BRPI0807928A2

BRPI0807928A2 - Métodos para identificar um ativador de lyn quinase, e para tratar diabetes em um humano, kit, e, composição

Info

Publication number: BRPI0807928A2
Application number: BRPI0807928-5A
Authority: BR
Inventors: Andrew Reaume; Michael Saporito
Original assignee: Melior Pharmaceuticals I Inc
Priority date: 2007-02-20
Filing date: 2008-02-20
Publication date: 2014-07-08
Also published as: MX2009008874A; JP2010518860A; ZA200905776B; AU2008218765A1; WO2008103692A2; CA2678813A1; IL200429A0; EP2120581A2; WO2008103692A3; NZ579227A; CN101686686A; KR20100014480A; EP2120581A4; US20100152215A1

Description

I “MÉTODOS PARA IDENTIFICAR UM ATIVADOR DE LYN QUINASE, E PARA TRATAR DIABETES EM UM HUMANO, KIT, E, COMPOSIÇÃO”

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a métodos de identificar um

ativador de Iyn quinase e aos kits relacionados a ele.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Lyn quinase é um membro da família src de tirosinas quinases de proteína não receptora que é predominantemente expressa em células linfóide B e mielóide. Ver, por exemplo, Briggs SD, Lemer EC, Smithgall TE: Affinity Of Src Family Quinase SH3 Domains For HIV Nef In Vitro Does Not Predict Quinase Ativação By Nef In Vivo. Biochemistry 39: 489- 495 (2000), aqui incorporado pela referência. Lyn participa na transdução de sinal de receptores de superfície celular que não têm atividade de tirosina quinase intrínseca. A ativação da atividade quinase Iyn é necessária para proliferação de células de mieloma CD45+ estimuladas por IL-6. Ver, por exemplo, Ishikawa H, Tsuyama N, Abroun S, Liu S, Li FJ, Taniguchi The, Kawano MM: Requirements of src family kinase activity associated with CD45 for myeloma cell proliferation by interleukin-6. Blood 99: 2172-2178 (2002), aqui incorporado pela referência. A associação de Iyn e fyn com o domínio rico em prolina de glicoproteína VI regula sinalização intracelular. Ver, por exemplo, Suzuki-Inoue K, Tulasne D, Shen Y, Bori-Sanz T, Inoue The, Jung SM, Moroi M, Andrews RK, Bemdt MC, Watson SP: Association of Fyn and Lyn with the proline-rich domain of glicoproteína VI regulates intracellular signaling. J. Biol. Chem. 277: 21561-21566 (2002), aqui incorporado pela referência. O caminho lyn/CD22/SHP-l é importante na autoimunidade. Ver, por exemplo, Blasioli J, Goodnow CC: Lyn/CD22/SHP

1 e their importance in autoimmunity. Curr. Dir. Autoimmun. 5: 151-160 (2002), aqui incorporado pela referência. Obesidade, hiperlipidemia, e diabetes mostraram exercer um papel causai em várias desordens incluindo, por exemplo, doenças cardiovasculares ateroscleróticas, que atualmente é responsável por uma proporção considerável de morbidade na sociedade ocidental. Uma desordem 5 humana, denominada “Síndrome X” ou “Síndrome metabólica,” é manifestada por metabolismo de glicose defeituoso (por exemplo, resistência à insulina), pressão sanguínea elevada (isto é, desequilíbrio), e um desequilíbrio de lipídeo sanguíneo (isto é, dislipidemia). Ver, por exemplo, Reaven, 1991, Annu. Rev. Med. 44: 121-131.

Nenhum dos medicamentos comercialmente disponíveis

atualmente para modular Iyn quinase ou gerenciar níveis de glicose elevados tem uma utilidade geral na regulação de lipídeo, lipoproteína, níveis de insulina e glicose no sangue. Assim, compostos que têm uma ou mais destas utilidades são claramente necessários. Além do mais, existe uma necessidade 15 clara de desenvolver medicamentos mais seguros que são eficazes na diminuição do colesterol do soro, aumentando níveis séricos de HDL, prevenindo doença coronária cardíaca, e/ou tratando doença já existente, tais como aterosclerose, obesidade, diabetes, e outras doenças que são afetadas por metabolismo de glicose e/ou níveis de glicose elevados. Desta maneira, 20 ensaios para identificar ativadores de Iyn quinase seriam enormemente desejados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece métodos de identificar um ativador de Iyn quinase compreendendo: pré-incubar um composto de teste na 25 presença de Iyn quinase; adicionar o ATP e substrato à Iyn quinase e composto de teste; incubar o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato; e medir o nível de fosforilação do substrato, em que um aumento no nível de fosforilação do substrato indica que o composto de teste é um ativador de Iyn quinase. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase de cerca de 5 minutos a cerca de 120 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase de cerca de 30 minutos a cerca de 90 minutos. Em algumas 5 modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase de cerca de 45 minutos a cerca de 75 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase por cerca de 60 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase por 20 a 40 minutos.

Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado

na presença de Iyn quinase a cerca de O0C a cerca de 3 0°C. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 0°C a cerca de 10 0C. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 4°C.

Em algumas modalidades, a concentração da Iyn quinase é de

cerca de 10 ng/mL a cerca de 500 ng/mL. Em algumas modalidades, a concentração da Iyn quinase é de cerca de 25 ng/mL a cerca de 300 ng/mL.

Em algumas modalidades, a concentração de ATP é de cerca de 5 jjM a cerca de 25 μΜ. Em algumas modalidades, a concentração de ATP é cerca de 10 μΜ. Em algumas modalidades, o ATP é radiomarcado.

Em algumas modalidades, o substrato é uma proteína ou peptídeo que compreende uma tirosina.

Em algumas modalidades, o substrato é um peptídeo FRET sintético compreendendo uma tirosina.

Em algumas modalidades, o composto de teste, Iyn quinase,

ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 5 minutos a cerca de 90 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 30 minutos a cerca de 75 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 45 minutos a cerca de 60 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente por cerca 5 de 60 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados a temperatura ambiente por cerca de 30 a 50 minutos.

Em algumas modalidades, o nível de fosforilação do substrato compreende medir quantitativa ou qualitativamente o substrato radiomarcado. 10 Em algumas modalidades, a medição do nível de fosforilação do substrato compreende medir quantitativa ou qualitativamente a fluorescência do peptídeo FRET sintético substrato. Em algumas modalidades, a incubação do composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato acontece na presença de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% albumina sérica bovina, de cerca de 0,5 mM 15 a cerca de 2,5mM ditiotreitol, de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% albumina sérica bovina e de cerca de 0,5 mM a cerca de 2,5 mM ditiotreitol, ou de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de β-mercaptoetanol.

Em algumas modalidades, a incubação do composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato acontece na presença de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de β-mercaptoetanol. Em algumas modalidades, a incubação do composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato acontece na presença de cerca de 0,1% de β-mercaptoetanol.

Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase de cerca de 5 minutos a cerca de 120 minutos; o 25 composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 0°C a cerca de 30°C; e o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 5 minutos a cerca de 90 minutos, na presença de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de βmercaptoetanol. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase de cerca de 30 minutos a cerca de 90 minutos; o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 0°C a cerca de 10°C; e o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são 5 incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 30 minutos a cerca de 75 minutos, na presença de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de βmercaptoetanol.

Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase de cerca de 45 minutos a cerca de 75 minutos; o 10 composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 4°C; e o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 45 minutos a cerca de 60 minutos, na presença de cerca de 0,1% de β-mercaptoetanol.

Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado 15 na presença de Iyn quinase por cerca de 60 minutos; o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 4°C; e o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente por cerca de 60 minutos, na presença de cerca de 0,1% de βmercaptoetanol.

