PL200744B1

PL200744B1 - Agonista apolipoproteiny ApoA-I, multimeryczny agonista ApoA-I, kompleks agonista ApoA-I-lipid, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie agonisty ApoA-I

Info

Publication number: PL200744B1
Application number: PL362598A
Authority: PL
Inventors: Jean-Louis Dasseux; Renate Sekul; Klaus Buttner; Isabelle Cornut; Gunther Metz
Original assignee: Klaus Buttner; Isabelle Cornut; Dasseux Jean Louis; Gunther Metz; Renate Sekul
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2009-01-30
Also published as: US20030008827A1; AU747823B2; DE69837855T2; DE69837855D1; PL362598A1; UA71554C2; KR100650974B1; JP2003525840A; US6265377B1; US20040029807A9; NO20001600L; ES2288768T3; KR20010030805A; EP1019010B1; HUP0003280A3; US7211565B2; RU2219941C2; CN1345245A; WO1999016408A2; AU9779198A

Abstract

Wynalazek dostarcza peptydów i analogów peptydowych, które na sladuj strukturalne i far- makologiczne w lasno sci ludzkiej ApoA-I. Pep- tydy i analogi peptydowe s a u zyteczne w lecze- niu ró znych chorób zwi azanych z dyslipidemi a. PL PL PL PL PL

Description

1. Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest agonista apolipoproteiny ApoA-I, multimeryczny agonista ApoA-I, kompleks agonista ApoA-I-lipid, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie agonisty ApoA-I. Agonistów apolipoproteiny A-I (ApoA-I) wykorzystuje się do leczenia chorób związanych z dyslipoproteinemią, w tym hipercholesterolemią, chorobą naczyniową, miażdżycą, restenozą oraz innymi chorobami takimi jak wstrząs septyczny.

2. Tło wynalazku

Krążący cholesterol jest przenoszony przez lipoproteiny osocza - cząsteczki złożone z lipidów i biał ek, które transportują lipidy we krwi. Lipoproteiny o mał ej gę stoś ci (LDL) i lipidy o duż ej gę stości (HDL) są najważniejszymi nośnikami cholesterolu. Uważa się, że LDL są odpowiedzialne za przenoszenie cholesterolu z wątroby (gdzie jest syntetyzowany lub uzyskiwany z diety) do pozawątrobowych tkanek organizmu. Termin odwrócony transport cholesterolu opisuje transport cholesterolu z tkanek pozawątrobowych do wątroby, gdzie jest katabolizowany i eliminowany. Uważa się, że cząstki HDL osocza odgrywają główną rolę w procesie odwrotnego transportu, działając jako wychwytywacze tkankowego cholesterolu.

Dowody łączące podwyższony poziom cholesterolu w surowicy z chorobą naczyń wieńcowych są przytłaczające. Na przykład, miażdżyca jest wolno postępującą chorobą charakteryzującą się nagromadzeniem cholesterolu na wewnętrznej ścianie tętnicy. Dowody nie do odparcia potwierdzają koncepcję, że lipidy zawarte w lezjach miażdżycowych pochodzą głównie z LDL osocza, a zatem LDL jest popularnie zwany jako zły cholesterol. Dla kontrastu, poziomy HDL w surowicy korelują odwrotnie do choroby wieńcowej - wysoki poziom HDL w surowicy jest uważany jako negatywny czynnik ryzyka. Istnieje hipoteza, że wysoki poziom HDL w surowicy nie tylko chroni przed chorobą naczyń wieńcowych, ale może w istocie powodować ustępowanie płytek miażdżycowych, (np. Patrz Badimon i wsp., 1992, Circulation 86 (Suppl. III): 86-94). A zatem, HDL są popularnie znane jako dobry cholesterol.

2.1. Transport cholesterolu.

System transportu tłuszczów można podzielić na dwa szlaki: egzogenny dla cholesterolu i trójglicerydów wchłanianych z jelita, endogenny dla cholesterolu i trójglicerydów dostających się do strumienia krwi z wątroby i innych tkanek niewątrobowych.

W szlaku egzogennym tłuszcze z diety tworzą cząsteczki lipoprotein zwane chylomikronami, które dostają się do krwi i dostarczają swoje trójglicerydy do tkanki tłuszczowej (przechowywanie) oraz do mięśni (utlenianie w celu dostarczenia energii). Reszta chylomikronu, zawierająca estry cholesterylu jest usuwana z krwiobiegu przez specyficzny receptor znajdujący się jedynie na komórkach wątroby. Ten cholesterol staje się następnie dostępny dla metabolizmu komórkowego lub recyklizacji do komórek pozawątrobowych jako lipoproteiny osocza.

W szlaku endogennym, wątroba wydziela do krwiobiegu dużą cząsteczkę lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL). Rdzeń VLDL składa się głównie z trójglicerydów syntetyzowanych w wątrobie, z mniejszą ilością estrów cholesterylu (syntetyzowanych albo w wątrobie albo odzyskiwanych z chylomikronów). Na powierzchni VLDL eksponowane są dwa dominujące białka, apoproteina B-100 i apoproteina E. Gdy VLDL osiąga naczynia włosowate tkanki tłuszczowej lub mięśni, jego trójglicerydy są ekstrahowane prowadząc do nowego rodzaju cząsteczki, mniejszej i wzbogaconej w estry cholesterylu ale zachowującej swoje dwa apolipoproteiny zwane lipoproteinami pośredniej gęstości (IDL).

W ludzkich organizmach około połowy cząsteczek IDL jest szybko usuwane z krążenia (w ciągu dwóch do sześciu godzin od wytworzenia), ponieważ wiążą się ściśle do komórek wątroby, które ekstrahują ich cholesterol, aby zrobić nowe VLDL kwasy żółciowe. Cząstki IDL nie pobrane przez wątrobę pozostają w krążeniu dłużej. Z czasem, apoproteina E oddysocjowuje od krążących cząsteczek przekształcając je do LDL mających apoproteinę B-100 jako ich jedyne białko.

W pierwszym rzędzie, wątroba pobiera większość cholesterolu i degraduje do kwasów żółciowych, będących końcowym produktem metabolizmu cholesterolu. W pobieraniu cząsteczek zawierających cholesterol pośredniczą receptory LDL, które są obecne w wysokich stężeniach na hepatocytach. Receptor LDL wiąże zarówno apoproteinę E, jak i apoproteinę B-100 oraz jest odpowiedzialny za wiązanie i usuwanie z krążenia zarówno IDL jak i LDL. Jednakże, powinowactwo apoproteiny E dla receptora LDL jest większe niż apoproteiny B-100. W efekcie tego cząsteczki LDL mają dużo dłuższy okres życia w krążeniu niż cząstki IDL -LDL krążą przeciętnie dwa i pół dnia przed związaniem do

PL 200 744 B1 receptorów LDL w wątrobie i innych tkankach. Wysokie poziomy LDL w surowicy (złego cholesterolu) są pozytywnie skorelowane z chorobą wieńcową serca. Na przykład w miażdżycy tętnic, cholesterol pochodzący z krążących LDL kumuluje się w ścianach arterii prowadząc do tworzenia rozległych złogów, hamujących przepływ krwi, aż ostatecznie tworzy skrzep powodujący obstrukcję tętnicy i powodujący atak serce lub zawał.

Ostatecznie, ilość wewnątrzkomórkowego cholesterolu pochodzącego z LDL kontroluje komórkowy metabolizm cholesterolu. Nagromadzenie komórkowego cholesterolu pochodzącego z VLDL i LDL kontroluje trzy procesy: po pierwsze redukuje moż liwość syntezy cholesterolu w komórce poprzez wyłączenie syntezy reduktazy HMGCoA - kluczowego enzymu w szlaku biosyntezy cholesterolu. Po drugie, napływający cholesterol pochodzący z LDL sprzyja gromadzeniu cholesterolu poprzez aktywacje ACAT - enzymu komórkowego, który przekształca cholesterol w estry cholesterylu, które są gromadzone w kropelkach do przechowywania tłuszczu. Po trzecie, gromadzenie cholesterolu wewnątrz komórek napędza mechanizm zwrotny, który hamuje komórkową syntezę nowych receptorów LDL. Komórki zatem dopasowywują swój zestaw receptorów LDL w taki sposób, aby wystarczająca ilość cholesterolu była dostarczana do zaspokojenia ich potrzeb metabolicznych. (Przegląd, patrz Brown i Goldstein, w: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8^th Ed, Goodeman & Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, Ch. 36, s. 874-896).

2.2 Odwrócony transport cholesterolu.

Podsumowując, obwodowe (niewątrobowe) komórki otrzymują swój cholesterol z połączenia lokalnej syntezy i pobierania uprzednio wytworzonego cholesterolu z VLDL i LDL. Dla odmiany, odwrócony transport cholesterolu (RCT) jest szlakiem, dzięki któremu cholesterol komórek obwodowych może powrócić do wątroby do recyrkularyzacji do tkanek pozawątrobowych lub wydzielenia do jelita w ż ó ł ci. Szlak RCT stanowi jedyny sposób eliminacji - cholesterolu z wię kszoś ci tkanek pozawą trobowych i jest istotny dla utrzymania struktury i funkcji większości komórek w ciele.

RCT składa się głównie z trzech etapów: (a) wypływu cholesterolu, wstępnego usunięcia cholesterolu z puli komórek obwodowych; (b) estryfikacji cholesterolu poprzez działanie acylotransferazy lecytyna:cholesterol (LCAT), zapobiegającej powtórnemu wejściu wypłyniętego cholesterolu do komórek; (c) poboru/dostarczenia estrów cholesterylu HDL do komórek wątroby. W szlaku RCT biorą udział HDL. HDL jest ogólną nazwą dla cząsteczek lipoprotein, charakteryzujących się wysoką gęstością. Głównymi składnikami lipidowymi kompleksów HDL są różne fosfolipidy, cholesterol (estry) i trójglicerydy. Najbardziej widocznymi komponentami apolipoproteinowymi są: A-I i A-II, które determinują funkcjonalne cechy HDL; co więcej, obserwowano niewielkie ilości apolipoprotein C-I, C-II, C-III, D, E, J, itp. HDL może istnieć w szerokim zakresie różnych wielkości i różnych mieszanin wyżej wspomnianych składników w zależności od stanu remodelowania podczas kaskady metabolicznej RCT.

Kluczowym enzymem uwikłanym RCT jest LCAT. LCAT jest produkowany głównie w wątrobie i krąży w osoczu związanym z frakcją HDL. Białko transportujące estry cholesterylu (CETP) i kolejne białko przenoszące fosfolipidy (PLTP) przyczyniają się do dalszego przekształcania krążącej populacji HDL. CETP może przemieszczać estry cholesterylu wyprodukowane przez LCAT do innych lipoprotein, w szczególności lipoprotein zawierających ApoB, takich jak VLDL i LDL. Trójglicerydy HDL mogą być katabolizowane przez zewnątrzkomórkową wątrobową lipazę trójglicerydów a cholesterol z lipoprotein jest usuwany przez wątrobę poprzez kilka mechanizmów.

Każda z cząsteczek HDL zawiera co najmniej jedną kopię (zazwyczaj dwie do czterech) ApoA-I. ApoA-I jest syntetyzowana w wątrobie i jelicie cienkim jako preproapolipoproteina, wydzielana jako probiałko, które jest szybko cięte, aby wytworzyć dojrzały peptyd mający 243 reszty aminokwasowe. ApoA-I składa się głównie z od 6 do 8 różnych 22-aminokwasowych powtórzeń przedzielonych łącznikiem, którym często jest prolina. I w niektórych przypadkach składa się z odcinka zbudowanego z kilku reszt. ApoA-I tworzy z lipidami trzy typy stabilnych kompleksów: małe ubogie w lipidy kompleksy określane jako pre-β-Ι HDL; spłaszczone, dyskowe cząsteczki zawierające jedynie polarne lipidy (fosfolipidy i cholesterol) określone jako pre-^-2 HDL; kuliste cząstki zawierające lipidy zarówno polarne jak i niepolarne, nazwane sferycznymi lub dojrzałymi HDL (HDL3 i HDL2). Większość HDL w populacji krążącej zawiera zarówno ApoA-I i ApoA-II (drugie główne białko HDL) i jest tutaj nazywane jako frakcja ApoA-I i ApoA-II. Jednakże, frakcja HDL zawierająca jedynie ApoA-I (nazwana tutaj jako frakcja AIHDL) wydaje się być bardziej efektywna w RCT. Niektóre badania epidemiologicze potwierdzają hipotezę, że frakcja AI-HDL jest miażdżycogenna. (Parra i wsp.1992, Arterioscler. Thromb. 12:701-707; Decossin i wsp.1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307).

PL 200 744 B1

Chociaż nieznany jest mechanizm transportu cholesterolu z powierzchni komórki uważa się, że ubogi w lipidy kompleks, pre-β-Ι HDL jest korzystnym akceptorem cholesterolu przenoszonego z tkanek peryferyjnych biorących udział w RCT. Cholesterol świeżo przeniesiony z powierzchni komórki do pre-e-1 HDL szybko pojawia się w dyskoidalnym pre-e-2 HDL. PLTP może zwiększać szybkość tworzenia się dysku, jednak brakuje danych wskazujących na rolę PLTP w RCT. LCAT korzystnie reaguje z dyskowymi i kulistymi HDL, przenosząc grupę 2-acylo z lecytyny lub innych fosfolipidów na wolną resztę hydroksylową steroidów, w szczególności cholesterolu, tworząc estry cholesterylu (zatrzymywane w HDL) i lizolecytynę. Reakcja LCAT wymaga ApoA-I jako aktywatora; tj. ApoA-I jest naturalnym kofaktorem LCAT. Konwersja cholesterolu do estrów zatrzymywanych w HDL zapobiega powtórnemu wnikaniu cholesterolu do komórki, w rezultacie powodując usunięcie estrów cholesterolu. Estry cholesterylu w dojrzałych cząsteczkach HDL we frakcji AI-DHL (tj. ApoA-I i nie ApoA-II) są usuwane przez wątrobę w przekształcane w żółć bardziej skutecznie, niż te pochodzące z HDL zawierającego zarówno ApoA-I jak i ApoA-II (frakcja AI/AII-HDL). Może to częściowo wynikać, z bardziej skutecznego wiązania AI-HDL do błon hepatocytów. Postulowano istnienie receptora HDLi ostatnio receptor wymiataczy, SR-BI został zidentyfikowany jako receptor HDL. (Acton i wsp. 1996, Science 271:518-520). SR-BI jest produkowany obficie w tkankach steroidogennych (np. nadnerczach) oraz w wątrobie. (Landshulz i wsp. 1996, J. Clin. Invest. 98:984-995; Rigotti i wsp. 1996, J. Biol. Chem. 271:33545-33549).

CEPT nie wydaje się odgrywać znaczącej roli w RCT, zamiast tego jest uwikłany w metabolizm lipidów pochodzących od VLDL i LDL. Jednakże, zmiany w aktywności CETP lub jego akceptorów, VLDL i LDL odgrywają role w remodelowaniu populacji HDL. Na przykład w nieobecności CETP, HDL stają się powiększonymi, nieusuwalnymi cząsteczkami. (Przeglądy RCT i HDL, patrz Fielding & Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36:211-228; Barrans i wsp. 1996, Biochem. Biophys. Acta. 1300:73-85; Hirano i wsp. 1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17 (b):1053-1059).

2.3. Aktualne terapie obniżające cholesterol w surowicy

Obecnie dostępnych jest szereg terapii obniżających cholesterol i trójglicerydy w surowicy (patrz, np. Brown & Goldstein, powyżej). Jednakże, każda z nich ma swoje wady i ograniczenia w zakresie skuteczności, efektów ubocznych i wyboru populacji pacjentów.

Żywice wiążące kwasy żółciowe są klasą leków zaburzających recyrkulację kwasów żółciowych pomiędzy jelitem a wątrobą; np. cholestyramina (Questran Light®, Bristol-Myers Squibb) i chlorowodorek kolestypolu (Colestid®, The Upjohn Company). Pobierane doustnie te dodatnio naładowane nośniki wiążą negatywnie naładowane kwasy żółciowe w jelicie. Ponieważ żywice nie mogą być wchłonięte z jelita, są one wydalane unosząc ze sobą kwasy żółciowe. Stosowanie takich żywic jednakże, w najlepszym wypadku obniża poziom cholesterolu jedynie o około 20% i jest związane z efektami ubocznymi ze strony przewodu pokarmowego, w tym zaparciem i niedoborem pewnych witamin Co więcej, ponieważ żywice wiążą inne leki, pozostałe leki doustne muszą być podawane najmniej jedną godzinę przed lub cztery do sześciu godzin po spożyciu żywicy; w ten sposób komplikując rygory pobierania lekarstw pacjentów z chorym sercem.

Statyny są czynnikami obniżającymi cholesterol, które blokują syntezę cholesterolu poprzez hamowanie reduktazy AMGCoA - kluczowego enzymu związanego ze ścieżką biosyntezy cholesterolu. Statyny, np. Lowastatyna (Mevacor®, Merck & Co., Inc.) i prawastatyna (Pravachol®, Bristol-Myers Squibb Co.) są czasami stosowane w powiązaniu z żywicami wiążącymi kwasy żółciowe. Statyny znacząco redukują poziomy cholesterolu i LDL w surowicy. Jednakże, poziom cholesterolu HDL w surowicy wzrasta tylko umiarkowanie. Mechanizm efektu obniżania cholesterolu może dotyczyć zarówno obniżenia stężenia VLDL i indukcji komórkowej ekspresji receptora LDL, prowadząc do obniżonej produkcji i/lub zwiększonego katabolizmu LDL. Efekty uboczne, w tym dysfunkcje wątroby i nerek są związane ze stosowaniem tych leków (Physicians Desk Reference, Medical Economics Co., Inc., Montvale, N. J. 1997). Ostatnio, FDA dopuściła atorwastatynę (inhibitor reduktazy HMGroA opracowany przez Parke-Davis (Warner Lambert) do leczenia rzadkich ale naglących przypadków rodzinnej hipercholesterolemii (1995, Scrip 20 (19):10).

Niacyna, lub kwas nikotynowy jest rozpuszczalnym w wodzie kompleksem witaminy B stosowanym jako uzupełnienie diety i czynnik przeciwhiperlipidowy. Niacyna obniża produkcję VLDL i skutecznie obniża LDL. Stosowana jest w powiązaniu z żywicami wiążącymi kwasy żółciowe. Niacyna może zwiększyć HDL, gdy jest stosowana w odpowiednich dawkach, jednakże jej użyteczność jest ograniczona przez poważne efekty uboczne jeśli zostanie zastosowana w takich dawkach.

PL 200 744 B1

Fibraty są klasą leków obniżających poziom lipidów stosowanych do leczenia różnych form hiperlipidemii (tj. podwyższonego poziomu trójglicerydów w surowicy), które mogą być również związane z hipercholesterolemią. Fibraty wydają się obniżać frakcje VLDL i nieznacznie podnosić HDL - jednakże wpływ tych środków na poziom cholesterolu w surowicy jest zmienny. W Stanach Zjednoczonych fibraty zostały zaaprobowane do użytku jako środki przeciwlipideniczne, ale nie uzyskały pozwolenia jako środki przeciwko hipercholesterolemii. Na przykład klofibrat (Atromid-S®, Wyeth-Ayerest Laboratories) jest środkiem przeciwlipidenicznym, który działa aby obniżyć (poprzez nieznany mechanizm) trójglicerydy poprzez redukcje frakcji VLDL. Chociaż cholesterol może być obniżony w niektórych subpopulacjach pacjentów, odpowiedź biochemiczna na lekarstwo jest zróżnicowana, i nie zawsze możliwe jest przewidzenie u którego z pacjentów wystąpią pozytywne efekty. Atromid-S® nie okazał się efektywny dla zapobiegania chorobie wieńcowej serca. Chemicznie i farmakologicznie pokrewne lekarstwo, gemfibrozyl (Lopid®, Parke-Davis) jest czynnikiem regulującym lipidy, który w sposób umiarkowany zmniejsza trójglicerydy i cholesterol VLDL w surowicy oraz cholesterol HDL - zarówno subfrakcje HDL2 i HDL3, jak i ApoA-I oraz A-II (tzn. frakcję AI/AII-HDL). Jednakże, odpowiedź lipidowa jest heterogenna, zwłaszcza wśród różnych populacji pacjentów. Co więcej, podczas gdy u mężczyzn pomiędzy 40-55 bez historii lub symptomów istniejącej choroby wieńcowej obserwowano zapobieganie chorobie wieńcowej serca, nie jest pewne w jakim stopniu te wyniki mogą być ekstrapolowane na inne populacje pacjentów (np. kobiet, starszych bądź młodszych mężczyzn). Nie obserwowano wręcz żadnej skuteczności u pacjentów z rozwiniętą chorobą wieńcową serca. Z użyciem fibratów wiążą się poważne efekty uboczne w tym złośliwe nowotwory (zwłaszcza nowotwory przewodu pokarmowego), choroby woreczka żółciowego i zwiększona śmiertelność niezwiązana z chorobą wieńcową. Leki te nie są przeznaczone do leczenia pacjentów z wysokim, LDL lub niskim HDL jako jedynym zaburzeniem lipidowym (Physicians Desk Reference, 1997, Medical Economics Co., Inc., Montvale, N.J.)

Doustna estrogenowa terapia zastępcza może być rozważana dla umiarkowanej hipercholesterolemii u kobiet po menopauzie. Jednak wzrostowi HDL może towarzyszyć wzrost trójglicerydów. Terapia estrogenowa jest oczywiście ograniczona do specyficznej populacji pacjentów (kobiet po menopauzie) i jest związana z poważnymi efektami ubocznymi w tym indukcją złośliwych nowotworów, choroby woreczka żółciowego, choroby zakrzepowej gruczolaka wątroby, zwiększonego ciśnienia krwi, nietolerancji glukozy, i hiperkalcemii.

A zatem istnieje potrzeba rozwinięcia bezpieczniejszych leków, które są skuteczne w obniżaniu cholesterolu w surowicy, zwiększają poziom HDL w surowicy, zapobiegają chorobie wieńcowej serca i/lub leczeniu istniejącej choroby.

2.4. ApoA-I jako cel

Żaden z obecnie dostępnych środków do bezpiecznego obniżenia cholesterolu nie podwyższa poziomu HDL i stymuluje RCT - większość wydaje się działać na szlak transportu cholesterolu, modulując pobór pokarmu, recyrkulację, syntezę cholesterolu i populację VLDL.

Podczas gdy potrzebne jest znalezienie środków, które stymulują wypływ i usuwanie cholesterolu, istnieje kilka potencjalnych celów w RCT - np. LCAT, HDL i różne składniki (ApoA-I, ApoA-II i fosfolipidy), PLTP i CETP - i nie wiadomo, który cel mógł by być najbardziej efektywny w osią ganiu pożądanych profili lipoprotein i efektów ochronnych. Zaburzenie jakiegokolwiek pojedynczego składnika szlaku RCT ostatecznie wpływa na skład populacji krążących liporotein i skuteczność RCT.

Kilka linii dowodów opartych na danych otrzymanych in vivo wskazuje na udział HDL i jego głównego składnika białkowego, ApoA-I, w zapobieganiu lejom miażdżycowym, i potencjalnie, regresji złogów - co czyni je atrakcyjnymi celami dla interwencji terapeutycznej. Po pierwsze, istnieje odwrócona korelacja pomiędzy stężeniem ApoA-I w surowicy (HDL) i rozwojem miażdżycy u człowieka (Gordon & Rifkind, 1989, N. Eng. J. Mod. 321:1311-1316; Gordon i wsp. 1989, Circulation 79:8-15). W istocie, specyficzne subpopulacje HDL został y powią zane ze zmniejszonym ryzykiem arteriosklerozy u ludzi (Miller, 1987, Amer. Heart 113:589-597; Cheung i wsp. 1991, Lipid Res. 32:383-394); Furchart & Allhaud, 1992, Clin.Chem. 38:79).

Po drugie, badania na zwierzętach potwierdzają ochronną rolę ApoA-I (HDL). Podawanie karmionym cholesterolem królikom ApoA-I lub HDL zmniejsza rozwój i postęp złogów (złogi tłuszczu) u karmionych cholesterolem królików. (Koizumi i wsp.1988, J. Lipid Res. 29:1405-1415; Badimon i wsp. 1989, Lab. Inwest. 60:455-461; Badimon i wsp.1990, J. Clin. Invest. 85:1234-1241). Jednak skuteczność różniła się w zależności od źródła HDL (Beitz i wsp. 1992, 30 Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47:149-152; Mezdour i wsp. 1995, Atherosclerosis 113:237-246). Po trzecie, bezpośrednie dowody na rolę ApoA-I zostały otrzymane z eksperymentów na transgenicznych

PL 200 744 B1 zwierzętach. Ekspresja ludzkiego genu ApoA-I przeniesionego do myszy genetycznie predysponowanych do indukowanej dietą miażdżycy chroniła przed rozwojem lezji aort (Rubin i wsp. 1991, Nature 353:265-267). Wykazano, że ApoA-I transgen powodował supresję miażdżycy tętnic u myszy pozbawionych ApoE i myszy transgenicznych Apo(a) (Paszty i wsp. 1994, J. Clin. Invest. 94:899-903; Plump i wsp. 1994, Proc. Natl. Acad. 5 Sci. USA 91:9607-9611, Lin i wsp. 1994, J. Lipid Res.35:2263-2266). Podobne wyniki zaobserwowano u transgenicznych królików produkujących ludzką ApoA-I (Duverger, 1996, Circulation 94:713-717; Duverger i wsp. 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16:1424-1429; Emmanuel i wsp.1997, 10 Artheriosclerosis 1035:144), i u transgenicznych szczurów gdzie podniesione poziomy ludzkiej ApoA-I chroniły przed miażdżycą tętnic i hamowały restenozę po angioplastyce balonowej (Burkey i wsp. 1992, Circulation, Supplement I, 86:1-472, Abstract No. 1876; Burkey i wsp. 1995, J. Lipid 15 Res. 36:1463-1473).

AI-HDL wydają się być bardziej wydajne w RCT niż frakcja AI/AII-HDL. Badania z myszami transgenicznymi dla ludzkiej ApoA-I lub ApoA-I oraz ApoA-II (AI/AII) wykazały, że skład białkowy HDL w sposób znaczący wpływa na jego rolę - AI-HDL jest bardziej przeciwmiażdżycowy niż AI/AII-HDL (Schultz i wsp.1993, Nature 365:762-764). Równolegle badania dotyczące myszy transgenicznych produkujących ludzki gen LCAT pokazują, ze umiarkowany wzrost aktywności LCAT znacząco zmienia poziomy lipoprotein cholesterolu i że LCAT ma znaczącą preferencję dla HDL zawierającego ApoA-I (Francone i wsp.1995, J. Clinic. Invest. 96:1440-1448; Beard i wsp.1997, Nature Medicine 3,7:744-749). Podczas gdy te wyniki potwierdzają znaczącą rolę ApoA-I w aktywowaniu LCAT i stymulacji RCT, dodatkowe badania pokazują bardziej skomplikowany scenariusz: główny komponent HDL, który moduluje wpływ komórkowego cholesterolu jest fosfolipidem (Fournier i wsp.1996, J. Lipid Res. 37:1704-1711).

W obliczu potencjalnej roli HDL, tj. zarówno ApoA-I i związanych z nim fosfolipidów, w ochronie przeciwko chorobie miażdżycowej, rozpoczęte zostały ludzkie badania kliniczne stosujące rekombinowaną ApoA-I, przerwane i najwyraźniej powtórnie rozpoczęte przez UCB Belgium (Pharma Projects, October 27, 1995; IMS R&D Focus, June 30, 1997; Drug Status Update, 1997, Atherosclerosis 2(6):261-265); patrz również M. Eriksson at Congress, The Role of HDL in Disease Prevention, Nov. 7-9, 1996, Fort Worth; Lacko & Miller, 1997, J. Lipid Res. 38:1267-1273; and W094/13819) oraz rozpoczęte i przerwane przez Bio-Tech (Pharmaprojects, April 7, 1989). Podjęte zostały również próby zastosowania ApoA-I i związanych z nim fosfolipidów w leczeniu szoku septycznego (Opal, Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis, IBCs 7th Annual International 10 Conference on Sepsis, April 28-30, 1997, Washington, D.C.;Gouni i wsp.1993, J. Lipid Res. 94:139-146; Levine W096/04916). Jednakże, istnieje wiele pułapek związanych z produkcją i zastosowaniem ApoA-I czyniących ją mniej niż idealnym środkiem; np. ApoA-I jest dużym białkiem, trudnym i kosztownym w produkcji; znaczące problemy wytworzenia i powielania muszą zostać pokonane z uwzglę dnieniem stabilności w trakcie transportu, dostarczania aktywnego produktu i czasu półtrwania in vivo.

W obliczu tych pułapek, podjęto próby przygotowania peptydów naśladujących ApoA-I. Ponieważ kluczowa aktywność ApoA-I została przypisana obecności licznych powtórzeń unikalnej cechy struktury drugorzędowej - amfipatycznej α-helisy klasy A (Segrest, 1974, FEBS Lett. 38:247-253), większość wysiłków zaprojektowania, peptydów, które naśladują aktywność ApoA-I skupiło się na zaprojektowaniu peptydów formujących amfipatyczną α-helisę klasy A.

Amfipatyczne α-helisy klasy A są unikalne w tym, że reszty aminokwasowe o pozytywnym ładunku są zgromadzone na powierzchniach hydrofobowo-hydrofilowych a reszty aminokwasowe o negatywnym ładunkach są zgromadzone w centrum powierzchni hydrofilowej. Negatywnie, co więcej, Klasa A β-helikalnych peptydów posiada kąt hydrofobowy mniej niż 180° (Segrest i wsp.PROTEINS, 1990; Structure, Function and Genetics 8:103-117). Początkowe strategie projektowania de novo naśladujących ApoA-I peptydów nie były oparte na pierwszorzędowych sekwencjach naturalnie występujących apolipoprotein ale raczej na włączeniu zarówno tych unikalnych cech helisy Klasy A do sekwencji analogów peptydowych jak i niektórych własności domen ApoA-I (patrz np. Davidson i wsp.1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13605-13610; Rogers i wsp.1997, Biochemistry 36:288-300; Lins i wsp.1993, Biochim. Biophys. Acta 5 biomembranes 1151:137-142; Ji and Jonas, 1995, J. Biol. Chem. 270:11290-11297; Collet i wsp.1997, Journal of Lipid Research, 38:634-644; Sparrow and Gotto, 1980, Ann. N.Y. Acad. Sci. 348:187-211; Sparrow and Gotto, 1982, CRC Crit. Rev. Biochem. 13:87-107; Sorci-Thomas i wsp.1993, J. Biol. 10 Chem. 268:21403-21409; Wang i wsp. 1996, Biochim. Biophys. Acta 174-184; Minnich i wsp.1992, J. Biol. Chem. 267:16553-16560;

PL 200 744 B1

Holvoet i wsp.1995, Biochemistry 34:13334-13342; Sorci-Thomas i wsp.1997, J. Biol. Chem. 272 (11): 7278-7284; and Frank i wsp.1997, Biochemistry 36:1798-1806).

W jednym z badań, Fukushima i wsp., zsyntetyzowali 22-aminokwasowy peptyd złożony całkowicie z reszt Glu, Lys i Leu ułożonych periodycznie tworzących amfipatyczną α-helisę z jednakowymi powierzchniami hydrofilowymi i hydrofobowymi (peptyd ELK) (Fukushima i wsp.1980, J. Biol. Chem. 255:10651-20 10657; Fukushima i wsp.1979, J. Amer. Chem. Soc. 101 (13):3703-3704). ELK peptyd posiada 41% homologii sekwencji z 198-219 fragmentem ApoA-I. Jak badano jakościową ultrafiltracją, chromatografie przepuszczalności żelowej i ciągłym dichroizmem, peptyd ELK efektywnie wiąże się fosfolipidami i naśladuje niektóre z fizycznych i chemicznych właściwości ApoA-I (Kaiser i wsp.1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1137-1140; Kaiser i wsp.1984, Science 223:249-255; Fukushiroa i wsp.1980, powyżej; Nakagawa i wsp.1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-30 7092). Yokoyama i wsp. wywnioskowali z takich badań że istotnym czynnikiem dla aktywacji LCAT jest jedynie obecność wystarczająco dużych struktur amfipatycznych (Yokoyama i wsp.1980, J. Biol. Chem. 255 (15): 7333-7339). Dimer tych 22-aminokwasowego peptydu okazał się później bardziej dokładnie naśladować ApoA-I niż monomer. Opierając się na tych wynikach założono, że 44-mer, który jest przerwany w połowie przez przełamujące helisę Gly lub Pro, stanowi minimalną domenę funkcjonalną ApoA-I (Nakagawa i wsp.1985, powyżej).

Inne badania dotyczyło modelu amfipatycznych peptydów zwanych peptydami LAP (Pownall i wsp., 1980, Proc. Natl. 5 Acad. Sci. USA 77(b):3154-3158; Sparrow i wsp. 1981, In. Peptides:Synthesis-Structure-Function, Roch and Gross, Eds., Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 253-256). Opierając się na badaniach wiązania lipidów z fragmentami natywnych apolipoprotein, zaprojektowano kilka peptydów LAP, oznaczonych LAP-16, LAP-20 and LAP-24 (zawierających odpowiednio, 16, 20 i 24 reszt aminokwasowych). Te modelowe peptydy amfipatyczne nie posiadają homologii z apolipoproteinami i były zaprojektowane tak aby mieć polarne powierzchnie zorganizowane w sposób nie podobny do domen helis amfipatycznych typu klasy A, związanych z apolipoproteinami. Z tych badań, autorzy wywnioskowali, że minimalna długość 20 reszt jest konieczna do przekazania zdolności do wiązania lipidów modelowym peptydom amfipatycznym.

Badania z mutantami LAP20 zawierającymi resztę proliny w różnych miejscach sekwencji wskazały na istnienie bezpośredniego związku pomiędzy wiązaniem lipidów i aktywacja LCAT, jednak potencjał helikalny samego peptydu nie prowadzi do aktywacji LCAT (Ponsin i wsp., 1986 J. Biol. Chem. 261(20):9202-9205). Co więcej, obecność łamiącej helisę Pro blisko środka peptydu redukowała jego powinowactwo do powierzchni fosfolipidów jak również jego zdolność do aktywacji LCAT. Podczas gdy pewne peptydy LAP miały zdolność do wiązania fosfolipidów (Sparrow i wsp., powyżej), istnieje kontrowersja co do stopnia w jakim peptydy LAP są helikalne w obecności lipidów (Buchko i wsp.1996, J. 30 Biol. Chem. 271 (6): 3039-3045; Zhong i wsp.1994, Peptide Research 7 (2):99-106).

Segrest i wsp., zsyntetyzowali peptydy złożone z od 18 do 24 reszt aminokwasowych, które nie mają homologii sekwencji z helisami ApoA-I (Kannelis i wsp.1980, 35 J. Biol. Chem. 255 (3): 11464-11472; Segrest i wsp.1983, J. Biol. Chem. 258:2290-2295). Sekwencje były specyficznie zaprojektowane aby naśladować amfipatyczne domeny helikalne klasy A wymiennych apolipoprotein w zakresie momentu hydrofobowego (Eisenberg i wsp.1982, Nature 299:371-374) i rozmieszczenia ładunku (Segrest i wsp.1990, Proteins 8:103-117; U.S. Patent No. 4,643,988).

Jeden 18-resztowy peptyd, 18A został zaprojektowany aby stanowić model klasy A α-helisy (Segrest i wsp.1990, powyżej). Badania z tymi peptydami i innymi peptydami posiadającymi odwrócone rozmieszczenie ładunku, jak peptyd 18A, stale wykazywały, że rozmieszczenie ładunku jest krytyczne dla aktywności; peptydy z odwróconym rozmieszczeniem ładunków wykazują zmniejszone powinowactwo do lipidów relatywne do 18A peptydów naśladujących klasę A i mniejsza zawartość helisy w obecności lipidów (Kanellis i wsp. 1980, J. Biol. Chem. 255:11464-11472; Anantharamaiah i wsp.1985, J. Biol. Chem. 260:10248-10255; Chung i wsp.1985, J. Biol. 15 Chem. 260:10256-10262; Epand i wsp.1987, J. Biol. Chem. 262:9389-9396; Anantharamaiah i wsp.1991, Adv. Exp. Med. Biol. 285:131-140).

Inne syntetyczne peptydy nie osiadające homologii sekwencji z apolipoproteinami, które zaproponowano z mniejszym powodzeniem dotyczą dimerów i trimerów peptydu 18A (Anatharamaiah i wsp.1986, Proteins of Biological Fluids 34:63-66), peptydów GALA i EALA (Subbarao i wsp.1988, Proteins: Structure, Function and Genetics 3:187-198), peptydów ID (Labour i wsp.1997, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 17:580-588) oraz peptydów 18AM4 (Brasseur i wsp.1993, Biochem. Biophys. Acta 1170:1-7).

Zaprojektorany został również peptyd koncensusowy zawierający 22 reszty aminokwasowe oparte na sekwencjach ludzkiej ApoA-I (Venkatachalapathi i wsp.1991, Mol. Conformation and Bio. Interactions

PL 200 744 B1

B:585-596). Sekwencja została skonstruowana przez identyfikację najbardziej dominującej reszty w każdej pozycji helis ApoA-I. Podobnie jak opisane powyżej peptydy, helisa tworzona przez ten peptyd ma reszty aminokwasowe o pozytywnym ładunku zebrane na powierzchni hydrofilowo:hydrofobowej, reszty aminokwasowe o negatywnym ładunku zebrane w centrum powierzchni hydrofilowej i kąt hydrofobowy mniejszy niż 180°. Podczas gdy dimer tego peptydu jest w jakiś sposób efektywny w aktywowaniu LCAT, monomer wykazywał słabe własności wiązania lipidów (Vekatachalapathi i wsp.1991, powyżej).

W oparciu głównie o badania in vitro z opisanymi powyż ej peptydami, pojawił się zestaw zasad do projektowania peptydów naśladujących funkcje ApoA-I. Uważa się, że amfipatyczna α-hlisa posiadająca reszty o pozytywnych ładunkach zebranych na powierzchni hydrofilowo-hydrofobowej i reszty o negatywnym ładunku zebrane w centrum powierzchni polarnej jest znacząco wymagana do powinowactwa do lipidów i aktywacji LCAT (Venkatachalapathi i wsp.1991, powyżej). Anantharamaiah i wsp. również wykazali, że reszta Glu o negatywnym ładunku w pozycji 13 konsensusowego 22-merowego peptydu, umiejscowionego wewnątrz hydrofobowej powierzchni α-helisy, odgrywa istotną rolę w aktywacji LCAT (Anantharamaiah i wsp.1991, powyżej). Co więcej, Brasseur wskazał, że kąt hydrofobowy (kąt pho) mniejszy niż 180° jest wymagany dla optymalnej stabilności kompleksu lipidowo-apolipoproteinowego, i również odpowiada za formowanie diskoidalnych cząstek posiadających peptydy wokół krawędzi dwuwarstwy lipidowej (Brasseur, 1991, J. Biol. Chem. 66 (24):16120-16127). Rosseneu i wsp., również wskazywali, że kąt hydrofobowy mniejszy niż 180° jest wymagany dla aktywności LCAT (W093/25581).

Jednakże, pomimo tych zasad do chwili obecnej nikt nie zaprojektował lub wyprodukował peptydu tak aktywnego jak ApoA-I, najlepszy miał mniej niż 40% aktywności ApoA-I mierzonej opisanym tutaj testem aktywacji LCAT. Żaden z mimetyków opisanych w literaturze nie okazał się skutecznym lekarstwem.

W obliczu powyższego, istnieje potrzeba rozwoju stabilnego agonisty ApoA-I, który naśladuje aktywność ApoA-I i jest relatywnie prosty i efektywny w kosztach produkcji. Jednakże, zasady projektowania skutecznych naśladowców ApoA-I nie były rozwikłane a zasady wynalezienia molekuł organicznych o funkcji ApoA-I są nieznane.

