KR20100014480A - Ｌｙｎ 키나제 활성제의 확인 방법 - Google Patents

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KR20100014480A
KR20100014480A KR1020097019560A KR20097019560A KR20100014480A KR 20100014480 A KR20100014480 A KR 20100014480A KR 1020097019560 A KR1020097019560 A KR 1020097019560A KR 20097019560 A KR20097019560 A KR 20097019560A KR 20100014480 A KR20100014480 A KR 20100014480A
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lyn kinase
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KR1020097019560A
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앤드류 레오메
마이클 사포리토
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멜리어 파마슈티칼스 아이, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 예비 인큐베이션하고; lyn 키나제 및 테스트 화합물에 ATP 및 기질을 첨가하고; 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 인큐베이션하고; 기질의 인산화 수준을 측정하여, 기질의 인산화 수준의 증가로 테스트 화합물이 lyn 키나제의 활성제임을 나타내게 되는 것을 포함하는 lyn 키나제 활성제 확인 방법에 관한 것이다.
lyn 키나제, 활성제, 당뇨병

Description

ＬＹＮ 키나제 활성제의 확인 방법{METHODS OF IDENTIFYING ACTIVATORS OF LYN KINASE}
본 발명은 lyn 키나제 활성제의 확인 방법 및 그와 관련된 키트에 관한 것이다.
lyn 키나제는 B-림프계 및 골수 세포에서 주로 발현되는, src 족의 비-수용체 단백질 티로신 키나제의 일원이다. 예를 들어, 본원에 참고로 도입된 문헌 [Briggs SD, Lerner EC, Smithgall TE: Affinity Of Src Family Kinase SH3 Domains For HIV Nef In Vitro Does Not Predict Kinase Activation By Nef In Vivo. Biochemistry 39: 489-495 (2000)]을 참조한다. lyn은 내인성 티로신 키나제 활성이 결여된 세포 표면 수용체로부터의 신호 전달에 관여한다. lyn 키나제 활성의 활성화는 IL-6에 의해 자극되는 CD45+ 골수종 세포의 증식에 필수적이다. 예를 들어, 본원에 참고로 도입된 문헌 [Ishikawa H, Tsuyama N, Abroun S, Liu S, Li FJ, Taniguchi O, Kawano MM: Requirements of src family kinase activity associated with CD45 for myeloma cell proliferation by interleukin-6. Blood 99: 2172-2178 (2002)]를 참조한다. lyn 및 fyn과 당단백질 VI의 프롤린-풍부 도메인과의 결합은 세포내 신호 전달을 조절한다. 예를 들어, 본원에 참고로 도입된 문헌 [Suzuki-Inoue K, Tulasne D, Shen Y, Bori-Sanz T, Inoue O, Jung SM, Moroi M, Andrews RK, Berndt MC, Watson SP: Association of Fyn and Lyn with the proline-rich domain of glycoprotein VI regulates intracellular signaling. J. Biol. Chem. 277: 21561-21566 (2002)]를 참조한다. lyn/CD22/SHP-1 경로는 자가면역에서 중요하다. 예를 들어, 본원에 참고로 도입된 문헌 [Blasioli J, Goodnow CC: Lyn/CD22/SHP-1 and their importance in autoimmunity. Curr. Dir. Autoimmun. 5: 151-160 (2002)]를 참조한다.
비만증, 고지혈증 및 당뇨병은 현재 서구 사회에서 이환률의 상당 부분을 차지하는, 예를 들어, 죽상경화성 심혈관 질환을 포함하는 다양한 장애의 원인 역할을 하는 것으로 입증되었다. "증후군 X" 또는 "대사 증후군"으로 지칭되는 인간의 한 장애는 손상된 글루코스 대사 (예를 들어, 인슐린 내성), 혈압의 상승 (즉, 고혈압) 및 혈액 지질 불균형 (즉, 이상지혈증)에 의해 나타난다. 예를 들어, 문헌 [Reaven, 1993, Annu. Rev. Med. 44:121-131]을 참조한다.
현재 시판 중인 lyn 키나제 조절용 또는 증가된 글루코스 수준 관리용 약물 중 어떤 것도 혈중 지질, 지단백, 인슐린 및 글루코스 수준을 조절하는데 있어서 일반적인 효용성을 갖지 않는다. 따라서, 그러한 효용성 중 하나 이상을 갖는 화합물이 명백히 요구된다. 추가로, 혈청 콜레스테롤의 저하, HDL 혈청 수준의 증가, 관상동맥 심질환의 예방, 및/또는 현존하는 질환, 예컨대 죽상동맥경화증, 비만증, 당뇨병, 및 글루코스 대사 및/또는 증가된 글루코스 수준에 의해 영향을 받는 기타 질환의 치료에 효능이 있는 보다 안전한 약물을 개발하는 것이 명백히 요구되고 있 다. 따라서, lyn 키나제 활성제의 확인을 위한 분석이 크게 요망되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 예비 인큐베이션하고; lyn 키나제 및 테스트 화합물에 ATP 및 기질을 첨가하고; 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 인큐베이션하고; 기질의 인산화 수준을 측정하여, 기질의 인산화 수준의 증가로 테스트 화합물이 lyn 키나제의 활성제임을 나타내게 되는 것을 포함하는 lyn 키나제 활성제의 확인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 5분 내지 약 120분 동안 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 30분 내지 약 90분 동안 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 45분 내지 약 75분 동안 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 60분 동안 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 20분 내지 40분 동안 예비 인큐베이션한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 30℃에서 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 10℃에서 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 4℃에서 예비 인큐베이션한다.
일부 실시양태에서, lyn 키나제의 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 500 ng/ml이다. 일부 실시양태에서, lyn 키나제의 농도는 약 25 ng/ml 내지 약 300 ng/ml이 다.
일부 실시양태에서, ATP의 농도는 약 5 μM 내지 약 25 μM이다. 일부 실시양태에서, ATP의 농도는 약 10 μM이다. 일부 실시양태에서, ATP는 방사성 표지된 것이다.
일부 실시양태에서, 기질은 티로신을 포함하는 펩티드 또는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 기질은 티로신을 포함하는 합성 FRET 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질은 약 실온의 온도에서 약 5분 내지 약 90분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질은 약 실온의 온도에서 약 30분 내지 약 75분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질은 약 실온의 온도에서 약 45분 내지 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질은 약 실온의 온도에서 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질은 약 실온의 온도에서 약 30분 내지 약 50분 동안 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 기질의 인산화 수준의 측정은 방사성 표지된 기질을 정량적 또는 정성적으로 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질의 인산화 수준의 측정은 합성 FRET 펩티드 기질의 형광을 정량적 또는 정성적으로 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질의 인큐베이션을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 소혈청 알부민, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM의 디티오 트레이톨, 약 0.05% 내지 약 0.25%의 소혈청 알부민 및 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM의 디티오트레이톨, 또는 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에 수행한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질의 인큐베이션을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에 수행한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질의 인큐베이션을 약 0.1%의 β-머캅토에탄올의 존재하에 수행한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 5분 내지 약 120분 동안 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 30℃에서 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 5분 내지 약 90분 동안 인큐베이션한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 30분 내지 약 90분 동안 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 10℃에서 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 30분 내지 약 75분 동안 인큐베이션한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 45분 내지 약 75분 동안 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 4℃에서 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.1%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 45분 내지 약 60분 동안 인큐베이 션한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 60분 동안 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 4℃에서 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.1%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 60분 동안 인큐베이션한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물은 화학식 II로 표시되는 화합물이다:
Figure 112009057532577-PCT00001
(식 중, R1은 알킬기이고; X는 할로겐이고; Y는 O, S 또는 NH이고; Z는 O 또는 S이고; n은 0 내지 5의 정수이고, m은 0 또는 1이고, 여기서, m + n은 5 이하임). 일부 실시양태에서, 알킬기는 메틸이고, n은 1이다. 일부 실시양태에서, 할로겐은 염소이고, m은 1이다. 일부 실시양태에서, Y는 O이다. 일부 실시양태에서, Z는 O이다. 일부 실시양태에서, R1은 메틸이고, Y는 O이고, Z는 O이고, n은 1이고, m은 0이다. 일부 실시양태에서, R1은 메타 위치에 존재한다. 일부 실시양태에서, X는 염소이고, Y는 O이고, Z는 O이고, n은 0이고, m은 1이다. 일부 실시양태에서, X는 메타 위치에 존재한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물은
Figure 112009057532577-PCT00002
또는
Figure 112009057532577-PCT00003
이다.