Em algumas modalidades, o composto de teste é um composto

da fórmula II

em que: R1 é um grupo alquila; X é um halogênio; Y é O, S, ou NH; Z é O ou S; n é um número inteiro de 0 a 5 e m é 0 ou 1, em que m + n é menor ou igual a 5. Em algumas modalidades, o grupo alquila é metila e n é I. Em algumas modalidades, o halogênio é cloro e m é I. Em algumas modalidades, Y é O. Em algumas modalidades, Z é O. Em algumas modalidades, R1 é metila, YéO, ZéO, né l,eméO. Em algumas

quinase, ATP, substrato, e instruções para realizar qualquer um ou mais dos métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, o kit adicionalmente compreende uma câmara de incubação. A presente invenção também compreende composições compreendendo um primeiro composto da fórmula I:

I

em que: cada um de R1, R2, R3, R4, R5, Re, e R7 são independentemente um hidrogênio, alcóxi, alquila, alquenila, alquinila, arila,

5

modalidades, R1 é na posição meta. Em algumas modalidades, X é cloro, Y é

O, Z é O, n é O, e m é 1. Em algumas modalidades, X é na posição meta.

Em algumas modalidades, o composto de teste é

CI

0

NH

ou

N

O

Me

A presente invenção também fornece kits compreendendo Iyn arilóxi, benzila, cicloalquila, halogênio, heteroarila, heterocicloalquila, -CN, OH, -NO2, -CF3, -CO2H, -C02alquila, ou -NH2; R8 é alquila ou hidrogênio; X é O, S, NH, ou N- alquila; e Z é O ou S; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste; e um ou mais do segundo composto, ou sal 5 farmaceuticamente aceitável deste, selecionado dos compostos listados na tabela a seguir. Em algumas modalidades, o primeiro composto é da fórmula II

em que: R1 é um grupo alquila; X é um halogênio; Y é O, S, ou NH; Z é O ou S; e n é um número inteiro de O a 5 e m é O ou 1, em que m + n é menor ou igual a 5.

A presente invenção também fornece métodos de tratar diabetes em um humano compreendendo administrar ao humano em necessidade da mesma uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição aqui descrita.

DESCRICÂO RESUMIDA DOS DESENHOS

A figura 1 ilustra a sinergia do composto 102 com metformina.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Da forma aqui usada, o termo “cerca de” significa ± 10% do valor que ele modifica. Por exemplo, “cerca de 10” significa de 9 a 11.

Da forma aqui usada, o termo “alcóxi” significa um grupo -O

alquila, em que alquila é da forma aqui definida. Um grupo alcóxi pode ser não substituído ou substituído com um ou dois substituintes adequados. Em algumas modalidades, a cadeia de alquila de um grupo alquilóxi é de 1 a 6 átomos de carbono de comprimento, referido aqui, por exemplo, como “alcóxi (C1-C6)." Da forma aqui usada, o termo “alquenila” significa uma cadeia de hidrocarboneto não ramificada e ramificada monovalente tendo uma ou mais duplas ligações nela. A dupla ligação de um grupo alquenila pode ser não conjugado ou conjugado a um outro grupo insaturado. Grupos alquenila 5 adequados incluem, mas sem limitações, grupos alquenila (C2-C6), tais como vinila, allila, butenila, pentenila, hexenila, butadienila, pentadienila, hexadienila, 2-etilexenila, 2-propil-2-butenila, 4-(2-metil-3-buteno)-pentenila. Um grupo alquenila pode ser não substituído ou substituído com um ou dois substituintes adequados.

Da forma aqui usada, o termo “alquila” significa uma cadeia

de hidrocarboneto não ramificada e ramificada monovalente saturada. Exemplos de grupo alquila incluem, mas sem limitações, grupos alquila (Cr C6), tais como metila, etila, propila, isopropila, 2-metil-l-propila, 2-metil-2 propila, 2-metil-l-butila, 3 -metil-l-butila, 2-metil-3 -butila, 2,2-dimetil-l15 propila, 2-metil-l-pentila, 3 -metil- 1-pentila, 4-metil-l-pentila, 2-metil-2- pentila, 3-metil-2-pentila, 4-metil-2-pentila, 2,2-dimetil-l-butila, 3,3 -dimetil1-butila, 2-etil-l -butila, butila, isobutila, t-butila, pentila, isopentila, neopentila, e hexila, e grupos alquila maiores, tais como heptila e octila. Um grupo alquila pode ser não substituído ou substituído com um ou dois 20 substituintes adequados.

Da forma aqui usada, o termo “alquinila” significa cadeia de hidrocarboneto não ramificada e ramificada monovalente tendo uma ou mais ligações triplas nela. A ligação tripla de um grupo alquinila pode ser não conjugada ou conjugada a um outro grupo insaturado. Grupos alquinila 25 adequados incluem, mas sem limitações, grupos alquinila (C2-C6), tais como etinila, propinila, butinila, pentinila, hexinila, metilpropinila, 4-metil-lbutinila, 4-propil-2-pentinila, e 4-butil-2-hexinila. Um grupo alquimia pode ser não substituído ou substituído com um ou dois substituintes adequados.

Da forma aqui usada, o termo “arila” significa um radical aromático monocíclico ou policíclico compreendendo átomos de carbono e hidrogênio. Exemplos de grupos arila adequados incluem, mas sem limitações, fenila, tolila, antacenila, fluorenila, indenila, azulenila, e naftila, bem como frações carbocíclicas benzo fundidas, tal como 5,6,7,8- 5 tetraidronaftila. Um grupo arila pode ser não substituído ou substituído com um ou dois substituintes adequados. Em algumas modalidades, o grupo arila é um anel monocíclico, em que o anel compreende 6 átomos de carbono, aqui referidos como “arila (C6).”

Da forma aqui usada, o termo “arilóxi” significa um grupo -Oarila, em que arila é da forma aqui definida. Um grupo arilóxi pode ser não substituído ou substituído com um ou dois substituintes adequados. Em algumas modalidades, o anel arila de um grupo arilóxi é um anel monocíclico, em que o anel compreende 6 átomos de carbono, aqui referido como “arilóxi

(C6)."

Da forma aqui usada, o termo “benzila” significa -CH2-fenila.

Da forma aqui usada, o termo “carbonila” é um grupo divalente da fórmula C(O)-. Da forma aqui usada, a frase “composto(s) da invenção” significa, coletivamente, os compostos das fórmulas I e II, e sais farmaceuticamente aceitáveis deste. Os compostos da invenção são identificados aqui por sua 20 estrutura química e/ou nome químico. Onde um composto é referido tanto por uma estrutura química quanto por um nome químico, e a estrutura química e nome químico em conflito, a estrutura química é determinante da identidade do composto. Os compostos da invenção podem conter um ou mais centros quirais e/ou duplas ligações e, desta forma, existem como estereoisômeros, 25 tais como isômeros de ligação dupla (isto é, isômeros geométricos), enantiômeros, ou diastereômeros. De acordo com a invenção, as estruturas químicas apresentadas aqui e, desta forma, os compostos da invenção englobam todos os enantiômeros e estereoisômeros do composto correspondente, isto é, tanto a forma estereomericamente pura (por exemplo, geometricamente pura, enantimericamente pura ou diastereomericamente pura) quanto misturas enantioméricas e estereoisoméricas. Misturas enantioméricas e estereoisoméricas podem ser resolvidas nos seus enantiômeros ou estereoisômeros do componente por métodos bem 5 conhecidos, tais como cromatografia gasosa de fase quiral, cromatografia líquida de alto desempenho de fase quiral, cristalização do composto como um complexo de sal quiral, ou cristralização do composto em um solvente quiral. Enantiômeros e estereoisômeros também podem ser obtidos de intermediários esteriomérica ou enantiomericamente puros, reagentes, e 10 catalisadores por métodos sintéticos assimétricos bem conhecidos. Quando usados nos métodos de identificação aqui descritos, os compostos da invenção são aqui referidos como compostos de teste (que também podem servir como controles positivos em tais métodos).

