KR20010030805A

KR20010030805A - 비정상 지혈증 장애 치료용 아포리포단백질 ａ-ｉ 작용제

Info

Publication number: KR20010030805A
Application number: KR1020007003405A
Authority: KR
Inventors: 잔-루이스 다세욱스; 레나트 세퀼; 클라우스 버트너; 이사벨 코넛; 귄터 메츠
Original assignee: 잔-루이스 다세욱스; 레나트 세퀼; 클라우스 버트너; 이사벨 코넛; 귄터 메츠
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2001-04-16
Also published as: NZ503719A; DE69837855D1; DE69837855T2; JP2003525840A; NO20001600D0; ATE363287T1; US20030008827A1; EP1019010A1; HUP0003280A1; KR100650974B1; PL362598A1; HK1044898A1; AU9779198A; US6265377B1; UA71554C2; EP1019010A4; US6734169B2; EP1019010B1; ES2288768T3; US20080058270A1

Abstract

본 발명은 사람 ApoA-I의 구조적, 약리학적 성질을 모방하는 펩티드 또는 펩티드 유사체를 제공한다. 상기 펩티드 또는 펩티드 유사체는 지혈증이상과 관련된 다양한 질환의 치료에 유용하다.

Description

비정상 지혈증 장애 치료용 아포리포단백질 Ａ-Ｉ 작용제{Apolipoprotein A-I Agonists and their use to treat dyslipidemic disorders}

순환 콜레스테롤은 혈액에서 지질을 운반하는 지질 및 단백질 복합조성물 입자인 혈장 리포단백질에 의해 운반된다. 저밀도 리포단백질(LDL)과 고밀도 리포단백질(HDL)은 주요한 콜레스테롤 캐리어이다. LDL은 콜레스테롤(합성되거나 음식물에서 수득되는)을 간에서 신체의 간외의 조직으로 운반한다. "역 콜레스테롤 운반"은 간외의 조직으로 부터 간으로 콜레스테롤을 운반하는 것을 의미하며, 간에서 대사 및 제거된다. 혈장 HDL 입자는 역운반 과정에서 중요한 역할을 하며 조직 콜레스테롤 제거제로서 작용한다.

상승된 혈청 콜레스테롤과 관상 심장 질병을 관련시키는 증거는 많다. 예컨대 아테롬성 경화증은 동맥벽내에 콜레스테롤이 축적됨으로써 생긴 느리게 진행되는 질병이다. 아테롬성 경화성 장애시 침전된 지질은 혈장 LDL로 부터 주로 유도된다. 따라서 LDL은 "나쁜" 콜레스테롤로 알려져 왔다. 대조적으로 HDL 혈청 수준은 관상 심장 질병과 반비례한다. 사실상 고 혈청 HLDL 수준은 위험인자가 아닌 것으로 간주된다. 고수준의 혈장 HDL은 관상 동맥 질병을 방어할 뿐만 아니라 아테롬성 경화성 플라크 퇴행을 유도할 수 있다(Badimon et al., 1992, Circulation 86 (Suppl. III):86-94). 따라서 HDL은 "좋은" 콜레스텔로서 알려져 왔다.

2.1. 콜레스테롤 운반

지방 운송 시스템은 두 가지 경로로 분할될 수 있다.: 장에서 흡수된 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 경우에 외인성 경로, 간과 기타 간외의 조직으로 부터 혈류에 들어가는 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 경우에 내인성 경로.

외인성 경로에서 음식물 지방은 유미지립이라 불리는 리포단백질 입자에 쌓여서 혈류에 들어가고 트리글리세리드를 지방성 조직(저장시)과 근육(에너지 제공을 위한 산화시)에 전달한다. 콜레스테릴 에스테르를 포함하는 유미지립의 나머지는 간세포상에서만 발견되는 특이성 수용체에 의해 순환으로 부터 제거된다. 이러한 콜레스테롤은 나중에 세포대사에 이용되거나 혈장 리포단백질로서 간외의 조직에 재순환된다.

내인성 경로에서 간은 큰 극저밀도 리포단백질 입자(VLDL)을 혈류에 분비한다. VLDL의 핵은 간에서 합성된 트리글리세리드 주성분과 소량의 콜레스테릴 에스테르(간에서 합성되거나 유미지립으로 부터 재순환된)으로 구성된다. 두 가지 주 단백질, 아포단백질 B-100과 아포단백질 E가 VLDL 표면에 나타난다. VLDL이 아디포스 단백질 또는 근육의 모세관에 도달할 때 트리글리세리드가 추출되어서 크기가 감소되고 콜레스테릴 에스테르가 농후하지만 중밀도 리포단백질(IDL)이라 불리는 두가지 아포단백질이 유지된 새로운 종류의 입자가 된다.

인체에서 약 절반의 IDL 입자는 콜레스테롤을 추출하는 간세포에 단단히 결합되어서 새로운 VLDL과 담즙산을 형성하므로 빠르게(형성 2 내지 6시간 이내에) 순환으로 부터 제거된다. 간에 의해 포획되지 않은 IDL 입자는 더 오래 순환된다. 아포단백질 E는 순환 입자로 부터 해리되어서 이들을 유일한 단백질로서 아포단백질 B-100을 갖는 LDL로 전환시킨다.

간은 대부분의 콜레스테롤을 포착하여 콜레스테롤 대사의 최종 생성물인 담즙산으로 분해한다. 콜레스테롤 함유 입자의 포획은 고농도로 헤파토사이트에 존재하는 LDL 수용체에 의해 중재된다. LDL 수용체는 아포단백질 E 및 아포단백질 B-100와 결합하여 순환하는 IDL 및 LDL과 결합하여 제거한다. 그러나 LDL 수용체에 대한 아포단백질 E의 친화력은 아포단백질 B-100의 경우보다 크다. 결과적으로 LDL 입자는 IDL 입자보다 긴 순환수명을 가진다. LDL은 간과 기타 조직에서 LDL 수용체에 결합되기전 평균 2.5일간 순환한다. 혈청의 고 LDL 수준("나쁜" 콜레스테롤)은 관상 심장 질병과 관련있다. 예컨대 아테롬성 경화증에서 순환 LDL로 부터 유도된 콜레스테롤은 동맥벽에 축적되어 매듭이 형성되어 동맥을 차단하여 심장병 또는 발작을 초래할 때까지 혈액 흐름을 방해하는 커다란 플라크 형성을 가져온다.

궁극적으로 LDL로 부터 발생된 세포간 콜레스테롤의 양은 세포 콜레스테롤 대사를 조절한다. VLDL 및 LDL로 부터 유도된 세포 콜레스테롤의 축적은 3가지 과정을 조절한다: 첫째, 콜레스테롤 생합성 경로에서 핵심 효소인 HMGCoA 환원효소의 합성을 차단함으로써 세포 콜레스테롤 합성을 감소시킨다. 둘째, 유입된 LDL 유도 콜레스테롤은 저장 소적에 저장되는 콜레스테릴 에스테르로 콜레스테롤을 전환시키는 세포 효소인 ACAT를 활성화시킴으로써 콜레스테롤의 저장을 축적시킨다. 셋째, 세포내 콜레스테롤의 축적은 새로운 LDL 수용체의 세포합성을 방해하는 피이드백 메카니즘을 추진시킨다. 그러므로 세포는 LDL 수용체에 대한 상보성을 조절하여서 과다함이 없이 대사요구를 충족시키도록 충분한 콜레스테롤이 들어오게 한다(Brown ＆ Goldstein, In, The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8th Ed., Goodman ＆ Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, Ch. 36, pp. 874-896).

2.2. 역 콜레스테롤 운반

주변(간외의) 세포는 국지적 합성을 통해 콜레스테롤을 수득하며 VLDL 및 LDL로 부터 예비형성된 스테롤을 취해 콜레스테롤을 획득한다. 대조적으로 역 콜레스테롤 운반(RCT)은 담즙산으로 변성 또는 산화된 형태로 장에 분비되거나 간외 조직으로 재순환하기 위해 주변 세포 콜레스테롤이 간으로 복귀될 수 있는 경로이다. RCT 경로는 대개의 간외조직으로 부터 콜레스테롤을 제거하는 유일한 수단이며 신체에서 대개의 세포의 기능 및 구조를 유지하는데 중요하다.

RCT는 3가지 경로로 주로 구성된다: (a) 주변세포의 다양한 풀(pool)로 부터 콜레스테롤을 초기에 제거하는 콜레스테롤 유출; (b) 유출된 콜레스테롤이 세포에 다시 들어오는 것을 방지하기 위해 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼아제(LCAT)의 작용에 의한 콜레스테롤 에스테르화; (c) HDL 콜레스테릴 에스테르를 간세포에 전달. RCT 경로는 HDL에 의해 매개된다. HDL은 고밀도를 특징으로 하는 리포단백질 입자의 일반명이다. HDL 복합체의 주요 지질성분은 다양한 인지질, 콜레스테롤(에스테르) 및 트리글리세리드이다. 가장 우세한 아포리포단백질 성분은 HDL의 기능을 결정하는 A-I 및 A-II 이다; 또한 소량의 아포리포단백질 C-I, C-II, C-III, D, E, J 등이 관찰된다. HDL은 RCT 대사동안 재모델링 상태에 따라 위에서 언급된 성분의 다양한 혼합물 및 다양한 크기로 존재할 수 있다.

RCT 경로에 관련된 핵심 효소는 LCAT이다. LCAT는 간에서 주로 생성되며 HDL 부분과 조합된 혈장에서 순환한다. LCAT는 세포유도 콜레스테롤을 콜레스테릴 에스테르로 전환하고, 이것은 제거를 위해 HDL에 격리된다. 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(CDTP)와 인지질 전달 단백질(PLTP)는 순환 HDL 분포 재모델링에 기여한다. CETP는 LCAT에 의해 형성된 콜레스테릴 에스테르를 다른 리포단백질, VLDL 및 LDL과 같은 ApoB 함유 리포단백질에 이동시킬 수 있다. HDL 트리글리세리드는 세포간 간 트리글리세리드 리파아제에 의해 동화될 수 있으며 리포단백질 콜레스테롤은 여러 가지 메카니즘을 통해 간에 의해 제거된다.

각 HDL 입자는 하나 이상(보통 2 내지 4개)의 ApoA-I을 포함할 수 있다. ApoA-I은 간과 소장에 의해 빠르게 절단되어 243 아미노산 잔기를 가지는 성숙한 폴리펩티드를 발생시키는 프로단백질로 분비되는 예비 프로아포리포단백질로서 합성된다. ApoA-I은 종종 프롤린인 링커에 의해 연결된 6 내지 8개의 상이한 22 아미노산 반복으로 구성되며 여러개의 잔기로 구성된 스트레치로 구성될 수 있다. ApoA-I은 지질과 3가지 종류의 안정한 복합체를 형성한다: 프리-베타-1 HDL이라 칭하는 작은 지질 빈약 복합체; 프리-베타-2 HDL이라 칭하는 극성 지질(인지질 및 콜레스테롤) 함유 평탄한 원판형 입자; 구형 또는 성숙한 HDL(HDL₃및 HDL₂)라 칭하는 극성 및 비극성 지질함유 구형입자. 순환 분포에서 대부분의 HDL은 ApoA-I 및 ApoA-II (두 번째 주요한 HDL 단백질)을 함유하며 HDL의 AI/AII-HDL 부분이라 칭한다. 그러나 ApoA-I 만을 함유한 HDL 부분(AI-HDL 부분)이 RCT에 더 효과적이다. 전염병 연구는 AI-HDL 부분이 항-아테롬 경화증임을 보여준다(Parra et al., 1992, Arterioscler. Thromb. 12:701-707; Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307).

세포표면으로부터 콜레스테롤 전달 메카니즘(콜레스테롤 유출)은 미지이지만 지질-빈약 콤플렉스인 프리-베타-1 HDL이 RCT에 관련된 주변 조직으로 부터 전달된 콜레스테롤에 대한 선호되는 수용체인 것으로 판단된다(Davidson et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:22975-22982; Bielicki et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1699-1709; Rothblat et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1091-1097; and Kawano et al., 1993, Biochemistry 32:5025-5028; Kawano et al., 1997, Biochemistry 36:9816-9825). 세포표면으로 부터 콜레스테롤 보충과정동안 프리-베타-1 HDLdms 빠르게 프리-베타-2 HDL로 전환된다. PLTP는 프리-베타-2 디스크 형성 속도를 증가시킬 수 있지만 데이터는 RCT에서 PLTP의 역할이 부족하다고 나타낸다. LCAT는 특히 원판형 및 구형 HDL 과 반응하여 레시틴 또는 다른 인지질의 2-아실기를 콜레스테롤의 자유 수산기에 전달하여서 콜레스테릴 에스테르(HDL에 유지되는)과 리소레시틴을 발생시킨다. LCAT 반응은 활성화제로서 ApoA-I을 필요로 한다; 즉 ApoA-I은 LCAT의 자연 보조인자이다. 콜레스테롤은 HDL에 격리되는 에스테르로 전환시키면 콜레스테롤의 세포로의 재도입을 방해하며, 그 결과 콜레스테릴 에스테르가 제거된다. AI-HDL 부분(즉, ApoA-I을 함유하나 ApoA-II는 없는)에 있는 성숙한 HDL 입자내 콜레스테릴 에스테르는 간에 의해 제거되고 ApoA-I과 ApoA-II(AI/AII-HDL 부분)을 둘다 함유한 HDL로 부터 유도된 것보다 효과적으로 담즙으로 가공된다. 이것은 부분적으로 AI-HDL의 헤파토사이트막에 더 효과적으로 결합하기 때문이다. HDL 수용체의 존재는 가설이며, 최근에 수용체 SR-BI이 HDL 수용체로서 식별되었다(Action et al., 1996, Science 271:518-520; Xu et al., 1997, Lipid Res. 38:1289-1298). SR-BI는 스테레오이도제닉 조직(예컨대 아드레날)과 간에서 풍부하게 나타난다(Landshulz et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:984-995; Rigotti et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:33545-33549).

CETP는 RCT에 주된 역할을 하지 않는 것으로 보이며 대신에 VLDL- 및 LDL-유도 지질 대사에 관련된다. 그러나 CETP 활성 변화나 수용체 VLDL 및 LDL은 HDL 분포 "재모델링"에 역할을 한다. 예컨대 CETP가 없을 때 HDL은 제거되지 못하는 커다란 입자가 된다(For reviews on RCT and HLDs, see Fielding ＆ Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36:211-228; Barrans et al., 1996, Biochem. Biophys. Acta. 1300:73-85; Hirano et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17(6):1053-1059).

2.3. 비정상 지혈증에 대한 최신 치료법

혈청 콜레스테롤과 트리글리세롤을 낮추기 위해 수많은 치료법이 존재한다(Brown ＆ Goldstein, supra). 그러나 각 치료법은 효과, 부작용 및 환자 분포 정량 측면에서 자체 결함 및 한계를 가진다.

담즙산 결합 수지는 장으로 부터 간으로 담즙산의 재순환을 차단하는 약물이다; 예컨대 콜레스테릴아민(Questran Light, Bristol-Myers Squibb) 및 콜레스테폴 염화수소(Colestid, The Upjohn Company). 구강 복용시 이들 양전하를 띤 수지는 장에서 음전하를 띤 담즙산에 결합된다. 수지는 장에서 흡수될 수 없으므로 담즙산과 함께 배출된다. 그러나 이러한 수지의 사용은 혈청 콜레스테롤은 많아야 20% 정도 낮출 뿐이고 변비와 비타민 결합을 포함한 위장 부작용과 관련된다. 게다가 수지는 다른 약물을 결합하므로 수지 섭취전이나 섭취 4-6시간후 다른 구강복용 약물을 먹어야 한다. 따라서 심장용 환자의 약물 복용을 복잡하게 만든다.

스타틴(statin)은 콜레스테롤 생합성 경로에 관련된 핵심 요소인 HMGCoA 환원효소를 방해함으로써 콜레스테롤 합성을 차단하는 콜레스테롤 강하제이다. 로바스타틴(Mevacor, Merck ＆ Co., Inc.) 및 프라바스타틴(Pravachol, Bristol-Myers Squibb Co.)과 같은 스타틴이 담즙산 결합수지와 조합으로 종종 사용된다. 스타틴은 혈청 콜레스테롤과 LDL-혈청 수준을 크게 감소시키며 관상 아테롬성 경화증을 느리게 진행시킨다. 그러나 혈청 HDL 콜레스테롤 수준이 조금 증가된다. LDL 강하 메카니즘은 VLDL 농도 감소 및 LDL-수용체의 세포 발현 유도에 관련되며 LDL 생성을 감소시키며 동화를 증가시킨다. 간과 신장의 비정상기능을 포함한 부작용이 이러한 약물 사용과 관련된다(Physicians Desk Reference, Medical Economics Co., Inc., Montvale, N.J., 1997). 최근에 FDA는 희귀하지만 절박한 과콜레스테린 혈증 치료용으로 아토르바스타틴(HMGCoA reductase) 시판을 승인하였다.

니코틴산은 다이어트 보충 및 과지혈증 길항제로서 사용되는 수용성 비타민 B-복합체이다. 니콘틴산은 VLDL의 생성을 감소시키며 LDL 강하에 효과적이다. 어떤 경우에 담즙산 결합 수지와 조합으로 사용된다. 니코틴산은 적절한 투여량에서 HDL을 증가시킬 수 있지만 높은 투여량에서 심각한 부작용이 있으므로 유용성이 제한된다.

파이브레이트(Fibrate)는 과콜레스테린혈증과 관련될 수도 있는 다양한 형태의 과지혈증(즉, 상승된 혈청 트리글리세리드) 치료에 사용되는 지질 강하약이다. 파이브레이트는 VLDL을 감소시키며 HDL를 약간 증가시키지만 혈청 콜레스테롤에 대한 약물의 효과는 가변적이다. 미국에서 파이브레이트는 항지혈증 작용제로서 사용이 승인되었지만 과콜레스테린 혈증 작용제로서 승인을 받지 못하였다. 예컨대 클로피브레이트(Atromid-S, Wyeth-Ayerst Laboratories)는 VLDL 부분을 감소시킴으로써 혈청 글리세리드를 저하시키는 작용을 하는 항지혈증 작용제이다. 혈청 콜레스테롤이 일부 환자에서 감소될 수 있지만 약물에 대한 생화학적 반응이 가변적이어서 환자에게 유리한지를 항상 예측할 수는 없다. Atromid-S는 관상 심장 질병 방지에 효과적이지 못하다. 화학적 및 제약학적으로 관련된 약물 젬피브로질(Lopid, Parke-Davis)은 혈청 트리글리세리드와 VLDL 콜레스테롤을 감소시키며 HDL 콜레스테롤(HDL₂, HDL₃, ApoA-I 및 A-III, 즉 AI/AII-HDL 부분)을 증가시키는 지질 조절제이다. 그러나 지질 반응은 환자들간에 가변적이다. 게다가 기초의 관상 심장 질병 병력 또는 징후가 없는 40-55명의 남성 환자에서 관상 심장 질병의 방지가 관찰되었지만 이러한 수치가 다른 환자(여성, 늙거나 어린 남성)에게도 적용되는지 명료하지 않다. 사실상 확정된 관상 심장 질병을 앓는 환자에게는 효과가 나타나지 않았다. 악성종양(특히 위장암), 쓸개질병 및 비-관상 사망 빈도증가와 같은 심각한 부작용이 피브레이트 사용과 관련된다. 이러한 약물은 지질 비정상으로 인한 고 LDL 또는 저 HDL을 갖는 환자 치료용으로 지정되지 않았다(Physician's Desk Reference, 1997, Medical Economics Co., Inc. Montvale, N.J.).

경구 에스트로젠 대체 치료법이 폐경기 여성의 과콜레스테린혈증에 대해 고려될 수 있다. 그러나 HDL 증가는 트리글리세리드 증가와 관련될 수 있다. 물론 에스트로젠 치료는 특수 환자(폐경기 여성)에 제한되며 악성종양, 쓸개 질병, 혈전색전증, 간 아데노마, 혈압상승, 글루코스 불내성 및 과칼슘혈증의 유도를 포함한 심각한 부작용과 관련된다.

따라서 혈청 콜레스테롤 강하, HDL 증가에 효과적이며 관상 심장 질병을 방지하고 기존의 질병, 특히 아테롬성 경화증 치료에 효과적인 더 안전한 약이 필요하다.

2.4. ApoA-I

콜레스테롤을 낮추기 위해 현재 구입가능한 약은 HDL 수준을 안전하게 상승시키지도 RCT를 자극하지도 못한다. 대부분은 콜레스테롤 운반 경로에 작용하여 음식물 섭취를 조절하며 콜레스테롤의 재순환 및 합성과 VLDL 분포를 조절한다.

콜레스테롤 유출 및 제거를 자극하는 약품 발견이 필요하지만 RCT에서 몇 가지 잠재적인 목표가 존재하며(예, LCAT, HDL, ApoA-I, ApoA-II, 인지질, PLTP 및 CETP) 필요한 리포단백질 프로파일과 보호 효과 달성에 가장 효과적인 목표가 알려지지 않았다. RCT 경로에서 단일 성분의 교란은 순환 리포단백질 분포의 조성과 RCT의 효율에 영향을 준다.

생체에서 수득된 데이터에 기초한 몇 가지 증거는 아테롬성 경화증 방지 및 플라크 퇴행에 있어서 주단백질 성분인 ApoA-I과 HDL을 함축하며 치료에 대한 목표를 정하게 한다. 먼저, 혈청 ApoA-I(HDL) 농도와 남성 아테롬성 경화증간에는 역상관 관계가 존재한다(Gordon ＆ Rifkind, 1989, N, Eng. J. Med. 321:1311-1316; Gordon et al., 1989, Circulaton 79:8-15). 사실상 HDL은 어떤 경우에 인간의 아테롬성 경화증 위험 감소와 관련된다(Miller, 1987, Amer. Heart 113:589-597; Cheung et al., 1991, Lipid Res. 32:383-394); Fruchart ＆ Ailhaud, 1992, Clin. Chem. 38:79).

둘째, 동물연구는 ApoA-I(HDL)의 보호역할을 지지한다. 콜레스테롤이 공급된 토기를 ApoA-I 또는 HDL로 처리하면 콜레스테롤 공급 토기에서 플라크(지방층)의 전개 및 진행을 감소시킨다(Koizumi et al., 1988, J. Lipid Res. 29:1405-1415; Badimon et al., 1989, Lab. Invest. 60:455-461; Badimon et al., 1990, J. Clin. Invest. 85:1234-1241). 그러나 HDL 소스에 따라 효과는 가변적이다(Beitz et al., 1992, Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47:149-152; Mezdour et al., 1995, Atherosclerosis 113:237-246).

셋째, ApoA-I의 역할에 대한 직접적인 증거는 유전자변이 동물이 관련된 실험에서 수득된다. 다이어트 유도 아테롬성 경화증에 걸린 생쥐에 옮겨진 ApoA-I 인간유전자의 발현은 대동맥 질병 전개를 방지한다(Rubin et al., 1991, Nature 353:265-267). ApoA-I 트랜스유전자는 또한 ApoE 결핍 생쥐와 Apo(a) 유전자변이 생쥐의 아테롬성 경화증을 억제시킨다(Paszty et al., 1994, J. Clin. Invest. 94:899-903; Plump et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9607-9611; Liu et al., 1994, J. Lipid Res. 35:2263-2266). 유사한 결과가 인간 ApoA-I을 발현하는 유전자변이 토끼(Duverger, 1996, Circulation 94:713-717; Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:1424-1429)에서 관찰되었고 인간 ApoA-I 수준이 향상된 유전자변이 쥐에서 아테롬성 경화증이 방지되었고 맥관형성기구 사용후 재협착증이 억제되었다(Burkey et al., 1992, Circulation, Supplement I, 86:I-472, Abstract No. 1876; Burkey et al., 1995, J. Lipid Res. 36:1463-1473).

AI-HDL은 AI/AII-HDL보다 RCT에 더 효과적이다. 인간 ApoA-I 또는 Apo-I 및 ApoA-II(AI/AII)로 유전자 변이한 생쥐에 대한 연구는 HDL의 단백질 조성이 그 역할에 영향을 줌을 보여준다. AI-HDL은 AI/AII-HDL보다 더 아테롬성 경화증을 억제한다(Schultz et al., 1993, Nature 365:762-764). 인간의 LCAT 유전자를 발현시킨 유전자변이 생쥐에 대한 연구는 LCAT 활성의 증가가 리포단백질 콜레스테롤 수준을 변화시키고 LCAT가 ApoA-I 함유 HDL에 대해 특히 선호됨을 보여준다(Francone et al., 1995, J. Clinic. Invest. 96:1440-1448; Berard et al., 1997, Nature Medicine 3(7):744-749). 이들 데이터는 LCAT 활성화 및 RCT 자극에 ApoA-I 의 역할을 지원하지만 추가연구는 더 복잡한 시나리오를 보여준다: 세포 콜레스테롤의 유출을 조절하는 HDL의 주성분은 인지질이다(Fournier et al., 1996, J. Lipid Res. 37:1704-1711).

HDL의 잠재적 역할 측면에서, 즉 아테롬성 경화증 방지에 대한 ApoA-I 과 조합된 인지질의 역할 측면에서 재조합된 ApoA-I을 활용한 임상 연구가 UCB Belgium (Pharmaprojects, Oct. 27, 1995; IMS R＆D Focus, June 30, 1997; Drug Status Update, 1997, Atherosclerosis 2(6):261-265); M. Eriksson at Congress, "The Role of HDL in Disease Prevention," Nov. 7-9, 1996, Fort Worth; Lacko ＆ Miller, 1997, J. Lip. Res. 38:1267-1273; and WO94/13819)과 Bio-Tech(Pharmaprojects, April 7, 1989)에 의해 개시되었다. 패혈증성 쇼크를 처리하기 위해 ApoA-I을 사용하는 시도가 있었다(Opal, "Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis," IBC's 7th International Conference on Sepsis, April 28-30, 1997, Washington, D.C.; Gouni et al., 1993, J. Lipid Res. 94:139-146; Levine, WO96/04916). 그러나 ApoA-I 의 제조 및 사용과 관련된 수많은 문제가 있어서 이것을 약품으로서 덜 이상적으로 만들었다. 즉 ApoA-I 은 제조하기가 곤란하고 비싼 커다란 단백질이며; 저장 안정성, 활성제품의 전달 및 생체내 반감기 측면에서 제조 및 재현성 문제가 극복되어야 한다.

이러한 문제에 대해서 ApoA-I을 모방하는 펩티드 제조가 시도되었다. ApoA-I 의 활성도는 단백질내 고유한 이차구조 특징의 다중 반복부위, 즉 클래스 A 양방향 α-헬릭스(Segrest, 1974, FEBS Lett. 38:247-253)의 존재 때문이므로 ApoA-I 활성도를 모방하는 펩티드 설계노력은 클래스 A형 α-헬릭스를 형성하는 펩티드 설계에 집중되었다.

클래스 A형 α-헬릭스는 양전하를 띤 아미노산 잔기가 친수성-소수성 계면에서 뭉쳐지며 음전하를 띤 아미노산 잔기는 친수성 부위의 중심에 모인다는 점에서 독특하다. 게다가 클래스 A형 α-헬릭스 펩티드는 180°미만의 소수성 각도를 가진다(Segrest et al., 1990, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 8:103-117). ApoA-I 모방물 설계전략은 천연발생 아포리포단백질의 일차 서열에 기초하지 않고 고유한 클래스 A 헬릭스 특징을 펩티드 상동물의 서열과 ApoA-I 도메인의 성질의 일부에 포함시키는 것에 기초한다(Davidson et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13605-13610; Rogers et al., 1997, Biochemistry 36:288-300; Lins et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta biomembranes 1151:137-142; Ji and Jonas, 1995, J. Biol. Chem. 270:11290-11297; Collet et al., 1997, Journal of Lipid Research, 38:634-644; Sparrow and Gotto, 1980, Ann. N.Y. Acad. Sci. 348:187-211; Sparrow and Gotto, 1982, CRC Crit. Rev. Biochem. 13:87-107; Sorci-Thomas et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:21403-21409; Wang et al., 1996, Biochim. Biophys. Acta 174-184; Minnich et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 16553-16560; Holvoet et al., 1995, Biochemistry 34:13334-13342; Sorci-Thomas et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(11):7278-7284; and Frank et al., 1997, Biochemistry 36:1798-1806).