본 발명은 또한 lyn 키나제, ATP, 기질 및 본원에 기재된 1 이상의 방법을 수행하기 위한 지시사항을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 인큐베이션 챔버를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 화학식 I로 표시되는 제1 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 하기 표에 열거된 화합물로부터 선택된 1 이상의 제2 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 조성물을 포함한다:
Figure 112009057532577-PCT00004
(식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 알콕시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴옥시, 벤질, 시클로알킬, 할로겐, 헤테로아릴, 헤테로시클로알킬, -CN, -OH, -NO2, -CF3, -CO2H, -CO2알킬 또는 -NH2이고; R8은 알킬 또는 수소이고; X는 O, S, NH 또는 N-알킬이고; Z는 O 또는 S임). 일부 실시양태에서, 제1 화합물은 화학식 II의 화합물이다:
<화학식 II>
Figure 112009057532577-PCT00005
(식 중, R1은 알킬기이고; X는 할로겐이고; Y는 O, S 또는 NH이고; Z는 O 또는 S이고; n은 0 내지 5의 정수이고, m은 0 또는 1이고, 여기서, m + n은 5 이하임).
본 발명은 또한 본원에 기재된 조성물의 치료학적 유효량을, 당뇨병 치료를 필요로 하는 인간에게 투여하는 것을 포함하는 인간의 당뇨병 치료 방법을 제공한다.
도 1은 화합물 102와 메트포르민(Metformin)의 상승 작용을 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "약"은 수치가 ± 10% 변화되는 것을 의미한다. 예를 들면, "약 10"은 9 내지 11을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "알콕시"는 -O-알킬기를 의미하고, 이때 알킬은 본원에서 정의된 바와 같다. 알콕시기는 비치환되거나, 또는 1 또는 2개의 적합한 치환기로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 예를 들어 "(C1-C6)알콕시"라고 지칭된 알킬옥시기의 알킬 쇄는 1 내지 6개의 탄소 원자 길이이다.
본원에 사용되는 용어 "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 갖는 1가 비분지형 또는 분지형 탄화수소 쇄를 의미한다. 알케닐기의 이중 결합은 공액되지 않거나, 또는 또 다른 불포화기에 공액될 수 있다. 적합한 알케닐기로는 (C2-C6)알케닐기, 예컨대 비닐, 알릴, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 부타디에닐, 펜타디에닐, 헥사디에닐, 2-에틸헥세닐, 2-프로필-2-부테닐, 4-(2-메틸-3-부텐)-펜테닐을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 알케닐기는 비치환되거나, 또는 1 또는 2개의 적합한 치환기로 치환될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "알킬"은 포화된 1가 비-분지형 또는 분지형 탄화수소 쇄를 의미한다. 알킬기의 예로는 (C1-C6)알킬기, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 2-메틸-1-프로필, 2-메틸-2-프로필, 2-메틸-1-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-3-부틸, 2,2-디메틸-1-프로필, 2-메틸-1-펜틸, 3-메틸-1-펜틸, 4-메틸-1-펜틸, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 2,2-디메틸-1-부틸, 3,3-디메틸-1-부틸, 2-에틸-1-부틸, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸 및 헥실, 및 보다 긴 알킬기, 예컨대 헵틸 및 옥틸을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 알킬기는 비치환되거나, 또는 1 또는 2개의 적합한 치환기로 치환될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 1가 비분지형 또는 분지형 탄화수소 쇄를 의미한다. 알키닐기의 삼중 결합은 공액되지 않거나, 또는 또 다른 불포화기에 공액될 수 있다. 적합한 알키닐기로는 (C2-C6)알키닐기, 예를 들면 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 메틸프로피닐, 4-메틸-1-부티닐, 4-프로필-2-펜티닐 및 4-부틸-2-헥시닐을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 알키닐기는 비치환되거나, 또는 1 또는 2개의 적합한 치환기로 치환될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "아릴"은 탄소 및 수소 원자를 포함하는 모노시클릭- 또는 폴리시클릭-방향족 라디칼을 의미한다. 적합한 아릴기의 예로는 페닐, 톨릴, 안트라세닐, 플루오레닐, 인데닐, 아줄레닐 및 나프틸뿐만 아니라, 5,6,7,8-테트라히드로나프틸과 같은 벤조-융합된 카르보시클릭 잔기를 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 아릴기는 비치환되거나, 또는 1 또는 2개의 적합한 치환기로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 "(C6)아릴"이라고 지칭된 아릴기는 6개의 탄소 원자를 포함하는 모노시클릭 고리이다.
본원에 사용되는 용어 "아릴옥시"는 -O-아릴기를 의미하고, 이때 아릴은 본원에서 정의된 바와 같다. 아릴옥시기는 비치환되거나, 또는 1 또는 2개의 적합한 치환기로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 "(C6)아릴옥시"라고 지칭된 아릴옥시기의 아릴 고리는 6개의 탄소 원자를 포함하는 모노시클릭 고리이다.
본원에 사용되는 용어 "벤질"은 -CH2-페닐을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "카르보닐"은 화학식 -C(O)-의 2가 기이다.
본원에 사용되는 어구 "본 발명의 화합물"은 화학식 I 및 II의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염을 통칭하여 의미한다. 본 발명의 화합물은 그의 화학적 구조 및/또는 화학명으로써 본원에서 식별된다. 화학적 구조 및 화학명 둘 다에 의해 식별되지만 화학적 구조 및 화학명이 모순되는 경우, 화학적 구조가 화합물의 식별의 결정 요인이다. 본 발명의 화합물은 하나 이상의 키랄 중심 및/또는 이중 결합을 함유할 수 있으며, 따라서 입체 이성질체, 예컨대 이중 결합 이성질체 (즉, 기하 이성질체), 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체로 존재할 수 있다. 본 발명에 따라, 화학적 구조를 본원에 도시하였고, 이에 따라 본 발명의 화합물은 상응하는 화합물의 모든 거울상 이성질체 및 입체 이성질체, 즉, 입체 이성질체적으로 순수한 (예를 들어, 기하학적으로 순수, 거울상 이성질체적으로 순수하거나, 또는 부분입체 이성질체적으로 순수한) 형태, 및 거울상 이성질체 및 입체 이성질체 혼합물 모두를 포함한다. 거울상 이성질체 및 입체 이성질체 혼합물은 잘 알려진 방법, 예컨대 키랄-상 기체 크로마토그래피, 키랄-상 고성능 액체 크로마토그래피, 키랄 염 착물로서의 화합물의 결정화, 또는 키랄 용매 중에서의 화합물의 결정화로 각각의 성분인 거울상 이성질체 또는 입체이성질체로 분할될 수 있다. 거울상 이성질체 및 입체 이성질체는 또한 잘 알려진 비대칭 합성법에 의해 입체 이성질체적 또는 거울상 이성질체적으로 순수한 중간체, 시약 및 촉매로부터 수득할 수 있다. 본원에 기재된 확인 방법을 사용할 때, 본원에서 본 발명의 화합물을 테스트 화합물(이러한 방법에서 양성 대조군으로서의 역할 또한 할 수 있음)이라고 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "시클로알킬"은 탄소 및 수소 원자를 포함하고, 탄소-탄소 다중 결합을 갖지 않는 모노시클릭 또는 폴리시클릭 포화 고리를 의미한다. 시클로알킬기의 예로는 (C3-C7)시클로알킬기, 예를 들면 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 및 시클로헵틸, 및 포화된 시클릭 및 비시클릭 테르펜을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 시클로알킬기는 비치환되거나, 또는 1 또는 2개의 적합한 치환기로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시클로알킬기는 모노시클릭 고리 또는 비시클릭 고리이다.