Da forma aqui usada, o termo “cicloalquila” significa um anel monocíclico ou policíclico saturado compreendendo átomos de carbono e hidrogênio e sem nenhuma ligação múltipla carbono-carbono. Exemplos de grupos cicloalquila incluem, mas sem limitações, grupo cicloalquila (C3-C7), tais como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila, e cicloeptila, e terpenos cíclicos e bicíclicos saturados. Um grupo cicloalquila pode ser não substituído ou substituído por um ou dois substituintes adequados. Em algumas modalidades, o grupo cicloalquila é um anel monocíclico ou anel bicíclico. Da forma aqui usada, o termo “diabetes” e a frase “diabetes tipo II” são usados indiferentemente e incluem, mas sem limitações, diabetes melitus não dependente de insulina, diabetes insipidus, e são relacionados à resistência à insulina (isto é, falta da capacidade do corpo de responder à insulina apropriadamente) e é frequentemente acompanhado por complicações relacionadas incluindo, por exemplo, obesidade e alto colesterol.

Da forma aqui usada, o termo “halogênio” significa flúor, cloro, bromo ou iodo. Desta maneira, o significado dos temos “halo” e “Hal” engloba flúor, cloro, bromo, e iodo.

Da forma aqui usada, o termo “heteroarila” significa um anel aromático monocíclico ou policíclico compreendendo átomos de carbono, 5 átomos de hidrogênio, e um ou mais heteroátomos, tais como 1 a 3 heteroátomos, independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Exemplos ilustrativos de grupos heteroarila incluem, mas sem limitações, piridinila, piridazinila, pirimidila, pirazila, triazinila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, (1,2,3)- e (l,2,4)-triazolila, pirazinila, pirimidinila, 10 tetrazolila, furila, tienila, isoxazolila, tiazolila, furila, fenila, isoxazolila, e oxazolila. Um grupo heteroarila pode ser não substituído ou substituído com um ou dois substituintes adequados. Em algumas modalidades, um grupo heteroarila é um anel monocíclico, em que o anel compreende 2 a 5 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos, aqui referido como “heteroarila (C2-C5).”

Da forma aqui usada, o termo “grupo heterocicloalquila”

significa um anel monocíclico ou policíclico compreendendo átomos de carbono e hidrogênio e pelo menos um heteroátomo, ou 1 a 3 heteroátomos, selecionado de nitrogênio, oxigênio, e enxofre, e sem nenhuma insaturação. Exemplos de grupos heterocicloalquila incluem, mas sem limitações, 20 pirrolidinila, pirrolidino, piperidinila, piperidino, piperazinila, piperazino, morfolinila, morfolino, tiomorfolinila, tiomorfolino, e piranila. Um grupo heterocicloalquila pode ser não substituído ou substituído com um ou dois substituintes adequados. Em algumas modalidades, o grupo heterocicloalquila é um anel monocíclico ou bicíclico, em que o anel compreende de 3 a 6 25 átomos de carbono e de 1 a 3 heteroátomos, aqui referidos como heterocicloalquila (CrC6).

Da forma aqui usada, a frase “radical heterocíclico” ou “anel heterocíclico” significa um grupo heterocicloalquila ou um grupo heteroarila.

Da forma aqui usada, o termo “hidrocarbila” significa um grupo monovalente selecionado de alquila (Ci-C8), alquenila (C2-Cg), e alquinila (C2-C8), opcionalmente substituído com um ou dois substituintes adequados. Em algumas modalidades, a cadeia de hidrocarboneto de um grupo hidrocarbila é de 1 a 6 átomos de carbono de comprimento, aqui 5 referido como “hidrocarbila (Ci-C6)."

Da forma aqui usada, o termo “fenila” significa -C6H5. Um grupo fenila pode ser não substituído ou substituído com um ou dois substituintes adequados. Da forma aqui usada, a frase “pré-diabetes” refere-se a sintomas de diabetes em que o paciente apresenta níveis de glicose 10 elevados, mas o início de ação completo das desordens associado diabetes tipo II ainda não foi manifestada em si.

Da forma aqui usada, a frase “substituinte adequado” significa um grupo que não invalida a utilidade sintética ou farmacêutica dos compostos da invenção ou os intermediários usados para prepará-los. 15 Exemplos de substituintes adequados incluem, mas sem limitações: alquila (Ci-C8); alquenila (Ci-C8); alquinila (Ci-C8); arila (C6); heteroarila (C3-C5); cicloalquila (C3-C7); alcóxi (Ci-C8); arilóxi (C6); -CN; -OH; oxo; halo, -NO2, -CO2H; -NH2; -NH(alquila (CrC8)); -N((alquila CrC8))2; -NH(arila (C6)); N(arila (C6))2; -CHO; -CO(alquila (CrC8)); -CO(arila (C6)); -C02(alquila (Cr 20 C8)); e -C02(arila (C6)). Um versado na tecnologia pode prontamente escolher um substituinte adequado com base na estabilidade e atividade farmacológica e sintética do composto da invenção.

Da forma aqui usada e a menos que de outra forma indicado, a frase “quantidade terapeuticamente efetiva” de uma composição da invenção 25 é medida pela efetividade terapêutica de um composto da invenção, em que pelo menos um efeito adverso de uma desordem é melhorado ou aliviado. Em uma modalidade, a frase “quantidade terapeuticamente efetiva” de uma composição da invenção é medida pela efetividade terapêutica de um composto da invenção para alterar a expressão e/ou atividade de Iyn quinase incluindo, mas sem limitações sobre e sob regulação desta proteína. Surpreendentemente, os inventores observaram que quantidades terapeuticamente efetivas dos compostos da invenção sobre-regulam a expressão e/ou atividade de Iyn quinase.

5 Quando usados nos métodos aqui descritos, os compostos, ou

sal(is) farmaceuticamente aceitável(eis) deste, são usados tanto na forma isolada, forma purificada quanto como uma mistura de compostos. Da forma aqui usada, “isolado” significa que os compostos são separados dos outros componentes tanto de uma fonte natural, tal como uma planta ou célula, 10 preferivelmente cultura bacteriana quanto uma mistura de reação química orgânica sintética por meio de técnicas convencionais. Da forma aqui usada, “purificado” significa que quando isolado, o isolado contém pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de um composto em peso do isolado.

A frase “sal(is) farmaceuticamente aceitável(eis),” da forma

aqui usada inclui, mas sem limitações sais de grupos ácidos ou básicos que podem estar presentes nos compostos usados nos presentes métodos. Compostos incluídos nos presentes métodos que são básicos na natureza são capazes de formar uma ampla variedade de sais com vários ácidos 20 inorgânicos e orgânicos. Os ácidos que podem ser usados para preparar sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos básicos são os que formam sais de adição de ácido não tóxicos, isto é, sais contendo ânions farmacologicamente aceitáveis incluindo, mas sem limitações, ácido sulfurico, cítrico, maleico, acético, oxálico, clorídrico, bromídrico, iodídrico, 25 nitrato, sulfato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, sais de isonicotinato, acetato, lactato, salicilato, citrato, citrato, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato e pamoato (isto é, l,r-metileno-bis-(2-hidróxi-3-naftoato)). Compostos incluídos nos presentes métodos que incluem uma fração amino podem formar sais farmaceuticamente aceitáveis com vários aminoácidos, além dos ácidos mencionados anteriormente. Compostos incluídos nos presentes métodos, que 5 são de natureza ácida são capazes de formar sais de base com vários cátions farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de tais sais incluem sais de metal alcalino ou metal alcalino terroso e, particularmente, sais de cálcio, magnésio, sódio, lítio, zinco, potássio e ferro.

A presente invenção fornece métodos de identificar um 10 ativador de Iyn quinase compreendendo: pré-incubar um composto de teste na presença de Iyn quinase; adicionar ATP e substrato à Iyn quinase e composto de teste; incubar o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato; e medir o nível de fosforilação do substrato, em que um aumento no nível de fosforilação do substrato indica que o composto de teste é um ativador de Iyn 15 quinase.

O composto de teste pode ser qualquer composto que um versado na tecnologia deseja, incluindo qualquer composto descrito aqui. A concentração do composto de teste pode se qualquer concentração desejada e, tipicamente, inclui uma faixa de concentrações a ser testada.