3. Podsumowanie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest agonista ApoA-I który stanowi:

(i) 18-resztowy peptyd lub analog peptydowy tworzący amfipatyczną α-helisę w obecności lipidów i posiadający wzór strukturalny (I):

^Z1^-X1^-X2^-X3^-X4^-X5^-X6^-X7^-X8^-X9^-X10^-X11^-X12^-X13^-X14^-X15^-X16^-X17^-X18^-Z2 w którym:

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Gln (Q) lub D-Pro (p);

X2 oznacza aminokwas alifatyczny;

X3 oznacza Leu (L);

X4 oznacza aminokwas kwaśny;

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza aminokwas zasadowy;

X8 oznacza aminokwas kwaśny;

X9 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

X10 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

XII oznacza aminokwas kwaśny lub Asn (N);

X12 oznacza aminokwas kwaśny;

X13 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Phe (F);

X14 oznacza aminokwas zasadowy lub Leu (L);

X15 oznacza Gln (Q) lub Asn (N);

X16 oznacza aminokwas zasadowy;

X17 oznacza Leu (L);

X18 oznacza aminokwas zasadowy;

Z1 oznacza H2N- lub RC(O)NH-;

Z2 oznacza -C(O)NRR, lub -C(O)OR, -C(O)OH lub ich sole;

każdy R niezależnie oznacza -H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinil, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkaryl, 5-20 członowy heteroaryl lub 6-26 członowy heteroaryl lub 1-4 resztowy analog peptydowy;

PL 200 744 B1 każdy - pomiędzy resztami Xn niezależnie oznacza wiązania amidowe, podstawione wiązanie amidowe, izoster amidu lub amidomimetyk; i (ii) zmienioną postać wzoru strukturalnego (I) w którym co najmniej jedna z reszt X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16, X17 lub X18 jest konserwatywnie podstwiona inną resztą.

Korzystnie agonista ApoA-I według wykazuje co najmniej około 38% zdolności do aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I.

W korzystnym wykonaniu agonista ApoA-I wedł ug wynalazku, we wzorze (I) mo ż e posiadać następujące podstawniki:

X1 oznacza Pro (P), D-Pro (p), Gly (G), Asn (N) lub Ala (A);

X2 oznacza Ala (A), Leu (L) lub Val (V);

X3 oznacza Leu (L);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X9 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

X10 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

X13 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Phe (F);

X17 oznacza Leu (L); i co najmniej jedna z X4, X7, X8, X11, X12, X14, X15, X16 i X18 jest konserwatywnie odstawiona inna resztą.

Także korzystnie agonista ApoA-I według wynalazku we wzorze (I) może posiadać następujące podstawniki:

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X7 oznacza Arg (R), Lys (K) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X11 oznacza Asn (N) lub Glu (E);

X12 oznacza Glu (E);

X14 oznacza Lys (K), Arg (R) lub Orn;

X15 oznacza Gln (Q) lub Asn (N);

X16 oznacza Lys (K), Arg (R) lub Orn;

X18 oznacza His (H), Lys (K) lub Arg (R); i co najmniej jedna z X1, X2, X3, X5, X6, X9, X10, X13 i X17, jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

Także korzystnie agonista ApoA-I według wynalazku charakteryzuje się tym, że we wzorze (i) X3 oznacza Leu (L), X6 oznacza Phe (F), X9 oznacza Leu (L) lub Trp (W), X10 oznacza (L) lub Trp (W) i co najmniej jedna z X1, X2, X5, X13 oraz X17 jest konserwatywnie podstawiona inną resztą .

Podstawiona reszta może być także zklasyfikowana wewnątrz tej samej subkategorii co podstawiona reszta.

Jeden helikalny skręt peptydu lub analogu peptydowego według wynalazku może być korzystnie skrócony przez delecję.

Agonista ApoA-I według wynalazku korzystnie stanowi 18-resztowy peptyd lub analog peptydu o wzorze strukturalnym (I). Korzystnie agonista ApoA-I wedł ug wynalazku o wzorze strukturalnym (I) w którym - pomiędzy resztami oznacza -C(O)NH-; Z1 oznacza H2N-; Z2 oznacza -C(O)OH lub ich sole. Jeszcze bardziej korzystnie, agonista ApoA-I według wynalazku w powołanym wzorze w którym:

X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N) lub D-Pro (p),

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L);

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X9 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

X10 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

X11 oznacza Glu (E) lub Asn (N);

X12 oznacza Glu (E);

PL 200 744 B1

X13 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Phe (F);

X14 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn;

X15 oznacza Gln (Q) lub Asn (N);

X16 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn;

X17 oznacza Leu (L); i

X18 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn.

Także korzystnie agonista ApoA-I według wynalazku może być wybrany z grupy obejmującej:

peptyd 191 peptyd 192 peptyd 193 peptyd 194 peptyd 195 peptyd 196 peptyd 197 peptyd 198 peptyd 199 peptyd 200 peptyd 201 peptyd 202 peptyd 203 peptyd 204 peptyd 205 peptyd 206 peptyd 207 peptyd 208 peptyd 209 peptyd 210 peptyd 211 peptyd 212 peptyd 213 peptyd 214 peptyd 215 peptyd 229 peptyd 230 peptyd 231

PVLDLLRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:191) PVLDLFKELLEELKQKLK (SEQ ID NO:192) PVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:193) PVLELFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:194) PVLELFKELLEELKQKLK (SEQ ID NO:195) PVLDLFRELLEELKNKLK (SEQ ID NO:196) PLLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:197) GVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:198) PVLDLFRELWEELKQKLK (SEQ ID NO:199) NVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:200) PLLDLFKELLEELKQKLK (SEQ ID NO:201) PALELFKDLLEELRQKLR (SEQ ID NO:202) AVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:203) PVLDFFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:204) PVLDLFREWLEELKQKLK (SEQ ID NO:205) PLLELLKELLEELKQKLK (SEQ ID NO:206) PVLELLKELLEELKQKLK (SEQ ID NO:207) PALELFKDLLEELRQRLK (SEQ ID NO:208) PVLDLFRELLNELLQKLK (SEQ ID NO:209) PVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:210) PVLDLFRELLEELOQOLO (SEQ ID NO:211) PVLDLFOELLEELOQOLK (SEQ ID NO:212) PALELFKDLLEEFRQRLK (SEQ ID NO.213) pVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO: 214) PVLDLFRELLEEWKQKLK (SEQ ID NO:215) PVLELFERLLEDLQKKLK (SEQ ID NO: 229) PVLDLFRELLEKLEQKLK (SEQ ID NO:230) PLLELFKELLEELKQKLK (SEQ ID NO: 231) w postaciach zarówno N- i/lub C-końcowo blokowanych jak i nieblokowanych.

Przedmiotem wynalazku jest także multimeryczny agonista ApoA-I wykazyjący co najmniej 38% zdolności do aktywacji LCAT w porównaniu do ludzkiej ApoA-I, o wzorze strukturalnym (II):

(II) HH[LLm-HH]nLLm-HH lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól, w którym każde m niezależnie oznacza liczbę naturalną od 0 do 1; n liczbę naturalną od 0 do 10; każde HH niezależnie oznacza peptyd lub analog peptydu jak zdefiniowano w zastrz. 1; każde LL niezależnie oznacza bifunkcjonalny łącznik; i każde -- niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.

Przedmiotem wynalazku jest również multimeryczny aganista ApoA-I wykazujący co najmniej 38% zadolności do aktywacji LCAT w porównaniu do ludzkiej ApoA-I o wzorze strukturalnym (III):

(III) X - Nya - X(ya-1) (Nyb - X(yb-1))p lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w którym każdy X niezależnie oznacza HH[LLm-HH]nLLm-HH, każde HH niezależnie oznacza peptyd rdzenia o wzorze strukturalnym (I) lub jego analog lub jej postać zmutowaną, obciętą, wewnętrznie skróconą przez delecję lub rozszerzoną; każde LL oznacza niezależnie bifunkcjonalny łącznik; każde m oznacza niezależnie liczbę naturalną od 0 do 1; każde n oznacza liczbę naturalną od 0 do 8; Nya i Nyb każda są niezależnymi multifunkcjonalnymi resztami łącznikowymi ya i yb stanowią liczbę funkcjonalnych grup na Nya i Nyb, odpowiednio, a każdy ya i yb oznacza niezależnie liczbę naturalną od 3 do 8; p jest liczbą naturalną od 0 do 7; i każda - niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjnie.

PL 200 744 B1

Przedmiotem wynalazku jest każdy multimeryczny agonista ApoA-I wykazujący co najmniej 38% zdolności do aktywacji LCAT w porównaniu do ludzkiej ApoA-I, o wzorze strukturalnym (IV) lub (V).

lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól, w którym:

każde X niezależnie oznacza HH[LLm-HH]nLLm-HH;

każde HH niezależnie oznacza peptyd lub jego analog jak zdefiniowano powyżej, każde LL oznacza niezależnie bifunkcjonalny łącznik; każde n oznacza niezależnie liczbę naturalną od 0 do 1; każde m oznacza liczbę naturalną od 0 do 8; R1 oznacza -OR lub -NRR; i każde R oznacza niezależnie -H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinil, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkaryl, 5-20 członowy heteroaryl lub 6-26 członowym alkheteroaryl.

Korzystna postać multimerycznych agonistów ApoA-I według wynalazku to taka, w którym bifunkcjonalny łącznik jest odszczepialny. Korzystnie n może w nich oznaczać 0 i m może oznaczać 0, a każ de HH niezależ nie oznacza peptyd rdzenia o wzorze strukturalnym (I) lub jego analog lub jego postać zmutowaną, obciętą, wewnętrznie skróconą przez delecję lub rozszerzoną, w którym każde HH niezależnie oznacza peptyd każde LL oznacza niezależnie bifunkcjonalny łącznik; każde n oznacza niezależnie liczbę naturalną od 0 do 1; każde m oznacza liczbę naturalną od 0 do 8;

R1 oznacza -OR lub -NRR; i każde R oznacza niezależnie - H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinil, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkaryl, 5-20 członowy heteroaryl lub 6-26 członowy alkheteroaryl. Korzystnie multimeryczny agonista ApoA-I to taki, w którym każde HH niezależnie oznacza peptyd wybrany z grupy peptyd 191

PVLDLLRELLEELKQKLK(SEQ ID NO:191) peptyd 192 PVLDLFKELLEELKQKLK (SEQ ID NO:192) (SEQ ID NO:193) (SEQ ID NO:194) (SEQ ID NO:195) (SEQ ID NO:196) (SEQ ID NO:197) (SEQ ID NO:198) peptyd 193 PVLDLFRELLEELKQKLK peptyd 194 PVLELFRELLEELKQKLK peptyd 195 PVLELFKELLEELKQKLK peptyd 196 PVLDLFRELLEELKNKLK peptyd 197 PLLDLFRELLEELKQKLK peptyd 198 GVLDLFRELLEELKQKLK peptyd 199 PVLDLFRELWEELKQKLK (SEQ ID NO:199) peptyd 200 NVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:200) peptyd 201 PLLDLFKELLEELKQKLK peptyd 202 PALELFKDLLEELRQKLR peptyd 203 AVLDLFRELLEELKQKLK peptyd 204 PVLDFFRELLEELKQKLK peptyd 205 PVLDLFREWLEELKQKLK (SEQ ID NO:205) peptyd 206 PLLELLKELLEELKQKLK (SEQ ID NO: 206) peptyd 207 PVLELLKELLEELKQKLK peptyd 208 PALELFKDLLEELRQRLK peptyd 209 PVLDLFRELLNELLQKLK (SEQ ID NO: 201) (SEQ ID NO:202) (SEQ ID NO:203) (SEQ ID NO:204) (SEQ ID NO:207) (SEQ ID NO:208) (SEQ ID NO:209)

PL 200 744 B1 (SEQ ID NO:210) (SEQ ID NO:211) (SEQ ID NO:212) (SEQ ID NO:213) (SEQ ID NO: 214) peptyd 210 PVLDLFRELLEELKQKLK peptyd 211 PVLDLFRELLEELOQOLO peptyd 212 PVLDLFOELLEELOQOLK peptyd 213 PALELFKDLLEEFRQRLK peptyd 214 pVLDLFRELLEELKQKLK peptyd 215 PVLDLFRELLEEWKQKLK (SEQ ID NO:215) peptyd 229 PVLELFERLLEDLQKKLK (SEQ ID NO:229) peptyd 230 PVLDLFRELLEKLEQKLK (SEQ ID NO:230) peptyd 231 PLLELFKELLEELKQKLK (SEQ ID NO:231) w postaciach zarówno N- i/lub C-końcowo blokowanych jak i nieblokowanych.

Przedmiotem wynalazku jest również kompleks agonista ApoA-I-lipid składający się z agonisty ApoA-I i lipidu, przy czym agonista ApoA-I jest peptydem lub analogiem peptydu jak zdefiniowano lub multimerycznym agonistą ApoA-I w odmianach jak zdefiniowano poprzednio. Korzystnie w kompleksie agonista ApoA-I-lipid to taki, w którym agonista ApoA-I jest multimerycznym agonistą o wzorze strukturalnym (II) lub w którym agonista ApoA-I jest peptydem lub analogiem peptydu o wzorze (I) w którym - pomiędzy resztami oznacza -C(O)NH-; Z1 oznacza H2N-; Z2 oznacza -C(O)OH lub ich sole, ewentualnie także korzystnie we wzorze tym

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N) lub D-Pro (p),

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L);

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X9 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

X10 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

XII oznacza Glu (E) lub Asn (N);

X12 oznacza Glu (E);

X13 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Phe (F);

X14 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn;

X15 oznacza Gln (Q) lub Asn (N);

X16 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn;

X17 oznacza Leu (L); i

X18 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn.

Korzystnie w kompleksie według wynalazku bifunkcjonalny łącznik może być odszczepialny, a lipid może być singomieliną. Kompleks według wynalazku może być w postaci zliofilizowanego proszku lub w postaci roztworu.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera agonistę ApoA-I i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, wypełniacz lub rozpuszczalnik, przy czym agonista ApoA-I jest peptydem/ami lub analogiem peptydu/ów jak zdefiniowano poprzednio, która korzystnie może być w postaci kompleksu lipid-agonista ApoA-I, i wspomniany kompleks składa się z agonisty ApoA-I i lipidu.

Kompleks agonista ApoA-I-lipid korzystnie sporządzany może być w postaci zliofilizowanego proszku.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie agonistów ApoA-I według wynalazku do sporządzania leku do leczenia pacjentów, korzystnie ludzi cierpiących na schorzenia związane z dislipidemią, który to lek może być w postaci kompozycji farmaceutycznej, składającej się z agonisty ApoA-I i farmaceutycznie dopuszczanego nośnika, wypełniacza lub rozpuszczalnika, a agonista ApoA-I jest w postaci kompleksu agonista ApoA-I-lipid, i składa się z agonisty ApoA-I i lipidu. Choroba związana z dyslipidernią oznacza hipercholesterolemię, ewentualnie oznacza chorobę naczyniową, ewentualnie oznacza miażdżycę, ewentualnie oznacza restenozę. Choroba związana z dyslipidemią może także oznaczać niedobór HDL lub ApoA-I, ewentualnie hipertriglicerydemię, ewentualnie onacza zespół metaboliczny. Ewentualnie agonistów ApoA-I według wynalazku można też stosować do sporządzania leku do leczenia pacjentów cierpiących na szok septyczny.

PL 200 744 B1

Agoniści ApoA-I to związki zdolne do tworzenia amfipatycznych α-helis, które naśladują aktywność ApoA-I ze specyficzną aktywnością, tj. jednostkami aktywności (aktywacja LCAT/jednostkę masy), podobnymi lub przekraczającymi nawet aktywność natywnej cząsteczki. W szczególności, agoniści ApoA-I wynalazku, są peptydami lub analogami peptydów, które: tworzą amfipatyczne helisy (w obecności lipidów), wiążą lipidy, tworzą kompleksy przypominające pre-β i HDL, aktywują LCAT, zwiększają stężenie HDL w surowicy i sprzyjają wypływowi cholesterolu.

Wynalazek jest częściowo oparty na projekcie zgłaszających i odkryciu peptydów naśladujących funkcję ApoA-I. Peptydy wynalazku były zaprojektowane w oparciu o przypuszczalną strukturę helikalną i amfipatyczne właściwości 22-aminokwasowej sekwencji najwyższej zgodności otrzymanej z helikalnych powtórzeń ApoA-I. Zadziwiające jest, że peptydy według wynalazku posiadają specyficzną aktywność znacznie większą od tej podawanej w literaturze dla peptydów otrzymanych z ApoA-I. Istotnie, w niektórych wykonaniach wynalazku aktywność ApoA-I zbliża się do 100% aktywności natywnej ApoA-I, podczas gdy opisani tutaj superagoniści przekraczają aktywność ApoA-I.

Jeden aspekt wynalazku jest również oparty, częściowo, na odkryciu Zgłaszających, że reszty aminokwasowe 14-17 z 22-merów o najwyższej zgodności Segresta mogą być wydeletowane bez utraty aktywności LCAT. W niektórych przypadkach, delecja reszt aminokwasowych zwiększa aktywność LCAT. W innym aspekcie wynalazku, inne reszty sekwencji najwyższej zgodności mogą być również wydeletowane ze zwiększeniem aktywności. Na dodatek, w niektórych wykonaniach delecje mogą być stosowane w połączeniu ze zmianą reszt aminokwasowych. W niektórych korzystnych wykonaniach, delecja 4 reszt z 22-merowego peptydu Segresta o najwyższej zgodności jest stosowana w połączeniu ze zmianami do hydrofobowej leucyny w resztach 5, 9 i 13.

Wynalazek jest zilustrowany w przykładach opisujących budowę, preparatykę i użycie poszczególnych amfipatycznych peptydów, które tworzą helisy (w obecności lipidów), wiążą lipidy, tworzą kompleksy i zwiększają aktywność LCAT. W oparciu o strukturę i aktywność podanych wykonań, zgłaszający opracował zestaw reguł, które mogą być użyte do zaprojektowania zmienionych lub zmutowanych form, które również znajdują się w zakresie wynalazku.

Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych zawierających jako aktywny składnik agonistów ApoA-I (zarówno jako peptydy i lipidy związane z peptydami) jak również ich zastosowania do leczenia chorób związanych z dyslipoproteinemią (np. chorobą sercowo-naczyniową, miażdżycą, zespołem metabolicznym), restenozą lub endotoksemią (np. wstrząsem septycznym).

l. Skróty

Jak zastosowano tutaj, skróty dla genetycznie kodowanych L-enancjomerów aminokwasów są konwencjonalne i następujące:

Aminokwas	Symbol jednoliterowy	Popularny skrót
1	2	3
Alanina	A	Ala
Arginina	R	Arg
Asparagina	N	Asn
Asparaginian	D	Asp
Cysteina	C	Cys
Glutamina	Q	Gln
Glutaminian	E	Glu
Glicyna	G	Gly
Histydyna	H	His
Isoleucyna	I	He
Leucyna	L	Leu
Lizyna	K	Lys

PL 200 744 B1 cd. tabeli

1	2	3
Metionina	N	Met
Fenyloalanina	F	Phe
Proilina	P	Pro
Seryna	S	Ser
Treonina	T	Thr
Tryptofan	W	Trp
Tyrozyna	y	Tyr
Valina	V	Val

Skróty stosowane do D-enancjomerów są odpowiednimi małymi literami dla symboli jednoliterowych. Np. R oznacza L-argininę i r oznacza D-argininę.

3.2. Definicje

Jak zastosowano tutaj, następujące terminy będą miały następujące znaczenie:

Alkil odnosi się do nasyconych, rozgałęzionych, prostych łańcuchów lub cyklicznych rodników wodorowęglowych. Typowe grupy alkilowe dotyczą ale nie ograniczają się do metylowej, etylowej, propylowej, izopropylowej, butylowej, izobutylowej, t-butylowej, pentylowej, izopentylowej, heksylowej, i tym podobnych. W korzystnych wykonaniach, grupy alkilowe są (C1-C6) alkilowe.

Alkenyl odnosi się do nienasyconego rozgałęzionego, prostego łańcucha lub cyklicznej worowęglowej reszty posiadającej przynajmniej jedno podwójne wiązanie węglowo-węglowe. Reszta może być zarówno w konformacji cis jak i trans wokół wiązania (ń) podwójnego (nych). Typowe grupy alkenylowe obejmują, ale nie są ograniczone do etenylowej, propenylowej, izopropenylowej, butenylowej, izobutenylowej, tert-butenylowej, pentenylowej, heksenylowej i tym podobnych. W korzystnych wykonaniach, grupą alkenylową jest (C1-C6) alkenyl.

Alkinyl odnosi się do nienasyconego rozgałęzionego, prostego łańcucha lub cyklicznej worowęglowej reszty mającej co najmniej jedno potrójne wiązanie węglowe. Typowe grupy alkinylowe dotyczą, ale nie są ograniczone do etynylowej, propynylowej, butynylowej, i sobutynylowej, pentenylowej, heksynylowej i tym podobnych. W korzystnych wykonaniach, grupą alkynylową jest (C1-C6) alkinyl.

Aryl odnosi się do nienasyconej cyklicznej reszty wodorowęglowej posiadającej połączony π-elektronowy system. Typowe grupy arylowe obejmują ale nie są ograniczone do penta-2,4-dienowej, fenylowej, naftyłowej, antracylowej, azulenowej, chrysenylowej, koronenylowej, fluoroantenylowej, indacenylowej, idenylowej, owalenylowej, perylenylowej, fenalenylowej, fenantrenylowej, picenylowej, pleiadenylowej, pyrenylowej, pyrantenylowej, rubicenylowej i tym podobnych. W korzystnych wykonaniach, grupą arylową jest (C5-C20) aryl, a szczególnie korzystny jest (C5-C10) aryl.

Alkaryl odnosi się do prostołańcuchowej grupy alkilowej, alkenylowej lub alkinylowej gdzie jeden z atomów wodoru związany z końcowym węglem jest zastąpiony przez resztę arylową. Typowe grupy alkarylowe obejmują ale nie są ograniczone do benzylowej, benzylidenowej, benzenobenzylowej, naftenobenzylowej i temu podobnych. W korzystnych wykonaniach, grupą alkarylową jest (C5-C26) alkaryl, tj. alkilową lub alkinylową resztą grupy alkarylowej jest (C1-C6) a resztą arylową jest (C5-C20). W szczególnie korzystnych wykonaniach, grupa alkarylowa jest (C6-C13) alkarylem, tj. reszta alkilowa, alkenylowa lub alkinylowa grupy alkarylowej jest (C1-C3), a resztą arylową jest (C5-C10).

Heteroaryl dotyczy reszt arylowych w których jeden lub więcej atomów węgla jest podstawiony innym atomem, takim jak N, P, O, S, As, Se, Si, Te, itd. Typowe grupy heteroarylowe-obejmują, choć nie ograniczają się do akrydarsyny, akrydyny, arsantrydyny, arsindolu, karbazolu, 3-karboliny, chromenu, cinnolinu, furanu, imidazolu, indazolu, indolu, indolizinu, izoarsindolu, izoarsinolinu, izobenzofuranu, izochromenu, izoindolu, isofosfoindolu, izofosfinolinu, izokwinolinu, isotiazolu, isoksazolu, naftyridyny, perimidyny, fenantrydyny, fenantroliny, fenazyny, fosfoindolu, fosfinoliny, ftalazyny, pterydyny, puryny, pyranu, pyrazyny, pyrazolu, pyridazyny, pyrydyny, pyrimidyny, pyrrolu, pyrrolizyny, kwinazoliny, kwinoliny, kwinolizyny, kwinoksaliny, selenofenu, tellurofenu, tiofenu i ksantenu. W korzystnych

PL 200 744 B1 wykonaniach, heteroarylową grupą jest 5-20 częściowy heteroaryl, ze szczególnie korzystnym 5-10 członowym arylem.

Alkheteroaryl odnosi się do prosto-łańcuchowej grupy alkilowej, alkenylowej lub alkinylowej gdzie jeden z atomów wodoru związany z końcowym atomem węgla jest zastępywany resztą heteroarylową. W korzystnych wykonaniach, alkheteroarylową grupą jest 6-26 członowy alkheteroaryl, tj. alkilową, alkenylową lub alkinylową resztą alkheteroarylu jest (C1-C6) a heteroaryl jest 5-20 członowym heteroarylem. W szczególnie korzystnym wykonaniu alkheteroaryl jest 6-13 członowym alkheteroarylem, tj. reszty alkilowa, alkenylowa lub alkinylowa jest 5-10 członowym heteroarylem.

Podstawiony Alkil, alkenyl, alkinyl, aryl, alkaryl, heteroaryl lub alkheteroaryl odnosi się do grupy alkilowej, alkenylowej, alkinylowej, arylowej, alkarylowej, heteroarylowej lub alkheteroarylowej, w której jeden lub wię cej atomów wodoru jest podstawiony innym podstawnikiem. Korzystne podstawniki dotyczą -OR, -SR, -NRR, -NO2, -CN, halogen, -C(O)R, -C(O)OR and -C(O)NR gdzie każdy R jest niezależnie wodorem, alkilem, alkinylem, arylem, alkarylem, heteroarylem lub alkheteroarylem.

4. Krótki opis rysunków.

Figura 1A jest schematem helikalnego koła Schiffer-Edmundsona wyidealizowanej amfipatycznej α-helisy, w którym otwarte kółka reprezentują hydrofitowe reszty aminokwasowe a zacienione kółka reprezentują hydrofobowe reszty aminokwasowe.

Figura 1B jest schematem helikalnej sieci wyidealizowanej amfipatycznej helisy z rys fig. 1A.

Figura 1C jest helikalnym cylindrycznym schematem wyidealizowanej amfipatycznej helisy z fig. 1A.

Figura 2A jest schematem helikalnego koła Schiffer-Edmundsona peptydowego rdzenia struktury (I) ilustrującym amfipatyczność helisy (otwarte kółka reprezentują hydrofilowe reszty aminokwasowe, zacienione kółka reprezentują hydrofobowe reszty aminokwasowe i częściowo zacienione kółka reprezentują zarówno reszty hydrofobowe jak i hydrofilowe).

Figura 2B jest schematem helikalnej sieci peptydowego rdzenia struktury (I) ilustrującym hydrofobową powierzchnię helisy.

Figura 2C jest schematem helikalnej sieci peptydowego rdzenia struktury (I) ilustrującym hydrofilową powierzchnię helisy.

Figura 3A jest schematem helikalnej sieci ilustrującym hydrofilową powierzchnię Peptydu 18A

Segresta (DWLKAFYDKVAEKLKEAF; SEQ ID NO:244).

Figura 3B jest schematem helikalnej sieci ilustrującym hydrofilową powierzchnię Peptydu 210 (PVLDLFRELLEELKQKLK; SEQ ID NO:210).

Figura 3C jest schematem helikalnej sieci ilustrującym hydrofilową powierzchnię 22-merowego koncensusowego peptydu Segresta (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO:75).

Figura 4A jest schematem helikalnej sieci ilustrującym hydrofobową powierzchnię Peptydu 18A

Segresta (SEQ ID NO:244).

Figura 4B jest schematem helikalnej sieci ilustrującym hydrofobową powierzchnię Peptydu 210 (SEQ ID NO:210).

Figura 4C jest schematem helikalnej sieci hydrofobowej powierzchni 22-merowego koncensusowego peptydu Segresta (SEQ ID NO:75).

Figura 5A jest schematem helikalnego koła Schiffer-Edmundsona Peptydu 18A Segresta (SEQ ID NO:244).

Figura 5B jest schematem helikalnego koła Schiffer-Edmundsona przykładowego peptydu rdzeniowego 210 (SEQ ID NO:210).

Figura 6A ilustruje rozgałęzioną trzeciorzędową sieć według wynalazku.

Figura 6B. ilustruje rozgałęzioną czwartorzędową sieć według wynalazku.

Figura 6C ilustruje rozgałęzioną sieć mieszanego rzędu według wynalazku.

Figura 6D ilustruje przykładowe rozgałęzione sieci typu Lys-tree według wynalazku.

Figura 7A jest grafem ilustrującym różnice pomiędzy obserwowanymi chemicznymi przesunięciami Ha a tabulowaną losową spiralą przesunięć chemicznych Ha dla peptydu 210 (SEQ ID NO:210) i 22-merowego peptydu wysokiej zgodności Segresta (SEQ ID NO:75).

Figura 7B jest grafem ilustrującym różnice pomiędzy obserwowanymi przeniesieniami chemicznymi protonów amidowych a tabulowaną losową spiralą przesunięć chemicznych protonów amidowych dla peptydu 210 (SEQ ID NO:210) i 22-merowego peptydu najwyższej zgodności Segresta (SEQ ID NO:75).

Figura 8A jest rysunkiem przedstawiającym rożne stadia agregacji i kompleksów peptydowolipidowych, które mogą być otrzymane z agonistami ApoA-I wynalazku. Na lewo: Proces multimeryza16

PL 200 744 B1 cji peptydów powstający z interakcji kilku helis peptydowych i prowadzący do tworzenia oligomerów w warunkach określonego stężenia peptydu, pH i siły jonowej. Środek: oddziaływanie peptydów (w którymkolwiek ze stanów agregacji) z lipidowymi całościami (takimi jak SUV) prowadzi do reorganizacji peptydów. Na prawo: Poprzez zmianę stosunku molowego lipidy:peptydy można otrzymać różne typy kompleksów peptydowo-lipidowych, od peptydowo-lipidowych komicelli przy niskim stosunku lipidowo-białkowym przez cząstki dyskoidalne do ostatecznie dużych multilamellarnych kompleksów przy wzrastających stosunkach lipidowo-peptydowych.

Figura 8B ilustruje ogólnie akceptowany model diskowych peptydowo-lipidowych kompleksów powstających w ograniczonym zakresie stosunków lipidowo:peptydowych. Każdy peptyd otaczający krawędź dysku jest w bliskim kontakcie ze swoimi dwoma najbliższymi sąsiadami.

5. Szczegółowy opis wynalazku

Agoniści ApoA-I według wynalazku naśladują funkcje i aktywność ApoA-I. Tworzą oni amfipatyczne helisy (w obecności lipidów), wiążą lipidy, tworzą kompleksy przypominające pre-β i HDL, aktywują LCAT, zwiększają stężenie HDL w surowicy i sprzyjają wypływowi cholesterolu. Biologiczna funkcja peptydów koreluje z ich strukturą helikalną, lub przemianą do struktury helikalnej w obecności lipidów.

Agoniści ApoA-I według wynalazku mogą być przygotowani w formie stabilnej całości lub jednorazowych dawek, jako np., produkty liofilizowane, które mogą być rozpuszczone przed użyciem in vivo czy reformułowane. Wynalazek dotyczy formuł farmacetycznych i sposobu użycia tych preparatów w leczeniu hiperlipidemii, hipercholesterolemii, choroby wieńcowej serca, miażdżycy i w innych schorzeniach takich jak endotoksemia powodująca wstrząs septyczny.

Wynalazek został zilustrowany roboczymi przykładami, które demonstrują, że agoniści wynalazku ApoA-I są niezwykle efektywni w aktywacji LCAT i w ten sposób sprzyjają RCT. Zastosowanie agonistów wynalazku ApoA-I in vivo u zwierząt spowodowało wzrost stężenia HDL w surowicy.

Wynalazek jest przedstawiony poniżej z większymi szczegółami, w poniższych podrozdziałach, które opisują: skład i strukturę agonistycznych peptydów ApoA-I, charakterystykę strukturalną i funkcjonalną, sposób przygotowania całości i składów jednostkowych; zastosowane metody.

5.1 Struktura i funkcja peptydów

Agoniści wynalazku ApoA-I są głównie peptydami lub ich analogami, zdolnymi do formowania amfipatycznej α-helisy w obecności lipidów i naśladowania aktywności ApoA-I. Agoniści mają jako ich główną cechę rdzeń peptydu zbudowany z 15 do 22 reszt aminokwasowych, a korzystnie z 18 reszt aminokwasowych, lub ich analogów, w których co najmniej jedno wiązanie amidowe w peptydzie zastąpione jest podstawionym amidem, izosterem amidu lub mimetykiem amidu.

Agoniści ApoA-I według wynalazku są oparci, częściowo, na szczególnym odkryciu Zgłaszających, że zmiany i lub delecje pewnych reszt aminokwasów w pierwotnej 22-merowej sekwencji koncensusowej Venkatachalapathi i wsp., 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B: 585-596 (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO. •75; tutaj i dalej, uważa się, że 22-mer najwyższej zgodności Segresta lub 22-mer o najwyższej zgodności jest niezbędny dla aktywności syntetycznych peptydów, które wykazują lub przekraczają aktyność natywnej ApoA-I. W jednym z aspektów wynalazku, cztery reszty 22-meru o najwyższej zgodności, reszty 14-27, są deletowane do utworzenia 18-merów zdolnych do aktywacji LCAT. W dodatkowych wykonaniach, deletowane są cztery inne reszty. W niektórych wykonaniach, 3 naładowane reszty aminokwąsowe, które uważane są za niezbędne dla aktywacji (Glu-5, Lys-9 i Glu-13) są zastąpione resztami hyrofobowymi takimi jak Leu.

Chociaż wynalazek nie jest oparty na jakiejś szczególnej teorii, uważa się, że helisa tworzona przez agonistów ApoA-I według wynalazku bliżej imituje strukturalne i funkcjonalne właściwości amfipatycznych regionów helikalnych natywnego ApoA-I, które są ważne dla wpływu na wiązanie lipidów, wypływ cholesterolu i aktywację LCAT niż α-helisa tworzona przez peptydy imitujące ApoA-I opisane w literaturze, w ten sposób dając peptydy, które wykazują znacząco wyższą aktywność podobną do ApoA-I niż te inne peptydy. Zaiste, podczas gdy wiele agonistów ApoA-I wynalazku ma aktywność zbliżoną i w niektórych postaciach nawet przekraczającą aktywność ApoA-I, dotychczas najlepsze mimetyki ApoA-I opisane w literaturze - jest peptyd 18AM4 (EWLEAFYKKVLEKLKELF; SEQ ID NO: 246) (Corinjn i wsp., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:8-16; Labeur i wsp., Oct. 1994, Arteriosclerosis: Abstract Nos. 186 and 187) i N-acetylowany, C-amidowany peptyd 18AM4 (SEQ ID NO: 239) (Brasseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:1-7), które wykazują odpowiednio mniej niż 4% i 11%, aktywności ApoA-I mierzonej testem aktywacji LCAT opisanym poniżej.

PL 200 744 B1

W jednym ilustrującym wykonaniu, peptydy rdzeniowe (lub ich analogi) towrzące agonistów ApoA-I według wynalazku mają następujący wzór strukturalny (I):

lub X18 ^X1^-X2^-X3^-X4^-X5^-X6^-X7^-X8^-X9^-X10^-X11^-X12^-X13^-X14^-X15^-X16^-X17

Gdzie:

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Gln (Q) lub D-Pro (p);

X2 oznacza aminokwas alifatyczny;

X3 oznacza Leu (L);

X4 oznacza aminokwas kwaśny;

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza aminokwas zasadowy;

X8 oznacza aminokwas kwaśny;

X9 oznacza Leu (L) lub Trp (w);

X10 oznacza Leu (L) lubTrp (W;

XII oznacza aminokwas kwaśny lub Asn (N);

X12 oznacza aminokwas kwaśny;

X13 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Phe (F);

X14 oznacza aminokwas zasadowy lub Leu (L);

X15 oznacza Gln (Q) lub Asn (N);

X16 oznacza aminokwas zasadowy;

X17 oznacza Leu (L);

X18 oznacza aminokwas zasadowy;

Peptydy rdzeniowe struktury (I) są zdefiniowane, częściowo, w zakresie aminokwasów poszczególnych klas. Definicje różnych wyszczególnionych klas są dostarczone poniżej w połączeniu z opisem zmutowanych lub zmienionych wykonań wynalazku.

W peptydach rdzeniowych struktury (I), symbol „-,, pomiędzy Xn reszt aminokwasowych oznacza zazwyczaj konstytutywną funkcję łączącą szkieletu. Ponadto, symbol „-„ zazwyczaj reprezentuje wiązania peptydowe lub wiązania amidowe (-C(O)NH-). Jest zrozumiałym, jednakże, że niniejszy wynalazek dotyczy analogów peptydowych, w których jedno lub więcej wiązań amidowych jest zastąpione wiązaniem innym niż amidowe, najkorzystniej podstawionym amidem lub izosterem amidu. A zatem, podczas gdy różne reszty Xn w obrębie struktury (I) są ogólnie określane jako aminokwasy a korzystne wykonania wynalazku są przedstawione na przykładzie peptydów, fachowiec z łatwością rozpozna, że w przykładach posiadających wiązania nie-amidowe, termin „aminokwas lub „reszta odnosi się do innych reszt bifunkcjonalnych posiadających grupy podobne w strukturze do łańcuchów bocznych aminokwasów.

Zastępcze amidy generalnie dotyczą, ale nie są ograniczone do grup o wzorze -C(O)NR-, gdzie R jest (C1-C6) alkil(em), podstawionym (C1-C6) alkilem, (C1-C6) alkenylem, (C5-C20) arylem, podstawionym (C5-C20) arylem, (C6-C26) alkarylem, podstawionym (C6-C26) alkarylem, 5-20 członowym heteroarylem, podstawionym 5-20 członowym heteroarylem lub 6-26 członowym alkheteroarylem i podstawionym 6-26 członowym alkheteroarylem.

Izostery amidowe generalnie zwierają, ale nie są ograniczone do -CH2NH-; CH2S-, -CH2CH2; -CH=CH- (cis i trans), -C(O)H2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Związki mające takie wiązania amidowe oraz metody sporządzenia takich związków są dobrze znane specjalistom, (patrz, np., Spatola, Marzec 1983, Vega Data Vol. 1, Issue 3; Spatola, 1983, Peptide Backbone 15 Modifications w: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins, Weinstein, ed., Marcel Dekker, New York, p. 267 (przegląd ogólny); Morley, 1980, Trends Pharm. Sci. 1:463-468; Hudson i wsp., 1979, Int. J. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2NH-, -CH2CH;); Spatola i wsp., 1986, Life Sci. 20 38:1243-1249 (-CH2-S); Hann, 1982, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1:307-314 (-CH=CH-, cis i trans); Almquist i wsp., 1980, J. Med. Chem. 23:1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White i wsp., Tetrahedron. Lett. 23:2533 (-COCH2-) Europejski Wniosek Patentowy EP 45665 (1982) CA 97:39405 (-CH(OH)CH2-); Holladay 25 i wsp., 1983, Tetrahedron Lett. 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-); i Hruby, 1982, Life Sci. 31:189-199 (-CH2-S-).

Dodatkowo, jedeno lub więcej wiązań amidowych może być przeniesione z resztami peptydomimetycznymi lub amidomimetycznymi, które nie wpływają w sposób znaczący na strukturę i aktywność peptydów. Opisane są odpowiednie reszty amidomimetyczne, np. w Olson i wsp. 1993, J. Med.

Chem. 36:3039-3049.

PL 200 744 B1

Krytyczną cechą peptydów rdzenia struktury (I) jest ich zdolność do tworzenia amfipatycznych α-helis w obecności lipidów. Przez amfipatyczność rozumiane jest, że α-helisa ma przeciwstawne powierzchnie hydrofilowe i hydrofobowe zorientowane wzdłuż jej długiej osi, tj., jedna powierzchnia helisy prezentuje głównie hydrofobowe łańcuchy boczne podczas, gdy powierzchnia przeciwstawna prezentuje głównie hydrofobowe łańcuchy boczne. Fig. 1A i 1B przedstawiają dwa rzuty przeciwstawnych powierzchni hydrofilowych i hydrofobowych przykładowej wyidealizowanej amfipatycznej α-helisy. Fig. 1A jest schematem helikalnego koła Schiffer-Edmundsona (Schiffer i Edmundson, 1967, Biophys. J. 7:121-135). W kole długa oś helisy jest prostopadła do kartki. Rozpoczynając od N-końca, kolejne reszty aminokwasów (reprezentowane przez kółka) są promieniście rozmieszczone wokół obwodu koła w odstępach 100°. Tak więc reszta aminokwasu n+1 jest rozmieszczona 100° od reszty n, reszta n+2 jest umieszczona 100° od reszty n+1 i tak dalej. Umieszczenie 100° powoduje 3,6 aminokwasów na skręt, które są typowo obserwowane w idealnej α-helisie. W fig. 1A przeciwstawne hydrofilowe i hydrofobowe powierzchnie helisy są wyraźnie widoczne, hydrofilowe aminokwasy są reprezentowane jako otwarte kółka i hydrofobowe aminokwasy są reprezentowane jako cieniowane kółka.

