, 또는 약 0.07nM 미만이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 100nM, 약 50nM, 약 10nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 또는 약 50pM 중 어느 하나 내지는 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 또는 약 40pM 중 어느 하나이다. 어떤 구체예에서, 결합 친화성은 약 100nM, 약 50 nM, 약 10nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 또는 약 50pM 중 어느 하나이거나, 또는 약 50pM 미만이다. 어떤 구체예에서, 결합 친화성은 약 100nM, 약 50nM, 약 10 nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 또는 약 50pM 중 어느 하나 미만이다. 또 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 약 40pM, 또는 약 40pM 이상이다. 본 분야에 잘 공지된 바와 같이, 결합 친화성은 K_D, 또는 해리상수로서 표현될 수 있으며, 결합 친화성의 증가는 K_D의 감소에 상응한다. 사람 NGF에 대한 마우스 모노클로날 항체 911(Hongo 등 Hybridoma 19:215-227(2000))의 결합 친화성은 약 10nM이고, 사람 NGF에 대한 사람화된 항-NGF 항체 E3(본원에 설명된)의 결합 친화성은 약 0.07nM이다.

NGF 길항제는 수술-후 통증을 일으키거나 또는 그와 관련된 수술, 절개 및/또는 상처 전에, 동안, 및/또는 후에 투여될 수 있다. 어떤 구체예에서 NGF 길항제는 수술, 절개 또는 상처 전에 투여된다. NGF 길항제의 투여는 본 분야에 공지된 어떤 수단에 의해서도 행해질 수 있으며, 경구, 정맥내, 피하, 동맥내, 근육내, 심장내, 척수내, 흉부내, 복강내, 심실내, 혀밑, 및/또는 경피적 방식을 포함한다. 어떤 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체이며, 정맥내, 피하, 흡입, 동맥내, 근육내, 심장내, 심실내, 및 복강내 수단 중 하나 이상에 의해 투여된다. 투여는 전신성, 예를 들어 정맥내 수단에 의한 것이거나, 또는 국부적일 수 있다.

어떤 구체예에서 NGF 길항제는 약 0.1 내지 10mg/kg 체중의 용량으로 투여되고, 다른 구체예에서는 NGF 길항제는 약 0.3 내지 2.0mg/kg 체중의 용량으로 투여된다.

다른 양태로서, 본 발명은 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 유효량의 신경성장인자(NGF) 길항제를 포함하는 수술-후 통증의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물을 특징으로 한다. 어떤 구체예에서, NGF는 NGF 분자와 특이적으로 결합하는 항체이다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 본원에 설명된 어떤 길항제이다.

다른 양태로서, 본 발명은 본원에 설명된 방법 중 어느 것에서 사용하기 위한 키트를 특징으로 한다. 어떤 구체예에서, 키트는 제약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 본원에 설명된 NGF 길항제 중 어느 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 본원에 설명된 방법 중 어느 것에서의 NGF 길항제의 사용에 대한 지침을 더 포함한다.

다음의 실시예들은 예시를 위해 제공되며 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1

항-NGF 모노클로날 항체는 수술-후 통증을 치료하는데 효과적이다

우리는 항-NGF 항체 911(마우스 모노클로날 항체: Hongo, 등, Hybridoma 19: 215-227 (2000) 참조)를 사용한 치료 효능을 평가하기 위해서 수술-후 통증을 모방하는 통증 모델을 사용했다. 각 실험은 16마리의 동물(n=그룹 당 8마리)을 포함했다. 항-NGF 항체를 절개 15시간 전에 실험 당 다양한 농도(kg 당 35 또는 7mg)로 복강내(i.p.) 주사했다. 대조군은 항체를 받지 않았고 식염수 용액을 복강내 주사했다.

동물. 220-240g의 수컷 Sprague Dawley 래트를 Harlan(샌디에고)에서 구입했고 수술 전 1주일 동안 동물 시설에 적응시켰다.