Fukushima 등은 동일한 친수성 및 소수성 면을 갖는 α-헬릭스("ELK 펩티드")를 형성하기 위해서 주기적으로 배열된 Glu, Lys 및 Leu 잔기로 구성된 22-펩티드를 합성하였다(Fukushima et al., 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101(13):3703-3704; Fukushima et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:10651-10657). ELK 펩티드는 ApoA-I 의 198-219 단편과 41% 서열 상동성을 공유한다. 정량적인 한외여과, 겔투과 크로마토그래피 및 원형 이색분리에 의한 연구에 의해 ELK 펩티드는 인지질과 효과적으로 조합되어 ApoA-I 의 물성 및 화학적 성질의 일부를 모방한다(Kaiser et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1137-1140; Kaiser et al., 1984, Science 223:249-255; Fukushima et al., 1980, supra; Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092). Yokoyama등은 이러한 연구로 부터 LCAT 활성화를 위한 중심인자는 충분히 큰 양친화성 구조의 존재라는 결론을 내렸다(Yokoyama et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(15):7333-7339). 22-잔기 펩티드 이합체가 모노머보다 ApoA-I 에 더 가깝다. 이 결과에 기초하여 헬릭스 브레이커(Gly 또는 Pro)이 중앙에 있는 44-mer가 의 최소한의 기능성 도메인을 나타냄이 제시되었다(Nakagawa et al., 1985, supra).

또다른 연구는 양친화성 펩티드 "LAP 펩티드"가 관련된다(Pownall et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(6):3154-3158; Sparrow et al., 1981, In: Peptides: Synthesis-Structure-Function, Roch and Gross, Eds., Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 253-256). 원 아포리포단백질 단편을 사용한 지질 결합 연구에 기초하여 여러개의 LAP 펩티드 LAP-16, LAP-20, LAP-24가 설계되었다(각각 16, 20, 24개의 아미노산 잔기를 함유한). 이들 모델 양친화성 펩티드는 아포리포단백질과 서열 상동성을 공유하지 않으며 아포리포단백질과 관련된 클래스 A형 양친화성 헬릭스형 도메인과 상이한 방식으로 조직된 친수성 면을 가지도록 설계된다(Segrest et al., 1992, J. Lipid Res. 33:141-166). 최소 20개의 잔기가 모델 양친화성 펩티드에 지질-결합성을 부여하는데 필요하다.

서열의 상이한 지점에서 프롤린 잔기를 함유한 LAP20 돌연변이 연구는 지질 결합과 LCAT 활성화 잔기는 직접적 관계가 존재하지만 펩티드의 헬릭스 구조만으로는 LCAT 활성화를 가져오지 못한다를 보여준다(Ponsin et al., 1986 J. Biol. Chem. 261(20):9202-9205). 게다가 펩티드 중앙 근처에 이러한 헬릭스 브레이커(Pro)의 존재는 인지질 표면에 대한 친화력과 LCAT 활성화 능력을 감소시킨다. 일부 LAP 펩티드는 인지질을 결합하지만(Sparrow et al., supra) LAP 펩티드가 지질 존재하에서 헬릭스형이 되는 정도에 대해 논란이 있다(Buchko et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(6):3039-3045; Zhong et al., 1994, Peptide Research 7(2):99-106).

Segrest등은 ApoA-I 헬릭스와 서열 상동성을 공유하지 않은 18-24 아미노산 잔기로 구성된 펩티드를 합성하였다(Kannelis et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(3):11464-11472; Segrest et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2290-2295). 소수성 모멘트(Eisenberg et al., 1982, Nature 299:371-374)와 전하분포(Segrest et al., 1990, Proteins 8:103-117; U.S. Patent No. 4,643,988) 측면에서 클래스 A 교환가능한 아포리포단백질의 양친화성 헬릭스 도메인을 모방하도록 서열이 설계된다. 18-잔기 펩티드, 즉 "18A" 펩티드가 모델 클래스 A형 α-헬릭스로 설계되었다(Segrest et al., 1990, supra). 이러한 펩티드와 "18A" 펩티드와 같이 역전된 전하 분포를 갖는 다른 펩티드의 연구로 전하 분포가 활성도에 있어서 중요함을 알 수 있었다; 역전된 전하 분포를 갖는 펩티드는 18A 클래스 A형 모방물에 비해서 감소된 지질 친화력을 보이며 지질 존재하에서 적은 헬릭스 함량을 보인다(Kannellis et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:11464-11472; Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10248-10255; Chung et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10256-10262; Epan et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:9389-9396; Anantharamaiah et al., 1991, Adv. Exp. Med. Biol. 285:131-140).

제한된 성공을 보이며 아포리포단백질과 서열 상동성을 고유하지 않은 다른 합성 펩티드는 18A 펩티드(Anantharamaiah et al., 1986, Proteins of Biological Fluids 34:3-66), GALA 및 EALA 펩티드(Subbarao et al., 1988, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 3:187-198) 및 ID 펩티드(Labeur et al., 1997, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 17:580-588)와 18AM4 펩티드(Brasseur et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:1-7)의 이합체 및 삼합체를 포함한다.

인간 ApoA-I 의 헬릭스 서열에 기초한 22-아미노산 잔기 함유 "컨센서스" 펩티드가 설계되었다(Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10(1):95-105; Venkatachalapathi et al., 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B:585-596). 이 서열은 인간 ApoA-I 헬릭스의 각 위치에서 가장 우세한 잔기를 식별함으로써 구축된다. 상기 펩티드와 유사하게 이러한 펩티드로 형성된 헬릭스는 친수성-소수성 계면에 모인 양전하를 띤 아미노산 잔기, 친수성 면의 중심에 모인 음전하를 띤 아미노산 잔기와 180°미만의 소수성 각도를 가진다. 이 펩티드의 이합체는 LCAT 활성화에 약간 효과적이지만 모노머는 나쁜 지질 결합성을 보인다(Venkatachalapathi et al., 1991, supra).

상기 펩티드를 사용한 생체내 연구를 기초로 apoA-I 기능을 모방하는 펩티드 설계에 "규칙"이 제시된다. 친수성-소수성 계면에 모인 양전하를 띤 잔기와 친수성 면의 중심에 모인 음전하를 띤 잔기를 갖는 양친화성 α-헬릭스는 지질 친화력 및 LCAT 활성화에 필요하다(Venkatachalapathi et al., 1991, supra). Anantharamaiah 등은 α-헬릭스의 소수성면내에 위치된 컨센서스 22-mer 펩티드의 13번 위치에 있는 음전하 Glu 잔기가 LCAT 활성화에 중요한 역할을 함을 제시한다(Anantharamaiah et al., 1991, supra). 게다가, Brasseur 등은 180°미만의 소수성각도가 최적의 지질-아포리포단백질 복합체 안정성을 위해 필요하며 지질 이중층 엣지 근처에 펩티드를 갖는 원판형 입자 형성에 기여한다고 발표한다(Brasseur, 1991, J. Biol. Chem. 66(24):16120-16127). Rosseneu 등 역시 180°미만의 소수성 각도가 LCAT 활성화에 필요하다고 주장한다(WO93/25581).

그러나 이러한 "규칙"에도 불구하고 누구도 ApoA-I 과 같은 활성이 있는 펩티드를 설계하지도 제조하지도 못하였다. LCAT 활성도 분석시 최대 활성도는 ApoA-I 활성도의 40% 미만이었다. 문헌에 발표된 펩티드 "모방물"은 모두 약물로서 유용하지 못하다.

따라서 ApoA-I 의 활성도를 모방하며 제조가 단순하고 비용 효율적인 안정한 ApoA-I 작용제 개발이 필요하다. 그러나 ApoA-I 모방물 설계를 위한 "규칙"은 밝혀지지 않았고 ApoA-I 기능을 갖는 유기분자 설계원리도 미지상태이다.

3. 발명의 요약

본 발명은 ApoA-I 의 활성도를 모방하는 양친화성 α-헬릭스(원 분자의 활성도를 능가하는 LCAT 활성도를 갖는)를 형성할 수 있는 ApoA-I 작용제에 관계한다. 특히 본 발명의 ApoA-I 작용제는 양친화성 헬릭스(지질의 존재하에)를 형성하며, 지질과 결합하고, 프리-β형 또는 HDL 형 복합체를 형성하며, LCAT를 활성화시키며, 혈청의 HDL 비율을 증가시키고, 콜레스테롤 유출을 촉진시키는 펩티드 또는 펩티드 유사물이다.

본 발명은 ApoA-I 의 기능을 모방하는 펩티드의 설계 및 발견에 기초한다. 본 발명의 펩티드는 ApoA-I 의 헬릭스형 반복부로 부터 유도된 22 아미노산 컨센서스 서열의 양친화성 성질과 중첩된 헬릭스형 구조에 기초하여 설계된다. 놀랍게도 본 발명의 펩티드는 문헌에 발표된 ApoA-I 유도 펩티드 이상의 활성도를 가진다. 사실상 본 발명의 일부 구체예는 원 ApoA-I 활성도의 100%에 접근하며 또한 일부 초작용제는 ApoA-I 의 활성도를 능가한다.

본 발명의 한 특징은 Segrest의 콘센선스 22-MER의 아미노산 잔기 14-17이 LCAT 활성 손살없이 결손될 수 있다는 것에 기초한다. 일부 경우에, 아미노산이 결손되면 LCAT 활성을 강화시킨다. 본 발명의 또 다른 특징에 있어서, 콘센선스 서열의 다른 잔기 또한 결손되어도 활성이 강화된다. 또한, 일부 구체예에서, 결손은 아미노산 잔기 변형과 함께 이용된다. 일부 적절한 구체예에서, Segrest의 콘센선스 22-mer 잔기의 4개 잔기를 결손시키고, 5, 9, 13에 있는 잔기를 소수성 루이신으로 변경하는 것을 같이 이용한다.

본 발명은 지질의 존재하에 헬릭스를 형성하며, 지질과 결합하며, 복합체를 형성하며 LCAT 활성도를 증가시키는 양친화성 펩티드의 제조 및 용도, 구조를 실시예에서 예시한다. 예시된 구체예의 구조 및 활성도에 기초하여 본 출원인은 본 발명의 범위내에 있는 다른 형태를 설계하는데 사용될 수 있는 "규칙"을 고안하였다.

본 발명은 또한 활성성분으로서 작용제(펩티드 또는 펩티드-지질 복합체로서)를 함유한 제약 조성물과 그 제조방법과 비정상 리포단백질 질병(심장혈관 질병, 아테롬성 경화증, 대사 증후군), 재협심증 또는 폐혈증에 관련된 질병 치료용으로 용도에도 관계한다.

3.1. 약어

유전공학에 의해 인코딩된 아미노산의 D-엔안시오머에 대한 약어는 일문자 기호와 등가이다. 예컨대 "R"은 L-아르기닌을 "r"은 D-아르기닌을 나타낸다.

3.2. 정의

"알킬": 포화된 직쇄형, 측쇄형 또는 고리형 탄화수소기이다. 대표적인 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 헥실등이다. 선호되는 구체예에서 알킬기는 (C₁-C₆) 알킬이다.

"알케닐": 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 가진 불포화 직쇄형, 측쇄형 또는 고리형 탄화수소기이다. 탄화수소기는 이중결합 주위에 시스 또는 트랜스 구조를 가질 수 있다. 대표적인 알케닐은 에텐일, 프로펜일, 이소프로펜일, 부테닐, 이소부테닐, t-부테닐, 펜테닐, 헥세닐등이다. 선호되는 구체예에서 알케닐은 (C₁-C₆) 알케닐이다.

"알키닐": 하나 이상의 탄소-탄소 삼중결합을 갖는 불포화 직쇄형, 측쇄형 또는 고리형 탄화수소기이다. 대표적인 알키닐기는 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 이소부티닐, 펜티닐, 헥시닐등이다. 선호되는 구체예에서 알키닐기는 (C₁-C₆) 알키닐이다.

"아릴": 공액 II 전자 시스템을 갖는 불포화 고리형 탄화수소기이다. 대표적인 아릴기는 펜타-2,4-디엔, 페닐, 나프틸, 안트라실, 아줄레닐, 크리세닐, 코로넨일, 펜알레닐, 펜아트레닐, 피세닐, 플레이아데닐, 피레닐, 피란트레닐, 루비세닐등이다. 선호되는 구체예에서 아릴기는 (C₅-C₂₀), 특히 (C₅-C₁₀) 아릴이다.

"알크아릴": 말단 탄소에 결합된 수소원자중 하나가 아릴으로 대체된 직쇄형 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이다. 대표적인 알크아릴기는 벤질, 벤질리덴, 벤질리딘, 벤제노벤질, 나프테노벤질등이다. 선호되는 구체예에서 알킬기는 (C₆-C₂₆) 알크아릴이다. 즉, 알크아릴기의 알킬, 알케닐 또는 알키닐 부위가 (C₁-C₆)이고 아릴 부분이 (C₅-C₂₀)이다. 더욱 선호되는 구체예에서 알크아릴기는 (C₆-C₁₃) 알크 아릴이다. 즉, 알크아릴기의 알킬, 알케닐 또는 알케닐 부분이 (C₁-C₃)이고 아릴부분이 (C₅-C₁₀)이다.

"헤테로아릴": 하나이상의 탄소원자가 N, P, O, S, As, Se, Si, Te과 같은 원자로 대체된 아릴을 의미한다. 대표적인 헤테로아릴기는 아크리다신, 아크리딘, 아르스안트리딘, 아르신돌, 아르신돌린, 카르바졸, β-카르볼린, 크로멘, 시놀린, 퓨란, 이미다졸, 인다졸, 인돌, 인돌리진, 이소아르신돌, 이소아르신돌린, 이소벤조퓨란, 이소크로멘, 이소인돌, 이소포스포인돌, 이소포스포인돌린, 이소퀴놀린, 이소티아졸, 이속사졸, 나프티리딘, 페리미딘, 펜안트리딘, 펜안트롤린, 펜아진, 포스포인돌, 포스포인돌린, 프탈라진, 프테리딘, 퓨린, 피란, 피라진, 피라졸, 피리다진, 피리딘, 피리미딘, 피롤, 피롤리진, 퀸아졸린, 퀴놀린, 퀴놀리진, 퀴녹살린, 셀레노펜, 텔우로펜, 티오펜, 크산텐등이 있다. 선호되는 구체예에서 헤테로아릴기는 5-20각형, 특히 5-10각형 헤테로아릴이 선호된다.

"알크헤테로아릴": 말단 탄소원자에 결합된 하나의 수소원자가 헤테로아릴기로 대체된 직쇄형 알킬, 알케닐 또는 알키닐기이다. 선호되는 구체예에서 알크헤테로아릴기는 6-26각형 알크헤테로아릴, 즉 알크헤테로아릴의 알킬, 알케닐 또는 알키닐부분이 (C₁-C₆) 이고 헤테로아릴이 5-20각형 헤테로아릴이다. 더욱 선호되는 구체예에서 알크헤테로아릴은 6-13각형 알크헤테로아릴, 즉 알킬, 알케닐 또는 알키닐 부분이 C₁-C₃이고 헤테로아릴이 5-10각형 헤테로아릴이다.

"치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알크아릴, 헤테로아릴 또는 알크헤테로아릴": 하나 이상의 수소원자가 또다른 치환체로 대체되는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알크아릴, 헤테로아릴 또는 알크헤테로아릴기이다. 선호되는 치환체는 -OR, -SR, -NRR, -NO₂, -CN, 할로겐, -C(O)R, -C(O)OR 및 -C(O)NR 이고 여기서 R은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알크아릴, 헤테로아릴 또는 알크헤테로아릴이다.

본 발명은 과콜레스테린혈증, 심장혈관 질병, 아테롬성 경화증 및 패혈병성 쇼크를 포함한 비정상 지혈증과 관련된 질병 치료용 아포리포단백질 A-I(ApoA-I) 작용제 조성물에 관계한다.

도 1a 는 개방 원이 친수성 아미노산 잔기를, 음영 원이 소수성 아미노산 잔기를 나타내는 이상화된 양친화성 α-헬릭스의 Schiffer-Edmundson 헬릭스 휘일 다이아그램이다.

도 1b 는 도 1a 헬릭스의 헬릭스형 네트 다이아그램이다.

도 1c 는 도 1a 양친화성 헬릭스의 헬릭스형 실린더 다이아그램이다.

도 2a 는 구조(I)의 코어 펩티드에 대한 Schiffer-Edmundson 헬릭스 휘일 다이아그램으로서 헬릭스의 양친화성을 보여준다(개방원은 친수성 아미노산 잔기를, 음영 원은 소수성 아미노산 잔기를, 부분음영 원은 친수성 또는 소수성 아미노산 잔기를 나타낸다).

도 2b 는 구조(I) 코어 펩티드의 헬릭스형 네트 다이아그램으로서 헬릭스의 소수성 면을 보여준다.

도 2c 는 구조(I) 코어 펩티드의 헬릭스형 실린더 다이아그램으로서 헬릭스의 친수성 면을 보여준다.

도 3a 는 Segrest의 컨센서스 18A 펩티드(DWLKAFYDKVAEKLKEAF; 서열:244)의 친수성 면을 보여주는 헬릭스형 네트 다이아그램이다.

도 3b 는 코어펩티드 210(PVLDLFRELLEELKQKLK; 서열:210)의 친수성면을 보여주는 헬릭스형 네트 다이아그램이다.

도 3c는 Segrest 콘센선스 22-mer 펩티드(PVLELFENLLERLLDALQKKLK; 서열 :75)의 친수성 면을 설명하는 헬릭스 네트 다이아그램이다.

도 4a 는 Segrest의 컨센서스 18A 펩티드(서열:244)의 소수성 면을 보여주는 헬릭스형 네트 다이아그램이다.

도 4b 는 코어펩티드 210(서열:210)의 소수성면을 보여주는 헬릭스형 네트 다이아그램이다.

도 4c는 Segrest 콘센선스 22-mer 펩티드(서열:75)의 소수성 면을 설명하는 헬릭스 네트 다이아그램이다.

도 5a는 Segrest의 컨센서스 18A 펩티드(서열:244)의 Schiffer-Edmundson 헬릭스 휘일 다이아그램이다.

도 5b는 코어 펩티드 210(서열:2105)의 Schiffer-Edmundson 헬릭스 휘일 다이아그램이다.

도 6a는 본 발명의 3차 분지쇄 네트워크를 나타낸다.

도 6b는 본 발명의 4차 분지쇄 네트워크를 나타낸다.

도 6c 는 본 발명의 혼성 측쇄형 네트워크를 보여준다.

도 6d 는 본 발명의 "Lys-트리" 측쇄형 네트워크를 보여준다.

도 7a 는 펩티드 210(서열:210)와 Segrest의 컨센서스 22-mer 펩티드(서열:75)에 대해서 관찰된 Hα케미칼 쉬프트와 랜덤 코일 Hα케미칼 쉬프트간의 차이를 보여준다.

도 8a 는 본 발명의 ApoA-I 작용제로 수득될 수 있는 다양한 응집상태 및 펩티드-지질 복합체를 보여주며, 좌측에는 수개의 펩티드 헬릭스의 상호작용을 통해서 나타내며 펩티드 농도, pH 및 이온세기에서 올리고머 형성은 가져오는 펩티드의 멀티머화 과정을, 중앙에는 펩티드(다양한 응집상태에서)가 지질(SUV)과 상호작용하여 지질이 재배열됨을, 우측에서는 지질:펩티드 몰비를 변화시켜서 낮은 지질-펩티드 비율에서 지질-펩티드 미셀이, 높은 지질:펩티드 비율에서 원판형 입자 및 커다란 다층 복합체로 다양한 형태의 펩티드-지질 복합체가 수득됨을 보여준다.

도 8b 는 한정된 범위의 지질:펩티드 비율에서 형성된 원판형 펩티드-지질 복합체의 모델로서, 각 디스크 엣지를 에워싸는 각 펩티드는 두 개의 최근접 이웃과 접촉한다.

본 발명의 ApoA-I 작용제는 ApoA-I의 기능 및 활성을 모방한다. 이들은 양친화성 헬릭스 (지질의 존재하에서)를 형성하고, 지질에 결합하고, 프리-β형 또는 HDL형 복합체를 형성하고, LCAT를 활성화시키고, 혈청 HDL 농도를 증가시키고 콜레스테롤 유출을 촉진한다. 펩티드의 생물학적 기능은 헬릭스형 구조와 상관되고 지질의 존재하에서 헬릭스구조로 전환된다.

본 발명의 ApoA-I 작용제는 안정적인 벌크 또는 단위 투여 형태(예컨대 동결건조제품)로 제조되어서 생체에 사용된 재배합될 수 있다. 본 발명은 고지혈증, 과콜레스테린혈증, 관상 심장병, 아테롬성 경화증, 폐혈증과 같은 질병의 치료에 유용한 제약 조성물을 포함한다.

본 발명의 실시예에서 LCAT 활성화시 매우 효율적이어서 RCT를 촉진시킨다. 본 발명의 ApoA-I 작용제를 동물 생체에 사용하면 혈청 HDL 농도를 증가시킨다.

하기에 본 발명은 ApoA-I 펩티드 작용제의 조성 및 구조; 구조 및 기능 분석; 벌크 및 단위 투여 배합물 제조방법; 사용방법을 기술한다.

5.1. 펩티드 구조와 기능

본 발명의 ApoA-I 작용제는 지질의 존재하에서 양친화성 α-헬릭스를 형성할 수 있으며 ApoA-I 의 활성을 모방하는 펩티드 또는 그 상동물이다. 이 작용제는 주 특징으로서 15 내지 29, 특히 22개의 아미노산 잔기로 구성된 "코어" 펩티드를 가진다. 펩티드에서 적어도 하나의 아미드 결합은 치환된 아미드 또는 아미드 모방물로 대체된다.

본 발명의 ApoA-I 작용제는 활성에 있어서 중요한 22-mer 컨센서스 서열의 일차 서열에 있는 아미노산 잔기의 변경(Venkatachalapathi et al., 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B:585-596 (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; 서열:75; hereinafter "Segrest's 22-mer" "consensus 22-mer")이 원래의 ApoA-I 활성도를 능가하는 활성도를 보이는 합성 펩티드를 생성한다는 발견에 기초한다. 본 발명의 한 특징에 있어서, 콘센선스 22-mer의 4개 아미노산 잔기 예를 들면 잔기 14-17을 결손시켜, LCAT를 활성화시킬 수 있는 18-mer를 만든다. 추가 실시예에서 4개의 다른 잔기가 결손되었다. 일부 구체예에서, 활성에 중요한 것으로 간주되는 3개의 전하를 띤 아미노산 잔기(Glu-5, Lys-9 및 Glu-13)를 소수성 Leu 잔기로 대체하였다.

본 발명의 ApoA-I 작용제에 의해 형성된 헬릭스는 문헌에서 발표된 ApoA-I 모방 펩티드로 형성된 α-헬릭스보다 지질-결합, 콜레스테롤 유출 및 LCAT 활성화에 중요한 역할을 하는 원 ApoA-I 의 양친화성 헬릭스 지역의 구조 및 기능을 더 밀접하게 모방하여서 다른 펩티드보다 더 높은 ApoA-I 형 활성도를 보이는 펩티드를 생성한다. 사실상 본 발명의 ApoA-I 작용제는 지금까지의 ApoA-I 활성도를 능가하며 문헌에 발표된 최상의 펩티드 ApoA-I 모방물인 펩티드 18AM4(EWLEAFYKKVLEKLKELF; 서열: 246)(Corinjn et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:8-16; Labeur et al., Oct. 1994, Arteriosclerosis: Abstract Nos. 186 and 187)와 N-아실화, C-아민화 펩티드 18AM4(서열:239(Brasseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170:1-7)는 LCAT 활성화 분석으로 측정시 ApoA-I 활성도의 각각 4%, 11% 미만의 활성도를 보인다.

일반적으로 본 발명의 ApoA-I 작용제를 구성하는 코어 펩티드는 다음 구조식(I)을 가진다:

(I) X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X₂₂

X₁은 Pro(P), Ala(A), Gly(G), Gln(Q), Asn(N), Asp(D) 또는 D-Pro(p)이며;

X₂는 지방족 아미노산이고;

X₃은 Leu(L)이고;

X₄는 산성 아미노산이고;

X₅는 Leu(L) 또는 Phe(F)이며;

X₆은 Leu(L) 또는 Phe(F)이고;

X₇은 염기성 아미노산이고;

X₈은 산성 아미노산이고;

X₉는 Leu(L) 또는 Trp(W)이고;

X₁₀은 Leu(L), Trp(W)이고;

X₁₁은 산성 아미노산 또는 Asn(N)이고;

X₁₂는 산성 아미노산이고;

X₁₃는 Gly(G), Trp(W) 또는 Phe(F)이고;

X₁₄는 염기성 아미노산 또는 Leu(L)이고;

X₁₅는 Gln(Q) 또는 Asn(N)이고;

X₁₆은 염기성 아미노산이고;

X₁₇은 Leu(L)이고;

X₁₈은 염기성 아미노산이다.

구조(I)의 코어 펩티드는 아미노산 측면에서 정의된다. 구조(I)의 변경 또는 돌연변이된 형태에 대해 다양한 클래스의 정의가 제공된다.

구조(I)의 코어 펩티드에서 아미노산 잔기(Xn)간이 "－"는 골격구성연결기능기를 표시한다. 따라서 기호 "－"는 보통 펩티드 결합이다. 아미드 결합(-C(O)NH-)를 나타낸다. 그러나 본 발명은 하나 이상의 아미드 결합이 아미드 이외의 결합 특히 치환형 아미드로 대체됨을 특징으로 하는 펩티드 상동물을 고려한다. 따라서 구조(I)내의 다양한 Xn 잔기는 아미노산으로 일반적으로 기술되며 본 발명의 선호된 구체예는 펩티드를 수단으로 예시되지만 당해분야 숙련자라면 비 아미드결합을 갖는 구체예에서 "아미노산" 또는 "잔기"가 아미노산 측쇄에 구조적으로 유사한 기를 갖는 다른 2작용기를 지칭할 수 있다.

치환형 아미드는 식-C(O)NR-의 기를 포함하며, 여기서 R은 (C₁-C₆)알킬, 치환형(C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알켄일, 치환형(C₁-C₆)알켄일, (C₁-C₆)알킨일, 치환형(C₁-C₆)알킨일, (C₅-C₂₀)아릴, 치환형 (C₅-C₂₀)아릴, (C₆-C₂₆)알크아릴, 치환형 (C₆-C₂₆)알크아릴, 5-20각형 헤테로아릴, 치환형 5-20각형 헤트로아릴, 6-26각형 알크헤테로아릴 및 치환형 6-26각형 알크헤테로아릴이다.

아미드의 이소스티어(Isostere)는 일반적으로 -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH- (cis and trans), -C(O)CH₂-, -CH(OH)CH₂, 그리고 -CH₂SO-을 포함한다. 이러한 비-아미드 결합을 갖는 화합물과 그 제조방법은 당해분야에서 공지이다(Spatola, March 1983, Vega Data Vol. 1, Issue 3; Spatola, 1983, "Peptide Backbone Modifications" In: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Poptides and Proteins, Weinstein, ed., Marcel Dekker, New York, p. 267(general review); Morley, 1980, Trends Pharm. Sci. 1:463-468; Hudson et al., 1979, Int. J. Prot. Res. 14:177-185(-CH₂NH-, -CH₂CH₂-); Spatola et al., 1986, Life Sci. 38:1243-1249(-CH₂-S); Hann, 1982, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1:307-314(-CH=CH-, cis and trans); Almquist et al., 1980, J. Med. Chem. 23:1392-1398(-COCH₂-); Jennings-White et al., Tetrahedron. Lett. 23:2533(-COCH₂-); European Patent Application EP 45665(1982) CA 97:39405(-CH(OH)CH₂-); Holladay et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24:4401-4404 (-C(OH)CH₂-); and Hruby, 1982, Lefe Sci. 31:189-199(-CH₂-S-).