본원에 사용되는 용어 "당뇨병" 및 "II형 당뇨병"은 상호교환적으로 사용되며, 인슐린 비의존성 당뇨병, 요붕증을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않으며, 인슐린 내성 (즉, 인슐린에 적절하게 반응하는 신체 능력의 부족)과 관계 있으며, 예를 들어, 비만증 및 고콜레스테롤을 포함하는 관련 합병증을 종종 수반한다.
본원에 사용되는 용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다. 상응하게, 용어 "할로" 및 "Hal"의 의미는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "헤테로아릴"은 탄소 원자, 수소 원자, 및 하나 이상의 헤테로 원자, 예를 들면 질소, 산소 및 황으로부터 각각 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 모노시클릭- 또는 폴리시클릭 방향족 고리를 의미한다. 헤테로아릴기의 예시적 예로는 피리디닐, 피리다지닐, 피리미딜, 피라질, 트리아지닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, (1,2,3)- 및 (1,2,4)-트리아졸릴, 피라지닐, 피리미디닐, 테트라졸릴, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 푸릴, 피에닐, 이속사졸릴 및 옥사졸릴을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 헤테로아릴기는 비치환되거나, 또는 1 또는 2개의 적합한 치환기로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 "(C2-C5)헤테로아릴"이라고 지칭된 헤테로아릴기는 2 내지 5개의 탄소 원자 및 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 모노시클릭 고리이다.
본원에 사용되는 용어 "헤테로시클로알킬기"는 탄소 및 수소 원자, 및 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자 또는 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하며 불포화를 갖지 않는 모노시클릭 또는 폴리시클릭 고리를 의미한다. 헤테로시클로알킬기의 예로는 피롤리디닐, 피롤리디노, 피페리디닐, 피페리디노, 피페라지닐, 피페라지노, 모르폴리닐, 모르폴리노, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리노 및 피라닐을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 헤테로시클로알킬기는 비치환되거나, 또는 1 또는 2개의 적합한 치환기로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 (C1-C6)헤테로시클로알킬이라고 지칭된 헤테로시클로알킬기는 3 내지 6개의 탄소 원자 및 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 모노시클릭 또는 비시클릭 고리이다.
본원에 사용되는 용어 "헤테로시클릭 라디칼" 또는 "헤테로시클릭 고리"는 헤테로시클로알킬기 또는 헤테로아릴기를 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "히드로카르빌"은 1 또는 2개의 적합한 치환기로 임의로 치환된 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐 및 (C2-C8)알키닐로부터 선택되는 1가 기를 의미한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 "(C1-C6)히드로카르빌"이라고 지칭된 히드로카르빌기의 탄화수소 쇄는 1 내지 6개의 탄소 원자 길이이다.
본원에 사용된 용어 "페닐"은 -C6H5를 의미한다. 페닐기는 비치환되거나, 또는 1 또는 2개의 적합한 치환기로 치환될 수 있다.
본원에 사용되는 "당뇨병전기(pre-diabetes)"는 환자가 증가된 글루코스 수준을 나타내지만, II형 당뇨병과 연관된 장애의 완전한 발병은 아직 나타나지 않은 당뇨병의 증상을 지칭한다.
본원에 사용되는 "적합한 치환기"는 본 발명의 화합물 또는 이의 제조에 유용한 중간체의 합성 또는 제약 효용성을 파괴하지 않는 기를 의미한다. 적합한 치환기의 예로는 (C1-C8)알킬; (C1-C8)알케닐; (C1-C8)알키닐; (C6)아릴; (C3-C5)헤테로아릴; (C3-C7)시클로알킬; (C1-C8)알콕시; (C6)아릴옥시; -CN; -OH; 옥소; 할로; -NO2, -CO2H; -NH2; -NH((C1-C8)알킬); -N((C1-C8)알킬)2; -NH((C6)아릴); -N((C6)아릴)2; -CHO; -CO((C1-C8)알킬); -CO((C6)아릴); -CO2((C1-C8)알킬); 및 -CO2((C6)아릴)을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 본 발명의 화합물의 안정성 및 약리 및 합성 활성에 근거하여 적합한 치환기를 쉽게 선택할 수 있다.
달리 제시되지 않는다면, 본원에 사용되는 어구인 본 발명의 조성물의 "치료학적 유효량"은 장애의 부작용이 하나 이상 개선되거나 완화되는, 본 발명의 화합물의 치료 효능에 의해 결정된다. 일 실시양태에서, 어구 본 발명의 조성물의 "치료학적 유효량"은 lyn 키나제의 단백질의 상향조절 및 하향조절을 포함하나 이에 제한되지 않는 상기 단백질의 발현 및/또는 활성을 변경시키는 본 발명의 화합물의 치료 효능에 의해 결정된다. 놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명의 화합물의 치료학적 유효량이 lyn 키나제의 발현 및/또는 활성을 상향조절한다는 것을 발견하였다.
본원에 기재된 방법에 사용되는 경우, 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 단리된 형태, 정제된 형태로 또는 화합물의 혼합물로서 사용된다. 본원에 사용되는 "단리된"은 통상의 기술을 통해 화합물이 천연 공급원, 예컨대 식물 또는 세포, 바람직하게는 세균 배양, 또는 합성 유기 화학 반응 혼합물의 다른 성분으로부터 분리되는 것을 의미한다. 본원에 사용되는 "정제된"은 단리된 경우, 단리물이 단리물 중량 기준으로 90％ 이상, 95％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상의 화합물을 함유하는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 어구 "제약상 허용되는 염"으로는 본 방법에서 사용되는 화합물 내에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 방법에 포함된 사실상 염기성인 화합물은 다양한 무기 및 유기 산과 광범위한 염을 형성할 수 있다. 그러한 염기성 화합물의 제약상 허용되는 산부가염을 제조하는데 사용될 수 있는 산은 황산, 시트르산, 말레산, 아세트산, 옥살산, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 니트레이트, 술페이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 아세테이트, 락테이트, 살리실레이트, 시트레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 젠티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트 및 파모에이트 (즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염을 포함하나 이에 제한되지 않는 무독성 산 부가염, 즉, 약리학상 허용되는 음이온을 함유하는 염을 형성하는 산이다. 아미노 잔기를 포함하는, 본 발명에 포함되는 화합물은 상기 언급된 산 이외의 다양한 아미노산과 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 본 방법에 포함되는 사실상 산성인 화합물은 다양한 약리학상 허용되는 양이온과 염기 염을 형성할 수 있다. 그러한 염의 예로는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 및 특히 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 리튬, 아연, 칼륨 및 철 염을 들 수 있다.