Brennan 등(Pain 64:493-501(1996))에 설명된 과정을 기초로 수술했다. 동물을 2% 이소플루란 공기 혼합물을 수술하는 동안 노즈 콘을 통해 주입하여 마취했다. 오른쪽 뒷발의 발바닥 표면을 포비돈-요오드 패드로 준비하고, 뒷꿈치 가장자리에서 0.5cm 떨어진 곳에서 시작하여 발가락을 향해 피부와 근막을 통과하여 중앙에 세로방향으로 1cm 절개했다. 관절 위치에 고정된 발 부분을 자를 사용하여 측정했다. 발바닥 근육을 구부러진 겸자를 사용하여 들어올려 세로방향으로 절개했다. 이 근육은 착점과 삽입점 사이의 전깊이를 통과하여 절개했다. 가제 패드를 통해 압력을 가하여 수술 동안 출혈을 제어했다. 상처를 2개의 매트리스 봉합으로 밀봉했다(5-0 에틸론 블랙 모노필라멘트). 이들 봉합은 5-6회 매듭지었으며 첫번째 매듭은 좀 느슨하게 묶었다. 상처 부위를 바시트라신 용액으로 닦았다. 동물을 행동 시험을 시작하기 전에 2시간 이상 깨끗한 우리에 두어 회복시키고 쉬게 했다.

휴식중 통증 평가. 누적 통증 점수를 사용하여 체중부하에 관련된 통증을 평가했다. 동물을 발의 아래쪽을 검사할 수 있도록 플랫폼(h: 18") 위에 들어올려진 깨끗한 플라스틱 우리안의 플라스틱 메시(격자: 8mm²)에 두었다. 20분의 적응 기간 후 체중부하를 0에서 2의 규모로 평가했다. 발이 하얗게 되거나 메시에 대해 압박되는 경우 점수 0을 주었으며, 이는 전체 체중부하를 나타낸다. 발이 피부가 메시와 겨우 접촉하는 것을 더 선호하고 피부가 하얗게 되거나 오목한 자국이 없을 때 점수 1을 준다. 발이 메시와 완전히 떨어져서 유지될 때 점수 2를 준다. 래트가 여전히 휴식 중인 때에 발을 움찔하는 것은 점수 2로 생각한다. 각 동물은 30분 동안 5분마다 1분간 관찰했다. 30분 동안 얻어진 6회 점수의 합(0-12)을 사용하여 절개된 발의 통증을 평가한다. 점수 2의 빈도를 계산하여 심한 통증의 발생 또는 동물에 의한 발의 전체적인 보호를 평가했다. 각 동물은 수술 24시간 전, 그리고 수술 2시간, 24시간, 48시간 및 72시간 후에 시험했다. 이 실험의 결과를 도 1에 나타냈으며, 이것은 항-NGF 마우스 항체 911 35mg/kg으로 치료된 동물에서 관찰된 누적 휴식중 통증 점수를 나타낸다. 이들 결과는 항-NGF 항체를 사용한 치료가 수술-후 휴식중 통증을 현저히 감소시켰음을 증명했다. 체중부하는 동물이 사지를 얼마나 자유로이 사용할 수 있었는지와 잘 상호관련되었으며, 따라서 통증 완화에 대한 효과적인 측정이다.

촉각 무해자극통증을 사용한 기계적으로 유발된 통증의 평가. 촉각 무해자극통증을 Semmes-Weinstein von Frey 털(Stoelting, 일리노이 우드데일)을 사용하여 측정했다. 동물을 발의 아래쪽을 검사할 수 있도록 플랫폼(h: 18") 위에 들어올려진 12mm 플라스틱 메시 바닥으로 된 우리에 두었다. 실험을 시작하기 전에 동물을 이 환경에 길들였다(그 전 주 1-2일에 걸쳐). 15분의 적응 기간 후, 발을 후퇴하는 반응이 도출될 때까지 힘의 정도를 올리면서 von Frey 털을 가진 동물의 뒷발의 발꿈치 상의 절개 진입점의 중앙과 기부에서 피부를 건들임으로써 촉각 무해자극통증을 시험했다. von Frey 수는 4.08에서 5.46을 사용했다: 각 숫자는 하기 설명된 대로 힘(g)과 상호관련된다. 각 von Frey 털을 직각으로 표면에 대고 2초동안 또는 반응이 일어날 때까지 휘었다. 일단 후퇴 반응이 일어나면, 반응이 일어나지 않을 때까지 다음번 내려온 von Frey 털로 시작하여 발을 2회 이상 다시 시험했다.

