CZ20001392A3 - kané nedostatečnosti proteinu C - Google Patents

Abstract

Řešení se týká léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C. Týká se lidských pacientů se získaným hyperkoagulovatelným stavem nebo získanou nedostatečností proteinu C souvisejícím se sepsí, purpura fulminans, meningokokální sepsí, transplantací kostní dřeně nebo dalšími transplantacemi, těžkými popáleninami, těhotenstvím, těžkými chirurgickými zákroky, těžkým traumatem nebo ARDS, které zahrnuje podávání aktivovaného proteinu C, který představuje vysoce selektivní terapeutické činidlo s nízkým potenciálem způsobení komplikací představujících krvácením.

Description

Předložený vynález se týká lékařské vědy, konkrétně způsobu léčení hyperkoagulovatelných stavů nebo získané nedostatečnosti proteinu C aktivovaným proteinem C.

Dosavadní stav techniky protein C j ednoduchý

Protein C je serinová proteáza a přirozeně se vyskytující antikoagulant, který hraje roli při regulaci hemostázy prostřednictvím své schopnosti blokovat vytváření thrombinu inaktivací Faktorů Va a Vlila v koagulační kaskádě. Lidský se vytváří in vivo především v játrech jako polypeptid o 461 aminokyselinách. Tato prekursorová molekula podstupuje vícenásobné posttranslační modifikace zahrnující 1) odštěpení signální sekvence o 42 aminokyselinách; 2) proteolytické odstranění lysinového zbytku v poloze 155 a argininového zbytku v poloze 156 z jednořetězcového zymogenu pro vytvoření 2-řetězcové formy molekuly, (to jest lehkého řetězce 155 aminokyselinových zbytků vázaného pomocí disulfidového můstku k těžkému řetězci obsahujícímu serinovou proteázu o 262 aminokyselinových zbytcích); 3) vitamin K-dependentní karboxylace devíti zbytků kyseliny glutamové soustředěných mezi 42 aminokyselinami lehkého řetězce, což vede vytvoření 9 zbytkům kyseliny gama-karboxyglutamové;

4)

444 4 uhlovodíkové připojení ve čtyřech místech (jedno v lehkém řetězci a tři v těžkém řetězci). Těžký řetězec obsahuje dobře známou triádu serinových proteáz Asp 257, His 211 a Ser 360. Nakonec se 2-řetězcový zymogen v oběhu aktivuje in vivo thrombinem na fosfolipidovém povrchu v přítomnosti vápníkových iontů. K aktivaci dodekapeptidu na N-konci těžkého vytvoření aktivovaného proteinu enzymatickou aktivitu.

dochází odstraněním řetězce, což vede k C (aPC) , který má

Spolu s dalšími proteiny má aPC funkci jako snad nejdůležitější regulátor pro snižováni krevní koagulace, což vede k ochraně proti trombóze. Kromě svých antikoagulačních funkcí má aPC protizánětlivé účinky prostřednictvím své inhibice vytváření cytokinů (například TNF a IL-1) a také vykazuje profibrinolytické vlastnosti, které usnadňují rozpouštění sraženiny. Enzymatický systém proteinu C tedy představuje hlavní fyziologický mechanismus antikoagulace, protizánětlivého působení a fibrinolýzy.

Sepse

Sepse je definována jako systemická zánětlivá odezva na infekci, spojená s a mediovaná aktivací řady hostitelských obranných mechanismů, které zahrnují síť cytokinů, leukocyty a doplňují koagulační/fibrinolytické systémy. [Mesters a kol., Blood 88:881-886, 1996]. Diseminovaná intravaskulární koagulace [DIC], s rozšířeným ukládáním fibrinu v mikrovaskulatuře různých orgánů, je časnou manifestací sepse/septického šoku. DIC je důležitý mediátor při vývinu syndromu vícenásobného orgánového selhání a přispívá ke

A A A ♦ • AAAA A · špatné prognóze pacientů trpících septickým šokem. [Fourrier a kol., Chest 101:816-823, 1992].

Bylo publikováno několik povzbuzujících preklinických studií používajících protein C u různých zvířecích modelů sepse. Studie v modelu sepse s paviánem, které provedl Taylor a kol., [J. Clin. Invest. 79:918-25, 1987], používaly z plasmy odvozený lidský aktivovaný protein C. Zvířata byla léčena profylakticky (to znamená, že aPC byl podáván na počátku dvouhodinové infúze LDioo E. coli) . Pět z pěti zvířat přežilo 7 dní a byly považovány za trvale přežívající v experimentálním protokolu. U kontrolních zvířat, která dostala identickou infúzi E. coli, pět z pěti zvířat zemřelo během 24 až 32 hodin. Účinná dávka byla 7 až 8 mg/kg.

V lipopolysacharidovém modelu sepse (LPS; E. coli) u krys [Murakami a kol., Blood 87:642-647, 1996], bylo pulmonární vaskulární poškození indukované pomocí LPS inhibováno z lidské plasmy odvozeným aktivovaným proteinem C v dávce 100 gg/kg. Kromě toho v ligačním a punkčním modelu sepse u králíka, Okamoto a kol., [Gastroenterology 106:A747, 1994] bylo demonstrováno, že z plasmy odvozený lidský aktivovaný protein C byl účinný pro ochranu zvířat před koagulopatií a selháním orgánů v dávce 12 pg/kg/hod po devět hodin. V důsledku druhové specificity aPC výsledky získané u těchto zvířat nemusí být nutně prediktivní pro léčení člověka. Hodnoty účinných dávek lidského aktivovaného proteinu C jsou extrémně proměnlivé a nepředvídatelné a závisí na zvoleném zvířecím modelu. Například sérový poločas života lidského aktivovaného proteinu C u člověka je 30 až 40 minut, ve srovnání s 8 až 10 minutami u paviánů a 90 minutami u

• · φφφ φφ φ* φ · φ φ φ φ φ * φ φ φ φ φφ králíka.

Byla řada pokusů léčit sepsi u člověka, ve většině případů použitím činidel, která blokují zánětlivé mediátory spojené s patofyziologií tohoto onemocnění. Avšak klinické studie s řadou činidel, které blokují zánětlivé mediátory byly neúspěšné [přehled v Natanson a kol., Ann. Intern. Med. 120:771-783, 1994; Gibaldi, Pharmacotherapie 13:302-308,

1993]. Jelikož mnoho mediátorů zúčastňujících se zánětů má kompenzační odezvu a proto mají léčivé účinky, někteří výzkumníci došli k názoru, že blokování jejich činnosti nemusí být odpovídající [například Parrillo, N. Engl. J. Med. 328:1471-1477, 1993].