추가로 하나 이상의 아미드 결합은 펩티드의 구조 또는 활성화 크게 간섭하지 않는 펩티드 모방물 또는 아미드 모방물로 대체될 수 있다. 적당한 아미드 모방물은 Olson et al., 1993, J. Med. Chem. 36:3039-3049에 발표된다.

구조(I)의 코아 펩티드의 중요한 특징은 지질의 존재하에서 양친화성 α-헬릭스를 형성하는 능력이다. 양친화성이란 장축을 따라 배향된 대향하는 친수성 및 소수성면을 가짐을 의미한다. 즉, 헬릭스의 한 면은 주로 친수성 측쇄를 돌출시키지만 대향면은 주로 소수성 측쇄를 돌출시킨다. 도 1a 및 1b는 이상화된 양친화성 α-헬릭스의 대향하는 친수성 및 소수성면의 두가지 예를 보여준다. 도 1a는 Schiffer-Edmundson 헬릭스형 휠 다이아그램이다(Schiffer and Edmundson, 1967, Biophys. J. 7:121-135).

휘일에서 헬릭스의 장축은 종이면에 대해 수직이다. N-말단으로 시작하여 연속적인 아미노산 잔기(원으로 표시된)는 100˚간격으로 원주 주위에 방사상 분포되다. 따라서 아미노산 잔기 n+1은 잔기 n으로부터 100˚지점에 위치되고 전가 n+2는 잔기 n+1로부터 100˚지점에 위치된다. 100˚위치선정은 이상화된 α-헬릭스에서 전형적으로 관찰되는 일회전당 3.6개의 아미노산잔기를 의미한다. 도 1a에서 헬릭스의 대향하는 친수성 및 소수성면이 명백히 도시되며 친수성아미노산은 개방원으로 표시되며 소수성 아미노산 잔기는 음영이진 원으로 표시된다.

도 1b는 도 1a 양친화성 헬릭스에 헬릭스형 네트 다이아그램이다(Lim, 1978, FEBS Lett. 89:10-14). 전형적인 헬릭스형 네트 다이아그램에서 α-헬릭스는 소수성면의 중심을 따라 절단되고 평탄해진 실린더로써 나타난다. 따라서 헬리스의 소수성 모멘트로 측정되는 소수성면의 중심(Eisenberg et al., 1982, Nature 299:371-374)은 도면의 중심에 놓이고 종이면으로부터 상승하도록 배향된다. 절단 및 평탄해지기 이전의 헬릭스형 실린더의 예는 도 1c에 도시된다. 다양한 평면을 따라 실린더를 절단함으로써 동일한 양친화성 헬릭스의 다양한 도면이 관찰되며 헬릭스의 성질에 대한 다양한 정보가 수집된다.

지질의 존재하에서 구조(I)의 코어 펩티드에 의해서 형성된 α-헬릭스의 양결오성이 도 2에 도시된다. 도 2a는 Schiffer-Edmundson 헬릭스형 휘일 다이아그램을 나타내면 도 2b는 소수성면을 보여주는 헬릭스형 네트 다이아그램을 나타내면 도 2c는 친수성면을 보여주는 헬릭스형 네트 다이아그램을 나타낸다. 도 2a, 2b, 2c에서 친수성 잔기는 개방원으로서 표시되며 소수성잔기는 음영이진 원으로 표시된다. 구조(I)의 펩티드 변경 또는 돌연변이된 형태와 관련하여서 특정 아미노산 잔기는 다른 아미노산잔기로 대체될 수 있음으로써 펩티드에 의해 형성된 친수성 및 소수성면이 친수성 및 소수성 아미노산 잔기로 전체적으로 구성될 수 없도록 한다. 따라서 본 발명의 코어 펩티드로 형성된 양경로서 α-헬릭스를 언급할 경우에 "친수성면"은 친수성을 가지는 펩티드의 면을 가리킨다. "소수성면"은 소수성을 가지는 펩티드면을 자칭한다.

구조(I)의 코아 펩티드에 의해 형성된 양친화성 헬릭스의 구조 또는 물성은 활성도에 중요하다. 이러한 성질로는 양경로서 정도, 총소수성, 평균소수성, 친수성 및 소수성 각도, 소수성 모멘트, 평균 모멘트, α-헬릭스의 총 전하가 있다.

도 2a의 헬릭스형 휘일 다이아그램이 구조 1의 코아 펩티드의 양친화성을 시각화해주는 편리한 수단을 제공할지라도 양친화성정도(소수성의 비대칭정도)는 헬릭스의 소수성 모멘트(μ_H)를 계산함으로써 편리하게 정량된다. 특별한 펩티드서열을 계산하는 방법은 당해분야에 공지된다(Eisenberg, 1984, Ann. Rev. Biochem. 53:595-623). 특정 펩티드에 대해서 수득되는 실제 μ_H를 직접 비교하는 것은 정보를 제공하지 못한다.

상이한 길이의 펩티드의 양친화성은 평균 소수성 모멘트(〈μ_H〉)을 수단으로 직접 비교될 수 있다. 평균 소수성 모멘트는 μ_H를 헬릭스에 있는 잔기의 수로 나눔으로써 획득될 수 있다(즉, 〈μ_H〉 = μ_H/N). 일반적으로 Eisenberg의 정규화된 컨센서스 소수성 크기를 사용하여 측정 0.45~0.65의 범위〈μ_H〉를 보이는 코어 펩티드는 본 발명의 범위에 속한다(Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142). 0.65~0.60의 〈μ_H〉가 선호된다.

펩티드의 총 소수성(Ho)은 펩티드에 있는 각 아미노산 잔기의 소수성에 대수적인 합을 취함으로써 쉽게 계산될 수 있다(즉, Ho=Hi). 여기서 N은 펩티드에 있는 아미노산잔기의 개수이고 Hi는 i번째 아미노산 잔기의 소수성이다. 평균 소수성(〈Ho〉)은 아미노산잔기의 수로 나뉘어진다(즉, 〈Ho〉=Ho/N). 일반적으로 Eisenberg의 정규화된 컨센서스 소수성 크기를 사용하여 측정시 -0.050~-0.070의 평균 소수성을 보이는 코어 펩티드는 본 발명의 범위에 속하며 (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142), -0.030 ∼ -0.055의 평균 소수성이 선호된다.

양친화성 헬릭스의 소수성면의 총 소수성(Ho^pho)은 아래에 정의된 소수성각도에 속하는 소수성아미노산 잔기의 소수성의 합을 측정함으로써 습득될 수 있다(즉, Ho^pho=Hi이며 Hi는 앞서 정의한 바와 같고 N_H는 소수성면에 있는 소수성 아미노산의 총수이다). 소수성면의 평균 소수성 (〈Ho^pho〉)은 Ho^pho/N_H이고 N_H는 위에서 정의된 바와같다. 일반적으로 Eisenberg의 정규화된 컨센서tm 소수성 크기를 사용하여 측정시 0.90~1.20의 〈Ho^pho〉를 보이는 코어 펩티드는 본 발명의 범위에 속하며 0.950~1.10 의 〈Ho^pho〉가 선호된다.

소수성각도(pho 각도)는 펩티드가 Schiffer-Edmundson헬릭스형 휘일 표현에 배열될 때 가장 긴 소수성 아미노산 잔기에 연속신장 길이로 덮힌 호 또는 각도로 정의된다(즉, 휘일상의 인접한 소수성 잔기의 개수에 20˚를 곱한). 소수성 각도(pho 각도)는 360˚와 pho 각도의 차이이다(360˚-pho각도). 당해분야 숙련자라면 pho 및 phi 각도가 펩티드에 있는 아미노산잔기의 개수에 달려있음을 알 것이다. 예컨대 도 5a 및 도 5b에서 18개의 아미노산만이 Schiffer-Edmundson 헬릭스형 휘일에 1회전에 해당됨을 알 수 있다. 더 적은수의 아미노산은 휘일에 갭을 남기며 더 많은 수의 아미노산은 휘일의 특정위치가 하나이상 아미노산 잔기에 점유되게 한다.

구조(I)의 코어펩티드와 같이 18개 이상의 아미노산 잔기를 함유한 펩티드의 경우에 소수성 아미노산 잔기의 "연속"스트레치는 두 개이상의 아미노산을 포함한 휘일을 따라 적어도 하나의 아미노산이 소수성 아미노산임을 의미한다.

대체로, 120°내지 160°의 범위의 pho 각을 가지는 18개 또는 그 이하의 아미노산으로 구성된 코어 단백질을 본 발명의 범위에 속한다고 보고, 이때 130° 내지 150°의 각 범위가 적절하다. 18개 이상의 아미노산을 포함하는 구체예예서는 160내지 220˚의 pho각도를 갖는 코어 펩티드가 본 발명의 범위에 속하며, 180 내지 200˚의 pho 각도가 선호된다.

구조(I) 코어펩티드의 구조적 또는 물리적 특성이 도 3 및 도 4 에 도시된다. 도 3b 는 본 발명의 펩티드, 펩티드 210(PVLDLFRELLEELKQKLK; 서열 210)의 헬릭스형 네트 다이아그램으로서 헬릭스의 소수성면을 따른 전하분포를 보여준다. 도 3b에서 헬릭스형 실린더가 소수성면의 중심을 따라 절단되고 평탄해진다. Segrest의 컨센서스 22-mer에 있는 친수성 잔기를 대체하는 3개의 소수성 Leu(L)은 음영이 있다(도 3a). 도 3b에서 알 수 있듯이 양전하를 띤 아미노산 잔기는 헬릭스의 마지막 C-말단에 모인다(C-말단은 종이면의 상부에 있다). 이론에 국한시키는 것은 아니지만, C-말단에 있는 염기성 잔기(잔기 14, 16, 18) 클러스터는 전하(NH₃ ⁺)-헬릭스 쌍극자가 정전기적 인력을 통해 헬릭스를 안정화시킨다. 안정화는 라이신 측쇄와 헬릭스 코어간의 소수성 상호작용을 통해 헬릭스를 안정화시킨다. 안정화는 라이신 측쇄와 헬릭스코어간의 소수성 상호작용을 통해 이루어진다(Groebke et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:4025-4029; Esposito et al., 1997, Biopolymers 41:27-35).

양전하를 띤 C-말단 클러스터를 제외하면 나머지 친수성면상에 음전하가 분포되며 1회전당 하나 이상의 음전하를 띤(산성)아미노산 잔기가 있으므로 헬릭스의 친수성면을 따라 연속 음전하가 스트레치가 존재한다.

도 4b는 코어 펩티드 210(SEQ ID:210)에 의해 형성된 양친화성 헬릭스의 소수성면을 보여주는 헬릭스형 네트 다이아그램이다. 도 4b에서 헬릭스형 실린더는 친수성면의 중심을 따라 절단되고 평탄해진다. 코어 펩티드의 소수성면은 염기성 잔기가 지배적인 마지막 C-말단을 제외하고는 1회전당 두 개의 소수성 잔기로 구성된다. NMR 연구는 유사체 22-mer 펩티드(PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; 서열 4)의 아미노산 잔기 3, 6, 9 및 10 이 헬릭스의 N-말단 근처에 소수성 클러스터를 형성함을 보여준다. phe-6이 이 클러스터에서 중심이고 소수성 클러스터 안정화에 중요한 역할을 한다.

잔기 3, 6, 9 및 10에 의해 형성된 소수성 클러스터는 지질 결합 및 LCAT 활성화에 역할을 한다. 양친화성 펩티드는 소수성면을 지질의 알킬사슬쪽으로 향하게 함으로써 인지질을 결합한다. 따라서 고 소수성 클러스터는 본 발명의 코어 펩티드에서 관찰되는 강한 지질 친화력에 기여한다고 판단된다. 지질결합은 LCAT 활성화에 전제조건이므로 이러한 소수성 클러스터는 LCAT 활성화에 필수적이다.

방향족 잔기는 펩티드와 단백질을 지질에 부착하는데 중요하다(De Kruijff, 1990, Biosci. Rep. 10:127-130; O'Neil and De Grado, 1990, Science 250:645-651; Blondelle et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1202:331-336). 따라서 소수성 클러스터의 중심에 위치한 phe-6은 구조(I)의 코어 펩티드를 지질에 부착하는데 핵심역할을 한다.

본 발명의 코어펩티드와 지질간의 상호작용은 펩티드-지질 복합체 형성을 가져온다. 도 8a에 도시된 바와같이 수득된 복합체의 형태(미셀, 디스크, 소포 또는 다층)는 지질:펩티드 몰비율에 달려있으며, 미셀은 낮은 지질:펩티드 비율에서 형성되며 원판 및 소포 또는 다층 복합체는 지질:펩티드 몰비를 증가시켜 형성된다. 이러한 특성은 양친화성 펩티드(Epand, The Amphipathic Helix, 1993)와 ApoA-I(Jones, 1992, Structure and Function of Apolipoproteins, Chapter 8, pp. 217-250)에도 적용된다. 지질:펩티드 몰비율은 복합체의 크기 및 조성을 결정한다(Section 5.3.1, infra).

구조(I)의 코어 펩티드로 형성된 α-헬릭스의 장축은 곡선형 모양을 가진다. 전형적인 양친화성 헬릭스에서 친수성과 소수성면의 수소결합 길이는 가변적이어서 헬릭스의 소수성면이 오목하게된다(Barlow and Thornton, 1988, J. Mol. Biol. 201:601-619; Zhou et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 33:11174-11183; Gesell et al., 1997, J. Biomol. NMR 9:127-135). 헬릭스 소수성면의 총곡률은 원판형 복합체 결합시 중요할 수 있다. 곡선형 헬릭스는 펩티드가 원판형 입자의 엣지 주변에 더 양호하게 "정합"되게 함으로써 펩티드-디스크 복합체의 안정화를 증가시킨다.

ApoA-I의 일반적으로 허용된 구조 모델에서 양친화성 α-헬릭스는 원판형 HDL의 엣지 주변에 패키징된다(도 8b). 이 모델에서 헬릭스는 지질 아실쇄를 향하는 소수성면과 정렬된다(Brasseur et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta 1043:245-252). 헬릭스는 반대방향으로 평행하게 배열되어서 헬릭스간의 상호작용은 원판형 HDL 복합체의 안정성에 기여한다(Brasseur et al., supra). HDL 원판형 복합체의 안정성에 기여하는 한가지 인자는 산성 잔기와 염기성 잔기간의 이온상호작용의 존재로서, 이것은 인접한 반대방향으로 평행한 헬릭스상의 잔기들간에 분자간 염다리 또는 수소결합을 형성시킨다. 이 모델에서 펩티드는 단일체가 아니라 두 개이상의 다른 이웃하는 펩티드 분자와 상호작용한다(도 8b).

헬릭스의 위치 I와 i+3에서 산성잔기와 염기성 잔기간 분자내 수소결합 또는 염다리 형성은 헬릭스형 구조를 안정화시킨다(Marqusee et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(24):8898-8902).

따라서 구조(I)코어 펩티드의 핵심 특징은 펩티드가 지질에 결합되는 경우에서 처럼 동일 방향을 향하는 소수성면과 반대방향으로 평행하게 정렬될 때 분자간 수소결합을 형성하는 능력과 헬릭스의 N- 및 C-말단 근처에서 분자내 수소결합 또는 염다리를 형성하는 능력이다. 안티패럴한 방식으로 지질에 결합될 때 분자간 또는 분자내 염 다리eHSMS 수소 결합을 형성하기 위해 밀접하게 패킹되고, 이온적으로 상호작용하는 코어 펩티드 구조(i)의 능력이 본 발명의 코어 펩티드의 중요한 능력으로 간주된다.

코어 펩티드가 분자간 펩티드-펩티드 상호작용을 하는 능력은 지질 부재하에서도 관련이 있다. 본 발명의 코어 펩티드는 높은 〈μ_H〉, 〈Ho〉 및 소수성각도 때문에 자체 조합한다(표 1 참조). 자체 조합 현상은 pH, 펩티드 농도 및 이온세기에 달려있으며 모노머형으로부터 멀티머 형까지 여러 조합 상태를 가져온다(도 10a). 펩티드 응집체의 소수성 코어는 지질과 소수성 상호작용에 유리하다. 매우 낮은 농도에서 펩티드가 응집하는 능력은 지질에 대한 결합이 유리하다. 펩티드 응집체의 코어에서도 펩티드-펩티드 상호작용이 일어나며 지질-펩티드 상호작용과 결쟁한다.

위에서 언급된 성질에 추가적으로 소수성 잔기의 총수, 전하는 띤 화학종의 총수 및 펩티드의 총전하와 같은 다른 인자가 활성화에 중요하다.

구조(I) 코어 펩티드의 물성 및 구조적 특징이 표 1 에 제시된다.

표 1

본 발명의 코어 펩티드는 형성된 양친화성 α-헬릭스의 성질은 클래스 A형 양친화성 α-헬릭스, 특히 Segrest 컨센서스 18A형 α-헬릭스과 콘센선스 22-mer 펩티드와 상당히 다르다. 이러한 차이는 도 3-5에서 코어 펩티드 210(서열:210)로 예시된다.

도 4a 및 4c에서 펩티드 210의 소수성면은 Segrest의 18A 펩티드 또는 컨센서스 22-mer의 소수성면 보다 큰 소수성 클러스터를 가진다. 특히 잔기 9 및 13 (도4b에서 음영지역)은 18A펩티드(서열:244)의 전하를 띈 잔기 및 컨센서스 22-mer (서열:75)에 있는 전하를 띤 화학층에 비해서 펩티드 210(서열:210)에서는 소수성 Leu(L) 잔기이다. Segrest 18A 펩티드 및 컨센서스 22-mer의 2개의 전하를 띤 화합종을 소수성 Leu(L) 잔기로 대체하면 헬릭스의 양친화성, 소수성, pho 각도등에 있어서 큰 차이를 가져온다.

구조(I)의 두 가지 코어 펩티드, 즉 펩티드 210(서열:210)와 Segrest 18A 펩티드(서열:244)와 Segrest 컨센서스 22-mer (서열:75)의 물리적 및 구조적 성질 비교가 표2에 제공된다.

표 2

이러한 성질 차이는 활성도에 큰 차이를 가져온다. Segrest 18A 펩티드(서열:244) 및 컨센서스 22-mer(서열:75)는 원 ApoA-I에 비해서 5% 및 10% 정도의 LCAT 활성을 보이지만, 펩티드 210(서열:210)은 원 ApoA-I에 비해서 46% LCAT 활성을 보인다. 펩티드210의 N-말단이 아실화되고, C-말단이 아미데이트화된 펩티드 193(서열 193)는 동일한 검사에서 96% LCAT활성을 보인다.

구조(I) 코어 펩티드에 있는 일부 아미노산 잔기는 특별한 영향을 주지 않고, 많은 경우에 펩티드 활성을 증가시키면서 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 따라서 본 발명은 변경 또는 변이된 형태의 코어(I) 코어 펩티드를 고려하는데, 구조(I) 코어 펩티드에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 본 발명 코어 펩티드의 활성도에 영향을 주는 중요한 특징중의 하나는 지질의 존재하에서 α-헬릭스를 형성하여 양친화성과 위에서 기술된 성질을 보이는 것이므로 본 발명의 구체예에서 아미노산 치환은 보존적이다. 즉 대체하는 아미노산 잔기가 대체되는 아미노산 잔기와 유사한 물성 및 화학적 성질을 갖는다.

보존적 아미노산 치환을 결정할 목적으로 아미노산은 아미노산 측쇄의 물리 화학적 특성에 따라 두가지 범주로 분류될 수 있다 (친수성과 소수성) 이들 두가지 범주는 아미노산 측쇄의 특성을 더욱 구별되게 한정하는 아범주로 더욱 분류될 수 있다. 예컨대 친수성 아미노산 클래스는 산성, 염기성 및 극성 아미노산으로 세분될 수 있다. 소수성 아미노산 클래스는 비극성 및 방향족 아미노산으로 세분될 수 있다. 구조(I)을 한정하는 다양한 아미노산 범주의 정의는 다음과 같다: "친수성 아미노산"은 정규화된 컨센서스 소수성 크기(Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142)에 따라 0 미만의 소수성을 보이는 아미노산이다. 유전공학적으로 인코딩된 친수성 아미노산은 Thr(T), Ser(S), His(H), Glu(E), Asn(N), Gln(Q), Asp(D), Lys(K), Arg(R)을 포함한다.

"산성 아미노산"은 7미만의 측쇄 pk값을 가지는 친수성 아미노산이다. 산성 아미노산은 수소이온의 손실로 인하여 생리적 pH에서 음전하를 띤 측쇄를 보통 가진다. 유전학적으로 인코딩된 산성 아미노산은 Glu(E) 및 Asp(D)을 포함한다.

"염기성 아미노산"은 7미만의 측쇄 pk값을 가지는 친수성 아미노산이다. 염기성 아미노산은 수소이온과 화합됨으로써 생리적 pH에서 양전하를 띤 측쇄를 보통 가진다. 유전학적으로 인코딩된 염기성 아미노산은 His(H), Arg(R) 및 Lys(K)를 포함한다.

"극성 아미노산"은 생리적 pH에서 전하를 띠지 않는 측쇄를 갖지만 두 개이상의 원자에 의해 공유되는 전자쌍이 원자중 하나에 의해 더 밀접하게 유지되는 결합을 갖는 친수성 아미노산이다. 유전학적으로 인코딩된 극성 아미노산은 Asn(N), Gln(Q), Ser(S) 및 Thr(T)을 포함한다.

"소수성 아미노산"은 정규화된 컨센서스 소수성 척도(Eisenberg, 1984, J. Mol. biol. 179:125-142)에 따라 0 이상의 소수성을 보이는 아미노산이다. 유전학적으로 인코딩된 소수성 아미노산은 pro(P), Ile(I), Phe(F), Val(V), Leu(L), Trp(W), Met(M), Ala(A), Gly(G), Tyr(Y)을 포함한다.

"방향족 아미노산"은 적어도 하나의 방향족 또는 헤테로 방향족 환을 가지는 측쇄가 있는 소수성 아미노산이다. 방향족 또는 헤테로 방향족 환은 -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO₂, -NO, -NH₂, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH₂, -C(O)NHR, -C(O)NRR와 같은 하나 이상의 치환체를 포함하며, R은 C(C₁-C₆)알킬, 치환된 (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알케닐, 치환된 (C₁-C₆)알케닐, (C₁-C₆)알키닐, 치환된 (C₁-C₆)알키닐, (C₅-C₂₀)아릴, 치환된 (C₅-C₂₀)아릴, (C₆-C₂₆)알크아릴, 치환된 (C₆-C₂₆)알크알릴, 5-20각형 헤테로 아릴, 치환된 5-20각형 헤테로 아릴, 6-26각형 알크헤테로 아릴, 또는 치환된 6-26각형 알크헤테로 아릴을 포함한다. 유전학적으로 인코딩된 방향족 아미노산은 Phe(F), Tyr(Y), Trp(W)을 포함한다.

"비극성 아미노산"은 생리적 pH에서 전하를 띠지 않으며 두 개의 원자에 의해 공유되는 전자쌍이 두 원자에 의해 동등하게 유지되는 결합을 갖는 측쇄(즉, 비극성)가 있는 소수성 아미노산이다. 유전학적으로 인코딩된 비극성 아미노산은 Leu(L), Val(V), Ile(I), Met(M), Gly(G), Ala(A)을 포함한다.

"지방족 아미노산"은 지방족 탄화수소 측쇄를 갖는 소수성 아미노산이다. 유전학적으로 인코딩된 지방족 아미노산은 Ala(A), Val(V), Leu(L), Ile(I)을 포함한다.

아미노산 잔기 Cys(C)는 다른 Cys(C)잔기 또는 다른 술파닐-함유 아미노산과 디술파이드 브릿지를 형성할 수 있다는 점에서 특이하다. 환원된 자유-SH 또는 산화된 디술파이드 연결형으로 펩티드에 Cys(C)잔기 ( 및 -SH 함유 측쇄를 갖는 다른 아미노산)가 존재하는 능력은 Cys(C) 잔기가 펩티드에 소수성 또는 친수성에 기여하는지 여부에 영향을 미친다. Cys(C)는 Eisenberg의 정규화된 카센서스 척도(Eisenberg, 1984, supra)에 따라 0.29의 소수성을 보이지만 본 발명의 목적을 위해 Cys(C)는 극성 친수성 아미노산으로 분류된다.

상기 범주는 상호 배타적이지 않다. 따라서 두가지 이상의 물리-화학적 성질을 보이는 측쇄를 갖는 아미노산 다중 범주에 포함될 수 있다. 예컨대 Tyr(Y)과 같이 극성 치환체로 더욱 치환된 방향족 부분을 갖는 아미노산 측쇄는 방향족 소수성과 극성 또는 친수성을 둘다 보일 수 있으므로 방향족 및 극성 범주에 포함될 수 있다.

"헬릭스 파괴"아미노산이라 부르는 아미노산 잔기는 헬릭스내에서 내부위치에 포함될 때 α-헬릭스 구조를 파괴한다. 이러한 헬릭스 파괴성을 갖는 아미노산 잔기는 공지이며(Chou and Fasman, Ann, Rev. Biochem. 47:251-276) Pro(P), Gly(G) 및 모든 D-아미노산(L-펩티드에 포함될 경우; 반대로 L-아미노산은 D-펩티드에 포함될 때 헬릭스 구조를 파괴한다)을 포함한다. 이러한 헬릭스 파괴 아미노산 잔기는 Gly(G)를 제외하면 상기 정의된 범주에 속하지만 이들 잔기는 헬릭스내에서 내부위치에서 아미노산 잔기를 치환하는데 사용되서는 안되고 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 1-3아미노산 잔기를 치환하는데에만 사용되어야 한다.

위에서 정의된 범주가 유전학적으로 인코딩된 아미노산에 대해서 예시되지만 아미노산 치환이 유전학적으로 인코딩된 아미노산에 국한될 필요는 없다. 사실상 구조(I)의 선호되는 펩티드는 유전학적으로 비-인코딩된 아미노산을 포함한다. 따라서 자연 발생 유전학적으로 인코딩된 아미노산에 추가해서 구조(I)의 코어 펩티드에 있는 아미노산은 자연발생 유전학적으로 비-인코딩된 아미노산 및 합성 아미노산으로 치환될 수 있다.

구조(I) 코어 펩티드를 치환시키는 아미노산은 β-알라닌(β-Ala)와 3-아미노프로피온산, 2,3-디아미노프로피온산(Dpr), 4-아미노부티르산과 같은 다른 오메가-아미노산; α-아미노이소부티르산(Aib); ε-아미노헥산산(Aha); δ-아미노발레르산(Ava); N-메틸글리신 또는 사코신(MeGly); 오르니틴(Orn); 시트룰린(Cit); t-부틸알라닌(t-BuA); t-부틸글리신(t-BuG); N-메틸이소루신(MeIle); 페닐글리신(Phg); 시클로헥실알라닌(Cha); 노르루신(Nle); 나프틸알라닌(Nal); 4-클로로페닐알라니(Phe (4-Cl)); 2-플루오로페닐알라니(Phe(2-F)); 3-플루오로페닐알라니(Phe(3-F)); 4-플루오로페닐알라닌(Phe(4-F)); 피니실아민(Pen); 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산(TiC); β-2-티에닐알린(Thi); 메티오닐 술폭사이드(MSO); 호모아르기닌(hArg); N-아세틸 아리신(AcLys); 2,4-디아미노부티르산(Dbu); 2,3-디아미노부티르산(Dab); p-아미노페닐알라닌(Phe(pNH₂)); N-메틸 발린(MeVal); 호모시스테인(hCys), 호모페닐알리닌(hPhe) 및 호모세린(hSer); 히드록시프롤린(Hyp), 호모프롤린(hPro), N-메틸화 아미노산 및 펩토이드(N-치환 글리신)을 포함한다.

위에서 정의된 범주에 따른 유전학적으로 인코딩 및 비-인코딩된 아미노산의 분류가 표 3에 요약된다. 언급되지 않은 다른 아미노산 잔기가 상기 정의에 비추어서 관찰된 물성 및 화학적 성질에 기초하여 분류될 수 있다.

