PL200515B1 - Zastosowanie aktywowanego białka C - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy zastosowania aktywowanego bia lka C (aPC) do wytwarzania leku do lecze- nia ludzi z nabytymi stanami nadkrzepliwo sci albo nabytymi stanami niedoboru aPC lub do zapobie- gania tym stanom. Leczenie lub zapobieganie obejmuje podawanie ludzkiego aktywowanego bia lka C w ci ag lym wlewie przez 24 do 144 godzin dawki 20 µg/kg/godzin e do 50 µg/kg/godzin e. Stan nad- krzepliwo sci albo nabyty stan niedoboru aPC zwi azany jest z posocznic a, plamic a piorunuj ac a, bakte- riemi a meningokokow a, oparzeniem, powik laniami w trakcie ci azy, powik laniami zakrzepowo-za- torowymi zwi azanymi z przeszczepianiem szpiku kostnego, przeszczepem innego narz adu, z zabie- giem chirurgicznym albo obra zeniem. PL PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania aktywowanego białka C do wytwarzania leku do leczenia stanów nadkrzepliwości albo nabytego niedoboru białka C aktywowanym białkiem C.

Białko C jest protezą serynową i jest naturalnie występującą substancją przeciwkrzepliwą odgrywającą rolę w regulacji hemostazy poprzez swoją zdolność do blokowania wytwarzania trombiny przez inaktywację Czynnika Va i VIIIa w kaskadzie krzepnięcia. In vivo ludzkie białko C jest pierwotnie wytwarzane w wątrobie jako pojedynczy polipeptyd składający się z 461 aminokwasów. Cząsteczka prekursorowa przechodzi wielokrotne potranslacyjne modyfikacje, w tym: 1) cięcie 42 aminokwasowej sekwencji sygnałowej; 2) proteolityczne usunięcie z jednego łańcucha zymogenu reszty lizenowej w pozycji 155 i reszty argininowej w pozycji 156 w celu wytworzenia postaci dwułańcuchowej cząsteczki (tj. lekki łańcuch 155 reszt aminokwasowych połączony mostkiem dwusiarczkowym z protezą serynową zawierającą ciężki łańcuch 262 reszt aminokwasowych); 3) karboksylacja zależna od witamy K dziewięciu reszt kwasu glutaminowego zgrupowanych wśród pierwszych 42 aminokwasów lekkiego łańcucha, co powoduje powstanie 9 reszt kwasu gammakarboksyloglutaminowego; i 4) węglowodorowe połączenie w czterech pozycjach (jedno w lekkim łańcuchu i trzy w łańcuchu ciężkim). Ciężki łańcuch zawiera stabilną triadę proteaz serynowych, Asp 257, His 211 i Ser 360. W końcu, kolisty dwułańcuchowy zymogen jest aktywowany in vivo przez trombinę w obecności jonów wapnia na powierzchni fosfolipidowej. Aktywacja powoduje usunięcie dodekapeptydu na końcu N łańcucha ciężkiego, co wywołuje wytworzenie aktywnego białka C (aPC) posiadającego aktywność enzymatyczną.

W połączeniu z innymi białkami, aPC działa być może jako najważniejszy czynnik powodujący regulację w dół krzepnięcia krwi, dając ochronę przed krzepnięciem. Poza jego działaniem przeciwkrzepliwym, aPC wywołuje działanie przeciwzapalne poprzez hamowanie wytwarzania cytokin (tj. TNF i IL-1) i wykazuje ponadto właściwości profibrynolityczne, które ułatwiają lizę skrzepliny. Tak więc, układ enzymatyczny białka C wykazuje znaczące fizjologiczne działanie przeciwkrzepliwe, przeciwzapalne i fibrynolityczne.

Posocznica

Posocznica jest określana jako układowa odpowiedź zapalna na zakażenie, związana z i pośredniczona przez aktywację wielu mechanizmów obronnych gospodarza włączając sieć cytokin, leukocyty i dopełniacz oraz układy krzepnięcia/fibrynolizy. [Mesters, i in., Blood 88: 881-886, 1996]. Rozsiane wykrzepiane wewnątrznaczyniowe [DIC], z ogólnoustrojowym odkładaniem fibryny w drobnych włośniczkach różnych organów, jest wczesną manifestacją wstrząsu posocznicowo/septycznego. DIC jest istotnym pośrednikiem w rozwoju zespołu niewydolności wielonarządowej i odpowiada za złe rokowanie u pacjentów z wstrząsem septycznym [Fourrier, i in., Chest 101: 816-823, 1992].

Opublikowano wiele zachęcających badań przedklinicznych wykorzystujących białko C w różnych zwierzęcych modelach posocznicy. W badaniu na modelu posocznicy u pawiana przeprowadzanym przez Taylora, i in., [J. Clin. Invest. 19: 918-25, 1987], wykorzystywano ludzkie aktywowane białko C z osocza. Zwierzęta leczono profilaktycznie (tj. aPC podawano na początku dwugodzinnego wlewu LD100 E. coli). Pięć z pięciu zwierząt przeżyło 7 dni i zostało uznanych za stale wyleczone w protokole doświadczalnym. W grupie zwierząt kontrolnych otrzymujących identyczny wlew E. coli, pięć z pięciu zwierząt zmarło w ciągu 24 do 32 godzin. Wystarczająca dawka to od 7 do 8 mg/kg.

W liposacharydowym (LPS; E. coli) modelu posocznicy szczurów [Murakami, i in., Blood 81: 642-641, 1996), uszkodzenie układu naczyniowego płuc wywoływane LPS było zahamowane przez ludzkie aktywowane białko C z osocza w dawce 100 L9/kg. Następnie, w podwiązaniowym i nakłuciowym modelu posocznicy u królików, Okamoto i in., [Gastroenterology 106: A747, 1994) wykazał, że ludzkie aktywowane białko C z osocza było skuteczne w ochronie zwierząt przed zaburzeniami krzepnięcia i niewydolnością narządów w dawce 12 pg/kg/godz. w ciągu 9 godzin. Ze względu na swoistość gatunkową aPC, wyniki uzyskane u tych zwierząt nie koniecznie są wyznacznikiem do leczenia ludzi. Skuteczny poziom dawki ludzkiego aktywowanego białka C jest niezwykle zmienny i nieprzewidywalny zależnie od wybranego modelu zwierzęcego. Na przykład, półokres trwania ludzkiego aktywowanego białka C u ludzi wynosi od 30 do 40 minut, w porównaniu do półokresu od 8 do 10 minut u pawianów i 90 minut u królików.

Istnieje obecnie wiele podejść do leczenia posocznicy u ludzi, w większej części z wykorzystaniem czynników blokujących czynniki pośredniczące zapaleniu związane z patofizjologią tej choroby. Jednakże, badania kliniczne z różnorodnymi czynnikami, które blokują czynniki pośredniczące w zapaleniu nie przyniosły sukcesu [przegląd u Natansona, i in., Ann. Intern. Med. 120: 771-183, 1994; Gibaldi, Pharmacotherapy 13: 302-308, 1993]. W związku z tym, że w stosunku do wielu czynników

PL 200 515 B1 pośredniczących związanych z zapaleniem istnieją odpowiedzi kompensujące i przez to występują efekty leczące, niektórzy badacze sugerują, że blokowanie tych odpowiedzi może nie być odpowiednie [np. Parillo, N. Engl. J. Med. 328: 1471-1477, 1993].