A Iyn quinase pode ser obtida comercialmente de, por

exemplo, Invitrogen ou Millipore, ou pode ser isolada de células como desejado pelos versados na tecnologia. Em algumas modalidades, a concentração da Iyn quinase é de cerca de 10 ng/mL a cerca de 500 ng/mL. Em algumas modalidades, a concentração da Iyn quinase é de cerca de 25 ng/mL a cerca de 300 ng/mL.

Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase de cerca de 5 minutos a cerca de 120 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase de cerca de 30 minutos a cerca de 90 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase de cerca de 45 minutos a cerca de 75 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase por cerca de 60 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase por 20 a 40 minutos.

Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 0°C a cerca de 3 0°C. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 0°C a cerca de 10°C. Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 4°C.

ATP pode ser comercialmente obtido de uma variedade de fabricantes na forma não marcada ou radiomarcada. Em algumas modalidades, a concentração de ATP é de cerca de 5 μΜ a cerca de 25 μΜ. Em algumas modalidades, a concentração de ATP é cerca de 10 μΜ.

Em algumas modalidades, o substrato é uma proteína ou

peptídeo que compreende uma tirosina. Em algumas modalidades, o substrato é um peptídeo FRET sintético compreendendo uma tirosina. Inúmeros peptídeos FRET compreendendo uma tirosina são comercialmente disponíveis. Um exemplo de uma proteína ou peptídeo é poly(Glu,Tyr) e pode 20 ser usado em uma concentração de cerca de 0,05 mg/mL a cerca de 0,25 mg/mL. Em algumas modalidades, a concentração do substrato é cerca de 0,1 mg/mL.

Em algumas modalidades, o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 25 5 minutos a cerca de 90 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 30 minutos a cerca de 75 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 45 minutos a cerca de 60 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente por cerca de 60 minutos. Em algumas modalidades, o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados a temperatura ambiente por cerca de 30 a 50 minutos.

Em algumas modalidades, o nível de fosforilação do substrato compreende medir quantitativa ou qualitativamente o substrato radiomarcado. Assim, um aumento na fosforilação do substrato pode ser observada sem uma medida real da quantidade de fosforilação. Alternativamente, a quantidade de 10 fosforilação também pode ser medida por técnicas padrão conhecidas pelos versados na tecnologia. Em algumas modalidades, a medição do nível de fosforilação do substrato compreende medir quantitativa ou qualitativamente a fluorescência do substrato sintético de peptídeo FRET. A medição da fluorescência emitida por um peptídeo FRET é bem conhecida pelos 15 versados. Em algumas modalidades, a incubação do composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato acontece na presença de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de albumina sérica bovina, de cerca de 0,5 mM a cerca de 2,5 mM de ditiotreitol, de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de albumina sérica bovina e de cerca de 0,5 mM a cerca de 2,5 mM de ditiotreitol, ou de cerca de 0,05% a 20 cerca de 0,25% de β-mercaptoetanol. Em algumas modalidades, a incubação do composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato acontece na presença de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de β-mercaptoetanol. Em algumas modalidades, a incubação do composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato acontece na presença de cerca de 0,1% de β-mercaptoetanol.

Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado

na presença de Iyn quinase de cerca de 5 minutos a cerca de 120 minutos; o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 0°C a cerca de 30°C; e o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 5 minutos a cerca de 90 minutos, na presença de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de βmercaptoetanol.

Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase de cerca de 30 minutos a cerca de 90 minutos; o 5 composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 0°C a cerca de 10°C; e o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 30 minutos a cerca de 75 minutos, na presença de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de βmercaptoetanol.

Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado

na presença de Iyn quinase de cerca de 45 minutos a cerca de 75 minutos; o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 4°C; e o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 45 minutos a cerca de 60 minutos, na presença de cerca de 0,1 % de β-mercaptoetanol.

Em algumas modalidades, o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase por cerca de 60 minutos; o composto de teste é pré-incubado na presença de Iyn quinase a cerca de 4°C; e o composto de teste, Iyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura 20 ambiente por cerca de 60 minutos, na presença de cerca de 0,1% de βmercaptoetanol.

Em algumas modalidades, o composto de teste é um composto

da fórmula II

em que: R1 é um grupo alquila; X é um halogênio; Y é O, S, ou NH; Z é O ou S; n é um número inteiro de 0 a 5 e m é 0 ou 1, em que m + n é menor ou igual a 5. Em algumas modalidades, o grupo alquila é metila e n é I. Em algumas modalidades, o halogênio é cloro e m é I. Em algumas modalidades, Y é O. Em algumas modalidades, Z é O. Em algumas modalidades, R1 é metila, YéO, Zé O, n é 1, e m é 0, Em algumas modalidades, R1 é na posição meta. Em algumas modalidades, X é cloro, Y é O, Z é O, n é 0, e m é 1. Em algumas modalidades, X é na posição meta.

Em algumas modalidades, o composto de teste é CL

ou

A presente invenção também fornece kits compreendendo Iyn quinase, ATP, substrato, e instruções para realizar qualquer um ou mais dos 10 métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, o kit ainda compreende uma câmara de incubação. Câmaras de incubação, tais como placas de microtitulação, tubos de microcentrífiiga, e similares são bem conhecidos pelos versados na tecnologia.

A presente invenção também compreende composições compreendendo um primeiro composto da fórmula I: Rs Re R?

I

em que: cada um de R1, R2, R35 R4, R5, Re, e R7 são independentemente um hidrogênio, alcóxi, alquila, alquenila, alquinila, arila, arilóxi, benzila, cicloalquila, halogênio, heteroarila, heterocicloalquila, -CN, OH, -NO2, -CF3, -CO2H, - alquila CO2, ou -NH2;

R8 é alquila ou hidrogênio;

X é O, S, NH, ou N-alquila; e

Z é O ou S; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste; e um ou mais segundos compostos, ou sal farmaceuticamente aceitável deste, selecionado dos compostos listados na tabela I.

Q

Em algumas modalidades, R é alquila, tal como metila.

Em algumas modalidades, R8 é hidrogênio.

Em algumas modalidades, X é oxigênio.

Em algumas modalidades, Z é oxigênio.

0 fl

Em algumas modalidades, pelo menos um de R -R é alquila,

2 c

tal como metila. Em algumas modalidades, pelo menos um de R -R é halogênio, tal como cloro. Em algumas modalidades, pelo menos um de R -R é -CN. Em algumas modalidades, pelo menos um de R -R é -OH. Em algumas modalidades, pelo menos um de R -R é -NO2. Em algumas

modalidades, pelo menos um de R2-R5 é -CF3. Em algumas modalidades, pelo

2 6

menos um de R -R é -CO2H. Em algumas modalidades, pelo menos um de

Λ / Λ £■

R -R é -NH2. Em algumas modalidades, pelo menos um de R -R é -alcóxi.

Em algumas modalidades, R2 é alquila, tal como metila e cada um de R15 e R3-R8 é hidrogênio e X e Z são O.

Em algumas modalidades, R2 é um halogênio, tal como cloro, e cada um de R1, e R3-R8 é hidrogênio e X e Z são O.

Λ

Em algumas modalidades, R é alquila, tal como metila, e cada um de R1, R2 e R4-R8 é hidrogênio e X e Z são O.

Λ

Em algumas modalidades, R é um halogênio, tal como cloro, e cada um de R1, R2, e R4-R8 é hidrogênio e X e Z são O.

Em algumas modalidades, R4 é alquila, tal como metila, e cada um de R1- R3 e R5-R8 é hidrogênio e X e Z são O.

Em algumas modalidades, R4 é um halogênio, tal como cloro,

e cada um de R1-R3, e R5-R8 é hidrogênio e X e Z são O.

Em algumas modalidades, R5 é -CF3, e cada um de R1-R4 e R6-

O

R é hidrogênio e X e Z são O.

Em algumas modalidades, R5 -ISIH2, e cada um de R1-R4 e R6- R8 é hidrogênio e X e Z são O.

/ _ 1

Em algumas modalidades, R é -CF3, e cada um de R -R e R

R8 é hidrogênio e X e Z são O.

ST __H

Em algumas modalidades, R é -NH2 e cada um de R -R e R R8 é hidrogênio e X e Z são O.