V současné době bylo blokování DIC navrženo jako nový cíl klinických pokusů se sepsí [například Leví a kol., JAMA 270;975-979, 1993]. Nicméně prosté blokování koagulačního defektu u sepse nemusí být dostatečné. Jak je uvedeno v přehledu, který vypracoval Esmon [Arteriosclerosis & Thromb. 12:135-145, 1992], řada antitrombotik nevykázala účinnost v modelu sepse s paviánem, v to počítaje aktivní místně blokující faktor Xa [Taylor a kol., Blood 78:364-368, 1991], hirudin a hirulog [Maraganore, přehled v Drug Discovery and Design 1:461-478, 1994]. Každé z těchto antitrombotik bylo schopno blokovat konsumptivní koagulopatii u zvířat, ale nebyla schopna zlepšit přežívání. Kromě

Japonsku [patentová přihláška JP7097335A] koagulopatii spojenou s hepatickou nedostatečností, která má potenciál vést k vývoji symptomů typu DIC, z plasmy odvozeným aktivovaným proteinem C.

toho vědci v navrhli léčit • φφ φ ·* · φ φ φ • φφφφ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ

Do současné doby byl zymogen z plasmy odvozeného lidského proteinu C použit jako úspěšný doplněk pro agresivní konvenční terapii při léčbě dvaceti pěti pacientů s purpura fulminans při bakteriální sepsi, ze kterých dvacet dva přežilo (Gerson a kol., Pediatrics 91:418-422, 1993; Smith a kol., Thromb. Haemost., PS1709, p419, 1997; Rintala a kol., Lancet 347:1767, 1996; Rivard a kol., J. Pediatr. 126:646652, 1995). Gerson a kol. [1993] popisují kazuální studii léčení dítěte s prokázanou gram pozitivní bakterémií a purpura fulminans, které byl neodpovídalo na obvyklé agresivní léčení. Pacient byl léčen zymogenem z plasmy odvozeného lidského proteinu C (280 ng/kg jednorázová dávka + 40 ng/kg/hod infúze) což vedlo ke korekci koagulopatie a DIC, a k zastavení klinických znaků vývoje purpura fulminans související se septickým šokem. Rintala a kol. [1996] popsali léčení dvou dospělých osob s meningokokální septicemií, doprovázenou purpura fulminans. Pacienti byli léčení zymogenem z plasmy odvozeného proteinu C v dávce 400 μς/kg jednorázově každých šest hodin po 8-10 dní. Jeden pacient zemřel a jeden přežil. Rivard a kol. [1995] popsali léčení čtyř pacientů s meningokokémií, také doprovázenou purpura fulminans, kteří všichni přežili po terapii zymogenem lidského proteinu C. Tito pacienti byli léčeni dávkami 400 μς/kg jednorázově každých šest hodin. Ačkoliv velikost těchto vzorků z uvedených studií je malá, mortalita spojená s meningokokémií doprovázenou purpura fulminans je větší než 50% [Powars a kol., Clin. Infectious Diseases 17:254 - 261, 1993]. Nicméně jelikož tyto studie byly prováděny se zymogenem lidského proteinu C, podávají jen slabé vodítko pro stanovení dávek a trvání terapie ···· ·» ♦ • · · * • · · * ·

* · • · • « • · aktivovaným proteinem C.

Kromě meningokokémie, purpura fulminans a/nebo DIC se vyskytly s mnohými bakteriálními, virálními nebo protozoanovými infekcemi, které zahrnují neomezujícím způsobem infekce způsobené organismy Rickettsia (Rocky Mountain skvrnitá horečka, zápal mozkových blan, tyfus, a podobně.) [Graybill a kol., Southern Medical Journal, 66(4):410-413, 1973; Loubser a kol., Annals of Tropical Paediatrics 13:277-280, 1993]; Salmonella (tyfoidní horečka, horečka z krysího kousnutí) [Koul a kol., Acta Haematol, 93:13-19, 1995]; pneumokoky [Carpenter a kol., Scand. J. Infect. Dis, 29:479-483, 1997], Yersina pestis (Bubonický mor) [Butler a kol., The Journal of Infectious Disease, 129:578-584, 1974]; Legionella pneumophila (legionářská nemoc); Plasmodium falciparum (mozková malárie) [Lercari a kol., Journal of Klinický Apheresis, 7:93-96, 1992]; Burkholderia pseudomallei (Melioidóza); Pseudomonas pseudomallei (Melioidóza) [Puthucheary a kol., Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 86:683-685, 1992]; Streptokoky (Odontogenní infekce) [Ota, Y., J. Japanese Assoc. Infect. Dis., 68:157-161]; zoster virus [Nguyen a kol., Eur. J. Pediatr., 153:646-649, 1994]; Bacillus anthracis (Anthrax) [Franz a kol., Journal of the American Medical Assoc., 278(5):399-411, 1997]; Leptospira interrogans (leptospiróza) [Hill a kol., Seminars in Respirátory Infections, 12(1):44-49, 1997]; Staphylokoky [Levin, M., Pediatrie Nephrology, 8:223-229]; Haemophilus aegyptius (Brazilská purpurová horečka); Neisseria (gonokokémie, meningokokémie); a mykobacterium tuberculosis (vojenská tuberkulóza).

44··

• 4 4 · ·

4 4 4 « 44···

4·*

4· ·

9

4 4 9 4 * 4 4

4

4 ·

·

9 ·*

I když stavy představované purpura fulminans, DIC nebo získanou nedostatečností proteinu C při sepsi/septickém šoku nebo dalších infekcích byly dobře dokumentovány, jak je uvedeno výše, existuje málo dat, která by ukazovala, jak léčit tyto pacienty aktivovaným proteinem C. Stanovení lidských dávkových úrovní použitím preklinických farmakologických dat, vytvořených na základě léčby aktivovaným lidským proteinem C ve zvířecích modelech je obtížné v důsledku druhové specificity biologického působení proteinu C.

Transplantace

K řadě tromboembolických komplikací souvisejících s transplantací může dojít po transplantaci kostní dřeni (bone marrow transplantation - BMT) nebo transplantaci jater, ledvin nebo dalších orgánů [Haire a kol., JAMA 274:12891295, (1995); Harper a kol., Lancet 924-927 (1988); a Sorensen a kol., J. Inter. Med. 226:101-105 (1989); Gordon a kol., Bone Marrow Transplan. 11:61-65, (1993)]. Požadovaná hladina proteinu C v oběhu byla popsána po BMT [Bazarbachi a kol., Noův. Rev. Fr. Hematol. 35:135-140 (1993); Gordon a kol., Bone Marrow Trans. 11:61-65 (1993)] , renální transplantaci [Sorensen a kol., J. Inter. Med. 226:101-105 (1989)] a transplantaci jater [Harper a kol., Lancet 924927(1988)]. Tato nedostatečnost proteinu C přispívá k hyperkoagulovatelným stavům, které pro pacienty přinášejí riziko tromboembolických komplikací. Například hepatické venoklusivní onemocnění (hepatic venocclusive disease - VOD) jater je hlavní komplikací omezující dávkování u • ♦ ·· · ΣΣ Σ • ···* · Σ Σ Σ · · · ··*· · * « · * . · .. ·* ·· předtransplantačních režimů pro BMT. VOD je pravděpodobně výsledek malé intrahepatické venulárni obliterace v důsledku intravaskulárniho ukládání fibrinu. [Faioni a kol., Blood 81:3458-3462 (1993)]. Kromě toho VOD způsobuje značnou morbiditu a mortalitu po provedení BMT [Collins a kol., Throm. and Haemo. 72:28-33 (1994)]. Bylo popsáno, že snížená hladina proteinu C koinciduje se špičkovou incidencí VOD [Harper a kol., Bone Marrow Trans. 5:39-42 (1990)] a je to pravděpodobně faktor, který přispívá k vytvoření tohoto stavu.