Ostatnio, proponuje się blokowanie D1C jako nowy cel badań klinicznych posocznicy [tj. Levi i in., JAMA 270: 975-919, 1993]. Jednakże, zwykłe blokowanie zaburzeń krzepnięcia w posocznicy może nie być wystarczające. W przeglądzie Esmonda, [Arteriosclerosis & Thromb. 12: 135-145, 1992], wiele czynników przeciwkrzepliwych nie wykazało skuteczności w modelu posocznicy pawiana, w tym bloker miejsca aktywnego czynnika Xa [Taylor, i in., Blood 18: 364-368, 1991], hirudyna i hirulog [Maraganore, Perspective in Drug Discovery and Design 1: 461-418, 1994]. Każdy z tych czynników przeciwkrzepliwych jest zdolny do blokowania koagulopatii suchotniczej u zwierząt, lecz nie jest zdolny do poprawy rokowania. Dodatkowo, badacze w Japonii [zgłoszenie patentowe JP 091335A] proponują leczenie koagulopatii związanej z niewydolnością wątroby, stanu potencjalnie wywołującego powstanie objawów podobnych do DIC aktywowanym białkiem C z osocza.

Do dziś, zymogen ludzkiego białka C z osocza był używany jako skuteczny czynnik dodatkowy do tradycyjnej, agresywnej terapii w leczeniu dwudziestu pięciu pacjentów z plamicą piorunującą w posocznicy bakteryjnej z których 22 ocalało [Gerson, et al., Pediatrics 91: 418-422, 1993; Smith, et al., Thromb. Haemost, PS1709, p419, 1997; Rintala, et al., Lancet 347: 1767, 1996; Rivard, et al., J. Pediatr. 126: 646-652, 1995). Gerson, et al., [1993]] opisują leczenie dziecka z udowodnioną gramodadatnią bakteriemią i plamicą piorunującą, które nie odpowiedziało na agresywne tradycyjne leczenie. Pacjent był leczony zymogenem ludzkiego białka C z osocza (bolus 280 ug/kg+40 ug/kg/godzinę we wlewie) co powodowało łączną poprawę zaburzeń krzepnięcia i DIC, i zatrzymanie objawów klinicznych rozwoju plamicy piorunującej związanej ze wstrząsem septycznym. Rintala i in., [1996] donosi o leczeniu dwóch dorosłych pacjentów z meningokokową sepsą i bakteriemią występującą wraz z plamicą piorunującą. Pacjenci byli leczeni zymogenem białka C pochodzącego z osocza w bolusie 400 ug/kg co sześć godzin przez 8 do 10 dni. Jeden przeżył, a jeden zmarł. Rivard, i in., [1995] donosi o leczeniu czterech pacjentów z bakteriemią meningokokową objawiającą się również plamicą piorunującą, którzy przeżyli po leczeniu zymogenem ludzkiego białka C. Pacjenci ci byli leczeniu dawką 400 ug/kg w bolusie co sześć godzin. Chociaż, wielkość grupy w tych badaniach była mała, śmiertelność związana z bakteriemią meningokokową objawiająca się plamicą piorunującą jest większa niż 50% [Powars, i in., Clin. Infectious Disease 17: 254-261, 1993]. Jednakże, w związku z tym, że badania te przeprowadzano z zymogenem ludzkiego białka C, oferują one niewielką sugestię co do ustalenia dawki i czasu trwania leczenia aktywowanym białkiem C.

Oprócz bakteriemii meningokokowej plamica piorunująca albo/i DIC jest związane z wieloma zakażeniami bakteryjnymi, wirusowymi albo pasożytniczymi, które obejmują lecz nie są ograniczone do Ricketssia [gorączka Gór Skalistych, gorączka związana z ukąszeniem kleszcza, dur brzuszny, itd.] [Graybill i in., Souther Medical Journal, 66 (4): 410-413, 1973; Loubser i in., Annals of Tropical Paediatrics 13: 277-280, 1993]; Salmonella (paradur, gorączka związana z ukąszeniem szczura) [Koul i in., Acta Haematol. 93: 13-19, 1995]; Pneumococci [Carpenter i in., Scand J Infect Dis, 29: 479-483, 1997], Yersinia pestis (dżuma dymieniczna) [Butler i in., The Journal of Infectious Disease, 129: 578584, 1974]; Legionella pneumophila (choroba legionistów); Plasmodium falciparum (malaria ośrodkowego układu nerwowego) [Lercari, i in., Journal of Clinical Apheresis, 7: 93-96, 1992]; Burkholderia pseudomallei (melioidoza); Pseudomonas pseudomallei (melioidoza) [Pathucheary, i in., Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 86: 683-685, 1992]; Streptococci (zakażenie odzębowe) [Ota, Y. J. Japanese Assoc. Infect. Dis., 68: 157-161]; wirus zoster [Nguyen i in., Eur J Pediatr, 153: 646-649, 1994]; Bacillus anthracis (wąglik) [Franz i in., Journal of the American Medical Assoc., 278 (5): 399-411, 1997]; Leptospira interrogans (leptospiroza) [Hill i in., Seminars in Respiratory Infections, 12(1): 44-49, 1997]; Staphylococci [Levin, M. Pediatric Nephrology, 8: 223-229]; Haemophilus aegyptius (krwotoczna gorączka brazylijska); Neisseria (bakteriemia gonokokowa i meningokokowa); i mycobacterium tuberculosis (gruźlica prosówkowa).

Nawet jeśli plamica piorunująca, DIC albo stany związane z nabytym niedoborem białka C w sepsie/wstrząsie septycznym albo w innych zakażeniach są dobrze udokumentowane jak to pokazano powyżej, istnieje mało danych co do sposobu leczenia tych pacjentów aktywowanym białkiem C. Ustalenie poziomów dawki dla ludzi wykorzystując przedkliniczne dane farmakologiczne uzyskane z leczenia aktywowanym ludzkim białkiem C modeli zwierzęcych jest trudne ze względu na swoistość gatunkową oddziaływań biologicznych białka C.

PL 200 515 B1

Przeszczep

Różnorodne powikłania związane z przeszczepami mogą występować po przeszczepie szpiku kostnego (BMT), wątroby, nerek i innych narządów [Haire, i in., JAMA 274: 1289-1295, (1995); Harper i in., Lancet 924-927 (1988); i Sorensen i in., J. Inter. Mad 226: 101-105 (1989); Gordon i in., Bone Marrow Transplan. 11: 61-65, (1993)]. Donoszono o obniżonym poziomie krążącego białka C po BMT [Bazarbachi i in., Nouv Rev Fr Hematol 35: 135-140 (1993); Gordon i in., Bone Marrow Trans. 11: 61-65 (1993)], przeszczepie nerek [Sorenson i in., J. Inter. Med 226: 101-105 (1989)] i po przeszczepie wątroby [Harper i in., Lancet 924-927 (1988)]. Niedobór białka C odpowiada za stan nadkrzepliwości powodując u pacjentów ryzyko powikłań zakrzepowo-zatorowych.

Na przykład, zarostowe zapalenie żył wątroby (VOD) jest głównym powikłaniem ograniczającym dawkę przedtransplantacyjnego schematu leczniczego dla BMT. VOD jest ogólnie wynikiem zwężenia żyłek wewnątrzwątrobowych zależnego od wewnątrznaczyniowego odkładania włóknika. [Faioni i in., Blood 81: 3458-3462 (1983). Dodatkowo, VOD powoduje znaczącą chorobowość i śmiertelność po BMT [Collins i in., Throm. and Haemo. 72: 28-33 (1994)]. Zmniejszony poziom białka C współwystępujący ze szczytem występowania VOD [Harper i in., Bone Marrow Trans. 5: 39-42 (1990)] jest prawdopodobnie czynnikiem współodpowiedzialnym za powstawanie tego stanu.