Figura 1B przedstawia schemat helikalnej sieci dla wyidealizowanej helisy amfipatycznej fig. 1A (Lim, 1978, FEBS Lett. 89:10-14). W typowym schemacie helikalnej sieci α-helisa jest przedstawiana jako cylinder, który został przecięty wzdłuż środka swojej hydrofilowej powierzchni i spłaszczony. Tak więc środek powierzchni hydrofobowej, okreśłany przez hydrofobowy moment helisy (Eisenberg i wsp, 1982, Nature 229:371-374), leży w środku figury i jest zorientowany tak by wystawał z płaszczyzny kartki. Ilustracja cylindra helikalnego przed cięciem i spłaszczeniem jest przedstawiona na fig. 1C. Przez przecięcie cylindra wzdłuż różnych płaszczyzn, można obserwować różne widoki tej samej helisy amfipatycznej, i można uzyskać różne informacje o właściwościach helisy.

Amfipatyczna natura α-helisy tworzonej przez peptydy rdzenia struktury (I) w obecności lipidów jest przedstawiona na fig. 2. Fig. 2A jest diagramem helikalnego koła Schiffera-Edmundsona. Fig. 2B przedstawia schemat helikalnej sieci ilustrujący hydrofobową powierzchnię a fig. 2C jest schematem helikalnej sieci ilustrującym powierzchnię hydrofilową. Na każdym rysunku fig. 2A, 2B i 2C hydrofilowe reszty aminokwasowe reprezentują otwarte kółka, a zacienione kółka reprezentują hydrofobowe reszty aminokwasowe zaś częściowo zacienione kółka reprezentują zarówno reszty hydrofobowe, jak i hydrofilowe.

Nie wiążąc się z żadną konkretną teorią, uważa się, że pewne właściwości strukturalne i/lub fizyczne amfipatycznej helisy tworzonej przez peptydy rdzenia struktury (I), są ważne dla aktywizacji. Te właściwości dotyczą stopni amfipatyczności, całkowitej hydrofobowości, średniej hydrofobowości, hydrofobowości i kątów hydrofilowych, momentu hydrofobowego, średniego momentu hydrofobowego i całościowego ładunku helisy.

Podczas gdy helikalny diagram kołowy fig. 2A dostarcza przekonujących środków do przedstawienia amfipatycznej natury peptydów rdzenia struktury (I), stopień amfipatyczności (stopień asymetrii hydrofobowości) może być przekonująco określony przez przeliczenie momentu hydrofobowego helisy. Metody przeliczania μ_Μ dla poszczególnych sekwencji peptydowych są dobrzez znane fachowcom i są opisane, np. w Eisenberg, 1984, Ann. Rev. Biochem. 53:595-623. Faktyczny μ_Μ otrzymany dla określonego peptydu będzie zależeć od całkowitej liczby aminokwasów tworzących peptyd. A zatem, nie jest sensownym bezpośrednie porównywanie μ_Μ peptydów o różnej długości.

Amfipatyczność peptydów o różnej długości może być bezpośrednio porównywana drogą porównywania średniego momentu hydrofobowego (<μΗ>)· Średni moment hydrofobowy helisy może być otrzymany poprzez podział μ_Η przez liczbę reszt w helisie (np. <μ_Η> = μ_Η/Ν). Generalnie, peptydy rdzeniowe, wykazujące <μΗ> W zakresie od 0,55 do 0,65, jak określono stosując znormalizowaną skalę zgodności hydrofobowości Eisenberga (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142) są uważane za znajdujące się w obrębie niniejszego wynalazku, z korzystnym zakresem <μΗ> od 0,55 do 0,65.

Całkowita hydrofobowość (H_o) peptydu może być zazwyczaj wyliczona poprzez wyliczenie sumy algebraicznej hydrofobowości każdej reszty aminokwasowej w peptydzie

N (tj., Ho = Σ Hi), i=1 gdzie N jest liczbą reszt aminokwasów w peptydzie a H_i jest hydrofobowością reszty aminokwasowej i). Średnia hydrofobowość (<H_o>) stanowi hydrofobowość podzieloną przez liczbę reszt aminokwasoPL 200 744 B1 wych (tj. <Ho> = Ho/N). Ogólnie, peptydy rdzeniowe, które wykazują średnią hydrofobowość w zakresie -0.150 do -0.070, jak określono stosując znormalizowaną skalę zgodności hydrofobowości Eisenberga (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142) są uważane za znajdujące się w zakresie niniejszego wynalazku, z korzystnym zakresem hydrofobowości od -0.130 do -0.050.

Totalna hydrofobowość powierzchni hydrofobowej (Ho^pho) helisy amfipatycznej może być otrzymana poprzez zsumowanie hydrofobowości reszt aminokwasów, które znajdują się w kącie hydrofobowym jak zdefiniowano poniżej,

N (Ho^pho = Σ H), i=1 gdzie Hi jest jak poprzednio zdefiniowano całkowitą ilością aminokwasów w powierzchni hydrofobowej). Średnia hydrofobowość powierzchni hydrofobowej (<Ho^pho>) stanowi Ho^pho/NH gdzie NH jest zdefiniowane jak powyżej. Ogólnie, peptydy rdzeniowe, które wykazują (<Ho^pho>) w zakresie od 0.90 to 1.20, jak określono stosując znormalizowana skalę zgodności hydrofobowości Eisenberga (Eisenberg, 1984, poniżej; Eisenberg i wsp., 1982, poniżej) są uważane za znajdujące się w zakresie niniejszego wynalazku, z korzystnym <Ho^pho> w zakresie od 0.950 do 1.10.

Kąt hydrofobowy (kąt pho) jest ogólnie zdefiniowany jako kąt lub łuk pokrywający najdłuższy ciągły odcinek reszt aminokwasowów hydrofobowych wówczas, gdy peptyd jest przedstawiony w postaci helikalnego koła Schiffer-Edmundsona (tj., liczba sąsiednich reszt hydrofobowych na kole mnożona przez 20°). Kąt hydrofobowy (kąt phi) jest różnicą pomiędzy 360° a kątem pho (tj., 360°-kąt pho). Fachowcy zauważa, że kąty phi i pho będą zależeć, częściowo, od liczby reszt aminokwasowych w peptydzie. Na przykład, odnosząc się do fig. 5A i 5B, widocznym staje się, że tylko 18 aminokwasów odpowiada jednemu obrotowi helikalnego koła Schiffer-Edmundsona. Mniej aminokwasów zostawia przerwę w kole, więcej aminokwasów powoduje, że niektóre pozycje na kole są zajmowane przez więcej niż jedną resztę aminokwasu.

W przypadku peptydów zawierających więcej niż 18 reszt aminokwasowych, ciągły odcinek hydrofobowych reszt aminokwasowych oznacza, że co najmniej jedna reszta aminokwasowa na pozycjach wokół koła zajmowanych przez dwa lub więcej reszt aminokwasowych jest resztą aminokwasu hydrofobowego.

Zazwyczaj, peptydy rdzeniowe złożone z 18 lub mniej aminokwasów posiadające kąt pho w zakresie 120° do 160° są uważane za znajdujące się w zakresie wynalazku, z korzystnym kątem pho w zakresie 130° to 150°. Przykłady zawierające więcej niż 18 aminokwasów posiadają kąt pho w zakresie 120-220°, przy czym preferuje się zakres 180-200°.

Pewne strukturalne i/lub fizyczne właściwości budowy peptydów rdzeniowych struktury (I) są zilustrowane na fig. 3 i 4. fig. 3B przedstawia schemat helikalnej sieci przykładowego peptydu rdzeniowego wynalazku, peptydu 210 (PVLDLFRELLEELKQKLK; SEQ ID NO:210), ukazującego rozkład ładunku wzdłuż hydrofilowej powierzchni helisy. Na rys. 3B, helikalny cylinder przecięto wzdłuż środka powierzchni hydrofobowej i spłaszczono. Trzy hydrofobowe reszty lizynowe, które zastępują reszty hydrofilowe 22-merze najwyższej zgodności Segresta (reszty 5, 9 i 13) (fig. 3C) są zacieniowane. Jak można zobaczyć na fig. 3B dodatnio naładowane reszty aminokwasowe są zgrupowane przy C-końcowym zakręcie helisy (koniec C jest na górze strony). Ponieważ nie było zamiarem wiązanie się jakąś szczególną teorią, uważa się, że to zgrupowanie zasadowych reszt przy C-końcu (reszty 14, 16, i 18) stabilizuje helisę poprzez oddziaływania elektrostatyczne dipola helisy (NH3+). Uważa się ponadto, że stabilizacja odbywa się poprzez hydrofobowe oddziaływania miedzy łańcuchami bocznymi lizyny i rdzeniem helisy (patrz Groebke i wsp., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 4025-4029; Esposito i wsp., 1997, Biopolymers 41:27-35).

Z wyjątkiem dodatnio naładowanego zgrupowania przy C-końcu (reszty 14, 16 i 18), ujemne ładunki są rozłożone na pozostałej części strony hydrofobowej, z co najmniej jedną naładowaną ujemnie (kwaśną) resztą aminokwasową przypadającą na obrót, czego wynikiem jest ciągły obszar ujemnych ładunków wzdłuż hydrofilowej strony helisy.

Figura 4B przedstawia schemat helikalnej sieci pokazujący powierzchnie hydrofobowe amfipatycznej helisy tworzonej przez przykładowy peptyd rdzeniowy 210 (SEQ ID NO:210). Na ryć 4B helikalny cylinder przecięto wzdłuż środka strony hydrofobowej i spłaszczono. Powierzchnia hydrofobowa peptydu rdzeniowego składa się z 2 reszt hydrofobowych na obrót, oprócz ostatniego C-końcowego obrotu, gdzie przeważają reszty zasadowe. Badanie NMR wskazuje, że reszty aminokwasowe 3, 6, 9 i 10 analogowego 22-merowego peptydu (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ID NO:4) tworzą hy20

PL 200 744 B1 drofobowe zgrupowanie obok N-końca helisy. Phe-6 znajduje się w środku tego zgrupowania i uważa się, że odgrywa ważną rolę w stabilizacji tego hydrofobowego zgrupowania. Ponieważ nie było zamiarem wiązanie się jakąś szczególną teorią, uważa się, że to zgrupowanie hydrofobowe tworzone przez reszty 3, 6, 9 i 10 ma znaczenie w efektywnym wiązaniu lipidów i aktywacji LCAT. Oczekuje się, że amfipatyczne peptydy będą wiązać fosfolipidy wystając swoimi powierzchniami hydrofobowymi naprzeciwko łańcuchów alkilowych reszt lipidowych. Tak wiec, uważa się, że to wysoce hydrofobowe zgrupowanie przyczynia się do silnego powinowactwa do lipidów obserwowanego u peptydów rdzeniowych wynalazku. Ponieważ wiązanie lipidów jest potrzebne do aktywacji LCAT, uważa się, że to hydrofobowe zgrupowanie jest niezbędne także do aktywacji LCAT.

Reszty aromatyczne często okazują się być ważne w zakotwiczaniu peptydów i białek do lipidów (De Kruijff, 1990, Biosci. Rep. 10:127-130; O'Neil and De Grado, 1990, Science 250:645-651; Blondelle i wsp., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1202:331-336). Tak więc wierzy się także, że Phe-6, która jest umieszczona w środku skupienia hydrofobowego może też odgrywać kluczową rolę w. zakotwiczaniu peptydów rdzeniowych o strukturze (I) do lipidów.

Oddziaływania między peptydami rdzeniowymi wynalazku a lipidami prowadzą do utworzenia kompleksu peptyd-lipid. Jak zilustrowano na fig. 8A typ otrzymanego kompleksu zależy od stosunku lipid-peptyd, komicele głównie tworzą się przy małym stosunku molarnym lipid:peptyd a dyskowate i pęcherzykowe lub wielowarstwowe kompleksy tworzą się przy wzrastającym stosunku molarnym lipid:peptyd. Tę cechę opisano dla amfipatycznych peptydów (Epand, The Amphipathic Helix, 1993) i ApoA-I (Jones, 1992 Structure and Function of Apolipoproteins, Chapter 8, pp. 217-250). Molarny stosunek lipid:peptyd determinuje również wielkość i skład kompleksów (patrz Rozdział 5.3.1, poniżej). Długa oś α-helisy tworzonej przez peptydy rdzeniowe o strukturze (I) ma ogólny kształt zakrzywiony. W typowych helisach amfipatycznych stwierdzono, że długości wiązań wodorowych hydrofilowej i hydrofobowej powierzchni są tak różne, że hydrofobowa strona helisy jest wklęsła (Barlow and Thornton, 1988, J. Mol. Biol.201:601-619; Zhou i wsp., 1992, J. Am. Chem. Soc. 33:11174-11183; Gesell i wsp., 1997, J. Biomol. NMR 9:127-135). Ponieważ nie było zamiarem wiązanie się z jakąś szczególną teorią, uważa się, że całkowite zakrzywienie hydrofobowej strony helisy może być ważne w wiązaniu dyskowych kompleksów - zakrzywiona helisa umożliwia lepsze dopasowanie się peptydu wzdłuż brzegów dyskowatych cząsteczek, przez co wzrasta stabilność kompleksu peptyd-dysk.

W ogólnie przyjętym modelu strukturalnym ApoA-I, amfipatyczne α-helisy są upakowane wokół krawędzi dyskowego HDL (zob. fig. 10B). W tym modelu, zakłada się że helisy są uliniowane ze swoimi hydrofobowymi powierzchniami skierowanymi do acylowych łańcuchów lipidów (Brasseur i wsp., 1990, Biochim. Biophys. Acta 1043:245-252). Helisy są ułożone w formie przeciwrównoległej, i uważa się, że kooperatywny efekt między helisami wpływa na stabilność dyskowego kompleksu HDL (Brasseur i wsp., powyżej). Zaproponowano, że jednym czynnikiem, który wpływa na stabilność dyskowego kompleksu jest istnienie jonowych interakcji między kwaśnymi a zasadowymi resztami dając w efekcie wytworzenie międzycząsteczkowych wiązań jonowych lub wiązań wodorowych między resztami na przyległych przeciwrównoległych helisach. W tym modelu peptydy rozważa się jako pojedynczą całość, ale za interakcję z przynajmniej dwoma sąsiadującymi cząsteczkami peptydów (fig. 8B).

Ogólnie przyjmuje się, że tworzenie wewnątrzcząsteczkowego wiązania wodorowego lub jonowego między kwaśnymi i zasadowymi resztami, odpowiednio, w pozycjach i oraz i+3 helisy stabilizuje strukturę helikalną (Marquee i wsp., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(24): 8898-8902). Jeden dodatni ładunek znajduje się w reszcie 7 potencjalnie przyczyniając się do stabilności helisy poprzez formowanie mostków solnych z resztą kwasową jeden obrót dalej.

Tak więc dodatkową kluczową cechą peptydów rdzeniowych struktury (I) jest ich zdolność do tworzenia wewnątrzcząteczkowych wiązań wodorowych ze sobą gdy są ułożone liniowo w sposób antyrównoległy ze swoimi powierzchniami hydrofobowymi skierowanymi w tę samą stronę, co miałoby miejsce w przypadku gdy peptydy są związane z lipidami (np. między kwaśnymi resztami w pozycjach 4 i 7 i zasadowymi resztami w pozycjach 19, 20 i 22, odpowiednio), a także ich zdolność do tworzenia wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych lub mostków solnych w pobliżu N- i C-końców helisy.

Przyjmuje się, że zdolność peptydów rdzeniowych struktury (I) do ścisłego upakowania się i oddziaływań jonowych, oraz tworzenia wewnątrz- i międzycząsteczkowych mostków soinych i/lub wiązań wodorowych w czasie antyrównoległego wiązania się z lipidem jest ważną cechą peptydów rdzeniowych wynalazku.

PL 200 744 B1

Zdolność peptydów rdzeniowych do tworzenia korzystnych międzycząsteczkowych oddziaływań peptyd-peptyd ma znaczenie także przy nieobecności lipidów. Peptydy rdzeniowe wynalazku same asocjują, częściowo dzięki ich wysokiemu <μΗ>> <H₀> i kątowi hydrofobowemu (patrz, tabela I, poniżej). Zjawisko samoasocjacji zależy od warunków: pH, stężenia peptydów i siły jonowej, i może dawać w rezultacie wiele stanów asocjacji, od monomerów do wielu form multimerycznych (fig. 10A). Hydrofobowy rdzeń peptydu agreguje ułatwiając hydrofobowe oddziaływania z lipidami. Zdolność peptydów do skupiania się nawet przy bardzo niskich stężeniach może ułatwiać ich wiązanie się do lipidów. Uważa się, że w rdzeniu agregatu peptydów oddziaływania peptyd-peptyd także występują i mogą konkurować z oddziaływaniami lipid-peptyd.

Oprócz opisanych powyżej właściwości, inne parametry uważane są także za ważne dla aktywności, w tym całkowitą liczbę reszt hydrofobowych, i ładunek netto na peptydach.

Streszczenie korzystnych fizycznych i strukturalnych właściwości peptydów rdzeniowych o budowie (I) jest przedstawiony w tabeli I poniżej.

T a b e l a I

Fizyczne właściwości korzystnych agonistów ApoA-I struktury (I)

Właściwość	Zakres	Korzystny zakres
% aminokwasów hydrofobowych	40 - 70	50 - 60
<Ho>	-0.150 to -0.070	-0.130 to - 0.050
<Ho^pho>	0.90 - 1.20	0.95 - 1.10
<Hh>	0.55 - 0.65	0.58 - 0.62
Kąt pho	120° - 160°	130° - 150°
Ilość pozytywnie naładowanych aminokwasów	3-5	4
Ilość negatywnie naładowanych aminokwasów	3-5	4
Ładunek całościowy	-1 do +1	0
Nagromadzenie hydrofobowe	Pozycje 3, 6, 9, 10 są aminokwasami hydrofobowymi
Nagromadzenie kwasowe	Co najmniej 1 kwaśny aminokwas na obrót poza ostatnimi 5 C-końcowymi aminokwasami
Nagromadzenie zasadowe	Co najmniej 2 zasadowe aminokwasy w ostatnich 5 C-końcowych aminokwasach

Właściwości amfipatycznych α-helis tworzonych przez peptydy rdzeniowe wynalazku zasadniczo zależą od właściwości klasy A amfipatycznych α-helis, w szczególności α-helisy klasy A Segresta 18A i 22-merowych peptydów wysokiej zgodności. Różnice te są przedstawione na przykładowym peptydzie rdzeniowym 210 (SEQ ID NO:210) w fig. 3-5.

Odnosząc się do fig. 4A-4C, widocznym jest, że powierzchnia hydrofobowa peptydu 210 ma znacznie większy charakter hydrofobowy niż powierzchnia hydrofobowa peptydu Segresta 18A lub 22-meru wysokiej zgodności. W szczególności, reszty 9 i 13 (zacieniony region fig. 4B) są hydrofobowymi resztami Leu (L) w peptydzie 210 (SEQ ID NO:210) jak porównano do naładowanych reszt w peptydzie 18A (SEQ ID NO:244) i 22-meru o wysokiej zgodności (SEQ ID NO:75). Zamiana dwóch reszt w peptydach Segresta 18A i 22-merze o wysokiej zgodności hydrofobowymi resztami Leu (L) prowadzi do znaczących różnic w amfipatyczności, hydrofoboowości, kącie pho i innych własnościach helisy.

Porównanie fizycznych i strukturalnych właściwości peptydu 210 (SEQ ID NO:210) i peptydu 18A Segresta (SEQ ID NO:244) oraz 22-merowego peptydu wysokiej zgodności (SEQ ID NO:75) jest zawarte w tabeli II, poniżej:

PL 200 744 B1

T a b e l a II

Porównanie właściwości przykładowego peptydu rdzeniowego 210 (SEQ ID NO:210) z peptydem 18A (SEQ ID NO:244)

Właściwość	18A	Koncensusowy 22-mer	Peptyd 210
Ilość aminokwasów	18	22	18
Ilość aminokwasów hydrofitowych	9	13	9
Ilość aminokwasów hydrofobowych	9	9	9
% aminokwasów hydrofobowych	50	41	50
<Ho>	-0.430	-0.293	-0.125
<Ho^pho>	0.778	0.960	1.081
<Hh>	0.485	0.425	0.597
Kąt pho	100°	100°	140°
Ilość pozytywnie naładowanych aminokwasów	4	5	4
Ilość negatywnie naładowanych aminokwasów	4	6	4
Ładunek całościowy	0	-1	0

Te różnice we właściwościach prowadzą do znaczących różnic w aktywności. Podczas gdy peptyd Segresta 18A (SEQ ID NO:244) i 22-merowy peptyd wysokiej zgodności (SEQ ID NO:75) wykazują jedynie 5% i 10% aktywacji LCAT, odpowiednio, w porównaniu do natywnej ApoA-I; w opisywanych tutaj testach, peptyd 210 (SEQ ID NO:210) wykazuje 46% aktywacji w porównaniu do natywnej ApoA-I w tych samych testach. Peptyd 193 (SEQ ID NO:193), który jest N-końcowo acetylowany i C-końcowo amidowany peptyd 210, wykazują 96% aktywacji LCAT w tym samym teście.

Pewne reszty aminokwasowe peptydów rdzeniowych struktury (I) mogą być zastąpione innymi resztami aminokwasowymi bez znaczącego wpływu delecyjnego, w wielu przypadkach ze zwiększeniem aktywności peptydów. A zatem, niniejszy wynalazek dotyczy zmienionych lub zmutowanych form peptydów rdzeniowych struktury (I), przynajmniej jedna określona reszta aminokwasu w strukturze jest zastąpiona przez inną resztę aminokwasu. Ponieważ uważa się, że jedną z krytycznych cech wpływających na aktywność peptydów rdzeniowych według wynalazku jest ich zdolność do tworzenia a-helisy w obecności lipidów, które wykazują właściwości amfipatyczne i inne opisane powyżej, będzie rozpoznane, że w korzystnych postaciach wynalazku podstawienia aminokwasów są konserwatywne tzn. podstawiająca reszta aminokwasu ma fizyczne i chemiczne właściwości, które są podobne do zastępowanej reszty aminokwasu.

Dla celów określenia konserwatywnych substytucji aminokwasowych, aminokwasy mogą być sklasyfikowane konwencjonalnie na dwie główne kategorie - hydrofilowe i hydrofobowe - w zależności przedewszystkim od fizyczno-chemicznych właściwości aminokwasowych łańcuchów bocznych. Te dwie kategorie mogą być dalej zaklasyfikowane do podkategorii, które bardziej wyraźnie definiują właściwości łańcuchów bocznych aminokwasów. Dla przykładu, klasa aminokwasów hydrofilowych może być w dalszym ciągu podzielona na kwaśne, zasadowe i polarne. Klasa aminokwasów hydrofobowych może być dalej podzielona na aminokwasy apolarne i aromatyczne. Definicje różnych kategorii aminokwasów, które definiują strukturę (I) są następujące:

„Aminokwas hydrofilowy odnosi się do aminokwasu mającego łańcuch boczny, który wykazuje tendencję do łączenia się z fazą wodną lub polarnymi końcami fosfolipidów w obecności lipidów. Genetycznie kodowane aminokwasy hydrofilowe dotyczą: Asp (D), Glu (E), His (H), Lys (K), Arg (R), Asn (N), Gln (Q), Ser (S) i Thr (T).

„Kwaśny aminokwas odnosi się do aminokwasu mającego łańcuch boczny o pK mniejszej niż 7. Kwaśne aminokwasy mają zazwyczaj łańcuchy boczne o negatywnym ładunku w fizjologicznym pH ze względu na utratę protonu. Genetycznie kodowane kwaśne aminokwasy dotyczą: Glu (E) i Asp (D).

PL 200 744 B1 „Zasadowy aminokwas odnosi się do aminokwasu mającego łańcuch boczny o pK większej niż 7. Kwaśne aminokwasy mają zazwyczaj łańcuchy boczne o pozytywnym ładunku w fizjologicznym pH ze względu na asocjację z jonem hydroksylowym. Genetycznie kodowane zasadowe aminokwasy dotyczą: Arg (R) i Lys 10 (K).

„Polarny aminokwas odnosi się do aminokwasu mającego łańcuch boczny pozbawiony ładunku w fizjologicznym pH ale, posiadającego co najmniej jedno wiązanie, w którym wspólna para elektronowa dwóch atomów znajduje się bliżej jednego z atomów. Genetycznie kodowane zasadowe aminokwasy dotyczą: Asn (N) i Gln (Q) „Hydrofobowy aminokwas odnosi się do aminokwasu mającego łańcuch boczny wykazujący tendencję do wiązania się z acylowymi łańcuchami fosfolipidów w obecności lipidów. Genetycznie kodowane zasadowe aminokwasy dotyczą: Phe (F), Tyr (Y), Trp (W), Leu (L), Val (V), He (I), Met (M), Gly (G), Ala (A) i Pro (P).

„Aromatyczny aminokwas odnosi się do hydrofobowego aminokwasu mającego w łańcuchu bocznym co najmniej jeden pierścień aromatyczny lub heteroaromatyczny. Pierścień aromatyczny lub heteroaromatyczny może zawierać jeden lub więcej podstawników. Genetycznie kodowane zasadowe aminokwasy dotyczą: Phe (F), Tyr (Y) i Trp (W).

„Niepolarny aminokwas odnosi się do hydrofobowego aminokwasu mającego łańcuch boczny, który jest pozbawiony ładunku w fizjologicznym pH. I który posiada wiązania, w których wspólna para elektronowa dwóch atomów jest dokładnie pośrodku pomiędzy dwoma atomami (tj. łańcuch boczny nie jest polarny).

„Alifatyczny aminokwas odnosi się do hydrofobowego aminokwasu mającego alifatyczny wodorowęglowy łańcuch boczny. Genetycznie kodowane zasadowe aminokwasy dotyczą: Ala (A), Val (V), Leu (L) i Ile (I).

Reszta aminokwasowa Cys (C) jest nietypowa poprzez formowanie mostków dwusiarczkowych z innymi resztami Cys (C) lub innymi aminokwasami zawierającymi grupy sulfanylowe. Zdolność reszt Cys (C) (i innych aminokwasów zawierających w łańcuchu bocznym SH-) do funkcjonowania w peptydzie zarówno w formie zredukowanej -SH, jak i utlenionej mostka siarczkowego wpływa na całościowy charakter hydrofobowy lub hydrofilowy peptydu. Podczas gdy Cys (C) wykazuje hydrofobowość 0.29 według znormalizowanej skali Eisenberga (Eisenberg, 1984, poniżej), staje się zrozumiałym że dla celów niniejszego wynalazku Cys (C) jest uznawana jako hydrofilowy aminokwas, nieodpowiadający ogólnej klasyfokacji zdefiniowanej powyżej.

Jak zostanie docenione przez fachowców, powyżej zdefiniowane kategorie nie wykluczają się wzajemnie.

A zatem, aminokwasy mające łańcuchy boczne wykazujące dwie lub więcej właściwości fizykochemicznych mogą dotyczyć różnych kategorii. Na przykład, łańcuchy boczne aminokwasów mające reszty aromatyczne, które w dalszej części są podstawiane polarnymi podstawnikami, takimi, jak Tyr (Y), mogą wykazywać zarówno właściwości kategorii aromatycznej jak i polarnej. Odpowiednia kategoryzacja jakichkolwiek aminokwasów będzie widoczna dla fachowców, zwłaszcza w świetle szczegółowego, zamieszczonego tutaj opisu.

Pewne reszty aminokwasowe, zwane aminokwasami łamiącymi helisę, posiadają zdolność do przerywania struktury α-helisy, jeśli znajdują się we wnętrzu helisy. Reszty aminokwasowe wykazujące zdolności łamania helisy są dobrze znane fachowcom, (patrz, np. Chou and Fasman, Ann. Rev. Biochem. 4_7.: 251-276) i dotyczą (P), Gly (G) i potencjalnie wszystkich D-aminokwasów (jeśli znajdą się w L-peptydzie; dla odmiany L-aminokwasy przyrywają strukturę helikalną peptydu D). Podczas gdy te aminokwasy zawarte są w kategoriach zdefiniowanych powyżej, reszty te nie powinny być używane do substytucji reszt aminokwasowych znajdujących się wewnątrz helisy - powinny być stosowane do podstawiania reszt 1-3 na N- lub/i C-końcu peptydu.

Podczas gdy zdefiniowane powyżej kategorie zostały przedstawione w postaci genetycznie kodowanych aminokwasów, substytucje aminokwasowe nie powinny być, i w niektórych korzystnych wykonaniach nie są ograniczone do genetycznie kodowanych aminokwasów. W rzeczywistości, wiele korzystnych peptydów struktury (I) zawiera genetycznie nie-kodowane aminokwasy. A zatem, w dodatku do naturalnie występujących genetycznie kodowanych aminokwasów, reszty aminokwasowe w peptydach rdzeniowych struktury (I) mogą być podstawione naturalnie występującymi, niekodowanymi genetycznie i syntetycznymi aminokwasami.

Pewne zwyczajowo napotykane aminokwasy, które dostarczają użytecznych substytucji dla peptydów rdzeniowych struktury (I) dotyczą, ale nie są ograniczone do β-alaniny (β-Ala) i innych ome24

PL 200 744 B1 ga-aminokwasów takich jak kwas 3-aminopropionowy, kwas 2,3-diaminopropionowy (Dpr), kwas 4-aminomasłowy i tak dalej; kwas α-aminoizomasłowy (Aib); kwas ε-aminoheksaniowy (Aha); kwas δ-aminowalerianowy (Ava); N-metyloglicynę czy sarkozynę (MeGly); ornitynę (Orn); cytrulinę (Cit); t-butyloalaninę (t-BuA); t-butyloglicynę (T-BuG); N-metyloizoleucynę (Melle); fenyloglicynę (Phg); cykloheksyloalaninę (Cha); norleucynę (Nle); naftyloalaninę (Nal); 4-chlorofenyloalaninę (Phe(4-Cl)); 2-fluorofenyloalaninę (Phe (2-F)); 3-fluorofenyloalaninę (Phe (3-F)); 4-fluorofenyloalaninę (Phe (4-F)); penicyloaminę (Pen); β-2-tienyloalaninę (Thi); sulfotlenek metioniny (MSO); homoargininę (hArg); N-acetylolizynę (AcLys); kwas 2,4-diaminomasłowy (Dbu); kwas 2,3-diaminomasłowy (Dab); β-aminofenyloalaninę (Phe(pNH2)); N-metylowalinę (MeVal); homocysteinę (hCys), homofenyloalaninę (hPhe) i homoserynę (hSer); hydroksyprolinę (Hyp), homoprolinę, N-metylowanę aminokwasy i peptoidy (glicyny podstawione w N).

Klasyfikacja powszechnie kodowanych i ogólnie nie kodowanych aminokwasów zgodnie z kategoriami zdefiniowanymi powyżej jest podsumowana w tabeli III, poniżej. Należy rozumieć, że tabela III jest jedynie zilustrowaniem propozycji i nie pokrywa pełnej listy reszt aminokwasowych, które można użyć do podstawień opisanych tu peptydów rdzeniowych. Inne nie wymienione tu reszty aminokwasowe można z łatwością zaklasyfikować na podstawie obserwowanych właściwości fizycznych i chemicznych w świetle dostarczanych tu definicji.

T a b e l a III

Klasyfikacje powszechnie spotykanych aminokwasów.

Klasyfikacja	Genetycznie kodowane	Nie-genetycznie kodowane
Hydrofobowy
Aromatyczny	F, Y, W	Phg, Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe(2-F), Phe(3-F), Phe(4-P), hPhe
Apolarny	L, V, I, M, G, A, P	t-BuA, t-BuG, Melle, Nie, MeVal, Cha, McGly, Aib
Alifatyczny	A, V, L, I	b-Ala, Dpr, Aib, Aha, MeGly, t-BuA, t-BuG, Melle, Cha, Nie, MeVal
Hydrofilowy
Kwaśny	D, E
Zasadowy	H, K, R	Dpr, Om, hArg, Phe (p-NH₂), Dbu, Dab
Polarny	C, Q, N, S, T	Cit, AcLys, MSO, bAla, hSer
Łamiący helisę	P, G	D-Pro i inne D-aminokwasy (w L-peptydach)

Mimo, że w większości przypadków aminokwasy peptydów rdzeniowych struktury (I) zostaną podstawione L-enencjomerami aminokwasów jednak substytucje nie są ograniczone do L-enancjomerów aminokwasów. A zatem, zawarte w definicji zmutowane lub zmienione substytucje dotyczą sytuacji, w których co najmniej jeden L-aminokwas jest zastępowany identycznym D-aminokwasem (np. L-Arg D-Arg) lub D-aminokwasem z tej samej kategorii lub subkategorii (np., L-Arg D-Lys), i vice versa. W rzeczywistości, w pewnych korzysntch wykonaniach odpowiednich do podania doustnego zwierzętom, peptydy mogą być korzystnie złożone z co najmniej jednego aminokwasu D-enancjomerycznego. Peptydy zawierające takie D-aminokwasy są uważane za bardziej stabilne w jamie ustnej, jelicie lub surowicy, niż peptydy złożone wyłącznie z L-aminokwasów.

Jak zauważono powyżej, D-aminokwasy mają tendencję do przerywania struktury α-helisy jeśli znajdują się na pozycjach wewnętrznych α-helikalnego peptydu. W konsekwencji, D-aminokwasy nie powinny być stosowane do podstawiania wewnętrznych L-aminokwasów; D-aminokwasowe substytucje powinny być ograniczone do 1-3 aminokwasowych reszt na N-końcu i/lub C-końcu peptydu. Korzystnie, jedynie aminokwas na N-końcu i/lub C-końcu peptydu jest podstawiony D-aminokwasem.

Stosując opisaną powyżej klasyfikację w połączeniu z helikalnym kołem Schiffer-Edmundsona i helikalnym sieciowym schematem peptydów rdzeniowych struktury (I), podobnie jak szczegółowy przedstawiony tutaj opis wymaganych właściwości, zmienione lub zmutowane formy peptydów rdzePL 200 744 B1 niowych struktury (I), która zasadniczo zatrzymuje amfipatyczność i inne cechy helisy, i które są zatem rozważane jako zawarte w zakresie niniejszego wynalazku, mogą być łatwo otrzymane.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, zmienione lub zmutowane formy peptydów rdzeniowych o strukturze (I) otrzymuje się przez określenie stałych reszt hydrofilowych i hydrofobowych stosownie do struktury (I) i podstawienie co najmniej jednej nie stałej reszty innym aminokwasem, korzystnie konserwatywne tzn. innym aminokwasem z tej samej kategorii lub podkategorii. Można także określić stałe zgrupowania reszt zasadowych i/lub hydrofobowych stosownie do struktury (I) i co najmniej jedno podstawienie nie stałej reszty, korzystnie konserwatywne.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku, zmienione lub zmutowane formy peptydów rdzeniowych o strukturze (I) otrzymuje się przez określenie stałych reszt hydrofilowych aminokwasów położonych na hydrofilowej powierzchni helisy stosownie do struktury (I) i podstawienie co najmniej jednej reszty nie stałego aminokwasu innym aminokwasem, korzystnie inną resztą aminokwasową z tej samej kategorii lub podkategorii. Odnosząc się do fig. 2A, widocznym jest że reszty 1, 4, 7, 8, 11, 12, 14, 15 i 18 są położone wewnątrz powierzchni hydrofilowej amfipatycznej helisy tworzonej przez peptyd rdzeniowy struktury (I). Z tych reszt, wszystkie są hydrofilowe, z wyjątkiem reszty pierwszej, która może być zarówno hydrofilowa, jak i hydrofobowa. A zatem, w korzystnym wykonaniu, reszty 4, 7, 8, 22, 12, 15 i 18 są położone według struktury (I) i co najmniej jedna z reszt 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, i 17, jest podstawiona innym aminokwasem z tej samej kategorii, korzystnie innym aminokwasem z tej samej podkategorii. Alternatywnie, reszta 1 jest także stała stosownie do struktury (I) a co najmniej jedna z reszt 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, i 17, jest podstawiona.

W szczególnie korzystnym wykonaniu położone na C końcu zasadowe zgrupowanie (reszty 14, 16 i 18) jest także stałe stosownie do struktury (I) a jedynie reszty 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13 i/lub 17 są podstawione.

W innym szczególnie korzystnym wykonaniu hydrofobowe zgrupowanie (reszty 3, 6, 9 i 10) jest także stałe zgodnie ze strukturą (I) a jedynie reszty 2, 5, 13, 16 i/lub, 17 są podstawione.

W jeszcze innym szczególnie korzystnym wynalazku zarówno zasadowe jak i hydrofobowe zgrupowanie jest stałe a jedynie reszty 2, 5, 13, i/lub 17 są podstawione.

W innym korzystnym wykonaniu według wynalazku zmienione lub zmutowane formy peptydów rdzeniowych otrzymuje się poprzez określenie stałych reszt hydrofobowych aminokwasów na powierzchni hydrofobowej helisy a podstawiana jest co najmniej jedna nie stała reszta aminokwasowa na inną resztę aminokwasową, korzystnie na inną resztę aminokwasową z tej samej kategorii lub podkategorii.

Odnośnie do fig. 2A, może wydawać się, że aminokwasy w pozycjach 2, 3, 5, 6, 10, 13, 16 i 17 są położone wewnątrz powierzchni hydrofobowej. Wszystkie z w/w reszt aminokwasowych, prócz 16 aminokwasu, są hydrofilowe. W ten sposób, w korzystnym wykonaniu, następujące reszty aminokwasowe: 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13 i 17 są zamocowane zgodnie ze strukturą (I) i co najmniej jedna z reszt: 1, 4, 7, 8, 11, 12, 14, 15, 16 i 18, ulega substytucji inną resztą aminokwasową, korzystnie aminokwasem należącym do tej samej kategorii lub podkategorii.

W korzystnym wykonaniu, zgromadzenie zasadowe na C-końcu (reszty: 14, 16, 18) jest również stałe, i tylko aminokwasy w pozycjach 1, 4, 7, 8, 11, 12 i/lub 15 są podstawione.

W innym wykonaniu, zmienione lub zmutowane formy peptydów o strukturze (I) otrzymuje się poprzez pozostawienie stałymi wszystkie reszty aminokwasowe występujące na hydrofobowej lub hydrofilowej powierzchni helisy i podstawienie, korzystnie konserwatywne, co najmniej jednej reszty aminokwasowej występującej na drugiej powierzchni inną resztą aminokwasową. Reszty obejmujące zgrupowanie hydrofobowe i/lub zgrupowanie zasadowe mogą być fakultatywnie stałe stosownie do struktury (I) jak omówiono wcześniej.

Następnym wykonaniem wynalazku są zmienione lub zmutowane formy struktury (I), które otrzymano przez podstawienie przynajmniej jednego aminokwasu przez inny, niekonserwatywny. Specjaliści wiedzą, że takie podstawienia nie powinny zasadniczo zmieniać omawianych powyżej właściwości amfipatycznych i/lub strukturalnych helisy. Zatem, w pewnych przypadkach może być pożądane podstawienie jednej lub więcej par aminokwasów w celu zachowania wypadkowej właściwości helisy. Dodatkowe informacje pozwalające na selekcjonowanie odpowiednich podstawień aminokwasowych dostarczone są poprzez sekwencje peptydowe przedstawione w tabeli X (patrz Rozdział 8.3, poniżej).