3회 시험에 걸친 반응을 도출하는데 필요한 힘의 최저량을 후퇴 역치(g)로 기록했다. 29g의 최고 힘은 발을 들어올렸을 뿐만 아니라 반응을 도출했으며, 따라서 이것은 컷-오프 지점을 나타낸다. 반응이 검출되지 않은 경우 다음번 올라온 필라멘트 "5.88"을 기록했다. 왼발과 오른발 모두 이 방식으로 시험했다. 각 동물은 수술 24시간 전(베이스라인), 그리고 수술 2시간, 24시간, 48시간 및 72시간 후에 시험했다. 촉각 무해자극통증은 휴식중 통증 점수를 기록한 후에 시험했다. 이 실험의 결과를 도 3에 나타냈으며, 이것은 항-NGF 항체 911 7mg/kg으로 치료된 동물에서 기계적 자극에 반응하는 누적 점수를 제공한다. 이들 결과는 항-NGF 항체를 사용한 치료가 수술-후의 기계적으로 유발된 통증을 감소시켰음을 증명했다.

열 통각과민의 평가. 열 통각과민을 Hargreaves, 등(1988)의 변형된 방법에 따른 래트 발바닥 시험(Ugo Basile, 이탈리아)에 의해 평가했다. 래트를 들어올려진 유리 테이블 위에 있는 4개의 개별 플렉시글라스 상자로 구성된 장치에 길들였다. 이동하는 복사 열원을 테이블 아래에 위치시키고 뒷발 위에 집중시켰다. 동물이 잠자는 것은 아니지만 움직이지 않는 동안 조절 상자 위의 버튼을 누르고, 복사 열원을 가깝게 가져와서 동물이 열원으로부터 후퇴하기까지의 시간을 자동기록했다. 이런 발 후퇴 잠재성(PWL)은 복사 열원의 반사율의 변화에 의해 래트 발의 이동을 감지하는 복사 열원에 내장된 광검출기에 의해 검출된다. 발 후퇴 잠재성은 초 단위로 기록했다. 22.5의 자동 컷-오프 지점이 조직 손상을 예방했다. PWL은 각 동물의 두 뒷발에 대해 3 내지 4시간 걸렸다. 결과는 오른발(수술 부위)과 왼발에서 측정된 점수의 비로서 나타낸다. 장치를 일단 캘리브레이션하고(연구 시작시에) 대략 6초의 정상 PWL을 제공하도록 강도 40으로 설정했다. 각 동물은 수술 24시간 전에 그리고 수술 3시간, 24시간, 48시간 및 72시간 후에 시험했다. 열 통각과민 측정은 촉각 무해자극통증 측정 후에 행했다. 이 실험의 결과를 도 2에 나타냈으며, 이것은 열 자극에 대한 반응에 있어서 항-NGF 항체 911 35mg/kg으로 치료된 동물에서 관찰된 누적 점수를 나타낸다. 이들 결과는 항-NGF 항체를 사용한 치료가 수술-후 열 통각과민을 감소시켰음을 증명했다.