Niewydolność narządowa po BMT obejmuje płuca, ośrodkowy układ nerwowy, wątrobę i nerki i jest powikłaniem, które występuje u znacznego procenta pacjentów po przeszczepie [Haire i in., JAMA 274: 1289-1295, (1995)]. Niewydolność pojedynczego narządu po BMT jest silnym wskaźnikiem zespołu niewydolności wielonarządowej (MODS), który jest podstawową przyczyną śmierci u pacjentów po BMT. Rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe (DIC) zależne od znacznej aktywacji układu krzepnięcia i rozsianego odkładania włóknika w układzie naczyń włosowatych różnych narządów jest ważnym mediatorem rozwoju MODS (Fourrier i in., Chest 101: 816-823 (1992)]. Tak więc, niedobór poziomu białka C u pacjentów poddanych przeszczepowi szpiku albo innych narządów prowadzi do stanu nadkrzepliwości, który predysponuje pacjentów do żylnych powikłań zakrzepowozatorowych i niewydolności narządowej. Obecnie istnieje potrzeba określenia sposobu wykorzystującego aktywowane białko C leczenia ludzi ze stanami nadkrzepliwości związanymi z przeszczepami.

Oparzenia

Od dawna wiadomo, że u pacjentów z ciężkimi oparzeniami występują powikłania związane z nadkrzepliwością [Currieri i in., Ann. Surg. 181: 161-163 (1974)]. Pacjenci oparzeni posiadają odbiegającą od normy zdolność do tworzenia skrzeplin in vitro i często rozwijają DIC, charakteryzujące się nagłym wystąpieniem rozsianego krwawienia, zużyciem fibrynogenu, płytek krwi i spadkiem aktywności czynnika VIII; hemolizą wewnątrznaczyniową; wtórną fibrynolizą; i wykazywanymi w bioptatach mikrozatorami [McManis i in., J. of Trauma 13: 416-422, (1973)]. Ostatnio, donoszono o tym, że poziom białka C jest znacząco niższy u pacjentów z ciężkimi oparzeniami i, że zmniejszenia poziomu tego naturalnego czynnika przeciwkrzepliwego może prowadzić do wzrostu ryzyka DIC [Lo i in., Burns 20: 1860187 (1994)]. Dodatkowo, Ueyama i in., omawiając patogenezę DIC we wczesnym etapie oparzenia dochodzą do wniosku, że intensywne wytwarzanie trombiny i zmniejszenie aktywności przeciwkrzepliwej może występować w zależności od nasilenia oparzenia [Ueyama i in., Nippon Geka Gakkai Zasshi 92: 907-12 (991)]. DIC jest jednym z cięższych powikłań występującym u pacjentów z ciężkimi oparzeniami.

Mimo, że niedobór białka C został udokumentowany u pacjentów z ciężkimi oparzeniami, o czym wspomniano powyżej istnieje niewiele danych wskazujących na to, że terapia zastępcza białkiem C może być skuteczna, lub odnoszących się do tego jak leczyć tych pacjentów aktywowanym białkiem C.

Ciąża

Dobrze wiadomo, że ciąża powoduje różnorodne zmiany układu krzepnięcia mogące prowadzić do stanu nadkrzepliwości. Na przykład, w czasie ciąży i po porodzie ryzyko wystąpienia zakrzepicy jest prawie pięciokrotnie wyższe niż nie w ciąży. Dodatkowo, poziom czynników krzepnięcia wzrasta, a poziom naturalnych inhibitorów krzepnięcia maleje, występują zmiany w układzie fibrynolizy, wzrasta napięcie naczyń żylnych, jak również wzrasta uszkodzenie naczyń żylnych podczas porodowego oddzielenia łożyska, cięcia cesarskiego albo zakażenia [Barbour i in., Obstet Gynecol 86: 621-633, 1995].

Mimo, że ryzyko powikłań związanych z tym stanem nadkrzepliwości u kobiet bez czynników ryzyka jest niskie, u kobiet z wywiadem epizodów zakrzepowo-zatorowym występuje zwiększone ryzyko nawrotów w trakcie ciąży. Dodatkowo, kobiety z współistniejącym stanem nadkrzepliwości, w tym kobiety z wrodzoną opornością na aktywowane białko C, mają również podwyższone ryzyko nawrotów [Dahlback, Blood 85: 607-614, 1995].

PL 200 515 B1

Tak więc, sugeruje się, że kobiety z wywiadem żylnych epizodów zakrzepowo-zatorowych, u których wykryto niedobór antytrombiny-III, białka C, albo białka S są szczególnie narażone na ryzyko nawracających zatorów i u nich powinna być rozważana profilaktyczna terapia przeciwkrzepliwa [Condar i in., Thromb Haemost 63: 319-320, 1990].

Stany przedrzucawkowe i rzucawka u kobiet w ciąży objawiają się stanem zwiększonej krzepliwości na co wskazuje zwiększone tworzenie fibryny, aktywacja układu fibrynolitycznego, aktywacja płytek i spadek liczby płytek [Clin Obstet Gynecol 35: 338-350, 1992]. Uważa się, że przedrzucawka jest wynikiem niedotlenienia łożyska zależnego od nieprawidłowego usadowienia się naczyniowego łożyska. Konsekwencje przedrzucawki obejmują zarówno nadciśnienie, jak i DIC, prowadzące do uwolnienia licznych mikrozatorów, powodujących uszkodzenie łożyska, nerek, wątroby i mózgu [Rev Fr Gynecol Obstet 86: 158-163, 1991)]. Następnie, przedrzucawka prowadzi do ciężkich i zagrażających życiu stanów znanych jako zespół HELLP, określanych jako przedrzucawka powikłana małopłytkowością, hemolizą i zaburzoną funkcją wątroby [Rathgeber i in., Anasth Intensivther Notfallmed 25: 206-211, 1990]. Dodatkowo, udokumentowano, że kobiety w ciąży z nasilonym stanem przedrzucawkowym wykazują znaczne obniżenie poziomów białka C w porównaniu do zdrowych ciężarnych [De Stefano i in., Thromb Haemost 74: 793-794, 1995].

Tak więc, ryzyko powikłań zakrzepowo-zatorowych w kobiet w ciąży jest znacznym problemem, szczególnie u kobiet z wywiadem epizodów zakrzepowo-zatorowych. Mimo, że prawdopodobieństwo ciężkich powikłań takich jak stan przedrzucawkowy albo DIC jest stosunkowo niewielkie uważa się, że postawienie takiego rozpoznania jest wystarczające do rozpoczęcia leczenia DIC czyli rozpoczęcia hamowania aktywacji układu krzepnięcia [Rathgeber i in., Anasth Intensivther Notfallmed 25: 206-211, 1990]. Powikłania stanu przedrzucawkowego i DIC są podobne do sytuacji występującej w posocznicy, w której pojawia się stan nadkrzepliwości i obniżenia poziomu białka C.

Uszkodzenie wynikające z dużych zabiegów chirurgicznych

Pacjenci odzyskujący zdrowie po dużych zabiegach chirurgicznych albo przypadkowych obrażeniach często wykazują zaburzenia układu krzepnięcia, będące wynikiem wywołania stanu nadkrzepliwości [Watkin i in., Klin WochenSchr 63/1019-1027, 1985]. Stany nadkrzepliwości są coraz częściej rozpoznawane jako przyczyna zakrzepicy żylnej u pacjentów chirurgicznych [Thomas i in., Am. J Surg 158: 491-494, 1989; LeClerc J.R Clin Appl Thrombosis/Hemostasis 3(30: 153-156, 1997]. Następnie, stany nadkrzepliwości mogą prowadzić do powikłań z objawami DIC-podobnymi, które nie często są rozpoznawane, lecz mimo to są uszkadzające i śmiertelne po ich wystąpieniu [Collins, i in., Am J Surg 124: 375-380, 1977].