본 발명은 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 예비 인큐베이션하고; lyn 키나제 및 테스트 화합물에 ATP 및 기질을 첨가하고; 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 인큐베이션하고; 기질의 인산화 수준을 측정하여, 기질의 인산화 수준의 증가로 테스트 화합물이 lyn 키나제의 활성제임을 나타내게 되는 것을 포함하는 lyn 키나제 활성제의 확인 방법을 제공한다.
테스트 화합물은 본원에 기재된 임의의 화합물을 포함하는 당업자가 원하는 임의의 화합물일 수 있다. 테스트 화합물의 농도는 원하는 임의의 농도일 수 있고, 전형적으로, 테스트한 농도 범위를 포함한다.
lyn 키나제는 예를 들면 인비트로젠(Invitrogen) 또는 밀리포어(Millipore)로부터 시판 중인 것으로부터 입수 가능하거나, 또는 당업자에 의해 원하는대로 세포로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, lyn 키나제의 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 500 ng/ml이다. 일부 실시양태에서, lyn 키나제의 농도는 약 25 ng/ml 내지 약 300 ng/ml이다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 5분 내지 약 120분 동안 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 30분 내지 약 90분 동안 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 45분 내지 약 75분 동안 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 60분 동안 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 20분 내지 40분 동안 예비 인큐베이션한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 30℃에서 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 10℃에서 예비 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 4℃에서 예비 인큐베이션한다.
ATP는 표지되지 않거나, 방사성 표지된 형태로 다양한 제조사로부터 시판되는 것으로 입수 가능하다. 일부 실시양태에서, ATP의 농도는 약 5 μM 내지 약 25 μM이다. 일부 실시양태에서, ATP의 농도는 약 10 μM이다.
일부 실시양태에서, 기질은 티로신을 포함하는 펩티드 또는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 기질은 티로신을 포함하는 합성 FRET 펩티드이다. 티로신을 포함하는 수많은 FRET 펩티드가 시판 중이다. 단백질 또는 펩티드의 일례는 폴리(Glu, Tyr)이고, 약 0.05 mg/ml 내지 약 0.25 mg/ml의 농도로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기질의 농도는 약 0.1 mg/ml이다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 실온의 온도에서 약 5분 내지 약 90분 동안 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 실온의 온도에서 약 30분 내지 약 75분 동안 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 실온의 온도에서 약 45분 내지 약 60분 동안 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 실온의 온도에서 약 60분 동안 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 실온의 온도에서 약 30분 내지 약 50분 동안 인큐베이션한다.
일부 실시양태에서, 기질의 인산화 수준의 측정은 방사성 표지된 기질을 정량적 또는 정성적으로 측정하는 것을 포함한다. 따라서, 기질의 인산화의 증가는 인산화 양의 실측 없이도 관찰할 수 있다. 이와는 다르게, 인산화의 양은 또한 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기질의 인산화 수준의 측정은 합성 FRET 펩티드 기질의 형광을 정량적 또는 정성적으로 측정하는 것을 포함한다. FRET 펩티드로부터 방출된 형광의 측정은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질의 인큐베이션을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 소혈청 알부민, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM의 디티오트레이톨, 약 0.05% 내지 약 0.25%의 소혈청 알부민 및 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM의 디티오트레이톨, 또는 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에 수행한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질의 인큐베이션을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에 수행한다. 일부 실시양태에서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질의 인큐베이션을 약 0.1%의 β-머캅토에탄올의 존재하에 수행한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 5분 내지 약 120분 동안 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 30℃에서 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 5분 내지 약 90분 동안 인큐베이션한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 30분 내지 약 90분 동안 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 10℃에서 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 30분 내지 약 75분 동안 인큐베이션한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 45분 내지 약 75분 동안 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 4℃에서 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.1%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 45분 내지 약 60분 동안 인큐베이션한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 60분 동안 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 4℃에서 예비 인큐베이션하고; 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.1%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 60분 동안 인큐베이션한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물은 화학식 II의 화합물이다:
<화학식 II>
Figure 112009057532577-PCT00006
(식 중, R1은 알킬기이고; X는 할로겐이고; Y는 O, S 또는 NH이고; Z는 O 또는 S이고; n은 0 내지 5의 정수이고, m은 0 또는 1이고, 여기서, m + n은 5 이하임). 일부 실시양태에서, 알킬기는 메틸이고, n은 1이다. 일부 실시양태에서, 할로겐은 염소이고, m은 1이다. 일부 실시양태에서, Y는 O이다. 일부 실시양태에서, Z는 O이다. 일부 실시양태에서, R1은 메틸이고, Y는 O이고, Z는 O이고, n은 1이고, m은 0이다. 일부 실시양태에서, R1은 메타 위치에 존재한다. 일부 실시양태에서, X는 염소이고, Y는 O이고, Z는 O이고, n은 0이고, m은 1이다. 일부 실시양태에서, X는 메타 위치에 존재한다.
일부 실시양태에서, 테스트 화합물은
Figure 112009057532577-PCT00007
또는
Figure 112009057532577-PCT00008
이다.
본 발명은 또한 lyn 키나제, ATP, 기질 및 본원에 기재된 임의의 1 이상의 방법을 수행하기 위한 지시사항을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 인큐베이션 챔버를 추가로 포함한다. 인큐베이션 챔버, 예를 들면 마이크로타이터 플레이트, 마이크로 원심 분리 튜브 등은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명은 또한 화학식 I로 표시되는 제1 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 하기 표 I에 열거된 화합물로부터 선택된 1 이상의 제2 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 조성물을 포함한다:
<화학식 I>
Figure 112009057532577-PCT00009
(식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 알콕시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴옥시, 벤질, 시클로알킬, 할로겐, 헤테로아릴, 헤테로시클로알킬, -CN, -OH, -NO2, -CF3, -CO2H, -CO2알킬 또는 -NH2이고; R8은 알킬 또는 수소이고; X는 O, S, NH 또는 N-알킬이고; Z는 O 또는 S임).
일부 실시양태에서, R8은 알킬, 예를 들어 메틸이다. 일부 실시양태에서, R8은 수소이다.
일부 실시양태에서, X는 산소이다.
일부 실시양태에서, Z는 산소이다.
일부 실시양태에서, R2-R6 중 하나 이상은 알킬, 예를 들면 메틸이다. 일부 실시양태에서, R2-R6 중 하나 이상은 할로겐, 예를 들면 클로로이다. 일부 실시양태에서, R2-R6 중 하나 이상은 -CN이다. 일부 실시양태에서, R2-R6 중 하나 이상은 -OH이다. 일부 실시양태에서, R2-R6 중 하나 이상은 -NO2이다. 일부 실시양태에서, R2-R6 중 하나 이상은 -CF3이다. 일부 실시양태에서, R2-R6 중 하나 이상은 -CO2H이다. 일부 실시양태에서, R2-R6 중 하나 이상은 -NH2이다. 일부 실시양태에서, R2-R6 중 하나 이상은 알콕시이다.
일부 실시양태에서, R2는 알킬, 예를 들면 메틸이고, R1 및 R3-R8은 각각 수소이고, X 및 Z는 O이다.
일부 실시양태에서, R2는 할로겐, 예를 들면 클로로이고, R1 및 R3-R8은 각각 수소이고, X 및 Z는 O이다.
일부 실시양태에서, R3은 알킬, 예를 들면 메틸이고, R1, R2 및 R4-R8은 각각 수소이고, X 및 Z는 O이다.
일부 실시양태에서, R3은 할로겐, 예를 들면 클로로이고, R1, R2 및 R4-R8은 각각 수소이고, X 및 Z는 O이다.