실시예 2

사람화된 항-NGF 항체를 사용한 수술-후 통증의 치료와 수술-후 통증의 아편유사제 치료와의 비교

수술-후 통증에 대한 E3으로 명명된 사람화된 항-NGF 항체의 효과를 실시예 1에서 설명된 수술-후 통증에 대한 동물 모델에서 시험했다. E3 항체는 돌연변이 A330P331에서 S330S331(야생형 IgG2a를 참조로 번호매긴 아미노산; Eur.J.Immunol. (1999)29:2613-2624 참조)을 함유하는 사람 중쇄 IgG2a 불변영역; 사람 경쇄 kappa 불변영역; 및 표 1 및 2에 나타낸 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함한다.

항-NGF 항체를 절개 15시간 전에 다양한 항체 농도(0.004, 0.01, 0.02, 0.1, 0.6, 및 1mg, 동물 체중 kg 당)로 복강내(i.p.) 주사했다. 음성 대조군은 항체를 받지 않았고 식염수 용액을 복강내 주사했다. 0.01mg/kg의 펜타닐을 양성 대조군으로서 시험 30분 전과 수술 24시간 후에 복강내 주사했다. 각 실험은 각 조건에 대해 8마리(n=그룹 당 8마리)를 포함했고, 대조군은 56마리의 동물을 가졌다. 수술을 행했으며, 수컷 Sprague Dawley 래트를 Harlan(위스콘신)에서 구입한 것을 제외하고는 누적 통증점수를 실시예 1에 설명된 대로 측정했다. 휴식중 통증을 실시예 1에 설명된 대로 수술 24시간 후에 평가했다.

도 4에 나타낸 대로, 사람화된 항-NGF 항체 E3는 0.02mg/kg 내지 1mg/kg 용량으로 투여되었을 때 수술 후 휴식중 통증을 유의하게 감소시켰다(p<0.05). "*"는 대조군과의 상당히 유의한 차이를 나타낸다(p<0.05). 0.02mg/kg을 사용한 치료는 적어도 0.01mg/kg 펜타닐을 사용한 치료 만큼 효과적으로 통증 거동을 개선시켰다. 이 용량의 펜타닐은 이런 효능의 아편유사제의 정상 사람 용량의 10배이다.

실시예 3

항-NGF 항체를 사용한 수술-후 통증의 수술-전 및 수술-후 치료

절개 후 투여했을 때 수술-후 통증을 감소시키는데 있어서의 항-NGF 항체의 효능을 Harlan(위스콘신)에서 구입한 수컷 Sprague Dawley 래트를 사용하여 실시예 1에 설명된 수술-후 통증 동물 모델로 시험했다. 사람화된 항-NGF 항체 E3(0.5mg/ kg)을 절개 2시간 후에 정맥내(i.v.) 주사했다. 대조군은 항체를 받지 않았고 식염수 용액을 정맥내 주사했다. 수술을 행하고 누적 통증 점수로서 표현된 휴식중 통증을 실시예 1에 설명된 대로 수술 24시간 후에 평가했다. 도 5에 나타낸 대로, 항-NGF 항체를 사용한 치료는 항체를 절개 2시간 후에 투여했을 때 절개 24시간 후에 휴식중 통증을 유의하게(p<0.05) 감소시켰다. 이들 결과는 항-NGF 항체가 수술 후 투여되었을 때 수술-후 통증을 효과적으로 완화시켰음을 증명했다.

절개 14일전 또는 절개 21일전에 투여했을 때 수술-후 통증을 감소시키는데 있어서의 항-NGF 항체의 효능을 Harlan(위스콘신)에서 구입한 수컷 Sprague Dawley 래트를 사용하여 실시예 1에 설명된 수술-후 통증 동물 모델로 시험했다. 항-NGF 마우스 모노클로날 항체 911을 절개 14일전이나 절개 21일전에 다양한 농도(1mg/kg 또는 5mg/kg)로 복강내 주사했다. 대조군은 식염수 용액을 복강내 주사했다. 수술을 행하고 누적 통증 점수로서 표현된 휴식중 통증을 실시예 1에 설명된 대로 수술 24시간 후에 평가했다. 도 6 및 도 7에 나타낸 대로, 항-NGF 항체 911은 수술 14일 전에 투여했을 때 5mg/kg 용량에서 휴식중 통증을 유의하게 감소시켰으며, 그리고 수술 21일전에 투여했을 때도 휴식중 통증을 감소시켰다.