Dodatkowo, pacjenci przechodzący zabieg pomostowania wieńcowego (CABG) [Menges i in., J Cardiothor Vasc An. 10: 482-489, 1996], duże operacje rdzenia kręgowego [Mayer i in., Clin Orthop. 245: 83-89, 1989], duże operacje brzuszne [Blamey, i in., Thromb Haemost. 54: 622-625, 1985], duże operacje ortopedyczne i plastyki stawów kończyn dolnych [LeClerc, 1997], albo inne rodzaje zabiegów chirurgicznych [Thomas i in., Am J Surg 158: 491-494, 1989] często rozwijają objawy żylnych powikłań zakrzepowo-zatorowych. Dodatkowo, badacze japońscy proponują leczenie zatorów mikrokrążenia związanych z uszkodzeniem rdzenia kręgowego [zgłoszenie patentowe JP8325161A] pochodzącym z surowicy białkiem C w dawce 1-10 mg/dzień dla dorosłych, albo korzystnie 2-6 mg podzielonych na 1-2-krotne podanie w bolusie lub we wlewie dożylnym.

Uważa się, że terapia przeciwkrzepliwa jest ważna jako terapia profilaktyczna w celu zapobiegania żylnym objawom zakrzepowo-zatorowym u pacjentów po dużych zabiegach i po wypadkach [Thomas i in., 1989; LeClerc, 1997]. Na przykład, wielu pacjentów umierających z powodu zatoru płucnego nie ma klinicznych objawów wcześniejszych epizodów zakrzepowo-zatorowych i umiera przed postawieniem diagnozy i przed wdrożeniem leczenia [LeClerc, 1997]. Obecne metody profilaktyczne tj. warfaryna, heparyna drobnocząsteczkowa mają działanie ograniczone do resztkowych centralnych zatorów lub wymagają częstego dostosowywania dawek.

ARDS

Zespół błon szklistych dorosłych (ARDS) charakteryzuje się obrzękiem płuc, mikrozatorami, naciekiem komórek zapalnych i zwłóknieniem zejściowym. Przyczyną tych wielorakich odpowiedzi komórkowych i zapalnych jest aktywacja krzepnięcia powodująca powstanie stanu nadkrzepliwości. Zaburzenia krzepnięcia często związane z ARDS obejmują wykrzepianie wewnątrznaczyniowe i zahamowanie fibrynolizy. Włóknik utworzony wskutek aktywacji układu krzepnięcia i zahamowanie fibrynolizy odpowiadają przede wszystkim za patogenezę ostrego uszkodzenia płuc. Posocznica, uraz albo inne zagrażające życiu choroby są ważnymi czynnikami ryzyka prowadzącymi do rozwoju ARDS [Hasegawa, i in., Chest 105 (1): 268-277, 1994].

PL 200 515 B1

ARDS jest związany z aktywacją krzepnięcia i zahamowaniem fibrynolizy. Istotne objawy kliniczne występują w obecności mikrozatorów w części żylnej krążenia płucnego, które są analogiczne do stanu nadkrzepliwości występującego w DIC. Tak więc, istnieje obecnie potrzeba skutecznego leczenia tego stanu nadkrzepliwości związanego z ARDS.

Dla ułatwienia porównania poziomów dawek białka C przytaczanych w literaturze i zgłoszeniach patentowych przedstawiono Tabelę I porządkującą poziomy dawek z wielu badań na ludziach i zwierzętach. Dane te pokazują dawki, które są wyższe, albo niższe niż poziomy dawek dostarczone w niniejszym wynalazku. Znaczące jest, że w badaniach na ludziach wykorzystywano zymogen białka C pochodzący z surowicy, podczas gdy w badaniach na zwierzętach wykorzystywano rekombinowane ludzkie aPC.

T a b e l a I

Odnośniki	Publikowane dawki	znormalizowana dawka +
1	2	3
Taylor i in., patent U.S. nr 5,009,889	podawanie iv od 2 do 64 pg aPC/kg/minutę; dodatkowo podawano bolus od 1 do 10 pg aPC [kolumna 5, linie 14-19]	120 pg/kg/godzinę do 3800 pg/kg/godzinę we wlewie przez 8 do 10 godzin
Rivard i in, Ped. 126: 646, 1995	podawanie iv dawki 100 IU*/kg zymogenu białka C pochodzącego z surowicy w trakcie okresu od 15 do 20 minut co 6 godzin w trakcie fazy ostrej, a następnie do 1 do 2 razy dziennie przez 9 dni [str. 648, kolumna 1, pierwszy paragraf]	400 pg/kg w ciągu 15 do 20 minut
Gerson i in., Ped. 91: 418-422, 1993	podawanie iv bolus o w dawce 70 IU*/kg zymogenu białka C pochodzącego z surowicy 6 godzin. Następnie, ciągły wlew 10 lU/kg/godz. przez 11 dni. [str. 419, kolumna 2, pierwszy paragraf]	280 pg/kg w bolusie co 6 godzin, następnie ciągły wlew 40 pg/kg/godzinę przez 11 dni
Rintala i in., Lancet 347; 1767, 1996	podawanie iv rozpoczęto 3 godziny po przyjęciu i kontynuowano przez 7 dni w dawce 100 IU*/kg zymogenu białka C pochodzącego z surowicy w trakcie okresu co 6 godzin, a następnie dostosowywano dawkę do aktywności w surowicy białka C. [str. 1767, kolumna 2, drugi paragraf]	400 pg/kg w bolusie co 6 do 7 dni
Smith i in., Thromb. Haera., PS-1709, 1997	każdy pacjent dostawał dawkę nasycającą 100 IU*/kg zymogenu białka C pochodzącego z surowicy, a następnie ciągły wlew 15 lU/kg. [str. 419, kolumna 1, PS-1709]	400 pg/kg w bolusie + 60 pg/kg/godzinę (nie podany czas wlewu)
Fujiwara, i in., patent japoński JP7097335A	typową dawką jest 20-1000 U** pochodzącego z surowicy APC/kg ciężaru ciała/dzień, albo więcej korzystnie 50-300 U/kg podzielone na 1-2 dawki. Najkorzystniejszą metodą podawania jest wlew dożylny [str. 9, paragraf 0016]	4 pg/kg do 200 pg/kg nie podano czasu wlewu
Okajima i in., paten japoński JP 8325161A	skuteczną dawką pochodzącego z surowicy PC albo APC jest podawanie 1-10 mg/dzień dla dorosłych, albo korzystnie 2-6 mg podzielone na 1-2 dawki. Jako metodę podawania można stosować podawanie w bolusie (pojedyncze podanie) albo we wlewie dożylnym [str. 10, paragraf 0013]	od 42 pg/godzinę do 420 pg/godzinę
Okajima i in., Amer. J of Hematology, 33: 277-278 (1990)	podawanie pochodzącego z surowicy APC (3 mg/dzień przez 2 dni, po czym 6 mg/dzień przez 3 dni) [str. 278, kolumna 1, pierwszy paragraf]	2 pg/kg/godzinę i 4 pg/kg/godzinę

PL 200 515 B1 cd. tabeli I

1	2	3
Bang i in., patent amerykański 4,775,624	dawka nasycająca aktywowanego białka C waha się od 1 do 10 mg, po czym następuje ciągły wlew ilości wahających się od 3 do 30 mg/dzień [kolumna 19, linie 55-59]	od 1,8 do 18 pg/kg/godzinę nie podano czasu wlewu

+ znormalizowana dawka jest przeliczeniem opisywanej dawki na równoważne oznaczenie pg/kg/godzinę * 1 IU jest równoważnikiem około 4 pg PC ** 1 U jest określana jako ilość, która podwaja czas aktywowanej protrombiny (APTT) w prawidłowej surowicy ludzkiej. Przelicza się do około 5 jednostek/pg APC

Pomimo tych badań nie jest znany bezpieczny i skuteczny schemat leczenia ludzi cierpiących z powodu nabytego stanu nadkrzepliwości albo nabytego niedoboru białka C związanego z posocznicą, przeszczepem, oparzeniem, ciążą, dużymi zabiegami chirurgicznymi, obrażeniami albo ARDS. Na podstawie tych badań nie można było przewidywać zastosowania rekombinowanego, aktywowanego białka C według niniejszego wynalazku w leczeniu stanów nadkrzepliwości albo nabytego niedobory białka C u ludzi.