Orgánové dysfunkce po provedené BMT zahrnující pulmonární dysfunkci, centrál nervový systém, hepatickou nebo renální dysfunkci představují komplikaci, ke které dochází u velkého procenta transplantovaných pacientů [Haire a kol., JAMA 274:1289-1295, (1995)]. Dysfunkce jednoho orgánu u BMT je silný predikátor syndromu mnohonásobné orgánové dysfunkce (multiple organ dysfunction syndrome - MODS), který je hlavní příčinou smrti pacientů po BMT. Diseminovaná intravaskulární koagulace (DIC) v důsledku masivní aktivace koagulačního systému a široce rozšířené ukládání fibrinu v mikrovaskulatuře různých orgánů je důležitý mediátor vývinu MODS [Fourrier a kol., Chest 101:816-823 (1992)]. Nedostatečnost úrovní proteinu C u pacientů, kteří podstoupili transplantace kostní dřeni nebo dalších orgánů tedy vede k hyperkoagulovatelným stavům, které vytvářejí predisposici pacientů k venálním tromboembolickým komplikacím a orgánové dysfunkci. Existuje potřeba určit způsob léčby člověka s hyperkoagulovatelným stavem spojeným s orgánovými transplantacemi použitím aktivovaného proteinu C.

···« ·» to ·* ·· * « * · · · · Z··» · » · · • * · ·♦♦· · ♦ · ' * • · · ···..·

Popáleniny

Je již dlouho známo, že vážně popálení pacienti mají komplikace spojené s hyperkoagulací [Curreri a kol., . Ann. Surg. 181:161-163 (1974)]. Pacienti s popáleninami mají supranormální in vitro srážlivou aktivitu a často u nich dochází k vývinu DIC, který je charakterizován náhlým vznikem difúzního krvácení; nají spotřebu fibrinogenu, krevních destiček a aktivitu Faktoru VIII; intravaskulární hemolýzu; sekundární fibrinolýzu; a biopticky prokázané mikrotromby [McManis a kol., J. of Trauma 13:416-422, (1973)]. V současné době bylo popsáno, že u vážně popálených pacientů byly drasticky sníženy úrovně proteinu C a že tato redukce přirozeného antikoagulantu může vést ke vzrůstu rizika DIC [Lo a kol., Burns 20:186-187 (1994)]. Kromě toho Ueyama a kol. při diskusi patogenese DIC v časných stádiích popálenin dovozují, že masivní vytváření trombinu a pokles antikoagulační aktivity může nastat v úměrnosti k těžkosti popáleniny [Ueyama a kol., Nippon Geka Gakkai Zasshi 92:90712 (1991)]. DIC je jednou z běžných komplikací u pacientů trpících následky vážných popálenin.

Jak bylo uvedeno výše, nedostatečnost proteinu C byla dokumentována u vážně popálených pacientů, avšak existuje málo dat, která by naznačovala, že nahrazovací léčba proteinem C by mohla být účinná nebo by ukazovala jak léčit pacienty aktivovaným proteinem C.

φ··· φφ • · • « · • ····

- 10 Těhotenství

Je dobře známo, že těhotenství způsobuje vícenásobné změny v koagulačním systému, které mohou vést k hyperkoagulovatelnému stavu. Například během těhotenství a post-partum je riziko cévní trombózy takřka pětkrát vyšší než ve stavu bez těhotenství. Kromě toho faktory srážlivosti vzrůstají, přirozené inhibitory koagulace klesají, dochází ke změnám ve fibrinolytickém systému, cévní stáza roste stejně tak jako roste při vaskulárním poškození při porodu při oddělení z lacenty, císařském řezu nebo při infekci [Barbour a kol., Obstet. Gynecol. 86:621-633, 1995].

Ačkoli riziko komplikace v důsledku tohoto hyperkoagulovatelného stavu u žen bez rizikových faktorů je malé, ženy s historií tromboembolických příhod jsou pod zvýšeným rizikem opětného výskytu, pokud otěhotní. Kromě toho ženy, které se nacházejí v hyperkoagulovatelných stavech, v to počítaje nedávný objev dědičné rezistence na aktivovaný protein C, mají také zvýšené riziko opakované příhody [Dahlback, Blood 85:601-614, 1995],

Proto bylo navrženo, aby u žen s historií cévních tromboembolických příhod, u kterých byla zjištěna nedostatečnost antithrombinu-III, proteinu C nebo proteinu S, a jsou proto pod značným rizikem opakované trombózy, byla uvažována profylaktická antikoagulační terapie [Conrad a kol., Throm. Haemost. 63:319-320, 1990].

Stav preeklampsie a eklampsie u těhotných žen se zdá být stavem zvýšené koagulopatie, jak je indikováno vzrůstem ···· ··* ·

• 9 9 9

9 ··

- 11 vytváření fibrinu, aktivací fibrinolytického systému, aktivací krevních destiček a poklesem počtu krevních destiček [Clin. Obstet. Gynecol. 35:338-350, 1992].

Preeklampsie je považována za výsledek uteroplacentální ischemie v důsledku anomálie vaskulární inserce placenty. Důsledky preeklampsie zahrnují hypertenzi stejně tak jako DIC, což vede k uvolňování četných mikrotrombů a způsobuje placentální, renální, hepatické a cerebrální léze [Rev. Fr. Gynecol. Obstet. 86:158-163, 1991]. Kromě toho preeklampsie může vést k těžkému a život ohrožujícímu stavu, který je HELLP syndrom, který je definován jako komplikovaná trombocytopenií, hemolýzou a funkcí jater [Rathgeber a kol., Anasth.

znám jako preeklampsie porušenou

Intensivther. Notfallmed. 25:206-211, 1990]. Kromě toho bylo dokumentováno, že dochází k redukci úrovní proteinu C u těhotných žen se těžkou preeklampsií ve srovnání s normálním těhotenstvím [De Stefano a kol., Thromb. Haemost. 74:793794, 1995].

Riziko cévních tromboembolických komplikací, ke kterému dochází u těhotných žen, je tedy těžkým faktorem, především u žen, které mají historii tromboembolických příhod. Ačkoli možnost těžkých komplikací jako je preeklampsie nebo DIC je relativně nízká, bylo navrženo, že je důležité započít terapii DIC jakmile dojde k diagnóze započetí inhibice aktivovaného koagulačního systému [Rathgeber a kol., Anasth. Intensivther. Notfallmed. 25:206-211, 1990]. Komplikace preelampsie nebo DIC jsou analogické situaci, ke které dochází při sepsi v tom, že dochází ke hyperkoagulovatelnému stavu a poklesu úrovní proteinu C.

• · · · · ·

Těžké chirurgické zákroky/trauma

U pacientů, zotavujících se po těžkých chirurgických zákrocích nebo traumatu po nehodě, často dochází ke komplikacím s krevní koagulací jako výsledek indukovaného hyperkoagulovatelného stavu [Watkins a kol., Kliň. Wochenschr. 63:1019-1027, 1985], Hyperkoagulovatelné stavy jsou stále častěji považovány za příčinu cévních tromboembolií u chirurgických pacientů [Thomas a kol., Am. J. Surg. 158:491-494, 1989; Leclerc, J.R., Clin. Appl. Trombosis/Hemostasis 3(3):153-156, 1997]. Kromě toho tento hyperkoagulovatelný stav může vést ke komplikacím se symptomy podobnými DIC, ke kterým nedochází často, ale nicméně mají devastující a mnohdy fatální průběh, pokud k nim dojde. [Collins a kol., Am. J. Surg. 124:375-380, 1977].