실시예 4

항-NGF 항체를 사용한 치료는 상처 치유에 대한 영향을 나타내지 않는다

과량의 NGF를 사용한 치료가 당뇨병 동물(Matsuda 등 (1998) J Exp Med 187 (3):297-30) 및 각막궤양 및 피부(Lambiase 등 (2003) Arch Ital Biol. 141(2-3): 141-8)에서의 상처 치유를 촉진할 수 있다는 것이 과학문헌에서 제시되고 있다. 항-NGF 항체의 사용이 상처 치유를 손상시킬 수 있는지 측정하기 위해서 상처 치유에 대한 항-NGF 항체 치료의 효과를 래트에서 시험했다.

Harlan(위스콘신)에서 구입한 250-350g의 수컷 Sprague-Dawley 래트를 시설로 보내서 적어도 1주간 적응시켰다. 동물을 이소플루란으로 마취하고 등 표면(등)을 얇게 잘라서 포비돈 요오드로 세정한 후 알콜 패드로 세정했다. 가제 패드로 압력을 가하여 출혈을 제어했다. 상처를 4개의 단일 4-0 에틸론 봉합으로 봉하고 동물을 회복시켰다. 다음에, 동물을 세 그룹으로 나누었다: 한 그룹은 수술 시에 1회 용량의 마우스 모노클로날 항-NGF 항체 911(1mg/kg, 복강내)을 받았다; 한 그룹은 대조군으로서 케토롤락(5mg/kg, 수술 시작일부터 5일간 매일, 근육내(IM0))을 받았다; 한 그룹은 식염수 치료된 대조군이다(음성 대조군). 케토롤락은 상처 치유를 억제하는 것으로 알려져 있다. Haws 등(1996) Ann Plast Surg. 37(2):147-51; Gerstenfeld 등 (2003) J Orthop Res. 21(4):670-5.

절개 부위를 시험했고 수술 1일 후부터 시작해서 매일 사진을 찍었다. 봉합을 수술 2일 후에 제거했다. 전체 절개가 봉합된 채로 남아 있다면 절개는 "무손상"으로서 점수 매기고, 절개의 일부나 전부가 다시 개봉되었다면 "실패"로서 점수 매겼다. 결과는 무손상 상처의 비율(즉, 점수 매긴 동물의 총수로 나눈 무손상 상처의 수)로서 나타냈다.

도 8에 나타낸 대로, 항-NGF 항체 911로 치료된 동물의 상처 치유는 식염수로 치료된 동물과 그다지 다르지 않았다. 따라서, 항-NGF 치료는 상처 치유에 분명한 영향을 나타내지 않았다. 반대로, 식염수 또는 항-NGF 항체 911 치료된 동물과 비교했을 때, 케토롤락으로 치료된 동물에서 상처 치유는 유의하게 억제되었다(p<0.0005).

또한, 치유된 상처의 조직학적 외관을 항-NGF 항체로 치료된 3마리의 래트와 식염수로 치료된 3마리의 래트에서 시험했다. 절개 21일 후에 동물을 죽이고 절개 부위를 포함하는 피부 샘플을 포르말린에 고정시키고 파라핀으로 포매시킨 후 절개 부위를 가로질러 절편으로 만들었다. 이들 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 항-NGF 항체 또는 식염수로 처리한 후, 동물의 치료에 대해서는 알지 못하는 수의 병리학자에게 시험을 의뢰했다. 상처 치유에 대한 비정상성은 어느 그룹의 래트에서도 보여지지 않았다.