Em algumas modalidades, o primeiro composto é da fórmula

II

em que:

R1 é um grupo alquila; X é um halogênio;

Y é O, S, ou NH; Z é O ou S; e n é um número inteiro de 0 a 5 e m é 0 ou 1, em que m + n é menor ou igual a 5.

Exemplos ilustrativos de compostos que são usados nas composições e métodos aqui descritos incluem, mas sem limitações:

Me

\ /

O

102

:N

Me

V /

•o-U >=0

-NH

V / OII 601

HN

O:

Vo^/ \

-OH

801

iOI

HN

Ο:

N=

901

IO

ZZ :Ν

V

-NH

:Ν

V

Q-^=O

NH

H5N

:Ν

V /

V

-O

*ΝΗ

115

Os compostos podem ser sintetizados por técnicas de química orgânica conhecidas pelos versados na tecnologia, por exemplo, da forma descrita na patente U.S. número 3.922.345, que está aqui incorporado pela referência na íntegra.

Em algumas modalidades da invenção, os compostos da invenção podem ser usados em terapia de combinação com pelo menos um outro agente terapêutico. O composto da invenção e o agente terapêutico podem agir aditiva ou sinergisticamente. Em uma modalidade, uma 10 composição compreendendo um composto da invenção é administrada concorrentemente com a administração de um outro agente terapêutico, que pode ser parte da mesma composição que o composto da invenção ou uma composição diferente. Em uma outra modalidade, uma composição compreendendo um composto da invenção é administrada antes ou 15 subsequente à administração de um outro agente terapêutico. Em uma modalidade, terapia de combinação envolve alternar entre administrar uma composição compreendendo um composto da invenção e uma composição compreendendo um outro agente terapêutico, por exemplo, para minimizar a toxicidade associada a um medicamento particular. A duração da 20 administração de cada medicamento ou agente terapêutico pode ser, por exemplo, um mês, três meses, seis meses ou um ano. Em algumas modalidades, quando uma composição da invenção é administrada concorrentemente com um outro agente terapêutico que potencialmente produz efeitos colaterais adversos incluindo, mas sem limitações, toxicidade, 25 o agente terapêutico pode vantajosamente ser administrado em uma dose que cai abaixo do limiar no qual o efeito adverso é elicitado.

Em uma modalidade, “tratamento” ou “tratar” refere-se a uma melhora da diabetes, ou pelo menos um sintoma discemível deste. Em uma outra modalidade, “tratamento” ou “tratar” refere-se a uma melhora de pelo menos um parâmetro físico mensurável, não necessariamente discemível pelo paciente. Ainda em uma outra modalidade, “tratamento” ou “tratar” refere-se à inibição da progressão da diabetes, tanto fisicamente, por exemplo, estabilização de um sintoma discemível, quanto fisiologicamente, por 5 exemplo, estabilização de um parâmetro físico, ou ambos. Ainda em uma outra modalidade, “tratamento” ou “tratar” refere-se ao atraso do início de ação da diabetes.

Em algumas modalidades, as composições da invenção são administradas a um paciente, preferivelmente um humano, como uma medida 10 preventiva contra diabetes. Da forma aqui usada, “prevenção” ou “prevenir” refere-se a uma redução do risco de adquirir diabetes. Em uma modalidade, as composições da presente invenção são administradas como uma medida preventiva a um paciente, preferivelmente um humano tendo uma predisposição genética a diabetes. Em uma outra modalidade, as composições 15 da invenção são administradas como uma medida preventiva a um sujeito tendo uma predisposição não genética a diabetes.

Da forma aqui usada, “tratamento ou prevenção de diabetes” engloba tratamento ou prevenção de uma complicação associada à diabetes tipo Π incluindo, mas sem limitações, retinopatia (isto é, cegueira); neuropatia 20 (isto é, dano do nervo) que leva a úlceras nos pés, gangrena, e amputações; dano renal, que leva a diálise; e doença cardiovascular. Em algumas modalidades, a diabetes tipo II é associada a atividade e/ou expressão anormal/alterada de quinase lyn.

As composições compreendendo um composto da invenção 25 são, desta forma, usadas no tratamento ou prevenção de diabetes tipo II ou complicações que surgem de diabetes tipo II e desordens e fatores de risco associados à síndrome metabólica. Complicações de diabetes incluem, mas sem limitações, neuropatia diabética, retinopatia diabética, disfunção erétil e doença renal e os compostos da invenção são usados no tratamento ou prevenção destas complicações.

A invenção fornece métodos de tratar e profilaxia por administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição compreendendo um composto da invenção. O paciente é um 5 mamífero, incluindo, mas sem limitações, um animal, tais como vaca, cavalo, ovelha, porco, galinha, peru, codoma, gato, cão, camundongo, rato, coelho, porquinho da índia, etc., e é mais preferivelmente um humano.

As presentes composições, que compreendem um ou mais compostos da invenção, podem ser administradas oralmente. Os compostos da invenção também podem ser administrados por qualquer outra via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção de bolo, por absorção através do revestimento epitelial ou mucocutâneo (por exemplo, mucosa oral, retal e mucosa intestinal, etc.) e podem ser administrados junto com um outro agente biologicamente ativo. A administração pode ser sistêmica ou local. Vários sistemas de distribuição são conhecidos, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc., e podem ser usados para administrar um composto da invenção. Em algumas modalidades, mais de um composto da invenção é administrado a um paciente. Métodos de administração incluem, mas sem limitações, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdérmica, retal, por inalação, ou topicamente, particularmente nos ouvidos, nariz, olhos ou pele. O modo de administração é deixado a critério do médico e dependerá, em parte, do local da condição médica. Na maioria dos exemplos, a administração resultará na liberação dos compostos da invenção na corrente sanguínea.

Em algumas modalidades, pode ser desejável administrar um ou mais compostos da invenção localmente na área em necessidade de tratamento. Isto pode ser alcançado, por exemplo, e não a título de limitação, por infusão local durante cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, em conjunto com um curativo de ferida depois da cirurgia, por injeção, por meio de cateter, por meio de um supositório ou por meio de um implante, o dito implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tal como membranas sialásticas ou fibras. Em uma modalidade, a 5 administração pode ser por injeção direta no sítio (ou sítio formador) de um tecido de placa aterosclerótica.

A administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente aerossolizante, ou por meio de perfusão em um fluorocarboneto ou 10 agente tensoativo pulmonar sintético. Em algumas modalidades, os compostos da invenção podem ser formulados como um supositório, com aglutinantes tradicionais e veículos, tais como triglicerídeos.

Em uma outra modalidade, os compostos da invenção podem ser distribuídos em uma vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer, 15 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, Nova Iorque, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; ver geralmente ibid.).

Ainda em uma outra modalidade, os compostos da invenção 20 podem ser distribuídos em um sistema de liberação controlado. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507 Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321 :574). Em uma outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados (ver Medicai Applications of 25 Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fia. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, Nova Iorque (1984); Ranger e Peppas, 1983, J. Macromol. ScL Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver também Levy et al., 1985, Science 228: 190; Duanel et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105). Ainda em uma outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo dos compostos da invenção, por exemplo, o fígado, requerendo assim somente uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, in 5 Medicai Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Outros sistemas de liberação controlada discutidos na revisão por Langer, 1990, Science 249: 1527-1533) podem ser usados.

As presentes composições conterão uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto da invenção, opcionalmente mais de um composto da invenção, adequadamente na forma purificada, junto com uma quantidade adequada de um veículo farmaceuticamente aceitável de maneira a fornecer a forma para administração apropriada ao paciente.

Em algumas modalidades, a frase “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência regulatória Federal ou do governo do estado ou listado na farmacopéia U.S. ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em humanos. O termo “veículo” refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou carreador com os quais um composto da invenção é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos, tais como água e óleos, incluindo os de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de rícino e similares. Os veículos farmacêuticos podem ser salina, goma acácia, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, sílica coloidal, uréia, e similares. Além do mais, agentes auxiliares, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e corantes podem ser usados. Quando administrados a um paciente, os compostos da invenção e veículos

r

farmaceuticamente aceitáveis são preferivelmente estéreis. Agua é um veículo adequado quando o composto da invenção é administrado intravenosamente. Soluções de salina e dextrose aquosa e soluções de glicerol também podem ser empregados como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Veículos farmaceuticamente adequados também incluem excipientes, tais como amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha de trigo, carvão, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno 5 glicol, água, etanol e similares. As presentes composições, se desejado, também podem conter quantidades menores de agentes umectantes e emulsificantes ou agentes de tamponamento de pH.