Niniejszy wynalazek ujawnia zastosowanie aPC w badaniach klinicznych pacjentów z ciężką posocznicą. U tych pacjentów, grupa leczona r-aPC wykazywała statystyczną poprawę funkcjonowania narządów, obniżenia markerów DIC i zmniejszenie śmiertelności w porównaniu z grupą kontrolną leczoną placebo. Dawki aPC stosowane u pacjentów z ciężką posocznicą wynosiły 12, 18, 24 i 30 pg/kg/godzinę w ciągu 48-mio godzinnego wlewu. Dawki 12 i 18 pg/kg/godzinę nie były skuteczne w tym badaniu. Nieoczekiwanie dawki 24 i 30 pg/kg/godzinę stosowane w tym badaniu były skuteczne, możliwe do przyjęcia i niespodziewanie niskie w porównaniu z publikowanymi, przedklinicznymi badaniami farmakologicznymi.

Dodatkowo zgłaszający stwierdzili, że przedkliniczne badania toksykologiczne na naczelnych (nie człowieku) wskazują na bezpieczeństwo aPC w ciągu 96-cio godzinnego wlewu do maksymalnej dawki około 50 pg/kg/godzinę. Dane te są również nieoczekiwane w porównaniu z wcześniejszym stanem wiedzy. W rzeczywistości, poziomy dawek r-aPC dla ludzi, które oparte były na wcześniejszych przedklinicznych i klinicznych badaniach będą powyżej toksykologicznego zakresu ustalonego w powyższym badaniu toksykologicznym.

Wynalazek obejmuje zastosowanie aktywowanego białka C do wytwarzania leku do leczenia pacjentów (ludzi) z nabytymi stanami nadkrzepliwości albo nabytymi stanami niedoboru aPC lub do zapobiegania tym stanom obejmującego podawanie danemu pacjentowi ludzkiego aktywowanego białka C w ciągłym wlewie przez 24 godziny do 144 godzin dawki od 20 pg/kg/godzinę do 50 pg/kg/godzinę.

Zastosowanie dalej charakteryzuje się tym, że wymieniony stan nadkrzepliwości albo niedoboru białka C jest związany z posocznicą albo z plamicą piorunującą czy też z bakteriemią meningokokową.

Zastosowanie charakteryzuje się także tym, że pacjentem jest pacjent małoletni.

W innym rozwiązaniu niniejszego wynalazku zastosowanie charakteryzuje się tym, że wymieniony stan nadkrzepliwości albo niedoboru białka C jest związany z oparzeniem.

W zastosowaniu według wynalazku określony sposób leczenia albo zapobiegania jest dla ludzi cierpiących z powodu żylnych powikłań zakrzepowo-zatorowych związanych z przeszczepem szpiku kostnego albo przeszczepem innego narządu czy też związanych z zabiegiem chirurgicznym albo obrażeniem.

Zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że określony sposób leczenia albo zapobiegania jest dla ludzi cierpiących z powodu stanu nadkrzepliwości albo niedoboru białka C związanego z powikłaniami w trakcie ciąży lub z ARDS.

Zastosowanie według wynalazku w korzystnym rozwiązaniu obejmuje podawanie danemu pacjentowi dawki aktywowanego białka C od 22 pg/kg/godzinę do 30 pg/kg/godzinę.

Wynalazek obejmuje zastosowanie aktywowanego białka C do wytwarzania leku do leczenia człowieka z nabytym stanem nadkrzepliwości albo nabytym niedoborem białka C lub do zapobiegania tym stanom obejmującego podawanie danemu pacjentowi w ciągłym wlewie przez od 24 godzin do 144 godzin skutecznej ilości aktywowanego białka C w celu osiągnięcia poziomów białka C w surowicy w zakresie od 2 ng/ml do 200 ng/ml.

Dla celów niniejszego wynalazku, ujawnionego i zgłaszanego następujące terminy są wyjaśnione poniżej.

PL 200 515 B1 aPC albo aktywowane białko C odnosi się do rekombinowanego aktywowanego białka C. aPC obejmuje i jest korzystnie ludzkim białkiem C, jednakże aPC może również obejmować inne gatunkowe albo pochodne białko C wykazujące pełną aktywność proteolityczną, amidolityczną, estrolityczną i biologiczną (przeciwkrzepliwą i profibrynolityczną) aktywność. Przykłady pochodnych białka C są opisane przez Gerlitz'a i in., patent amerykański 5,453,373 i Fostera i in., patent amerykański nr 5,516,650. Całość tych doniesień została włączona jako odnośniki. Rekombinowane aktywowane białko C może być wytwarzane przez aktywację rekombinowanego zymogenu ludzkiego białka C in vitro albo przez bezpośrednie wydzielanie aktywowanej postaci białka C. Białko C może być wytwarzane w komórkach, komórkach eukariotycznych, zwierzętach transgenicznych albo roślinach transgenicznych, w tym na przykład w komórkach ludzkiej nerki 293 jako zymogen, a następnie oczyszczane i aktywowane technikami znanymi specjalistom w dziedzinie.

Leczenie - opisuje sposób postępowania i opieki nad pacjentem w celu zwalczenia choroby, stanu albo zaburzenia i obejmuje podawanie aPC profilaktycznie w celu zapobieżenia wystąpieniu objawów albo powikłań choroby, stanu albo zaburzenia, albo obejmuje podawanie aPC w celu wyeliminowania choroby, stanu albo zaburzenia.

Stały wlew - ciągłe, postępujące, nieprzerwane wprowadzanie roztworu do żyły przez określony czas.

Wstrzyknięcie w postaci bolusa - wstrzyknięcie leku w zdefiniowanej ilości (zwanej bolusem) przez czas nie dłuższy niż 120 minut.

Odpowiednie do podawania - liofilizowana formulacja albo roztwór, który jest odpowiedni do podawania jako czynnik leczniczy.

Zbiornik - pojemnik taki jak probówka albo butelka, który jest stosowany do dostarczania określonego materiały tj. aPC.

Jednostkowa postać dawkowania - odnosi się do fizycznie określonych jednostek odpowiednich jako jednostki dawkowania dla ludzi, każda jednostka zawiera wcześniej określoną ilość aktywnego materiału wyliczonego w celu osiągnięcia odpowiedniego skutku leczniczego, w powiązaniu z odpowiednią zaróbką farmaceutyczną.

Stany nadkrzepliwości - nadmierna zdolność do wykrzepiania związana z rozsianym wewnątrznaczyniowym krzepnięciem, stanami zatorowymi, aktywacją krzepnięcia albo wrodzonym, albo nabytym niedoborem czynników krzepnięcia takich jak aPC.

Zymogen - zymogen białka C, w sposób tu użyty odnosi się do wydzielniczej, nieaktywnej postaci zarówno jednego łańcucha, jak i dwóch łańcuchów białka C.

Małoletni - pacjent ludzki obejmujący, lecz nie ograniczony do noworodków, niemowląt, dzieci poniżej 18 roku życia.

Skuteczna ilość - terapeutycznie skuteczna ilość związku farmaceutycznego.

Plamica piorunująca - krwotoczne zmiany skórne, gorączka, niedociśnienie związane z posocznicą bakteryjną, wirusowym, bakteryjnym albo pasożytniczym zakażeniem. Zwykle występuje rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe.