표 3

대개의 경우에 구조(I) 코어 펩티드의 아미노산은 L-엔안시오머 아미노산으로 치환되지만 이에 국한되지 않는다. 따라서 L-아미노산이 동일한 D-아미노산으로(예컨대 L-Arg →D-Arg) 또는 동일한 범주나 아범주의 D-아미노산으로(예컨대 L-Arg →D-Lys)으로 대체되는 상황이 "변이" 또는 "변경"된 형태의 정의 포함된다. 사실상 동물에 경구투여에 적합한 구체예에서 펩티드는 하나이상의 D-엔안시오머 아미노산으로 구성될 수 있다. 이러한 D-아미노산 함유 펩티드는 L-아미노산 만으로 구성된 펩티드에 비해서 입안, 창자 또는 혈청에서 분해에 대해 더 안정적이다.

D-아미노산 α-헬릭스 L-펩티드내에서 내부 위치에 포함될 경우 α-헬릭스 구조를 파괴하는 경향이 있다. 결과적으로 D-아미노산 치환은 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 있는 1-3아미노산 잔기에 국한되어야 한다. 적절하게는 N-또는 C-말단에 있는 아미노산만 D-아미노산으로 치환되는 것이다.

구조(I) 코어 펩티드의 Schiffer-Edmundson 헬릭스 휘일 및 헬릭스 네트 다이아그램과 관련해서 기술된 아미노산 잔기 분류와 필요한 성질의 상세한 설명을 사용하여 헬릭스의 양친화성 및 다른 성질을 유지하는 구조(I) 코어 펩티드의 변경 또는 변이된 형태가 수득될 수 있다.

본 발명의 구체에에서 구조(I) 코어 펩티드의 변경 또는 변이된 형태는 구조(I)에 따른 친수성 또는 소수성 잔기를 고정하고 하나 이상의 고정안된 잔기를 또다른 아미노산, 특히 동일 범주나 아범주의 아미노산으로 치환함으로써 수득된다. 염기성 또는 소수성 클러스터를 구성하는 잔기 역시 고정되고 적어도 하나의 고정안된 잔기가 치환될 수 있다.

또다른 구체예에서 구조(I) 코어 펩티드의 변경 또는 변이된 형태가 구조(I)에 따른 헬릭스의 친수성면 내에 위치된 친수성 아미노산 잔기를 고정시키고 고정안된 하나 이상의 아미노산을 또다른 아미노산, 특히 동일 범주나 아범주의 아미노산으로 치환하여 수득된다. 도 2a에서 잔기 1, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18는 구조(I) 코어 펩티드에 의해 형성된 양친화성 헬릭스의 친수성면 내에 위치된다. 이들 잔기 중에서 친수성 또는 소수성일수 있는 잔기 1을 제외하고는 모두 친수성이다. 따라서 선호되는 구체예에서 잔기 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18는 구조(I)에 따라 고정되고 잔기 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17중 적어도 하나는 동일 범주의 또다른 아미노산, 특히 동일 아범주의 아미노산으로 치환된다. 혹은 잔기1이 구조(I)에 따라 고정되고 잔기 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16중 적어도 하나가 치환된다.

한 구체예에서 C-말단 염기성 클러스터 (잔기 14, 16, 18)가 구조(I)에 따라 고정되고 잔기 2, 3, 5, 6, 9,10, 13, 17만이 치환된다.

한 구체예에서 소수성 클러스터(잔기 3, 6, 9, 10)가 구조(I)에 따라 고정되고 잔기 2, 3, 5, 13, 16, 17만이 치환된다.

또다른 구체예에서 염기성 및 소수성 클러스터가 모두 고정되고 잔기 2, 5, 13, 17이 치환된다.

본 발명의 또다른 구체예에서 코어 펩티드의 변경 또는 변이된 형태는 헬릭스의 소수성면 내에 위치된 소수성 아미노산 잔기를 고정하고 고정 안된 아미노산 잔기를 또다른 아미노산 잔기, 특히 동일 범주나 아범주의 아미노산으로 치환시켜 수득된다.

도 2a에서 잔기 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 16, 17이 소수성면 내에 위치된다. 이들은 친수성인 잔기 16을 제외하고 모두 소수성이다. 따라서 한 구체예에서 잔기 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 17이 구조(I)에 따라 고정되고 잔기 1, 4, 7, 8, 11, 12, 14, 15, 16, 18중 적어도 하나의 아미노산이 또다른 아미노산, 특히 동일 범주 또는 아범주의 아미노산으로 치환된다.

한 구체예에서 C-말단 염기성 클러스터(잔기 14, 16, 18) 역시 고정되고 단지 1, 4, 7, 8, 11, 12 또는 15만이 치환된다.

또다른 구체예에서 구조(I) 펩티드의 변경 또는 변이된 형태는 헬릭스의 소수성 또는 친수성면내에 있는 모든 아미노산 잔기를 고정하고 다른면에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 또다른 아미노산 잔기로 보존적으로 치환시켜 수득된다. 소수성 클러스터 또는 염기성 클러스터를 구성하는 잔기는 구조(I)에 따라 고정된다.

또다른 구체예에서 구조(I)의 변경 또는 변이된 형태는 적어도 하나의 아미노산은 비-보존적 아미노산으로 치환시켜 수득된다. 이러한 치환된 헬릭스의 양친화성 또는 구조적 성질을 변경시켜서는 안된다. 따라서 헬릭스의 전체 성질을 보존하기 위해서 한쌍 이상의 아미노산을 치환시킬 필요가 있을 수 있다. 게다가 아미노산 치환 선택을 위한 가이드는 표10에 열거된 펩티드 서열에 의해 제공된다. (Section 8.3 참조)

또다른 구체예에서 구조(I) 코어 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 처음 1 내지 4개의 아미노산 잔기가 α-헬릭스 2차 구조에 안정성을 부여하는 것으로 알려진 하나 이상의 펩티드 세그멘트("단부-캡" 잔기 또는 세그멘트) 또는 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환된다. 이러한 단부-캡 잔기 및 세그멘트는 공지이다. (Richardson and Richardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper et al., 1993, Biochemistry 32(30):7605-7609; Dasgupta and Bell, 1993, Int. J. Peptide Proteon Res. 41:499-511; Seale et al., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig et al., 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou et al., 1994, Proteins 18:1-7; Doig and Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert er al., 1995, Biochemistry 34:12820-12829; Petrukhov et al., 1996, Biochemistry 35:387-197; Doig et al., 1997, Protein Science 6:147-155) 혹은 구조(I)의 첫 번째 1 내지 4개의 N-말단 또는 C-말단 아미노산 잔기가 단부-캡 잔기 또는 세그멘트의 구조나 성질을 모방하는 펩티드 모방물로 대체될 수 있다. 적당한 단부-캡 모방물은 공지이다(Richardson and Richardson, 1988, Science 240:1648-1652; Harper et al., 1993, Biochemistry 32(30) : 7605-7609; Dasgupta and Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41:499-511; Seale et al., 1994, Protein Science 3:1741-1745; Doig et al., 1994, Biochemistry 33:3396-3403; Zhou et al., 1994, Proteins 18:1-7; Doig and Baldwin, 1995, Protein Science 4:1325-1336; Odaert et al., 1995, Biochemistry 34:12820-12829; Petrukhov et al., 1996, Biochemistry 35:387-397; Doig et al., 1997, Protein Seience 6:147-155).

구조(I)가 22개의 특정 아미노산 잔기 위치를 포함하지만 본 발명의 코어 펩티드는 22개 미만의 아미노산 자기를 포함할 수 있다. 사실상 구조(I) 코어 펩티드에 의해 형성된 양친화성 헬릭스의 모든 특성을 유지하면서 18개 미만 또는 심지어 15개 미만의 아미노산 잔기는 포함하는 구조(I)의 절단 또는 내부 삭제된 형태가 본 발명의 범주내에서 고려된다.

구조(I) 펩티드의 절단된 형태는 구조(I)의 N-말단 또는 C-말단으로 부터 하나 이상의 아미노산을 제거함으로써 수득된다. 구조(I)의 내부 삭제된 형태는 구조(I) 펩티드의 내부 위치로 부터 하나 이상의 아미노산을 제거함으로써 수득된다. 제거된 내부 아미노산 잔기는 보존성 잔기일 수도 있다.

구조(I) 코어 펩티드로 부터 내부 아미노산을 제거하면 제거 지점에서 헬릭스의 친수성-소수성 계면을 100°회전시킨다. 이러한 회전은 헬릭스의 양친화성을 크게 변경시킬수 있으므로 본 발명의 구체예에서 아미노산 잔기는 헬릭스의 전체 장축을 따라 친수성-소수성 계면의 정렬을 유지하도록 제거된다.

이것은 하나의 완전환 헬릭스권선이 제거되도록 충분한 수의 보존성 또는 아미노산 잔기를 제거함으로써 달성될 수 있다. 이상화된 α-헬릭스는 1회전당 3.6 잔기를 포함한다. 따라서 한 구체에에서 3-4개의 아미노산 잔기가 제거된다. 제거되는 아미노산의 수가 3개인지 또는 4개인지의 여부는 제거될 제 1 잔기의 헬릭스내 위치에 달려 있다. 양친화성 헬릭스내 특정 시작점으로 부터 하나의 완전한 헬릭스권선을 형성하는 보존성 또는 비보존성 아미노산 잔기의 수를 결정하는 것은 당해 분야 숙련자에 의해 가능하다.

구조(I) 코어 펩티드의 C-말단에서 염기성 클러스터의 헬릭스 안정화 역할과 지질 결합 및 LCAT 활성화에 소수성 클러스터의 역할 때문에 본 발명의 구체에에서 염기성 및 소수성 클러스터를 구성하는 잔기는 제거되지 않는다. 따라서 한 구체예에서 잔기 14, 16, 18(염기성 클러스터)와 잔기 3, 6, 9 및 10(소수성 클러스터)는 제거되지 않는다.

구조(I) 코어 펩티드는 펩티드의 구조 또는 기능을 방해하지 않고 심지어 증진시키도록 양 말단, 한 말단 또는 내부가 추가 아미노산 잔기에 의해 확장될 수 있다. 19, 20, 21, 22 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 함유한 확장된 코어 펩티드도 본 발명의 범주에 속한다. 이러한 확장된 펩티드는 구조(I) 펩티드의 양친화성과 다른 성질을 유지할 것이다. 물론 아미노산을 내부에 첨가하면 내부 삭제의 경우와 유사하게 친수성-소수성 계면을 회전시킬 것이다. 따라서 내부 삭제와 관련하여 기술된 고려가 내부첨가에도 적용된다.

한 구체예에서 코어 펩티드는 하나 이상의 헬릭스 전선만큼 N-또는 C-말단에서 연장된다. 이러한 연장은 앞서 기술된 단부-캡 아미노산 및 세그멘트 처럼 지질의 존재하에 헬릭스형 2차 구조를 안정시킬 것이다.

선호되는 구체예에서 구조(I) 펩티드는 C-말단에서 단일한 염기성 아미노산 자기, 특히 Lys(K)에 의해 확장된다.

ApoA-I 작용제의 "블로킹된" 형태, 즉 N-말단 -NH₂또는 C-말단 -C(O)OH 와 반응할수 있는 부분으로 N-말단 또는 C-말단이 블로킹된 ApoA-I 작용제도 본 발명의 범주에 속한다. 18개 이하의 아미노산 잔기를 함유한 본 발명 ApoA-I 작용제의 C-또는 N-말단 전하를 제거하면 (N-아실화 펩티드 아미드/에스테르/히드라지드/알콜을 합성하고 이를 치환함으로써) 비-블로킹된 작용제의 활성도와 유사한 또는 능가하는 작용제가 생성된다. 예를 들면, 펩티드 210(서열 210)은 고유 ApoA-I의 것과 비교하였을 때 46% LCAT 활성을 보이고, 이 펩티드의 N- 및 C-말단이 차단된 펩티드, 즉 펩티드 193(서열 193)은 동일한 검사에서 96% LCAT 활성을 보인다. 22개 이상의 아미노산을 함유한 경우에 N-말단 또는 C-말단의 블로킹을 비-블로킹 형태보다 낮은 활성도의 ApoA-I 작용제가 생성된다. 그러나, 22개 이상의 아미노산으로 구성된 ApoA-I의 N-말단과 C-말단을 둘다 블로킹하면 활성도를 회복한다. 따라서, 선호되는 구체예에서 18개 이항의 아미노산을 함유한 코어 펩티드의 N-말단 또는 C-말단 (특히 두 개의 말단모두)은 블로킹되지만 18개 이상의 아미노산을 함유한 코어 펩티드의 N- 및 C-말단은 둘다 블로킹되거나 둘다 블로킹되지 않는다. 전형적인 N-말단 블로킹 그룹은 RC(0)-이며, R은-H, (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알케닐,(C₁-C₆)알키닐, (C₅-C₂₀)아릴, (C₆-C₂₆)알크아릴, 5-20 각형 헤테로아릴 또는 6-26 각형 알크헤테로아릴을 포함한다. 선호되는 N-말단 블로킹 그룹은 아세틸, 포밀, 및 댄실을 포함한다. 전형적인 C-말단 블로킹 그룹은 -C(O)NRR 및 -C(O)OR을 포함하고 여기서 R은 위에서 정의된 바와 같다. 선호되는 C-말단 블로킹 그룹은 R이 메틸인 것이다. 이러한 말단 블로킹그룹은 지질의 존재하에서 α-헬릭스를 안정시킨다(Venkatachelapathi et al., 1993, PROTEINS:Structure, Function and Genetics 15:349:359).

ApoA-I의 원래 구조는 지질에 결합하는 작용을 하는 8개의 헬릭스 단위를 포함한다(Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092; Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10248-10262; Vanloo et al., 1991, J. Lipid Res. 32:1253-1264; Mendez et al., 1994, J. Clin. Invest. 94:1698-1705; Palgunari et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:328-338; Demoor et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239:74-84). 따라서 발표된 코어 펩티드의 이합체, 삼합체, 사합체 및 폴리머("멀티머")로 구성된 ApoA-I 작용제로 본 발명에 포함된다. 이러한 멀티머는 탠덤 반복물, 브랜치형 네트워크 또는 이의 조합형태이다. 코어 펩티드는 하나 이상의 링커에 의해 서로 부착되거나 분리된다.

멀리머를 구성하는 코어 펩티드는 구조(I)의 펩티드, 구조(I) 상동물, 구조(I)의 변이된 형태, 구조(I)의 절단 또는 내부삭제된 형태, 구조(I)의 연장된 형태 또는 이의 조합일 수 있다. 코어 펩티드는 헤드-투-테일 방식(N-말단-C-말단), 헤드-투-헤드 방식(N-말단-N-말단), 테일-투-테일 방식(C-말단-C-말단)으로 연결될 수 있다.

한 구체에에서 멀티머는 두 개, 세 개, 네 개 및 10 최대 10개의 코어 펩티드의 탠덤 반복물이다. 특히 멀티머는 2 내지 8개의 코어 펩티드의 탠덤 반복물이다. 따라서 한 구체예에서 본 발명의 ApoA-I 작용제는 다음 구조식을 가지는 멀티머이다:

(II) HH｛LL_m-HH｝_nLL_m-HH

여기서 m은 0 또는 1 , 특히 1이고;

n은 0 내지 10, 특히 0 내지 8의 정수이고;

각"HH"는 구조(I)의 코어 펩티드 또는 펩티드 상동물, 변이, 절단, 내부 삭제 또는 연장된 형태를 나타내며;

"LL"은 링커이고;

" - "은 공유 결합이다.

구조(II)에서 링커(LL)는 두 개의 펩티드를 서로 연결시킬수 있는 2작용성 분자이다. 따라서 적당한 링커는 펩티드의 N-또는 C-말단에 공유결합될 수 있는 작용기를 갖는 분자이다. 펩티드의 N-또는 C-말단에 부착하기에 적합한 작용기는 공유 결합을 형성시킨다.

링커는 멀티머의 필요한 성질에 따라 신축성, 강성 또는 반-강성일 수 있다. 적당한 링커는 Pro 또는 Gly 와 같은 이미노산 잔기, 2 내지 5, 10, 15, 25 또는 그 이상의 아미노산을 함유한 펩티드 세그멘트, H₂N(CH₂)_NCOOH (n은 1 내지 12의 정수)와 같은 그작용성 유기 화합물을 포함한다. 이러한 링커와 그 제조방법 및 이러한 링커를 포함한 펩티드 제조방법은 공지이다. (Hunig et al., 1974, Chem. Ber. 100:3039-3044; Basak et al., 1994, Bioconjug. Chem. 5(4):301-305).

한구체에에서 탠덤 반복물은 단일 프롤린 잔기에 의해 내부가 중단된다. 이러한 목적으로 코어 펩티드가 N-또는 C-말단에서 프롤린으로 종결되는 경우에 (X₁이 구조(I)에서 Pro(P)인 경우에) 구조(II)에서 m은 0이다. 코어 펩티드가 N-말단 또는 C-말단 프롤린을 포함하지 않는 경우에 LL은 Pro(P) 또는 D-Pro(P)이고, m은 1이다.

한 구체예에서 특정조건하에서 하나 이상의 헬릭스 세그멘트(HH)를 방출시킬 수 있는 절단가능한 링커를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 절단가능한 링커는 프로테아제에 의해 식별되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 엔도누클레아제에 의해 절단되는 올리고누클레오티드 및 산성, 염기성 또는 다른 조건하에서 화학적 수단에 의해 절단될 수 있는 유기화합물을 포함한다. 특히 헬릭스 세그멘트 또는 멀티머 ApoA-I 작용제를 구성하고 절단안된 링커를 변성 또는 분해시키지 않도록 절단 조건은 비교적 온화하다.

선택적으로 절단될 수 있는 펩티드 및 올리고누클레오티드 링커와 링커 절단 수단은 당해분야에 알려진다. 선택적으로 절단될 수 있는 유기화합물 링커는 예컨대 WO 94/08051에 발표된다.

한 구체예에서, 사용된 링커는 내부 순환 효소에 대한 기질이어서 멀티머 ApoA-I 작용제가 생체내에서 선택적으로 절단될 수 있게 하는 펩티드이다. 링커 절단에 적합한 내부 효소는 프로아포리포프로테인 A-I 프로펩티드아제를 포함한다. 이러한 효소에 대해 기질로 작용하는 펩티드 세그멘트와 효소는 당해 분야에서 공지이다(Edelstein et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:11430-11433; Zanis, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2574-2578).

본 발명 코어 펩티드의 핵심 특징은 안티-평행 방식으로 배열될 때 분자내 수소결합 또는 염다리를 형성하는 능력이다. 따라서 한 구체예에서 충분한 길이 및 신축성의 링커가 사용되어서 구조(Ⅱ)의 헬릭스 세그멘트(HH)를 안티-평행 방식으로 정렬시켜 지질의 존재하에서 분자내 수소결합 또는 염다리를 형성할 수 있다.

적당한 길이 및 신축성의 링커는 Pro (P), Gly (G), Cys-Cys, H2N-(CH₂)n-COOH(n은 1 내지 12, 특히 4 내지 6이다) H₂N-아릴-COOH 및 탄수화물이다.

원래의 아포리포단백질은 안티-평행 헬릭스 세그멘트간의 상호 결합을 허용하므로 일차 서열에서 원래의 아포리포단백질(ApoA-I, ApA-Ⅱ, ApoA-Ⅳ, ApoC-I, ApoC-Ⅱ, ApoC-Ⅲ, ApoD, ApoE 및 ApoJ를 포함하는)의 인접한 헬릭스를 연결하는 펩티드 세그멘트에 대응하는 펩티드 링커가 코어 펩티드 연결에 사용될 수 있다. 서열은 공지이다(Rosseneu et al., "Analysis of the Primary and of the Secondary Structure of the Apolipoproteins," In: Structure and function of Lipoproteins, Ch. 6, 159-183, CRC Press, Inc., 1992).

안티-패럴 헬릭스 세그멘트의 탠덤 반복물간에 분자내 수소결합 또는 염다리를 형성할 수 있는 다른 링커는 β-턴, r-턴과 같은 펩티드 역전 턴(turn)과 펩티드 β-턴 또는 r-턴의 구조를 모방하는 유기화합물을 포함한다. 일반적으로 역전 턴은 단일한 폴리펩티드 사슬이 안태패럴 β-쉬이트 또는 안티패럴(antiparallel) α-헬릭스 구조가 되도록 폴리펩티드 사슬의 방향을 역전시키는 펩티드 세그멘트이다. β-턴은 4개의 아미노산 잔기로 구성되고 r-턴은 3개의 아미노산 잔기로 구성된다.

펩티드 β-턴의 구조 및 서열은 공지이며 type-I, type-I', type-Ⅱ, type-Ⅱ', type-Ⅲ, type-Ⅲ', type-Ⅳ, type-Ⅳ', type-Ⅴ, type-Ⅴ', type-Ⅵa, type-Ⅵb, type-Ⅶ 과 type-Ⅷ을 포함한다(Richardson, 1981, Adv. Protein Chem. 34:167-339; Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol. 206:759-777; tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6:382-394).

β-턴과 같은 짧은 펩티드 턴의 구조는 턴에 있는 아미노산 잔기(Gly, Asn 또는 Pro)의 위치에 달려있다. 일반적으로 타입-I β-턴은 턴의 1 내지 4번 위치에서 모든 아미노산 잔기와 양립할 수 있지만 Pro는 3번위치에 있을수 없다. Gly는 4번 위치에 우세하며 Pro는 타입-I 및 타입-Ⅱ턴에서 2번 위치에서 우세하다. Asp, Asn, Ser 및 Cys 잔기는 1번 위치에서 빈번히 나타나며 이의 측쇄는 잔기 3의 NH에 자주 수소결합된다.

타입-Ⅱ턴에서 Gly 및 Asn 은 필요한 골격 각도를 쉽게 제공하므로 3번 위치에서 가장 빈번하게 나타난다. 타입-I'턴은 2번 및 3번 위치에서 Gly를 가지며 타입-Ⅱ'턴은 2번위치에서 Gly를 가진다. 타입-Ⅲ턴은 2번 및 3번위치에서 Gly를 필요로 한다. 타입-VIa 및 VIbxjs은 시스 펩티드 결합과 내부 잔기로서 Pro를 가진다. 단백질 및 펩티드의 β-턴 서열 및 종류는 공지이다(Wilmot et l., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232).

펩티드 r-턴의 구조 및 서열도 공지이다(Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37:1-109; Wilmer-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. 12:189-192; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203:221-232; Sibanda et al., 1989, Proteins: Struc. funct. Genet. 6:382-394). 모든 형태의 β-턴 및 r-턴의 구조 및 서열이 본 발명에서 고려된다.

링커(LL)는 펩티드 β-턴 또는 r-턴의 구조를 모방하는 유기 분자를 포함할 수 있다. 이러한 β-턴 또는 r-턴 모방물과 이러한 부분을 포함한 펙티드 합성 방법은 공지이다(Giannis and Kolter, 1993 Angew. Chem. Intl. Ed. Eng. 32:1244-1267; Kahn et al., 1988, J. Molecular Recognition 1:75-79; and Kahn et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28:1623-1626).

또다른 구체예에서 멀티머는 브랜치형 네트워크 형태이다(도 7 참조). 이러한 네트워크는 2개 이상의 헬릭스단위가 연결부위에 부착되게 하는 다기능 연결부위를 사용하여 수득된다. 따라서 브랜치형 네트워크는 펩티드의 N-또는 C-말단에 공유결합할 수 있는 3, 4 또는 그 이상의 작용기를 갖는 분자를 사용한다. 적당한 연결부분은 Ser(S), Thr(T), Cys(C), Tyr(Y), Asn(N), Gln(Q), Lys(K), Arg(R), Orn, Asp(D) 및 Glu(E)와 같이 히드록실, 술파닐, 아미노, 카르복실, 아미드 또는 에스테르기 함유 측쇄를 가지는 아미노산 잔기나 이러한 작용기 함유 유기분자를 포함한다.

단일 연결부분에 부착되는 헬릭스 세그멘트는 말단을 통해 부착될 필요는 없다. 한 구체예에서 헬릭스 세그멘트는 안티패럴 방식으로 정렬되도록 단일 연결부분에 부착된다. 즉, 일부 헬릭스는 N-말단 또는 C-말단을 통해 부착된다.

헬릭스 세그멘트는 연결부분에 직접 부착되거나 하나이상의 2작용성 링커(LL)를 수단으로 연결 부분으로부터 거리가 떨어질 수 있다.

도 7a 및 7b에서 브랜치형 네트워크는 네트워크를 구성하는 "노드"의 수로 기술되며 각 다기능성 연결부분은 노드를 구성한다. 도 7a 및 7b에서 헬릭스 세그멘트(즉 본 발명의 코어 세그멘트)는 실린더로 도시되면 다기능성 연결부분(또는 노드)는 원()으로서 도시되며 원으로부터 나오는 라인의 수는 다기능성 연결부분의 작용기수("차수")를 나타낸다.

네트워크에서 노드의 수는 헬릭스 세그멘트의 필요한 총수에 달려있으며 보통 1내지 2개이다. 주어진 개수의 헬릭스 세그멘트에서 더 높은 차수의 연결부분을 갖는 네트워크는 더 적은 수의 노드를 가진다. 예컨대 도 7a, 7b에서 7개의 헬릭스단위로된 3차 네트워크(즉, 3작용성 연결부분을 갖는)는 3개의 노드를 가지지만(도 7a) 7개의 헬릭스 단위로 구성된 4차 네트워크(즉, 4작용성 연결부분을 갖는)는 단지 2개의 노드를 가진다(도 7b).

네트워크는 균일한 차수를 가질 수 있다(즉, 모든 노드가 3작용성 또는 4작용성 연결부분을 가진다). 네트워크는 혼성차수를 가질 수 있다(즉, 노드는 3작용성 및 4작용성 연결부분의 혼합이다). 물론 균일한 차수의 네트워크에서 조차도 여결부분이 동일할 필요는 없다. 4차 네트워크는 2, 3, 4 또는 그 이상의 상이한 3작용성 연결부분을 가질 수 있다.

선형 멀티머처럼 브랜치형 네트워크를 구성하는 헬릭스 세그멘트는 동일할 필요는 없다.

이러한 혼성차수 브랜치형 네트워크의 예가 도 7c에 도시된다. 도 7c에서 헬릭스 세그멘트(즉 본 발명의 코어 펩티드)가 실린더로서 도시되며 다기능성 연결부분은 원()으로서 도시되며 원에서 나오는 라인의 수는 "차수"를 나타낸다. 헬릭스 세그멘트를 연결하는 라인은 2작용성 링커 LL를 나타낸다. 브랜치형 네트워크를 구성하는 헬릭스 세그멘트는 코어 펩티드의 탠덤 반복물일 수 있다.

한 구체예에서 본 발명의 브랜치형 네트워크는 다음식으로 표시된다:

(III) X-N_ya-X_(ya-a)-(-N_yb-X_(yb-1))_p

여기서 X는 HH-(-LLm-HH-)-nLLm-HH 이며; HH는 구조(I)의 코어 펩티드 또는 상동물, 변이, 절단, 내부삭제, 또는 연장된 형태일 수 있으며,

LL은 2작용성 링커이며;

m은 0 또는 1;

n 은 0 내지 8의 정수;

N_ya및 N_yb는 다작용성 연결부분이고, ya와 yb는 N_ya와 N_yb상의 작용기 개수를 나타내며;

ya 또는 yb는 3 내지 8의 정수이고;

p는 0 내지 7의 정수;

"－"는 공유결합을 나타낸다.

한 구체예에서 브랜치형 네트워크는 "Lys-트리"를 포함한다. 즉 다작용성 연결부분이 하나 이상의 Lys (K)잔기이다(도 7d).

또 다른 구체예에서 "Lys 트리"브랜치형 네트워크는 다음 구조식을 표현된다.