W jeszcze innym aspekcie wykonania, pierwsza do czwartej reszty aminokwasowej N-końca i/lub C-końca peptydu rdzeniowych struktury (I) ulega substytucji jednym lub kilkoma aminokwasami

PL 200 744 B1 lub jednym albo więcej fragmentami peptydowymi, które utrzymują stabilność regionów α-helikalnych w strukturze drugorzędowej (reszty koniec-czapeczka lub segmenty). Reszty koniec-czapeczka lub segmenty są dobrze znane specjalistom (Richardson and Richardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper i wsp., 1993, Biochemistry 32 (30):7605-7609; Dasgupta and Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41:499-511; Scale i wsp., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig i wsp., 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou i wsp., 1994, Proteins 18:1-7; Doig and Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert i wsp., 1995, Biochemistry 34:12820-12829; Petrukhov i wsp., 1996, Biochemistry 35:387-397; Doig i wsp., 1997, Protein Science 6:147-155). Ponadto, pierwszy do 4 aminokwas N-końca i/lub C-końca peptydu rdzeniowego struktury (I) mogą być zastąpione przez fragmenty struktur podobnych do peptydów. Te fragmenty naśladują struktury i/lub właściwości reszt aminokwasowych i reszt koniec-czapeczka. Odpowiednie jednostki naśladujące reszty i segementy koniecczapeczka zostały dobrze poznane i opisane np: Richardson and Richardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper i wsp., 1993, Biochemistry 32 (30):7605-7609; Dasgupta and Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41:499-511; Seale i wsp., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig i wsp., 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou i wsp., 1994, Proteins 18:1-7; Doig and Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert i wsp., 1995, Biochemistry 34:12820-12829; Petrukhov i wsp., 1996, Biochemistry 35:387-397; Doig i wsp., 1997, Protein Science 6:147-155).

Podczas gdy struktura (I) zawiera 18 określonych reszt aminokwasowych, to jest zrozumiałe, że peptydy rdzeniowe wynalazku, mogą zawierać mniej niż 18 aminokwasów. Rzeczywiście, skrócone lub wydeletowane wewnętrznie formy struktury (I) zawierające tak mało jak 14-15 reszt aminokwasowych zasadniczo zachowują całość charakterystyk i właściwości helisy amfipatycznej tworzonej przez peptydy rdzeniowe struktury (I) są również uważane za należące do niniejszego wynalazku.

Skrócone formy peptydów struktury (I) są otrzymywane poprzez delecję jednego lub więcej aminokwasów z N- lub/i C-końca struktury (I). Wewnętrznie wydeletowane formy struktury (I) są otrzymywane poprzez delecję jednego lub więcej aminokwasów pozycji wewnętrznych peptydu o strukturze (I). Wewnętrznie wydeletowane reszty aminokwasowe mogą lub nie w być kolejnymi resztami.

Fachowcy rozpoznają, że usuniecie reszty aminokwasowej ze środka peptydu rdzeniowego struktury(I) spowoduje obrót helisy o 100° w płaszczyźnie hydrofilowo-hydrofobowej w punkcie delecji aminokwasów. Pewne obroty mogą znacząco zmienić właściwości amfipatyczne uzyskanej helisy. W korzystnym wykonaniu wynalazku, reszty aminokwasowe są wydeletowane w ten sposób, że interfejs hydrofobowo-hydrofilowy zasadniczo zachowuje położenie płaszczyzny wdłuż całej długiej osi helisy.

To może być uzyskane poprzez usunięcie określonej liczby reszt aminokwasowych położonych w ciągu lub nie w taki sposób, że usunięty jest jeden pełny helikalny skręt. Idealna α-helisa zawiera 3,6 reszt na skręt. Zatem w korzystnym wykonaniu usuwane są grupy 3-4 reszt aminokwasowych ciągłych lub nie ciągłych. To czy usunięte zostaną 3 aminokwasy czy 4 będzie zależało od pozycji pierwszej reszty w helisie. Specjaliści mają możliwość określenia odpowiedniej liczby reszt aminokwasowych ciągłych lub nie ciągłych stanowiących jeden pełny helikalny skręt od dowolnego określonego punktu startu w amfipatycznej helisie.

Ze względu na przypuszczalną istotną rolę zasadowego zgrupowania, na C końcu peptydów rdzeniowych o strukturze (I), w stabilizowaniu helisy oraz wpływ hydrofobowego zgrupowania na wiązanie lipidów i aktywację LCAT, w korzystnym wykonaniu według wynalazku reszty obejmujące zgrupowanie zasadowe i hydrofobowe nie są usuwane. Zatem, w korzystnym wykonaniu nie są usuwane reszty 14, 16 i 18 (zgrupowanie zasadowe) oraz reszty 3, 6, 9 i 10 (zgrupowanie hydrofobowe).

Peptydy rdzeniowe struktury (I) mogą być także wydłużone na jednym lub obu końcach również porzez wstawienie aminokwasów w środek łańcucha. Takie zmiany nie wpływają znacząco na właściwości i strukturę tych peptydów. Istotnie, wydłużone peptydy rdzeniowe zawierające 19, 20, 21, 22 lub więcej aminokwasów wchodzą w zakres tego wynalazku. Korzystnym jest gdy wydłużone peptydy całościową amfipatyczność i inne właściwości peptydów struktury (I). Oczywiście, jeśli aminokwasy będą wstawiane w środek łańcucha otrzymana struktura będzie miała obrócony interfejs hydrofobowo-hydrofilowy w punkcie insercji w sposób przypominający ten opisany powyżej dla delecji wewnętrznych. A zatem, dyskutowane powyżej rozważania związane z wewnętrznymi delecjami stosują się również do wewnętrznych addycji.

PL 200 744 B1

W jednym z wykonań, peptydy rdzeniowe są wydłużane na N końcu i/lub C końcu poprzez co najmniej jeden skręt helisy. Korzystnie takie wydłużenia będą stabilizowały drugorzędową strukturę helikalną w obecności lipidów tak jak aminokwasy koniec-czapeczka lub segmenty opisane wcześniej.

W szczególnie korzystnym wykonaniu peptyd rdzeniowy o strukturze (I) jest wydłużony na C końcu przez pojedynczą resztę aminokwasu zasadowego, korzystnie Lys (K).

W zakres niniejszego wynalazku wchodzą także tzw. zablokowane formy agonistów ApoA-I, tj. formy agonistów ApoA-I w których N- i/lub C-koniec jest zablokowany resztą zdolną do reagowania z N-końcową NH2 lub C-końcową grupą -C(O)OH. Odkryto, że przez przeniesienie N- i/lub C-końcowych ładunków agonistów ApoA-I wynalazku składających się z 18 lub mniej aminokwasów (przez zsyntetyzowanie N-acylowanych peptydowych amidów/estrów/hydrazydów/alkoholi i ich podstawień) daje agonistów posiadających zbliżoną, a w niektórych wykonaniach nawet przekraczającą, aktywność nie zablokowanych form agonistów, np: podczas gdy peptyd 210 (SEQ ID NO: 210) wykazuje 46% aktywności LCAT, w porównaniu z natywną formą ApoA-I, z N-i C- blokowanymi końcami tego peptydu, peptyd 193 (SEQ ID NO: 193) wykazuje 96% aktywności LCAT, w takiej samej próbie. W niektórych wykonaniach zawierających 22 lub więcej aminokwasów blokowanie N albo C-końca agonistów ApoA-I prowadzi do zmniejszonej aktywności w porównaniu do form niezablokowanych. Jednak zablokowanie obydwu końców agonistów ApoA-I złożonych z 22 aminokwasów prowadzi do odzyskania aktywności. W korzystnych wykonaniach wynalazku, albo N- albo C-koniec (korzystnie oba) są w odniesieniu do peptydów zawierających 18 lub mniej aminokwasów, podczas gdy Ni C-końce peptydów zawierających więcej niż 18 peptydów są oba zablokowane lub oba niezablokowane. Typowe grupy blokujące N koniec obejmują RC(O)-, gdzie R jest grupą H, (C1-C6) alkilową, (C1-C6) alkenylową, (C1-C6) alkinylową, (C5-C20) arylową, (C6-C26) alkarylową, 5-20 członowym heteroarylem lub 6-26 członowym alkheteroarylem. Korzystne grupy blokujące N koniec obejmują grupy acetylowe, formylowe i dansylowe. Typowe grupy blokujące C koniec obejmują -C(O)NRR i -C(O)OR, gdzie każde R jest niezależnie zdefiniowane jak powyżej. Korzystne grupy blokujące C koniec obejmują te gdzie każe R jest niezależną grupą metylową. Choć nie jest to związane z żadną szczególną teorią uważa się, że takie grupy blokujące stabilizują α-helisę w obecności lipidów (patrz np. Venkatachelapathi i wsp., 1993, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 15:349-359).

Natywna struktura ApoA-I zawiera 8 jednostek helikalnych, które prawdopodobnie współdziałają w wiązaniu się do lipidów (Nakagawa i współ., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092; Anantharamaiah i współ., 1985, J. Biol. Chem. 260:10248-10262; Vanloo i współ., 1991, J. Lipid Res. 32:1253-1264; 20 Mendez i współ., 1994, J. Clin. Invest. 94:1698-1705; Palgunari i współ., 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16:328-338; Demoor i współ., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84). Tak wiec również w skład tego wynalazku wchodzą cząsteczki agonistów ApoA-I złożone z dimerów, trimerów, tetramerów a nawet multimerów większego rzędu peptydów rdzeniowych opisanych tutaj. Takie multimery mogą być w formie powtórzeń liniowych, rozgałęzionych sieci lub ich kombinacji.

Peptydy rdzeniowe mogą być przyłączone bezpośrednio jeden do drugiego lub rozdzielone jednym lub dwoma łącznikami. Peptydy rdzeniowe, które tworzą multimery mogą mieć strukturę (I), (II), (III), mogą być analogami struktury (I), (II), (III), zmutowanymi formami struktury (I), (II), (III), skróconymi lub wydłużonymi formami struktury (I), (II), (III) oraz kombinacjami powyższych. Peptydy rdzeniowe mogą być połączone głową do ogona (tj. N-koniec do C-końca), głową do głowy (tj. N-koniec do N-końca) i ogon do ogona (tj. C-koniec do C-końca) lub kombinacje powyższych.

W jednym z wykonań wynalazku, multimery mogą być powtórzeniami tandemowymi 2, 3, 4 do 10 peptydów rdzeniowych. Korzystnie, multimery są tandemowymi powtórzeniami od 2 do 8 peptydów. W jednym wykonaniu wynalazku agoniśći ApoA-I składają się z multimerów mających następujący wzór strukturalny:

(II) HH-[LLm-HH]-nLLm-HH gdzie:

każde m oznacza niezależnie liczbę całkowitą od 0 do 1, korzystnie 1; n jest liczbą całkowitą od 0 do 10 korzystnie od 0 do 8;

każde HH oznacza niezależnie peptyd rdzeniowy lub analog peptydu o strukturze (I), jego wersje zmutowaną, skróconą lub wydłużoną, jak to tutaj opisano;

każde LL oznacza niezależnie łącznik i każde „-„ oznacza niezależnie wiązanie kowalencyjne.

PL 200 744 B1

W strukturze (II) łącznikami mogą być jakiekolwiek dwufunkcyjne cząsteczki zdolne do tworzenia wiązań kowalencyjnych między dwoma peptydami. Dlatego też stosowanymi łącznikami są dwufunkcyjne cząsteczki, w których grupy funkcyjne są zdolne do wiązania kowalencyjnego do N- i/lub C-końca peptydu. Grupy funkcyjne odpowiednie do przyłączania do N lub C końca peptydów są dobrze znane specjalistom i istnieją odpowiednie metody chemiczne wpływające na tworzenie wiązań kowalencyjnych.

Łącznik może być elastyczny, sztywny, półsztywny zależnie od wymaganych właściwości multimetru. Odpowiednie łączniki dotyczą np: Pro lub Gly, lub odcinków peptydowych, w których jest od 2 do około 5, 10, 15, 20 lub nawet więcej aminokwasów, dwufunkcyjnych związków organicznych takich jak H2N(CH2)HCOOH, gdzie n jest liczbą całkowitą od 1 do 12. Przykłady takich łączników jak i metody ich otrzymywania opisano w (Hunig i wsp., 1974, Chem. Ber. 100:3039-3044; Basak i wsp., 1994, Bioconjug. Chem. 5(4):301-305).

W szczególnych wykonaniach wynalazku tandemowe powtórzenia są wewnętrznie przerywane przez resztę prolinową. W tym celu, w przypadkach gdzie peptydy rdzeniowe kończą się na swoich N lub C końcach proliną, tam np. gdzie X1 w strukturze (I) jest Pro (P) lub D-Pro (p), m w strukturze (II) korzystnie jest 0. W tych przypadkach, gdzie peptydy rdzeniowe nie zawierają Proliny na N lub C końcu, LL jest korzystnie Pro (P) lub D-Pro (p) i m jest korzystnie 1.

W niektórych przypadkach wynalazku, może być wymaganym użycie ciętych łączników, co umożliwia uwolnienie jednego lub więcej segmentów helisy (HH) w niektórych warunkach. Odpowiednie cięte łączniki dotyczą peptydów z sekwencjami aminokwasowymi rozpoznawanymi przez proteazy; oligonukleotydy, które są trawione przez endonukleazy oraz związki organiczne cięte drogą chemiczną, np. w warunkach kwaśnych zasadowych, lub innych. Korzystnie warunki rozdzielania będą relatywnie łagodne aby niezdenaturować lub niezdegradować fragmentów helisy i/lub rozgałęzionych łączników, wchodzących w skład multimerycznych agonistów ApoA-I. Łączniki peptydowe i oligonukleotydowe, które mogą być selektywnie cięte, jak również sposoby cięcia łączników są dobrze znane fachowcom. Odpowiednie łączniki-związki organiczne, które mogą być selektywnie cięte będą oczywistymi dla fachowców i obejmują te opisane, na przykład, w: WO 94/08051, jak również zacytowanych tu odniesieniach.

W korzystnym wykonaniu, używane łączniki są peptydami, które stanowią substraty dla endogennie występujących enzymów cyrkularnych, przez co umożliwiają trawienie agonistów ApoA-I in vivo. Endogennie występujące enzymy użyteczne do trawienia łączników obejmują na przykład peptydazę proapolipoproteiny A-I. Odpowiednie enzymy, jak również fragmenty peptydowe, które są substratami dla danych enzymów są dobrze znane specjalistom (patrz, np. Edelstein i współ., 1983, J. Biol. Chem. 258:11430-11433; Zanis, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2574-2578).

Jak wcześniej omawialiśmy, kluczową cechą peptydów rdzeniowych tego wynalazku jest ich zdolność do tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych lub mostków solnych, kiedy są ułożone antyrównolegle. W korzytnym wykonaniu naszego wynalazku łączniki o odpowiedniej długości i ruchliwości są używane po to, ażeby pozwolić segmentom helikalnym (HH) struktury (II) ułożyć się w sposób antyrównoległy i utworzyć wiązania wodorowe lub mostki solne w obecności lipidów.

Łączniki odpowiedniej długości obejmują, ale nie są ograniczone do Pro (P), Gly (G), Cys-Cys, Cys-Cys, H2N-(CH2)n-C(O)OH, gdzie n jest 1 do 12, korzystnie 4 do 6; H2N-aryl-C(O)OH i węglowodany.

Alternatywnie mogą być używane łączniki peptydowe, które odpowiadają w pierwotnej sekwencji segmentom peptydowym łączącym przyległe heliksy w natywnych apolipoproteinach w tym ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE i ApoJ, w celu łączenia peptydów rdzeniowych. Sekwencje te są dobrze znane specjalistom (Rosseneu i współ., Analysis of the Primary and of the Secondary Structure of the Apolipoproteins, W: Structure and Function of Lipoproteins, Ch. 6, 159-183, CRC Press, Inc., 1992).

Inne łączniki, które umożliwiają tworzenie miedzycząsteczkowych wiązań wodorowych lub mostków solnych miedzy powtórzeniami tandemowymi antyrównoległych segmentów helikalnych, obejmują białkowe skręty odwracające takie, jak skręty β i skręty a. Ogólnie skręty odwracające są segmentami białkowymi, które odwracają kierunek łańcucha polipeptydowego tak, że pojedynczy polipeptyd może utworzyć strukturę antyrownoleglej β-kartki lub α-helisy. Skręty β są złożone z 4 reszt aminokwasowych, a skręty a są złożone z 3 reszt aminokwasowych. Konformacja i sekwencja wielu białkowych skrętów β jest dobrze opisana i obejmuje przykładowo typ-I, typ-I', typ-II, typ-II', typ-III, typ-III', typ-IV, typ-V, typ-V, typ-VIa, typ-VIb, typ-VII i typ-VIII (Richardson, 1981, Adv. Protein Chem. 34:167-339; Rose i współ., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmot i współ., 1988, J. Mol. Biol. 20

PL 200 744 B1

203:221-232; Sibanda i współ., 1989, J. Mol. Biol. 206:759-777; Tramontane i współ., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6:382-394).

Specyficzna konformacja krótkich skrętów białkowych, takich jak skręty β zależy przede wszystkim od pozycji pewnych aminokwasów w skręcie, zwykle Gly, Asn lub Pro. Ogólnie typ-I skrętu β może składać się z jakiegokolwiek aminokwasu w pozycjach 1-4 z wyjątkiem, że prolina nie może występować w pozycji 3. Gly występuje w pozycji 4, a Pro występuje głownie w pozycji 2 w typie-I i typie-II skrętów. Asp, Asn, Ser, Cys występują najczęściej w pozycji 1, gdzie ich łańcuchy boczne tworzą często wiązania wodorowe z grupą NH reszty w pozycji 3. W typie-II skrętów Gly i Asn występują najczęściej w pozycji 3, ponieważ najłatwiej mogą przyjąć wymagane kąty wiązań. Idealnie typ-I' skrętów ma Gly w pozycji 2 i 3, a typ-II' skrętów ma Gly w pozycji 2. Typ-III skrętów może zawierać większość aminokwasów, typ-III' skrętów wymaga zwykle Gly w pozycji 2 i 3. Typ-VIa i typ-VIb skrętów zawiera wiązanie peptydowe typu Cis i Pro, jako wewnętrzną resztę. Przegląd rożnych typów β skrętów został opublikowany przez Wilmot i współ., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232.

Konformacja i sekwencja wielu γ skrętów została również dobrze opisana przez specjalistów (Rose i współ., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmer-White 10 i współ., 1987, Trends Biochem. Sci. 12:189-192; Wilmot i współ., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda i współ., 1989, J. Mol. Biol. 206:759-777; Tramontane i współ., 1989, Proteins:Struct. Funct. Genet. 6:382-394). Wszystkie typy β skrętów i y skrętów oraz odpowiadające im sekwencje i struktury, jak również ostatnio odkryte β skręty i y skręty zostały szczegółowo rozważone przez wnioskodawców. Alternatywnie, łącznik (LL) może dotyczyć cząsteczki organicznej lub reszty, która naśladuje strukturę peptydu skrętu -β lub -γ. Takie mimetyki β- lub γ-skrętów jak również metody syntezy peptydów zawierających takie reszty, są dobrze znane fachowcom i obejmują, miedzy innymi, te opisane w Giannis and Kolter, 1993 Angew. Chem. Intl. Ed. Eng. 32:1244-1267; Kahn i wsp.,1988, J. Molecular Recognition 1:75-79; and Kahn i wsp., 1987, Tetrahedron Lett. 28:1623-1626.)

W jeszcze innym wykonaniu według wynalazku multimery występują w formie rozgałęzionej sieci (patrz np. fig. 7). Takie sieci można z łatwością wytwarzać poprzez użycie wielofunkcyjnych cząstek łączących pozwalających na to, że więcej niż dwie helikalne jednostki zostaną przyłączone do prostej cząstki łączącej. Zatem rozgałęzione sieci wykorzystują cząsteczki posiadające trzy, cztery lub więcej grup funkcyjnych zdolnych do kowalencyjnego przyłączania do N i/lub C końca peptydu. Odpowiednie cząstki łączące obejmują przykładowo reszty aminokwasowe posiadające łańcuchy boczne niosące hydroksylowe, sulfanylowe, aminowe, karboksylowe, amidowe i/lub estrowe grupy funkcyjne takie jak przykładowo Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q), Lys (K), Arg (R), Orn, Asp (D) i Glu (E); lub inne cząsteczki organiczne zawierające takie grupy funkcyjne.

Helikalne odcinki dołączone do pojedynczych wiążących podjednostek nie muszą być dołączone na końcach peptydu. W niektórych wykonaniach, helikalne odcinki są dołączone do pojedynczych reszt łączących, tak aby być ułożonymi w formie antyrównoległej, tzn., niektóre z helis są połączone poprzez ich N-koniec, inne zaś przez C-koniec.

Helikalne fragmenty mogą być dołączone bezpośrednio do reszty wiążącej lub mogą być oddzielone przez 1 lub więcej dwufunkcyjnych łączników (LL), tak jak poprzednio opisano.

Odnośnie do fig. 7A i 7B widać, że rozgałęzioną sieć można opisać przeliczywszy na liczbę węzłów jaką zawiera sieć, gdzie każda wielofunkcyjna cząstka łącząca stanowi węzeł. Na fig. 7A i 7B, helikalne segmenty (tzn. peptydy rdzeniowe według wynalazku) są zilustrowane jako cylindry a wielofunkcyjne cząstki łączące (lub węzły) jako kółka (•), gdzie liczba linii wychodzących z kółka wskazuje na rzędowość (lub liczbę grup funkcyjnych) wielofunkcyjnej cząstki łączącej.

Liczba węzłów w sieci będzie ogólnie zależała od całkowitej żądanej liczby helikalnych segmentów i typowo będzie od około 1 do 2. Oczywiście szacuje się, że dla danej liczby żądanych helikalnych segmentów, sieci posiadające cząstki łączące wyższego rzędu będą posiadały mniej węzłów. Przykładowo, w odniesieniu do fig. 7A i 7B, trzeciorzędowa sieć (tzn. sieć posiadająca trifunkcyjne cząstki łączące) złożona z siedmiu helikalnych jednostek ma trzy węzły (fig. 7A), podczas gdy czwartorzędowa sieć (tzn. sieć posiadająca tetrafunkcyjne cząstki łączące) złożona z siedmiu helikalnych jednostek ma tylko dwa węzły (fig. 7B).

Boczne sieci mogą tworzyć jednolitą strukturę, np: odgałęzienia, w których wszystkie węzły przykładowo są trifunkcyjnymi lub tetrafunkcyjnymi resztami łączącymi lub mogą być mieszane. Jest zrozumiałym, że nawet w sieciach o jednolitej rzędowości cząstki łączące nie muszą być identyczne. Trzeciorzędowa sieć może wykorzystywać przykładowo dwie, trzy cztery a nawet więcej różnych trifunkcyjnych cząstek łączących.

PL 200 744 B1

Jak w linearnych multimerach helikalne segmenty składające się z rozgałęzionych sieci mogą lecz nie muszą być identyczne.

Przykładem takiej mieszanej struktury jest przedstawiony na fig. 7. Na fig. 7C helikalne segmenty (tzn. peptydy rdzeniowe według wynalazku) są przedstawione jako cylindry a wielofunkcyjne cząstki łączące jako kółka (•), gdzie liczba linii wychodzących z kółka wskazuje na rzędowość (lub liczbę grup funkcyjnych) wielofunkcyjnej cząstki łączącej. Linie łączące helikalne segmenty reprezentują bifunkcyjne łączniki LL, jak opisano wcześniej. Helikalne segmenty obejmujące rozgałęzione sieci mogą być tandemowymi powtórzeniami peptydów rdzeniowych, jak opisano wcześniej.

W jednym ilustrującym wykonaniu rozga łęzione sieci według wynalazku są opisane wzorem:

(III) X - Nya - X(ya-1) (Nyb - Xyb-1))p gdzie:

każdy X jest niezależnie HH - (LLm-HH) - nLLm - HH;

każdy HH jest niezależnie peptydem rdzeniowym struktory (I) lub opisaną tutaj formą zmutowaną, skróconą, wewnętrznie wydeletowaną lub wydłużoną; każdy LL jest niezależnie dwufunkcjonalnym łącznikiem; każdy m jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 1; każdy n jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 8;

Nya i Nyb są każdy niezależnie wielofunkcyjną cząstką łączącą gdzie ya i yb reprezentują liczbę grup funkcyjnych odpowiednio na Nya i Nyb;

każdy ya czy yb jest niezależnie liczbą całkowitą od 3 do 8;

p jest liczbą cał kowitą od 0 do 7; oraz każdy - niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.

W korzystnym wykonaniu, rozgałęziona sieć obejmuje Lys-drzewko, tzn. sieć gdzie wielofunkcyjną cząstką łączącą jest jedna lub więcej reszt Lys (K) (patrz np. fig. 7D).

W jednym ilustrującym wykonaniu rozgałęzione sieci Lys-drzewko według wynalazku są opisane wzorami:

gdzie:

każdy X jest niezależnie HH - (LLm-HH) nLLm - HH;

każdy HH jest niezależnie peptydem rdzeniowym lub analogiem peptydu struktury (I) lub opisaną tutaj formą zmutowaną, skróconą, wewnętrznie wydeletowaną lub wydłużoną; każdy LL jest niezależnie dwufunkcjonalnym łącznikiem; każdy m jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 1; każdy n jest niezależnie liczbą całkowitą od 0 do 8;

R1 jest -OR lub NRR; oraz każde R jest niezależnie grupą -H, (C1-C6) alkilową, (C1-C6) alkenylową, (C1-C6) alkinylową, (C5-C20) arylową, (C6-C26) alkarylową, 5-20 członkiem heteroarylowym lub 6-26 członkiem alkheteroarylowym.

5.1.1. Analizy struktury i funkcji

Struktura i funkcja peptydów rdzeniowych lub analogów peptydowych wynalazku, jak również agonistów ApoA-I złożonych z takich peptydów rdzeniowych, w tym opisanych powyżej multimerycznych form może być testowana w celu selekcji aktywnych agonistów naśladujących ApoA-I. Na przyPL 200 744 B1 kład, peptydy rdzeniowe lub analogi peptydowe mogą być testowane pod względem ich zdolności do tworzenia α-helisy w obecności lipidów, tworzenia kompleksów z lipidami, aktywacji LCAT, sprzyjania wypływowi cholesterolu, itd.

Sposoby i testy analizujące strukturę i/lub funkcję peptydów są dobrze znane fachowcom. Korzystne sposoby są przedstawione na roboczych przykładach. Na przykład dichroizm kołowy (CD) i magnetyczny rezonans jądrowy opisane w Rozdziale 7, poniżej, mogą być zastosowane do analizy struktury peptydów lub analogów peptydów - w szczególności stopnia helikalności w obecności lipidów. Zdolność do wiązania lipidów może być określona stosując spektroskopię fluorescencyjną opisaną w Rożdziale 7, poniżej. Zdolność peptydów i/lub analogów peptydów do aktywacji LCAT może być łatwo określona stosując aktywację LCAT opisaną w Rozdziale 8, poniżej. Testy in vitro i in vivo opisane w Rozdziałach 9, 10 i 11, poniżej, mogą być zastosowane do określenia czasu półtrwania, dystrybucji, wypływu cholesterolu i wpływu na RCT. Generalnie, peptydy rdzeniowe i/lub analogi peptydów według wynalazku, wykazujące właściwości zebrane w tabeli IV, poniżej, są uważane za aktywne.

T a b e l a IV

Właściwości aktywnych peptydów

Właściwości	Zakres	Korzystny zakres
% helikalności w obecności lipidów (R, =30) (niezablokowane 22-aminokwasowe reszty peptydowe)	> 60%	> 80%
% helikalności w obecności lipidów (Ri =30) (niezablokowane 18-aminokwasowe reszty peptydowe)	> 40%	> 60%
% helikalności w obecności lipidów (Ri =30) (niezablokowane 18-aminokwasowe reszty peptydowe i krótsze peptydowe)	> 60%	> 80%
Wiązanie lipidów (w obecności SUV)	0.5-10 pM peptyd Ri =1-50
Aktywacja LCAT	> 38%	> 80%

RI oznacza stosunek molarny lipidipeptyd.

Jak pokazano na roboczych przykładach, poniżej, peptydy rdzeniowe = które wykazują wysoki stopień aktywacji LCAT (> 38%) ogólnie posiadają znaczącą strukturę α-helikalną w obecności małych lipidowych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV) (60% struktury helikalnej w przypadku niezablokowanych peptydów zawierających 22 lub więcej reszt aminokwasowych i zablokowanych peptydów zawierających 18 lub mniej reszt aminokwasowych; > 40% struktury w przypadku niezablokowanych peptydów zawierających 18 lub mniej aminokwasów). Natomiast peptydy mające niewiele lub brak aktywności LCAT mają niewielką strukturę α-helikalną. Jednakże, w pewnych sytuacjach peptydy wykazujące znaczącą strukturę helikalną w obecności lipidów nie wykazują znaczącej aktywacji LCAT.

Podobnie, podczas gdy peptydy rdzeniowe, które wykazują znaczącą aktywację LCAT zazwyczaj wiążą lipidy, w pewnych sytuacjach peptydy, które wykazują wiązanie lipidów nie wpływają znacząco na aktywność LCAT.

W konsekwencji, widocznym dla fachowców jest, że opisana tutaj krytyczna dla aktywności zdolność peptydów rdzeniowych do tworzenia α-helis (w obecności lipidów) i wiązania lipidów w wielu przypadkach może okazać się niewystarczająca.

W korzystnym wykonaniu peptydy rdzenia wynalazku są poddawane serii testów w celu selekcji peptydów wykazujących znaczącą aktywność farmakologiczną.

W pierwszym etapie, peptyd rdzeniowy jest badany pod względem zdolności do tworzenia α-helisy w obecności lipidów z zastosowaniem testu CD opisanego w Rozdziale 7, poniżej. Peptydy, które są helikalne przynajmniej w 40% (niezablokowane peptydy zawierające 18 lub mniej reszt aminokwasowych) lub w 60% (niezablokowane peptydy zawierające 18 lub mniej reszt aminokwasowych; niezablokowane peptydy zawierające 22 lub więcej reszt aminokwasowych) w obecności lipidów (przy st. około 5 pM i stosunku molowym lipidy:peptydy około 30) są testowane na ich zdolność do wiązania lipidów z zastosowaniem testów fluorescencji opisywanych w Rozdziale 7, poniżej. Oczywiście, jedynie te peptydy rdzeniowe, które zawierają fluorescencyjne reszty Trp (W) lub Nal są testowane na wiązanie lipidów drogą fluorescencji. Jednakże, dla peptydów nie zawierających reszt fluorescencyjnych, wiązanie lipidów staje się oczywiste, jeśli helikalność wzrasta w obecności lipidów.

PL 200 744 B1

Peptydy rdzeniowe, które wykazują wiązanie lipidów w obecności SUV (0.5-10 μΜ peptyd stosunek molowy lipid:peptyd w zakresie od 1 do 50) są następnie testowane na aktywność farmakologiczną. Oczywiście przeszukiwanie na aktywność farmakologiczną będzie zależało od pożądanego użycia agonistów ApoA-I. W wybranym wykonaniu, peptydy rdzeniowe są testowane na ich zdolność do aktywacji LCAT, jako że peptydy aktywujące LCAT są szczególnie przydatne w opisanych poniżej metodach. Korzystne są peptydy rdzeniowe, które wykazują co najmniej 38% aktywacji LCAT, w porównaniu do natywnej ludzkiej ApoA-I (jak określono stosując test aktywacji LCAT opisany w Rozdziale 8, poniżej.), ze szczególnie korzystnymi peptydami rdzeniowymi wykazującymi 50%, 60%, 70%, 80% lub nawet 90% aktywności.

5.1.2. Korzystne postaci wynalazku

Agoniści ApoA-I mogą być następująco zdefiniowani w korzystnych wykonaniach.

W jednym z korzystnych wykonań, agoniści ApoA-I są peptydami o 18 resztach aminokwasowych zgodnych ze strukturą (I), lub ich formami acetylowanymi na N końcu i/lub amidowanymi lub estryfikowanymi na C końcu.

W innym korzystnym wykonaniu agonistami ApoA-I są peptydy o 18 resztach aminokwasowych zgodne ze strukturą (I), lub ich formy acetylowane na N końcu i/lub amidowane lub estryfikowane na C końcu, w których:

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X7 oznacza Arg (R), Lys (K) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X11 oznacza Glu (E) lub Asn (N);

X12 oznacza Glu (E);

X14 oznacza Arg (R), Lys (K), Orn lub Leu (L);

X16 oznacza Arg (R), Lys (K) lub Orn; lub/i

X18 oznacza Arg (R), Lys (K) lub Orn, i

X1, X3, X5, X6, X9, X10, X13, X15 i X17 zostały wcześniej zdefiniowane dla struktury (I).

W kolejnym korzystnym wykonaniu, agoniści ApoA-I są 18 aminokwasowymi peptydami zgodnymi ze strukturą (I) lub jej formami N-końcowo acylowanymi i/lub C-końcowo amidowanymi lub estryfikowanymi, w których jeśli X11 oznacza Asn (N) to X14 oznacza Leu (L); jeśli X11 oznacza aminokwas innych niż (N), to X14 oznacza aminokwas inny niż Leu (L). Szczególnie korzystnymi wykonaniami zgodnie z tym aspektem wynalazku są te peptydy lub ich formy N-końcowo acylowane i/lub C-końcowo amidowane lub estryfikowane, w których różne Xn. Przykładowo, korzystnym peptydem wynalazku jest peptyd 209 (PVLDLFRELLNELLQKLK; SEQ ID NO:209), i jego formy N-końcowo acylowane i/lub C-końcowo amidowane lub estryfikowane.

W kolejnych wybranych wykonaniach, agoniści ApoA-I są zmienionymi lub zmutowanymi formami peptydów zgodnymi ze strukturą (I), lub ich formami N-końcowo acylowanymi i/lub C-końcowo amidowymi lub estryfikowanymi w których

X1 oznacza inny niż Asp (D);

X9 oznacza inny niż Gly (G);

X10 oznacza inny niż Gly (G);

X12 oznacza inny niż Leu (L); i

X13 oznacza inny niż Gly (G).

W kolejnym wykonaniu agoniści ApoA-I są wybrani z grupy peptydów przedstawionych poniżej:

peptyd 191 PVLDLLRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO: 191) peptyd 192 PVLDLFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO: 192) peptyd 193 PVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO: 193) peptyd 194 PVLELFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO: 194) peptyd 195 PVLELFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO: 195) peptyd 196 PVLDLFRELLEELKNKLK* (SEQ ID NO:196) peptyd 197 PLLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:197) peptyd 198 GVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:198) peptyd 199 PVLDLFRELWEELKQKLK* (SEQ ID NO:199) peptyd 200 NVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:200) peptyd 201 PLLDLFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO: 201) peptyd 202 PALELFKDLLEELRQKLR* (SEQ ID NO:202)

PL 200 744 B1 peptyd 203 peptyd 204 peptyd 205 peptyd 206 peptyd 207 peptyd 208 peptyd 209 peptyd 210 peptyd 211 peptyd 212 peptyd 213 peptyd 214 peptyd 215 peptyd 229 peptyd 230 peptyd 231

AVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:203) PVLDFFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:204) PVLDLFREWLEELKQKLK* (SEQ ID NO:205) PLLELLKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:206) PVLELLKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:207) PALELFKDLLEELRQRLK* (SEQ ID NO:208) PVLDLFRELLNELLQKLK (SEQ ID NO:209) PVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:210) PVLDLFRELLEELOQOLO* (SEQ ID NO:211) PVLDLFOELLEELOQOLK* (SEQ ID NO:212) PALELFKDLLEEFRQRLK* (SEQ ID NO:213) pVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO: 214) PVLDLFRELLEEWKQKLK* (SEQ ID NO:215) PVLELFERLLEDLQKKLK (SEQ ID NO:229) PVLDLFRELLEKLEQKLK (SEQ ID NO:230) PLLELFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:231) zarówno w formach z zablokowanym lub niezablokowanym C i/lub N-końcem.

W innym wybranym wykonaniu, agoniści ApoA-I są wybrani z grupy peptydów przedstawionych poniżej:

peptyd 191 peptyd 192 peptyd 193 peptyd 194 peptyd 195 peptyd 196 peptyd 197 peptyd 198 peptyd 199 peptyd 200 peptyd 201 peptyd 202 peptyd 203 peptyd 204 peptyd 205 peptyd 206 peptyd 207 peptyd 208 peptyd 209 peptyd 210 peptyd 211 peptyd 213 peptyd 214 peptyd 215 peptyd 229 peptyd 230 peptyd 231

PVLDLLRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:191) PVLDLFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:192) PVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:193) PVLELFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:194) PVLELFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:195) PVLDLFRELLEELKNKLK* (SEQ ID NO:196) PLLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:197) GVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:198) PVLDLFRELWEELKQKLK* (SEQ ID NO:199) NVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:200) PLLDLFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:201) PALELFKDLLEELRQKLR* (SEQ ID NO:202) AVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:203) PVLDFFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:204) PVLDLFREWLEELKQKLK* (SEQ ID NO:205) PLLELLKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:206) PVLELLKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:207) PALELFKDLLEELRQRLK* (SEQ ID NO:208) PVLDLFRELLNELLQKLK (SEQ ID NO:209) PVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ ID NO:210) PVLDLFOELLEELOQOLK* (SEQ ID NO:212) PALELFKDLLEEFRQRLK* (SEQ ID NO:213) pVLDLFRELLEELKQKLK* (SEQ ID NO: 214) PVLDLFRELLEEWKQKLK* (SEQ ID NO:215) PVLELFERLLEDLQKKLK (SEQ ID NO:229) PVLDLFRELLEKLEQKLK (SEQ ID NO:230) PLLELFKELLEELKQKLK* (SEQ ID NO:231) zarówno w formach z zablokowanym lub niezablokowanym C i/lub N-końcem.

W kolejnym korzystnym wykonaniu, agoniści ApoA-I są multimerycznymi formami zgodnie ze strukturą II, III i/lub r IV w kórych każde HH jest niezależnym peptydem zgodnie ze strukturą (I) lub jego formami N-końcowo acylowanymi i/lub C-końcowo amidowanymi lub estryfikowanymi, lub jakimkolwiek z korzystnych peptydów zgodnym z opisywaną tutaj strukturą (I).

W kolejnym korzystnym wykonaniu, peptydy rdzeniowe tworzące agonistów ApoA-I nie są żadnym z następujących peptydów:

Peptyd75: PVLDEFREKLNEELEALKQKLK peptyd 94: PVLDEFREKLNEALEALKQKLK peptyd 109: PVLDEFREKLNERLEALKQKLK (SEQ ID NO:75); (SEQ ID NO:94); (SEQ ID NO:109);

PL 200 744 B1 peptyd 237 peptyd 238 peptyd 241 peptyd 242 peptyd 243 peptyd 244 peptyd 245 peptyd 246 peptyd 247 peptyd 248 peptyd 249 peptyd 250 peptyd 251

LDDLLQKWAEAFNQLLKK

EWLKAFYEKVLEKLKELF*

DWFKAFYDKVFEKFKEFF

GIKKFLGSIWKFIKAPVG

DWFKAFYDKVAEKFKEAF

DWLKAFYDKVAEKLKEAF

DWLKAFYDKVFEKFKEFF

EWLEAFYKKVLEKLKELF

DWFKAFYDKFFEKFKEFF

EWLKAFYEKVLEKLKELF

EWLKAEYEKVEEKLKELF*

EWLKAEYEKVLEKLKELF*

EWLKAFYKKVLEKLKELF* (SEQ ID NO:237); (SEQ ID NO:238); (SEQ ID NO:241); (SEQ ID NO:242);. (SEQ ID NO: 243); (SEQ ID NO:244); (SEQ ID NO:245); (SEQ ID NO:246); (SEQ ID NO:247) (SEQ ID NO:248); (SEQ ID NO:249); (SEQ ID NO:250); (SEQ ID NO:251).

W ostatecznie korzystnym wykonaniu, agoniści ApoA-I nie są żadnym z peptydów przedstawionych w tabeli X (Rozdział 8.3, poniżej), wykazujących aktywację LCAT poniżej 38% w porównaniu do natywnek ApoA-I.

5.2. Synteza i oczyszczanie agonistów peptydowych ApoA-I.

Peptydy rdzeniowe wynalazku mogą być przygotowane stosując niemal którąkolwiek ze znanych fachowcom technik przygotowywania peptydów. Na przykład, peptydy mogą być przygotowane stosując konwencjonalne stopniowe rozpuszczanie lub syntezę na fazie stałej bądź technikami rekombinacyjnymi DNA.