실시예 5

소분자 NGF 길항제인 K252a를 사용한 수술-후 통증의 치료

수술-후 통증을 치료하는데 있어서의 NGF 길항제 K252a의 효능을 실시예 1에 설명된 절개 모델에서 시험했다. K252a 25mg/mL 용액을 DMSO로 제조했다. 이 용액 250㎕에 45% 시클로덱스트린 용액 3500㎕를 가하여 잘 혼합했다. 다음에, 식염수 3750㎕를 가하여 최종 농도 0.8333mg/mL의 K252a를 제조했다. 동물(실시예 2에 설명된 대로 얻은)을 절개하고, 휴식중 통증을 실시예 1에 설명된 대로 평가했다. "베이스라인" 누적 휴식중 통증을 절개 24시간 후에 측정했다. 다음에, K252a를 시험 동물에 4mg/kg으로 복강내 주사했고 대조군 동물에는 부형제 용액(K252a를 제외하고 K252a 용액의 모든 성분을 함유하는 용액)을 주사했다. 누적 휴식중 통증 점수를 치료에 대해서는 알지 못하는 실험자에 의해 K252a 또는 부형제 치료 1시간 후(도면에 "1H-P-tmt"로 표시됨)와 K252 또는 부형제 치료 3시간 후(도면에 "3H-P-tmt"로 표시됨)에 측정했다. 도 9에 나타낸 대로, K252a를 사용한 치료는 투약 3시간 후에 휴식중 통증을 유의하게 감소시켰지만(p<0.005), 부형제를 사용한 치료는 그렇지 못했다. 이 결과는 K252a 치료가 항-NGF 항체를 사용한 치료가 유사한 실험에서 행한 것과 동일한 정도의 휴식중 통증을 감소시켰음을 증명했다.

실시예 6

항-NGF 항체 또는 동형 일치된 대조군 항체로 치료된 동물에서 수술-후 통증의 비교

항-NGF 항체의 진통 효과는 NGF의 억제를 필요로 했다는 것을 보여주기 위해서 수술-후 통증을 치료하는데 있어서의 항-NGF 마우스 항체 911의 효능을 초파리 단백질 기억상실증과 면역반응성인 동형 일치된 대조군 뮤린 항체의 동일한 용량에 대한 효능과 비교했다. 실험은 Sprague Dawley 래트를 harlan(위스콘신)에서 구입한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 수행했다. 래트를 수술 15시간 전에 항-NGF 항체 911(도면에 "911"로 표시됨) 또는 동형 일치된 항-기억상실증 항체(도면에 "amn ab"로 표시됨) 1mg/kg으로 복강내 치료했다. 수술 24시간 후 휴식중 통증(누적 통증 점수)을 동물의 치료에 대해서는 알지 못하는 관찰자에 의해 평가했다. 도 10에 나타낸 대로 항-NGF 항체 911을 사용한 치료는 기억상실증 항체로 치료된 동물과 비교하여 휴식중 통증을 유의하게(p<0.005) 감소시켰다.

전술한 발명은 이해를 명확히 할 목적으로 예시 및 실시예의 방식으로 일부 상세하게 설명되었지만, 설명 및 실시예들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

Claims (8)

1. TrkA 면역부착소 이외의 다른 신경성장인자(NGF) 길항제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 수술-후 통증을 치료하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 휴식중 통증을 억제하거나 개선하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 기계적으로 유발된 통증을 억제하거나 개선하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, NGF 길항제는 항-NGF 항체 이외의 다른 것임을 더 이상의 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, NGF 길항제는 NGF 수용체 활성에 관련된 하류 키나제 신호화를 억제할 수 있는 키나제 억제제인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 키나제 억제제는 K252a인 것을 특징으로 하는 방법.
7. TrkA 면역부착소 이외의 다른 NGF 길항제, 및 수술-후 통증을 치료하기 위한 NGF 길항제의 사용에 관한 지침을 포함하는 수술-후 통증을 치료하기 위한 키트.
8. 제 7 항에 있어서, NGF 길항제는 항-NGF 항체 이외의 다른 것임을 더 이상의 특징으로 하는 키트.