As presentes composições podem ter a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, pelotas, cápsulas, cápsulas 10 contendo líquidos, pós, formulações de liberação prolongada, supositórios, emulsões, aerossóis, jatos, suspensões, ou qualquer outra forma adequada para uso. Em uma modalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável é uma cápsula (ver, por exemplo, patente U.S. No. 5.698.155). Outros exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são descritos em Remington's 15 Pharmaceutical Sciences, A.R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Co.

Em uma modalidade, os compostos da invenção são formulados de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, compostos da invenção para administração intravenosa são 20 soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, as composições também podem incluir um agente solubilizante. Composições para administração intravenosa podem opcionalmente incluir um anestésico local, tal como lidocaina para melhorar a dor no local da injeção. No geral, os ingredientes são fornecidos tanto separadamente quanto misturados juntos em 25 forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado sem água em um recipiente fechado hermeticamente, tal como uma ampola ou sache que indica a quantidade de agente ativo. Onde o composto da invenção é para ser administrado por infusão, ele pode ser dispensado, por exemplo, com uma garrafa de infusão contendo água ou salina de grau farmacêutico estéril. Onde o composto da invenção é administrado por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou salina pode ser fornecida de maneira que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

As composições da invenção podem ser administradas

oralmente. Composições para distribuição oral podem ser na forma de comprimidos, comprimidos em forma de losango, suspensões aquosas ou oleosas, grânulos, pós, emulsões, cápsulas, xaropes ou elixires, por exemplo. Composições administradas oralmente podem conter um ou mais agentes 10 opcionais, por exemplo, agentes adoçantes, tais como frutose, aspartame ou sacarina; agentes flavorizantes, tais como hortelã-pimenta, óleo de gualtéria, ou cereja; agentes corantes; e agentes conservantes, para fornecer uma preparação farmaceuticamente agradável. Além disso, na forma de comprimido ou pílula, as composições podem ser revestidas para atrasar a 15 desintegração e absorção no trato gastrintestinal, fornecendo assim uma ação prolongada por um maior período de tempo. Membranas seletivamente permeáveis que rodeiam um composto ativo osmoticamente acionado também são adequadas para compostos da invenção oralmente administrados. Nestas últimas plataformas, fluido do ambiente que rodeia a cápsula é embebido pelo 20 composto guia, que intumesce para deslocar o agente ou composição do agente através de uma abertura. Estas plataformas de distribuição podem fornecer um perfil de ordem essencialmente zero oposto aos perfis espetados de formulações de liberação imediata. Um material de atraso de tempo, tais como monoestearato de glicerol ou estearato de glicerol também pode ser 25 usado. Composições orais podem incluir veículos padrão, tais como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Tais veículos são adequadamente de grau farmacêutico.

A quantidade de um composto da invenção que será efetiva no tratamento de uma desordem ou condição particular aqui descrita dependerá da natureza da desordem ou condição, e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além do mais, ensaios in vitro ou in vivo podem opcionalmente ser empregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ideais. A dose precisa a ser empregada nas composições também dependerão 5 da via de administração, e da seriedade da doença ou desordem, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e cada circunstância do paciente. Entretanto, faixas de dosagem adequadas para administração oral são geralmente cerca de 0,001 miligrama a 200 miligramas de um composto da invenção por kilograma de peso corporal. Em algumas modalidades, a dose 10 oral é 0,01 miligrama a 70 miligramas por kilograma de peso corporal, ou 0,1 miligrama a 50 miligramas por kilograma de peso corporal, ou 0,5 miligrama a 20 miligramas por kilograma de peso corporal, ou 1 miligrama a 10 miligramas por kilograma de peso corporal. Em algumas modalidades, a dose oral é 5 miligramas de um composto da invenção por kilograma de peso 15 corporal. As quantidades de dosagem aqui descritas referem-se às quantidades totais administrada; isto é, se mais que um composto da invenção for administrado, as dosagens correspondem à quantidade total dos compostos da invenção administrados. Composições orais preferivelmente contêm 10% a 95% de ingrediente ativo em peso.

Faixas de dosagem adequadas para administração intravenosa

(i.v.) são 0,01 miligrama a 100 miligramas por kilograma de peso corporal, 0,1 miligrama a 35 miligramas por kilograma de peso corporal, e 1 miligrama a 10 miligramas por kilograma de peso corporal. Faixas de dosagem adequadas para administração intranasal são, no geral, cerca de 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Supositórios geralmente contêm

0,01 miligrama a 50 miligramas de um composto da invenção por kilograma de peso corporal e compreendem ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10% em peso. Dosagens recomendadas para administração intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, epidural, sublingual, intracerebral, intravaginal, transdérmica ou administração por inalação são na faixa de

0,001 miligrama a 200 miligramas por kilograma de peso corporal. Doses adequadas dos compostos da invenção para administração tópica são na faixa de 0,001 miligrama a 1 miligrama, dependendo da área na qual o composto é 5 administrado. Doses efetivas podem ser extrapoladas das curvas de doseresposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou de modelo animal. Tais modelos e sistemas animais são bem conhecidos na tecnologia.

A tabela a seguir descreve alvos de medicamento para diabetes tipo II com medicamentos representativos (aprovados para uso), medicamentos em estágio de desenvolvimento ou compostos pré-clínicos para o alvo, qualquer um ou mais dos quais podem ser usados em combinação com qualquer um ou mais dos compostos da presente invenção.

Tabela I

Nome do medicamento ou Número de CAS MECANISMO composto 859721-77-0 inibidor tipo 1 da 11-betahidroxiesteróide desidrogenase LG-101506 331248-11-4 modulador de RXR retinóide melhorador da expressão de ABCAl 232252-56-1 antagonista de adenosina A2B Acarbose 056180-94-0 inibidores de alfa-glicosidase A-769662 844499-71-4 ativador de AMP ativado por proteína quinase (AMPK) NVP-DPP-728, sitagliptina 207556-62-5 inibidor de DPP-IV MB-05032 261365-11-1 inibidor de frutose-1,6- bisfosfatase 886451-10-1 agonista GPR4O do receptor acoplado à proteína G 882509-86-6 antagonista GPR4O do receptor acoplado à proteína G GLP-I ou fragmento de antagonista do receptor GLP-I GLP-I BAY-27-9955 202855-56-9 antagonista de glucagon LY-2121260 731018-97-6 ativador de glicoquinase 260545-12-8 inibidor de glicose-6-fosfatase BAY-R-3401 100276-03-7 inibidor de glicogênio fosforilase 890050-91-6 ativador de glicogênio sintase SB-216763 280744-09-4 inibidor de GSK-3 leporina B 175883-72-4 melhorador da expressão de HK2 Nome do medicamento ou Número de CAS MECANISMO composto TER-16998 sensibilizador de insulina CRx-401 sensibilizador de insulina benzafibrato/diflunisal 325979-95-1 ativador de IRK tolbutamida 000064-77-7 bloqueadores do canal de K(ATP) 748166-36-1 antagonista do receptor do hormônio MCH que concentra melanina agonista MC4 de melanocortina SB-334867-A antagonista de orexina OX-I 748147-23-1 inibidor de fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) agonista PPAR gama agonista PPAR alfa rosiglitazona 155141-29-0 agonista PPAR gama 737805-90-2 agonista parcial PPAR gama lutidinato de dietila 041438-38-4 inibidor de prolil 4-hidroxilase 251475-05-5 inibidor de PTP Ib sergliflozina inibidores de SGLT-2 916338-41-5 antagonista de somatostatina SRIFlB (sst5) 916888-66-9 inibidor de estearoil-CoA desnaturase 811811-95-7 inibidor de triacilglicerol lipase metformina 001115-70-4 desconhecido DecbSM 148565-56-4 desconhecido NNC-57-0511 desconhecido A presente invenção também diz respeito ao uso das

composições aqui descritas para o tratamento de diabetes. A presente invenção também diz respeito ao uso dos compostos e/ou composições aqui descritos na preparação de um medicamento para uso no tratamento de diabetes. De maneira que a invenção aqui descrita possa ser mais eficientemente entendida são fornecidos exemplos a seguir. Deve-se entender que estes exemplos são para propósitos ilustrativos somente e não devem ser considerados como limitantes da invenção de nenhuma maneira.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Seletividade de Lyn Quinase