일부 실시양태에서, R4는 알킬, 예를 들면 메틸이고, R1-R3 및 R5-R8은 각각 수소이고, X 및 Z는 O이다.
일부 실시양태에서, R4는 할로겐, 예를 들면 클로로이고, R1-R3 및 R5-R8은 각각 수소이고, X 및 Z는 O이다.
일부 실시양태에서, R5는 -CF3이고, R1-R4 및 R6-R8은 각각 수소이고, X 및 Z는 O이다.
일부 실시양태에서, R5는 -NH2이고, R1-R4 및 R6-R8은 각각 수소이고, X 및 Z는 O이다.
일부 실시양태에서, R6은 -CF3이고, R1-R5 및 R7-R8은 각각 수소이고, X 및 Z는 O이다.
일부 실시양태에서, R6은 -NH2이고, R1-R5 및 R7-R8은 각각 수소이고, X 및 Z는 O이다.
일부 실시양태에서, 제1 화합물은 화학식 II의 화합물이다:
<화학식 II>
Figure 112009057532577-PCT00010
(식 중, R1은 알킬기이고; X는 할로겐이고; Y는 O, S 또는 NH이고; Z는 O 또는 S이고; n은 0 내지 5의 정수이고, m은 0 또는 1이고, 여기서, m + n은 5 이하임).
본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 화합물의 예시적 예로는 하기와 같은 화합물을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다:
Figure 112009057532577-PCT00011
Figure 112009057532577-PCT00012
Figure 112009057532577-PCT00013
상기 화합물은 당업자에게 공지된 유기 화학 기법으로, 예를 들어 본원에 전체로서 참고로 도입된 미국 특허 제3,922,345호에 기재된 바와 같이 합성할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 조성물의 치료학적 유효량을, 당뇨병 치료를 필요로 하는 인간에게 투여하는 것을 포함하는 인간의 당뇨병 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 다른 치료제와 병용 요법으로 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 치료제는 부가적으로 또는 상승 작용적으로 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 본 발명의 화합물과 동일한 조성물 또는 상이한 조성물의 일부일 수 있는 또 다른 치료제의 투여와 동시에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 또 다른 치료제의 투여 전에 또는 이어서 투여된다. 일 실시양태에서, 예를 들어 특정한 약물과 관련된 독성을 최소화시키기 위해, 병용 요법은 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물과 또 다른 치료제를 포함하는 조성물을 번갈아 투여하는 것을 포함한다. 각 약물 또는 치료제의 투여 기간은 예를 들어, 1개월, 3개월, 6개월 또는 1년일 수 있다. 일부 실시양태에서, 독성을 포함하나 이에 제한되지 않는 부작용을 잠재적으로 야기하는 또 다른 치료제와 동시에 본 발명의 조성물이 투여되는 경우, 치료제는 유리하게는 부작용이 야기되는 역치 미만으로 감소된 투여량으로 투여될 수 있다.
일 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는"은 당뇨병 또는 하나 이상의 식별 가능한 그의 증상의 개선을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는"은 환자에 의해 반드시 식별 가능하지는 않은 하나 이상의 측정 가능한 신체 지표의 개선을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는"은 신체적으로, 예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화, 또는 생리적으로, 예를 들어, 신체 지표의 안정화, 또는 둘 다로 당뇨병의 진행을 억제하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는"은 당뇨병의 발병을 지연시키는 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 당뇨병에 대한 예방적 방법으로서 환자, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 본원에 사용되는 "예방" 또는 "예방하는"은 당뇨병에 걸릴 위험의 감소를 지칭한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 당뇨병에 유전적 소인을 가지는 환자, 바람직하게는 인간에게 예방적 방법으로서 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 당뇨병에 비-유전적 소인을 가지는 환자에게 예방적 방법으로서 투여된다.
본원에 사용되는 "당뇨병의 치료 또는 예방"은 망막증 (즉, 실명); 발 궤양, 괴저 및 절단을 초래하는 신경병증 (즉, 신경 손상); 투석을 초래하는 신장 손상; 및 심혈관 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 II형 당뇨병과 연관된 합병증의 치료 또는 예방을 포함한다. 일부 실시양태에서, II형 당뇨병은 비정상적/변형된 lyn 키나제 활성 및/또는 발현과 관련이 있다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 II형 당뇨병 또는 II형 당뇨병으로부터 발생하는 합병증, 및 대사 증후군과 연관된 장애 및 위험 요인을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 당뇨병의 합병증으로는 당뇨성 신경병증, 당뇨성 망막증, 발기기능장애 및 신질환이 있지만, 이에 제한되지는 않으며, 본 발명의 화합물은 이러한 합병증의 치료 또는 예방에 유용하다.
본 발명은 본 발명의 화합물을 포함하는 치료학적 유효량의 조성물의 환자에게의 투여에 의한 치료 및 예방법을 제공한다. 환자는 동물, 예를 들어 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 포유류이며, 더욱 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 화합물을 하나 이상 포함하는 본 발명의 조성물은 경구 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 임의의 다른 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 일시주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내층 (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장관 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며, 또 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국부일 수 있다. 리포솜 내 캡슐화, 미립자, 마이크로캡슐제, 캡슐제 등과 같은 다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며, 본 발명의 화합물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 화합물이 환자에게 투여된다. 투여 방법으로는 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외, 구강, 설하, 뇌내, 질내, 경피 또는 직장으로, 흡입에 의해, 또는 특히, 귀, 코, 눈 또는 피부에 국소 투여가 있으나 이에 제한되지는 않는다. 투여 방식은 진료의의 재량이며, 의학적 증상의 부위에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 대부분의 경우, 투여는 본 발명의 화합물을 혈류 내로 방출하도록 할 것이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 화합물을 치료가 필요한 부위에 국부로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 예를 들어, 비제한적으로, 수술 동안 국부 주입 또는 국소 도포에 의해 (예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께), 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 시알라스틱 막과 같은 막 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비다공성 또는 아교모양 물질인 이식물에 의해 달성될 수 있다. 일 실시양태에서, 투여는 죽상경화판 조직의 부위 (또는 그 앞의 부위)에 직접 주사하여 행해질 수 있다.
폐로의 투여가 예를 들어, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제로의 제제를 사용하여, 또는 탄화불소 또는 합성 폐 계면활성제의 살포를 통해 또한 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 통상의 결합제 및 비히클, 예를 들어 트리글리세리드와 함께 좌제로 제제화될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 (문헌 [Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327] 참조; 통상적으로는 ibid. 참조).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 일 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다 (문헌 [Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald etal., 1980, Surgery 88:507 Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 또 다른 실시양태에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다 (문헌 [Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61] 참조; 또한 [Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참조). 또 다른 실시양태에서, 제어 방출 시스템은 본 발명의 화합물의 표적, 예를 들어 간 근처에 배치될 수 있으므로, 전신 투여량의 단지 일부만을 필요로 한다 (예를 들어, 문헌 [Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조). 문헌 [Langer, 1990, Science 249:1527-1533]의 개관에서 논의된 다른 제어 방출 시스템이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 환자에게 적당한 투여 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 제약상 허용되는 비히클과 함께, 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물, 임의로는 하나 이상의 본 발명의 화합물을, 적합하게는 정제된 형태로 함유할 것이다.