Niniejszy wynalazek dotyczy leczenia albo zapobiegania aktywowanym białkiem C stanom nadkrzepliwości albo nabytego stanu niedoboru białka C związanego z posocznicą, przeszczepami, oparzeniami, ciążą, dużymi zabiegami chirurgicznymi, obrażeniami albo ARDS. aPC można wytworzyć technikami znanymi w stanie techniki wykorzystującymi eukariotyczne linie komórkowe, zwierzęta transgeniczne albo rośliny transgeniczne. Specjaliści w dziedzinie łatwo zrozumieją, że odpowiednie linie komórkowe gospodarza obejmują, lecz nie są ograniczone do komórek HEPG-2, LLC-MK2, CHOK1,293 albo AV12, przykłady których opisał Grinnell w patencie amerykańskim nr 5,681,932, włączonym tu jako odnośnik. Ponadto przykłady transgenicznego wytwarzania białek rekombinowanych są opisane przez Drohan'a i in., w patencie amerykańskim 5,589,604 i Archibalda i in., w patencie amerykańskim 5,650,503, włączonymi tu jako odnośniki.

Aby być w pełni aktywnym i możliwym do pełnego wykorzystania w sposobie tu opisanym aPC wytworzone którąkolwiek z tych metod musi przejść potranslacyjne modyfikacje takie jak addycja dziewięciu gamma-karboksy-glutaminianów (gamma-karboksylacja tj. zawarcie Gla), addycję jednego erytro-beta-hydroksy-Asp (beta-hydroksylacja), addycję czterech Asn-powiązanych oligosacharydów (glikozylacja), usunięcie sekwencji liderowej (42 reszt aminokwasowych) i usunięcie dipeptydu Lys 156 - Arg 157. Bez takich modyfikacji potranslacyjnych aPC nie jest w pełni czynne lub jest nie czynne.

aPC może zostać poddane formulacji zgodnie ze znanymi sposobami przygotowywania kompozycji przydatnych farmaceutycznie. aPC będzie podawane pozajelitowo w celu dostarczenia go do

PL 200 515 B1 krwioobiegu w skutecznej postaci przez wstrzyknięcie odpowiedniej dawki w ciągłym wlewie przez od około 24 godzin do około 144 godzin. Ilość podawanego aPC będzie od około 20 ug/kg/godzinę do około 50 ug/kg/godzinę. Bardziej korzystnie ilość podawanego aPC będzie od około 22 ug/kg/godzinę do około 40 ug/kg/godzinę. Najbardziej korzystnie ilość podawanego aPC będzie około 22 ug/kg/godzinę do około 30 ug/kg/godzinę. Najkorzystniej ilość podawanego aPC będzie około 24 ug/godzinę lub około 30 ug/godzinę.

Alternatywnie, aPC będzie podawane we wstrzyknięciach w dawkach podzielonych (1/3 do 1/2) odpowiedniej dawki przez godzinę jako wstrzyknięcie w postaci bolusa przez czas od około 5 minut do około 120 minut, po czym będzie następował ciągły wlew odpowiedniej dawki przez od około 24 godzin do około 144 godzin.

Jedynie po szczególnie dokładnie kontrolowanych badaniach klinicznych i wyczerpujących badaniach doświadczalnych zgłaszający stwierdzili, że poziomy dawek od około 20 ug/kg/godzinę do około 50 ug/kg/godzinę w ciągłym wlewie prze od około 24 godzin do około 144 godzin powodują skuteczne leczenie. Najbardziej korzystną dawką aPC do podawania w leczeniu ludzi z nabytymi stanami nadkrzepliwości albo nabytymi stanami niedoboru aPC tak jak to tutaj opisano będzie dawka 24 ug/kg/godzinę.

Preparat 1

Wytwarzanie ludzkiego białka C

Rekombinowane ludzkie białko C (r-hPC) wytworzono w komórkach nerki ludzkiej 293 techniką znaną specjalistom, taką jak podana w Yan, patent USA nr 4,981,952, którego opis włączony jest tu jako odnośnik. Gen kodujący ludzkie białko C ujawniono i zastrzeżono w Bang, et al., U.S. Patent Nr 4775624, którego całkowite ujawnienie włącza się tu jako odnośnik. Plazmidem zastosowanym do wyrażenia ludzkiego białka C w komórkach 293 był plazmid pLPC, który ujawniono w Bang i in., patent USA nr 4,992,373, którego opis włączony jest tu jako odnośnik. Konstruowanie tego plazmidu pLPC opisano również w publikacji patentu europejskiego nr 0 445 939, oraz w Grinnell i in., 1987, Bio/Technology 5: 1189-1192, którego opis włączony jest tu jako odnośnik. Pokrótce, plazmid transfekowano do komórek 293, następnie identyfikowano stabilne transformanty, które klonowano i hodowano w pożywce bezsurowiczej. Po fermentacji, bezkomórkową pożywkę otrzymano przez mikrofiltrację.

Ludzkie białko C wydzielono z płynu hodowlanego przez adaptację techniki Yan, patent USA nr 4,981,952, którego opis włączony jest tu jako odnośnik. Sporządzono sklarowaną pożywkę 4 mM w EDTA, a następnie poddano absorpcji na żywicy anionowymiennej (Fast-Flow Q, Pharmacia). Po przepłukaniu 4 objętościami kolumny 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 i 2 objętościami kolumny 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4, związany zymogen ludzkiego rekombinowanego białka C eluowano 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,4. Eluowane białko miało czystość ponad 95%, jak oceniono przez elektroforezę na żelu poliakryloamidowym z SDS.

Dalsze oczyszczanie białka uzyskano przez dodanie do białka NaCl w stężeniu końcowym 3 M, a następnie przez adsorpcję na żywicy oddziaływań hydrofobowych (Toyopearl Phenyl 650 M, TosoHaas) zrównoważonej 20 mM Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,4. Po przepłukaniu 2 objętościami kolumny bufora bez CaCl₂, rekombinowane ludzkie białko C eluowano 20 mM Tris, pH 7,4.

Eluowane białko przygotowano do aktywacji przez usunięcie resztek wapnia. Rekombinowane ludzkie białko C przepuszczono przez kolumnę o powinowactwie do metalu (Chelex-100, BioRad) w celu usunięcia wapnia i ponownie wiązano z żywicą anionowymienną (Fast-Flow Q, Pharmacia). Obie kolumny ustawiono szeregowo i równoważono 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 6,5. Po załadowaniu białka, kolumnę Chelex-100 płukano jedną objętością kolumny tego samego bufora, po czym odłączono ją od szeregu. Kolumnę anionowymienną płukano 3 objętościami kolumny bufora do równoważenia, po czym eluowano białko 0,4 M NaCl, 20 mM octanu Tris, pH 6,5. Stężenia białka roztworów rekombinowanego ludzkiego białka C i rekombinowanego aktywowanego białka C zmierzono przez ekstynkcję UV 280 nm, i 1°% wynosiły one, odpowiednio, E^o,1% = 1,85 i 1,95.

Preparat 2

Aktywacja rekombinowanego ludzkiego białka C

Trombinę bydlęcą sprzęgnięto z aktywowaną CH-Sepharose 4B (Pharmacia) w obecności 50 mM HEPES, pH 7,5 w 4°C. Reakcję sprzęgania przeprowadzono na żywicy wprowadzonej do kolumny, z użyciem 5000 jednostek trombiny na ml żywicy. Roztwór trombiny cyrkulowano przez kolumnę przez około 3 godziny, po czym dodano MEA w stężeniu 0,6 ml/l krążącego płynu. Roztwór zawierający MEA cyrkulowano przez dodatkowe 10-12 godzin, w celu zapewnienia całkowitego zablokowania nieprzereagowanych amin na żywicy. Po blokowaniu, żywicę sprzęgniętą z trombiną płukano

PL 200 515 B1 objętościami kolumny 1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 6,5, w celu usunięcia wszystkich białek związanych nieswoiście i zastosowano do reakcji aktywacji po zrównoważeniu w buforze do aktywacji.