Kromě toho u pacientů, podstupujících vložení koronárního arteriálního „bypass štěpu (coronary artery bypass grafting - CABG) [Menges a kol., J. Cardiothor. Vasc. An. 10:482-489, 1996], těžký chirurgický zákrok na páteři [Mayer a kol., Clin. Orthop. 245:83-89, 1989], těžký abdominální chirurgický zákrok [Blamey a kol., Thromb Haemost. 54:622625, 1985], těžký ortopedický zákrok nebo artroplastický zákrok na dolních končetinách [LeClerc, 1997] nebo další typy chirurgických zákroků [Thomas a kol., Am. J. Surg. 158:491-494, 1989], občas dochází k tromboembolickým komplikacím. Kromě toho japonští mikrovaskulární trombózy spojené [patentová přihláška JP8325161A] vědci navrhli léčbu s poraněním míchy z plasmy odvozeným proteinem C v dávkách 1-10 mg/den u dospělého nebo výhodně 2-6 mg rozdělených na 1-2 dávky a podávané jednorázově nebo • · · · * · · » · · <

• · ·· jako intravenózní infúze.

Bylo popsáno, že antikoagulační terapie je důležitá jako profylaktická terapie pro prevenci cévních tromboembolických příhod při těžkých chirurgických zákrocích nebo u pacientů s traumatem [Thomas a kol., 1989; LeClerc, 1997]. Například mnoho pacientů, kteří podlehnou plicní embolii nemají žádný klinický důkaz předchozích tromboembolických příhod a zemřou než dojde ke stanovení diagnózy a zahájení léčby [LeClerc, 1997]. Existující profylaktické metody, například warfarin, nízkomolekulární hepariny, mají omezení jako je reziduální proximální trombóza nebo nutnost častého přizpůsobování dávek.

ARDS

Respirační distres syndrom dospělých osob [adult respirátory distress syndrome - ARDS] je charakterizován plicním edémem, mikrotromby, zánětlivou buněčnou infiltrací a pozdní fibrózou. Rozhodující pro tyto mnohočetné buněčné a zánětlivé odezvy je aktivace koagulace vedoucí ke hyperkoagulovatelnému stavu. Běžné koagulační poruchy spojené s ARDS zahrnují intravaskulární koagulaci a inhibici fibrinolýzy. Předpokládá se, že fibrin vytvářený aktivací koagulačního systému a inhibici fibrinolýzy přispívá k patogenezi akutního poškození plic. Sepse, trauma a další kritická onemocnění jsou důležitými rizikovými faktory, které vedou k ARDS [Hasegawa a kol., Chest 105(1):268-277, 19943.

ARDS souvisí s aktivací koagulace a inhibici fibrinolýzy.

φφφφ • φ

Existuje značné množství klinických důkazů pro přítomnost pulmonárních vaskulárních mikroembolií, které jsou analogické hyperkoagulaci, ke které dochází při DIC. Proto v současné době existuje potřeba účinné léčby tohoto hyperkoagulovatelného stavu, spojeného s ARDS.

Pro usnadnění porovnání úrovní dávek proteinu C uvedených v literatuře a patentových dokumentech udává Tabulka I normalizované úrovně dávek ze několika studií u člověka a ostatních primátů. Tato data udávající velikosti dávek jsou vyšší nebo nižší než úrovně dávek podle předloženého vynálezu. Významné je i to, že studie u člověka byly prováděny se zymogenem proteinu C získaného z plasmy, zatímco studie s primáty jinými než člověk používaly rekombinantní lidský aPC.

TABULKA • · · · t—1

dávka je p epočet uvedené dávky na ekvivalent μς/Υς/Ικ^ • ·

TABULKA I (pokračováni)

E-i

Fh

Oi •H

X!

-P

O &

O

X!

'(D

G > O > •I—I -P

3	O
Ό	CL,
0
Ό	cn
	=L
sH
0
co	Φ
'3	-P
G	0
-ΓΊ	G
0	Ό
>	Φ
T5	ΓΊ
N
	Lf)
'0) G <D	>Φ G
-P	>N
	Ή
i—1
	•i—j
Ή	ř
>	cl
-P
co	f0
>N	G
O
G	-P
£	Φ
	>0
O	O
CL Φ
3	ř
•r~>	cl
3 G '03	>φ £
>	co
0	3
G	i—|
Ή	CL
tp	'Φ CO
ω Ό
	Ό
CD	•H
•r~l	l-)
D	G
	i—1
i—I	'3
	£
	G
*	0
•X	G

···· ·

I přes tyto výzkumné zprávy však není znám dávkovači režim pro bezpečnou a účinnou terapii u člověka, trpícího získaným hyperkoagulovatelným stavem nebo získanou nedostatečností proteinu C spojenou se sepsí, transplantacemi, popáleninami, těhotenstvím, těžkými chirurgickými zákroky, traumatem nebo ARDS. Tyto studie nejsou prediktivní vzhledem k použití rekombinantního aktivovaného proteinu C podle předloženého vynálezu při léčení hyperkoagulovatelných stavů nebo získané nedostatečnosti proteinu C u člověka.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká použití aPC v klinický zkouškách u pacientů s vážnou sepsí. U těchto pacientů, skupina léčená r-aPC vykázala statistické zlepšení funkcí orgánů, snížení hodnot DIC a pokles mortality ve srovnání s kontrolní skupinou, které bylo podáváno placebo. Dávky aPC používané u pacientů se těžkou sepsí byly 12, 18, 24 a 30 μg/kg/hod v 48 hodinové infúzi. Dávky 12 a 18 μg/kg/hod nebyly v této studii účinné. Dávky 24 a 30 μg/kg/hod použité v této studii však byly překvapivě účinné a jsou pozoruhodně a neočekávaně nízké ve srovnání s publikovanými preklinickými farmakologickými daty.

Kromě toho přihlašovatelé zjistili, že preklinické toxikologické studie u primátů jiných než člověk indikovaly, že bezpečné podávání aPC v 96 hodinové infúzi je omezeno maximální dávkou okolo 50 μg/kg/hod. Tato data jsou také neočekávaná, pokud se porovnají s dosavadním stavem • · · to techniky. Velikosti dávek r-aPC pro člověka, které byly založeny na předchozích preklinických a klinických studiích by byly na toxikologickým rozmezím, stanoveným ve výše uvedených toxikologických studiích.

Předložený vynález se týká způsobu léčby lidských pacientů se získaným hyperkoagulovatelným stavem nebo získanou nedostatečností proteinu C, který zahrnuje podávání to uvedenému pacientovi kontinuální infúze po dobu přibližně 24 až přibližně 144 hodin dávku od přibližně 20 μg/kg/hod do přibližně 50 μg/kg/hod aktivovaného proteinu C.

Předložený vynález se dále týká způsobu léčení lidských pacientů se získaným hyperkoagulovatelným stavem nebo získanou nedostatečností proteinu C, který spočívá v podávání uvedenému pacientovi účinného množství aktivovaného proteinu C pro dosažení plasmatické hladiny aktivovaného proteinu C v rozmezí od 2 ng/ml do 200 ng/ml.

Předložený vynález se tedy také týká způsobu použití aPC při léčení hyperkoagulovatelného stavu nebo nedostatečnosti proteinu C spojené se sepsí, purpura fulminans a meningokokémií u lidských pacientů.