각 HH는 독립적으로 구조(I)의 코어 펩티드 또는 펩티드 유사체이거나, 돌연변이되거나, 절단되거나, 내부에 결손이 일어나거나, 또는 전술한 것과 같이 이의 확장된 형태가 되고;

각 LL은 독립적으로 이중기능 링크가 되고;

각 n은 독립적으로 0 내지 1의 인테그러가 되고;

각 m은 독립적으로 0 내지 1의 정수가 되고;

R1은 -OR 또는 -NRR이 되고;

각 R은 독립적으로 -H, (C₁-C₆) 알킬, (C₁-C₆)알케닐, (C₁-C₆) 알키닐, (C₅-C₂₀)아릴, (C₁-C₂₆) 알카릴, C_5-20헤테로아릴, 또는 C6-26 아케테로아릴이다.

5.1.1. 구조 및 기능의 분석

전술한 다중결합 형태를 포함하여 코어 펩티드로 이루어진 ApoA-I 작용제를 비롯하여 본 발명의 코어 펩티드 또는 펩티드 유사체의 구조 및 기능을 분석하여 ApoA-I의 활성 작용제 또는 모방제를 선택할 수 있다. 가령, 코어 펩티드 또는 펩티드 유사체는 지질하에서 α-이중헬릭스의 형성능력, 지질과의 결합능력, 지질과의 복합체 형성능력, LCAT 활성화능력, 콜레스테롤 유출능력을 분석할 수 있다.

펩티드의 구조와 기능을 분석하는 방법 및 분석법은 당분양에 공지된 것이다. 적절한 구체예는 작업 실시예로 제시한다. 가령, 섹션 7에서 밝힌 순환 이색성(CD) 및 핵 자기공명(NMR)분석을 이용하여 펩티드 또는 펩티드 유사체의 구조, 특히 지질존재하의 헬리시티의 정도를 분석할 수 있다. 지질에 결합하는 능력은 섹션 7에서 밝힌 형광분광계수법을 이용하여 결정할 수 있다. 펩피드 또는 펩티드 유사체의 LACT 활성화 능력은 섹션 8에서 밝힌 LCAT 활성화를 이용하여 쉽게 결정할 수 있다. 섹션 9, 10, 11에서 밝힌 시험관내 및 생체내 분석을 이용하여, 반감기, 분산, 클레스테롤 유출, RCT에 대한 효과를 평가하였다.

일반적으로, 표 4상의 성질을 나타내는 본 발명에 따른 코어 펩티드 또는 펩티드 유사체는 활성인 것으로 간주한다.

표 4

Ri는 지질:펩티드 몰농도다

작업 실시예(아래쪽)에서 밝힌 바와 같이, 높은 수준의 LCAT 활성(≥ 60% 헬릭스형 구조(막히지 않은 펩티드가 22이상의 아미노산을 포함하고, 막힌 펩티드는 18개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 경우); ≥ 40% 헬릭스형구조(막히지 않은 펩티드가 18개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 경우)를 보유하고, LCAT 활성을 보이지 않는 펩티드는 α-헬릭스구조를 거의 보유하지 않는다. 하지만, 특정한 경우에, 지질존재하의 상당한 헬릭스형 구조를 보이는 펩티드는 LCAT 효과를 그다지 나타내지 않는다.

유사하게, 상당한 LCAT 활성을 보이는 코어 펩티드는 전형적으로 지질에 결합하지만, 특정한 경우에, 지질결합을 보이는 펩티드는 LCAT 활성화효과를 그다지 나타내지 않는다.

결과적으로, 당업자가 인식하는 바와 같이, 이 글에서 밝힌 코어 펩티드의 α-헬릭스형성능력(지질존재하에서)및 지질결합능력은 활성화에 매우 중요한데, 많은 경우에는, 이들 성질이 충분하지 못하다. 따라서, 적절한 구체예에서, 본 발명의 코어 펩티드는 일련의 선별과정을 거쳐, 상당한 제약학적 활성을 보이는 코어 펩티드를 선별하였다.

제 단계로, 코어 펩티드는 지질존재하에서, 섹션7(아래쪽)에서 밝힌 CD 분석을 이용하여 α-헬릭스형성능력을 선별하였다. 지질존재하에서(대략 5μM농도, 지질:펩티드 몰농도는 30), 적어도 40%헬릭스 (막히지 않은 펩티드가 18개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 경우) 또는 60%헬릭스(막히지 않은 펩티드가 22이상의 아미노산을 포함하고, 막힌 펩티드는 18개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 경우)는 섹션7(아래쪽)에서 밝힌 형광분석을 이용하여 지질결합능력을 선별하였다. 물론 형광 Trp(W) 또는 Nal 잔기를 보유한 코어 펩티드만 형광을 통한 지질결합을 선별하였다. 하지만, 형광잔기를 보유하지 않는 펩티드의 경우에, 지질존재하에 헬리시티가 증가하는 경우, 지질에 대한 결합은 명확하다.

이후, SUV(0.5-10 μM 펩티드, 지질:펩티드 몰농도비는 1 내지 50)존재하에, 지질결합을 보이는 코어 펩티드는 약물활성을 선별하였다. 물론, 선별된 약물활성은 ApoA-1 작용제의 원하는 용도에 따라, 달라진다. 적절한 구체예에서, 코어 펩티드는 LCAT 활성화능력을 선별하는데, 그 이유는 LCAT를 활성화시키는 펩티드는 이 글에서 제시한 방법에 유용하기 때문이다. 사람의 자연 ApoA-1과 비교하여(섹션 8에서 제시한 LCAT 활성화분석법을 이용하여 결정함), 적어도 38% LCAT 활성화를 보이는 코어 펩티드가 바람직하며, 좀더 적절하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%이상이 된다.

5.1.2. 적절한 구체예

본 발명의 ApoA-I 작용제는 구조 (I)에 따른 22개의 아미노산 펩티드이거나, 또는 이의 N-말단이 아실화되거나, C-말단이 아미드화되거나 또는 에스테르화된 형태가 된다.

다른 적절한 구체예에서, ApoA-1 작용제는 구조 (I)에 따른 18개의 아미노산 펩티드이거나, 또는 이의 N-말단이 아실화되거나, C-말단이 아미드화되거나 또는 에스테르화된 형태가 되는데, 이런 형태에서,

X₂는 Ala(A), Val(V) 또는 Leu(L)이고;

X₄는 Asp(D) 또는 Glu(E)이고;

X₇은 Arg(R), Orn 또는 Lys(K)이고;

X₈은 Asp(D) 또는 Glu(E)이고;

X₁₁은 Glu(E) 또는 Asn(N)이고;

X₁₂는 Glu(E)이고;

X₁₄는 Arg(R), Leu(L), Orn 또는 Lys(k)이고;

X₁₆은 Arg(R), Lys(K), Orn이고;

X₁₈은 Arg(R), Lys(K), Orn이고;

X₁, X₃, X₅, X₆, X₉, X₁₀, X₁₃, X₁₅, X₁₇는 이전에 구조(I)에서 정의한 바와 같다.

또 다른 적절한 구체예에서, ApoA-I 작용제는 구조 (I)에 따른 18개 아미노산 펩티드, 또는 이의 N-말단이 아실화되거나, C-말단이 아미드화되거나 또는 에스테르화된 형태가 되는데, 이런 형태에서, X₁₁은 Asn(N)인 경우, X₁₄는 Leu(L)이고, X₁₁은 Asn(N)이 아닌 경우, X₁₄는 Leu(L)가 아니다. 본 발명의 이런 특징에 따른 특히 선호되는 구체예는 이들 펩티드이거나, 또는 이의 N-말단이 아실화되거나, C-말단이 아미드화되거나 또는 에스테르화된 형태가 되는데, 이런 형태에서, 구조(I)상의 다양한 Xn은 전술한 바와 같이 정의한다. 본 발명의 이런 특징에 따른 특히 선호되는 전형적인 구체예는 펩티드 209(PVLDLFRELLNELLQKLK; SEQ ID NO:209), 그리고 이의 N-말단이 아실화되거나, C-말단이 아미드화되거나 또는 에스테르화된 형태이다.

또 다른 적절한 구체예에서, ApoA-I 작용제는 구조(I)에 따른 펩티드의 변형 또는 돌연변이된 형태이거나, 또는 이의 N-말단이 아실화되거나, C-말단이 아미드화되거나 또는 에스테르화된 형태가 되는데, 이런 형태에서,

X₁은 Asp(D)가 아니고;

X₉는 Gly(G)가 아니고;

X₁₀은 Gly(G)가 아니고;

X₁₂는 Leu(L)가 아니고;

X₁₃은 Gly(G)가 아니고;

또 다른 적절한 구체예에서, ApoA-I 작용제는 아래와 같은 펩티드에서 선택된다.

N-말단 또는 C-말단중 한 곳이 막히거나 또는 막히지 않은 형태.

또 다른 적절한 구체예에서, 본 발명의 ApoA-I 작용제는 구조 II, Ⅲ 또는 Ⅳ에 따른 다중결합 형태인데, 구조 IV에서 HH는 구조 (I)에 따른 펩티드, 또는 이의 N-말단이 아실화된 또는 C-말단이 아미드화 또는 에스테르화된 형태, 또는 이 글에서 밝힌 구조 (I)에 따른 적절한 펩티드 중의 하나가 된다.

또 다른 적절한 구체예에서, ApoA-I 작용제를 구성하는 코어 펩티드는 다음의 펩티드가 아니다.

적절한 최종구체예에서, ApoA-I 작용제는 표5(섹션8.3, 아래쪽)에서 제시한 펩티드가 아닌데, 표5의 펩티드는 사람 천연 ApoA-I와 비교할 때, LCAT 활성화활동력이 38% 미만이다.

5.2 ApoA-I 작용제의 합성 및 정제.

본 발명의 코어 펩티드는 펩티드 제조를 위한 임의의 공지된 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 가령, 펩티드는 통상적인 계단식 용액 또는 고형상 펩티드 합성, 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조한다.

5.2.2 화학적 합성

코어 펩티드는 통상적인 계단식 용액 또는 고형상 펩티드 합성(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., 1997, CRC Press, Boca Raton Florida, 이 글에 언급된 참고문헌; Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton ＆ Sheppard, Eds., 1989, IRL Press, Oxford, England, 이 글에 언급된 참고문헌).

다른 방법으로, 본 발명의 펩티드는 분절축합의 방법으로 제조할 수 있다(Liu et al., 1996, Tetrahedron Lett. 37(7):933-936; Baca, et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:1881-1997; Tam et al., 1995, Int. J. Peptide Protein Res. 45:209-217; Schnolzer and Kent, 1992, Science 256:221-225; Liu and Tam, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6584-6588; Yamashiro and Li, 1988, Int. J . 펩티드 Protein Res. 31:322-334). 이것은 특히 펩티드를 보유한 글리신의 경우에 적합하다. 본 발명의 펩티드의 합성에 유용한 다른 방법은 Nakagawa et al.,1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092에서 제시하였다.

N- 또는 C-말단 막힌 그룹을 보유한 ApoA-I 작용제는 유기화학의 표준 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 가령, 펩티드의 N-말단을 아실화시키는 방법 또는 펩티드의 C-말단을 아미드화 또는 에스테르화 시키는 방법은 당분야에 공지된 것이다. N-또는 C-말단에서 다른 변형을 일으키는 방법 및 말단 봉쇄그룹에 결합하기 위하여 필요한 임의의 측쇄 기능의 보호는 당업자에게 명확하다.

제약학적으로 수용가능한 염(반대이온)은 이온-교환 크로마토그래피 또는 당분야에 공지된 방법으로 쉽게 제조할 수 있다.

직렬의 다중체 형태인 본 발명의 화합물은 합성의 적절한 단계에서, 펩티드 사슬에 링크를 첨가하여 손쉽게 합성할 수 있다. 다른 방법으로, 나선형 분절을 합성하여 각 분절을 링크와 반응시킨다. 물론 합성의 실제방법은 링크의 조성에 따라 달라진다. 적절한 보호 반응식 및 화학식은 당분야에 공지된 것으로, 당업자에게 명확하다.

분지쇄형태인 본 발명의 화합물은 삼중결합 및 사중결합 레신과 화학식(Tam, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409-5413 and Domoor 35 al., 1996, Eur. J. biochem. 239:74-84)을 이용하여 손쉽게 합성할 수 있다. 합성레신을 변형하고, 더 상급 또는 더 하급의 분지쇄네트워크 또는 상이한 펩티드 나선형 분절을 합성하는 전략은 펩티드 화학 또는 유기화학분야의 당업자 능력범위 안에 있다.

원하는 경우, 이황화결합의 형성은 일반적으로 약한 산화제의 존재하에서 실시한다. 화학적 산화제를 사용하거나, 또는 화합물을 단순히 대기산소에 노출시켜 이런 결합의 효과를 나타낸다. 다양한 방법에 알려져 있다(Tam et al., 1979, Synthesis 955-957; Stewart et al., 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d Ed., Pierce Chemical Comapny Rockford, IL; Ahmed et al., 1975, J. Biol. Chem. 250:8477-8482; and Pennington et al., 1991 Petides 1990 164-166, Giralt and Andreu, Eds., ESCOM Leiden, The Netherlands). 추가적인 다른 방법은 Kamber et al., 1980, Helv. Chim. Acta 63:899-915에서 제시하고 있다. 고형 지지체상에서 행하는 방법은 Albericio. 1985, Int. J. Peptide Protein Res. 26:92-97에서 제시하고 있다. 이들중 임의의 방법을 이용하여 , 본 발명의 펩티드상에 이황화결합을 형성시킬 수 있다.

5.2.2 재조합 합성

펩티드가 유전자-인코드된 아미노산으로만 구성된다면, 또는 이의 일부로 구성된다면, 펩티드 또는 관련된 부분은 통상적인 재조합 유전자가공기술을 이용하여 합성할 수 있다.

재조합 생산의 경우에, 펩티드들 인코딩한 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 발현벡터에 삽입하는데, 상기 벡터는 삽입된 코딩서열의 전사 및 해독에 필요한 서열, RNA 바이러스 벡터의 경우에, 복제 및 해독에 필요한 서열을 보유한다. 발현운반체는 이후 펩티드를 발현하는 적당한 표적세포로 트랜스펙션시킨다. 사용한 발현계에 따라, 발현펩티드 이후, 당분야에 공지된 과정을 따라 분리한다. 재조합 단백질 및 펩티드 생산을 위한 방법은 당분야에 공지된 것이다(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. 이들 각각은 여기에 순전히 참고문헌으로 한다.).

생산효율을 증가시키기 위하여, 폴리뉴클레오티드는 효소분할위치에 의해 분리되는 펩티드의 다중 단위체를 인코드하도록 고안할 수 있다 -- 호모폴리머(펩티드 반복단위) 또는 헤테로폴리머(함께 배열된 상이한 펩티드)를 이런 방식으로 가공할 수 있다. 생성된 폴리펩티드는 분할하여(예, 적당한 효소로 처리하여), 펩티드 단위체를 수거할 수 있다. 이를 통해 단일 프로모터가 작동시키는 펩티드의 산출량을 증가시킬 수 있다. 적절한 구체예에서, 다중구조유전자 폴리뉴클레오티드는 다중 펩티드를 인코드한 mRNA가 전사되도록 고안할 수 있는데, 여기서 다중펩티드(호모폴리머 또는 헤테로폴리머)는 각각 캡-독립된 해독조절서열(예, 내부 리보좀 진입위치(IRES))에 연결되어 작동하는 영역을 코딩한다. 적당한 바이러스 발현계와 사용되는 경우, mRNA에 의해 인코드된 각 펩티드의 해독은 전사체의 내부에서 IRES에 의해 조절된다. 따라서, 다중구조유전자 구성체는 단일, 큰 다중구조유전자 mRNA의 전사를 조절하는데, 이 mRNA는 차례로, 다중, 개별 펩티드의 해독을 조절한다. 이 방식에서는, 다중단백질의 생산 및 효소가공이 필요없고, 단일 프로모터가 작동시킨 펩티드의 산출량이 상당히 증가한다.

다양한 숙주-발현계를 이용하여 이 글에서 밝힌 펩티디를 발현시킨다. 이들 발현계의 예에는 적절한 코딩서열을 보유한 박테이로파아지 DNA 또는 플라스미드 DNA 발현계로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 적절한 코딩서열을 보유한 재조합 효모나 진균발현계로 형질전환된 효모 또는 선상균; 적절한 코딩서열을 보유한 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 바큐로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 적절한 코딩서열을 보유한 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 콜리플라워 모자이크 바이러스 또는 담배모자이크 바이러스) 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예, Ti 플라스미드)에 의해 형질전환된 식물 세포계; 동물 세포계가 있지만, 이들에 한정하지는 않는다.

발현계의 발현인자는 길이 및 특이성에 따라 달라진다. 사용한 숙주/벡터계에 따라, 구성성 해독인자를 포함하여, 다수의 적절한 전사 및 해독인자를 발현벡터에 사용한다. 가령, 박테리아계로 클론하는 경우, 박테이로파아지 λ, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터)와 같은 유도성 프로모터를 사용한다; 곤충 세포계로 클론하는 경우, 바큐로바이러스, 다면체 프로모터와 같은 프로모터를 사용한다. 식물세포계로 클론할 경우, 식물세포의 게놈에서 파생된 프로모터(예, 열쇼크바이러스; RUBISCO의 작은 소단위체에 대한 프로모터), 클로로프로필 a/b 결합 단백질에 대한 프로모터, 또는 식물바이러스에서 얻은 프로모터(예,CaMV의 35S RNA 프로모터; TMV의 외막 단백질 프로모터)를 사용한다; 포유동물세포계로 클론하는 경우, 포유동물세포의 게놈에서 파생된 프로모터(예, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스에서 얻은 프로모터(아데로바이러스 후 프로모터; 두진 바이러스 7.5K 바이러스를 사용한다; 발현산물의 다중복사체를 보유한 세포계를 만드는 경우, SV40-,BPV-, EBV-기초의 벡터를 적절한 선택성 마크와 함께 사용한다.

식물발현 벡터를 사용하는 경우에, 본 발명의 펩티드를 인코딩한 서열의 발현은 다수의 프로모터중 임의의 하나로 작동시킨다. 가령, CaMV의 35S RNA, 19S RNA 프로모터(Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514), or the coat protein promoter of TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311)와 같은 바이러스 프로모터를 사용한다; 다른 방법으로, RUBISCO의 작은 소단위체와 같은 식물 프로모터(Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838-843) 또는 열쇼크 프로모터(예, 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B(Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565))를 사용한다. 이들 구성체는 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질전환, 미세주사, 에렉트로포레이션등을 이용하여 식물세로 도입할 수 있다. 이런 기술을 살펴보려면, Weissbach ＆ Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, SectionⅧ, pp 421-463; and Grierson ＆ Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9를 참고할 것.

본 발명의 펩티드의 생사에 사용되는 곤충 발현계에서, 핵 다한증 바이러스(AcNPV)인 Autographa californica(핵다각체병바이러스)를 벡터로 사용하여 외래 유전자를 발현시킨다. Spodoptera frugiperda(스포도프테라 프루기펠다)세포에서 바이러스는 생장한다. 코딩서열은 바이러스의 비-필수영역(가령 다면체 유전자)으로 클론하고, AcNPV 프로모터(예, 다면체 프로모터)로 조절한다. 코딩서열이 성공적으로 삽입되면, 다면체 유전자가 불활화되고, 비-폐색된 재조합 바이러스(즉, 다면체 유전자에 의해 코딩되는 단백질성분의 외막이 결핍된 바이러스)가 만들어진다. 이후 이들 재조합 바이러스를 사용하여 Spodoptera frugiperda(스포도프테라 프루기펠다)를 감염시키고, 여기에서 삽입유전자가 발현된다(Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584; Smith, U.S. Patent No. 4,215,051). 또한 이런 발현계의 예는 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ausubel et al., eds., Greene Publish. Assoc. ＆ Wiley Interscience에서 찾아 볼 수 있다.

포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기초 발현계를 사용한다. 아데노바이러스를 발현계로 사용하는 경우, 코딩서열은 아데노바이러스 전사/해독 조절복합체(예, 후기 프로모터 및 삼자리드서열)에 결찰시킨다. 이 키메라 유전자는 이후, in vitro or in vivo 재조합하여, 아데노바이러스 게놈에 삽입한다. 바이러스 게놈(예, E1 또는 E3영역)의 비-필수영역에 삽입하면, 생존가능하고, 감염된 숙주에서 펩티드를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 만들어진다(Logan ＆ Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659). 다른 방법으로, 두진 7.5K 프로모터를 사용할 수 있다(Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931).

본 발명의 펩티드를 생산하기 위한 다른 발현계는 당업자에게 명확하다.

5.2.3 펩티드의 정제

본 발명의 펩티드는 공지된 기술을 이용하여 정제할 수 있는데, 이런 방법의 예로, 역상 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피등을 들 수 있다. 특정 펩티드의 정제에 사용하는 실제조건은 부분적으로 합성 전략 및 망극성, 소수성, 친수성과 같은 인자에 따라 달라지는데, 당업자에게는 명확하다. 다중결합 분지쇄 펩티드는 이온 교환 또는 크기배제 크로마토그래피로 정제한다.

친화도 크로마토그래피 정제의 경우, 특이적으로 항체에 결합하는 항체를 사용한다. 항체 생산을 위해, 다양한 숙주동물은 펩티드를 주사하여 면역화시키는데, 이런 숙주동물의 예로, 토끼, 생쥐, 시궁쥐등을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다. 펩티드는 측쇄 기능기 또는 이에 결합하는 링크를 이용하여, BSA와 같은 적당한 담체에 부착시킨다. 다양한 항항원체를 사용하여, 숙주종에 따른 면역반응을 증가시키는데, 이런 항항원체의 예로, 프레운드(Freund)(완전 및 불완전)항하원체, 수산화암모늄과 같은 광물겔, 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 디니트로페놀, BCG(bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테륨 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 사람 항항원체를 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다.

펩티드에 대한 단일클론 항체는 배양중인 연속세포계로 항체분자를 생산할 수 있는 임의의 기술을 이용해 제조한다. 이런 방법의 예로, 하이브리도마 기술(Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497, or Kaprowski, U.S. Patent No. 4,376,110); 사람 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030), EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp 77-96(1985))들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다. 또한 적절한 항원-특이성의 생쥐 항체분자에서 얻은 유전자를 적절한 생리활성의 사람 항체분자와 접합시켜 "키메라 항체"(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454, Boss, U.S. Patent No. 4,816,397; Cabilly, U.S. Patent No. 4,816,567)를 생산하는 기술을 사용할 수 있다.

또는 "인체에 적응시킨"항체를 제조할 수 있다(Queen, U.S. Patent No. 5,585,089). 다른 방법으로, 단일 사슬항체의 생산기술(U.S. Patent No. 4,946,778)을 변형하여 펩티드-특이적 단일 사슬 항체를 생산할 수 있다.

특정결합위치가 결손된 항체단편은 공지된 기술로 만들 수 있다. 가령, 이런 단편의 예로 항체분자의 펩신 분해로 생산할 수 있는 F(ab')₂단편, F(ab')₂의 이황화결합을 환원시켜 만들 수 있는 Fab 단편을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다, 다른 방법으로, Fab 발현 라이버러리를 작제하여(Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) 관심있는 펩티드에 대해 원하는 특이성을 가진 단일클론 Fab 단편을 신속하게 쉽게 확인할 수 있다.

원하는 펩티드에 특이적인 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어, 아가로즈에 부착하고, 항체-아가로즈 복합체를 면역크로마토그래피에 사용하여, 본 발명의 펩티디를 정제한다(Scopes, 1984, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag New York, Inc., NY, Livingstone, 1974, Methods In Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723-731).

5.3 제약학적 조성물 및 치료방법

본 발명의 ApoA-I 작용제를 사용하여 동물, 특히, 사람을 포함한 포유동물의 임의 질환을 치료할 수 있는데, 이 작용제는 혈청 HDL 농도의 증가, LCAT의 활성화, 콜레스테롤 유출 및 RCT의 촉진에 유용하다. 임의 질환의 예로, 고지혈증, 고콜레스테롤 혈(증), 그리고 아테로마성경화증(아테로마성경화증의 치료 및 예방포함)과 같은 심장혈관질환; 재협착증(풍선 혈과형성술과 같은 의료과정의 결과로 발생하는 아테로마성경화증의 치료 또는 예방); 종종 폐형성 쇼크를 유발하는 엔도톡시미아와 같은 다른 질환을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다.

ApoA-I 작용제는 단독으로 또는 앞서 말한 이상의 치료에 사용하는 다른 약물과 병용하여 사용할 수 있다. 이런 치료요법의 예로, 관련된 약물의 동시 또는 순차 투여를 들 수 있는데, 이것에 한정하지 않는다.

가령, 고콜레스테롤 혈(증) 또는 아테로마성경화증의 치료시, ApoA-I 작용제 조성물은 현재 사용되고 있는 하나 또는 복수의 콜레스테롤 감소 치료약물(담즙산 레신, 니아신, 스타틴)과 함께 투여할 수 있다. 이런 병용치료법은 특히 유익한 치료효과를 내는데, 그 이유는 이런 약물은 콜레스테롤 합성 및 이동상의 상이한 표적에 작용하기 때문이다, 즉, 담즙-산 레신은 콜레스테롤 순환, 킬로미크론, LDL 개체군에 영향을 주고; 니아신은 주로 VLDL 및 LDL 개체군에 영향을 주고; 스타틴은 콜레스테롤 합성을 억제하고, LDL 개체군을 억제하고(LDL 수용체 발현을 증가시키고); 반면에, ApoA-I 작용제는 RCT에 영향을 주고, HDL을 증가시키고, LCAT 활성을 증가시키고, 콜레스테롤 유출을 촉진한다.

다른 구체예에서, ApoA-I 작용제는 피브레이트와 병용하여 고지혈증, 고콜레스테롤 혈(증), 그리고 아테로마성경화증과 같은 심장혈관질환을 치료하는데 사용한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 ApoA-I 작용제는 현재 내독소에 의해 야기된 페혈성 쇼크의 치료에 사용하는 항-미생물약, 항-염증약과 병용하여 사용한다.

본 발명의 ApoA-I 작용제는 펩티드 또는 펩티드-지질 복합체로 만들 수 있는데, 이때 펩티드는 ApoA-I 작용제를 순환계에 전달하는 다수의 방식으로 개체에 투여할 수 있다. 전형적인 조성물 및 치료방법을 아래에 제시하였다.

5.3.1 활성성분인 ApoA-I 작용제 및 펩티드/지질 복합체

ApoA-I 작용제 펩티드는 섹션 5.2 및 이의 소섹션에서 제시한 임의의 기술을 이용하여 합성 또는 제조할 수 있다. 선반에서 오랫동안 유지되는 안정한 조제물-은 펩티드를 동결건조하여 만드는데, 이때 펩티드는 재구성을 위해 대량제조하거나, 또는 개체에 투여되기 직전, 멸균수 또는 적절히 멸균된 버퍼용액으로 재수화시켜 재구성할 수 있는 개인별 일정분량 또는 약량단위로 제조한다.

특정 구체예에서, ApoA-I를 펩티드-지질 복합체로 제조하고, 투여하는 것이 바람직하다. 이런 방식은 몇 가지 이점이 있는데, 그 이유는 이런 복합체는 순화중, 특히 복합체가 HDL(특히, 선(pre)-β-1 또는 선(pre)-β-2 HDL 개체군)과 유사한 크기 및 밀도를 가질 경우, 반감기를 증가시킨다. 펩티드-지질 복합체는 아래에 제시한 다수의 방법중 임의의 방법으로 손쉽게 제조할 수 있다. 선반에서 장기간 유지되는 안정한 조제물은 동결건조(아래에서 밝힌 보조-동결건조과정이 바람직한 방법이다)로 제조한다. 동결건조된 펩티드-지질 복합체는 제약학적 재구성을 위해 대량으로 제조하거나, 또는 개체에 투여되기 직전, 멸균수 또는 적절히 멸균된 버퍼용액으로 재수화시켜 재구성할 수 있는 개인별 일정분량 또는 약량단위로 제조한다.