5.2.1. Syntezy chemiczne

Peptydy rdzeniowe mogą być przygotowane stosując konwencjonalne stopniowe rozpuszczanie lub syntezę w fazie stałej (patrz, np. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams i wsp., Eds., 1997, CRC Press, Boca Raton Florida, i zacytowane tutaj odnośniki; Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., 1989, IRL Press, Oxford, England, i zacytowane tutaj odnośniki).

Alternatywnie, peptydy wynalazku mogą być przygotowane drogą kondensacji segmentów, jak opisano, na przykład, w Liu i wsp., 1996, Tetrahedron Lett. 37(7):933-936; Baca, i wsp., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:1881-1887; Tarn i wsp., 1995, Int. J. Peptide Protein Res. 45:209-216; Schnolzer and Kent. 1992, Science 256:221-225; Liu and Tarn, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116 (10):4149-4153; Liu and Tarn, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6584-6588; Yamashiro and Li, 1988, Int. J. Peptide Protein Res. 31:322-334). Kondensacja segmentów jest szczególnie skuteczną metodą syntezy przykładów zawierających wewnętrzne reszty glicyny. Inne metody użyteczne do syntezy peptydów wynalazku są opisane w Nakagawa i wsp., 1985. J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092.

Agoniści ApoA-I zawierający N-końcowe lub/i C-końcowe grupy blokujące mogą być przygotowani stosując standardowe techniki chemii organicznej. Na przykład, metody acylacji N-końca peptydu lub amidacji lub estryfikacji C-końca są dobrze znane fachowcom. Sposoby wprowadzania modyfikacji na N- i/lub C-końcu staną się widoczne dla fachowców, podobnie jak sposoby zabezpieczania funkcjonalności łańcuchów bocznych, co może być koniecznym do przyłączania terminalnych grup blokujących.

Farmaceutycznie dopuszczalne sole (przeciwjony) mogą być wygodnie przygotowane drogą chromatografii jonowymiennej lub innymi metodami znanymi fachowcom.

Związki wynalazku, mające formę tandemowych multimerów mogą być wygodnie zsyntetyzowane poprzez dodanie łącznika (ów) do łańcucha peptydowego w odpowiednim etapie syntezy. Alternatywnie, helikalne segmenty mogą być zsyntetyzowane a każdy fragment oddziałuje z łącznikiem. Oczywiście faktyczna metoda syntezy będzie zależała od składu łącznika. Odpowiednie schematy ochrony i chemikalia są znane i oczywiste fachowcom.

Związki wynalazku, mające formę rozgałęzionych sieci mogą być łatwo syntetyzowane stosując timeryczne i tetrameryczne nośniki i chemikalia opisane w Tam, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5409-5413 i Demoor i wsp., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84. Modyfikowanie syntetycznych nośników i strategie syntezy rozgałęzionych sieci wyższego lub niższego rzędu, lub tych zawierających kombinacje różnych helikalnych segmentów peptydów rdzeniowych, są w obrębie możliwości fachowców w chemii peptydów i/lub chemii organicznej.

Tworzenie wymaganych mostków dwusiarczkowych jest generalnie przeprowadzane w obecności łagodnych środków utleniających. Do otrzymania tych wiązań zastosowane mogą być chemiczPL 200 744 B1 ne środki utleniające lub związki są po prostu wystawiane na działanie atmosferycznego tlenu. Fachowcom znane są różne metody, w tym te opisane przez Tarn i wsp., 1979, Synthesis 955-957; Stewart i wsp., 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d Ed., Pierce Chemical Company Rockford, IL; Ahmed i wsp., 35 1975, J. Biol. Chem. 250:8477-8482; and Pennington i wsp., 1991 Peptides 1990 164-166, Giralt and Andreu, Eds., ESCOM Leiden, The Netherlands. Dodatkową alternatywą jest opisywana przez Kamber i wsp., 1980, Helv. Chim. Acta 63:899-915. Metoda przeprowadzana na stałych nośnikach jest opisana przez Albericio, 1985. Int. J. Peptide Protein Res. 26:92-97. Którakolwiek z tych metod może być zastosowana do tworzenia mostków dwusiarczkowych w peptydach według wynalazku.

5.2.2 Synteza rekombinantów

Jeżeli peptydy są złożone wyłącznie z aminokwasów zakodowanych w genie, lub część peptydu jest w nim zapisana to peptyd lub jego fragment może być zsyntetyzowany za pomocą konwencjonalnych technik rekombinacji używanych w inżynierii genetycznej.

W produkcji rekombinantów sekwencje kodujące odpowiedni peptyd są włączane do odpowiedniego nośnika ekspresji, tzn. wektora zawierającego elementy konieczne do jego transkrypcji i translacji lub w wypadku wektora wirusowego zawierającego RNA elementy konieczne do jego replikacji i translacji. Następnym krokiem jest transfekcja nośnika informacji do odpowiednich komórek docelowych, w których będzie zachodzić ekspresja peptydu. W zależności od użytego systemu ekspresji, syntetyzowany peptyd jest następnie izolowany dobrze znanymi metodami. Metody dla rekombinacji białek i produkcji peptydów są dobrze znane fachowcom (patrz np. Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. i Ausubel i wsp.,1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assciates and Wiley Interscience, N.Y. każdy z nich jest zamieszczony w całości poprzez odniesienia).

Celem zwiększenia produkcji, polinukleotydy mogą być zaprojektowane jako kodujące wielokrotne jednostki peptydów rozdzielonych enzymatycznie ciętymi miejscami - zarówno jako homopolimery (powtarzające się jednostki peptydów) jak i heteropolimery (różne peptydy złączone razem). W rezultacie polipetydy mogą być cięte (np. przez traktowanie odpowiednim enzymem) w celu oddzielenia poszczególnych jednostek peptydowych, w efekcie powodując wzrost ilości peptydów, których synteza jest inicjowana z pojedynczego promotora. W korzystnym wykonaniu polinukleotydowe fragmenty policystronowe mogą być tak zaprojektowane, że pojedynczy ulegający transkrypcji mRNA ma zakodowane peptydy wielokrotne (tj, homopolimery bądź heteropolimery), każdy kodujący region jest obowiązkowo połączony z sekwencją niezależną od „czapeczki np. wewnętrznym rybosomalnym miejscem inicjacji (IRES). Użyty w odpowiednim wirusowym systemie ekspresji każdy peptyd kodowany przez mRNA jest bezpośrednio przekształcany w transkrypt np. przez IRES. Takie policystronowe konstrukty kierują transkrypcją pojedynczych, dużych policystronowych mRNA które następnie kierują translacją wielokrotnych indywidualnych peptydów. Takie podejście eliminuje konieczność enzymatycznego obrabiania poliprotein i może znacząco podwyższyć wydajność syntezy peptydów inicjowanej z jednego promotora.

Różnorodność organizmów gospodarza, w których zachodzi ekspresja peptydów została tu opisana. Obejmują one między innymi mikroorganizmy takie jak bakterie transformowane bakteriofagiem o zrekombinowanym DNA lub plazmidem wektorów ekspresyjnych DNA zawierających odpowiednio zakodowane sekwencje; drożdże, grzyby pleśniowe transformowane zrekombinowanyni wektorami drożdży zawierającymi wstawione sekwencje; systemów komórek owadów zainfekowanych zrekombinowanymi wektorami wirusowymi - (np. bakulowirus) zawierającymi odpowiednie sekwencje kodujące; komórki roślinne zainfekowane odpowiednio zrekombinowanym wirusem użytym jako wektor (np. wirus mozaiki tytoniowej lub wirus mozaiki kalafiora) czy transformowane zrekombinowanymi plazmidami-wektorami ekspresyjnymi zawierającymi odpowiednie sekwencje kodujące (np. Ti plazmid); lub komórki zwierzęce.

Różnorodność organizmów, w których może zachodzić ekspresja sprawia, że przy doborze układu wektor-gospodarz należy uwzględnić odpowiednie elementy dla transkrypcji i translacji, włączając promotory konstytutywne lub indukowane. Przykładowo w wypadku klonowania w komórkach bakteryjnych jako promotów używa się promotora indukowalnego pL bakteriofaga λ plac, ptrp, ptac, (promotor hybrydowy ptrplac) i wielu innych. Kiedy klonuje się w systemach komórek owadzich jako promotora należy użyć promotora polihedronowego bakulowirusa; kiedy klonuje się w systemach komórek roślinnych można użyć promotory pochodzące z genomu komórek roślinnych (np. promotory szoku cieplnego; promotor małej podjednostki RUBISCO; promotor białka wiążącego chlorofil a/b) lub

PL 200 744 B1 z wirusów roślinnych (np. promotor 35S RNA z CaMV; promotor białka otoczki TMV); kiedy klonuje się w systemach komórek ssaków można zastosować promotory pochodzące z genomu komórek ssaków (np. promotor metalotioniny) lub wirusów ssaków (np. późny promotor adenowirusa; promotor 7.5 K wirusa vaccinii). Kiedy wytwarzane są linie komórkowe zawierające wiele kopii produktu ekspresji, można zastosować wektory oparte na SV40, BPV i EBV posiadające odpowiedni marker selekcyjny.

W wypadku użycia jako wektorów komórek roślinnych ekspresja sekwencji kodujących peptydy może zachodzić z dużej liczby promotorów. Przykładowo, można użyć wirusowych promotów takich jak 35S RNA i 19S RNA oraz CaMV (Brisson i wsp., 1984, Nature 310: 511-514) lub promotora białek otoczki TMV (Takamatsu et. Al.,1987 EMBO J. 6: 307-311). Alternatywnie stosuje się roślinne promotory takie jak promotory małej podjednostki RUBISCO (Coruzzi i wsp., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie i wsp., 1984, Science 224:838-843) lub szoku cieplnego np. soji hsp17.5-E lub hsp17.3-B (Gurley i wsp., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565). Konstrukty te można wprowadzać do komórek roślinnych przy użyciu plazmidów Ti, plazmidów Ri, wirusowych wektorów roślinnych, poprzez bezpośrednią transformację, mikroinjekcję, elektroporacje itp. Dla przeglądu technik patrz np. Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sekcja VIII, str. 421-463; oraz Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2-gie Wyd., Blackie, London Rozdz. 7-9.

W owadzim systemie ekspresyjnym, który można zastosować do wytwarzania peptydów według wynalazku, jako wektor do ekspresji obcych genów zastosowano wirus jądrowej polihydrozy Autographa californica (AcNPV). Wirus namnaża się w komórkach Spodoptera frugiperda. Sekwencję kodującą można klonować w regionach nieistotnych (przykładowo genu polihedronu) dla wirusa i wprowadzać pod kontrolę promotora AcNPV (przykładowo promotora polihedronu). Skuteczne wprowadzenie sekwencji kodującej pozwoli na inaktywację genu polihedronu i wytwarzanie zrekombinowanych nie opłaszczonych wirusów (tzn. wirusów, które nie posiadają białkowego płaszcza kodowanego przez gen polihedronu). Takie zrekombinowane wirusy są następnie używane do infekcji komórek Spodoptera frugiperda, w których wprowadzony gen ulega ekspresji (np. patrz Smith i wsp., 1983, J. Virol. 46:584; Smith patent USA nr 4215051). Dalsze przykłady takich systemów ekspresyjnych można znaleźć w Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, Ausubel i wsp., wyd., Green Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

Szereg opartych na wirusach systemów ekspresyjnych można wykorzystywać w komórkach ssaczych. W przypadku użycia adenowirusa jako wektora ekspresyjnego sekwencja kodująca jest ligowana z kompleksem kontrolującym transkrypcję/translację adenowirusa, np. późnym promotorem i trzyczęściową sekwencją liderową. Taki chimerowy gen można wprowadzić do genomu adenowirusa poprzez rekombinację in vitro i in vivo. Insercja w regionie nie istotnym dla genomu wirusa (np. region E1 lub E3) powoduje powstanie zrekombinowanego wirusa zdolnego do życia i ekspresji peptydu w zainfekowanych komórkach gospodarza, (np. patrz Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659. Alternatywnie, można użyć promotor 7.5 K vaccinii (patrz, np. Mackett i wsp., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackett i wsp., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali i wsp., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931).

Inne systemy ekspresyjne produkujące peptydy wynalazku będą oczywiste dla fachowców.

5.2.3. Oczyszczania peptydów

Peptydy według wynalazku mogą być oczyszczane za pomocą znanych technik rozdziału takich jak odwrotnofazowa wysoko-ciśnieniowa cieczowa chromatografia (HPLC), chromatografia jonowymienna, elektroforeza na żelu, chromatografia powinowactwa i innych. Rodzaj techniki użytej do rozdziału będzie zależał od strategii użytej do syntezy peptydu i czynników takich jak ładunek całościowy peptydu, hydrofobowość hydrofilowość itp. i będą oczywiste dla fachowców. Rozgałęzione peptydy mogą być oczyszczane z zastosowaniem wymienników jonowych lub poprzez sączenie molekularne.

W oczyszczaniu poprzez chromatografię powinowactwa można zastosować dowolne przeciwciało swoiście wiążące peptyd. Do produkcji przeciwciał immunizuje się, poprzez wstrzyknięcie peptydu, różnych gospodarzy zwierzęcych między innymi króliki, myszy, szczury itp. Peptyd można przyłączyć do odpowiedniego nośnika takiego jak BSA poprzez grupę funkcyjną łańcucha bocznego lub przyłączenie łącznika do grupy funkcyjnej łańcucha bocznego. Dla wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej, w zależności od rodzaju gospodarza, można stosować różnego rodzaju adjuwanty między innymi odczynnik Freunda (kompletnego lub nie), żele mineralne takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne jak lizolektyna, niejonowe poliole, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocjaninę skałoczepa, dinitrofenol i potencjalnie przydatne adjuwanty ludzkie takie jak BCG (bacilli Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum.

PL 200 744 B1

Monoklonalne przeciwciała jako mogą być wytwarzane jako produkty w ciągłej hodowli linii komórkowej. Obejmują one między innymi technikę hodowli hybrydom opisaną pierwotnie przez Kohler and Miltsen, 1975, Nature 256 : 495-497 czy przez Kaprowskiego, Patent U.S.A nr 4,376,110 które są tu zamieszczone poprzez odniesienia, technikami fuzji ludzkich komórek B, Kosbor i wsp., 1983, Immunology Today 4;72 Cote i wsp., 1983 Proc Natl. Acad. Sci (USA) 80; 20026-2030; technikami fuzji EBV- hybryda (Cote i wsp.,1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Teraphy, Alan R. Liss Inc., pp.77-96 (1985). Dodatkowe techniki używane do różnicowania produkcji chimerycznych przeciwciał zostały opisane przez Morrisona i wsp., 1984 1983 Proc Natl. Acad. Sci (USA) 81;6851-6855; Neuberger i wsp., 1984, Nature 312:604-608; Takeda i wsp.,1985, Nature 314:452-454, Patent Boss U.S.A. nr 4,816,397; Cabilly, U.S. Patent No. 4,816,567; które zostały zamieszczone w odniesieniach) przez cięcie genów kodujących mysie przeciwciała i połączenie ich z odpowiednimi genami ludzkich przeciwciał można uzyskać aktywne przeciwciała zwane przeciwciałami prawie ludzkimi lub uczłowieczonymi (zobacz Queen Patent U.S.A nr 5,585,089) wraz z odpowiednimi odniesieniami. Opisane zostały alternatywne techniki do produkcji pojedynczych łańcuchów przeciwciał (Patent U.S.A. nr 4,946,778) i mogą być użyte do produkcji peptydów specyficznych dla pojedynczych łańcuchów przeciwciał.

Fragmenty przeciwciał zawierające specyficznie wbudowane sekwencje powstają w oparciu o znane techniki. Przykładowo fragmenty wbudowane do fragmentów F(ab')2 ale nie tylko powstają w wyniku trawienia przeciwciał przez pepsynę która rozcina mostki siarkowe łączące fragmenty F(ab')2. Alternatywna ekspresja z fragmentów Fab powoduje uwolnienie konstruktów (Huse i wsp., 1989 Science 246:1275-1281) łatwa szybka i identyfikacja monoklonanlnych fragmentów Fab posiadających fragmenty ze specyficznie wbudowanym peptydem.

Przeciwciała lub fragmenty przeciwciał specyficzne dla peptydów mogą być wiązane przez agarozę a kompleks agaroza-przeciwciało wykorzystany w immunochromatografii do oczyszczania peptydów wynalazku. Zobacz Scopes, 1984, Protein Puryfication: Principles and Practice, Springer-Verlag New York Inc., NY, Livingstone, 1974, Metods in Enzymology:Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723-731.

5.3. Kompozycie farmaceutyczne i sposoby podawania

Agoniści ApoA-I wynalazku, mogą być używani w leczeniu chorób, zwłaszcza chorób zwierzęcych, głównie ssaczych, łącznie z ludźmi, dla których obserwuje się wzrost koncentracji HDL w surowicy, aktywację LCAT, i zwiększenie wpływu cholesterolu i RCT. Te stany obejmują, ale nie są ograniczone do hiperlipidemii, jak również hipercholesterolonemii i choroby sercowo-naczyniowej, (włączając leczenie i zapobieganie miażdżycy tętnic); restenozy (np. zapobieganie i leczenie płytek miażdżycowych rozwijających się w następstwie angioplastyki balonikowej) oraz inne zaburzenia takie jak endotoksemia, która często jest następstwem wstrząsu septycznego.

Agonistów ApoA I można stosować pojedynczo lub w kombinacji z innymi lekami stosowanymi przy leczeniu wymienionych stanów. Terapie takie obejmują między innymi jednoczesne lub następujące po sobie podawanie wymaganych leków.

Przykładowo przy leczeniu hipercholesterolemii lub miażdżycy naczyniowej preparaty agonisty ApoA-I można stosować z jedną lub większą liczbą preparatów obniżających poziom cholesterolu stosowanych bieżąco np. ze złożami kwasów żółciowych, niacyną i/lub statynami. Taki łączony tryb leczenia może dawać korzystne wyniki terapeutyczne jako, że każdy lek działa na różne etapy syntezy i transportu cholesterolu; np. złoża kwasów żółciowych zaburzają recyklizację cholesterolu, populacji chilomikronu i LDL; niacyna przede wszystkim zaburza populację VLDL i LDL; statyny hamują syntezę cholesterolu, obniżając populację LDL (i prawdopodobnie podwyższając ekspresję receptora LDL); podczas gdy agoniści ApoA-I zaburzają RCT, podwyższają HDL, podwyższają aktywność LCAT i umożliwiają wypływ cholesterolu.

W innym wykonaniu wynalazku, agonistów ApoA-I można użyć przy leczeniu hiperlipidemii, hipercholesterolemii i choroby sercowo-naczyniowej takiej jak miażdżyca tętnic w sprzężeniu z fibratami.

W jeszcze innym wykonaniu wynalazku agonistów ApoA-I wynalazku można użyć w połączeniu z czynnikami przeciwbakteryjnymi i przeciwzapalnymi aktualnie stosowanymi przy leczeniu wstrząsu septycznego wywołanego endotoksyną.

Agonistów ApoA-I według wynalazku można przygotować jako peptydy lub jako kompleksy peptydowo-lipidowe, które można podawać pacjentowi różnymi drogami, celem dostarczania agonisty ApoA-I do układu krążenia. Przykłady preparatów i sposobu podawania opisano poniżej.

PL 200 744 B1

5.3.1 Agoniści ApoA-I i kompleks peptyd/lipid jako aktywne składniki

Agoniści ApoA-I mogą być syntetyzowani lub wytwarzani przy użyciu technik opisanych w Rozdziale 5.2 i jego podrozdziałach. Stabilne preparaty, które mają długi okres trwania, mogą być otrzymywane przez liofilizację peptydów - także do dalszej preparatyki lub do przygotowywania mniejszych jednostek, które będą następnie rehydrowane w sterylnej wodzie lub w odpowiednio sterylnym buforze, w zależności od przeznaczenia.

W pewnych wykonaniach, korzystnym jest stworzenie i podawanie agonistów ApoA-I w kompleksach białkowo-lipidowych. To podejście ma kilka korzyści ponieważ komplkeksy powinny mieć wydłużony czas życia podczas krążenia, zwłaszcza gdy kompleksy mają zbliżoną wielkość i gęstość do HDL, a szczególnie dla populacji HDL pre-e-1 i pre-e-2. Kompleksy peptydowo-lipidowe są odpowiednio przygotowywane przez szereg metod opisanych poniżej. Stabilne preparaty mające długi czas życia są przygotowywane przez liofilizację - koliofilizacyjne procesy opisane poniżej są korzystnym sposobem. Z liofilizowane kompleksy peptydo-lipidowe mogą być zastosowane do przygotowania większej ilości do preparatyki farmaceutycznej, lub przygotowania indywidualnych porcji lub jednostek podawania, które mogą być rekonstytuowane poprzez rehydratację w sterylnej wodzie lub odpowiednim buforze przed podaniem.

Różnorodne, dobrze znane fachowcom metody, są używane do przygotowywania nośników lub kompleksów peptydowo-lipidowych. Stosuje się również techniki odpowiednie do przygotowywania liposomów lub proteoliposomów. Na przykład, peptydy mogą być sonifikowane (używając kąpieli lub sonifikatora) wspólnie z odpowiednimi lipidami, do wytworzenia kompleksów. Alternatywną metodą jest łączenie odpowiednio otrzymanych kompleksów lipidowych do spontanicznego tworzenia się kompleksów proteninowo-lipidowych. Kolejną alternatywną metodą do wytwarzania kompleksów proteinowo-lipidowych jest ich formowanie z zastosowaniem metody detergentowo-dializacyjnej; na przykład mieszanina peptydów, lipidów i detergentów jest dializowana aż do usunięcia detergentu i uformowania peptydowo-lipidowego kompleksu (np. patrz Jonas i wsp.1., 1986, Methods in Enzymol. 128:553-582).

Powyższe metody nie w pełni odzwierciedlają złożoność tych procesów, ponieważ każda z nich posiada specyficzny problem dotyczący np. kosztów, czasu trwania, wydajności, bezpieczeństwa. Zgłaszający rozwinęli prostą metodę preparatyki peptydu lub proteino-fosfolipidowego kompleksu, zbliżoną do preparatyki HDL. Ta metoda, może być używana do przygotowywania peptydo-lipidowego kompleksu ApoA I, i ma nastepujące korzyści: (1) do wytworzenia docelowego kompleksu wykorzystane są wszystkie użyte składniki lub ich większość, przez co unika się strat materiału, co jest powszechne w innych metodach; (2) liofilizowane związki są bardzo stabilne podczas magazynowania; używane kompleksy mogą być rekonstytuowane bezpośrednio przed użyciem; (3) uzyskane kompleksy zazwyczaj nie wymagają dalszego oczyszczania po uformowaniu i przed użyciem; (4) toksyczne związki, wliczając detergenty takie jak chelaty, są usuwane, co więcej, metody produkcji mogą być łatwo oszacowane i odpowiednie do wytwarzania GMP (na przykład w środowisku wolnym od endotoksyn).

W zgodzie z korzystnym sposobem, peptydy i lipidy są połączone w rozpuszczalny system w którym każdy składnik rozpuszcza się i może być całkowicie usunięty przez liofilizację. Tak więc pary rozpuszczalników muszą być uważnie dobrane, aby zapewnić jednoczesną rozpuszczalność zarówno amfipatycznego peptydu jak i lipidu. W jednym wykonaniu, wbudowana do cząsteczki proteina lub peptyd musi być rozpuszczalny w wodzie lub rozpuszczalniku organicznym bądź też mieszaninie ich obu (roztwór 1). (Fosfo)lipidowy składnik jest rozpuszczalny w wodzie lub organicznym rozpuszczalniku bądź też mieszaninie ich obu (roztwór 2). Jest on mieszalny z roztworem 1 i te dwa roztwory są mieszane. Alternatywnie, peptyd i lipid mogą być wbudowane w system współrozpuszczalny; tj. mieszaninę dwóch mieszalnych rozpuszczalników. Odpowiednio dobrane proporcje peptydu (proteiny) do lipidu są najpierw określone doświadczalnie, tak więc powstałe kompleksy posiadają odpowiednie właściwości fizyczne i chemiczne, tzn. zazwyczaj (lecz nie koniecznie), podobne do HDL. Ostatecznie mieszanina jest zamrażana i liofilizowana do sucha. Czasami, aby ułatwić liofilizację, trzeba dodać do mieszaniny jakiś dodatkowy rozpuszcalnik. Ten liofilizowany produkt musi być przechowywany przez długi czas i pomimo to pozostać niezmieniony.

W roboczych przykładach opisanych poniżej peptyd 210 (SEQ ID NO: 210) i fosfolipidy, były rozpuszczane oddzielnie w metanolu, następnie połączone, po czym, przed liofilizacją, mieszane z ksylenem. Zarówno peptyd jak i lipid mogą być dodane do mieszaniny w dwóch rozpuszczalnikach. Alternatywnie, roztwór peptydu rozpuszczony w metanolu może być mieszany z roztworem lipidu rozpuszczonym w ksylenie. Należy zwrócić szczególną uwagę na eliminację soli z roztworu, aby uniknąć

PL 200 744 B1 wysolenia peptydu. W rezultacie, roztwór zawierający zarówno peptyd jak i lipid rozpuszczone w układzie metanol/ksylen jest liofilizowany do postaci proszku.

Liofilizowany produkt może być rekonstytuowany w celu uzyskania roztworu lub zawiesiny kompleksu peptydo-lipidowego. W tym celu liofilizowany proszek jest rehydratowany w odpowiednim roztworze i odpowiedniej objętości (często 5 mg peptydu/ml, który jest odpowiedni dla zastrzyku do żylnego). W korzystnym wykonaniu, zliofilizowany proszek jest rehydratowany buforowanym fosforanem roztworem soli fizjologicznej lub samym roztworem soli. Mieszanina musi być wytrząsana lub worteksowana w celu ułatwienia rehydratacji. W większości wypadków, etap rekonstrukcji powinien przebiegać w temperaturze równej lub wyższej od temperatury fazy przejścia lipidowego składnika kompleksów. W przeciągu kilku minut uzyskuje się czysty zrekonstruowany kompleks lipidowo-proteinowy.

Uzyskany w wyniku rekonstytucji preparat może być scharakteryzowany celem potwierdzenia, czy kompleks osiągnął wymagany rozdział wielkości np.rozdział wielkości HDL. W tym celu można użyć sączenia molekularnego. W opisanych poniżej przykładach roboczych użyto żelu do sączenia molekularnego Pharmacia Superose 6 FPLC. Użyty bufor zawiera 150 mM NaCl w 50 mM buforze fosforanowym o Ph 7,4. Typowa objętość próbki wynosi od 20 do 200 mikrolitrów kompleksu zawierającego 5 miligramów peptydu na mililitr. Tempo przepływu kolumny wynosi 0,5 ml/min. Do kalibracji kolumny są używane serie białek o znanym ciężarze molekularnym i średnicy Stokesa jak również ludzkie HDL. Proteiny i lipoproteinowe kompleksy są monitorowane przez absorbancję lub stopień rozpraszania światła dla długości fali 254 lub 280 nm.

Agoniści ApoA I wynalazku mogą tworzyć kompleks z różnymi rodzajami lipidów, włączając nasycone i nienasycone naturalne i syntetyczne lipidy i/lub fosfolipidy. Włączając w to odpowiednie lipidy, ale nie ograniczając się do nich, małe alkilowe łańcuchy fosfolipidów, fosfatydylocholina jaja kurzego, fosfatydylocholina soi, dipalmitoilofosfatydylocholina, dimiristoilofosfatydylocholina, distearynoilofosfatydylocholino-1-miristoilo-2-palmitoilofosfatydylocholina, 1-palmitoilo-2-miristoilofosfatydylocholina, 1-palmitoilo-2-stearynofosfatydylocholina, 1-stearynoilo-2-palmitoilofosfatydylocholina, diolenoilofosfatydylocholina, diolenoilofosfatydyloetanoloamina, dilaurynoilofosfatydyloglicerol, fosfatydylocholina, fosfatydyloseryna, fosfatydyloetanoloamina, fosfatydyloinozytol, sfingomielina, sfingolipid, fosfatydyloglicerol, difosfatydyloglicerol, dimiristoilofosfatydyloglicerol, dipalmitoilofosfatydyloglicerol, distearynofosfatydyloglicerol, diolenoilofosfatydyloglicerol, kwas dimiristoilofosfatydowy, kwas dipalmitoilofosfatydowy, dimiristoilofosfatydyloetanoloamina, dipalmitoilofosfatydyloetanoloamina, dimiristoilofosfatydyloseryna, dipalmitoilofosfatydyloseryna, mózgowa fosfatydyloseryna, mózgowa sfingomirina, dipalmitoilosfingomilina, distearynoilosfingomilina, kwas fosfatydynowy, galaktocelebrozyt, gangliolizozyt, celebrozyt, dilaurynoilofosfatydylocholina, (1,3)-D-mannozylo-(1,3)digliceryd, aminofenyloglikozyd, eter 3-cholesterylo-6'-(thioglikozylo)heksylo glikolipidu oraz cholesterol i jego pochodne.

Zgłaszający odkryli, że, kiedy agoniści ApoA I wynalazku są połączeni ze sfingomiliną, cały HDL jest usuwany z cząstek typu pre-β. Odpowiednio w najkorzystniejszym wykonaniu tego wynalazku agoniści ApoA I są podawani w kompleksie ze sfingomiliną.

5.3.2. Sposoby użycia leku

Peptydy agonistów ApoA-I lub kompleksy peptydowo-lipidowe według wynalazku można podawać dowolną drogą, która zapewnia ich dostępność biologiczną w układzie krążenia. Najlepiej można to osiągnąć podając je drogą pozajelitową, obejmującą zastrzyki dożylne (IV), domięśniowe (IM), śródskórne, podskórne (SC) i dootrzewnowe (IP). Jednak można zastosować inne drogi podawania. Przykładowo, wchłanianie z przewodu pokarmowego można uzyskać przy podawaniu drogami doustnymi (obejmującymi miedzy innymi połykanie, drogi policzkowe i podjęzykowe) przy założeniu, że stosuje się odpowiednie formuły (np. powłoki zabezpieczające przed strawieniem) aby uniknąć lub zminimalizować degradację składników aktywnych np. w niesprzyjającym środowisku błony śluzowej jamy ustnej, żołądka i/lub jelita cienkiego. Alternatywnie, można zastosować podawanie poprzez tkanki błony śluzowej, np. sposoby podawania dopochwowe lub doodbytnicze w celu uniknięcia lub zminimalizowania degradacji w przewodzie pokarmowym. Jeszcze inną alternatywę stanowi podawanie kompozycji według wynalazku przezskórnie (np. przez skórę właściwą) lub poprzez inhalację. Będzie oczywiste, że korzystna droga podawania może się zmieniać w zależności od stanu, wieku i zdyscyplinowania biorcy.

Konkretna dawka agonistów ApoA-I lub kompleksów peptydowo-lipidowych będzie się zmieniała w zależności od drogi podawania i powinna być doprowadzana do uzyskania stężenia w osoczu krwi od 100 mg/l do 2 g/l. Dane otrzymane w opisanych tu zwierzęcych systemach modelowych pokazują, że agoniści ApoAI według wynalazku łączą się ze składnikiem HDL, a obserwowany okres półtr40

PL 200 744 B1 wania u ludzi wynosi około pięciu dni. A zatem, według jednego z wykonań, agonistów ApoA-I można podawać w zastrzykach w dawce od 0,5 mg/kg do 100 mg/kg raz na tydzień. W innym wykonaniu, pożądany poziom w surowicy można utrzymywać poprzez wlew stały lub wlew przerywany dostarczający od około 0,5 mg/kg/godz. do 100 mg/kg/godz.

Toksyczność i skuteczność terapeutyczna różnych agonistów ApoA-I może być ustalona przez zastosowanie standardowych procedur farmaceutycznych z użyciem kultur tkankowych lub zwierząt eksperymentalnych, przez pomiar LD50 (dawka śmiertelna dla 50% populacji) i ED50 (dawka terapeutyczna dla 50% populacji. Stosunek między dawką toksyczną a leczniczą jest indeksem terapeutycznym i jest wyrażony jako LD50/ED50. Korzystni są agoniści ApoA-I wykazujący duże indeksy terapeutyczne.

5.3.3. Kompozycje farmaceutyczne

Farmaceutyczne formuły dotyczą agonistów ApoA I lub kompleksów peptydowo-lipidowych jako aktywnych składników w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku odpowiednim do dawkowania i podawania in vivo. Peptydy mogą też zawierać odpowiednie wolne kwasy, zasady lub dopuszczalne farmaceutycznie sole.

Preparaty wstrzykiwane obejmują, sterylne zawiesiny, roztwory, lub emulsje aktywnego czynnika w wodzie lub nośniku oleistym. Skład może obejmować również takie czynniki jak czynniki stabilizujące, rozpuszczające, zawieszające. Preparaty do wstrzykiwania mogą być w formie dawek jednorazowych np. ampułek lub wielorazowych i mogą zawierać konserwanty.

Inaczej, preparaty do iniekcji mogą być w formie proszku do zawieszenia przed użyciem w odpowiednim nośniku m.in. wodzie niepirogennej, buforze, roztworze glukozy. Peptydy lub kompleksy lipidowo-petydowe agonistów ApoA-I mogą by liofilizowane. Preparaty takie mogą być przechowywane w dawkach jednorazowych i zawieszone przed podaniem.

W celu przedłużonego dawkowania aktywny składnik może być użyty w formie implantu umieszczanego podskórnie, doskórnie lub domięśniowo. Może być użyta wraz z odpowiednim polimerem, substancją hydrofobową (np. emulsją w tolerowanym oleju), złożem jonowymiennym lub jako słabo rozpuszczalne pochodne (np. słabo rozpuszczalne sole agonistów ApoA-I.

Alternatywnie, można użyć plaster lub przyklejany krążek, który będzie wolno wydzielał aktywny czynnik absorbowany następnie przez skórę. Można również użyć substancji wzmagających absorpcje przez skórę. Szczególnie korzystne wydaje się użycie agonistów ApoA-I wynalazku w kompleksach z lipidami w plastrach z nitrogliceryną przez pacjentów z chorobą niedokrwienną serca i hipercholesterolemią.

Dla celów podawania doustnego, preparat, leczniczy może przybrać formę tabletek lub kapsułek przygotowanych w konwencjonalny sposób z tolerowanymi farmaceutycznie dodatkami: wiążącymi (np. skrobia kukurydziana, poliwinylopirolidon, hydroksypropylem metylo-celuloza); wypełniaczami (np. laktozą, celulozą mikrokrystaliczną, fosforanem wapnia); substancjami powlekającymi (stearynian magnezu, talk, krzemiany); substancjami nawilżającymi (siarczan dodecylu). Tabletki mogą być pokrywane znanymi fachowcom metodami. Preparaty płynne do zażywania doustnego mogą przybierać formę np. roztworów, syropów, zawiesin lub jako proszek do rozpuszczenia w nośniku przed zażyciem. Płynne preparaty mogą być przygotowane w sposób konwencjonalny przez użycie farmaceutycznie tolerowanych dodatków takich jak; środki zawieszające (np. syrop sorbitolowy, pochodne celulozy, nasycone jadalne kwasy tłuszczowe); środki emulgujące (np. lecytyna); nośniki nie-wodne (np. olej migdałowy, alkohol etylowy, rafinowane oleje roślinne) i konserwanty (np. metylo- lub propylo-p-hydroksybenzoesan, sorbinian). Preparat może zawierać również w miarę potrzeby sole buforu, środki zapachowe, barwiące i smakowe. Preparaty do zażywania doustnego mogą być przygotowane tak, że zapewniają kontrolowane uwalnianie czynnika aktywnego.

Jeśli chodzi o podawanie podjęzykowe, preparat może przyjąć formę tabletek lub pastylek przygotowanych w sposób konwencjonalny. Dla celów podawania dopochwowego lub doodbytowego, czynnik aktywny może wchodzić w skład roztworów (do lewatyw), czopków lub maści.

W celu podawania w formie inhalacji, składnik aktywny może być zawieszony w odpowiednim nośniku (np. dichlorodifluorometan, trichlorodifluorometan dichlorotetrafluorometan) dostarczony w postaci aerozolu w pojemnikach pod ciśnieniem lub jako nebulizatory. W przypadku aerozoli pod ciśnieniem doza może być ustalona przez odpowiedni zawór mierzący. Kapsułki (np. z żelatyny) używane w inhalatorach mogą być tak wykonane, że zawierają składnik aktywny i nośnik (laktozę lub skrobie) w formie stałej.

PL 200 744 B1

Preparat może być dostępny w formie opakowania lub dozownika, który może zawierać jedną lub więcej porcji zawierających aktywny składnik. Opakowania mogą być np. listków. opakowanie lub dozownik zaopatrzony może być w instrukcje.

5.4 Inne zastosowania

Peptydy ApoA-I i jej agoniści kodowane przez sekwencje wynalazku, mogą być użyte do celów mierzenia HDL w osoczu in vitro np. w diagnostyce. Ponieważ agoniści ApoA-I łączą się z osoczową HDL, mogą służyć jako znaczniki populacji HDL.

Co więcej agoniści, mogą służyć jako znaczniki subpopulacji HDL aktywnej w RCT. Agoniści mogą być dodani i zmieszani z próbką osocza pacjenta, po odpowiednim czasie inkubacji, populacja HDL morze być mierzona przez detekcję włączonego agonisty ApoA-I. Może to być osiągnięte przez użycie znakowanego agonisty (np. znakowanie radioaktywne, fluorescencyjne, enzymatyczne, z zastosowaniem barwników itp.) lub testy immunologiczne z użyciem przeciwciał lub ich fragmentów specyficznych do agonisty.

Wyznakowany agonista może być użyty w badaniach wizualizacyjnych (np. tomografia komputerowa (CAT), rezonans magnetyczny (MRI)) w celu wizualizacji krwiobiegu, monitorowania RCT, akumulacji HDL w tkance tłuszczowej lub złogach miażdżycowych itd. (gdzie HDL powinna być aktywna w uwalnianiu cholesterolu).

6. Przykład: Synteza peptydowego agonisty ApoA i

Peptydy opisane w tabeli X (Rozdział 8.3, poniżej) były syntetyzowane i scharakteryzowane jak opisano w sekcji poniżej. Peptydy te były także zanalizowane strukturalnie i funkcjonalnie, jak opisano w Rozdziale 7 i 8, poniżej.