Předložený vynález podává způsoby použití aPC pro léčení hyperkoagulovatelného stavu nebo nedostatečnosti proteinu C spojených se těžkými popáleninami.

Předložený vynález podává způsoby použití aPC pro léčení hyperkoagulovatelného stavu nebo nedostatečnosti proteinu C spojených s transplantací kostní dřeni nebo dalších orgánů.

Předložený vynález podává způsoby použití aPC pro léčení hyperkoagulovatelného stavu nebo nedostatečnosti proteinu C ke kterým dochází u lidských pacientů podstupujících nebo zotavujících se z těžkých chirurgických zákroků nebo těžkého traumatu.

Předložený vynález podává způsoby použití aPC pro léčení hyperkoagulovatelného stavu nebo nedostatečnosti proteinu C spojených s komplikacemi během těhotenství.

Předložený vynález se dále týká způsobu léčení lidských pacientů se získaným hyperkoagulovatelným stavem nebo získanou nedostatečností proteinu C spojenými s ARDS.

Pro účely popisu předloženého vynálezu, tak jak je určen přiloženými patentovými nároky, jsou dále definovány následující výrazy.

aPC nebo aktivovaný protein C označuje rekombinantní aktivovaný protein C. aPC zahrnuje a výhodně představuje lidský protein C ačkoli aPC může také zahrnovat protein dalších druhů nebo deriváty, které mají plnou proteolytickou, amidolytickou, esterolytickou a biologickou (antikoagulační nebo profibrinolytickou) aktivitu úplného proteinu C. Příklady derivátů proteinu C jsou popsány v Gerlitz a kol., U.S. Patent č. 5,453,373 a Foster a kol., U.S. Patent č. 5,516, 650, které jsou zde celé zahrnuty jako reference. Rekombinantní aktivovaný protein C může být produkován aktivovací zymogenu rekombinantního lidského proteinu C in vitro nebo přímým vylučováním aktivované formy • ••φ

- 20 proteinu C. Protein C může být produkován v buňkách, eukaryotních buňkách, transgenických zvířatech nebo transgenických rostlinách, které například zahrnují vylučování z lidských ledvinových buněk 253 ve formě zymogenu, které se potom čistí a aktivuje způsoby známými ze stavu techniky.

Léčení - popisuje zacházení s pacientem a péči o pacienta s cílem potlačit onemocnění, stav nebo poruchu a zahrnuje podávání aPC profylakticky pro prevenci vzniku symptomů nebo komplikací spojených s onemocněním, stavem nebo poruchou nebo podávání aPC pro eliminaci onemocnění, stavu nebo poruchy.

Kontinuální infúze - kontinuální a v zásadě nepřerušené přivádění roztok do cévy po určené časové období.

Bolus injekce - jednorázová injekce látky v určeném množství (které je nazýváno bolus) v průběhu doby až do přibližně 120 minut.

Vhodný pro podávání - lyofilizovaný přípravek nebo roztok, který je vhodný pro podávání jako terapeutické činidlo.

Nádoba - prostředek jako je lahvička nebo nádobka, která je určena pro uložení zvoleného materiálu, v tomto případě aPC.

Jednotková dávková forma - označuje fyzikálně diskrétní jednotku vhodnou jako jednotková dávka pro lidské subjekty, přitom každá jednotka obsahuje předem určené množství účinné látky a je vypočtena tak, aby vyvolala požadovaný • 4· · • · ♦

# * • · · * ♦ ··· • · ♦ ♦ 9 9

9 9 9 ♦ 9 9 9 < 9 9 · ·· ·» terapeutický účinek, ve spojení se vhodným farmaceutickým excipientem.

Hyperkoagulovatelné stavy - excesivní koagulovatelnost spojená s diseminovanou intravaskulární koagulací, pretrombotickými stavy, aktivací koagulace nebo vrozenou nebo získanou nedostatečností faktorů srážlivosti jako je aPC.

Zymogen - zymogen proteinu C, jak je tento výraz zde používán, označuje vylučované, neaktivní formy, buď s jedním nebo dvěma řetězci, proteinu C.

Juvenilní - lidský pacient, kterým je neomezujícím způsobem například novorozenec, kojenec a dítě mladší než 18 let.

Účinné množství - terapeuticky účinné množství farmaceutické sloučeniny.

Purpura fulminans - ekchymózní kožní léze, horečka, hypotenze, spojené s bakteriální sepsí, virální, bakteriální nebo protozoální infekcí. Obvykle je přítomna diseminovaná intravaskulární koagulace.

Předložený vynález se týká léčení nebo prevence hyperkoagulovatelných stavů nebo získané nedostatečnosti proteinu C spojenými se sepsí, transplantacemi, popáleninami, těhotenstvím, těžkými chirurgickými zákroky, traumatem nebo ARDS, pomocí aktivovaného proteinu C. aPC může být získán způsoby dobře známými ze stavu techniky použitím eukaryotních buněčných linií, transgenických zvířat φφ φ φ

• φ φ φ ♦· τ • φ · • φ φ φ • φ φφφ· φ φ φ • · · nebo transgenických rostlin. Odborníkovi je okamžitě zřejmé, že vhodné hostitelské eukaryotické buněčné line zahrnují, aniž by tím byly omezeny, buňky HEPG-2, LLC-MK₂, CHO-Kl, 293, nebo AV12, jejichž příklady jsou popsány v Grinnell, U.S. Patent č. 5,681,932, který je zde zahrnut jako reference. Další příklady transgenické produkce rekombinantních proteinů jsou popsány v Drohan a kol., U.S. Patent č. 5,589,604 a Archibald a kol., U.S. Patent č. 5,650,503, které jsou zde zahrnuty jako reference.

K tomu aby byl plně aktivní a použitelný ve způsobech podle předloženého vynálezu musí aPC vyrobený kterýmkoli z těchto způsobů podstoupit posttranslační modifikace jako je přidání devíti gama-karboxy-glutamátů (gama-karboxylace Gla obsahu), přidání jednoho erytro-beta-hydroxy-Asp (beta-hydroxylace), přidání čtyř oligosacharidů vázaných ke Asn (glykosylace), odstranění signální sekvence (42 aminokyselinových zbytků) a odstranění dipeptidu Lys 156-Arg 157. Bez těchto posttranslačních modifikací není aPC plně funkční nebo je nefunkční.

aPC může být upraven pro podávání známými způsoby přípravy farmaceuticky použitelných kompozic. aPC se podává parenterálně pro zajištění jeho dodání do krevního oběhu v účinné formě injekcí vhodné dávky jako kontinuální infúze po dobu přibližně 24 až přibližně 144 hodin. Podávané množství aPC je od přibližně 20 μρ/Άρ/Ίιοά do přibližně 50 μς/Άρ/Ιιοά. Výhodněji je množství podávaného aPC v rozmezí od přibližně 22 μg/kg/hod do přibližně 40 μg/kg/hod. Ještě výhodněji je množství podávaného aPC v rozmezí od přibližně 22 μg/kg/hod do přibližně 30 μg/kg/hod. Nejvýhodněji je množství • φφφ f

• φ • φφφ

· · • Φ Φ podávaného aPC přibližně 24 μg/kg/hod nebo přibližně 30 μg/kg/hod.