당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여, 펩티드-지질 소포체 또는 복합체를 제조할 수 있다. 이런 목적에, 리포좀 또는 프로테오리포좀을 제조하기 위한 다수의 다양한 기술을 사용한다. 가령, 펩티드는 적절한 지질로 초음파보조처리하여(용액기 또는 프로브 초음파처리기를 이용하여), 복합체를 만든다. 다른 방법으로, 펩티드는 적절한 지질 소포체와 병합하여, 자발적으로 펩티드-지질 복합체가 형성되도록 한다. 또 다른 방법으로, 펩티드-지질 복합체는 세정제 분석방법으로 만들 수 있다; 예를 들면, 펩티드, 지질, 세정제의 혼합물을 투석하여 세정제를 제거하고, 페비드-지질 복합체로 재구성하거나 또는 만든다(Jonas et al., 1986, Methods in Enzymol. 128:553-582).

앞서 말한 방식을 사용할 수는 있지만, 각 방법은 비용, 산출율, 재생산성, 안전성의 측면에서 나름대로의 생산상의 문제점을 나타낸다. 본 출원인은 HDL과 유사한 특성을 지닌 펩티드 또는 단백질-인지질 복합체를 제조하기 위한 간단한 방법을 개발하였다. 이 방법을 사용하여 ApoA-I 펩티드-지질 복합체를 만들 수 있고, 다음과 같은 이점을 갖는다:

(1) 대다수 또는 모든 포함성분을 사용하여 원하는 복합체를 만들어, 다른 방법에서는 흔한 시작물질의 낭비를 막는다. (2) 저장동안 매운 안전한 동결건조 화합물이 만들어진다. 생성된 복합체는 사용직전에 재구성한다. (3) 생성된 복합체는 일반적으로 제조후와 사용전 추가로 정제할 필요가 없다. (4) 콜레이트와 같은 세정제를 포함하여, 독성 화합물은 피한다. 또한, 이 생산방법은 쉽게 규모를 확대할 수 있고, GMP 제조(즉, 내독소-무(無) 환경)에 적당하다.

적절한 방법에 따라, 펩티드 및 지질은 용매상에서 결합하는데, 이 용매는 각 성분을 동시에 용해하는데, 동결건조시 완전히 제거할 수 있다. 이런 목적에, 용매쌍을 조심스럽게 선택하여, 양친매성 펩티드 및 지질 모두를 용해할 수 있도록 한다. 한 구체예에서, 입자로 병합할 단백질 또는 펩티드는 수용성 또는 유기 용매, 또는 용매혼합물(용매1)에 녹일 수 있다. (인)지질 성분은 용매1과 섞일 수 있는 수용성 또는 유기 용매, 또는 용매혼합물(용매2)에 녹일 수 있고, 두 용액은 혼합한다. 다른 방법으로, 펩티드와 지질은 공동-용매; 혼화가능 용매의 혼합물로 병합할 수 있다. 펩티드 및 지질의 적당한 비율을 먼저 경험적으로 결정하여, 생성된 복합체가 적당한 물리적, 화학적 성질; 즉, 일반적으로(반드시 필요한 것은 아니지만) HDL과 유사한 크기를 갖도록 한다. 생성된 혼합물은 동결시키고, 마를때까지 동결건조한다. 때때로, 추가용매를 혼합물에 첨가하여, 동결건조를 가능하게 한다. 이 동결건조된 산물은 장기간 동안 보관할 수 있어 안정한 상태로 유지된다.

작업 실시예(아래쪽)에서, 펩티드 210(서열:210) 및 인지질은 개별적으로 메탄올에 녹이고, 병합하고, 이후 동결건조전 실렌과 혼합한다. 펩티드 및 지질 모두 두 용매의 혼합물에 첨가할 수 있다. 용매로부터 염을 조심스럽게 제거하여 펩티드가 소금에 의해 분리되지 않도록 한다. 메탄올/실렌용매에 동시용해한 펩티드 및 지질을 보유한 생성혼합물은 동결건조하여 분말을 만든다.

동결건조된 산물은 재구성하여, 펩티드-지질 복합체의 용액 또는 현탁액을 수득할 수 있다. 이런 목적에, 동결건조된 분말은 수용성 용액으로 재수화시켜, 적당한 부피(종종 정맥내 주사를 위해 5mg 펩티드/㎖)로 만든다. 적절한 구체예에서, 동결건조분말은 인산완충식염수 또는 생리식염수로 재수화시킨다. 혼합물은 휘젓거나 또는 교반하여 재수화가 이루어지도록 하고, 대개의 경우, 재구성단계는 복합체의 지질성분의 상전이(PHASE TRANSITION)온도와 동일 또는 이상의 온도로 실시해야 한다. 수분내에, 재구성된 지질-단백질 복합체의 투명한 제조물이 생성된다.

생성된 재구성조제물의 일정부분을 특성화시켜, 조제물상의 복합체가 원하는 크기분산; 예, HDL의 크기분산을 갖도록 한다. 겔 여과 크로마토그래피를 이런 목적에 사용할 수 있다. 아래에 밝힌 작업실시예에서, Pharmacia Superose 6 FPLC 겔 여과 크로마토그래피 장치를 사용하였다. 사용한 완충용액은 50mM 인산염 완충용액상의 150mM Nacl를 보유한다(pH 7.4). 일반적인 샘플부피는 5mgs 펩티드/㎖를 보유한 복합체의 20 내지 200 ㎖이다. 칼럼 유속은 0.5mls/min이다. 사람 HDL을 비롯하여, 공지된 분자량 및 스토크 직경의 단백질들을 표준으로 사용하여 칼럼의 눈금을 정한다. 단백질 및 지질단백질 복합체는 254 또는 280㎚ 파장의 광흡수도 또는 산란도로 모니터한다.

본 발명의 ApoA-I 작용제는 다양한 지질과 복합체를 형성할 수 있는데, 이런 지질의 예로, 포화된, 불포화된, 천연, 인공지질 및 인지질을 들 수 있다. 적당한 지질의 예로, 작은알킬사슬 인지질, 난(卵)포스타티딜콜린, 대두 포스타티딜콜린, 디팔미토일포스타티딜콜린, 디미리스토일포스타티딜콜린, 디스테어로일포스타티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일포스타티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스타티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테어로일포스타티딜콜린, 1-스테어로일-2-팔미토일포스타티딜콜린, 디올레일포스타티딜콜린, 디올레오포스타티딜에탄올아민, 디라우로일포스타티딜글리세롤포스타티딜콜린, 포스타티딜세린, 포스타티딜에탄올아민, 포스타티딜리노시토일, 스핑고미엘린, 스핑고지질, 포스타티딜글리세롤, 디포스타티딜글리세롤, 디팔미토일포스타티딜글리세롤, 디스테어로일포스타티딜글리세롤, 디올레일포스타티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티드산, 디팔미토일포스파티드산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 뇌 스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 디스테어로일스핑고미엘린, 포스파티드산, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세리드, 아미노페닐글리코시드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 당지질, 콜레스테롤 및 이의 유도체를 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다.

본 출원인은 본 발명의 ApoA-I 작용제가 스핑고미엘린과 복합체를 형성할 경우, 선(pre)-β-유사 입자의 모든 HDL이 제거된다는 것을 발견했다. 따라서, 본 발명의 적절한 구체예에서, ApoA-I 작용제는 스핑고메엘린과의 복합체로 투여한다.

5.3.2 치료방법

본 발명의 ApoA-I 펩티드 작용제 또는 펩티드-지질 복합체는 순환계에서 생체이용효율을 확보할 수 있는 임의의 적절한 경로로 투여한다. 이것은 장관외 투여경로를 통해 최적으로 성취할 수 있는데, 이런 투여경로의 예로, 정맥내(Ⅳ), 근육내(IM), 피하(SC), 복강사이(IP)주사를 들 수 있다. 하지만, 다른 투여경로도 사용할 수 있다. 가령, 위장계를 통한 흡수는 경구투여(예로서, 음식물의 섭취, 입 및 혀의 경로을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않음)경로를 통해 이룰 수 있는데, 단 적절한 조성물을 사용하여, 입의 점막, 위장 및 소장의 거친 환경에서 활성성분의 분해가 최소화되도록 해야 한다.

다른 방법으로, 질 또는 직장투여경로와 같은 점막 조직을 통한 투여를 사용하여, 위장계상의 분해를 최소화한다. 또 다른 방법으로, 본 발명의 조성물을 경피(예, 경피를 통한 흡수)로 투여하거나 또는 흡입할 수 있다. 인지하는 바와 같이, 적절한 투여경로는 수용자의 상태, 나이, 수용정도에 따라 달라진다.

사용한 ApoA-I 작용제 또는 펩티드-지질 복합체의 실제약량은 투여경로에 따라 달라지는데, 순환 형질농도가 100㎎/ℓ 내지 2g/ℓ이 되도록 조정한다. 이 글에서 제시한 동물 모델 시스템에서 얻은 자료에서, 본 발명의 ApoA-I 작용제가 HDL 성분과 결합하여, 사람에서 대략 5일 정도의 예상반감기를 가짐을 알 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, ApoA-I 작용제는 일주일에 한번, 0.5㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏사이의 약량으로 주사투여할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 원하는 혈청 수준은 0.5㎎/㎏/hr 내지 100㎎/㎏/hr을 지속적 주입 또는 간헐 주입하여 유지한다.

다양한 ApoA-I 작용제의 독성 및 치료요법적 효능은 세포배양물 또는 실험동물에서 LD₅₀(개체군 50%의 치사량) 및 ED₅₀(개체군 50%의 치료요법적 효과량)을 정하기 위한 표준제약학적과정을 이용하여 결정할 수 있다. 독성 및 치료요법적 효과사이의 약량비율은 치료요법적 지표가 되는데, 이를 LD₅₀/ED₅₀비율로 나타낼 수 있다. 상당한 치료요법적 지표를 보이는 ApoA-I 펩티드 작용제가 바람직하다.

5.3.3 제약학적 조성물

본 발명의 제약학적 조성물은 활성성분으로 ApoA-I 펩티드 작용제 또는 펩티드-지질 복합체를 보유하고, 이 조성물은 투여 및 생체내 전달에 적당한 제약학적으로 수용가능한 담체상에 위치한다. 펩티드는 산성 또는 염기말단, 또는 측쇄를 보유하기 때문에, 펩티드는 자유 산 또는 염기의 형태로, 또는 제약학적으로 수용가능한 염의 형태로 조성물상에 포함될 수 있다.

주사용 조성물에는 멸균 현탁액, 용액 또는 수용성이나 유성 소포에 녹인 활성성분의 유제가 포함된다. 조성물은 또한, 약물의 현탁, 안정화, 확산과 같은 조성화 약물을 포함한다. 주사용 조성물은 단위약량형태(예, 앰플) 또는 다중약량 함유제로 제공되고, 추가로 방부제를 함유할 수 있다.

다른 방법으로, 주사용 조성물은 사용전, 적당한 담체와 함께 재구성용 분말형태로 제공할 수 있는데, 이런 담체의 예로, 멸균 피로겐 자유수, 완충용액, 델스트로스 용액을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다. 이런 목적에, ApoA-I 작용제는 동결건조시키거나 또는 동시-동결건조된 펩티드-지질 복합체를 제조할 수 있다. 저장된 제조물은 단위약량형태로 제공하고, 생체 사용전에 재구성할 수 있다.

장기간 전달을 위해, 활성성분은 주입투여(예, 피하, 경피 또는 근육사이 주사)용 저장조제물로 만들 수 있다. 따라서, 활성성분은 적당한 다중결합 물질 또는 소수성 물질(예, 수용가능 기름상의 유제) 또는 이온 교환 레신, 또는 약간 용해성 유도체(ApoA-I 작용제의 약간 용해성 염)에서 만들 수 있다.

다른 방법으로, 피부흡수용 활성성분을 천천히 방출하는 흡착 디스크 또는 패치형태로 제조된 경피전달 시스템을 사용할 수 있다. 이런 목적에, 침투 강화물질을 사용하여, 활성성분의 경피침투를 가능하게 한다. 본 발명의 ApoA-I 작용제 또는 펩티드-지질 복합체를 허혈성 심장질환 및 고콜레스테롤 혈(증)을 가진 환자에게 사용하기 위한 니트로글리세린 패치와 병합하면, 특히 이롭다.

경구 투여의 경우, 제약학적 조성물은 정제 또는 캡슐형태를 취하는데, 이들은 소결제(예, 선젤라틴화된 옥수수 당, 포리비닐리폴리돈 또는 하이드로프로필 메틸셀룰로스)와 같은 제약학적으로 수용가능한 부형제; 충전제(예, 락토오스, 미세결정 셀룰로스 또는 수소인산칼슘); 윤활제(예, 스테아르산마그네슘, 활석, 실리카); 정제분해물질(예, 감자당 또는 당글리코산나트륨); 수화물질(예, 라우릴 황산나트륨)과 함께 통상적인 방법으로 제조한다. 정제는 당분야에 공지된 방법으로 피막한다. 경구투여용 액제조성물은 용액, 시럼 또는 현탁액형태를 취하거나, 또는 사용전 물 또는 다른 적당한 담체와의 구성을 위한 건조산물로 제공된다. 이런 액제제조물은 제약학적으로 수용가능한 첨가제와 함께 통상적인 방법으로 제조하는데, 이런 첨가제에는 현탁물질(예, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소첨가된 식용 지방); 유화 물질(레시틴 또는 아카시아); 비-수용성 담체(예, 알몬드 기름, 유성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분화된 식물기름); 방부제(예, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)가 있다. 조제물은 또한 적당한 완충염, 향료, 착색제, 감미료를 함유한다. 경구투여용 조제물은 활성성분을 조절방출하도록 적절하게 만든다.

구강투여의 경우, 조성물은 통상적인 방법으로 만든 정제 또는 마름모꼴 정제형태를 취한다. 직장 및 질투여경로의 경우, 활성성분은 용액(유지 관장제) 좌약 또는 연고(제)로 제조된다.

흡입투여의 경우, 활성성분은 적당한 추진체를 사용하여, 가압한 팩 또는 약액분무기로부터 에어로졸 분무형태로 쉽게 전달할 수 있는데, 이런 추진체의 예로, 디클로로디플루오로메탄, 트리클롤로플로오로메탄, 디클롤로테트라플루오로메탄, 이산화탄소, 또는 다른 적당한 가스를 들 수 있다. 가압한 에어로졸의 경우에, 약량단위는 미터단위량을 전달하는 밸브를 제공하여 결정한다. 흡입기 또는 취입기에 사용하는 겔라틴 갭슐 또는 약포는 화합물의 분말혼합 및 락토오스 또는 당과 같은 적당한 분말을 함유하도록 제조한다.

원하는 경우, 조성물은 팩 또는 디스펜서 장치로 제공하는데, 이들은 활성성분을 함유한 하나 또는 복수의 단위약량을 담고 있다. 팩은 예를 들면, 발포제팩과 같은 금속 또는 플라스틱 박으로 이루어진다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여지시를 따른다.

5.4 다른 용도

본 발명의 ApoA-I 작용제를 시험관내 분석에 사용하여, 혈청 HDL(예, 진단목적의)을 측정할 수 있다. ApoA-I 작용제는 혈청의 HDL 성분과 결합하기 때문에, 작용제는 HDL 개체군에 대한 "마크"로서 사용할 수 있다. 또한, 이 작용제는 RCT에 효과적인 HDL의 소개체군에 대한 마크로서 사용할 수 있다. 이런 목적에, 작용제는 환자 혈청 샘플에 첨가하거나 또는 혼합할 수 있다; 적당히 배양한후, HDL 성분은 병합된 ApoA-I 작용제를 검출하여 분석할 수 있다. 이것은 라벨된 작용제(예, 방사능라벨, 형광라벨, 효소라벨, 염료등)를 사용하거나, 또는 작용제에 특이적인 항체(또는 항체단편)를 이용한 면역분석으로 성취한다.

다른 방법으로, 라벨된 작용제를 영상과정(예, CAT 스캔, MRI 스캔)에 사용하여, 순환계를 시각화하거나, RCT를 모니터하거나, 또는 지방 선조(線條)상에 HDL 축척, 아테로마성 병소를 시각화한다(여기서 HDL은 활발하게 콜레스테롤을 유출시켜야 한다).

6. 실시예: ApoA-I의 펩티드 작용제의 합성

표 5(섹션8.3, 아래쪽)에서 제시한 펩티드는 아래의 소섹션에서 밝힌 바와 같이 합성하고 특성화하였다. 펩티드는 또한, 섹션 7 및 8에서 밝힌 바와 같이 구조적으로, 기능적으로 분석하였다.

6.1 코어 펩티드의 합성

펩티드는 메리필드 기술(Merrifield 1969, j. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)을 따라, 0.25mmol ρ-알콕시벤질알코올 레신(HMP 레신)(Wang, 1973, J. Am. Chem. Soc. 95:1328-1333) 및 Fmoc 화학식을 이용하여, 고형상에서 합성하였다. 모든 합성은 Applied Biosystems ABI model 430A 자동화 펩티드 합성기(Perkin elmer, Foster City, CA)상에서 실시하였다. 각 결합 주기에 사용한 용매화 및 활성화시간은 아래의 표 5에 제시하였다.

표 5

레신은 각 결합단계의 중간에 NMP로 세척하였다. 합성 주기의 한 프로토콜을 아래의 표 6에 제시하였다.

표 6

Fomc-β-(1-나프틸)알라닌을 제외한 모든 아미노산이 이런 방식으로 결합하였다. Fmoc-β-(1-나프틸)알라닌은 지시에 따라 결합하였다. 지시결합의 경우, 1mmol Fmoc-β-(1-나프틸)알라닌 및 1mmol 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루로보레이트(TBTU)는 5㎖ NMP 용매에 녹이고, 펩티드-레신과 혼합하였다.

이후, 2mmol의 N-에틸디이소프로필아민을 첨가하고, 혼합물은 2시간동안 진탕하고, 펩티드는 6번 10㎖ NMP로 세척하였다. 결합효율은 카이저 시험기(Kaiser Test)(Kaiser, 1970, Anal. Biochem. 34:59577)를 이용하여 모니터하고, 필요할 경우 결합을 반복했다. 나프틸알라닌의 결합후, 합성의 나머지단계를 전술한 바와 같이 자동적으로 실시하였다.

6.2 펩티드 아미드의 합성

표 5(섹션8.3, 아래쪽)에서 지시한 바와 같이, 펩티드 아미드는 링크(Rink) 아미드 레신을 이용하여 합성하였는데, 상기 레신은 Fmoc-Rink 아미드 핸들 4-(2',4'-디메틸페닐)-Fmoc-페녹시메틸(Rink, 1987, Tetrahedron Lett. 28:3787- 3790)을 함유하고, 합성 프로토콜은 섹션6.1(위에)에서 밝혔다.

6.3 N-말단 아실화된 펩티드의 합성

표 5(섹션8.3, 아래쪽)에서 지시한 바와 같이, N-말단 아실화된 펩티드는 섹션6.1 또는 6.2(위에)에서 밝힌 바와 같이 만든 레신-결합 펩티드를 적당한 아실화약물에 노출시켜 만든다.

N-말단 아세틸화된 펩티드의 경우, 15㎖ 아세트 무수용액(10% v/v, NMP 용매)을 1g의 레신-결합 펩티드에 첨가하고, 혼합물은 5분동안 교반하고, 레신은 여과를 통하여 회수한다. 회수한 레신은 NMP(15㎖)로 세 번 세척하고, 에탄올(15㎖)로 세 번 세척하였다.

6.4 분리 및 보호해제

합성이후, 섹션6.1, 6.2, 6.3(위에)에서 제시한 펩티드는 레신으로부터 분리하고, 92.5% 트리플루오로아세트산(TFA)/3.75% 아니솔/3.75% 도데칸티올(v/v/v)를 함유한 분리용액으로 보호해제하였다. 분리시키기 위하여, 10㎖의 분리용액은 0.25mmol 펩티드 레신에 첨가하고, 실온에서 1.5시간동안 휘젓었다. 레신은 여과를 통하여 제거하고, 분리/보호해제된 펩티드는 디에틸 에테르로 침강시키고, 에테르로 세척하고, in vacuo에서 건조시켰다.

펩티드 아미드를 비롯하여, Trp (W)를 함유한 펩티드분리 혼합용액은 86.5% TFA, 4.5% H₂O, 4.5% 1,2-에탄디티올, 4.5% 아니솔, 3% 페놀로 이루어진다.

6.5 정제

섹션6.4의 정제하지 않은, 분리 펩티드는 역상 HPLC로 정제하였다. 각 펩티드의 정제는 상이한 분석기술(분석 HPLC, 모세혈관 전기영동)로 확인하였다. 모세혈관 전기영동은 70cm 길이 및 75㎛의 내부 직경의 융합된 실리카 모세혈관상에 실시하였다(Thermo Seperation Product). 분리는 상이한 두 개의 버퍼 시스템: 버퍼 1(20mM Na₂B₄O₇, pH 9.2) 및 버퍼 2(10mM Na₂B₄O₇, pH 2.5)에서 실시하였다(25℃, 15kV, 작동시간 35분). HPLC 분리는 Nucleosil 7C18 or Nucleosil 7C4 칼럼(Macherey and Nagel, Germany), 250 x 21 mm상에서, 8㎖/min의 유속으로 실시하였다. 농도차 용리는 물에 녹인(용매 A) 0.1 TFA 및 아세토니트릴에 녹인 0.1＆ TFA혼합물을 이용하여 실시하였다. 사용한 농도차는 각 펩티드의 필요를 충족시킬 수 있도록 변형하였다.

6.6 특성화

섹션6.5에서 밝힌 정제된 펩티드의 질량 및 아미노산분석은 후술한 바와 같이 각각 질량 형광계수법 및 아미노산 분석으로 확인하였다. 에드만(Edman) 분해를 서열화에 사용하였다.

6.6.1 LC-MS

상업적으로 이용가능한 표준 삼단계 4중 질량 형광계수기(model TSQ 700; Finnigan MAT, San Jose CA, USA)을 사용하여 질량을 결정하였다. 압축공기 보조의 전기스퍼레이(ESI) 인터페이스를 사용하여, 샘플을 질량 형광계수기의 대기압 이온화원으로 도입하였다. 인터페이스 스프레이는 4.5kV의 양전압에서 작동시켰다. 금속 모세혈관의 온도는 200℃도 유지하고, 반면 분기관은 70℃로 유지하였다. 이 이온증발과정에서 발생한 양이온은 질량 형광계수기의 분석기안으로 들어간다. 증폭기는 1000V로 조정하였다. 질량 형광계수기의 분석기는 4E-6에 놓아두었다. 모든 획득은 해상도 〈 1u로 실시하였다.

펩티드는 ABI (Applied Biosystems)마이크로보르 장치를 이용하여, 정제한 펩티드를 직접 주입하여 분석하는데, 이 장체는 시린지 펨프(model 140B), UV 검출기(model 785A), 오븐/분사장치(model 112A)로 이루어진다. 용매계는 물(용매A) 및 아세토니트릴(용매B)로 이루어지는데, 각각 0.1% TFA를 함유한다. 펩티드는 농도차 또는 동등농도를 이용하여 주입하고, 아쿠아포어 C18 칼럼으로부터 용출시킨다. 유속은 일반적으로 300㎕/min이 된다. 각 펩티드의 농도는 대략 0.03㎎/㎖이 되는데, 이중 20㎕를 주사한다(예, 30 pmol)

전체 스캔 MS 실험결과는 4초동안 m/z 500-15000에서 1를 4배 스캔하여 얻는다. 데이터는 Alpha DEC Station을 이용하여 얻고, Finnigan MAT(BIOWORKS)에 서 제공한 소프트웨어 패키지를 이용하여 처리한다.

6.6.2 아미노산 분석

아미노산 분석은 ABI(Applied Biosystems)420 아미노산 분석기상에서 실시하였다. 이 장치는 세 개의 모듈로 구성된다; 가수분해 및 유도장치, 역상 HPLC, 데이터 장치. 펩티드 샘플은 다공성 유리슬라이드상에 발르고(세번 반복), 곧이어, 가스 상 조건(150℃, 90분)하에서 가수분해하였다. HVL제거후, 생성된 아미노산은 PITC(페닐이소티오시아네이트)를 이용하여 PTC-AA(페닐티오카르바모일-아미노산)로 전환시켰다. HPC 샘플 루프로의 전환이후, 생성된 혼합물은 농도차 모드(용매 A: 50mmol 아세트산 암모늄(NH₄Ac), pH 5.4, 물; 용매B: 32 mmol 아세트산 나트륨(NaOAc))를 이용하여, 아쿠아포어 C18 칼럼상에 분포시켰다. HPLC 데이터는 Applied Biosystems에서 제공한 소프트웨어 패키지로 처리하였다. 정량화는 Applied Biosystems에서 제공한 펩티드 표준과 비교하여 실시하였다.

6.7 분지쇄망의 합성

사중결합-코어 펩티딜 레신 및 삼중결합-코어 펩티딜 레신은 Demoor et al., 1996, Eur. J. Bioche. 239:74-84에서 밝힌 바와 같이 합성한다. 4-메틸 벤즈히드릴아민 레신에 연결되어 있는 사중결합 및 삼중결합 코어 메트릭스를 이후, 전술한 바와 같이 십부 펩티드의 자동합성을 위한 내부 펩티딜-레신으로 사용한다.

7. 실시예: ApoA-I 펩티드의 구조 및 지질 결합 분석

섹션6에서 밝힌 것과 같이 합성한 정제펩티드의 구조 및 지질 결합 특성은 순환 이색성(CD), 형광분광광도계, 핵자기공명(NMR)로 결정하였다.

7.1 순환 이색성

이 실시예는 버퍼내 자유상태 또는 지질존재하의 본 발명의 코어 펩티드의 헬리시티를 결정하기 위한 적절한 방법을 설명한다.

7.1.1 실험방법

UV 순환 이색성 스펙트럼은 190 및 260㎚(0.5㎚ 또는 0.2㎚ 내부직경)사이에서 AVIV62DS 분광계(AVIV Associates, Lakewood, NJ, USA)로 기록하는데, 이 장치에는 온도전기 세포 용기 및 샘플 교환기가 장착되어 있다. 이 장치는 (+)-10-캠포르산으로 눈금을 재었다. 한번 및 세 번 스캔사이에서, 각 샘플은 10^-7M to 10^-4M 펩티드 농도에서, 각각 10㎝, 5㎝, 1㎝, 0.1㎝ 패치 길이 콰츠 수프라실 세포를 이용하여 수거하였다. 밴드너비는 1.5㎚로 고정하고, 스캔 속도는 파장단계마다 1초로 하였다. 기록한 데이터는 적어도 2 또는 3번의 독립된 수치의 평균값이다.

배경 서브스트렉션이후, 스펙트럼은 cm^-2dmol^-1상의 잔기당 몰 타원율(θ)로 전화하였다. 펩티드농도는 아미노산 분석 및 a Perkin Elmer Lambda 17 UV/V상의 흡수스펙트럼으로 결정하였는데, 여기서 펩티드는 크로모포어(트립토판, 단실, 나프틸알라닌)를 함유하였다.

CD 스펙트럼은 자유, 미결합 펩티드(5μM, 5mM 인산염버퍼 용매, pH 7.4); 펩티드-SUV 복합체(20:1 EPC:Chol., Ri=30, Ri=50); 펩티트-교질입자 복합체(1-미리스토일-2-하이드록시-누-글리세롤-3-포스파티딜 콜린, Ri=100); 2,2,2-트리플루오르에탄올(TFE)(5μM 펩티드, 90% vol TFE)존재하의 자유, 미결합 펩티드로 얻었다.

SUV는 5분동안 N₂거품을 일으킨 인산염 버퍼(5mM, pH 7.4)에서 지질(10mM, 20:1 EOC:Chol., Avanti Polar Lipids, AL)을 분산시켜 얻고, 이후 용액초음파처리기에서 초음파 처리(1.5시간)하였다. 제조물의 균질도는 FPLC로 점검하였다.

교질입자는 5분동안 N₂거품을 일으킨 인산염 버퍼(5mM, pH 7.4)에서, 지질(6mM 1-미리스토일-2-하이드록시-누-글리세로-3-포스파티딜콜린, Avanti Polar Lipids, AL)을 분산시켜 얻고, 이후, 교반하였다.

펩티드-SUV 복합체를 얻기 위하여, SUV는 펩티드(5μM, 5mM 인산염버퍼 용매, pH 7.4)에 인지질-펩티드 30 또는 50의 몰농도(Ri)로 첨가하였다.