6.1 Synteza peptydów rdzeniowych

Peptydy były syntetyzowane na fazie stałej, zgodnie z technikami Merrifielda (Merrifield, 1969, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154), z użyciem 0,25 mM złoża ρ-alkoksybenzyloalkoholowego (złoże HMP) (Wang, 1973, J. Am. Chem. Soc. 95:1328-1333) oraz reakcji chemicznej Fmoc. Wszystkie syntezy były przeprowadzone w Applied Biosystems ABI, model 430A automatycznego syntetyzatora peptydów (Perkin-Elmer, Foster City, CA). Roztwór i czas aktywacji dla każdego sprzężenia pokazane są w tabeli V poniżej:

T a b e l a V

Pojedyncze sprzężenie aktywatorów cyklu

Nazwa cyklu	Zamierzone aminokwasy	Rozcieńczalnik	Czas	Czas aktywacji	Czas przenoszenia
afmc 31	Asn (trt), His (trt), Lys (Boc), Trp	-0.4 ml DCM -1.2 ml NMP -1.0 ml HOBt/NMP	-7 min	-51 min	1=50 sek. 2=36 sek.
afmc 32	Arg (Pmc), Gln (trt), Aib	-0.8 ml DCM -1.2 ml NMP -1.0 ml HOBt/NMP	-32 min	-51 min	1=60 sek. 2=40 sek.
afmc 33	Ala, Asp (OtBu), Glu (OtBu), Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro	-0.4 ml DCM -0,8 ml NMP -1.0 ml HOBt/NMP	-4 min	-36.5 min	1=38 sek. 2=27 sek.
afmc 34	Val	-0.4 ml DCM -0.8 ml NMP -0.1 ml HOBt/NMP	-4 min	-61.5 min	1=38 sek. 2=27 sek.
* 1= przeniesienie z wkładki do aktywatora. 2= przeniesienie z aktywatora do wkładki.
DCC to dicykloheksylokarbodiimid, BOC to t-butylooksykarbonyl HOBT to 1-hydroksybenzortiazol, Pmc to pentametylochromano-6-sulfonyl, NMP to N-metylopirolidon, OtBu to t-butylo ester, trt to trityl

Złoże przemywano NMP pomiędzy każdym kolejnym etapem łączenia. Protokół dla jednego cyklu syntezy jest pokazany poniżej w tabeli VI:

PL 200 744 B1

T a b e l a VI

Protokół łączenia dla jednego cyklu syntezy

Operacja	Czas (min)
1. Odblokowanie (10% piperydyna w NMP)	20
2. Przemywanie (NMP)	5
3. Łączenie (4 równoważniki estru Fmoc-aminokwas-HOBT w NMP, aktywowanego wstępnie przez 50 min)	61
4. Przemywanie	3
5. Próbka złoża (ewentualnie)	3
Całkowity	92

Wszystkie aminokwasy z wyjątkiem Fmoc-(-(1-naftylo) alaniny były sprzężone w ten sposób. Fmoc-(-(1-naftylo) alanina była ręcznie sprzęgana w pary. Przy ręcznym sprzęganiu, jeden mM Fmoc(-(1-naftylo) alaniny i jeden mM 1 mmol tetra-fluoroboranu 2-(1H-benzotriazolo-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowego (TBTU) rozpuszczano w 5 ml NMP i mieszano z peptydem-złożem.

Następnie, dodawano 2 mmol N-etylodiizopropyloaminy, mieszaninę wytrząsano przez 2 godziny i peptyd-złoże przemywano 6-krotnie 10 ml NMP. Wydajność łączenia monitorowano przy zastosowaniu Testu Kaiser (Kaiser, 1970, Anal. Biochem. 34:59577) i w razie potrzeby powtarzano. Po przyłączeniu naftyloalaniny, pozostałą syntezę przeprowadzano automatycznie tak, jak opisano powyżej.

6.2 Synteza amidów peptydowych

Jak pokazano w tabeli X (Rozdział 8.3, poniżej), amidy peptydowe były syntetyzowane z użyciem żywicy amidowej Rink zawierającej ramię amidowe Fmoc-Rink 4-(2',4'-dimetylofenylo)-Fmocfenoksymetyl (Rink, 1987, Tetrahedron Lett. 28:3787-3790) oraz protokołów syntezy opisanych w Rozdziale 6.1, powyżej).

6.3. Synteza N-terminalnie acylowanych peptydów

Jak pokazano w tabeli X (Rozdział 8.3, poniżej), N-terminalne acylowane formy peptydów były przyrządzane przez wystawianie związanego na żywicy peptydu, jak opisano w Rozdziale 6.1 lub 6.2, poniżej, na działanie właściwego czynnika acylującego.

Dla N-końcowo acylowanych peptydów, do każdych 15 ml bezwodnego octowego roztworu (10 proc. v/v w NMP) dodano 1 g peptydu związanego z żywicą. Mieszaninę wytrząsano 5 minut i żywicę usuwano porzez filtrację. Usuwana żywica była trzykrotnie przemywana NMP (15 ml) i trzy razy etanolem (15 ml).

6.4. Cięcie i odsłanianie

Po syntezie peptydów opisanej w Rozdziale 6.1 lub 6.2, poniżej, odcinano je od żywicy przez przemywanie 92.5% roztworem kwasu trójfluorooctowego (TFA)/3,75% anizol/3,75% dodekantiol (v/v/v). Dla skuteczniejszego cięcia dodawane było 10 ml buforu tnącego do 0.25.mmol żywicy peptydowej i mieszane przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Złoże usuwano poprzez filtrowanie a cięty/odblokowany peptyd wytrącano eterem dietylowym, przemywano eterem i suszono pod próżnią.

Mieszanina do odcinania peptydów zawierających Trp (W), jak również amidów peptydów składała się z 86,5% TFA, 4,5%, H2O 4,5% 1,2-etylenoditiolu, 4,5% anisolu i 3% fenolu.

6.5 Oczyszczanie

Surowe, pocięte peptydy, opisane w Rozdziale 6.4, były oczyszczane za pomocą odwrotnofazowej HPLC. Czystość każdego z peptydów była potwierdzona poprzez różnorodne techniki analityczne (analityczna HPLC, kapilarna elektroforeza). Kapilarna elektroforeza była przeprowadzana przy użyciu kapilar 70-cm długości, zrobionych z topionych kapilar krzemowych, o wewnętrznej średnicy 75 urn. (Thermo Separation Products). Rozdziały były przeprowadzane w 25°C, 15 kV, w czasie 35 min, w dwóch różnych buforach: buforze 1 (20 mM Na2B4O7, pH 9,2) i buforze 2 (10 mM Na2HPO4, pH 2,5). Rozdział HPLC był przeprowadzany na kolumnach Nucleosil 7C18 lub Nukleosil 7C4 (Macherey and Nagel, Niemcy), 250 x 21 mm, przy szybkości przepływu 8 ml/min. Zastosowano gradient wymywania przy użyciu mieszaniny 0,1% TFA w wodzie (Rozpuszczalnik A) i 0,1% TFA w acetonitrylu (Rozpuszczalnik B). Stosowane gradienty dopasowywano dla potrzeb każdego z peptydów.

PL 200 744 B1

6.6. Charakteryzowanie

Analizę masy i aminokwasów oczyszczonych peptydów opisanych w Rozdział 6.5 potwierdzono, odpowiednio, spektrometrią masową i analizą aminokwasów, jak opisano poniżej. Degradację Edmana zastosowano do sekwencjonowania.

6.6.1 LC-MS

Do określenia masy zastosowano handlowo dostępny standardowy trzystopniowy kwadrupolowy spektrometr masowy (model TSQ 700; Finnigan MAT, San Jose CA, USA). Pneumatycznie wytwarzaną granicę faz elektorozpylania (ESI) stosowano do wprowadzania próbki do źródła jonizacji przy ciśnieniu atmosferycznym w spektrometrze masowym. Rozpylacz wytwarzający granicę faz działał przy potencjale dodatnim 4,5 kV. Temperatura kapilary stalowej była utrzymywana na poziomie 200°C, podczas gdy powielania wynosiła 70°C. Jony dodatnie wytwarzane w tym procesie parowania jonowego wchodziły do analizatora spektrometru masowego. Wzmacniacz był nastawiany na 1000 V. Przedział analizatora w spektrometrze mas wynosił 4E-6. Wszystkie pomiary były wykonywane przy rozdzielczości < 1 u.

Peptydy analizowano poprzez bezpośrednie wprowadzanie oczyszczonych peptydów przy zastosowaniu systemu mikrodozownika ABI (Applied Biosystems), składającego się z pompki strzykawkowej (model 140B), detektora UV (model 785A) i pieca/wtryskiwacza (model 112A). System rozpuszczalników składał się z wody (rozpuszczalnik A) i acetonitrylu (rozpuszczalnik B), każdy zawierał 0,1% TFA. Peptydy wprowadzano przy zastosowaniu bądź gradientu, bądź warunków izokratycznych i wymywano z kolumny Aquapore C18. Szybkość przepływu wynosiła zazwyczaj 300 gl/min. Stężenie każdego peptydu wynosiło około 0,03 mg/ml, z czego wstrzykiwano 20 gl (np. 30 pmol).

Doświadczenia z pełnego widma MS przeprowadzono poprzez skanowanie kwadrupola 1 z m/z 500-1500 w ciągu 4 sek. Dane otrzymywano przy zastosowaniu stacji Alfa DEC i opracowywano przy zastosowaniu oprogramowania dostarczonego przez Finnigan MAT (BIOWORKS).

6.6.2 Analiza aminokwasów

Analizę aminokwasów przeprowadzano w analizatorze aminokwasów ABI (Applied Biosystems) 420 Amino Acid Analyser. System ten składa się z trzech modułów: urządzenia do hydrolizy i otrzymywania pochodnych, HPLC z odwróconymi fazami i systemu zbierania danych. Próbkę peptydu nanoszono (3 razy w trzech powtórzeniach) na porowate szkiełko szklane, a następnie hydrolizowano w warunkach fazy gazowej (155°C, 90 min). Po usunięciu HCl, otrzymane aminokwasy przekształcano w PTC-AA (fenylotiokarbamioloaminokwasy) przy zastosowaniu PITC (fenyloizotiocyjanianu). Po przeniesieniu na pętlę do nanoszenia próbek w HPC otrzymane mieszaniny frakcjonowano na kolumnie Aquapore C18 przy zastosowaniu trybu gradientowego (Rozpuszczalnik A: 50 mmol octan amonu (NH4Ac), pH 5,4, w wodzie; Rozpuszczalnik B: 32 mmol octan sodu (NaOAc) w wodnym acetonitrylu) w warunkach kontrolowanej temperatury. Dane z HPLC przetwarzano przy zastosowaniu oprogramowania dostarczonego przez Applied Biosystems. Ocenę ilościową przeprowadzono względem standardu peptydowego dostarczonego przez Applied Biosystems.

6.7 Synteza rozgałęzionych sieci

Złoże z tetramerowym rdzeniem peptydowym i trimerowym rdzeniem peptydowym syntetyzowano tak, jak opisano w Demoor i wsp., 1996, Eur. J. Biochem. 239: 74-84. Tetramerową i trimerową matrycę rdzeniową nadal połączoną ze złożem benzohydryloaminowym użyto następnie jako wyjściowe złoże peptydylowe do automatycznej syntezy rdzeniowych peptydów, jak opisano wcześniej.

Rozgałęzione sieci zawierające helikalne fragmenty różnych kompozycji aminokwasowych można syntetyzować przy zastosowaniu syntezy ortogonalnej i strategii blokowania dobrze znanej w tej dziedzinie.

7. Przykład: Analiza strukturalna i wiązania lipidów przez peptydy ApoA-I.

Charakterystyka strukturalna i wiązania oczyszczonych peptydów zsyntetyzowanych jak opisano w Rozdziale 6, powyżej, były określone poprzez dichroizm kołowy (CD), spektroskopię fluorescencyjną i magnetyczny rezonans jądrowy (NMR).

7.1. Dichroizm kołowy (CD)

Ten przykład opisuje korzystny sposób określenia procentowości drugorzędowej struktury a-helikalnej samych peptydów, bądź w obecności lipidów.

PL 200 744 B1

7.1.1. Metoda eksperymentalna

Widma dichroizmu kołowego w dalekim UV mierzono pomiędzy 190 a 260 nm (co 0,5 nm lub 0,2 nm) przy zastosowaniu spektrometru AVIV62DS (AVIV Associates, Lakewood, N J, USA) wyposażonego w termoelektryczny statyw do kuwet i zmiennik próbek. Urządzenie było kalibrowane (+) -10-kwasem kamforowym. Dla każdej próbki wykonywano od jednego do trzech skanów przy zastosowaniu kwarcowych kuwet o długości toru 10 cm, 5 cm, 1 cm i 0,1 cm dla stężeń peptydów, odpowiednio, od 10^-7do 10^-4 M. Szerokość pasma była ustalona na 1,5 nm, a szybkość skanowania 1 sek. na skok długości fali. Przedstawione dane stanowią średnią co najmniej 2 lub 3 niezależnych pomiarów.

Po odjęciu tła, widma przekształcano na eliptyczność molową (θ) na resztę w stopniach cm^-2 dmol^-1. Stężenie peptydu oznaczano poprzez analizę aminokwasów, a także poprzez spektrometrię absorpcyjną w spektrofotometrze UV/Światło widzialne Perkin Elmer Lambda 17 wówczas, gdy peptyd zawierał chromofor (tryptofan, dansyl, naftyloalaninę).

Widma CD otrzymywano dla wolnego, niezwiązanego peptydu (5 μΜ w 5 mM buforze fosforanowym, pH 7,4); dla kompleksów peptyd-SUV (20:1 EPC:Chol., Ri=30 oraz Ri=50); dla kompleksów peptyd-micella (1-mirystoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fostatydylocholina, Ri=100); oraz dla wolnego, niezwiązanego peptydu w obecności 2,2,2-trifluoroetenolu (TFE) (5 μΜ peptyd, 90% obj. TFE).

SUV otrzymywano poprzez rozproszenie lipidów (10 mM, 20:1 EPC:Chol., Avanti Polar Lipids, AL) w buforze fosforanowym (5 mM, pH 7,4) przy zastosowaniu strumienia N2 przez 5 min, a następnie sonikację (1,5 godz.) w sonikatorze wannowym. Homogenność preparatu sprawdzano poprzez FPLC.

Micelle otrzymywano poprzez rozproszenie lipidu (6 mM 1-mirystoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fostatydylocholina, Avanti Polar Lipids, AL.) w buforze fosforanowym (5 mM, pH 7,4) przy zastosowaniu strumienia N2 przez 5 min, a następnie mieszanie na worteksie.

W celu otrzymania kompleksów peptyd-SUV, SUV dodawano do peptydu (5 μΜ w 5 mM buforze fosforanowym pH 7,4) przy stosunku molowym fosfolipid-peptyd (Ri) wynoszącym od 30 do 50.

W celu otrzymania kompleksów peptyd-micella, micelle dodawano do peptydu (5 μΜ w 5 mM buforze fosforanowym pH 7,4) przy Ri wynoszącym 100. Wszystkie widma mierzono w 37°C. Stabilność peptydu 210 (SEQ ID NO:210) jako funkcja temperatury (zarówno w buforze jak i micellach) była określana poprzez zbieranie widm w seriach różnych temperatur. Określono również stopień helikalnośći peptydu 210 (SEQ ID NO:210) w funkcji stężenia.

7.1.2. Określanie helikalności

Stopień helikalnośći peptydów w różnych warunkach był określany ze średniej eliptyczności przy 222 nm (Chen i wsp., 1974, Biochemistry 13:3350-3359) lub przez to porównywanie otrzymanych widm CD do widm referencyjnych (16 referencyjnych widm helikalnych otrzymanych z Provencher & Glockner, 1981, Biochemistry 20:33-37; widmo referencyjne zdenaturowanego białka z Venyaminov i wsp., 1993, Anal. Biochem. 214:17-24), stosując algorytm dopasowania do krzywej CONTIN wersja 2DP, zestaw CD-1 (Aug. 1982) (Provencher, 1982, Comput. Phys. Commun. 27:213-227, 229-242). Dopuszczalne dopasowanie było określane przy zastosowaniu metod statystycznych dostarczonych w algorytmie CONTIN. Błąd wszystkich metod wynosił 5% helikalności.

7.1.3. Wyniki

Stopień helikalności (%) wolnych, niezwiązanych peptydów (wolne), kompleksów peptydy-SUV (SUV), kompleksów peptydowo-micellowych (mics) i roztworów peptydy- TFE (TFE) jest przedstawiony w tabeli X, Sekcja 8.3, poniżej.

Peptyd 210 (SEQ ID NO:210) zawiera znacząca strukturę α-helikalną (63% helikalności) w micellach. Co więcej, struktura α-helikalna jest całkowicie stabilna w zakresie temperatur 5°-45°C (wyniki nie pokazane). Helikalność peptydu 210 (SEQ ID NO:210) również wzrasta w obecności TFE, będącego rozpuszczalnikiem o znacząco mniejszej stałej dielektrycznej (8=26.7) niż woda (6=78.4), stabilizuje on α-helisy i wewnątrzpeptydowe wiązania wodorowe przy stężeniach pomiędzy 5 - 90% (v/v).

Odnosząc się do tabeli X, Rozdział 8.3, poniżej, widocznym jest, ze peptydy wykazujące się wysokim stopniem aktywacji LCAT (> 38%) generalnie posiadają znaczącą strukturę α-helikalną w obecności lipidów (> 60% struktury helikalnej w przypadku niezablokowanych peptydów zawierających 22 lub więcej aminokwasów lub zablokowanych peptydów zawierających 18 lub mniej aminokwasów; > 40% struktury helikalnej w przypadku niezablokowanych peptydów zawierających 18 lub mniej aminokwasów), podczas gdy peptydy wykazujące niewielką lub brak zdolności do aktywacji LCAT posidają niewielką strukturę α-helikalną. Jednak w niektórych przypadkach peptydy, które zawierają znaczącą strukturę α-helikalną w obecności lipidów nie wykazują znaczącej zdolności do akPL 200 744 B1 tywacji LCAT. W konsekwencji, zdolność peptydów rdzeniowych wynalazku do przyjmowania struktury α-helikalnej w obecności lipidów jest uznawana za krytyczną cechę peptydów rdzeniowych wynalazku, a jako zdolność do formowania α-helisy w obecności lipidów wydaje się warunkiem wstępnym do aktywacji LCAT.

7.2. Spektroskopia fluorescencyjna.

Właściwości wiązania lipidów dla peptydów syntetyzowanych w Rozdziale 6, powyżej, testowano poprzez pomiary fluorescencji przy użyciu wyznakowanych peptydów, w tym przypadku tryptofanu (Trp lub W) albo naftyloalaniny (Nal). Widma fluorescencji mierzono we Fluoromax ze Spex (JobinYvon) wyposażonym w lampę Xenon 150 W, dwa monochromatory (wzbudzenia i emisji), fotopowielacz R-928 do wykrywania czułego na czerwień do 850 mm i termoelektryczny statyw do kuwet z mieszadłem magnetycznym. Do pomiarów w mikromolarnym zakresie stężeń stosowano kwarcowe kuwety Suprasil. Przystawka ze zmiennymi szczelinami (od 0,4 do 5 nm) pozwala na modulowanie przypadkowych i emitowanych intensywności w zależności od stężenia zastosowanego peptydu. Przedstawione wartości są na ogół średnią z 2 do 4 widm. Stężenie peptydu określa się poprzez spektrometrię absorpcyjną przy użyciu Philips PU 8800 stosując pasmo absorpcji Trp (ε280 nm = 5,550 M^-1cm^-1w buforze Tris) lub Nal (ε280 nm = 5,550 M^-1cm^-1 w metanolu).

Widma fluorescencyjne peptydów mierzono w zakresie od 290 nm do 450 nm w buforze TrisHCl (20 mM, pH=7,5) w obecności lub nieobecności pęcherzyków lipidowych. Małe jednowarstwowe pęcherzyki wytwarzano po rehydratacji zliofilizowanych fosfolipidów w buforze, rozproszeniu i sonikacji z użyciem końcówki w strumieniu N2. Stosowanymi lipidami były PC/Chol. z jaja (20:1) bądź POPC/Chol. (20:1). Widma mierzono przy stężeniu peptydów 2 pM w temperaturze 37°C. Standardem fluorescencyjnym w przypadku Trp był N-acetylotryptofanyloamid (NATA).

Badania wiązania lipidów przeprowadzono dodając stopniowo pęcherzyki lipidowe do roztworu peptydu o stężeniu 2 pM (szczeliny: 5 nm dla wzbudzenia i 1,5 nm dla emisji). Efekty rozcieńczenia brano pod uwagę przy określaniu intensywności fluorescencji. Stężenia lipidów wahały się od 10 do 600 pM, a stosunek molowy lipidu do peptydu (Ri) zmieniał się w zakresie od 5 do 300. Długość fali wzbudzenia ustawiano na 280 nm zarówno dla Trp, jak i Nal.

7.2.1. Analizy widm fluorescencyjnych

Wyniki zostały bezpośrednio zarejestrowane i obrabiane przez IBM-PC połączony z spektrofluorometrem, przy użyciu oprogramowania DM3000F ze Spex. Widma były korygowane poprzez zdjęcie udziału rozpuszczalnika i poprzez zastosowanie współczynnika podanego przez konstruktora, uwzględniającego zróżnicowanie w odpowiedzi fotopowielacza w zależności do długości fali.

Widma fluorescencyjne peptydów charakteryzowano poprzez długość fali przy maksimum emisji fluorescencji i ich wydajność kwantową w porównaniu do NATA w przypadku peptydów wyznakowanych tryptofanem. Proces wiązania się do lipidów analizowano poprzez obliczenie przesunięcia długości fali przy maksimum emisji fluorescencji, (λ_Π3Χ), oraz różnic względnej intensywności emisji fluorescencji w zależności od stężenia lipidu. Względna intensywność fluorescencji jest zdefiniowana jako stosunek: (I-I₀)>.max/I₀ż.max. Zarówno I jak i I₀ są mierzone w przy (λ_Π3Χ), co odpowiada wyjściowemu wolnemu stanowi peptydu, tj. bez lipidów. I odpowiada intensywności dla określonego stosunku lipidu do peptydu, a I0 jest tym samym parametrem mierzonym w nieobecności lipidów. Brak tych różnic oznacza brak oddziaływań peptydów z lipidami.

7.2.2. Wyniki i dyskusja

Własności wiązania lipidów peptydu 199 (SEQ ID NO:199), którego sekwencja pierwszorzędowa przypomina sekwencję peptydu 210 (SEQ ID NO:210), poza tym, że zawiera resztę W (Trp) w pozycji 10 są przedstawione w tabeli IX.

T a b e l a VII

Zdolności wiązania peptydu 199 (SEQ ID NO:199) do pęcherzyków lipidowych mierzone drogą fluorescencji

Stosunek molowy (β,) Lipid: Petyd	I/I0	^λmax (^nm)
1	2	3
0	0	348
5	8	344
10	8	339

PL 200 744 B1 cd. tabeli VII

1	2	3
30	18	328
60	22
100	27	326
200	41	325

W buforze przy stężeniu 2 μm, maksimum emisji fluorescencji ^_max) dla tryptofanu w przypadku peptydu 199 (SEQ ID NO:149) wynosi 348 nm. Odpowiada to tryptofanowi, który jest względnie wystawiony na działanie środowiska wodnego to w porównaniu do NATA (X_max =350 nm). Peptyd 199 (SEQ ID NO:199) wiąże się bardzo wydajnie z małymi jednowarstwowymi pęcherzykami EPC/Chol (20:1) jak wykazano przez chowanie tryptofanu (długość fali dla maksimum emisji fluorescencji przesuwa się z 348 nm do 325 nm) i wysoką egzaltację intensywności fluorescencji (patrz tabela VII). Chowanie reszty tryptofanowej jest maksymalne przy stosunku molowym lipidu do peptydu wynoszącym około 100. Inne peptydy, które wykazywały wysoki poziom helikalności w obecności lipidów (> 60% dla peptydów niezablokowanych o długości > 22 aminokwasów lub peptydów zablokowanych o długości < 18 aminokwasów; > 40% dla peptydów niezablokowanych o długości < 18 aminokwasów), co zmierzono poprzez dichroizm kołowy, jak ujawniono w Rozdziale 7.1. powyżej, również wykazywały dobre wiązanie lipidów. Oczywiście, wśród wszystkich peptydów wybranych na podstawie dichroizmu kołowego, jedynie te, dla których można było obserwować fluorescencję, były testowane pod kątem właściwości wiązania lipidów.

7.3. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)

Ten przykład opisuje metodę NMR do analizowania struktury rdzenia peptydowego wynalazku.

7.3.1. Przygotowanie próbek do NMR.

Próbki były przygotowane poprzez rozpuszczenie 5 mg peptydu w 90% H2O/10% D2O zawierającym śladowe ilości sulfonianu 2,2-dimetylo-2-sila-5-pentanowego (DSS) będącego wewnętrznym odnośnikiem. Niektóre próbki zawierały trifluoroetanol (TFE) (wyrażony jako % obj.). Całkowita objętość próbki wynosiła 500 μ!, a stężenie peptydu wynosiło około 5 mM. Niektóre z próbek zawierały trifluoroetanol (TFE) (wyrażany w % v). Całkowita objętość próbki wynosiła 500 pl stężenie peptydów wynosiło około 5 mM.

7.3.2. Spektroskopia NMR

Widma protonu w jądrowym rezonansie magnetycznym zostały osiągnięte przy 550 MHZ spektrometrem Bruker DRX500 wyposażonym w urządzenie do kontroli temperatury B-VT2000. Jedno i dwuwymiarowe pomiary zostały zapisane z użyciem standardowej sekwencji pulsów. (Two Dimensional NMR Spectroscopy, Eds. W. R. Croasmun and RMK Carlson, 1994 VCH Publishers, New York, USA).

Maskowanie wody zostało uzyskane przez 2s przy niedosycie niskiej mocy. Eksperymenty dwuwymiarowe przeprowadzono w trybie fazoczułym, stosując inkrementacje fazy proporcjonalną do czasu (TPPI) oraz szerokość widmową 6000 Hz w obydwu wymiarach. Zazwyczaj sumowano 40 skanów dla każdego z 400 inkrementów t1, zawierających po 2048 punktów danych. Dane zostały obrobione przy pomocy oprogramowania FELIX95 (Molecular Simulations) na stacji roboczej INDIGO2 (Silikon graphics). Dane zostały wyzerowane aby otrzymać macierz 2Kx2K, a następnie apodyzowane przez przesuniętą o 45° kwadratową funkcję sinus-dzwonowy.

7.3.3. Oznaczenia NMR

Pełne przypisanie rezonansu protonowego zostało dokonane przez zastosowanie techniki przypisania sekwencyjnego przy użyciu widm DQFCOSY, TOCSY i NOESY opisanych w literaturze fachowej (Wuthrich, NMR of proteins and Nucleic Acids,1986, John Wiley & Sons, New York, USA). Drugorzedowe przesunięcia chemiczne zostały obliczone dla protonów HN oraz Ha przez odjęcie przesunięć losowych spiral (Wishart and Sykes,1994, Method. Enz. 239:363-392) od odpowiednich wartości doświadczalnych.

7.3.4. Wyniki i dyskusja

Ogólne rozważania. Amfipatyczne peptydy helikalne zmierzają do gromadzenia się w roztworach wodnych w wysokich stężeniach koniecznych dla spektroskopi magnetycznego rezonansu jądrowego, powodując trudności w otrzymaniu widma o wysokiej rozdzielczości. TFE jest znany ze

PL 200 744 B1 zdolności rozpuszczania peptydów oraz dodatkowo ze stabilizacji helikalnej konformacji peptydów posiadającacych skłonności do helikalizacji. Wyniki uzyskano przy pomocy spektroskopi magnetycznego rezonansu jądrowego dla peptydu 210 (SEQ ID NO:210) jako charakterystycznego przykładu i 22-meru o największej zgodności Segrest (SEQ ID NO:75) był analizowany dla porównania.

Drugorzedowe przesunięcia chemiczne.

Przesunięcia chemiczne protonów w aminokwasach zależą zarówno od typu reszty, jak i lokalnej struktury drugorzędowej w obrębie peptydu lub białka (Szlagyi, 1995, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 27:325-443). A zatem możliwa jest identyfikacja regularnej struktury drugorzędowej poprzez porównanie przesunięć eksperymentalnych ze stabularyzowanymi wartościami dla konformacji kłębka statystycznego. Tworzenie α-heliksy zwykle powoduje ujemne przesuniecie dla rezonansu Ηα. Obserwacja przesunięcia Ηα dla sekwencji reszt zwykle świadczy o strukturze helikalnej.

Drugorzędowe przesuniecie Ηα dla peptydu 210 (SEQ ID NO:210) przy 25% TFE w 294 K wykazuje znaczące przesunięcie dla reszt od 4 do 15, wskazując na wysoce helikalną konformację. Małe różnice są obserwowane w chemicznym przesunięciu Ηα wysocezgodnego 22-meru (SEQ ID NO:75) w porównaniu do peptydu 210 (SEQ ID NO:210).

Przesunięcia chemiczne wodorów amidowych reszt aminokwasowych występują w regionach α-helikalnych, są także przesunięte zgodnie z przesunięciami chemicznymi obserwowanymi dla spirali losowej. Dodatkowo obserwowana jest okresowość przesunięć HN co odzwierciedla okres skrętu helikalnego. Amplituda zmian przesunięć wzdłuż sekwencji jest związana z amfipatycznością helikalnego peptydu. Wyższy moment hydrofobowy prowadzi do bardziej wyraźnych oscylacji (Zhou i wsp., 1992, J.Am.Chem.Soc. 114:4320-4326). Przesunięcie drugorzędowe HN peptydu 210 (SEQ ID NO:210) w 25% TFE przy 295 K ukazuje zachowanie oscylacyjne zgodne z amfipatyczną naturą helisy.

Przemieszczenia aminokwasów prowadzą do uwypuklonej okresowości wzdłuż całej sekwencji. Ten obraz jaśniej odzwierciedla silniejszą naturę amfipatyczną peptydu 210 (SEQ ID NO:210) w porównaniu do 22-merowego peptydu o wysokiej zgodności Segresta (SEQ ID NO:75). Można wyodrębnić obecność 4-5 obrotów helikalnych. Drugorzedowe przesunięcie protonu amidowego jest powodowane długością wiązania wodorowego związanego z tlenem węgla jeden obrót poza heliksem. Dlatego okresowość obserwowanego przesunięcia chemicznego odzwierciedla różnice długości wiązań wodorowych. Ta różnica związana jest całkowicie zakrzywionym helikalnym kształtem szkieletu helisy. Reszty hydrofobowe umieszczone są po stronie wypukłej. Drogorzedowe przesunięcia peptydu 210 (SEQ ID NO:210) wskazują na ułożenie α-helikalne

8. Przykład: test aktywacji LCAT.

Wszystkie wymienione w Rozdziele 6, powyżej, peptydy zostały przeanalizowane in vitro pod względem ich zdolności do aktywacji LCAT. W teście aktywacji LCAT pęcherzyki (SUV) zbudowane z fosfatydylocholiny z jajka lub 1-palmitylo-2-oleilo-fosfatydylocholiny i znakowanego izotopowo cholesterolu są preinkubowane z równą ilością peptydu lub ApoA-I (izolowaną z osocza ludzkiego). Reakcja jest rozpoczynana przez dodanie LCAT (izolowanej z osocza ludzkiego). Natywną ApoA-I, która została użyta jako kontrola pozytywna stanowi 100% zdolności aktywacyjnej. „Aktywność specyficzna (tj. jednostki aktywności (aktywacji LCAT)/ jednostki masy) peptydów mogą być wyliczone jako stężenie, które powoduje maksymalną aktywacje LCAT. Na przykład w celu zmierzenia „aktywności specyficznej- stężenia przy którym osiągnięta jest maksymalna aktywacja LCAT (tj. procent przemiany cholesterolu w ester cholesterolu) w określonym czasie (np. 1 h) - pomiary można przeprowadzić na serii stężeń peptydu (np. kolejnych rozcieńczeniach). Kiedy określa się procent przemiany cholesterolu w czasie np. 1 h, wobec stężenia użytego peptydu, „aktywność specyficzna może być zidentyfikowana jako stężenie w którym wykres osiąga na wykreślanej krzywej plateau.

8.1 Przygotowanie pęcherzyków substratu.

W teście aktywacji LCAT używane są pęcherzyki (SUV) zbudowane z fosfatydylocholiny z jajka lub 1-palmitylo-2-oleilo-fosfatydylocholiny i cholesterolu w stosunku molowym 20:1. W celu przygotowania pęcherzyków wystarczających na 40 testów należy rozpuścić 7,7 mg EPC (lub 7.6 mg POPC; (10 moli), 78 μg (0,2 μmoli) 4-¹⁴C-cholesterolu, 116 μg cholesterolu (0,3 μmoli) w 5 ml ksylenu, a następnie liofilizować. Do liofilizatu należy dodać 4 ml buforu reakcyjny i sonikować pod azotem w 4°C. Warunki sonikacji: sonikator Branson 250, końcówka 10 mm, 6,5 min. Skład buforu reakcyjnego: 100 mM Tris, 0,14 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4. Sonikat jest następnie wirowany 6 razy po 5 min przy 14 000 rpm (16 000xg) w celu usunięcia cząsteczek tytanu. Powstały przeźroczysty roztwór jest używany w reakcji enzymatycznej.

PL 200 744 B1

Do oczyszczania LCAT, używa się ludzkiego osocza traktowanego siarczanem dekstranu/Mg²⁺w celu uzyskania surowicy bez lipoproteiny (LPDS), którą następnie poddaje się chromatografii na złożach Phenylsepharose, Affigelblue, ConcanavalinA sepharose i chromatografii powinowactwa wobec anty ApoA-I, co zestawiono w tabeli IX, poniżej, przedstawiającej reprezentatywny przykład oczyszczania, wobec anty-ApoA-I, co zestawiono w tabeli VII, poniżej, przedstawiającej reprezentatywny przykład oczyszczania.

8.2. Oczyszczanie LCA

Do oczyszczania LCAT, używa się ludzkiego osocza traktowanego siarczanem dekstranu/Mg²⁺w celu uzyskania surowicy bez lipoproteiny (LPDS), którą następnie poddaje się chromatografii na złożach Phenylsepharose, Affigelblue, ConcanavalinA sepharose i chromatografii powinowactwa wobec anty-ApoA-I, co zestawiono w tabeli IX, poniżej, przedstawiającej reprezentatywny przykład oczyszczania, wobec anty-ApoA-I, co zestawiono w tabeli VII, poniżej, przedstawiającej reprezentatywny przykład oczyszczania.

T a b e l a IX Oczyszczanie LCAT

Frakcja	Objętość całkowita	Białko całkowite	Aktywność całkowita	Wydajność	Stopień oczyszczenia
Osocze	550	44550	63706
LPDS	500	31000	62620	98	1.4
Phenyl eepharose	210	363	51909	82	100.0
Affigel blue	95	153	25092	39	115.0
ConA Sepharose	43	36	11245	18	220.0
Powinowactwo Anty-A-I	120	3.5	5500	9	1109.0

8.2.1. Przygotowanie LPDS

Aby przygotować LPDS, 500 ml surowicy jest dodawane do 50 ml roztworu siarczanu dekstranu (MW=500000), mieszane przez 20 minut, wirowane przez 30 minut w 3000 rpm (16,000 x g) w 4°C. Do dalszego oczyszczania stosowany jest supernatant (LPDS) (ok. 500 ml).

8.2.2. Chromatografia na fenylosefarozie

Następujące materiały i warunki są stosowane do chromatografii fenylosefarozy:

faza stała: fenylosefaroza z szybkim przepływem, o wysokiej czystości, Pharmacia kolumna: XK26/40, wysokość złoża: 33 cm, V=około 175 ml szybkość przepływu: 200 ml/godz. (próbka) przemywanie: 200 ml/ godz.(bufor) wymywanie: 80 ml/godz (woda destylowana) bufor: 10 mM Tris, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 7,4, 0,01% azydek sodu.

Zrównoważyć kolumnę buforem Tris, dodać 29 g NaCl do 500 ml LPDS i nałożyć na kolumnę. Przemyć kilkoma objętościami buforu Tris do osiągnięcia dolnego poziomu absorpcji przy długości fali 280 nm, a następnie rozpocząć wymywanie wodą destylowaną. Frakcje zawierające białko są łączone (wielkość puli 180 ml) i użyte w chromatografii na Affigelblue.

8.2.3 Chromatografia na Affigelblue

Pulę frakcji z kolumny z fenylosefarozą dializuje się przez noc w 4°C wobec 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,01% azydku sodu. Objętość puli zmniejsza się poprzez ultrawirowanie (Amicon YM30) do 50-60 ml i nakłada ma kolumnę Affigelblue.

faza stała: Affigelblue, Biorad, kolumna 153-7301,

XK26/20, wysokość złoża: około 13 cm; objętość kolumny: około 70 ml szybkość przepływu: nakładanie: 15 ml/godz.

przemywanie: 50 ml/godz.

PL 200 744 B1

Zrównoważyć kolumnę buforem Tris. Nałożyć pulę frakcji z kolumny z fenylosefarozą. Równocześnie rozpocząć zbieranie frakcji. Przemyć buforem Tris. Zebrane frakcje (170 ml) użyto do chromatografii na ConA.

8.2.4. Chromatografia na ConA.

Frakcja z Affigelblue jest redukowana na Amiconie (YM30) do 30-40 ml i dializowana wobec początkowego buforu ConA (1 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM CaCl2, 0,01% azydek sodu) przez noc w 4°C.

faza stała: sefaroza ConA (Pharmacia) kolumna: XK26/20, wysokość złoża: 14 cm (75 ml) szybkość przepływu: nakładanie 40 ml/godz.

przemywanie (wyjściowym buforem): 90 ml/godz.

wymywanie: 50 ml/godz 0,2 M metylo-iz-D-mannozydem w 1 mM

Tris, pH 7,4.

Frakcje białkowe wymywane mannozydem zbierano (110 ml) i objętość zmniejszano poprzez ultrafiltrację (YM30) do 44 ml. Pule ConA dzielono na porcje 2 ml, które przechowywano w -20°C.

8.2.5 Chromatografia powinowactwa na anty-ApoA-I

Chromatografię powinowactwa na anty-ApoA-I przeprowadzono na złożu Affigel-Hz (Biorad), do którego kowalencyjnie skoniugowano przeciwciała anty-ApoA-I.

kolumna: XK16/20, V=16 ml. Kolumna była zrównoważona PBS pH 7,4. Dwa ml puli ConA dializowano przez 2 godz. wobec PBS przed nałożeniem na kolumnę. Szybkość przepływu: nakładanie: 15 ml/godz., przemywanie: (PBS) 40 ml/godz.

Zebrane frakcje białkowe (V=14 ml) użyto w testach LCAT.

Kolumnę regeneruje się 0,1 M buforem cytrynianowym (pH 4,5) w celu wymycia związanej A-I (100 ml) i natychmiast po tej procedurze równoważy się ponownie PBS.

8.3. Wyniki

Wyniki testu aktywności LCAT są przedstawione w tabeli X, poniżej.

PL 200 744 B1

AKTYWACJA LCAT WYKAZYWANA PRZEZ PRZYKŁADOWE PEPTYDY RDZENIOWE

a ^va «*< W

σ\

in 07

M⁴ cn

07 σ\

Γ*

f*7 07

fi f*·

-

CO 10

m *-* s>

ri

o

p·

o

tn

t-ł

O

XJ*

P

00

co

07

o

00

u>

P>

co

10

Sł w

«

dP W *-* o

Lf>

w

in

fO

07

o

P-

u>

o

•H

co

07

co

07

®

Ch

10

© 6

35

d? © «- «

r*

Ol

o

Γ»

p>

o

w

S-s

P-

t~

co

!Λ

P*

PS

10

3A

a

©V»

«M>

<AP

ώ©

e\*

<&»

ώ©

ds»

*

«&»

«7«

oVi

4#>

s&*

s **

O

U7

<22

f*7

o

07

C3

O

r*

η

o

σ\

07

Cł

CO H

07

co

ω

β

00

P·

r·

P*

u>

10

in

ΙΛ

rif

© >

id

a a

Cd

a

g

54

a

A

a

O

>3

to

>4

to

+4

to

w

a

54

a

54

a

2.

fc4

&M 9

a

HJ

O

0

Ο»

σ

O

θ'

O

σ

o

ą

Ct

α

0

S

z

a

54

Ss

54

a

&

0

&

>5

*3

to

a

to

N

9

to

*4

to

*4

o

N

*e

SE

<

«Ϊ

a

<

£

«5

*c

ta

£

ω

H

a

W

u

a

W

00

j

to

j

J

to

>4

k4

to

>3

to

«

to

i-3

>4

to

o

i-4

«4

>4

&3

a

&?

a

&d

a

KJ

a

w

a

55

a

z

Z

z

0

z

Z

55j

z

*5

Ol

flS

to

j

to

o

to

3

>4

to

»4

>4

to

>4

to

»4

>5

O

Cd

K

Cd

W

a

u

a

&

a

W

9

ϋ

Cd

a

ώ

C4

a

cci

a

P*

a

£5

&(

Cu

&k

£x<

feł

a

Ob

a

Uł

Ou

to

U<

©

to

*4

>4

£

o

Q

q

o

Q

O

Q

to

α

to

e

Ul

fM

»4

to

>4

►4

to

Φ

>

£>

>

> 0

>

g*

CU

£0

Ou

O

Cu

CU

a

&

a

&

a

Ob

O*

f*»

**»

to**.

i—»

to*w

·**»

«*

#*·»»

***

*·*»

O

H

03

f*7

in

P>

i-i

10

f*·

€0

07

H

to

ft

to

fi

H

fi

o

s

ó

ό

6

2

o

6

o

»» O

o

·· O

·« 0

o

6

o

Z

z

23

2

z

Z

z

Z

z

to

O

Q

£3

Q

to

o

to

Q

Π

o

ο

o

to

W

H

W

H

W

H

w

K

H

W

σ K

σ Cd

g

o u

σ w

0 a

σ a

o £

α 00

cx

o &3

o a

0 a

m

<Z3

ta

w

CO

W

Wł

CO

w

w *»·*

ta

w

3

M

'd

N

ł*1

•n

1©

»

07

o

M

m

to

m

10

c*

>1

H

Γ*»

rł

H

fi

to

ri

to

+ł

Λ

®

CU......