Alternativně se aPC podává injekcí části (1/3 až 1/2) vhodné dávky za hodinu jednorázově během doby od přibližně 5 minut do přibližně 120 minut, která je následována kontinuální infúzí vhodné dávky po dobu od přibližně dvacet tři hodiny do přibližně 144 hodin, což vede k odpovídající dávce, podané během 24 hodin až 144 hodin.

Až teprve po pečlivě kontrolovaných klinických studiích a vyčerpávajících experimentálních studiích přihlašovatelé objevili, že dávkové úrovně přibližně 20 μρΑς/Ι^ až přibližně 50 μg/kg/hod podané kontinální infúzí po dobu přibližně 24 hodin až přibližně 144 hodin vedou k účinné terapii. Nejvýhodnější dávkové úrovně aPC pro podávání pro léčbu lidských pacientů se získaným hyperkoagulovatelným stavem nebo získanou nedostatečností proteinu C, které zde byly popsány jsou přibližně 24 μg/kg/hod.

Příklady provedení vynálezu

Příprava 1

Příprava lidského proteinu C

Rekombinantní lidský protein C (r-hPC) byl produkován v lidských ledvinových buňkách 293 způsoby dobře známými odborníkovi v oboru, jako jsou způsoby, které popsal Yan, U.S. Patent č. 4,981,952, který je zde zahrnut jako

4*4 4

*4 · • · 4 4 • ♦··· 4 4 • ♦ 4 reference. Genové kódování lidského proteinu C je popsáno a nárokováno v Bang a kol., U.S. Patent č. 4,775,624, který je zde celý zahrnut jako reference. Plasmid použitý pro expresi lidského proteinu C v buňkách 293 byl plasmid pLPC, který je popsán v Bang a kol., U.S. Patent č. 4,992,373, který je zde celý zahrnut jako reference. Konstrukce plasmidu pLPC je také popsána v evropské patentové publikaci č. 0 445 939 a v Grinnell a kol., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192, které jsou zde celé zahrnuty jako reference. Ve stručnosti byl plasmid transfektován do buněk 293, potom byly identifikovány stabilní transformanty, subkultivovány a pěstovány v médiu prostém séra. Po fermentaci bylo médium prosté buněk získáno mikrofiltrací.

Lidský protein C byl separován z kultivační tekutiny adaptací způsobu, který popsal Yan, U.S. Patent č. 4,981,952, který je zde zahrnut jako reference. Pročištěné médium bylo upraveno na 4 mM v EDTA před provedením absorbce na aniontoměničové pryskyřici (Fast-Flow Q, Pharmacia). Po promývání 4 objemy kolony 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 a 2 objemy kolony 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4, byl vázaný zymogen rekombinantního lidského proteinu C vymýván pomocí 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4. Vymytý protein měl po vymývání čistotu větší než 95%, jak bylo stanoveno elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu.

Další čištění proteinu byl prováděno úpravou proteinu na protein 3 M v NaCl a následující adsorpcí k hydrofobní interakční pryskyřici (Toyopearl Phenyl 650 M, TosoHaas) ekvilibrované v 20 mM Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,4. Po promývání 2 objemy kolony ekvilibračního pufr bez CaCl₂

- 25 AAAA * * · t ♦ · · * A * A·· « A

A A A *»AA A A A · A * · · A A A A • * * · » · ♦ vymýván pomocí 20 mM aktivaci odstraněním lidský protein C byl kolonou (Chelex-100, a znovu vázán k . Obě tyto kolonv byly byl rekombinantní lidský protein C Tris, pH 7,4.

Vymytý protein byl připraven na residuálního vápníku. Rekombinantní ponechán procházet kovovou afinitní Bio-Rad) pro odstranění vápníku aniontoměniči (Fast Flow Q, Pharmacia) uspořádány do série a ekvilibrovány v 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 6,5. Po vložení proteinu byla kolona Chelex-100 promývána jedním objemem stejného pufru před jejím odpojením ze série. Aniontoměničová kolona byla promývána 3 objemy kolony ekvilibračního pufr před vymýváním proteinu pomocí 0,4 M NaCl, 20 mM Tris-acetát, pH 6,5. Proteinové koncentrace roztoků rekombinantního lidského proteinu C a rekombinantního aktivovaného proteinu C byly měřeny pomocí extinkce UV 280 nm E°'^1%=1,85 respektive 1,95.

Příprava 2

Aktivace rekombinantního lidského proteinu C

Hovězí thrombin byl kopulován k aktivované CH-Sepharose 4B (Pharmacia) v přítomnosti 50 mM HEPES, pH 7,5 při teplotě 4 °C. Kopulační reakce byla prováděna na pryskyřici, která byla předtím vložena do kolony s použitím přibližně 5000 jednotek thrombinu na jeden ml pryskyřice. Thrombinový roztok byl ponechán cirkulovat kolonou po přibližně 3 hodiny před přidáním MEA na koncentraci 0,6 ml/1 cirkulujícího roztok. Roztok obsahující MEA byl ponechán cirkulovat po dalších 10-12 hodin pro zajištění úplné blokace nezreagovaných aminů na pryskyřici. Po provedení blokace • Ί) · *

• ♦ · • · · byla pryskyřice kopulovaná s thrombinem promývána 10 objemy kolony 1 M NaCl, 20 mM Tris pH 6,5 pro odstranění veškerého nespecificky vázaného proteinu a byla použita v aktivačních reakcích po ekvilibraci v aktivačním pufru. Pročištěný r-hPC byl upraven na 5 mM v EDTA (pro chelaci jakéhokoli residuálního vápníku) a zředěn na koncentraci 2 mg/ml pomocí 20 mM Tris, pH 7,4 nebo 20 mM Tris-acetát, pH 6,5. Tento materiál byl ponechán procházet thrombinovou kolonou ekvilibrovanou při teplotě 37 °C pomocí 50 mM NaCl a buď 20 mM Tris pH 7,4 nebo 20 mM Tris-acetát pH 6,5. Průtok byl upraven tak, aby umožnil po přibližně 20 minut kontakt mezi r-hPC a thrombinovou pryskyřicí. Vytékající tekutina byla odebrána a okamžitě testována na amidolytickou aktivitu. Pokud materiál neměl specifickou aktivitu (amidolytickou) ve srovnání s uznávaným standardem aPC, byl recyklován zpět do thrombinové kolony pro ukončení aktivace r-hPC. Tento postup byl následován zředěním 1:1 materiálu 20 mM pufrem jak bylo uvedeno výše, s pH kdekoli mezi 7,4 nebo 6,0 (nižší pH je výhodnější pro zabránění autodegradace) pro uchování aPC v nižších koncentracích, zatímco bylo připraveno pro následující krok.

Odstranění použitého thrombinu z aPC materiálu bylo dosaženo vazbou aPC k aniontoměničové pryskyřici (Fast Flow Q, Pharmacia) ekvilibrované v aktivačním pufru (buď 20 mM Tris, pH 7,4 nebo výhodně 20 mM Tris-acetát, pH 6,5) s 150 mM NaCl. Thrombin prochází kolonou a vymývá se během promývání 2-6 objemy kolony 20 mM ekvilibračního pufru. Vázaný aPC se vymývá krokovým gradientem použitím 0,4 M NaCl v buď 5 mM Tris-acetát, pH 6,5 nebo 20 mM Tris, pH 7,4. Promývání kolony vyššími objemy usnadňuje úplnější odstranění • ·4·4 44 4 ** · 4 4 4 • 4 9 4 4 4 • · 4 4 4 4 444 • * 4 4# •44 4 ...