모든 스펙트럼은 37℃에서 기록하였다. 온도에 대한 함수(완충액 및 미셀에서 자유형)로써 펩티드 210(서열 210)의 안정성은 일련의 상이한 온도에서 스펙트럼을 기록하여 결정한다.

농도에 대한 함수로써 펩티드 210(서열:210)의 헬릭스 형성도를 또한 결정한다.

7.1.2 나선도 결정

다양한 조건하의 펩티드의 헬리시티정도는 222㎚(Chen et al., 1974, Biochemistry 13:3350-3359)에서 평균 잔기 타원율에서 결정하거나, 또는 CONTIN 곡선-적합화 알고리즘 버전 2DP, CD-1 팩((Aug. 1982)(Provencher, 1982, Comput. Phys. Commun. 27:213-227, 229-242)을 이용하여 데이터베이스(16 헬리시티 참고 스펙트럼(Provencher ＆ Glockner, 1981, biochemistry 20:33-37; denatured protein reference spectra from Venyaminov et al., 1993, Anal. Biochem. 214:17-24))에서 입수가능한 참고 스펙트럼에서 얻은 CD 스펙트럼과 비교하여 결정하였다.

수용가능한 적정수치는 CINTIN 알고리즘에서 제공한 통계분석방법을 이용하여 결정하였다. 모든 방법의 오차는 ±5% 헬리시티이다.

7.1.3. 결과

자유형, 결합안된 드(자유형), 펩티드-SUV 복합체(SUVs), 펩티드-미셀 복합체(mics), 펩티드-TFE 용액(TFE)는 표 5 및 단락 8.3에서 설명한다.

펩티드 210(서열:210)는 미셀에서, 상당한 α-나선구조(63% 헬리시티)를 갖는다. 또한, α나선 구조는 5℃ 내지 45℃ 범위에서 전적으로 안정하다(데이타는 나타내지 않음). 펩티드 210(서열:210)의 헬리시티는 TFE 존재 하에서도 증가하는데, TFE는 물(ε=78.4)에 비해, 상당히 낮은 유전체 상수(ε=26.7)를 갖기 때문에, 5-90%(v/v)사이의 농도에서, α-나선구조 및 펩티드사이 수소결합을 안정화시키는 용매다.

표 5, 섹션 8.3을 참고로 하여, 고도의 LCAT 활성화(≥38%)를 보이는 펩티드는 지질(≥60%나선구조, 막히지 않은 펩티드가 22이상의 아미노산을 보유하거나 또는 막힌 펩티드가 18미만의 아미노산을 보유하는 경우; ≥40%, 막히지 않은 펩티드가 18미만의 아미노산을 보유하는 경우)의 존재하에서, 상당한 α-나선 구조를 보유하고, 반면, 거의 LCAT 활성화를 보이지 않는 펩티드는 거의 α-나선구조를 보유하지 않는다. 하지만, 몇 가지 경우에, 지질의 존재하에, 상당한 α-나선 구조를 보유한 펩티드는 LCAT 활성화를 그다지 보이지 않았다. 결과적으로, 지질존재하에서, 본 발명 코어 펩티드의 α-나선구조를 수용능력은 본 발명 코어 펩티드의 중요한 특징으로 간주하는데, 지질존재하에서, 본 발명의 α-나선구조를 형성하는 능력은 LCAT 활성화의 선결조건으로 보인다.

7.2 형광분광계

섹션6에서 합성한 펩티드의 지질 결합성질은 케이스 트립토판(Trp 또는 W) 또는 나프틸알라닌(Nal) 존재하에서, 라벨된 형광측정으로 시험하였다. 형광스펙트럼은 Fluoromax(Spex(Jobin-Yvon))상에 기록하였는데, 상기 장치는 150W의 제논 램프, 두 개의 단일크로메이터(자극 및 방출), 850㎚에 이르는 적외선의 민감한 검출을 위한 광증폭기 R-928, 온도전기 자기세포 용기가 장착되어 있다. 쿼츠 수프라실 쿠벳은 mmol 농도범위에서의 측정에 사용하였다. 틈 변수(0.4 내지 5㎚)의 장치를 통해, 사용한 펩티의 농도에 따른 발생 및 방출강도의 조절이 이루어진다. 제시한 수치는 일반적으로 2 내지 4번 스펙트럼의 평균이다. 펩티드 농도는 Trp(ε_280㎚=5,550 M^-1㎝^-1, Tris 버퍼)의 흡수밴드 또는 Nal(ε_224㎚=92,770 M^-1㎝^-1,메탄올 용매)을 이용하여, 필리프스(Philips) PU 8800상의 흡수스펙트럼으로 결정한다.

펩티드의 형광 스펙트럼은 지질소포체의 유무하의 Tris-HCl 버퍼(20mM, pH=7.5)에서, 290nm 및 450nm사이에서 기록하였다. 작은 소포체는 동결건조된 인지질의 버퍼상에서 재수화, 확산, N₂유출하의 tip 초음파 처리이후 만들어진다. 사용한 지질은 난(卵) PC/Chol. (20:1) 또는 POPC/Chol. (20:1)이었다. 스펙트럼은 2μM의 펩티드 농도, 37℃의 온도에서 기록하였다. Trp의 경우에, 형광참고표준은 N-아세틸트립토파닐아미드(NATA)였다.

지질결합은 2μM농도(틈: 5㎚(자극), 1.5㎚(방출))하의 펩티드에 점차로 지질소포체를 첨가하여 연구하였다. 희석효과를 형광강도결정시 참고하였다. 지질농도는 10 내지 600μM로 다양하였고, 펩티드에 대한 지질의 몰농도(Ri)는 5 내지 300으로 다양하였다. 자극 파장은 Trp 및 Nal 모두 280nm로 고정하였다.

7.2.1 형광스펙트럼 분석

데이터는 DM3000F 소프트웨어(Spex)를 통하여, 분광형광계에 연결한 IBM-PC로 직접 기록하고, 처리하였다. 스펙트럼은 용매분포의 서브스트렉션 및 광증폭기 대 파장의 변수를 고려한 상수를 응용하여 보정하였다.

펩티드의 형광스펙트럼은 최대형광 최대치에서의 파장 및 트립토판으로 라벨된 펩티드의 경우의 NATA와 비교한 이들의 양자량으로 특성화하였다. 지질에 결합시키는 과정은 형광방출 최대치(λ_max)에서 파장의 이동 및 상대적 형광방출강도 대 지질농도의 변화를 계산하여 분석하였다. 상대적 형광강도는 다음의 비율로 정의한다: (I-I₀)_λmax/I_0λmax

I 및 I₀모두 펩티드의 초기 자유상태(즉, 지질없는 상태)에 따라, λ_max에서 측정하였다. I는 정해진 지질/펩티드 비율에서의 강도이고, I₀는 지질부재하에, 측정한 동일 파라메터이다. 이들 변이의 부재는 지질과 펩티드의 상호작용 부재를 의미한다.

7.2.2 결과 및 토론

펩티드 199(서열:199)는 10번 위치에 W(Trp)를 보유한 다는 것을 제외하고, 펩티드 210(서열: 210)과 일차서열과 유사한데, 이를 표7에 제시하였다.

표 7

2㎛농도의 버퍼에서, 펩티드 199(서열:199)의 트립토판 형광방출 최대치(λmax)는 348nm이다. 이것은 NATA(λmax=350nm)에 비교할 경우, 상대적으로 수용성 용액에 노출된 트립토판에 해당한다. 펩티드 199(서열:199)는 효과적으로 작은 소포체에 매우 효과적으로 결합하는데, 이것은 트립토판의 묻힘(트립토판 최대형광방출강도에 대한 파장이 348nm에서 325nm로 이동한다) 및 고형광강도상승(표7)으로 입증하였다. 트립토판잔기의 묻힘은 지질 대 펩티드 100의 몰비율에서 최대가 된다.

섹션 7.1에서 밝힌 순환 이색성으로 측정한 바와 같이, 지질의 존재하에서, 고도의 헬리시티(≥60%, ≥22 아미노산의 막히지 않은 펩티드 또는 ≤18 아미노산의 막힌 펩티드의 경우; ≥40%, ≤18 아미노산의 막히지 않은 펩티드의 경우)를 보이는 다른 펩티드 역시 좋은 지질 결합을 나타내었다. 물론, 순환 이색성 선별로 선택한 펩티들 중에서, 형광으로 추적할 수 있는 것들만 지질결합성질을 조사하였다.

7.3 핵 자기 공명(NMR)

이 실시예는 본 발명의 코어 펩티드의 구조를 분석하기 위한 NMR 방법을 설명한다.

7.3.1 NMR 샘플 제조

샘플은 내부 화학이동참고물질로서 미량의 2,2-디메틸-2-실라-5-펜탄 술포네이트(DSS)를 함유한 90%H₂O/10% D₂O에 5mg의 펩티드 녹여 만들었다. 샘플중 일부는 트리플루오르에탄올(TFE)(% vol로 표현)을 함유하였다. 전체 샘플부피는 500㎕였고, 펩티드의 농도는 대략 5mM였다.

7.3.2. NMR 분광기

B-VT2000 온도조절기가 장착된 Bruker DRX500 분광광도계를 이용한¹H NMR 스펙트럼은 50MHz가 필요하였다. 일차, 이차원적 실험은 표준 펄스 서열을 이용하여 기록하였다(Two Dimensional NMR Spectroscopy, Eds. W.R. Croasmun and RMK Carlson, 1994, VCH Publishers, New York, USA). 물현탁액은 2초동안 저파워 선포화로 만들었다. 이차원적 실험은 시간 분할상 증강(TPPI) 및 양차원상의 6000Hz 스펙트럼 너비를 이용한 상 민감성 모드를 이용하여 실시하였다. 일반적으로, 40 스캔은 240 데이터포이터를 가진 400 t₁증가를 위해 동시에 첨가한다. 데이터는 FELIX95 소프트웨어(Molecular Simulation)를 사용하여, INDIGO2 작업대(Silicon Graphics)상에서 처리하였다. 데이터는 0부터 넣어, 2K X 2K 데이터 메트릭스를 만들고, 45°이동한 사각형 사인-벨 함수로 유도하였다.

7.3.3. NMR 지정

문헌에서 설명하는 바와 같이(Wuthrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids, 1986, John Wiley ＆ Sons, New Yor, USA), DQFCOSY, TOCSY, NOESY 스펙트럼을 이용하여 연속적으로 할당하는 기술을 적용하여 완전한 프로톤 공명 지정을 수득한다. 상응하는 실험에서 표로 만들어진 무작위 코일 화학전 변위를 감하여 HN 및 Hα프로톤에 대해 2차 화학적 변이를 계산하였다(Wishart and Sykes, 1994, Method. ENz. 239:363-392).

7.3.4. 결과 및 토의

일반적인 고려; NMR 스펙트로스코피에 필수적인 고농도에서 수용액에 양친화성 나선 펩티드가 응집하는 경향으로 인하여, 고해상 스펙트럼을 얻는 것이 어렵다. 샘플에 TFE를 첨가하면 스펙트럼의 해상도를 개선시킬 수 있다. TFE는 펩티드를 용해시키는 것으로 공지되고, 나선 형성 성형을 가지는 펩티드의 나선 모양을 안정화시키는 것으로 알려져 있다. NMR 스펙트로스코피에서 발견된 것으로 대표적인 예로써 펩티드 210(서열:210)의 것으로 설명된다. Segrest의 콘센선스 22-mer(서열:75)를 비교하기 위해 조사하였다.

2차 화학적 변이: 아미노산의 프로톤 화학적 변이는 잔기의 형태 및 펩티드 또는 단백질내에 있는 국소 2차 구조에 따라 달라진다(Szlagyi, 1995, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 27:325-443). 따라서, 규칙적인 2차 구조 확인은 표로 작성된 무작위한 코일 모양의 것과 실험중인 변이를 비교하면 된다.

α-나선은 일반적으로 Hα공명에 대해 up-field(네가티브) 변환으로 인하여 형성되는 것이다. 몇 개의 연속하는 잔기에서 upfield Hα변이가 관찰되면 나선 구조가 있다는 것으로 간주한다. 295K에서 25% TFE에서 펩티드 210(서열:210)의 Hα2차 변환은 잔기 4내지 15의 상당한 네가티브 변환을 나타낸다(도 7A). 이는 바로 나선 모양을 설명하는 것이다. 펩티드 210(서열:210)의 것과 비교하였을 때, 콘센선스 22-mer(서열:75)의 Hα변이에는 작은 차이가 있었다.

무작위 코일에서 관찰되는 화학적 변이에 비고하면 α-나선 부분에 있는 아미노산 잔기의 아미드 수소의 화학적 변이는, upfield 쪽으로 이동되었다. 또한, HN 이종의 주기성이 관찰되고, 이는 나선의 턴(turn) 주기를 반영하는 것이다. 서열을 EK라 변이의 다양성 정도는 나선형 펩티드의 양친화성과 관련된다. 소수성 모멘트가 더 높은 경우에는 더욱 선명한 진동을 유도한다(Zhou et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114:4320-4326). 25% TFE, 295K에서 펩티드 210(서열:210)의 HN 2차 변이에서는 나선의 양친화성 성질과 일치하는 진동 거동을 나타낸다(도 7B).

아미노산 치환은 전체 서열에서 좀더 심각한 주기성을 나타낸다(도 7B). 이 패턴은 Segrest 콘센선스 22-mer(서열 75)와 비교하였을 때, 펩티드 210(서열:210)이 더 강한 양친화성 성질을 반영한다. 5-6회 turn이 존재한다는 것을 논의 할 수 있다.

아미드 프로톤의 2차 변이는 나선으로부터 벗어나려는 카르보닐-산소와 수소 결합의 길이에 영향을 받는다. 따라서, 관찰된 화학적 변이 값의 주기성은 상이한 수소 결합 길이를 반영하는 것이다. 이와 같은 차이는 나선의 기본 골격에서 전반적으로 곡선을 이루는 나선 모양과 연합된다. 소수성 잔기는 오목한 측면에 위치한다. 펩티드 210(서열:210)의 2차 변이는 곡선을 이루는 α-모양을 나타낸다.

8. 실시예 : LCAT 활성화 검사

단락 6에서 설명하는 것과 같이 합성된 펩티드는 LCAT를 활성화시키는 능력이 있는지에 대해 in vitro에서 분석하였다. LCAT 검사에서, 난 포스파티딜콜린(EPC) 또는 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜-콜린(POPC) 및 방사능라벨된 콜레스테롤로 구성된 기질 소포(작은 단층 라벨라 소포 또는 "SUVs")를 동량의 펩티드 또는 ApoA-I(사람의 혈장에서 분리됨)와 배양시킨다. 반응은 LCAT(사람 혈장에서 정제한)를 첨가하여 개시한다. 고유 ApoA-I(포지티브 기준으로 이용)은 100% 활성화 활성을 나타낸다. 펩티드의 "특이 활성"(가령, LCAT 활성화의 활성 단위/단위 양)은 최대 LCAT 활성화를 이루는 펩티드의 농도로 계산된다. 예를 들면, 펩티드의 일련의 농도(가령, 희석)를 측정하여 펩티드에 대해 "특이 활성"을 결정한다--이는 특정 검사 시간대에 최대 LCAT 활성화를 얻는 농도(가령, 콜레스테롤이 콜레스테롤 에스테르로 전환하는 비율)를 말한다. 1시간에 콜레스테롤의 전환 비율을 플롯하여, 곡선에서 고원을 이루는 펩티드의 농도로 확인할 수 있다.

8.1. 기질 소포의 준비

LCAT 검사에 이용되는 소포는 난 포스파티딜콜린(EPC) 또는 1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜-콜린(POPC) 및 콜레스테롤이 몰비가 20:1로 구성된 SUVs이다. 40외 검사를 하는데 충분한 소포 원액 용액을 준비하기 위해, 7.5㎎ EPC(또는 7.6㎎ POPC; 10μmol), 78㎍(0.2μmol) 4-¹⁴C-콜레스테롤, 116㎍ 콜레스테롤(0.3μmol)을 5㎖ 실렌에 용해시키고, 냉동건조시킨다. 따라서, 4㎖ 검사 완충액을 건조 분말에 첨가하고, 4℃에서 질소 대기하에 초음파분쇄시킨다. 초음파분쇄의 조건; 검사 완충액: 10mM Tris, 0.14M NaCl, 1mM EDTa, pH7.4. 초음파분쇄된 혼합물은 14,000rpm(16,000x g)에서 각 5분간 6회 원심분리시켜, 티타늄 입자를 제거한다. 생성된 맑은 용액을 효소 검사에 이용한다.

8.2. LCAT의 정제

LCAT 정제를 위해, 사람 혈장을 덱스트란 설페이트/Mg²⁺처리한 것을 이용하여 리포프로테인 결손된 혈청(LPDS)을 수득하는데, 이는 다음의 표 9에서 제시한 정제과정과 같이 페닐세파로즈, Affigelblue, ConcanavalineA Sepharose, 항-ApoA-I 친화력 크로마토그래피에서 크로마토그래피한다.

표 9

8.2.1 LPDS 조제

LPDS를 준비하기 위해, 500㎖ 혈장을 50㎖ 덱스트란 설페이트(MW=500000) 용액에 첨가한다. 20 분간 교반 시킨 후에, 3000rpm(16,000 x g), 4℃에서 30분간 원심분리한다. 추가 정제를 위해 상청액(LPDS)(ca. 500㎖)을 이용한다.

8.2.2. 페닐세파로즈 크로마토그래피

다음의 재료 및 조건을 이용하여, 페닐세파로즈 크로마토그래피를 실시한다;

고형상; 페닐세파로즈의 고속 흐름, 고단위 기질, 등급, Pharmacia

컬럼; XK26/40 겔 상 높이; 33 cm, V=ca. 175㎖

유속; 200㎖/hr(샘플)

세척; 200㎖/hr(완충액)

용출; 80㎖/hr

완충액; 10 mM Tris, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH7.4, 0.01% 아지드 나트륨

Tris 완충액으로 컬럼을 평형을 이룬 후에, 29g NaCl을 500㎖ LPDS에 첨가하여, 컬럼에 얹는다. 몇 배 용적의 Tris 완충액으로 세척하여, 280nm에서의 흡수도가 거의 기저수준이 되도록 하고, 그 다음 증류수로 용출한다. 단백질을 포함하는 분취물을 모으고(크기;180㎖), Affigelblue 크로마토그래피에 이용한다.

8.2.3. Affigelblue 크로마토그래피

페닐세파로즈 농충액은 4℃ 20mM Tris-HC1, pH7.4, 0.01% 아지드 나트륨에 대해 하룻밤동안 투석시킨다. 푸울 용적은 한외원심분리(Amicon YM30)하여, 용적으로 50-60㎖로 감소시키고, Affigelblue 컬럼에 얹는다.

고형 상; Affigelblue, Biorad, 153-7301 컬럼, XK26/20 겔 베드 상 높이; ca. 13 cm; 컬럼 용적; 70㎖

유속- 적하;15㎖/h

세척;50㎖/h

평형은 Tris 완충액을 이용한다. 페닐세파로즈 푸울을 컬럼에 얹는다. 분취물을 수집하기 위해 나란히 시작한다. Tris 완충액으로 세척한다. 푸울된 분취물(170㎖)은 ConA 크로마토그래피에 사용한다.

8.2.4. ConA 크로마토그래피

Affigelblue 푸울은 Amicon(YM30)을 이용하여 30-40㎖으로 감소시키고, ConA 시발 완충액(1mM Tris HC1 pH7.4; 1mM MgCl₂, 1mM MnCl₂, 1mM CaCl₂, 0.01% 아지드 나트륨)을 이용하여 4℃에서 하룻밤동안 투석시킨다.

고형 상; ConA 세파로즈(Pharmacia)

컬럼; XK26/20 겔 상 높이; 14cm(75㎖)

유속; 적하 40㎖/h

세척(시발 완충액과 함께); 90㎖/h

용출; 50㎖/h, 0.2M 메틸-α-D-만노시드/1mM Tris, pH 7.4.

만노시드 용출액의 단백질 분취물을 모으고(110㎖), 용적은 한외원심분리(YM30)를 이용하여, 44㎖로 감소시킨다. ConA 푸울은 2㎖로 나누고, -20℃에 저장하였다.

8.2.5 ANTI-ApoA-I 친화력 크로마토그래피

Anti-ApoA-I 친화력 크로마토그래피를 Affigel-Hz 물질(Biorad)에서 실시하였고, 이때 항-ApoA-I이 공유결합되어 있었다.

컬럼; XK16/20, V=16㎖ 컬럼은 PBS pH 7.4.로 평형을 이루고, 2㎖ ConA 푸울 은 컬럼에 적하하기 전에 2시간동안 투석시킨다.

유속; 적하; 15㎖/h

세척; PBS 40㎖/hour.

푸울된 단백질(V=14㎖)은 LCAT 검사에 이용된다.

컬럼은 0.1M 구연산 완충액(pH 4.5)으로 다시 만들어, 결합된 A-I(100㎖)을 용출시키고, 이과정후에 바로 PBS로 평형을 이루게 한다.

8.3 결과

LCAT 활성화 검사의 결과는 표 10에 나타내었다.

표 10

표 10에서, *는 N-말단 아세틸화된 그리고 C-말단 아미데이트된 펩티드를 나타낸다; '는 N-말단 단실화된 펩티드를 나타내고; sp는 실험조건에서 용해도 문제를 일으키는 펩티드를 나타내고; X는 Aib이고; Z는 Nal이고; O는 Orn이고; He(%)는 나선형성비율을 나타내고; mics는 미셀을 나타내고; ~는 결손된 아미노산을 나타낸다.

9. 실시예: ApoA-I 작용물질의 약리역학

다음의 실시예는 ApoA-I 작용물질이 혈장의 HDL 성분과 연합하고, 순환계에서 안정하다는 것을 설명한다.

9.1. 방사능라벨된 펩티드의 합성

방사능라벨된 펩티드는 N-말단 아미노산으로¹⁴C-라벨된 Fmoc-Pro를 결합시켜 합성하였다. 합성은 Lapatsanis, Synthesis 1983, 671-173에 따라 실행한다. 간략하게 설명하면, 라벨안된 L-프로린 250μM (29.6 mg)을 225㎕ 9% Na₂Co₃에 용해시키고, 9.25MBq(250 μM)¹⁴C 라벨된 L-프로린 용액(9% Na₂Co₃)에 첨가하였다. 액체는 0℃로 냉각시키고, 600μM(202 mg) 9-플로레닐메틸-N-숙시니미딜카르보네이트(Fmoc-Osu)/0.75㎖ DMF와 혼합시키고, 실온에서 4시간동안 교반시킨다. 그 다음 혼합물은 디에틸에테르(2 x 5㎖) 및 클로로포름(1X5㎖)로 추출하고, 나머지 수용상은 30% HCl로 산성화시켜, 클로로포름으로 추출한다(5 x 8㎖). 유기상은 Na₂SO₄,에서 건조시키고, 여과시켜, 용적을 질소 기류하에서 5㎖로 감소시킨다. 순도는 TLC(CHCl₃:MeOH:Hac, 9:1:0.1 v/v/v 정체상 HPTLC 실리카겔 60, Merck, Germany)을 이용하여 측정한다.

¹⁴C-Fmoc 프로린을 포함하는 클로로포름 용액을 이용하여 직접적으로 펩티드 합성을 한다. 아미노산 2-22를 포함하는 펩티드 수지(단락 6에서 설명하는 것과 같이 자동으로 합성됨)를 합성에 이용한다. 펩티드의 서열은 Edman 분해를 이용하여 결정한다. 결합은 단락 6.1에서 설명한 것과 같이 실행한다.

9.2. 생쥐에서 약리역학

각 실험에서, 2.5mg/kg 방사능라벨된 펩티드를 생쥐의 복막으로 주사하는데, 이때 생쥐는 정상적인 생쥐 음식 또는 아테롬발생성 Thomas-Harcroft 변형된 다이어트(그 결과는 VLDL 및 IDL 콜레스테롤이 심각하게 상승됨)를 제공한다. 혈액 샘플을 여러 시간대에 측정하여 혈장에서 방사능활성을 평가한다. 그 결과는 표 11에 나타내었다.

9.3. 사람 혈청에서 안정성

사람 혈청에서 ApoA-I 작용물질의 안정성을 다음에서 논의한다.

9.3.1. 실험 방법

100㎍¹⁴C-라벨된 펩티드(단락 9.1)은 2㎖ 새로운 사람 혈장과 혼합하고(37℃에서), 바로 지질을 제거하거나(기준 샘플) 또는 37℃에서 8일간 배양한 후에 제거한다(시험 셈플). 지질제거는 동양의 2:1(v/v) 클로로포름:메탄올을 이용하여 지질을 추출함으로써 제거된다.

샘플은 역상 C₁₈HPLC 컬럼에 적하시키고, 아세토니트릴(0.1% TFA 포함) 선형 농도 경사(25-58%, 33분)를 이용하여 용출시킨다. 용출 프로파일을 작성 한 후에, 흡수도(220㎚) 및 방사능활성을 평가한다.

9.4. pre-β형 입자의 형성

pre-β형 입자를 형성하는 본 발명의 ApoA-I 작용물질의 능력을 하기에서 설명한다.

9.4.1. 실험 방법.

사람 HDL은 KBr 밀도 울트라 원심분리(밀도d= 1.21g/㎖)에 의해 분리시켜, 상측 분취물을 얻고, Superose 6 겔 여과 크로마토그래피를 실시하여, 다른 리포프로테인에러 HDL을 분리하였다. 분리된 HDL의 최종 농도를 생리학적 염으로 1.0 mg/㎖이 되도록 조정하는데, 이는 Bradford 단백질 검사에 의해 결정된 단백질 함량에 기초한 것이다. 300㎕ 방출을 분리된 HDL 준비물로부터 빼내어, 37℃에서 2시간 동안 100㎕¹⁴C-라벨된 펩티드 4(0.2-1.0㎍/㎕)와 배양시킨다. 5개 별개 배양물을 분석한다(블랭크-100㎕ 생리학헉 염 및¹⁴C-라벨된 펩티드 4의 4가지 희석물질 포함: (i) 0.20㎍/㎕ 펩티드:HDL=1:15;(ii) 0.30㎍/㎕ 펩티드:HDL=1:10; (iii) 0.60㎍/㎕ 펩티드:HDL=1:5; (iv) 1.00㎍/㎕ 펩티드:HDL=1:3 포함). 2시간 배양 후에, 샘플 200㎕(총 샘플의 용적은 400㎕)를 Superose 6 겔 여과 컬럼에 적하시켜, 리포프로테인 분리 및 분석을 시키는데, 100㎕를 이용하여 컬럼에 적하된 총 방사능활성을 측정한다.

9.5. 사람 리포프로테인과 펩티드 4의 연합

9.5.1 실험 방법

사람 리포프로테인과 본 발명의 ApoA-I 작용물질이 연합하는 능력은 각 리포프로테인 종류(HDL, LDL, VLDL)과 상이한 종류의 리포프로테인 종유를¹⁴C-라벨된 펩티드와 배양하여 결정한다.

HDL, LDL, VLDL은 KBr 밀도차 한외원심분리(d=1.21g/㎖)를 이용하여 분리시키고, FPLC에 의해 Superose 6B 컬럼 크기 압출 컬럼(크로마토그래피는 유속 0.7㎖/min에서 실시하고, 완충액은 10mM Tris(pH 8), 115 mM NaCl, 2 mM EDTA 0.01% NaN₃)에서 실시하였다.¹⁴C-라벨된 펩티드 4는 HDL, LDL, VLDL과 펩티드:인지질 비율이 1:5(질량비)로 하여, 37℃에서 2시간동안 배양시켰다. 필요한 리포프로테인의 양(1000㎍을 생산하는데 필요한 용적을 기준)을 0.2㎖ 펩티드 원액(1mg/㎖)과 혼합하고, 용액은 0.9% NaCl을 이용하여, 2.2㎖로 만든다.