PL 200 744 B1 cd. Tabeli

fa ©* a

m σι

H CO

81

O cn

o σι

CM kO

95

& Ώ «*»

CM

O

00

r4

&

CO

Ol

<h

K0

U>

a

di» Q

σ»

O

*-» o

CM

00

o

00

r*

o

•H

co

<n

c\

<h

σι

iO

w

H

© g

a

«««h

te

# a> *— Φ

w

CM

1Λ

σι

co

a

in

u

Ti¹

o

00

co

tn

σι

a

Ό sm f-«

0 2

oY>

&

«ν»

Α»

«V»

ώΡ

o\o

o\®

afc®

A>

oV

ćV>

Λ»

rfP

<ip

»v

ά»

> *

03

co

r*

r-

<*i

r-i

c*

O

Cl

00

Μ*

en

m

CM

r-i

Η

&

Ln

in

«3·

Φ

V

<*>

n

(*)

<n

en

n

m

en

m*

nu—

&

bś

2

34

54

34

54

2

ω

3

41

J

41

4

41

4

43

•4

5

3

d

>4

3

bd

bi

54

2

54

2

54

2

2 s?

2 Ot

bd

<0

o

O*

σ

α

r>

34

Ct

Ot

O

Ot

9¹

9

s

US

54

us

54

rx

bs

2

b4

bej

•zi

44

>4

43

41

43

3

41

4

41

A

41

i4

3

O

<

rt

O

2

<

41

2

<

s

dl

2

<

<c a

C

&

Ul

W

M

a

W

a

W

rl

3

U)

►4

43

41

N

2

4)

>4

41

43

3

41

o

43

4

43

41

2

49

41

43

41

»4

2

43

i4

41

»4

3

§

a

ω

a

Cx2

a

2

o

2

z

2

z

Z

2

%

a

(C

»4

43

41

>4

3

41

4

3

4

>4

4

3

41

Ϊ-3

»4

3

>4

43

O

41

43

41

43

41

43

41

43

41

i4

UJ

3

o

W

U3

ca

a

Ul

os

PC

tf

a

43

a

bS

G

ił.

te

u<

a

te

ik

te

u<

te

Ck

£k

3

,<D

J

>4

43

41

43

u<

43

a

4

>4

41

tS3

2

3

£

Q

O

α

a

o

Q

O

(4

Q

G

(4

O

Ul

41

3

43

4

3

41

43

41

43

41

3

Έ5

i>

>

44

>

?

>

3

OT

U

a

CU

a

Pm

CU

2

CU

«»·»

*“»»

-

ω

σ

o

W

CM

Γ0

Xt»

in

w

r-

00

0>

o

w

CM

PO

M*

m

10

rH

iM

CM

a

m

<n

CH

en

<n

m

o

O

o

ó

o

O

o

O

2

o

O

2

z

2

z

2

Q

o

Q

O

Q

O

Q

O

Q

O

□

W

H

W

K

W

H

K

H

W

ot

ΓΧ

rx

α

o

cx

o

CX

ot

o

ot

Ot

Ol

Ot

o

Ol

W

td

a

to

ta

03

co

03

ta

03

0}

w

ra

***

*“*

Ό

co

O\

o

ł-ł

CM

m

*

W

«Ο

t-

00

o\

o

t-ł

CM

en

tn

10

>t jJ

r4

H

CM

en

<n

m

en

CU

Φ

CU

PL 200 744 B1 cd. Tabeli

X F* 5*4 ® fr* X

η e*

01

03 r*

o* o*

Ol KO

CO r·

KO 03

10 co

J> UT

KO

m r-

eo r*

75

5 58 ' i>

KO

rl

co

Ol

in

r*

tn

co

es

eh

rl

a

CO

P

t-

03

ko

r*

«

CS

Ul

X

CO

«

co

i

® X

X

- ·

<*> w *-* 9

in

C\

0\

M·

Ol

s·

X

in

s·

es

a

rł

es

•H

r~

w

cc

o*

0-

GO

CO

co

KO

CO

CS

4

O

V s

X

dP ® «- ®

tn

in

KO

co

m

in

o

-Φ

o

r-

co

ro

a

«

H

KO

es

kO

KO

in

rl

CS

es

co

in

KO

ca

r·

® <H

X

W oc g 4

Λ»

d*

<ńP

alP

<&*

e¥>

<&»

<&>

<Ae

dP

Λ»

<jy>

di»

Ch

Ol

in

m

Ul

m

Łf>

M*

Ol

CS

es

H

o

<h

Ol

ov

CS

es

03

CS

w

03

CS

OJ

es

CS

es

03

C3

CS

rj

K

H

i>ttfi

<

ίθ

X

3:

X

w

X

34

X

O

4

r-t

4

A

4

d

►3

»4

d

&

2

X

&

bd

3$

Ot

Qt

X

ot

Ot

er

Ot

o

Ot

O

O·

2*

s

ot

o

*»

x

S^4

X

ot

X

M

X

ί*ί

fac*

X

X o G

x

X < w

Ś w

a < X

a X

<c ®

% X

ś X

X

S: X

X

2 w

*4 X

*3 X

X

ś X

i

μ?

(4

4

.s

4

rS

4

*□

4

<4

•r|

4

X

4

X

o

4

A

X

R

3

X

W

et

X

®

X

aS

S

Z 4 4

M 3

X »3 4

1

z >3 X

1

G 4 X

§ X

z g

z 4 4

JS 3

X

s 4 4

s 4

1

z 4 4

§ 4

s w

♦n

x

W

X

W

X

®

X

z

M

W

X

o

X

«

X

z

X

£

X

M

X

&

X

s

X

S⁵

β

X

M4

X

E

fc

Wi

X

£

X

Φ *>

4

o

4

X

©

X

4

>4

4

H?

4

»4

S

*4

4

»4

o

Q

O

o

Q

Ό

a

o

O

Q

O

o

Q

a

Q

1

5

4

łl

4

>4

»3

μι

»4

4

A

4

2

»4

ł

gj w

>

j>

>

5>

S>

>

a

ś?

>

Ϊ

X

Oj

X

€1»

X

ft

X

t

G<

&

X

Q<

>

0<

&

*»*►

r*»

*·*«

r*·

a«*».

r-

»

σ>

o

rl

CS

n

sp

tn

KO

0*

CD

01

O

H

CS

ro

ś*

trt

«

o

n

Si

«3«

•Φ

*3»

s·

M·

M¹

χί·

s>

irt

in

ΙΛ

tn

m

in

• a

»»

• a

«»

»«

««

»·

·»

**

»a

«·

·«

«»

»♦

»»

*»

O

o

O

o

O

o

O

o

2

o

z

J3

Q

o

Q

a

Q

o

G

Q

a

£3

o

a

c

o

Q

a

M

4

K

W

H

w

W

M

W

M

w

W

H

4

K

M

W

o

CX

ot

0<

ot

Ot

ot

a

ot

Ol

ot

OI

X

w

X

w

03

co

W

03

X

03

X

03

w

X

03

Ol

X

»

M

03

*'**

%«·

Na*

W*

*ϋ

r*

ff»

O

4

es

<n

tn

KO

t*

co

Ol

O

r<

es

#*1

*

in

ίχ

m

w

m

S*

«#

<4*

S¹

*

•s*

s*

4$

w

m

Ul

in

tn

in

w

-μ

CU

<υ

—a—

PL 200 744 B1 cd. Tabeli

dP M X 0)^ »

00

o Γ-

<5\

KD KD

di> W

Γ0

0.

kd

n

fc

b

KD

M·

KD

00

m

<0

» w

a

# <8 *-* O

o

fc

Cł

o

00

IX

CD

00

co

OK

r-

Cfl

« e

a

.

dP Φ *-* 0)

fc

r-i

(X

n

T-t

KO

00

CM

(Q

O MU

SS

Ό r,

'Ul £

di®

e\®

dP

&

dp

«V»

dP

4fi

dP

eM>

dP

A°

«V»

dP

«Α»

di®

5e ^u

CD

00

CO

r-

kd

KO

KD

tn

fc

Cl

rM

iH

O

i-i

i—ł

r-i

H

r-f

H

rd

r-i

H

rt

H

r4

H

i-i

H

rH

-P #

44

«2

<β

fc

>

i4

fc

ł

fc

l

fc

0

fc

41

ł

41

>4

41

>3

*3

»3

41

A

U)

fci

X

fc

ł

fc

X

fc

X

fc

X

ΰ

σ

o

σ

O

CK

O

o

O

fc

O

o

g

Ol

σ

S¹

CK

a

54

ω

fc

X

fc

Q

fc

X

•M

41

4!

41

fc

k4

►4

4!

41

a

41

A

>3

ł-3

A

>3

A

0

3

2

<

a,

<

2

*fi

3

<

X

w

2

ω

fc

W

fc

«

fc

W

a

X

41

pi

J

41

>4

41

k4

fc

A

i-3

41

fc

41

fc

41

A

fc

X

A

fc

X

a

Łx?

X

ω

fc

U

fc a

fc

W

Ui

W

w

W

uu

U4

id

S

ω

s

a

s

a

fc

&

fc

a

5*

a

ζ

<e

41

a

41

A

>4

k4

>3

41

A

u

A

41

43

fc

41

4)

fc

W

fc

41

A

fc

►3

fc

41

X

X X

•o

fc

JS

H

fc

M

a

fc

M

fc

a

fc

W

fc

υ

X

fc

a

X

fi

fc

X

fc

X

a

fc

X

fc

X

fc

X

Φ

41

,q

fc

4,

41

fc

ω

fc

u

>4

A

fc

A

w

X

Cl

O

Ω

a

Ω

o

Ω

o

Cl

Ω

A

Ω

o

Ω

A

J

41

A

41

A

41

>4

41

t-3

A

k3

41

A

h3

Φ cn

>

S>

>

a

>

fc

>

►

fc

41

fc

1

fc

1

X

ui-*

#**

a*»a

KO

t

€0

cn

O

H

CM

n

M*

tn

KD

r~

00

Ok

O

H

CM

ro

Ί¹

in

tn

kd

KD

KO

KD

fc

KD

c*

r*

f*

r*

·»

_a.

• a

·.

,·

a.

·»

• a

aa

··

• a

··

·»

··

*·

o

O

o

O

o

O

o

O

o

g

a

Ϊ3

o

Q

Ω

o

Ω

o

Ω

o

Ω

o

Ω

a

Ω

H

W

M

H

W

H

W

H

W

K

M

H

W

H

W

H

K

c*

CK

σ

O

σ

Ol

d

o

σ

Ol

O

Ol

σ

ck

ω

fc

ω

fc

«

fc

u

w

fc

w

co

fc

m

co

fc

<n

w

to

Ul

w

CO

m

CD

W

*na*

*-*

*''*

***

-

kd

t

co

DK

o

rH

ru

fÓ

•Φ

ID

fc

r-

00

OK

O

rt

CM

<n

o*

>1

cn

m

tn

m

kd

KD

fc

KD

us

c*

Γ

r*

P«

c*

+1

PU

Φ £U

PL 200 744 B1 cd. Tabeli

5« «

55

66

69

100

οοτ

«·» <#> o fli CO W

ra cm

ko

rf? « *— q -H ® ^βsci

co CM

CO co

pH M?

o o K

O o H

dP 4> — J) h ® M4 a

co r-i

i—1

00 tfl

o o H

ra

Aktywność (%) LCAT

rfp O

rfp <n

«V» (Λ

rfp σι

rfp Ολ

<& OO

«V» P*

eM» r

rfp r-

«V» f*

rfp r-

rf0 ω

rfP w

rfp ko

Sekwencja aminokwasowa

ΪΑ g g g W 2 2 X Cd (4 fc M O 3 CU

w 2 *6 σ Si g Cd UJ X Cd fc UJ Ul Cd CA fc Cd Q UJ > Λ

X Ul id O X Ul ω UJ X X 2 g W CA fc Cd s fc

X 2 X O X uj Cd Ul X Id 1 o 2 fc Id O Ul > fc

X Ul X © X UJ Cd UJ UJ W 2 Ul Ul Cd X fc Cd a U) > cu

X UJ X X © g w UJ Ul Cd 2 Ul Ul CA Cd fc Ul Ω Ul > fc

X g g g Cd ►4 X s g Cd X fc Cd s §:

X 2 X © X U) *c Cd Ul X Cd 2 g Cd X fc Cd Ω Ul 1 1

X Ul X © £ Ul X Cd 2 g Cd X fc Cd O Ul £ fc

X g g g Cd Ul UJ u 2 UJ X Cd X fc Cd Ω Ul > fc

X U) X © X g Cd Ul 2 Cd 2 Ul Ul Cd X fc Ul Ω Ul I fc

X g X © 3 ra 3 Ul X Cd fc 2 Cd 2 fc

X i-l X $ r-ł (0 0» r-ł rd Φ tr r*ł i—ł Φ Λ! r-ł pK Φ M r-4 Ol

X 2 X g Ul Id Ul X ω 2 Ul Ul Id X fc X Ω Ul > &

X 2 X © X I g ra 3 X Cd X fc Cd 1

X Ul X © X g Cd Ul X Cd 2 2 X Cd X fc W Ω 1 1 1

X g o X 2 Cd 2 X Cd 2 3 Cd X fc U Ω 2 > fc

l/l c* o 2 a H © Cd ca

v© r- o 2 a w o Cd 03

P r> O 2 O H © Cd W W

co o 2 O ł-f © Cd CO

i«x r* § Cl H © Cd CO

o GO o 2 Q H © Cd co

ł-ł GO o 2 a w © w co

CM CO o 2 Ω I-I © Cd 03

ra 00 o 2 O w © Cd CO

GO o 2 Ω H © Cd CO

10 co § Ω I-I © cd co

k£> Q0 o 2 Ω W © W co

r* co o 2 Ω H © Cd CO

co CG o 2 Ω I-I © Cd CO

Ch co o 2 Ω H © Cd CO

O o 2 Ω H © Cd CO

r-ł o o 2 Ω H O Cd ca

Ό +> Φ .....a....

•χ m r-

ko r*

C

CO r*

σ» c**

o «0

r*ł GO

CM CO

<a co

00

m co

W CO

r* co

CO co

σ\ co

O σ\

H <n

Segrest's Consensus 22-rner peptide (Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10(1):95-105).

PL 200 744 B1 cd. Tabeli

[A¹’]-Consensus 22-mer peptide (Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10(1):95-105).

PL 200 744 B1 cd. Tabeli

K

i 58

#> ra © w s

ro CS

i? a — □ Ή $ ^gW

in

Ol Ol

d? « ra h © tu aa

cn rH

ID

Ό H 'in <ć O O id X 4J £ 44 <

<#» O

riP O

<#> O

O

eV> O

o

©V> O

<*> O

O

<fr> O

<>P O

$P o

©Μ» O

Sekwencja aminokwąsowa

X X X o X X ca X ci w z $3 ca m Ul ca 3 &

X X X σ X X ca X X X z X X ca ca x ca a X > a

X X X g Ś U) » X ca z Ś ω ot Ul ca s > Oi

X X X g ś ca co X UU 2 si ca 01 Ui 1» Ω g Οι

X X X o X X w >4 Oj ca z x X ca X Ul ca o X 5> Οι

X X X a X X *< ca .z X ca z X ca oi Ui ca Q X «* CU

X si σ X A < ca X X ca 1 ω (4 Cu ca o »4 X Oi

X X X σ X >4 < ca X X ca Z X X W 01 Eu ca Ω X K 0i

X si g *3 *( ta x X ca z g ca 01 Cu ca Ω x ca 0i

X X X Oi ca x < ca X X ca z X ca Di X ca Ω X > 0<

X si g S ca X ca tu z X X ca X X ca Ω X > X

X »4 X Oi X X X W X ω X z si X X X X Ω X > X

X X X OI 3 g X X X z X X X X X X 3 X

X X X Oi X X z X X X X z X X X X X X Ω X > X

X X X q X *c X X X u3 z X X X X X X Ω X a* σ

s o o o i X X w § X X o X X Ω X > X

X X X Oi X a X X X X z X X X X X X 8

CD o H o a o H σ ca ra

O r*1 i-4 § a w O ca w

*—> «Μ H H o z Ω H σ ca cn

Ol H H o z a w σ ω TO M*

*> H o z Ω H O u co

KT w H o z Ω M O ca co

tn rH ri ó z Ω H O ω ca

KD 1-1 rH o z Ω H a ca C0

Ο» 1-4 H i o H a ca CO M»*

CO r4 rH o z Ω I-I o< ω ca

<J\ i-i o z Ω w a ω CO

K*> o CS H § Ω H OI X ra Md*

W CS H O z Ω H Oi X CO M·**

CS CS H o z Ω H a X ra ·**

« N rt o Z Ω H Oi X co

CS r4 o z Ω W Oi X co

in CS rH o z Ω H Oi X w

X) >. +> CU <D

•M rt ch o H

O rt i-i

H <4 H

cs rł H

<n rH H

·» H r4

m H H

vo H H

r* W H

co H H

ΟΪ i-4 r-4

O M rt

H <S H

CS CS H

CO CS H

«ί< H

Ift CS H

[R¹’)-Consensus 22-mer peptide (Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10(1):95-105).

PL 200 744 B1 cd. Tabeli

£ra to «

58

Ift σ*

O 03

Μ»

O 00

«Μ U?

..... 55.....

J»*»

1» »

*·*

fft

ift

Ift

rH

Φ 5»

r-ł

CN

EN

CO

a

«Wto

«κ» m *-* u

W

O

W

N<

n

Ul

ί>

c*

t-

<3>

ift

a s

w

**»

df> «1

— ®

tft

r~

O

»

Cft

Łft

eo

w

ift

F“i

03

rt

Μ»

w

CN

a ή

ra

Ό

'S fc O *C $ 3 *%

s*>

ώ»

ώ*

w*

eV>

»>.«

ĆP

*·

tfr

&

«Μ

*»

Ift

MO

in

fft

t*

ift

O

Cft

Φ

m

Ift

o

O

0»

00

c*

P*

U9

44 ** ,24 &

r4

oo

Γ*

P-

M5

Ift

in

tn

Ν’

ta

i*l

«

n

<n

<N

04

<N

Pt

ra

< -

5

X

Łc*

X

JjGj.

X

&

X

»

β

G

β

41

u

3

β

«

2

X

M

X

w

X

3?

X

Λ O β

§

o

O; >4

8

s

o β

s

o

3

o β

o ł“3

o β

o

o β

o »4

o

Ą

*c

*s

<

«5

«:

<

a

3

.<

<

a

s

3

Q

G

o

Q

o

Ci

o

α

o

α

o

Q

β

o

β

ra

Q

β

J

G

E

O

β

41

β

β·

β

a

W i

G

41

β

4!

45

β

43

o

iJI

*4

β

tfi

2

«

os

ai

OS

2

«

ra

&

ra

0!

2

Οί

X

os

ra

«

te

M

«

Cd

«

ca

ra

w

ra

w

ra

ω

ra

ca

ra

β

>4

SE

>4

o

β

2

β

+4

β

·ΓΊ

*4

r-5

β

>4

β

41

43

3

β

>4

β

a

β

o '

B

*23

ss

B

a

%

a

55

a

β

W

ta

ra

M

ca

w

ra

ł-3

β

f/|

β

feg

ra

«

ra

Gi

to

ki

£h

X

E

to

ra

to

β

w

>3

G

43

»4

β

s!

β

β.

β

Φ m

ta

ca

ra

ca

K

«

ra

££f

ω

o

ra

J-4

G

β

41

a

4!

ra

h4

β

»4

β

5

>

t¹

>

α

a»

Ot

04

Eu

£fe

0*

ra

Ski

ra

&

to

Ot

5,.

to

·**.

-««*

***

-*to

«<·%.

***»

»·*»

r-»

4*W,

r*i

-«to,

łft

X

Ol

O

H

CN

m

a<

Ift

ift

r·*

CC

<h

O

rd

«

<n

<,

sf

N*

V

Ift

ift

TO

ift

in

tft

ift

TO

ift H

U5

U3

to

tri

H

«Μ

r-i

r-ł

t-ś

rl

K

rt

ri

r*i

rł

H

Η

H

«Μ

·»

««

»«

4«

»ł

»·

··

·«

«<

·«

««

»«

a»

»«

•4

>1

>·

>»

I

o

s

o

O

ο

O

o

2

ss

2

B

2

B

a

a£t

a

jgj

2

52<

S2i

a

Cl

o

O

α

O

»

o

β

α

Ω

α

Q

β

Q

n

Cł

o

W

M

w

H

IM

W

K

W

M

W

κ

3M

IM

M

w

W

α

o

O

o

σ

o

σ

o

ra

w

X

to

ca

K

ra

u

ra

ta

ra

TO

ra

TO

ra

TO

w

TO

*-*·

W-*

w

>w-»

**

X4

**

W-s

«Μ*

***

W-*

w—

*ti >1

ift

V

t*»

»

m

o

r-i

CN

ł*S

a*

ift

N>

to

CS

<h

o

w

CN

m

N*

*

#

ift

m

Łft

ift

Sft

ift

Ift

u>

Ift

4Z) gi

H

rt

H;

T-ł

iM

rt

W

«Μ

H

H,

H

β

rt

w

H

Φ 04

PL 200 744 B1 cd. Tabeli

* w h ®F* K

61

He (%) SUV8

H in

α ** o •H s^s

ko

He (%) free

> ra

Aktywność (%) LCAT

oY» CM

«V ra CM

•V» CM CM

GO rd

p* rd

A® P- rd

«V > rd

A® kO rd

& kO rd

flV» in rd

ok® ra rd

ra rd

Λ» rd rd

rfe o rd

A® Ok

«V* CO

co

GO

rfP t*

Sekwencja ćirainokwasowe

X g X o s 2 X ω 2 2 Z W fc 2 Cd 2 > fc

X 2 X X © 2 2 Ω 2 2 X Cd 2 2 Z W fc 2 Cd 2 > fc

X 2 X X 3 o 2 2 X Cd 2 2 Z 2 fc 2 ω 2 > fc

X 2 X X © 2 4 O 2 2 X Cd 2 U Z W fc 2 Cd 2 > fc

X 2 X X © 2 O 2 2 X W 2 2 © Cd b 2 ω 2 > fc

X 2 X X © 2 Ω 2 2 X Cd 2 2 Z Cd fc 2 Cd 2 > fc

o 2 § © 2 g 2 2 <-> X 2 2 Z « fc 2 W 2 > fc

X 2 X X © 2 2 Ω 2 2 X Cd 2 2 Z Cd h 2 Cd 2 > fc

X 2 X X © 2 g s X id 2 2 fc 2 Cd 2 > fc

X 2 X X Z 2 2 Ω 2 2 X Ω 2 2 Z Ω fc 2 Ω 2 > fc

pvlelfenllerlldalqkklk

X 2 X X Z 2 2 Cd 2 2 X ω 2 2 Z Id fc 2 ω 2 > fc

X 2 X X © 2 g 2 2 X W 2 2 Z Id z 2 ω 2 £

X g X © 2 g 2 2 X Id 2 2 Z 2 fc 2 W 2 δ

X 2 X X © 2 W 2 2 X Cd 2 2 Z Ω fc 2 Cd 2 > fc

X 2 X X © 2 g 2 2 X Cd 2 2 Z Ω fc 2 Cd 2

X 2 X X © 2 Ω 2 2 X Ω 2 2 Z a χ 2 X 2 > fc

X 2 X X © 2 g 2 S X w 2 2 Z X fa 2 X 2 > fc

X 2 X X © 2 < X 2 2 X X 2 2 Z X fc 2 X 2 > fc

-M¹ kO rd o z Ω I-I © ω w

in ω rd o z Ω I-I © Cd CO

kO kO rd o z Ω H © Cd CO

t- kO rd o z Ω H © Cd CO

CO kO rd o z Ω M © ω co

Ok ko rd o z Ω I-I © Cd CO

o Γ- Η O Z Ω H O Cd CO

rd p* rd o z Ω I-I © Cd CO KF>

CM p» rd o 2 Ω I-I © Cd CO

ra P* rd O z Ct I-I © U CO

M· P* rd O z Ω I-I © Id CO

iA P- rd O z Ω I-I © X CO

kO P* rd O z Ω H © Cd CO K*

Ρ» P· rd o 2 Ω H a Cd CO Km*

GO P* rd O 2 Ω H O Cd CO

Ok P* rd o 2 Ω H © Cd CO

O 00 rd o 2 Ω H © ω co

rd GO rd o 2 Ω H © X w

CM 00 H § Ω H © X CO

Peptyd

kO rd

ΙΛ kO rd

ko kO rd

p· kO rd

GO ko rd

Ok ko H

o P* H

H p* H

M Γ- Η

ra r* rd

P* rd

in p* H

kO P* rd

Γ- Γ- Η

GO P* rt

Ok P* rd

o €0 H

rd CO rd

CM OO rd

PL 200 744 B1 cd. Tabeli

df B «*0* Ul ·* »

!Si

ł

G0 tn

Λ ta

dP »

m

co

o

p

CM

M*

10

w

<**►

d° (Q *·* ϋ

10

CM

σι

•H

tn

10

Γ-

<«·

© s

K

#**

dP 0) *-* Φ

r-ł

o

σι

CM

ra

M*

Μ»

© Ή

a

ό

o*«

•*3

«¥> CM

dP

Λ°

Λ>

«V»

Λ

oY>

dP

dP H

dP σι

&> Η

£,

CO

ω

GO

H

r-ł

O

Γ(

rH

Η

•Hd?

ΧΞ-

2

«3

z

0

ra

Λ

*

Z

2

te

Ul

A

4)

2

4

2

4

2

4

3

o

2

4

43

2

4

2

4

a

Ul

G

CX

O

α

O!

Ot

O

Ot

2

O<

Ot

3

bi

2

4

a,

2

'4

2

o*

a

2

Ot

3

4

41

4

ra

4

z

2

H

a

2

a

2

a

G

2

a

Ul

a

Ul

<v

a

2

4

ra

43

41

4

z

2

ra

4

a

>

2

43

41

4

ra

4

ra

4

3

2

‘ΓΊ

a

s

a

2

ϋ

a

04

a

&

Um

>«

i*

G

te

Ui

te

Ui

o

Ui

a

(U

41

2

4

2

4

3

4

3

'Ss

G

O

Q

O

G

o

O

Q

Ω

a

Q

a

3

2

W

Ai

43

4

3

o

4

3

Φ

>

4

G

5

z

OT

G

te

CU

3

a

CM

cn

M·

in

ra

r*

CS

σι

o

H

CM

ra

GO

σι

CM

(M

CM

m

n

en

σι

ra

CM

O

o

O

o

O

Z

z

25

z

Z

2

o

Q

o

Q

w

M

H

w

H

W

K

W

H

K

W

θ'

ΓΧ

θ'

o

ot

Ol

ot

o

ot

Ot

ot

σ

Ol

a

ra

w

**

***

·**

***

****

*»·*

Om*

Ow*

X

Ό

Ή

CM

<n

Mp

m

10

ra

00

σι

o

f-ł

CM

*

Sm +1

CM

en

<n

m CM

fO CM

σι CM

CM

CU

Φ

CO tn in

Ol

CQ m

σι i

σ co σι

G Ć rt _M ra £ ffl co

Oł

4J

0\

0>

te

M

TL·

a)

CH fl$ SC “iś O

-r £

-18AM4-C(O)NH₂ r Oe'o4uo( 'Brasseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:1-7).

PL 200 744 B1 cd. Tabeli

* W b z	57				co s»	£< W
d? m © ra z	ΙΛ			o tn	CO r-ł	O	Γ* s·		co H
#> a Μ-» U •H S^B	co <0			KO	o	r* r-			LA S*
He (%) free	i-i			O rH		co co	00 iH		CO H
Aktywność (%) LCAT	O i-ł	«*> CO	a\o	ĆP in	tfr in	oW s*	oV> S*	& Γ0	fr co
Sekwencja aminokwasowa	+ Cu ω X X X ω g X Ω h Ś X Z Ω	Cu Eu ra X bu X ra Cu X Ω £ g Cu Z Ω	ra £ S H Cu X Z H TO ra X Cu X X H ra	h ra X Cu X ra £ g a Cu Z Ω	Cu < ra X X X ra £ £ g X z Ω	Cu Cu ra X Cu X ra Cu > X Ω £ s X Z Ω	Cu X ra X X X ra X & X Ch Cu ra X z ra	Cu Cu ra X Cu X ra Cu Cu X Ω ra 3 ra z Ω	ra X ra X X X ra X £ ra £ 3 X z K	d Cu X ra X X X ra ra £ ra £ X z ra	* Cu X ra X X X ra X %£ u >· ra s X z H
	O s· CS o z Ω H O ra ra	rH CS o z Ω H O ra m	CS CS o z Ω I-I CU ra ra	CO CS o z Ω H Ol ra TO	«Ψ S¹ CS o z Ω H σ ra ra	in CS o z Ω I-I Oi ra m	KO S* CS o z Ω I-I Oi ra ra	s· CS o z Ω H Ol ra ra	GO CS O z Ω H Oi ra m	o> S¹ CS o z Ω H Ol ra ra	r—* o in CS o z Ω w σ ra ra
Peptyd	O S· CS	rH CS	X P« Ol * Ol	CO s« CS	*> ·» S¹ s· CS	io s< CS	> ·» ko * CS	s* CS	*s. O 4 CO s< CS	«4 ri OK s* CS	<4 O in <s

^12/ AC-18AM2-C (O) NH₂ (Rosseneu et al. , WO93/25581).

PL 200 744 B1

cd. Tabeli ^n/ Ac-18AM1-C(O)NH, (Rosseneu et al,_f WO93/25581).

PL 200 744 B1

W tabeli X * oznacza peptydy, które są N-końcowo acetylowane i C-końcowo amidowane; ^t oznacza peptydy N-końcowo dansylowane; sp oznacza peptydy wykazujące problemy z rozpuszczalnością w warunkach eksperymentalnych; X jest Aib; Z jest Nal; O jest Orn; He (%) oznacza stopień helikalności; mics oznacza micelle; i - oznacza wydeletowane aminokwasy.

9. Przykład: farmakokinetyka agonistów ApoA-I

Można zastosować następujące przykłady do pokazania, że agoniści ApoA-I są stabilni w krążeniu i wiążą się ze składnikami surowicy.

9.1. Synteza znakowanych radioaktywnie peptydów.

Wyznakowane radioaktywnie peptydy syntetyzuje się poprzez przyłączenie wyznakowanego ¹⁴C-aminokwasu jako aminokwasu N-końcowego. Syntezę przeprowadza się według Lapatsanis, Synthesis, 1983, 671-173. Pokrótce, 250 pM niewyznakowanego N-końcowego aminokwasu rozpuszcza się w 225 gl roztworu 9% Na2CO3 i dodaje się do roztworu (9% Na2CO3) z 9,25 mBq (250 gM) wyznakowanego ¹⁴C N-końcowego aminokwasu. Mieszanina jest chłodzona do 0°C, mieszana z 600 gl (202 mg) 9-fluoroenylometylo-N-sukcynimidylowęglanu (Fmoc-OSu) w 0,75 ml DMF i wytrącana w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę ekstrahuje się dietyloeterem (2x5 ml) i chloroformem (1x5 ml), a pozostałą fazę wodną zakwasza się 30% HCl i ekstrahuje chloroformem (5x8 ml). Fazę organiczną suszy się nad Na2SO4, odfiltrowuje i objętość zmniejsza pod strumieniem azotu do 5 ml. Czystość określa się poprzez TLC (CHCL3:MeOH:Hac, 9:1:0,1 v/v/v. stacjonarna faza RPTLC żelu krzemionkowego 60, Merck, Niemcy).

9.2. Farmakokinetyka u myszy

W każdym eksperymencie, 2.5 mg/kg znakowanego radioaktywnie peptydu jest wstrzykiwane dootrzewnowo myszom, które są karmione normalnym mysim pokarmem lub miażdżycogenną zmodyfikowaną karmą Thomas-Harcrofta (prowadzącą w rezultacie do poważnie zwiększonego poziomu cholesterolu VLVL i IDL). Próbki krwi pobiera się w punktach czasowych celem oznaczenia radioaktywności w osoczu.

9.3. Stabilność w ludzkiej surowicy

Stabilność agonistów ApoA-I wynalazku w surowicy przedstawiono jak poniżej.

9.3.1. Metody eksperymentalne

100 gl peptydu wyznakowanego ¹⁴C (otrzymanego jak opisano w Rozdziale 9.1, powyżej) miesza się z 2 ml świeżego osocza ludzkiego (w 37°C) i odtłuszcza bądź bezpośrednio (próbka kontrolna), bądź po 8 dniach inkubacji w 37°C (próbka testowa). Odtłuszczanie przeprowadza się poprzez ekstrakcję tłuszczów równą objętością mieszaniny chloroform:metanol 2:1 (v/v).

Próbki nakłada się na kolumnę HPLC C18 z odwróconymi fazami i wymywa liniowym gradientem (25-58% przez 33 min) acetonitrylu (zawierającego 0,1% TFA). Profile elucji śledzi się poprzez pomiar absorpcji (220 nm) i radioaktywności.

9.4. Tworzenie się cząstek typu pre-β.

Zdolność agonistów ApoA-I według wynalazku do tworzenia cząstek pre-β określa się tak, jak opisano poniżej.

9.4.1. Metoda eksperymentalna

Ludzki HLD izoluje się poprzez ultrawirowanie w gradiencie gęstości KBr przy gęstości d= 1.21 g/ml w celu otrzymania górnej frakcji, a następnie sączenie molekularne na Superose 6 w celu oddzielenia HLD od innych lipoprotein. Izolowany HLD doprowadza się do końcowego stężenia

1,0 mg/ml roztworem soli fizjologicznej w oparciu o zawartość białek oznaczoną metodą Bradforda.

Z preparatu wyizolowanego HDL pobiera się próbkę 300 gl i inkubuje ze 100 gl wyznakowanego ¹⁴C peptydu przez 2 godziny w 37°C. Analizuje się pięć odrębnych inkubacji, włączając w to ślepą próbę zawierającą 100 gl soli fizjologicznej i cztery rozcieńczenia peptydu wyznakowanego ¹⁴C: (i) 0,20 gl peptyd:HDL, stosunek 1:15; (ii) 0,30 gg/gl peptyd:HDL, stosunek 1:10; (iii) 0,60 gg/gl peptyd:HDL, stosunek 1:5; oraz (iv) 1,00 gl/gl peptyd:HDL, stosunek 1:3. Po dwóch godzinach inkubacji 200 gl porcje próbek (całkowita objetość=400 gl) nakłada się na kolumnę do sączenia molekularnego Superose 6 w celu oddzielenia i analizy lipoproteiny, a 100 gl używa się do określenia całkowitej radioaktywności nałożonej na kolumnę.

9.5 Połączenie agonistów ApoA-I z ludzkimi lipoproteinami

9.5.1. Metody eksperymentalne

Zdolność agonistów ApoA-I według wynalazku do łączenia się z frakcją ludzkich lipoprotein określa się poprzez inkubację peptydu wyznakowanego ¹⁴C z każdą klasą lipoproteiny (HDL, LDL i VLDL) i mieszaniną rożnych klas lipoprotein.

PL 200 744 B1

HDL, LDL i VLDL izoluje się poprzez ultrawirowanie w gradiencie gęstości KBr przy gęstości d=1,21 g/ml i oczyszcza poprzez FPLC na kolumnie ze złożem do sączenia molekularnego Superose 6 (chromatografię przeprowadza się przy szybkości przepływu 0,7 ml/min, w buforze 10 mM Tris (pH 8), 115 mM NaCl, 2 mM EDTA i 0,01% NaN3). Peptyd wyznakowany ¹⁴C inkubuje się z HDL:LDL:VLDL przy stosunku peptyd:fosfolipid 1:5 (stosunek mas) przez dwie godz. w 37°C. Wymagana ilość lipoprotein (objętości oparte o ilość niezbędną dla uzyskania wydajności 1000 pg) miesza się z 0,32 ml wyjściowego roztworu peptydu (1 mg/ml) i roztwór doprowadza się do 2,2 ml przy zastosowaniu 0,9% NaCl.

Po inkubacji przez 2 godziny w 37°C, próbki (0,1 ml) mierzy się w ciekłym scyntylatorze w celu określenia całkowitej radioaktywności, gęstość pozostałej mieszaniny inkubacyjnej doprowadza się do 1,21 g/ml KBr i próbki zwirowywuje się przy 100000 rpm (300000 g) przez 24 godziny w 4°C w rotorze TLA 100.3 przy zastosowaniu ultrawirówki stołowej Beckman. Otrzymany supernatant frakcjonuje się, pobierając 5 frakcji po 0,3 ml próbki od góry każdej próbki i 0,05 ml każdej frakcji używa się do zliczeń w płynnym scyntylatorze. Górne dwie frakcje zawierają unoszące się lipoproteiny, inne frakcje (3-5) odpowiadają białkom/peptydom w roztworze.

9.6 Agoniści ApoA-I według wynalazku selektywnie wiążą lipidy HDL w ludzkim osoczu

9.6.1. Metody eksperymentalne.

W celu wykazania, że agoniści ApoA-I według wynalazku selektywnie wiążą białka HDL w ludzkim osoczu, 2 ml ludzkiego osocza inkubuje się z 20, 40, 60, 80 i 100 pg wyznakowanego ¹⁴C peptydu przez 2 godz. w 37°C. Lipoproteiny wydziela się poprzez doprowadzenie do gęstości 1/21 g/ml i wirowanie w rotorze TLA 100.3 C przy 100000 rpm (300000 g) przez 36 godz. w 4°. Górne 900 pl (jako frakcje po 300 pl) pobiera się do analizy. W 50 pl z każdej 300 pl frakcji zlicza się radioaktywność

200 pl z każdej frakcji analizuje się poprzez FPLC (kombinacja kolumn Superose 6/Superose 12).

10. Przykład: Agoniści ApoA-I sprzyjają wypływowi cholesterolu

Aby pokazać, że agoniści ApoA-I wynalazku sprzyjają wypływowi cholesterolu komórki hepatomy HepG są nanoszone na 6-dołkowe płytki do hodowli i hodowane do osiągnięcia konfluencji. Komórki znakuje się ³H-cholesterolem poprzez wysuszenie cholesterolu, a następnie dodanie 1% albuminy z surowicy wołu (BSA) w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS), sonikowanie roztworu i dodanie 0,2 ml takiego wyznakowanego roztworu i 1,8 ml pożywki hodowlanej do komórek tak, że każda studzienka zawiera pCi radioaktywności. Komórki inkubuje się przez 24 godziny z po-żywką do znakowania. Peptyd (lub białko):kompleksy DMPC są przygotowywane w stosunku peptyd (lub białko):DMPC 1:2 (w:w). Aby przygotować kompleksy, peptyd lub natywne ludzkie białko ApoA-I jest dodawane do roztworu DMPC w PBS inkubowane w temperaturze pokojowej przez noc, po tym czasie roztwór staje się przejrzysty. Stężenie białka lub peptydu w roztworze końcowym wynosi około 1 mg/ml.