일부 실시양태에서, 어구 "제약상 허용되는"은 미국 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나, 또는 동물, 특히 인간용으로 미국 약전 또는 일반적으로 인가된 다른 약전에 열거되는 것을 의미한다. 용어 "비히클"은 본 발명의 화합물과 함께 투여되는 희석제, 어쥬반트, 부형제 또는 담체를 지칭한다. 그러한 제약 비히클은 액체, 예를 들면 물, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것을 포함하는 오일, 예를 들면 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등일 수 있다. 제약 비히클은 염수, 아카시아 고무, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드 실리카, 우레아 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 환자에게 투여되는 경우, 본 발명의 화합물 및 제약상 허용되는 비히클은 바람직하게는 멸균된다. 본 발명의 화합물이 정맥내 투여되는 경우, 물이 적합한 비히클이다. 염수 용액, 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 특히 주사액제에 대해 액체 비히클로서 또한 사용될 수 있다. 적합한 제약 비히클로는 또한 부형제, 예를 들면 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 곡분, 석회분, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 있다. 본 발명의 조성물은 원하는 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 용액, 현탁액, 유제, 정제, 환제, 펠렛, 캡슐, 액체-함유 캡슐, 분말, 서방형 제제, 좌제, 유제, 에어로졸, 스프레이, 현탁액, 또는 사용하기 적합한 임의의 다른 형태를 취할 수 있다. 일 실시양태에서, 제약상 허용되는 비히클은 캡슐이다 (예를 들어, 미국 특허 제5,698,155호 참조). 적합한 제약 비히클의 다른 예는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, A.R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Co.]에 기재되어 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 통상적인 절차에 따라 인간에의 정맥내 투여에 적합한 제약 조성물로 제제화된다. 통상적으로, 정맥내 투여용 본 발명의 화합물은 멸균 등장성 완충 수용액이다. 필요하다면, 조성물은 가용화제를 또한 포함할 수 있다. 정맥내 투여용 조성물은 주사 부위의 통증을 경감시키기 위해 리도카인과 같은 국소 마취제를 임의로 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분들은 개별적으로 또는 함께 혼합되어 단위 투여 형태, 예를 들어, 활성제의 양이 표시된 앰플 또는 봉지와 같은 밀봉 봉인된 용기 안의 동결 건조된 분말 또는 물이 없는 농축물로 제공된다. 본 발명의 화합물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 예를 들어, 멸균 제약 등급수 또는 염수를 함유한 주입 병에 계량 분배될 수 있다. 본 발명의 화합물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 투여된다. 경구 투여용 조성물은 예를 들어 정제, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 과립, 분말, 유제, 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르 형태일 수 있다. 경구 투여되는 조성물은 맛이 좋은 제약 제제를 제공하기 위해, 감미제, 예를 들면 프럭토스, 아스파르탐 또는 사카린; 향미제, 예를 들면, 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리; 착색제; 및 보존제와 같은 작용제를 임의로 하나 이상 함유할 수 있다. 또한, 정제 또는 환제 형태인 경우, 조성물은 위장 기관 내의 분해 및 흡수를 지연시키기 위해 코팅되어 장기간에 걸쳐 지속적인 활성을 제공할 수 있다. 삼투적 활성 작용 화합물을 둘러싼 선택적으로 투과 가능한 막은 경구 투여되는 본 발명의 화합물에 또한 적합하다. 후자의 플랫폼에서, 작용 화합물은 캡슐 주위 환경으로부터 유체를 흡수하며, 팽창되어 개구를 통해 작용제 또는 작용제 조성물을 방출한다. 이러한 전달 플랫폼은 즉방형 제제의 스파이크된 프로파일과는 대조적으로 본질적으로 0차 전달 프로파일을 제공할 수 있다. 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 또한 사용될 수 있다. 경구용 조성물은 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 비히클을 포함할 수 있다. 이러한 비히클은 적합한 제약 등급이다.
본원에 개시된 특정 장애 또는 증상의 치료에 효과적일 본 발명의 화합물의 양은 장애 또는 증상의 특성에 따라 달라질 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 또는 생체내 분석이 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 돕는데 임의로 사용될 수 있다. 조성물 중에 사용될 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 심각성에 따라 달라질 것이며, 진료의의 판단 및 환자 각각의 형편에 따라 결정되어야 한다. 그러나, 경구 투여에 적합한 투여량 범위는 일반적으로, 체중 kg 당 본 발명의 화합물 약 0.001 mg 내지 200 mg이다. 일부 실시양태에서, 경구 투여량은 체중 kg 당 0.01 mg 내지 70 mg, 또는 체중 kg 당 0.1 mg 내지 50 mg, 또는 체중 kg 당 0.5 mg 내지 20 mg, 또는 체중 kg 당 1 mg 내지 10 mg이다. 일부 실시양태에서, 경구 투여량은 체중 kg 당 본 발명의 화합물 5 mg이다. 본원에 기재된 투여량은 투여되는 총 양을 지칭한다. 즉, 하나 이상의 본 발명의 화합물이 투여되는 경우, 투여량은 투여되는 본 발명의 화합물의 총 양에 상응한다. 바람직하게는, 경구용 조성물은 10 중량％ 내지 95 중량％의 활성 성분을 함유한다.
정맥내 (i.v.) 투여에 적합한 투여량 범위는 체중 kg 당 0.01 mg 내지 100 mg, 체중 kg 당 0.1 mg 내지 35 mg, 및 체중 kg 당 1 mg 내지 10 mg이다. 비내 투여에 적합한 투여량 범위는 일반적으로, 체중 kg 당 약 0.01 pg 내지 1 mg이다. 좌제는 일반적으로, 체중 kg 당 본 발명의 화합물 0.01 mg 내지 50 mg을 함유하며, 0.5 중량％ 내지 10 중량％ 범위의 활성 성분을 포함한다. 진피내, 근육내, 복강내, 피하, 경막외, 설하, 뇌내, 질내, 경피 투여, 또는 흡입에 의한 투여에 대해 권장되는 투여량은 체중 kg 당 0.001 mg 내지 200 mg의 범위이다. 국소 투여에 적합한 본 발명의 화합물의 투여량은 0.001 mg 내지 1 mg의 범위이며, 화합물이 투여되는 영역에 따라 달라진다. 유효 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다. 이러한 동물 모델 및 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다.
하기 표는 II형 당뇨병에 대한 약물 타겟을 그 타겟에 대한 대표 약물(사용 승인됨), 개발 단계 약물 또는 임상 전 화합물로 기재한 것인데, 이들 중 하나 이상은 하나 이상의 본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있다.
Figure 112009057532577-PCT00014
본 발명은 또한 본원에 개시된 조성물의 당뇨병 치료용 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 화합물 및/또는 조성물의 당뇨병 치료용 약제의 제조 용도에 관한 것이다.
본원에 개시된 발명을 보다 효과적으로 이해할 수 있기 위해, 실시예가 이하에 제공된다. 이들 실시예는 오직 예시를 위한 것이며, 어떠한 방법으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1: lyn 키나제 선택도
화합물 102 (10 μM)를 억제 또는 활성화를 위한 49개의 키나제에 대해 선별한 키나제 선별(screen)을 수행하였다. 20% 이상 활성화 또는 억제된 임의의 키나제가 유의한 효과를 갖는 것으로 고려되었다. 선별된 49개의 키나제 중에, lyn 키나제가 51% 활성화되었다. 반복 실험에서, lyn 키나제 활성은 57% 증가하였다. 테스트한 다른 키나제 중 인슐린 유사 성장 인자 수용체 활성이 20.1% 억제되었고, p70S6K는 24.3% 억제되었다.