« :: 4 · «

dodekapeptidu. Materiál vymytý z této kolony byl uchováván buď ve zmrazeném roztoku (-20 °C) nebo jako lyof ilizovaný prášek.

Amidolytická aktivita (AU) aPC byla určena uvolňováním pnitroanalinu ze syntetického substrátu H-D-Phe-Pip-Arg-pnitroanilidu (S-2238) zakoupeného od společnosti Kabi Vitrum použitím spektrofotometru s diodovým polem Beckman DU-7400. Jedna jednotka aktivovaného proteinu C byla definována jako množství enzymu požadované pro uvolnění 1 μιηοΐ pnitroanilinu za 1 minutu při teplotě 25 °C, pH 7,4, použitím extinkčního koeficientu p-nitroanilinu při 405 nm o hodnotě 9620

Antikoagulační aktivita aktivovaného proteinu C byla určena měřením prodloužení doby srážení ve srážecím testu „aktivated partial thromboplastin time (APTT). Standardní křivka byla připravena v rozpouštěcím pufru (1 mg/ml BSA stupně pro radioimunologické testy, 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃) v rozmezí koncentrací proteinu C od 125-1000 ng/ml, zatímco vzorky byly připraveny v několika ředěních v tomto rozsahu koncentrací. Do každé zkumavky se vzorkem bylo přidáno 50 μΐ studené koňské plasmy a 50 μΐ rekonstituovaného reagentu pro test APTT (APTT Reagent, Sigma) a byly inkubovány při teplotě 37 °C po 5 minut. Po inkubaci bylo do každé zkumavky přidáno 50 μΐ odpovídajícího vzorku nebo standardu. Ředicí pufr byl používán namísto vzorku nebo standardu pro určení bazální srážecí doby. Časovač fibrometru (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor) byl nastartován po přidání 50 μΐ 37 °C 30 mM CaCl2 do každého vzorku nebo standardu. Koncentrace

9· «

• ·

9 • 9 9 • 9999

9

9« • 9 « «

9

9

9 aktivovaného proteinu C ve vzorcích byly vypočítávány z rovnice lineární regrese standardní křivky. Doby srážení zde udávané jsou průměry minimálně tří opakování, v to počítaje vzorky standardní křivky.

Výše uvedený popis umožňuje odborníkovi v oboru připravit aPC a použít jej pro léčení hyperkoagulovatelných stavů nebo získané nedostatečnosti proteinu C spojenými, aniž by tímto výčtem byly omezeny, se sepsí, transplantacemi, popáleninami, těhotenstvím, těžkými chirurgickými zákroky/traumatem a ARDS.

Příklad 1

Lidský plasmatické úrovně aPC

Šest lidských pacientů dostalo i. v. infúzi aPC v dávce 1 mg/m² /hodinu nebo přibližně 0,024 mg/kg/hod v průběhu 24 hodinové periody. Podávaný aPC byl lyofilizovaný přípravek obsahující 10 mg aPC, 5 mM Tris acetátový pufr a 100 mM chloridu sodného, rekonstituovaný dvěma ml vody a upravený na pH 6,5.

testu odebírána antikoagulantu a benzamidinu, aPC. Enzym byl z plasmy zachytáván myší monoklonální protilátkou,

Koncentrace aPC v plasmě imunozáchytného amidolytického Amidolytic Assay). Krev byla citrátového inhibitoru specifickou myší monoklonální protilátkou, C3, imobilizovanou na mikrotitrační destičce. Inhibitor byl odstraněn promýváním a amidolytická aktivita nebo aPC byly měřeny použitím oligopeptidového chromogenního substrátu. Po byly měřeny použitím (Immunocapturev přítomnosti reverzibilního aPC *

to • to to to toto to • · · to · · « • ♦ totototo * • * to • · · • ·· to • to • · · « « to· · •« ·♦ inkubaci po do absorbance měřefi analyzována v algoritmem. Koně křivky v rozm kvantifikace v t v plasmě byly mg/kg/hod dává hodinách.

Pu 16-20 hodin při teplotě a při vlnové délce 405 nm zeným lineárním °C byla a data byla aproximačním křivkově entrace aPC byly odhadovány ze standardní zí koncentrací od 0-100 ng/ml. Limit estu byl 1,0 ng/ml. Dávky aPC a koncentrace měřeny přibližně 24 hodin. Dávka 0,024 koncentraci v plasmě přibližně 50 ng/ml po 24

Příklad 2 Dvojitě slepý pacienty se seps placebem kontrolovaný pokus s ., etapa 1 lidskými

Tento protokol j s pacienty s t pacientům podána aktivovaného proi e dvojitě slepý placebem kontrolovaný pokus ěžkou sepsí. V etapě 1 byla celkově 72 infúze po 48 hodin rekombinantního lidského :einu C (r-aPC).

Vstupní kritéria kritérií sepse zvýšení/snížení krvinek) . Pacie: orgánové dysfunk vyměšování moči dávky; 12, 18, hodin způsobem k< byly: bezpečnost schopnost r-aPC a době podávání c zahrnovala tři ze čtyř obecně přijímaných : (srdeční tep, respirační úsilí, teploty, zvýšení/snížení počtu bílých iti také museli vykazovat jistý stupeň ce definované buď jako šok, nebo snížené nebo hypoxemii. Byly používány čtyři různé 24, 30 μg/kg/hod. r-aPC byl podáván po 48 mtinuální infúze. Primární cíle této studie jako funkce dávky a doby podávání dávky a zorigovat koagulopatii v závislosti na dávce ávky.

φφφφ • φ φ φ • * *φφ»φ φ φ φ φ · φ •Φ φ* φ φ φ · φ φ φ φ ♦ φ φ φ φ φ φ φ φ

9 ΦΦ

Informace ο mortalitě zahrnuje všechny dávky, dokonce u nejnižší dávky, pokud není specifikováno jinak. Je důležité uvědomit si, že placebo mortalita je v souladu s předpokládanou placebo mortalitou. 28 denní mortalita ze všech příčin byla cílem u pacientů, kteří dostávali placebo ve srovnání s pacienty, kterým byl podáván r-aPC.

Celkový pozorovaný poměr placebo mortality byl 38% (10/26) a celkový pozorovaný poměr r-aPC mortality byl 20% (9/46). Podskupina, zahrnující pouze nejvyšší dvě dávky r-aPC (24 a 30 μg/kg/hod) ve srovnání s placebo pacienty měla pozorovaný poměr mortality 13% (3/24).

Druhá analýza podskupiny zahrnovala pacienty se získanou nedostatečností proteinu C, která byla definována jako základní aktivita protein C menší než 60%. Z 64 pacientů, u kterých byla dostupná data o základní aktivitě proteinu C, 61 pacientů neboli 95%, trpělo získanou nedostatečností proteinu C v okamžiku vstupu do studie. Pozorovaný poměr placebo mortality pro pacienty s nedostatečností proteinu C byl 41% (9/22) a pozorovaný poměr r-aPC mortality u pacientů s nedostatečností proteinu C byl 18% (7/39) .