Sporządzono oczyszczony r-hPC 4 mM w EDTA (w celu chelatacji ewentualnego resztkowego wapnia) i rozcieńczono do stężenia 2 mg/ml 20 mM Tris, pH 7,4 albo 20 mM octanem Tris, pH 6,5. Materiał ten przepuszczono przez kolumnę trombiny zrównoważoną w 37°C 50 mM NaCl i 20 mM Tris pH 7,4 albo 20 mM octanem Tris pH 6,5. Prędkość przepływu ustalono w ten sposób, aby czas kontaktu r-hPC z żywicą trombinową wynosił około 20 minut. Materiał wypływający zbierano i poddawano natychmiast badaniu na aktywność amidolityczną. Jeżeli materiał nie miał aktywności właściwej (amidolitycznej) porównywalnej z ustalonym standardem aPC, zawracano go z powrotem do kolumny trombinowej w celu dokończenia aktywacji r-hPC. Następnie, materiał rozcieńczano 1:1 20 mM buforem jak wyżej, o pH od 7,4 do 6,0 (przy czym korzystniejsze było niższe pH, aby zapobiec autodegradacji) i trzymano aPC w rozcieńczeniu do następnego etapu obróbki.

Usuwanie uwolnionej trombiny z materiału aPC przeprowadzono przez wiązanie aPC z żywicą anionowymienną (Fast Flow Q, Pharmacia), zrównoważoną w buforze do aktywacji (20 mM Tris, pH 7,4 albo korzystnie 20 mM octan Tris, pH 6,5) z 150 mM NaCl. Trombina przechodziła przez kolumnę i eluowała przy płukaniu 2-6 objętościami kolumny 20 mM buforu do równoważenia. Związane aPC eluowano stopniowym gradientem stosując 0,4 M NaCl w 20 mM Tris, pH 7,4 albo 5 mM octanie Tris, pH 6,5. Większa objętość zastosowana do płukania ułatwiała dokładniejsze usuwanie dodekapeptydu. Eluowany materiał z tej kolumny przechowywano w zamrożonym roztworze (-20°C) albo jako liofilizowany proszek.

Aktywność amidolityczną (AU) aPC określono przez uwalnianie p-nitroaniliny z syntetycznego substratu H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilidu (S-2238), z Kabi Vitrum, przy użyciu spektrofotometru Beckman DU-7400. Jednostkę aktywowanego białka C określono jako ilość enzymu konieczną do uwolnienia 1 umola p-nitroaniliny w 1 minutę, przy 25°C, pH 7,4, stosując współczynnik ekstynkcji dla p-nitroaniliny w 405 nm równy 9620 M cm .

Aktywność antykoagulacyjną aktywowanego białka C określano przez pomiar przedłużenia czasu krzepnięcia w teście czasu aktywowanej częściowej tromboplastyny (APTT). Krzywe wzorcowe wytworzono w buforze do rozcieńczania (1 mg/ml BSA o czystości do testów radioimmunologicznych, 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3) w zakresie stężeń od 125 do 1000 ng/ml białka C, podczas gdy próbki wytworzono przez kilkakrotne rozcieńczanie w tym zakresie. Do każdej kuwety dodano 50 μΙ zimnego osocza końskiego i 50 μΙ odtworzonego reagenta czasu aktywowanej częściowej tromboplastyny (reagent APTT, Sigma) i inkubowano w 37°C przez 5 minut. Po inkubacji, 50 μΙ odpowiedniej próbki albo standardu dodawano do każdej kuwety. Bufor do rozcieńczania zastosowano jako próbkę albo standard, w celu określenia podstawowego czasu krzepnięcia. Zegar fibrometru (CoA Screen Hemostasis Analyzer, American Labor) uruchomiono po dodaniu 50 μΙ 30 mM CaCL w 37°C do każdej próbki albo standardu. Stężenie aktywowanego białka C w próbce obliczano przez równanie regresji liniowej krzywej wzorcowej. Opisywane tu czasy krzepnięcia stanowią średnią minimum trzech powtórzeń, w tym próbek krzywej wzorcowej.

Powyższy opis umożliwia odpowiedniemu specjaliście wytworzenie aPC i zastosowanie w leczeniu stanów hiperkoagulacyjnych albo nabytego niedoboru białka C związanego, choć nie wyłącznie, z posocznicą, przeszczepem, poparzeniem, ciążą, dużymi zabiegami chirurgicznymi/urazem i ARDS.

P r z y k ł a d 1

Poziomu aPC w ludzkim osoczu

Sześciu pacjentów otrzymywało wlew i.v. aPC w ilości 1 mg/m²/godzinę albo około 0,024 mg/ /kg/godzinę przez okres 24 godzin. Podawano aPC w postaci liofilizowanej, zawierającej 10 mg aPC, bufor 5 mM octanu Tris i 100 mM chlorek sodu, odtworzony w 2 ml wody i pH 6,5.

Stężenie aPC w osoczu mierzono przy użyciu testu Immunocapture-Amidolytic Assay. Krew pobierano w obecności antykoagulanta cytrynianowego i benzamidyny, odwracalnego inhibitora aPC. Enzym wychwytywano z osocza przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego swoistego wobec aPC, C3, unieruchomionego na płytce do mikromiareczkowania. Inhibitor usuwano przez wypłukanie i mierzono aktywność amidolityczną aPC przy użyciu chromogennego substratu oligopeptydowego. Po inkubacji przez 16-20 godzin w 37°C, mierzono absorbancję przy 405 nm i analizowano dane stosując algorytm ważonego dopasowywania do krzywej. Stężenia aPC oceniono na podstawie krzywej wzorcowej w zakresie od 0 do 100 ng/ml. Granicą oznaczenia była wartość 1,0 ng/ml. Poziomy i stęPL 200 515 B1 żenia aPC w osoczu mierzono przez około 24 godziny. Dawka 0,024 mg/kg/godzinę dawała stężenie w osoczu około 50 ng/ml po 24 godzinach.

P r z y k ł a d 2

Podwójnie ślepa próba, z grupą kontrolowaną otrzymującą placebo na ludzkich pacjentach z posocznicą, Etap 1

Protokół stanowi dwuetapową podwójnie ślepą próbę z grupą kontrolowaną otrzymującą placebo, przeprowadzoną na pacjentach z ciężką posocznicą. Na etapie 1, 72 pacjentom podano we wlewie przez 48 godzin rekombinowane ludzkie aktywowane białko C (r-aPC).

Kryterium wejścia do badania określały trzy z czterech powszechnie akceptowanych kryteriów (częstość pracy serca, wysiłek oddechowy, podwyższona/obniżona temperatura, wzrost/spadek liczby leukocytów we krwi). Pacjenci musieli również wykazywać pewnego stopnia dysfunkcję narządów, określaną jako wstrząs, zmniejszone wydzielanie moczu albo hipoksemię. Zastosowano cztery różne dawki: 12, 18, 24 albo 30 ąg/kg/godz. r-aPC podawano przez 48 godzin w ciągłym wlewie. Zasadniczymi kwestiami badania były: bezpieczeństwo jako funkcja dawki i długości czasu dawkowania, oraz zdolność aPC do korekcji koagulopatii w funkcji dawki i czasu dawkowania.

Informacja o śmiertelności obejmowała wszystkie dawki, nawet najniższą, o ile nie zaznaczono inaczej. Należy nadmienić, że obserwowana śmiertelność placebo była zgodna z oczekiwaną śmiertelnością placebo. Śmiertelność po 28 dniach stanowiła punkt końcowy dla pacjentów otrzymujących placebo, w stosunku do pacjentów otrzymujących r-aPC.