Figure 112009057532577-PCT00015
실시예 2: lyn 키나제 활성화 최적화 및 ATP 동역학
lyn 키나제 활성화의 확인 후, 화합물 102-매개된 lyn 키나제 활성화의 조건 을 최적화하기 위한 연구를 반복하였다. 다음의 연구: 1) lyn의 화합물 102-매개된 활성화를 최대화하기 위한 예비 인큐베이션 조건의 최적화; 및 2) lyn의 화합물 102 활성화를 매개하는 효소 동역학을 결정하기 위한 테스트를 수행하였다.
최적의 예비 인큐베이션 조건
실험에서, 키나제 lyn (h)를 DMSO 또는 1, 3, 10, 30 및 100 μM의 화합물 102와 함께 30분 동안 얼음 상에서 예비 인큐베이션하였다. 이어서, 키나제를 선형 동역학이 되는 농도로 희석하고, 10 μM의 ATP에서 40분 동안 실온에서 표준 방사 분석으로 분석하였다.
이 실험에서, lyn 키나제 (h)의 활성은 투여량 의존적으로 화합물 102의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 100 μM의 화합물 102에서, lyn 키나제 (h)의 활성은 DMSO 대조군에서 측정한 활성의 3배 이상이었다. lyn 키나제의 화합물 102 활성화에 대한 EC50은 650 nM였다.
ATP 동역학 연구
동역학 연구는 앞서 정해진 실험 조건 및 예비 인큐베이션을 사용하여 설계하였다. 이 연구에서, 화합물 102 농도를 100 μM로 일정하게 유지하였고, ATP 농도는 0에서 800 μM로 단계적으로 증가시켰다. ATP에 대한 동역학 변수를 비선형 회귀 분석 및 방정식 Y=Vmax(x)/(Km+x)를 사용하여 계산하였다. Vmax는 효소의 활성이고, Km은 최대 활성의 반이 되는데 필요한 ATP 농도이다. 이러한 조건하에서, 화합물 102는 lyn 키나제의 Vmax를 3배 증가시켰지만, ATP에 대한 Km이 바뀌지는 않았다. 따라서, 화합물 102는 ATP-독립적으로 lyn 키나제를 증가시키는 것으로 보인다.
실시예 3: lyn 활성화를 위한 선별
실시예 2에 기재된 최적화 분석에서 정해진 조건을 사용하여 lyn 키나제 활성화 고효율 선별이 현재 행해진다. 이 분석은 lyn 키나제의 새로운 활성제를 확인하는데 사용될 것이다. 이들 조건: 1) 테스트 화합물을 lyn 키나제 존재하에 30분 동안 4℃에서 예비 인큐베이션; 2) ATP 및 기질의 첨가에 의해 개시되는 분석; 3) 상온에서 약 40분 동안 인큐베이션; 및 4) 기질의 인산화 수준의 측정이 본원에 나타나 있다.
실시예 4: 생체내 키나제 활성화
8주령의 수컷 CD1 마우스를 이 연구에 사용하였다. 마우스가 음식 및 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하고, 12시간 동안 명/암 사이클을 유지하였다.
마우스를 18시간 동안 금식시키고, 혈당 기준선을 측정하였다. 기준 글루코스 수준에서 60분 경과 후, 마우스에 비히클, 30 또는 100 mg/kg의 화합물 102를 투여하였다. 약물 투여한 지 75분 경과 후, 간을 절개하였다.
구슬-비터(bead-beater) 및 세포 용해 완충액 (5OmM Tris-HCl, 1%NP-4O, 0.25% Na-데옥시콜레이트, 15OmM NaCl, ImM EDTA, ImM PMSF, lμg/ml 아프로티닌, 1 μg/ml 류펩틴, ImM Na3VO4, ImM NaF, 10% 글리세롤, pH 7.4) 0.75 ml 내에서 1.0 mm의 유리 구슬을 이용하여 간을 균질화하였다. 조직 균질액을 원심 분리하였고, 상청액의 포스포-IRS-1의 수준을 테스트하였다 (하기 참조).
포스포-티로신 표지된 단백질을 모노클로날 포스포-티로신 항체 및 단백질 세파로스 A를 사용하여 면역 침강시켰다. 면역 침강된 단백질을 PAGE 전기영동 시스템 (인비트로젠; NuPage 시스템)을 사용하여 분리하였다. 단백질을 PVDF 막으로 이동하였다. 팬(pan)-IRS-1 토끼 폴리클로날 항체, 2차-HRP 화학 발광을 이용하여 인산화된 IRS-1을 PVDF 막 상에 검출하였다 (업스테이트(Upstate)).
실시예 5: lyn 키나제 활성화 분석 최적화
다음의 실시예를 수행하여 lyn 키나제의 화합물 102-매개된 활성화의 검출을 위한 분석 조건을 추가로 최적화하였다. 하기에 기재된 분석은 Z'-LYTE™ 키나제 분석 키트-Tyr 펩티드 (인비트로젠, Carlsbad, CA)를 이용한다. 이 분석 시스템은 원래 다양한 티로신 키나제의 억제제를 검출하기 위해 개발되었다. 이 시스템에 가해진 변형은 lyn 키나제의 활성제를 검출하기 위한 조건을 최적화한다. 특히, lyn 키나제의 화합물 102-매개된 활성화를 검출하기 위한 최적의 lyn 키나제 단백질 농도, 완충액 성분 및 분석 조건이 본원에 기재되어 있다.
사용된 분석 시스템은 lyn 키나제의 활성 검출에 Z'-LYTE™ 키나제 분석 키트-Tyr 펩티드-2 (인비트로젠, Carlsbad, CA)를 이용하는 비-방사 분석이었다. 완충액 성분을 하기에 기재된 바와 같이 변경하였다. 이들 연구에서 사용된 lyn 키나제 단백질은 단백질의 비인산화된 형태였다. 이 비인산화된 lyn 단백질의 농도는 25 ng/mL 내지 300 ng/mL였다. 예비 인큐베이션 단계를 30분에서 60분으로 연장하였다.
모든 연구에 인비트로젠 반응 완충액을 사용하였다. 이 반응 완충액에 다음 의 첨가를 하고, 각각 테스트하여 반응 완충액 단독인 것과 비교하였다: 변형 1: 반응 완충액과 0.1% BSA; 변형 2: 반응 완충액과 1 mM 디티오트레이톨; 변형 3: 반응 완충액과 0.01% BSA, 1 mM 디티오트레이톨; 및 변형 4: 반응 완충액과 0.1% β-머캅토에탄올.
표 II는 상이한 완충액 성분을 이용한 상이한 활성화 수준을 나타낸다.
Figure 112009057532577-PCT00016
완충액 변형 4는 lyn 키나제를 위한 최적의 활성화 조건을 만들었다. 0.1% β-머캅토에탄올을 반응 완충액 (변형 4)에 첨가한 결과, 낮은 기준선 수준 (13.7% 기질 인산화)이 얻어졌고, 화합물 102의 첨가로, lyn 키나제의 활성화가 2.4배가 되었다. 완충액 변형 4는 변형 1, 2 및 3보다 상당히 나은 활성화를 나타냈다.
이들 연구는 lyn 키나제의 화합물 102-매개된 활성화를 검출하기 위한 최적의, 일관된 조건을 개시한다. 이들 최적 조건은: 1) Z'-LYTE™ 키나제 분석 키트-Tyr 펩티드-2 (인비트로젠, Carlsbad, CA) 이용; 2) 농도 25 ng/mL 내지 300 ng/mL 범위의 비인산화된 lyn 키나제 단백질 이용; 3) 0.1% β-머캅토에탄올이 첨가된 표준 반응 완충액 (인비트로젠); 및 ATP 부재하에 예비 인큐베이션 단계의 30분에서 60분으로의 연장이다.