37℃에서 2시간 동안 배양시킨 후에, 몇 방울(0.1㎖)을 빼내어, 총 방사능활성을 측정하기 위해 액체 신틸레이션 카운터를 하고, 남아있는 배양 혼합물의 밀도는 1.21g/㎖(KBr로 조정)로 하고, 샘플은 24시간 동안 4℃에서 TLA 100.3 rotor Beckman 테이블 탑 한외원심분리기를 이용하여, 100,000rpm(300,000 g)에서 원심분리한다. 생성된 상청액은 총 5개 분취물에서 각 샘플의 상단으로부터 0.3㎖을 빼내어 분취시킨다음 각 0.05㎖ 분취물을 이용하여 액체 신틸레이션 카운터를 실시한다. 상측 두 개 분취물에는 부유하는 리포프로테인을 포함하고, 다른 분취물(3-5)에는 용액에 단백질.펩티드에 상응하는 것을 포함한다.

9.6. 사람 혈정에서 HDL 지질에 선택적으로 결합하는 본 발명의 ApoA-I 작용물질.

9.6.1. 실험 방법

사람 혈장에 있는 HDL 단백질에 본발명의 ApoA-I 작용물질이 선택적으로 결합하는 것을 설명하기 위해, 사람 혈장(2㎖)을 2시간 동안 20, 40, 60, 80, 100㎍¹⁴C-라벨된 펩티드 4로 배양시켰다. 리포프로테인은 밀도를 1.21g/㎖로 조정하고, TLA 100.3 로터(100,000rpm(300,000 g)), 4℃에서 36시간 원심분리시켜 분리하였다. 상측 900㎕ (300㎕ 분취물에서)를 분석을 위해 취한다. 각 300㎕분취물에서 50㎕는 방사능활성을 카운터하고, 각 분취물에서 200㎕는 FPLC분석(Superose 6/Superose 12 복합 컬럼)으로 분석하였다.

10. 실시예 ; ApoA-I 작용제는 콜레스테롤 방출을 촉진시킨다.

본 발명의 ApoA-I 작용물질이 콜레스테롤 방출을 촉진시킨다는 것을 설명하기 위해, HepG2 간종양 세포는 6-웰 배양 접시에 도말하고 합류가 되도록 생장시킨다. 콜레스테롤을 건조시키고, 1% 소 혈청 알부민(BSA).인산염 완충염(PBS)에 첨가하고, 용액을 초음파분쇄시키고, 0.2㎖ 라벨링 용액 및 1.8㎖ 생장 배지를 세포에 첨가하여, 세포는³H-콜레스테롤로 라벨시킨 다음 각 웰에는 2 μCi 방사능활성을 포함한다. 세포는 라벨링 배제로 24시간 동안 배양시킨다.

펩티드(또는 단백질):DMPC 복합물은 1:2 펩티드(또는 단백질):DMPC 비율(w:w)에서 준비하였다. 복합체를 준비하기 위해, 펩티드4(서열:4) 또는 고유 사람 ApoA-I 단백질을 DMPC/PBS 용액에 첨가시키고, 실온에서 하룻밤동안 배양시키고, 이때 용액은 맑은 용액이 될 때까지 실시한다. 최종 용액에서의 펩티드 또는 단백질의 농도는 1mg/㎖이다.

라벨링 배지를 세포로부터 제거하고, 세포는 PBS로 세척하여, 복합체를 첨가한다. 1.6㎖ 생장 배지를 각 웰에 첨가하고, 펩티드(또는 단백질):DMPC 복합체 및 충분한 양의 PBS를 각 웰에 최종 용적이 2㎖이 되도록 한다. 최종 펩티드 또는 ApoA-I 농도는 1, 2.5, 5, 7.5, 25㎍/㎖ 배지가 된다. 37℃에서 24시간 배양후에, 배지를 제거하고, 세포는 2㎖ 1% BSA/PBS로 세척하고, 각 PBS 2㎖로 세척한다. 배지로 배출된³H-콜레스테롤의 양은 액체 신틸레이션 카운터로 결정한다.

11. 실시예: 동물 모델 시스템에서 ApoA-I의 작용제의 용도

본 발명에서 ApoA-I 작용제의 효과는 토끼에서 설명하고 있다.

11.1 인지질/펩티드 복합체의 준비

인지질(DPPC) 및 펩티드로 구성된 작은 원판상 입자는 콜레이트 투석 방법을 이용하여 준비하였다. 인지질은 클로로포름에 용해시키고, 질소 기류하에 전고시킨다. 펩티드는 완충액(염)에 2mg/㎖농도에서 용해시킨다. 지질 막은 콜레이트(43℃)을 포함하는 완충액에서 다시 용해시키고, 펩티드 용액은 3:1 인지질/펩티드 질량비로 첨가하였다. 혼합물은 43℃에서 하룻밤동안 배양시키고, 43℃(24 hr.)에서 투석, 실온(24 hr.) 및 4℃(24 hr.)에서 각각 투석시키는데, 이때 각 온도대에서 완충액을 세 번 교환시킨다. 복합체는 주사용으로 사용하기 위해 여과 멸균(0.22 μm)시키고, 4℃에 저장하였다.

11.2 펩티드/인지질 입자의 분리 및 특징조사

입자는 겔 여과 컬럼(Superose 6 HR)상에서 분리하였다. 입자를 포함하는 피크의 위치는 각 분취물에 있는 인지질의 농도를 측정하여 확인하였다. 용출 용적으로부터, Stokes 반경을 결정한다. 복합물에 있는 펩티드의 농도는 16시간동안 산 가수분해후에, 페닐알라닌 함량(HPLC를 이용)을 측정하여 결정한다.

11.3. 토끼에 주사

New Zealand 수컷 희 토끼(2.5-3 kg)에 정맥으로 1회 약량이 10-15㎖이 초과하지 않게 인지질/펩티드 복합체(5-10mg/kg 체중, 펩티드 또는 10㎎/㎏ ApoA-I(기준)으로 표현됨) 약량을 주사하였다. 동물은 조작전에 안정을 시킨다. 주사전에 그리고 주사후 5, 15, 30, 60, 240, 1140분에 혈액 샘플(EDTA를 이용하여 수집)을 취한다. 각 샘플에서 헤마토크릿트(Hct)를 측정한다. 샘플을 나누고, 분석하기 전에 -20℃에 저장시킨다.

11.4. 토끼 혈청 분석

혈장 지질; 총 혈장 콜레스테롤, 혈장 트리글리세리드, 혈장 인지질은 제조업자의 지시에 따라 시판되는 검사 장비를 이용하여 효소를 이용하여 측정하였다(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany and Biomerieux, 69280, Marcy-L' etoile, France).

리포프로테인 프로파일; 혈장을 이의 리포프로테인 분취물로 분리시킨 후에 수득된 혈장 리포프로테인 프로파일은 슈크로즈 밀도 차에서 스핀하여 측정하였다. 분취물을 수득하고 각 개별 분취물에서 인지질 및 콜레스테롤 함량을 효소적으로 측정하였다.

12. 실시예 공동-냉동건조 방법에 의해 펩티드-지질 복합체의 준비

다음의 과정을 이용하여 펩티드-지질 복합체를 준비한다.

1㎎ 펩티드 210(서열:210) 펩티드를 250㎕ HPLC 등급 메탄올(Perkin Elmer)에 용해시킨다(뚜껑이 있는 1㎎ 유리 바이알(Waters #WAT025054)). 펩티드를 용해하는데 있어서 실온에서 10분상 간헐적으로 교반하면 도움이 된다. 이 혼합물에, 100㎎/㎖ 원액/메탄올로부터 3㎎ 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC; Avanti Polar Lipids, 99% Purity, product #850355)을 이 혼합물에 첨가한다. 혼합물의 용적을 메탄올을 첨가시켜, 400㎕로 하고, 혼합물은 실온에서 10분동안 간헐적으로 교반시킨다. 각 튜브에, 200㎕ 실렌(Sigma-Aldrich 99% pure, HPLC-grade)을 첨가하고, 튜브를 각 10초간 교반시킨다. 20가우지 바늘을 이용하여 각 튜브의 꼭대기에 두 개의 작은 구멍을 내고, 튜브는 액체 질소하에서 각 15초간 냉동시키고, 튜브는 진공하에서 냉동건조시킨다. 각 튜브에 200㎖ 0.9% NaCl 용액을 첨가한다. 튜브는 각 20초간 교반시킨다. 이때 튜브에 있는 용액은 우유빛이 난다. 그 다음 튜브는 41℃에서 30분간 수조에서 둔다. 41℃에서 몇 분 배양 하면, 용액이 맑아진다(물과 비슷한 외양).

12.1 슈퍼로즈 6 겔 여과 크로마토그래피에 의한 복합체의 특성화

펩티드 210(서열:210)를 함유한 펩티드-인지질 복합체는 전술한 바와 같이 동시 건조동결하여 제조하였다. 제조물은 중량당 1mg 펩티드 및 3 mg DPPC를 보유하였다. 200㎕의 0,9% NaCl에서 복합체를 재구성한후, 복합체의 20㎕(100㎕펩티드 210)은 액체상으로 0.9%NaCl을 이용하여, Pharmacia Superose 6 칼럼에 첨가하였는데, 유속은 분당 0.5㎖이 되게 하였다. 크로마토그래피는 280nm 파장의 광흡수도 또는 분산도로 모니터하였다. 1㎖ 분취물을 수거하였다. 20㎕의 분취물을 함유한 일정부분은 제조자가 제시한 지시를 따라 bioMeriux Phospholipid Enzymatique PAP 150 키트(#61491)를 이용하여 인지질 함량을 분석하였다. 인지질 및 UV 흡수도 대부분은 대략 15.1㎖에서 최대치를 기록한 몇 개의 분취물에서 얻었다. 이런 용출부피는 스토크의 106Å 직경에 해당한다.

비교를 위해, 20㎕의 사람 HDL₂의 개별 크로마토그램은 동일한 조건에서 걸고, 펩티드 210 복합체로 동일한 칼럼을 사용하였다. HDL₂는 다음과 같이 만들었다: 300㎖ 동결된 사람 혈장(Manheim Blutspendzentrale #1185190)은 해동하고, 고형 브롬화칼륨으로 1.25밀도로 조정하고, 20℃에서 Ti45 로터(Beckmen)를 이용하여 45시간동안 40,00RPM으로 원심분리하였다. 유동층은 수거하고, 증류수에서 희석하고, 고형브롬화칼륨으로 1.07밀도로 조정하고, 70시간동안 전술한 바와 같이 원심분리하였다. 바닥층(튜브 바닥위 1cm 수준)은 수거하고, 0.01% 아지드나트륨을 가하고, 크로마토그래피 실시때까지 4일동안 4℃로 보관하였다. 칼럼 용출액은 254nm 파장의 광흡수도 또는 분산도로 모니터하였다. 분자량 및 스토크 직경이 공지된 일련의 단백질은 입자(Pharmacia Gel Filtration Calibration Kit Instruction Manual, Pharmacia Laboratory Separation, Piscataway, NJ, revised April, 1985)의 스토크 직경의 계산을 위한 칼럼의 눈금을 정하기 위한 표준으로 사용하였다. HDL₂는 14.8㎖의 유지부피로 용출하는데, 이 부피는 스토크 108nm 직경에 해당하는 것이다.

용적간에 불일치(방사능활성/인지질 검사 및 UV 흡수도로 측정하였을 때)는 UV 흡수도 유동 쎌과 분취물 수집기 출구사이에 있는 튜브의 데드 볼륨 1.3㎖ 때문이다. 이와 같은 용출 용적인 Stokes' 114 Å직경에 상응한다. 용출 용적이 15-19㎖인 것은 Stokes의 90-120Å 입자에 상응하고, 이는 사람의 HDL의 크기 범위이다.

13. 실시예; 항체의 준비

본 발명의 ApoA-I 작용물질에 대한 항체를 준비하기 위해, 펩티드를 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH; 1mg 펩티드- 10mg KLH)에 공액시킨다. KLH 공액물(LMG)을 컴플리트 Freund's 어쥬번트에 현탁시키고, 0시간에 토끼에 주사하고, 4주째와 5주째에 0.25mg KLH로 부스팅시킨다. 사전에 혈액 및 6주후에 취한 혈액에서 ELISA를 이용하여 조규 항원에 대해 항체 역가를 테스트한다.

각 두 마리 토끼에서 출혈된 샘플을 모은다. 펩티드 항원에 대한 배타적인 항체는 다음과 같이 분리하였다;

1. 자유 펩티드는 제조업자의 프로토콜에 따라 브롬화 시아노겐 활성화된 Sepharose 4B(Pharmacia)에 부착된다.

2. 항혈청은 무관한 펩티드 및 무관한 사람 및 생쥐 혈청 단백질 컬럼에 미리 흡착시킨다.

3. 미리-흡착된 항혈청은 이에 상응하는 펩티드 컬럼(1을 참고)을 통과시킨다.

4. 컬럼은 0.1 M 붕산 완충염(pH 8.2)으로 세척하고, 결합된 항체는 낮은 pH에서(pH 4.0) 시작하여, pH3.0, pH2.0(0.1 M 글리신 완충액)을 거쳐 최종 0.1M HCl을 이용하여 용출시킨다.

5. 용출된 물질은 과량의 붕산염으로 중화시키고, 한외여과(Amicon, YM30)에 의해 농축시키고, 붕산염에 대해 투석시킨다.

6. 단백질 농도는 280nm에서 흡수도를 측정하여 결정한다.

생성된 항체는 정제된 사람 ApoA-I 또는 정제된 생쥐 ApoA-I를 이용하여, 직접적인 ELISA 결합 검사에 따라 종간 특이성을 테스트한다. 사람 및 뮤린 항체는 사람 ApoA-I에 특이적이고, 이는 교차-활성이 최소라는 것을 설명한다.

본 발명은 여기에서 설명하는 특정 구체예에 국한되는 것이 아니고, 이와 같은 구체예는 본 발명의 개별적인 특징으로 설명하고자 함이며, 이의 기능적인 등가 방법 및 성분 또한 본 발명에 속한다는 것을 인지할 것이다. 여기에서 설명하는 것에 추가하여 다양한 변형 및 수정이 본 발명의 설명 및 첨부된 도면에서 당업자가 충분히 실시할 수 있으며, 이 또한 본 발명에 속한다는 것을 인지할 것이다.

여기에서 언급하는 모든 문헌은 참고를 목적으로 첨부한다.

Claims

다음과 같이 이루어지는 ApoA-I 작용제:

(i) 지질존재하에서, 양친화성 α-나선을 형성하고, 다음의 구조화학식(I)으로 이루어지는 14 내지 22개 아미노산 펩티드 또는 펩티드 유사체 또는 이들의 제약학적으로 수용가능한 염:

Z₁-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆-X₁₇-X₁₈

여기서, X₁은 Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N) 또는 D-Pro(P) 이며;

X₂는 지방족 아미노산이고;

X₃은 Leu (L)이며;

X₄는 산성 아미노산이고;

X₅은 Leu (L) 또는 Phe (F)이며;

X₆은 Leu (L) 또는 Phe (F)이고;

X₇은 염기성 아미노산이고;

X₈은 산성 아미노산이고;

X₉는 Leu (L) 또는 Trp(W)이고;

X₁₀은 Leu (L) 또는 Trp(W)이고;

X₁₁은 산성 아미노산 또는 Asn(N)이고;

X₁₂는 산성 아미노산이고;

X₁₃은 Leu (L), Trp(W) 또는 Phe(F)이고;

X₁₄는 염기성 아미노산 또는 Leu(L)이고;

X₁₅는 Gln(Q) 또는 Asn(N)이고;

X₁₆은 염기성 아미노산이고;

X₁₇은 Leu(L)이고;

X₁₈은 염기성 아미노산이고;

Z₁은 H₂N- 또는 RC(O)NH-이고;

Z₂는 -C(O)NRR, -C(O)OR 또는 -C(O)OH 또는 이의 염이고;

이때, 각 R은 독립적으로 -H, (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알켄일, (C₁-C₆)알킨일, (C₅-C₂₀)아릴, (C₆-C₂₆)알크아릴, 5-20각형 헤테로아릴, 6-26각형 알크헤테로아릴, 또는 1 내지 4개의 아미노산 펩티드 또는 펩티드 유사체이고;

아미노산 잔기(Xn)간이 "－"는 아미드 결합기, 치환된 아미노 결합기, 아미드 이소스티어 또는 아미드 모방체이다;

(II) 구조화학식(I)의 결손된 형태, 여기서 ,X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈중 적어도 하나에서 최대 8개 잔기가 결손된다;

(II) 구조화학식(I)의 변형된 형태, 여기서 ,X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, 또는 X₁₈중 적어도 한 잔기는 다른 잔기로 보존치환된다.
제 1항에 있어서, 사람 ApoA-I과 비교할 때, 적어도 38% LCAT-활성화활동을 보이는 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.
제 1항에 있어서, 구조화학식(I)의 변형된 형태인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.
제 3항에 있어서, 소수성 잔기는 구조화학식(I)에 따라 고정되고, 적어도 하나의 비-고정된 잔기는 다른 잔기로 보존치환되는 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.
제 4항에 있어서,

X₁은 Pro(P), D-Pro(P), Gly(G), Asn(N) 또는 Ala(A)이고;

X₂는 Ala(A), Val(V) 또는 Leu(L)이고;

X₃은 Leu(L)이고;

X₅는 Leu(L) 또는 Phe(F)이고;

X₆은 Leu(L) 또는 Phe(F)이고;

X₉는 Leu(L) 또는 Trp(W)이고;

X₁₀은 Leu(L) 또는 Trp(W)이고;

X₁₃은 Leu(L), Trp(W) 또는 Phe(F)이고;

X₁₇은 Leu(L)이고;

X₄, X₇, X₈, X₁₁, X₁₂, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₈중 적어도 하나는 다른 잔기로 보존치환되는 것을 특징으로 하는 ApoP-I 작용제.
제 3항에 있어서, 친수성 잔기는 구조화학식(I)에 따라 고정되고, 적어도 하나의 고정되지 않은 잔기는 다른 잔기로 보존치환되는 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.
제 6항에 있어서,

X₄는 Asp(D) 또는 Glu(E)이고;

X₇은 Lys(K), Arg(R) 또는 Orn이고;

X₈은 Asp(D) 또는 Glu(E)이고;

X₁₁은 Asn(N) 또는 Glu(E)이고;

X₁₂는 Glu(E)이고;

X₁₄는 Lys(k), Arg(R) 또는 Orn이고;

X₁₅는 Gln(Q) 또는 Asn(N)이고;

X₁₆은 Lys(K), Arg(R) 또는 Orn이고;

X₁₈는 Asn(N) 또는 Gln(Q)이고;

X₁, X₂, X₃, X₅, X₆, X₉, X₁₀, X₁₃, X₁₇중 적어도 하나는 다른 잔기로 보존치환되는 것을 특징으로 하는 ApoP-I 작용제.
제 6항에 있어서, X₃은 Leu(L)가 되고; X₆은 Phe(F)가 되고, X₉은 Leu(L) 또는 Trp(W)가 되고, X₁₀은 Leu(L) 또는 Trp(W)가 되고; X₁, X₂, X₅, X₁₃, X₁₇중 적어도 하나는 다른 잔기로 보존치환되는 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.
제 5항 또는 7항에 있어서, 치환잔기는 동일한 치환잔기 카테고리내에 있는 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.
제 1항에 있어서, 구조화학식(I)의 결손된 형태인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.
제 10항에 있어서, 펩티드 또는 펩티드 유사체의 나선회전 하나가 결손된 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.
제 1항에 있어서, 구조화학식(I)의 18개 아미노산 펩티드 또는 펩티드 유사체인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.
제 12항에 있어서, 잔기 사이의 "-"은 -C(O)NH를 의미하고, Z₁은 H₂N-이고, Z₂는 -C(O)OH 또는 이의 염인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.
제 13항에 있어서,

X₁은 Pro(P), Gly(G), Ala(A), Asn(N), Asp(D), 또는 D-Pro(P)이고;

X₂는 Ala(A), Val(V) 또는 Leu(L)이고;

X₃Leu (L)이며;

X₄는 Asp(D) 또는 Glu(E)이고;

X₅은 Leu (L) 또는 Phe (F)이며;

X₆은 Leu (L) 또는 Phe (F)이고;

X₇은 Lys(K), Arg(R) 또는 Orn이고;

X₈은 Asp(D) 또는 Glu(E)이고;

X₉은 Leu (L) 또는 Trp(W)이고;

X₁₀은 Leu (L) 또는 Trp (W)이고;

X₁₁은 Asn(N) 또는 Glu(E)이고;

X₁₂는 Glu(E)이고;

X₁₃은 Trp(W), Leu (L) 또는 Phe(F)이고;

X₁₄은 Arg(R), Lys(K) 또는 Orn이고;

X₁₅는 Gln(Q) 또는 Asn(N)이고;

X₁₆은 Arg(R), Lys(K) 또는 Orn이고;

X₁₇은 Leu(L)이고;

X₁₈은 Lys(K), Arg(R) 또는 Orn인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.
제 1항에서 있어서, 다음에서 선택되는 특징으로 하는 ApoA-I 작용제.

N-말단 또는 C-말단중 한 곳은 막히거나 또는 막히지 않는 형태.
사람 ApoA-I과 비교할 때, 적어도 38% LCAT-활성화활동을 보이고, 다음과 같은 구조화학식(II)을 갖는 것을 특징으로 하는 다중결합 ApoA-I 작용제 또는 제약학적으로 수용가능한 이의 염:

(II) (II) HH｛LL_m-HH｝_nLL_m-HH

여기서, m은 독립적으로, 0 또는 1이고;

n은 0 내지 10의 정수이고;

각 "HH"는 독립적으로, 구조(I)의 코어 펩티드 또는 펩티드 유사체이고;

각 "LL"은 독립적으로, 이중기능 링커이고;

각 " - "은 독립적으로, 공유 결합이다.
사람 ApoA-I과 비교할 때, 적어도 38% LCAT-활성화활동을 보이고, 다음과 같은 구조화학식(III)을 갖는 것을 특징으로 하는 다중결합 ApoA-I 작용제 또는 제약학적으로 수용가능한 이의 염:

(III) X-N_ya-X_(ya-a)-(-N_yb-X_(yb-1))_p

여기서 각 X는 HH-(-LLm-HH-)-nLLm-HH 이며; 각 HH는 구조(I)의 코어 펩티드 또는 유사체, 변이, 절단, 내부삭제, 또는 연장된 형태일 수 있으며,

각 LL은 이중기능 링커이며;

각 m은 0 또는 1;

각 n은 0 내지 8의 정수;

각 LL은 이중기능 링커이며;

각 m은 0 또는 1;

각 n은 0 내지 8의 정수;

N_ya및 N_yb는 다작용성 연결부분이고, 이때 ya와 yb는 N_ya와 N_yb상의 작용기 개수를 나타내며;

각 ya 또는 yb는 3 내지 8의 정수이고;

각 p는 0 내지 7의 정수;

각 "－"는 공유결합을 나타낸다.
사람 ApoA-I과 비교할 때, 적어도 38% LCAT-활성화활동을 보이고, 다음과 같은 구조화학식(IV) 또는 (V)을 갖는 것을 특징으로 하는 다중결합 ApoA-I 작용제 또는 제약학적으로 수용가능한 이의 염:

(IV) 또는 (V)

여기서, 각 X는 HH-(-LLm-HH-)-nLLm-HH 이며;

각 "HH"는 독립적으로, 제 1항에 따른 코어 펩티드 또는 펩티드 유사체이고;

각 LL은 이중기능 링커이며;

각 n은 0 내지 8의 정수;

각 m은 0 또는 1;

R₁은 -OR 또는 -NRR이고;

이때, 각 R은 독립적으로 -H, (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알켄일, (C₁-C₆)알킨일, (C₅-C₂₀)아릴, (C₆-C₂₆)알크아릴, 5-20각형 헤테로아릴, 또는 6-26각형 알크헤테로아릴이다.
제 16-18항중 어느 한 항에 있어서, 이중기능 링크는 분리가능한 것을 특징으로 하는 다중결합 ApoA-I 작용제.
제 16-18항중 어느 한 항에 있어서, n은 0인 것을 특징으로 하는 다중결합 ApoA-I 작용제.
제 20항에 있어서, m은 0인 것을 특징으로 하는 다중결합 ApoA-I 작용제.
제 16-18항중 어느 한 항에 있어서, 각 HH는 제 13항에 따른 펩티드인 것을 특징으로 하는 다중결합 ApoA-I 작용제.
제 16-18항중 어느 한 항에 있어서, 각 HH는 제 14항에 따른 펩티드인 것을 특징으로 하는 다중결합 ApoA-I 작용제.
제 16-18항중 어느 한 항에 있어서, 각 HH는 제 15항에 따른 펩티드인 것을 특징으로 하는 다중결합 ApoA-I 작용제.
ApoA-I 작용제 및 지질로 이루어진 ApoA-I 작용제-지질 복합체에 있어서, 상기 ApoA-I 작용제는 제 1항에 따른 펩티드 또는 펩티드 유사체, 제 16항에 따른 다중결합 ApoA-I 작용제, 제 17항에 따른 다중결합 ApoA-I 작용제, 또는 제 18항에 따른 다중결합 ApoA-I 작용제인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제-지질 복합체.
제 25항에 있어서, ApoA-I 작용제는 제 12항에 따른 펩티드인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제-지질 복합체.
제 25항에 있어서, ApoA-I 작용제는 제 13항에 따른 펩티드인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제-지질 복합체.
제 25항에 있어서, ApoA-I 작용제는 제 14항에 따른 펩티드인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제-지질 복합체.
제 25항에 있어서, ApoA-I 작용제는 제 15항에 따른 펩티드인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제-지질 복합체.
제 25항에 있어서, 지질은 스핑고미엘린인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제-지질 복합체.
제 25항에 있어서, 동결건조분말인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제-지질 복합체.
제 25항에 있어서, 용액형태인 것을 특징으로 하는 ApoA-I 작용제-지질 복합체.
ApoA-I 작용제 및 제약학적으로 수용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로 이루어진 제약학적 조성물에 있어서, ApoA-I 작용제는 제 1항에 따른 펩티드 또는 펩티드 유사체, 제 16항에 따른 다중결합 ApoA-I 작용제, 제 17항에 따른 다중결합 ApoA-I 작용제, 또는 제 28항에 따른 다중결합 ApoA-I 작용제인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 33항에 있어서, ApoA-I 작용제는 제 12항에 따른 펩티드인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 33항에 있어서, ApoA-I 작용제는 제 13항에 따른 펩티드인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 33항에 있어서, ApoA-I 작용제는 제 14항에 따른 펩티드인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 33항에 있어서, ApoA-I 작용제는 제 15항에 따른 펩티드인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 33-37항중 어느 한 항에 있어서, ApoA-I 작용제는 ApoA-I 작용제-지질 복합체이고, 상기 복합체는 ApoA-I 작용제 및 지질로 구성되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 38항에 있어서, ApoA-I 작용제-지질 복합체는 동결건조된 분말형태인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
지혈증이상과 관련된 질환으로부터 고통받는 개체를 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 개체에게 제 1항에 따른 ApoA-I 작용제의 효과량을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, ApoA-I 작용제는 제약학적 조성물의 형태이고, 상기 조성물은 ApoA-I 작용제, 제약학적으로 수용가능한 담체, 부형체 또는 희석제로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, ApoA-I 작용제는 ApoA-I 작용제-지질 복합체이고, 상기 복합체는 ApoA-I 작용제 및 지질로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 지혈증이상과 관련된 질환은 고콜레스테롤 혈(증)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 지혈증이상과 관련된 질환은 심장혈관 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 지혈증이상과 관련된 질환은 아테로마성경화증인 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 지혈증이상과 관련된 질환은 재협착층인 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 지혈증이상과 관련된 질환은 HDL 또는 ApoA-I 결핍인 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 지혈증이상과 관련된 질환은 고지혈증인 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 지혈증이상과 관련된 질환은 대사성 증상인 것을 특징으로 하는 방법.
폐혈성 쇼크와 관련된 질환으로부터 고통받는 개체를 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 개체에게 제 1항에 따른 ApoA-I 작용제의 효과량을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항 또는 50항에 있어서, 상기 개체는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항 또는 50항에 있어서, 0,5mg/kg 내지 100mg/kg ApoA-I 작용제를 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.