Całkowity odsetek śmiertelności ogólnej po placebo wynosił 38% (10/26), zaś całkowita śmiertelność po r-aPC wynosiła 20% (9/46). Podgrupa obejmująca tylko dwie najwyższe dawki r-aPC (24 i 30 ąg/kg/godz.) w stosunku do pacjentów placebo wykazywała odsetek śmiertelności 13% (3/24).

Analiza drugiej podgrupy obejmowała pacjentów z nabytym zespołem niedoboru białka C, określonego jako aktywność podstawowa białka C niższa niż 60%. Wśród 64 pacjentów, co do których dostępne były dane o poziomie podstawowym białka C, 61 pacjentów albo 95% wykazywało nabyty niedobór białka C w momencie wejścia do badania. Obserwowana śmiertelność po placebo w przypadku pacjentów z niedoborem białka C wynosiła 41% (9/22), zaś odsetek śmiertelności w grupie otrzymującej r-aPC wynosiła 18% (7/39).

Istotna informacja sugerująca, że niska dawka r-aPC jest korzystna dla pacjentów z ciężką posocznicą obejmuje średni czas do śmierci w grupie leczonej placebo w porównaniu z grupą leczoną. Wśród 10 pacjentów zmarłych w grupie placebo średni czas do śmierci wynosił 6 dni. W grupie pacjentów leczonych r-aPC, średni czas do śmierci wynosił 14 dni. Oprócz tego, 4 spośród 9 pacjentów zmarłych w grupie leczonej r-aPC, przeżyło 21 albo więcej dni, a więc z powodów niezwiązanych z ich pierwszym epizodem posocznicy. Dwie spośród czterech śmierci nastąpiły w grupie niskiej dawki (12 ąg/kg/godz.). Obaj pacjenci pozostawali na oddziale intensywnej terapii (ICU) i poddawani byli wentylacji mechanicznej przez cały czas trwania badania, aż do śmierci (w dniu 27). Inni dwaj pacjenci późno zmarli byli w grupie o wysokiej dawce (30 ąg/kg/godz.). Obaj wykazywali podobną początkową poprawę. W ciągu dwóch tygodni, obaj zostali odłączeni od respiratora i przeniesieni z ICU. Jeden z pacjentów zmarł w tydzień później z powodu niewydolności oddechowej wywołanej posocznicą po żądaniu nie reanimowania (DNR). Drugi z pacjentów zmarł w 28 dni później z powodu epizodu niewydolności oddechowej związanej z ponowną posocznicą. Pacjent ten również nie życzył sobie reanimacji, stąd nie intubowano go ponownie. Należy zaznaczyć, że ponowne leczenie r-aPC pacjentów, u których rozwinął się drugi epizod ciężkiej sepsy podczas 28 dni badania nie było zatwierdzone w protokole badania.

Informacja o śmiertelności w tym badaniu jest nieoczekiwana i zaskakująca. Żadne inne podwójnie ślepe próby, z kontrolowaną grupą otrzymującą placebo nie dały danych o tak znaczącym zmniejszeniu śmiertelności w ciągu 28 dni.

P r z y k ł a d 3

Formulacja aktywowanego białka C

Stabilizowaną, liofilizowaną formulację aktywowanego białka C wytworzono w procesie, który obejmował liofilizację roztworu obejmującego około 2,5 mg/ml aktywowanego białka C, około 15 mg/ml sacharozy, około 20 mg/ml NaCl i bufor cytrynianowy o pH powyżej 5,5, i poniżej 6,5. Oprócz tego, stabilną liofilizowaną formulację aktywowanego białka C wytworzono przez liofilizację roztworu obejmującego 5 mg/ml aktywowanego białka C, około 30 mg/ml sacharozy, około 38 mg/ml NaCl i bufor cytrynianowy o pH powyżej 5,5, i poniżej 6,5.

PL 200 515 B1

Stosunek aPC:sól:czynnik osmotyczny (wag.:wag.:wag.) jest istotnym czynnikiem w formułowaniu przydatnym do procesu liofilizacji. Stosunki różnią się w zależności od stężenia aPC, konkretnej soli i jej stężenia oraz konkretnego środka osmotycznego i jego stężenia. Konkretnie, korzystny jest stosunek około 1 części aktywowanego białka C do około 7,6 części soli do około 6 części czynnika osmotycznego.

Dawkę jednostkową formulacji aktywowanego białka C przydatną do podawania we wlewie ciągłym wytworzono przez zmieszanie białka C, NaCl, sacharozy i bufora cytrynianowego. Po zmieszaniu, 4 ml roztworu przeniesiono do pojemnika i liofilizowano. Pojemnik zawierający od około 5 do około 20 mg aktywowanego białka C, przydatnego do podawania od około 0,02 mg/kg/godz. do około 0,05 mg/kg/godz. wymagającym tego pacjentom zamknięto i przechowywano do czasu użycia.

Claims (9)

1. Zastosowanie aktywowanego białka C do wytwarzania leku do leczenia pacjentów będących ludźmi z nabytymi stanami nadkrzepliwości albo nabytymi stanami niedoboru aPC lub do zapobiegania tym stanom obejmującego podawanie danemu pacjentowi ludzkiego aktywowanego białka C w ciągłym wlewie przez 24 godziny do 144 godzin dawki od 20 pg/kg/godzinę do 50 pg/kg/godzinę.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymieniony stan nadkrzepllwości albo niedoboru białka C jest związany z posocznicą.

3. Zastosowanie według zas^z. 1, znamienne tym, że wymieniony ssan nadkrzepllwości albo niedoboru białka C jest związany z plamicą piorunującą.

4. Zastosowanie według zas^z. 1, znamienne tym, że wymieniony ssan nadkrzepllwości albo niedoboru białka C jest związany z bakteriemią meningokokową.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że wymieniony pacjent jest małoletni.

6. Zastosowanie według zas^z. 1, znamienne tym, że wymieniony ssan nadkrzepllwości albo niedoboru białka C jest związany z oparzeniem.

7. Zastośowaniewedług zas^z. 1, znamiennn tym, że dann spooób I eczenia albo zapobieeania jest dla ludzi cierpiących z powodu żylnych powikłań zakrzepowo-zatorowych związanych z przeszczepem szpiku kostnego albo przeszczepem innego narządu.

8. Zastoocwaniewedług ζθ-^ζ. 1, snamiennn tym, że dann spooób I eczenia albo zapobieeania jest dla ludzi cierpiących z powodu żylnych powikłań zakrzepowo-zatorowych związanych z zabiegiem chirurgicznym albo obrażeniem.

9. Zastoocwaniewedtuu zas^z. 1, znamiennn tym, że dann spooób I eczenia albo zapobieeania jest dla ludzi cierpiących z powodu stanu nadkrzepliwości albo niedoboru białka C związanego z powikłaniami w trakcie ciąży.

W. Zastosowanie według zass^. 1, znamienne tym, że dany ssan nadkrzepllwości albo niedoboru białka C jest związany z ARDS.

H. Zastosowanie według zas^z. 1, znamienne tym, że obejmuje podawanie danemu paccentowi dawki ludzkiego aktywowanego białka C od 22 pg/kg/godzinę do 30 pg/kg/godzinę.

,2. Zastosowanie białka C do wytwarzania leku do leczenia człowieka z nabytym stanem nadkrzepliwości albo nabytym niedoborem białka C lub do zapobiegania tym stanom obejmującego podawanie danemu pacjentowi w ciągłym wlewie przez 24 godziny do M4 godzin skutecznej ilości ludzkiego aktywowanego białka C w celu osiągnięcia poziomów białka C w surowicy w zakresie od 2 ng/ml do 200 ng/ml.