실시예 6: 병용 요법
예비 데이터에 근거하면, 화합물 102는 존재하는 II형 당뇨병제와 병용 치료하는 데 유용할 것이다. 동물을 각각 및 비-유효 투여량을 병용하여 치료하였다. 각각, 경구 포도당 부하검사에서 약물은 혈당 수준에 영향을 미치지 않았다. 병용시에, 약물은 혈당 수준을 상당히 감소시킨다. 게다가, 진행되는 연구는 db/db 마우스에서의 화합물 102와 술포닐우레아 (글리벤클아미드)의 병용 및 화합물 102와 로지글리타존의 병용을 포함한다.
CD1 수컷 마우스를 18시간 동안 금식시켰다. 금식 후에, 나타낸 투여량의 약물로 동물을 치료하였다 (하기 표 참조).
Figure 112009057532577-PCT00017
Figure 112009057532577-PCT00018
화합물과 메트포르민의 상승 작용을 도 1에 도시한다.
본원에 기재된 것뿐만 아니라 본 발명의 다양한 변경은 상기의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변경은 또한 첨부된 청구의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 출원에 인용된 각각의 참고 문헌 (논문 기사, 미국 특허, 미국이 아닌 나라의 특허, 특허 출원 공개, 국제 특허 출원 공개 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아님)은 본원에 전체로서 참고로 도입되어 있다. 2007년 2월 20일에 출원된 미국 출원 제60/890,632호는 본원에 전체로서 참고로 도입되어 있다.

Claims (43)

  1. 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 예비 인큐베이션하고;
    lyn 키나제 및 테스트 화합물에 ATP 및 기질을 첨가하고;
    테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 인큐베이션하고;
    기질의 인산화 수준을 측정하여, 기질의 인산화 수준의 증가로 테스트 화합물이 lyn 키나제의 활성제임을 나타내게 되는 것
    을 포함하는 lyn 키나제 활성제의 확인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 5분 내지 약 120분 동안 예비 인큐베이션하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 30분 내지 약 90분 동안 예비 인큐베이션하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 45분 내지 약 75분 동안 예비 인큐베이션하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 60분 동안 예비 인큐베이션하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 30℃에서 예비 인큐베이션하는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 10℃에서 예비 인큐베이션하는 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 4℃에서 예비 인큐베이션하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, lyn 키나제의 농도가 약 10 ng/ml 내지 약 500 ng/ml인 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, lyn 키나제의 농도가 약 25 ng/ml 내지 약 300 ng/ml인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, ATP의 농도가 약 5 μM 내지 약 25 μM인 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, ATP의 농도가 약 10 μM인 방 법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, ATP가 방사성 표지된 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 기질이 티로신을 포함하는 펩티드 또는 단백질인 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 기질이 티로신을 포함하는 합성 FRET 펩티드인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질이 약 실온의 온도에서 약 5분 내지 약 90분 동안 인큐베이션되는 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질이 약 실온의 온도에서 약 30분 내지 약 75분 동안 인큐베이션되는 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질이 약 실온의 온도에서 약 45분 내지 약 60분 동안 인큐베이션되는 방법.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질이 약 실온의 온도에서 약 60분 동안 인큐베이션되는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 기질의 인산화 수준의 측정이 방사성 표지된 기질을 정량적 또는 정성적으로 측정하는 것을 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 기질의 인산화 수준의 측정이 합성 FRET 펩티드 기질의 형광을 정량적 또는 정성적으로 측정하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질의 인큐베이션을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 소혈청 알부민, 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM의 디티오트레이톨, 약 0.05% 내지 약 0.25%의 소혈청 알부민 및 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM의 디티오트레이톨, 또는 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에 수행하는 방법.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질의 인큐베이션을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에 수행하는 방법.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질의 인큐베이션을 약 0.1%의 β-머캅토에탄올의 존재하에 수행하는 방법.
  25. 제1항에 있어서,
    테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 5분 내지 약 120분 동안 예비 인큐베이션하고;
    테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 30℃에서 예비 인큐베이션하고;
    테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 5분 내지 약 90분 동안 인큐베이션하는 방법.
  26. 제1항에 있어서,
    테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 30분 내지 약 90분 동안 예비 인큐베이션하고;
    테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 0℃ 내지 약 10℃에서 예비 인큐 베이션하고;
    테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.05% 내지 약 0.25%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 30분 내지 약 75분 동안 인큐베이션하는 방법.
  27. 제1항에 있어서,
    테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 45분 내지 약 75분 동안 예비 인큐베이션하고;
    테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 4℃에서 예비 인큐베이션하고;
    테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.1%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 45분 내지 약 60분 동안 인큐베이션하는 방법.
  28. 제1항에 있어서,
    테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 60분 동안 예비 인큐베이션하고;
    테스트 화합물을 lyn 키나제의 존재하에 약 4℃에서 예비 인큐베이션하고;
    테스트 화합물, lyn 키나제, ATP 및 기질을 약 0.1%의 β-머캅토에탄올의 존재하에, 약 실온에서 약 60분 동안 인큐베이션하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물이 화학식 II로 표시되는 화합물인 방법
    <화학식 II>
    Figure 112009057532577-PCT00019
    (식 중, R1은 알킬기이고; X는 할로겐이고; Y는 O, S 또는 NH이고; Z는 O 또는 S이고; n은 0 내지 5의 정수이고, m은 0 또는 1이고, 여기서, m + n은 5 이하임).
  30. 제29항에 있어서, 알킬기는 메틸이고, n은 1인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 할로겐은 염소이고, m은 1인 방법.
  32. 제29항에 있어서, Y는 O인 방법.
  33. 제29항에 있어서, Z는 O인 방법.
  34. 제29항에 있어서, R1은 메틸이고, Y는 O이고, Z는 O이고, n은 1이고, m은 0인 방법.
  35. 제34항에 있어서, R1이 메타 위치에 존재하는 방법.
  36. 제29항에 있어서, X는 염소이고, Y는 O이고, Z는 O이고, n은 0이고, m은 1인 방법.
  37. 제36항에 있어서, X가 메타 위치에 존재하는 방법.
  38. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 화합물이
    Figure 112009057532577-PCT00020
    또는
    Figure 112009057532577-PCT00021
    인 방법.
  39. lyn 키나제, ATP, 기질 및 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 방법 을 수행하기 위한 지시사항을 포함하는 키트.
  40. 제39항에 있어서, 인큐베이션 챔버를 추가로 포함하는 키트.
  41. 화학식 I로 표시되는 제1 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 표 I에 열거된 화합물로부터 선택된 1 이상의 제2 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 조성물:
    <화학식 I>
    Figure 112009057532577-PCT00022
    (식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 알콕시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴옥시, 벤질, 시클로알킬, 할로겐, 헤테로아릴, 헤테로시클로알킬, -CN, -OH, -NO2, -CF3, -CO2H, -CO2알킬 또는 -NH2이고; R8은 알킬 또는 수소이고; X는 O, S, NH 또는 N-알킬이고; Z는 O 또는 S임).
  42. 제41항에 있어서, 제1 화합물이 화학식 II의 화합물인 조성물:
    <화학식 II>
    Figure 112009057532577-PCT00023
    (식 중, R1은 알킬기이고; X는 할로겐이고; Y는 O, S 또는 NH이고; Z는 O 또는 S이고; n은 0 내지 5의 정수이고, m은 0 또는 1이고, 여기서, m + n은 5 이하임).
  43. 제41항 또는 제42항의 조성물의 치료학적 유효량을, 당뇨병 치료를 필요로 하는 인간에게 투여하는 것을 포함하는 인간의 당뇨병 치료 방법.
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