Przed dodaniem kompleksów podłoże znakujące jest usuwane znad komórek i i komórki przemywa się PBS przed dodaniem kompleksów. Do każdej studzienki dodaje się 1,6 ml pożywki wzrostowej, a następnie kompleks peptyd (lub białko):DMPC i odpowiednią ilość PBS, aby doprowadzić do końcowej objętości 2 ml na studzienkę. Końcowe stężenie peptydu lub ApoA-I wynosi około 1, 2,5, 5, 7,5 i 25 pg/ml pożywki. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C, pożywkę usuwa się, komórki przemywa ml 1% BSA/PBS, a następnie dwukrotnie przemywa się 2 ml PBS. Ilość ³H-cholesterolu wypływającego do pożywki określa się poprzez zliczenia w liczniku scyntylacyjnym.

11. Przykład: Zastosowanie agonistów ApoA-I w zwierzęcych systemach modelowych.

Skuteczność agonistów ApoA-I wynalazku została zademonstrowana na królikach. Wyniki pokazują, że podawanie agonistów ApoA-I zwiększa stężenie cząsteczek przypominających HDL w surowicy.

11.1. Przygotowanie kompleksów fosfolipid/peptyd

Małe diskoidalne cząstki składające się z fosfolipidów (DPPC) i peptydu 146 (SEQ ID NO:146) zostały przygotowane według następującej metody dializy cholanowej. Fosfolipid rozpuszczano w chloroformie i suszono w strumieniu azotu. Peptyd rozpuszczano w buforze (roztwór soli) w stężeniu 1-2 mg/ml. Film lipidowy rozpuszczano ponownie w buforze zawierającym cholan (43°C) i dodawano roztwór peptydu w stosunku fosfolipid/peptyd 1-3. Mieszaninę inkubowano przez noc w 43°C, a następnie dializowano w 43°C (24 godz.), temperaturze pokojowej (24 godz.) i 4°C (24 godz.) z trzema zmianami buforu (duże objętości) w temperaturze pokojowej. Kompleksy do zastrzyków sterylizowano poprzez filtrowanie (0,22 pl) i przechowywano w 4°C.

11.2. Izolacja i charakteryzacja cząsteczek peptydowo/fosfolipidowych.

Cząstki były rozdzielane na kolumnie do sączenia molekularnego, (Superose 6 HR). Pozycja piku zawierającego cząstki była identyfikowana poprzez pomiar stężenia fosfolipidów w każdej frakcji.

PL 200 744 B1

Na podstawie objętości po elucji, można określić promień Stokesa. Stężenie peptydu w kompleksie określono poprzez oznaczenie zawartości fenyloalaniny (poprzez HPLC), a następnie przeprowadzono 16 godz. kwaśną hydrolizę.

11.3. Zastrzyki na królikach

Samcom królików New Zealand (2.5-3 kg) wstrzykiwano dożylnie dawkę kompleksu fosfolipidowo/białkowego (8 mg/kg masy ciała peptydu 146 (SEQ ID NO: 146) lub 10 mg/kg masy ciała ApoA-I (wyrażanych jako zawartość peptydu lub białka) w pojedynczym, jednorazowym zastrzyku nie przekraczającym 10-15 ml. Przed zabiegami zwierzęta były lekko uspokajane. Próbki krwi (zebrane na EDTA) były pobierane przed i 5, 15, 30, 60, 240 oraz 1440 minut po zastrzyku. Hematokryt (Hct) był określony dla każdej próbki. Próbki były porcjowane i przechowywane w -20°C przed analizą.

11.4. Analiza surowicy królika

Lipidy surowicy. Całkowity cholesterol i trójglicerydy surowicy były oznaczane enzymatycznie stosując komercyjnie dostępne testy zgodnie z protokółami producenta (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany and Biomerieux, 69280, Marcy-1'Etoile, France).

Profile lipoproteinowe. Profile lipoproteiny osocza dla frakcji otrzymanych po rozdzieleniu osocza na frakcje lipoproteinowe określano poprzez odwirowanie w gradiencie sacharozy. Frakcje zbierano i w każdej z frakcji zmierzono enzymatycznie zawartość fosfolipidu i cholesterolu.

12. Przykład: Przygotowanie kompleksów peptydo-lipidowych drogą koliofilizacji.

Zastosowano następujący protokół do przygotowania kompleksów peptydowo-lipidowych.

Jeden mg peptydu 210 (PVLELFENLWERLLDALQKKLK; SEQ ID NO: 210) był rozpuszczany w 250 ul metanolu czystości HPLC (Perkin Elmer) w jednomililitrowej przezroczystej probówce szklanej z nakrętką (Waters #WAT025054). Rozpuszczanie peptydu było ułatwione poprzez okresowe wytrząsanie przez okres 10 minut w temperaturze pokojowej. To tej mieszaniny dodawano 3 mg dipalmitoilo-fosfatidylo-choliny (DPPC; Avanti Polar Lipids, 99% czystości, produkt numer 850355) z 100 mg/ml wyjściwego roztworu w metanolu. Objętość mieszaniny była doprowadzana do 400 ul poprzez dodanie metanolu, mieszanina była dalej wytrząsana sporadycznie przez okres 10 minut w temperaturze pokojowej. Do probówki dodawano 200 ul ksylenu (Sigma-Aldrich 99% czystości, do HPLC) i probówki wytrząsano na worteksie przez 10 sekund. W wieczku probówki wykonano dwa małe dziurki igłą do strzykawki kaliber 20, probówkę zamrażano przez 15 sekund w ciekłym azocie i liofilizowano przez noc pod próżnią. Do probówki dodawano 200 ml 0,9% roztworu NaCl. Probówka była wytrząsana przez 20 sekund. Po tym czasie roztwór w probówce miał mleczne zabarwienie. Probówka była następnie inkubowana w łaźni wodej przez 30 minut w 41°C. Roztwór stawał się przezroczysty (tj. przypominający wyglądem wodę) po kilku minutach inkubacji w 41°C.

12.1. Charakteryzacja kompleksów przez sączenie molekularne na Superose 6.

Kompleksy peptydowo-fosfolipidowe zawierające peptyd 210 (SEQ ID NO:149) były przygotowywane przez koliofilizację jak opisano powyżej. Preparat zawierał wagowo 1 mg peptydu i 3 mg DPPC. Po zawieszeniu kompleksów w 200 ul 0,9% NaCl, 20 ul (zawierających 100 ug peptydu 149) kompleksów nakładano na kolumnę Pharmacia Superose 6 przy zastosowaniu 0,9% NaCl jako fazy ciekłej przy szybkości przepływu 0,5 ml/min. Chromatografię śledzono poprzez pomiar absorpcji lub rozpraszania światła o długości fali 280 nm. Zbierano 1 ml porcje. Porcje zawierające 20 ul były testowane na zawartość fosfolipidów stosując zestaw bioMerieux Phospholipides Enzymatique PAP 150 (#61491) według instrukcji dostarczonych przez wytwórcę. Większość zarówno fosfolipidów, jak i absorpcji UV, odzyskiwano razem w kilku frakcjach z pikami przy około 15,8 ml. Ta objętość przesączu opowiada średnicy Stokesa 87 angstremów.

Dla porównania, oddzielny chromatogram 20 ul ludzkiego HDL2, był rozwijany w tych samych warunkach i stosując tą samą kolumnę jak dla kompleksów peptydu 210 (SEQ ID NO:210). HDL2 przygotowano jak następuje: 300 ml zamrożonego ludzkiego osocza (Mannheim Blutspendzentrale #1185190) rozmrożono, doprowadzono do gęstości 1,25 stałym bromkiem potasowym i wirowano przez 45 godzin przy 40000 rpm używając rotora Ti45 (Beckman) w 20°C. Unoszącą się warstwę zebrano, dializowano wobec wody destylowanej, doprowadzano do gęstości 1,07 stałym bromkiem potasu i wirowano tak, jak opisano powyżej przez 70 godzin. Spodnią warstwę (na poziomie około 1 cm powyżej dna probówki) zbierano, doprowadzono do stężenia 1,01% azydku sodu i przechowywano w 4°C przez 4 dni do czasu wykonania chromatografii. Wypływ z kolumny śledzono poprzez pomiar absorpcji lub rozpraszanie światła o długości fali 254 nm. Serie białek o znanych ciężarach cząsteczkowych i średnicy Stokesa zastosowano jako standardy do kalibracji kolumny w celu obliczenia średnicy Stokesa cząstek (Pharmacia Gel Filtration Calibration Kit Instruction Manual, Pharmacia Labora68

PL 200 744 B1 tory Separation, Piscataway, NJ, skorygowano kwiecień, 1985). HDL2 wymywany przy objętości retencji 14,8 ml odpowiada średnicy Stokesa 108 nm.

13. Przygotowanie przeciwciał

Aby przygotować przeciwciała przeciwko agonistom ApoA-I według wynalazku, peptyd jest koniugowany z hemocyjaniną z małży (KLH; 1 mg peptydu na 10 mg KLH). Koniugat KLH (LMG) jest rozpuszczany w pełnym adjuwancie Freunda i wstrzyknięty królikom w czasie 0 i wzmocniony 0.25 mg koniugatu KLH w 4 tygodniu i ponownie w 5 tygodniu. Próby przed-skrwawieniowe i w sześć tygodni po skrwawieniu są testowane na ilość przeciwciał przeciwko prawdziwemu antygenowi testem ELISA.

Krew jest zbierana z dwóch królików. Przeciwciała skierowane wyłącznie przeciw antygenom peptydów są izolowane jak następuje:

1. Wolny peptyd jest przyłączany do aktywowanej bromkiem cyjanogenu Sefarozy 4B (Pharmacia) według protokołu producenta.

2. Surowice są adsorbowane na kolumnie odpowiednich petydów, i na kolumnach odpowiednich ludzkich i mysich białek surowicy zgodnie z protokołami producenta.

3. Pre-adsorbowana surowica przechodzi przez odpowiednią kolumnę peptydową (patrz punkt 1).

4. Kolumny są przemywane solą fizjologiczną buforowaną 0.1 M boranem (pH 8.2) i związane przeciwciała są eluowane stosując niski gradient pH od 4.0 do pH 3.0 do pH 2.0 (0.1 M bufor glicynowy) i końcowo 0.1 M HCl.

5. Eluowany materiał jest neutralizowany nadmiarem soli fizjologicznej buforowanej boranem, koncentrowany poprzez ultrafiltrację (Amicon, YM30) i dializowany wobec soli fizjologicznej buforowanej boranem.

6. Stężenie białka jest określane przez absorbancję przy 280 nm.

Powstałe przeciwciała są testowane na specyficzność gatunkową stosując oczyszczoną ludzką ApoA-I lub oczyszczona mysią ApoA-I w bezpośrednim teście wiązania ELISA.

Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony zakresem specyficznych, opisanych tutaj przykładów, które mają na celu zilustrowanie poszczególnych aspektów wynalazku i zamienników funkcjonalnych sposobów i składników mieszczących się w zakresie wynalazku. Różne modyfikacje wynalazku poza tutaj opisywanymi staną się widocznymi dla fachowców na podstawie niniejszego opisu i towarzyszących mu rysunków.

W tym celu wszystkie cytowane odnośniki literaturowe sa włączone do niniejszego opisu.

PL 200 744 B1

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY: Dasseux, Jean-Louis Sekul, Renate Buttner, Klaus Cornut, Isabelle Metz, Gunther

[ii) TYTUŁ WYNALAZKU: TERAPIA GENOWA DOSTARCZAJĄCA AGONISTÓW ΔϋΓ)Τ.ΤΡΓ)ΏΏ/ΊΤΓΤΜν Δ-Ί ίΊΡ Δ 7. T PH punoAn

DYSLIPIDEMICZNYCH, (iii) LICZBA SEKWENCJI: 254 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Pennie & Edmonds LLP (B) ULICA: 1155 Avenue of the Americas (C) MIASTO: New York (D) STAN: NY (E) KRAJ: USA (F) KOD: 10036-2811 (v) FORMA ODCZYTU W KOMPUTERZE:

(A) TYP NOŚNIKA: Diskette (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: DOS (D) OPROGRAMOWANIE: FastSEQ Version 2.0 (vi) DANE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: PCT/US98/20328 (B) DATA WYPEŁNIENIA: 28-SEP-1998 (C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/940,093 (B) DATA WYPEŁNIENIA: 29-SEP-1997 (viii)INFORMACJE PEŁNOMOCNIKA/AGENTA:

(A) NAZWISKO: Coruzzi, Laura A (B) NUMER REJESTRACJI :30,742 (C) REFERENCJE/DOCKET NUMBER: 9196-006-228 (ix) INFORMACJA TELEFONICZNA:

(A) TELEFON:650-493-4935 (B) TELEFAX:650-493-5556 (C) TELEX: 66141 PENNIE

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak.

(ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:l:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Xaa 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:2:

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SE<2 ID NO: 3:

Pro Val· Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 4 :

Pro Val· Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:5:

Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:6:

PL 200 744 B1

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:7:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:8:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:9:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Asn Glu Leu Leu Glu Ala

PL 200 744 B1

10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 17 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:10:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 11:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:12:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

PL 200 744 B1

Gly Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B, TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:13:

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 18 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:14:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:15 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 200 744 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:15:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID N0:16:

Pro Val Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:17:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 '

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:1S:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: poj edyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:18:

PL 200 744 B1

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:19:

Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:20:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1

CD) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:21:

Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:22:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Gly 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:23:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:24:

PL 200 744 B1

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Aib <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:25:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C> NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:26:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: poj edyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna

PL 200 744 B1 (B) UMIEJSCOWIENIE: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 27:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:28:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:29:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:29:

Ala Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:30 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22

PL 200 744 B1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = peptyd N-końcowo dansylowany (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:30:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13

CD) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:31:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Leu Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:32:

Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:33

PL 200 744 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:33:

Pro Val Leu Asp Leu. Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 5 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftyloalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:34:

Pro Val Leu Asp Xaa Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:35:

Pro Val Leu Asp Trp Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:36:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:36:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:37:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:38 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:38:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Trp Lys Gin Lys Leu Lys 20

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:39:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:39:

Pro Val Leu. Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Lys Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:40:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:40:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Asn Glu Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:41:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:41:

Pro Val Leu Asp Leu Trp Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:42:

PL 200 744 B1 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:42:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Trp Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:43:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B> TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:43:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:44:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = wszystkie genetycznie kodowane aminokwasy są w konfiguracji D

PL 200 744 B1 (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:44:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:45:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:46:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:46:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20

PL 200 744 B1 (2} INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:47:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:47:

Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:48:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	NAZWA/KLUCZ: inna
(B)	UMIEJSCOWIENIE: 1
(D)	INNE INFORMACJE: Xaa	= D-Pro
(A)	NAZWA/KLUCZ: inna
(B)	UMIEJSCOWIENIE: 2
CD)	INNE INFORMACJE: Xaa	- D-Val

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:48:

Xaa Xaa Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:49:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:49:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys 20

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:50:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:50:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:51:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:51:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Trp Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:52:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib

PL 200 744 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:52:

Pro Val Trp Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:53:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:53:

Val Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:54:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:54:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Trp Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:55:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasy <B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:55:

Pro Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin 15 10 15

Lys Leu Lys

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:56:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:56:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Lys Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:57:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:57:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:58:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:58:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:59:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:59:

Leu Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:60:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:60:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:61:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:61:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Trp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:62 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:62:

Pro Val Leu Asp Glu Trp Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:63:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:63:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:64:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:64:

Pro Trp Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:65:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 12 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi> OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:65:

Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:66:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:66:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:67:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:67:

Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:60:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:68

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Lys Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:69:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:69:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Lys Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lya Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:70:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:70:

PL 200 744 B1

Pro Val· Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Tyr Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 14

- (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi> OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:71:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:72:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:72:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:73:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak

PL 200 744 B1 (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13

CD) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:73:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Trp Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:74:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13

CD) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:74:

Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:75:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:75:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:76 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 200 744 B1 (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:76:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Phe Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:77:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY: .

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:77:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Lys Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:78:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ; pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:78:

PL 200 744 B1

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Asp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:79 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:79:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:80:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:80:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:81:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:81:

PL 200 744 B1

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:82:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 11 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:82:

Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys 15 10 15

Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:83:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:83:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Trp Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:84:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy

CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:84:

Pro Val Leu. Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:85:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 85:

Pro Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu 15 10 15

Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:86:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:86:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asp Glu Leu Leu Asn Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:87:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

100

PL 200 744 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: wszystkie aminokwasy są w konfiguracji (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:87:

Pro Leu Leu Glu Leu. Leu Lys Glu Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJĄ 0 SEKWENCJI ID NO:88:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy <B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:88:

Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:89:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:89:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys

PL 200 744 B1

101 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:90:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: poj edyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 10 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:90:

Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys Gin 15 10 15

Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:91:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:91:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:92:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib

102

PL 200 744 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:92:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Tyr Asn Glu Xaa Leu Glu Ala ¹ 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:93:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza ID) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix> CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:93:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:94:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:94:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Ala Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:95 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1

103 (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:95:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:96:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: wszystkie genetycznie kodowane aminokwasy są w konfiguracji D (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:96:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:97:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:97:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Giu Leu Leu Glu

10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:98 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

104

PL 200 744 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:98:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:99:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:99:

Lys Leu Lys Gin Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg 15 10 15

Phe Leu Asp Leu Val Pro 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID KO:100:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: wszystkie aminokwasy są w konfiguracji D (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:100:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:101:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1

105 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix> CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:101:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO: 102:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: ' (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:102:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Glu Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:103:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:103:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys

106

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:104:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:104:

Pro Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gln Lys Leu Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:105:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:105:

Pro Ala Ala Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Glu Ala 15 10 15

Ala Lys Gln Lys Ala Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:106:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:106:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:107:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy

PL 200 744 B1

107 (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...22 (D) INNE INFORMACJE: wszystkie aminokwasy są w konfiguracji D (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:107:

Lys Leu Lys Gin Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg 15 10 15

Phe Leu Asp Leu Val Pro (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO: 108:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 108:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Trp Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:109:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: poj edyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ,ID N0:109:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20

108

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:110:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 14 (D). INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:110:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Xaa Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:111:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:111:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Trp Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:112:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1

109 (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:112:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Ser Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:113:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:113:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Pro Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:lii:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:114:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Met Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:115:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

110

PL 200 744 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:115:

Pro Lys Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Giu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:116:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:116:

Pro His Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:117:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:117:

Pro Glu Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20

PL 200 744 B1

111 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:118:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 13 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:118:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Glu Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:119:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 17 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:119:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:120 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Aib (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:120:

112

PL 200 744 B1

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Xaa 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:121:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:121:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Trp Gln Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:122:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:122:

Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Trp 1 5 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:123:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:123:

Gln Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20

PL 200 744 B1

113 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:124:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C> NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 18 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:124:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:125:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:125:

Asn Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:126 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

114

PL 200 744 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:126:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Gly Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:127:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:127:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:128:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 128:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Phe 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:129:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi> OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:129:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala

PL 200 744 B1

115

10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:130:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:130:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:131:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:131:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Arg Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:132:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:132:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:133:

116

PL 200 744 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:133:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Gin Ala 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:134:

(i) CHARAKTERYSTYKĄ SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:134:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Lys Ala 15 10 15

Leu Asn Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:135:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (Β) ΓΥΡ: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:135:

Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:136:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:136:

PL 200 744 B1

117

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Gin Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:137:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 17 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Naftylalanina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:137:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Xaa Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:138:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:138:

Pro Val· Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Trp 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:139:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:139:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Gly Leu Glu Ala

118

PL 200 744 B1

10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO: 14 0:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 18 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:140:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Xaa Gin Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO: 141:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:141:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gin Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:142:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

PL 200 744 B1

119 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:142:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 1 5 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:143:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .22 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja i C- terminalna amidacja peptydów (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:143:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:144:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:144:

Xaa Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO: 145:

120

PL 200 744 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA. SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:145:

Gly Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:146:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:146:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:147:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:147:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Phe Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:148:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1

121 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:148:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:149:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:149:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:150:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:150:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:151:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: S£Q ID NO:151:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Gly Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

122

PL 200 744 B1

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:152:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:152:

Pro Val Phe Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:153:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:153:

Ala Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:154:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:154:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Gly Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:155 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1

123 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:155:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala

5 10 . 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:156:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: ΞΕζ) ID N0:156:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:157:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:157:

Pro Val Leu Glu Phe Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:158:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

124

PL 200 744 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:158:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:159:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:159:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:160:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:160:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:161:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:161:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20

PL 200 744 B1

125 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:162:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:162:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Trp Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:163:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi> OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:163:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Trp Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:164 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:164

Pro	Val	Leu	Glu	Leu Phe Glu	Asn Leu Leu	Glu Arg Leu Leu Asp Ala
1				5	10	15
Trp	Gin	Lys	Lys	Leu Lys
		20	(2)	1 INFORMACJA	O SEKWENCJI	ID N0:165:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak

126

PL 200 744 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:165:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:166:

(i! CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:166:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:167:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:167:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Gly Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:168:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:168:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Gln Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys

PL 200 744 B1

127 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:169:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:169:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:170:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 12 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 19 (D) INNE INFORMACJE: Xaa - Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:170:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Asp Ala

10 15

Leu Gin Xaa Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:171:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

128

PL 200 744 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:171:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJĄ O SEKWENCJI ID NO:172:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NC:172:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:173:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:173:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Leu 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:174 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY;

PL 200 744 B1

129 (A) NAZWA/KLOCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .22 (D) INNE INFORMACJE: wszystkie aminokwasy sa w konfiguracji D (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:174:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:175:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:175:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Leu 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:176:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:176:

Pro Val Leu Glu Leu Trp Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:177:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 177:

Gly Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala

130

PL 200 744 B1

10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:178:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:178:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:179:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:179:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:180:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:180:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg 20

PL 200 744 B1

131 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:181:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:181:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Trp Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:182:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 182:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:183:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:183:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:184 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

132

PL 200 744 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:184:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 ¹⁵

Trp Gln Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:185:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 19 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 20 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 22 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:185:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gln Xaa Xaa Leu Xaa 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:186:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:186:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Gln Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Gln Lys Lys Leu Lys 20

PL 200 744 B1

133 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:187 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:187:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Asn Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:188:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 188:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Ala 15 10 ¹⁵

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:189:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEC ID NO:189:

Asp Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala 1 5 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Lys 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:190:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

134

PL 200 744 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:190:

Pro Val Leu Glu Phe Trp Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala 15 10 15

Leu Gin Lys Lys Leu Arg 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:191:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja i C-terminalna amidacja peptydów (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:191:

Pro Val Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:192:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja C-terminala amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:192:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:193:

PL 200 744 B1

135 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C> NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:193:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:194:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C— terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:194:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:195:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja

136

PL 200 744 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:195:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:196:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów <B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:196:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:197:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:197:

Pro Leu Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys Len, 15 10 15

Lys (2) INFORMACJĄ O SEKWENCJI ID NO:198:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 200 744 B1

137 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:198:

Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:199:

(i) CHARAKTERYSTYKĄ SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:199:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:200:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:200:

Asn Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

138

PL 200 744 B1

Leu Lys <2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:201:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:201:

Pro Leu Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys Lctt 15 10 15

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:202:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:202:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gin Lys 15 10 ¹⁵

Leu Arg (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:203 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18

PL 200 744 B1

139 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:203:

Ala Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:204:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (3) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:204:

Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:205:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:205:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys 1 5 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:206:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

140

PL 200 744 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:206:

Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:207:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:207:

Pro Val Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys l_eAV 1 5 10 15 ' (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:208:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1

141 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:208:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gln Arg 1 5 10 15

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:209:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:209:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gln Lys LttL 1 5 10 15

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:210:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:210:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys 1 5 10 15 - Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:211:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 14

142

PL 200 744 B1 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 18 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:211:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gin Xaa Lcal 1 5 10 15 ' ^!

Xaa (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:212:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 7 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 14 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 16 (D) INNE INFORMACJE: Xaa = Orn <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:212:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gin Xaa 1 5 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:213 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy

PL 200 744 B1

143 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:213:

Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Phe Arg Gin Arg L 15 10 15 ' ·

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:214:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja C-terminalna amidacja (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1 (D) INNE INFORMACJE: D-Pro (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:214:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys Lcw1 5 10 15 ' ’

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:215:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja C-terminalna amidacja

144

PL 200 744 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:215:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Trp Lys Gin Lys Le-tu 15 10 15 :Lys

2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:216:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:216:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys Lłlu· 1 5 10 15 '⁷

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:217:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:217:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Leu Leu Lys Gin Lys Le.tb 15 10 15 Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:218:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . . 18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:218:

PL 200 744 B1

145

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gin Lys Lex<, 15 10 IB ·. ·

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO :219:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:219:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Gin Lys Lłu· 1 5 10 15

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:220:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:220:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Gin Lys Lys 1 5 10 15 ' - .

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:221:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja C-terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:221:

146

PL 200 744 B1

Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys 15 10 15

Leu Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:222:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:222:

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Leu Gln Leu Lajs 15 10 15 ...

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:223:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:223:

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Ala Gln Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:224:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:224:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Trp Glu Glu Leu Lys Gln Lys 15 10 15

Leu Lys

PL 200 744 B1

147 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:225:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:225:

Pro Val Len Asp Ala Phe Arg Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Gin Leu 15 10 15

Lys Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:226 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:226:

Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Gly Glu Ala Leu Leu Gin Leu 15 10 15

Lys Lys ((2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:227:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja C-terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:227:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Glu Glu Leu Lys Gin Lys 15 10 15

Leu Lys

148

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:228:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . . 18 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja C-terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:228

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys Le_,cv 1 5 10 15 '

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:229:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . . 18 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja C-terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:229:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Gly Lys Gln Lys L^cl· 15 10 15 ' c

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:230:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak

PL 200 744 B1

149 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:230:

Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Gin Lys Lys Lf,tv 15 10 15 .

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:231:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ; 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:231:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Glu Gin Lys Lut 1 5 10 15

Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:232:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1,..18 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja C-terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:232:

Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gin Lys Le-[g_/ 1 5 10 15

Lys (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NO:233 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: ' (B) TYP:

(C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA:

150

PL 200 744 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:233 Sekwencja została pominięta celowo (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:234 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) TYP:

(C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:234:

Ta sekwencja została pominięta celowo (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:235:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

(B) TYP:

(C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:235:

Ta sekwencja została pominięta celowo (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:236 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ:

(B) TYP:

(C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:236:

Ta sekwencja została pominięta celowo (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:237:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

PL 200 744 B1

151 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:237:

Len Asp Asp Leu Leu Gln Lys Trp Ala Glu Ala Phe Asn Gln Leu Leu 1 5 10 15

Lys Lys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:238:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1- - .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:238:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 ¹⁵

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:239:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . . 18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:239:

Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15

Leu Phe

152

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID N0:240:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . . 18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:240:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15

Ala Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:241:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:241:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu 15 10 ¹⁵

Phe Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:242:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:242:

Gly Ile Lys Lys Phe Leu Gly Ser Ile Trp Lys Phe Ile Lys Ala Phe 15 10 15

Val Gly

PL 200 744 B1

153 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:243 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:243:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Gin Lys Phe Lys Glu 15 10 ¹⁵

Ala Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:244:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi> OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:244:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu f 5 10 15

Ala Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:245:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:245:

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu Ph-e, 15 10 15

Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:24S (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

154

PL 200 744 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:246:

Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:247:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:247:

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Phe Glu Lys Phe Lys Glu ! 5 10 15

Phe Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:248:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:248:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:249:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 200 744 B1

155 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:249:

Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Glu Glu Lys Leu Lys Glu 15 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:250:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . .18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:250:

Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 ¹⁵

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:251:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...18 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEC ID NO:251:

Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15

Leu Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:252:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

156

PL 200 744 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . . 15 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja C-terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:252:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Gln Lys Leu Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:253:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . . 16 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:253:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID N0:254:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . . 16 (D) INNE INFORMACJE: N- terminalna acetylacja C- terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:254:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Lys Gln Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:255:

PL 200 744 B1

157 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...15 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja C-terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:255:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:256:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(Ą) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . . 16 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja

C-terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:256:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gin Lys 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:257:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: brak (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1...16 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja

C-terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:257:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gin Lys 1 5 10 15

158

PL 200 744 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NO:258:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) UMIEJSCOWIENIE: 1. . . 16 (D) INNE INFORMACJE: N-terminalna acetylacja C-terminalna amidacja (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:258:

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Lys Gln Lys

Claims

1. Agonista ApoA-I który stanowi:

XI oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Gln (Q) lub D-Pro (p);

X2 oznacza aminokwas alifatyczny;

X3 oznacza Leu (L);

X4 oznacza aminokwas kwaśny;

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza aminokwas zasadowy;

X8 oznacza aminokwas kwaśny;

X9 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

X10 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

XII oznacza aminokwas kwaśny lub Asn (N);

X12 oznacza aminokwas kwaśny;

X13 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Phe (F);

X14 oznacza aminokwas zasadowy lub Leu (L);

X15 oznacza Gln (Q) lub Asn (N);

X16 oznacza aminokwas zasadowy;

X17 oznacza Leu (L);

X18 oznacza aminokwas zasadowy;

Z1 oznacza H2N- lub RC(O)NH-;

Z2 oznacza -C(O)NRR, lub -C(O)OR, -C(O)OH lub ich sole;

każdy R niezależnie oznacza -H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinil, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkaryl, 5-20 członowy heteroaryl lub 6-26 członowy heteroaryl lub 1-4 resztowy analog peptydowy; każdy - pomiędzy resztami Xn niezależnie oznacza wiązania amidowe, podstawione wiązanie amidowe, izoster amidu lub amidomimetyk; i (ii) zmienioną postać wzoru strukturalnego (I) w którym co najmniej jedna z reszt X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16, X17 lub X18 jest konserwatywnie podstwiona inna resztą.

PL 200 744 B1

159

2. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, znamienny tym, że wykazuje co najmniej około 38% zdolności do aktywacji LCAT w porównaniu z ludzką ApoA-I.

3. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, znamienny tym, że:

X1 oznacza Pro (P), D-Pro (p), Gly (G), Asn (N) lub Ala (A);

X2 oznacza Ala (A), Leu (L) lub Val (V);

X3 oznacza Leu (L);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X9 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

X10 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

X13 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Phe (F);

4. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, znamienny tym, że:

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X7 oznacza Arg (R), Lys (K) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X11 oznacza Asn (N) lub Glu (E);

X12 oznacza Glu (E);

X14 oznacza Lys (K), Arg (R) lub Orn;

X15 oznacza Gln (Q) lub Asn (N);

X16 oznacza Lys (K), Arg (R) lub Orn;

5. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, w którym X3 oznacza Leu (L), X6 oznacza Phe (F), X9 oznacza Leu (L) lub Trp (W), X10 oznacza (L) lub Trp (W) i co najmniej jedna z X1, X2, X5, X13 oraz X17 jest konserwatywnie podstawiona inną resztą.

6. Agonista ApoA-I według zastrzeżenia 3 lub 4, w którym podstawiona reszta jest zklasyfikowana wewnątrz tej samej subkategorii co podstawiona reszta.

7. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, w którym jeden helikalny skręt peptydu lub analogu peptydowego jest skrócony przez delecję.

8. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, stanowiący 18-resztowy peptyd lub analog peptydu o wzorze strukturalnym (I).

9. Agonista ApoA-I według zastrz. 8, w którym - pomiędzy resztami oznacza -C(O)NH-; Z1 oznacza H2N-; Z2 oznacza -C(O)OH lub ich sole.

10. Agonista ApoA-I według zastrz. 9, znamienny tym, że:

X1 oznacza Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N) lub D-Pro (p),

X2 oznacza Ala (A), Val (V) lub Leu (L);

X3 oznacza Leu (L);

X4 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X5 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X6 oznacza Leu (L) lub Phe (F);

X7 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn;

X8 oznacza Asp (D) lub Glu (E);

X9 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

X10 oznacza Leu (L) lub Trp (W);

X11 oznacza Glu (E) lub Asn (N);

X12 oznacza Glu (E);

X13 oznacza Leu (L), Trp (W) lub Phe (F);

X14 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn;

X15 oznacza Gln (Q) lub Asn (N);

X16 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn;

X17 oznacza Leu (L); i

160

PL 200 744 B1

X18 oznacza Arg (R) Lys (K) lub Orn.

11. Agonista ApoA-I według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej:

PVLDLLRELLEELKQKLK (SEQ PVLDLFKELLEELKQKLK (SEQ PVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ PVLELFRELLEELKQKLK (SEQ PVLELFKELLEELKQKLK (SEQ PVLDLFRELLEELKNKLK (SEQ PLLDLFRELLEELKQKLK (SEQ GVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ PVLDLFRELWEELKQKLK (SEQ NVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ PLLDLFKELLEELKQKLK (SEQ PALELFKDLLEELRQKLR (SEQ AVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ PVLDFFRELLEELKQKLK (SEQ PVLDLFREWLEELKQKLK (SEQ PLLELLKELLEELKQKLK (SEQ PVLELLKELLEELKQKLK (SEQ PALELFKDLLEELRQRLK (SEQ PVLDLFRELLNELLQKLK (SEQ PVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ PVLDLFRELLEELOQOLO (SEQ PVLDLFOELLEELOQOLK (SEQ PALELFKDLLEEFRQRLK (SEQ pVLDLFRELLEELKQKLK (SEQ PVLDLFRELLEEWKQKLK (SEQ PVLELFERLLEDLQKKLK (SEQ PVLDLFRELLEKLEQKLK (SEQ PLLELFKELLEELKQKLK (SEQ

ID NO:191) ID NO:192) ID NO:193) ID NO:194) ID NO:195) ID NO:196) ID NO:197) ID NO:198) ID NO:199) ID NO:200) ID NO:201) ID NO:202) ID NO:203) ID NO:204) ID NO:205) ID NO:206) ID NO:207) ID NO:208) ID NO:209) ID NO:210) ID NO:211) ID NO:212) ID NO.213) ID NO: 214) ID NO:215) ID NO: 229) ID NO:230) ID NO: 231) w postaciach zarówno N- i/lub C-koń cowo blokowanych jak i nieblokowanych.

12. Multimeryczny agonista ApoA-I wykazyjący co najmniej 38% zdolności do aktywacji LCAT w porównaniu do ludzkiej ApoA-I, o wzorze strukturalnym (II):

(II) HH[LLm-HH]nLLm-HH lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól, w którym każde m niezależnie oznacza liczbę naturalną od 0 do 1; n liczbę naturalną od 0 do 10;

każde HH niezależnie oznacza peptyd lub analog peptydu jak zdefiniowano w zastrz. 1; każde LL niezależnie oznacza bifunkcjonalny łącznik; i każde -- niezależnie oznacza wiązanie kowalencyjne.

13. Multimeryczny aganista ApoA-I wykazujący co najmniej 38% zadolności do aktywacji LCAT w porównaniu do ludzkiej ApoA-I o wzorze strukturalnym (III):

(III) X-Nya - X (ya-1) (Nyb - X(yb-1))p lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w którym każdy X niezależnie oznacza HH[LLm-HH]nLLm-HH, każde HH niezależnie oznacza peptyd rdzenia o wzorze strukturalnym (I) lub jego analog lub jej postać zmutowaną, obciętą, wewnętrznie skróconą przez delecję lub rozszerzoną; każde LL oznacza niezależnie bifunkcjonalny łącznik; każde m oznacza niezależnie liczbę naturalną od 0 do 1; każde n oznacza liczbę naturalną od 0 do 8;

Nya i Nyb każda są niezależnymi multifunkcjonalnymi resztami łącznikowymi ya i yb stanowią liczbę funkcjonalnych grup na Nya i Nyb, odpowiednio.

każdy ya i yb oznacza niezależnie liczbę naturalną od 3 do 8; p jest liczbą naturalną od 0 do 7;

PL 200 744 B1

161 i każ da - niezale ż nie oznacza wią zanie kowalencyjnie.

14. Multimeryczny agonista ApoA-I wykazujący co najmniej 38% zdolności do aktywacji LCAT w porównaniu do ludzkiej ApoA-I, o wzorze strukturalnym (IV) lub (V) lub jego dopuszczalną farmaceutycznie sól, w którym:

każde X niezależnie oznacza HH[LLm-HH]nLLm-HH;

każde HH niezależnie oznacza peptyd lub jego analog jak zdefiniowano w zastrz. 1;

każde LL oznacza niezależnie bifunkcjonalny łącznik;

każde n oznacza niezależnie liczbę naturalną od 0 do 1;

każde m oznacza liczbę naturalną od 0 do 8;

R1 oznacza -OR lub -NRR; i każde R oznacza niezależnie -H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkenyl, (C1-C6) alkinil, (C5-C20) aryl, (C6-C26) alkaryl, 5-20 członowy heteroaryl lub 6-26 członowym alkheteroaryl.

15. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 12, albo 13, albo 14, w którym bifunkcjonalny łącznik jest odszczepialny.

16. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz

17. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz

18. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz niezależnie oznacza peptyd według zastrzeżenia 13.

19. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 12, albo 13, albo 14, w którym każde HH niezależnie oznacza peptyd jak zdefiniowano w zastrz. 14.

20. Multimeryczny agonista ApoA-I według zastrz. 12, albo 13, albo 14, w którym każde HH niezależnie oznacza peptyd jak zdefiniowano w zastrz. 11.

21. Kompleks agonista ApoA-I-lipid składający się z agonisty ApoA-I i lipidu, znamienny tym, że agonista ApoA-I jest peptydem lub analogiem peptydu jak zdefiniowano w zastrz. 1, multimerycznym agonistą ApoA-I jak zdefiniowano w zastrz. 12, multimerycznym agonistą ApoA-I jak zdefiniowano w zastrz. 13 lub multimerycznym agonistą ApoA-I jak zdefiniowano w zastrz. 14.

22. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 21, w którym agonista ApoA-I jest peptydem jak zdefiniowano w zastrz. 12.

23. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 21, w którym agonista ApoA-I jest peptydem jak zdefiniowano w zastrz. 9.

24. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 21, w którym agonista ApoA-I jest peptydem jak zdefiniowano w zastrz. 10.

25. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 21, w którym agonista ApoA-I jest peptydem jak zdefiniowano w zastrz. 15.

26. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 21, w którym lipid jest sfingomieliną.

27. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 21, w postaci zliofilizowanego proszku.

12, albo 13, albo 14, w którym n oznacza 0. 12, w którym m oznacza 0.

12, albo 13, albo 14, w którym każde HH

162

PL 200 744 B1

28. Kompleks agonista ApoA-I-lipid według zastrz. 21, w postaci roztworu.

29. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera agonistę ApoA-I i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, wypełniacz lub rozpuszczalnik, przy czym agonista ApoA-I jest peptydem lub analogiem peptydu jak zdefiniowano w zastrz. 1, multimerycznym agonistą ApoA-I jak zdefiniowano w zastrz. 12, multimerycznym agonistą ApoA-I jak zdefiniowano w zastrz. 13 lub multimerycznym agonistą ApoA-I jak zdefiniowano w zastrz. 14.

30. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 29, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak zdefiniowano w zastrz. 12.

31. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 29, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak zdefiniowano w zastrz. 19.

32. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 29, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak zdefiniowano w zastrz. 10.

33. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 29, znamienna tym, że agonistę ApoA-I stanowi peptyd jak zdefiniowano w zastrz. 11.

34. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 29 albo 30, albo 31, albo 32, lub 33, znamienna tym, że agonista ApoA-I przyjmuje postać kompleksu lipid-agonista ApoA-I, i wspomniany kompleks składa się z agonisty ApoA-I i lipidu.

35. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 34, znamienna tym, że kompleks agonista ApoA-I-lipid jest w postaci zliofilizowanego proszku.

36. Zastosowanie agonistów ApoA-I jak zdefiniowano w zastrz. 1, do sporządzania leku do leczenia pacjentów, korzystnie ludzi cierpiących na schorzenia związane z dislipidemią.

37. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że agonista ApoA-I jest w postaci kompozycji farmaceutycznej, składającej się z agonisty ApoA-I i farmaceutycznie dopuszczanego nośnika, wypełniacza lub rozpuszczalnika.

38. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że agonista ApoA-I jest w postaci kompleksu agonista ApoA-I-lipid, i składa się z agonisty ApoA-I i lipidu.

39. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza hipercholesterolemię.

40. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza chorobę naczyniową.

41. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienny tym że choroba związana z dyslipidemią oznacza miażdżycę.

42. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza restenozę.

43. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza niedobór HDL lub ApoA-I.

44. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza hipertriglicerydemię.

45. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że choroba związana z dyslipidemią oznacza zespół metaboliczny.

46. Zastosowanie agonistów ApoA-I jak zdefiniowano w zastrz. 1 do sporządzania leku do leczenia pacjentów cierpiących na szok septyczny.