Uma seleção de quinase foi conduzida em que o composto 102 (10 μΜ) foi selecionado contra 49 quinases para inibição ou ativação. Qualquer quinase que foi ativada ou inibida em pelo menos 20% foi considerada como um efeito significativo. Das 49 quinases selecionadas, Lyn quinase foi ativada em 51%. Em um experimento repetido, atividade quinase 5 Iyn foi aumentada em 57%. Das outras quinases testadas, atividade do receptor do fator de crescimento tipo insulina foi inibida em 20,1%, e p70S6K foi inibida em 24,3%.

QUINASE ATIVIDADE DO COMPOSTO 102 (% DE ATIVIDADE QUINASE) AMPK -0,95 Abl -4,04 Aktl 1,51 Akt2 -6,83 AurA -12,21 BTK 10 CDK2/ciclinaA -3,93 CHKl 0,87 CHK2 -6,17 CKld -1,5 CaMK2a 0,08 CaMK4 17,35 EphA2 1,03 FGFR3 -1,58 Flt3 7,34 Fyn -4,64 GSK3b 2,47 IGFlR -20,18 IKKb -6,26 IRAK4 2,25 InsR 16,92 JNK2 -4,8 KDR (FLK1 , VEGFR2) 0 Lck 6,28 Lyn 51,05 Lyn (repetido) 57,11 Lyn 57 MAPKl 0,6 MAPKl4 (P38) 1,74 MAPK3 (p38) -6,05 MAPKAP2 -13,04 MAPKAP 5 0,79 MET 9,88 MSKl 1,55 MST2 4,59 QUINASE ATIVIDADE DO COMPOSTO 102 (% DE ATIVIDADE QUINASE) PAK2 1,55 PDKl -2,63 PKA -0,3 PKCb2 -1,12 PKCz 9,05 PKD2 -10,34 Pim2 -8,06 ROCK2 -3,05 RSKl 1,72 SGKl -19,24 Src 4,56 Syc 11,12 CKit 18,79 CRAF 5,08 Exemplo 2: Otimização da atividade de Lyn quinase e cinéticas de ATP

Depois da identificação da ativação de Iyn quinase, estudos foram repetidos para otimizar as condições da ativação de Lyn quinase mediada pelo composto 102. Os seguintes estudos foram conduzidos: 1) 5 otimizar as condições de pré-incubação para maximizar ativação mediada pelo composto 102 de Lyn; e 2) teste para determinar as cinéticas da enzima que mede iam a ativação do composto 102 de Lyn.

Condições de pré-incubação ideais

No experimento, a quinase Lyn (h) foi pré-incubada com DMSO ou 1,3, 10, 30, e 100 μΜ do composto 102 por 30 minutos no gelo. A quinase foi então diluída para uma concentração que dá cinéticas lineares e ensaiada em um ensaio radiométrico padrão a 10 μΜ de ATP por 40 minutos a temperatura ambiente.

Neste experimento, a atividade de Lyn quinase (h) aumentou com a concentração de composto 102 de uma maneira dependente da dose. A 100 μΜ do composto 102, a atividade de Lyn quinase (h) foi mais que 3 vezes maior que a atividade medida no controle de DMSO. O EC5O para a ativação do composto 102 de Lyn quinase foi 650 nM.

Estudo da cinética de ATP O estudo da cinética foi projetado usando a pré-incubação e condições experimentais estabelecidas anteriormente. Neste estudo, a concentração do composto 102 foi mantida constante a 100 μΜ e a concentração de ATP aumentou em etapas de 0 a 800 μΜ. Parâmetros cinéticos para ATP foram calculados usando análise de regressão não linear e 5 a equação: Y= Vmax(x)/(Km+x). Vmax — a atividade da enzima e Km = a concentração de ATP necessária para atividade meio máxima. Nestas condições, o composto 102 aumentou o Vmax de Lyn quinase em 3 vezes, mas não alterou o Km para ATP. Assim, parece que o composto 102 aumenta Lyn quinase de uma maneira dependente do ATP.

Exemplo 3: Seleção para ativação de Lyn

Uma seleção de alto rendimento de ativação de Lyn quinase é atualmente estabelecida usando condições estabelecidas nos ensaios de otimização descritos no exemplo 2. Este ensaio será usado para identificar novos ativadores de Lyn quinase. Estas condições estão apresentadas aqui: 1) 15 pré-incubação do composto de teste na presença de Lyn quinase por 30 minutos a 4°C; 2) ensaio iniciado pela adição de ATP e substrato; 3) incubação da temperatura ambiente por cerca de 40 minutos; e 4) medição do nível de fosforilação do substrato.

Exemplo 4: Ativação de quinase In Vivo

I

Camundongos macho CDl de 8 semanas de idade foram

usados para estes estudos. Camundongos foram mantidos com livre acesso ao alimento e água e mantidos em um ciclo de 12 horas de luz/escuro.

Camundongos foram jejuados por 18 horas e a glicose sanguínea de linha de base medida. Sessenta minutos depois dos níveis de glicose de linha de base, camundongos foram dosados com veículo, 30 ou 100 mg/kg do composto 102. Fígados foram dissecados 75 minutos depois da administração do medicamento.

Fígados foram homogeneizados usando um batedor de conta e contas de vidro de 1,0 mm em 0,75 mL de tampão de Iise (50 mM de TrisHCl, 1% de NP-40, 0,25% de Na-deoxicolato, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, I mM de PMSF, 1 μ^οιί. de Aprotinina, 1 μ^ιπΐ, de Leupeptina, 1 mM de Na3V04, I mM de NaF, 10% de Glicerol, pH 7,4). Homogenatos de tecido foram centrifugados e o sobrenadante testado para níveis de fosfr-IRS1 (ver a seguir).

Proteínas alvejadas fosfo-tirosina foram imunoprecipitados usando um anticorpo fosfo-tirosina monoclonal e proteína Sepharose A. Proteínas imunoprecipitadas foram separadas usando um sistema de eletroforese PAGE (Invitrogen; NuPage system). Proteínas foram transferidas 10 para membranas PVDF. IRS-I fosforilado foi detectado nas membranas PVDF usando um anticorpo policlonal de coelho pan-IRS-1, quimioluminescência HRP secundária (Upstate).

Exemplo 5: Otimização do ensaio de ativação de Lyn quinase

O seguinte exemplo foi conduzido para adicionalmente 15 otimizar condições de ensaio para detectar a ativação mediada pelo composto 102 de Lyn quinase. Os ensaios descritos a seguir utilizam o Z1-LYTEtm Quinase Assay Kit-Tyr Peptide (Invitrogen, Carlsbad, CA). Estes sistemas de ensaio foram originalmente desenvolvidos para detectar inibidores de várias tirosinas quinases. As modificações que foram adicionadas ao sistema 20 otimizam as condições para detectar ativadores de lyn quinase. Especificamente, as concentrações de proteína de Lyn quinase ideais, componentes tampão e condições de ensaio para detectar a ativação mediada pelo composto 102 de Lyn quinase são aqui descritas.

O sistema de ensaio usado foi um ensaio não radiométrico que 25 utiliza o Z'-LYTE™ Kinase Assay Kit-Tyr Peptide-2 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para detectar a atividade de Lyn quinase. Componentes de tampão foram alterados da maneira descrita a seguir. A proteína lyn quinase usada nestes estudos foi a forma não fosforilada da proteína. Concentrações desta proteína lyn não fosforilada variou de 25 ng/mL a 300 ng/mL. A etapa de préincubação durou de 30 minutos a 60 minutos.

O tampão de reação Invitrogen foi usado para todos os estudos. As seguintes adições foram feitas a este tampão de reação e testadas separadamente e comparadas ao tampão de reação sozinho: Modificação 1 : Tampão de reação com 0,1% de BSA; Modificação 2: Tampão de reação com

1 mM de ditiotreitol; Modificação 3: Tampão de reação com 0,01% de BSA,

1 mM de ditiotreitol; e Modificação 4: Tampão de reação com 0,1% de βmercaptoetanol.

A tabela II descreve os diferentes níveis de ativação com os diferentes componentes de tampão.

Tabela II: Ativação mediada pelo composto 102 de Lyn quinase

Tampão DMSO (controle);% Composto 102 (30 Vezes de de fosforilação do μΜ);% de fosforilação ativação substrato do substrato Tampão de reação 10,4 16,2 1,6 Modificação 30,8 33,6 1,1 Modificação 67,1 80,9 1,2 Modificação 51,7 83,4 1,6 Modificação 13,7 33,3 2,4 A modificação do tampão 4 produziu as condições de ativação

ideais para Lyn quinase. A adição de 0,1% de β-mercaptoetanol ao tampão de reação (modificação 4) resultou em um baixo nível de linha de base (13,7% de fosforilação do substrato) e com adição do composto 102, uma ativação de 2,4 vezes de Lyn quinase. O tampão de modificação 4 produziu ativação significativamente melhor que as modificações 1, 2 e 3.

Estes estudos descrevem as condições ideais, consistentes para detectar ativação mediada pelo composto 102 de Lyn quinase. Estas 20 condições ideais são como se segue: 1) utilização do Z'-LYTE™ Quinase Assay Kit-Tyr Peptide-2 (Invitrogen, Carlsbad, CA); 2) utilização da proteína lyn quinase não fosforilada em concentrações que variam de 25 ng/mL a 300 ng/mL; 3) tampão de reação padrão de Invitrogen que é suplementado com

0,1% de β-mercaptoetanol; e 4) aumento da etapa de pré-incubação de 30 a 60 minutos na ausência de ATP. Exemplo 6: Terapias de combinação

Com base nos dados preliminares, o composto 102 será usado no tratamento em combinação com agentes diabéticos tipo II já existentes. Animais foram tratados separadamente e em combinação em doses não 5 efetivas. Independentemente, medicamentos não afetam níveis de glicose sanguínea em um teste de tolerância à glicose oral. Em combinação, medicamentos significativamente diminuíram níveis de glicose sanguíneos. Além do mais, estudos que estão em andamento incluem o composto 102 em combinação com um sulfoniluréia (glibenclamida) e composto 102 em 10 combinação com rosiglitazona em camundongos db/db.

Camundongos macho CDl foram jejuados por 18 horas. Depois do jejum, animais foram tratados com medicamento nas doses

indicadas (ver tabelas a seguir).

TEMPO EVENTO - 18 horas Jei um 0 medição de glicose + 60 administração de medicamento + 75 desafio de glicose + 135 medição de glicose Tratamento N veículo controle 6 metformina (200 mg/kg) 6 composto 102 (30 mg/kg) 6 metformina (200 mg/kg) 6 composto 102 (30 mg/kg) nenhuma glicose/nenhum medicamento 4 A sinergia do composto com metformina é demonstrada na

figura 1.

Várias modificações da invenção, além das aqui descritas, ficarão evidentes para os versados na tecnologia da descrição anterior. Tais modificações também se destinam a cair no escopo das reivindicações em anexo. Cada referência (incluindo, mas sem limitações, artigos de jornal, 20 patentes U.S. e não U.S., publicações de pedido de patente, publicações de pedido de patente internacional e similares) citada no presente pedido de patente é aqui incorporada pela referência na íntegra. U.S. No. de série 60/890.632 depositado em 20 de fevereiro de 2007 está aqui incorporada pela referência na íntegra.

Claims

1. Método para identificar um ativador de lyn quinase, caracterizado pelo fato de que compreende: pré-incubar um composto de teste na presença de lyn quinase; adicionar ATP e substrato à lyn quinase e composto de teste; incubar o composto de teste, lyn quinase, ATP, e substrato; e medir o nível de fosforilação do substrato, em que um aumento no nível de fosforilação do substrato indica que o composto de teste é um ativador de lyn quinase.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é pré-incubado na presença de lyn quinase de cerca de 5 minutos a cerca de 120 minutos, de cerca de 30 minutos a cerca de90 minutos, de cerca de 45 minutos a cerca de 75 minutos, ou cerca de 60 minutos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é pré-incubado na presença de lyn quinase a cerca de 0°C a cerca de 30°C, a cerca de 0°C a cerca de 10°C, ou a cerca de 4°C.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a3, caracterizado pelo fato de que a concentração da lyn quinase é de cerca de10 ng/mL a cerca de 500 ng/mL ou de cerca de 25 ng/mL a cerca de 300 ng/mL.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a4, caracterizado pelo fato de que a concentração de ATP é de cerca de 5 μΜ a cerca de 25 μΜ, ou cerca de 10 μΜ, e que o ATP é radiomarcado.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a5, caracterizado pelo fato de que o substrato é uma proteína ou peptídeo que compreende uma tirosina.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a . 6, caracterizado pelo fato de que o substrato é um peptídeo FRET sintético compreendendo uma tirosina.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o composto de teste, lyn quinase, ATP, e substrato são incubados em tomo da temperatura ambiente de cerca de 5 minutos a cerca de 90 minutos, de cerca de 30 minutos a cerca de 75 minutos, de cerca de 45 minutos a cerca de 60 minutos, ou por cerca de 60 minutos.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a medição do nível de fosforilação do substrato compreende medir quantitativa ou qualitativamente o substrato radiomarcado ou a fluorescência do substrato sintético de peptídeo FRET.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a incubação do composto de teste, lyn quinase, ATP, e substrato acontece na presença de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de albumina sérica bovina, de cerca de 0,5 mM a cerca de 2,5 mM de ditiotreitol, de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de albumina sérica bovina e de cerca de 0,5 mM a cerca de 2,5 mM de ditiotreitol, ou de cerca de 0,05% a cerca de 0,25% de β-mercaptoetanol ou cerca de 0,1% de β-mercaptoetanol.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é um composto da fórmula II: <formula>formula see original document page 43</formula> em que: R1 é um grupo alquila; X é um halogênio; Y é O, S, ou NH; Z é O ou S; n é um número inteiro de 0 a 5 e m é 0 ou 1, em que m + n é menor ou igual a 5.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o grupo alquila é metila e n é 1, e que o halogênio é cloro e m é 1, e que Y é O, e que Z é O, e/ou e que R1 está na posição meta.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o composto de teste é <formula>formula see original document page 44</formula>

14. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende lyn quinase, ATP, substrato, e instruções para realizar o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

15. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro composto da fórmula II: <formula>formula see original document page 44</formula> em que cada um de R15 R25 R3, R45 R5, Re, e R7 são independentemente um hidrogênio, alcóxi, alquila, alquenila, alquinila, arila, arilóxi, benzila, cicloalquila, halogênio, heteroarila, heterocicloalquila, -CN, OH, -NO2, -CF3, -CO2H, -C02alquila, ou -NH2; R8 é alquila ou hidrogênio; X é O, S, NH, ou N-alquila; e Z é O ou S; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste; e um ou mais de segundo composto, ou sal farmaceuticamente aceitável deste, selecionado dos compostos listados na tabela I.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o primeiro composto é da fórmula II <formula>formula see original document page 45</formula> em que: R1 é um grupo alquila; X é um halogênio; Y é O, S, ou NH; Z é O ou S; e n é um número inteiro de O to 5 e m é O ou 1, em que m + n é menor ou igual a 5.

17. Uso de uma composição como definida na reivindicação 15 ou reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser para tratar diabetes.

18. Uso de uma composição como definida na reivindicação 15 ou reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar diabetes.