Významná informace, naznačující, že léčba nízkými dávkami raPC přináší prospěch pacientům s těžkou sepsí zahrnuje i střední dobu do úmrtí u placebo pacientů ve srovnání s pacienty, kterým pyl podáván protein C. Z deseti pacientů, kteří zemřeli v placebo skupině byla střední doba do úmrtí rovna 6 dnům. U pacientů léčených r-aPC byla střední doba do úmrtí 14 dní. Kromě toho 4 z 9 pacientů, kteří zemřeli v části léčené r-aPC, přežili 21 nebo více dní a následně ·· · » · · • · ♦ · • · »«o • · ·

4· · »*

podlehli události, která nesouvisela s jejich první epizodou sepse. Dvě ze čtyř pozdních úmrtí nastaly ve skupině s nízkými dávkami (12 pg/kg/hod). Oba tito pacienti zůstalí v jednotce intenzívní péče a byla jim prováděna umělá plicní ventilace po celou dobu studie až do jejich úmrtí (den 27). Další dva pacienti s pozdním úmrtím byli ve skupině s vysokými dávkami (30 pg/kg/hod). U obou těchto pacientů došlo k počátečnímu zlepšení. Během dvou týdnů byli odpojeni od umělé plicní ventilace a přemístěni z jednotky intenzívní péče. Jeden z pacientů zemřel o týden později na sepsí indukovaný respirační distres po požadavku neprovádět resuscitaci (DNR - do not resuscitate). Druhý pacient zemřel v den 28 po epizodě pulmonární nedostatečnosti vztahující se k druhé epizodě sepse. Tento pacient také požadoval DNR status a proto nebyl reintubován. Je třeba uvést, že opětovná léčba r-aPC u pacientů, u kterých došlo k druhé epizodě těžké sepse v průběhu 28 denní studie, nebyla zahrnuta do léčebného protokolu.

Informace o mortalitě v této studii je překvapivá a neočekávaná. Žádná další dvojitě slepá a placebem kontrolovaná studie sepse neposkytla data, která by demonstrovala takový význačný pokles 28-denní mortality za všech příčin.

Příklad 3

Přípravky obsahující aktivovaný protein C

Stabilní lyofilizovaný přípravek, obsahující aktivovaný protein C, byl připraven způsobem, který zahrnuje lyofilizaci roztoku obsahujícího přibližně 2,5 mg/ml «· φ φ φ •

φφ φ • · φ φ φφφ φ φ φφφφ • φ φ ·· φ • Φ • φ φ φ · φ * φ φ · φ φ φ φ φ φ» •

φ φ

φ aktivovaného proteinu C, přibližně 15 mg/ml sacharózy, přibližně 20 mg/ml NaCl, a pufr z citrátu sodného, který měl pH větší než 5,5 ale menší než 6,5. Kromě toho stabilní lyofilizovaný přípravek, obsahující aktivovaný protein C, zahrnoval lyofilizovaný roztok obsahující přibližně 5 mg/ml aktivovaného proteinu C, přibližně 30 mg/ml sacharózy, přibližně 38 mg/ml NaCl, a citrátový pufr, který měl pH větší než 5,5 ale menší než 6,5.

Poměr aPC:sůl:objemové činidlo (hmotnostně u všech složek) je důležitý faktor u přípravků určených pro sušení vymrazováním. Tento poměr se mění v závislosti na koncentraci aPC, volbě soli a koncentraci objemového činidla a jeho koncentraci. Konkrétně je výhodný poměr přibližně 1 díl aktivovaného proteinu C na přibližně 7,6 dílů soli na přibližně 6 dílů objemového činidla

Přípravek s obsahem jednotkové dávky aktivovaného proteinu C, vhodný pro podávání kontinuální infúzí, byl připraven smícháním aktivovaného proteinu C, NaCl, sacharózy a pufru citrátu sodného. Po smíchání byly 4 ml roztoku přeneseny do nádobky s jednotkovým obsahem a lyofilizovány. Nádobka s jednotkovým obsahem přibližně 5 mg až přibližně 20 mg aktivovaného proteinu C, vhodného pro podávání dávky přibližně od 0,02 mg/kg/hod do přibližně 0,05 mg/kg/hod pacientům, kteří mají její potřebu, byl uzavřena a uchovávána do použití.

Zastupuje:

Dr. Otakar Švorčík

PATENTOVÉ *444 • 4 • »44

4 ·

NÁROKY • · ♦ · 4 4 4

4 44 4 4 4 • · · ·44 44 • · · · 4 4 4 ·♦ 44 ·4

VJ?<C

Claims (26)

1. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C kontinuální infúzí po dobu přibližně 24 až přibližně 144 hodin dávkou přibližně 20 až přibližně 50 μg/kg/hod lidského aktivovaného proteinu C.

2. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1, kdy dávka je přibližně 22 μg/kg/hod až přibližně 40 μg/kg/hod.

3. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1, kdy dávka je přibližně 22 μg/kg/hod až přibližně 30 μg/kg/hod lidského aktivovaného proteinu C.

4. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1, kdy dávka je přibližně 30 μg/kg/hod lidského aktivovaného proteinu C.

5. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1, kdy dávka je přibližně 24 μg/kg/hod lidského aktivovaného proteinu C.

6. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1,2,3,4 nebo 5, kdy

- 3^• « · φ · φ φ φ φ φ φφ

Φ* φφ • φ φ φ φ φ φφ φφ uvedený hyperkoagulovatelný stav nebo nedostatečnost proteinu C souvisí se sepsí.

7. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1,2,3,4 nebo 5, kdy uvedený hyperkoagulovatelný stav nebo nedostatečnost proteinu C souvisí s purpura fulminans.

8. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1,2,3,4 nebo 5, kdy uvedený hyperkoagulovatelný stav nebo nedostatečnost proteinu C souvisí se meningokokémií.

9. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo . získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 6, kdy uvedený lidský pacient je juvenilní.

10. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu - nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1,2,3,4 nebo 5, kdy uvedený hyperkoagulovatelný stav nebo nedostatečnost proteinu C souvisí s popáleninami.

11. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1,2,3,4 nebo 5, kdy uvedená léčba nebo prevence se provádí u člověka, který trpí cévními tromboembolickými komplikacemi souvisejícími s transplantací kostní dřeně nebo dalších orgánů.

12. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané

jr - - •··· » » ·» · ··♦··· • · * · · · ·#♦ ··· 9 9 9 · • · · # • » · · * • 9 9 9 99 99 nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1,2,3,4 nebo 5, kdy uvedená léčba nebo prevence se provádí u člověka, který trpí cévními tromboembolickými komplikacemi souvisej Lcími s

chirurgickým zákrokem nebo traumatem.

13. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1,2,3,4 nebo 5, kdy uvedená léčba se provádí u člověka, který trpí získaným hyperkoagulovatelným stavem nebo nedostatečností proteinu C souvisejícími s komplikacemi během těhotenství.

14. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu . nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1,2,3,4 nebo 5, kdy uvedený hyperkoagulovatelný stav nebo nedostatečnost proteinu C souvisí s distress syndromem dospělých osob (ARDS).

15. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1,2,3,4 nebo 5, kdy jednorázová injekce lidského aktivovaného proteinu C je následována uvedenou kontinuální infúzí.

16. Použití aktivovaného, proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo , získané nedostatečnosti proteinu C podle nároku 1,2,3,4 nebo 5, kdy rekombinantní lidský aktivovaný protein C je podáván kontinuální infúzí po dobu přibližně 24 až přibližně 96 hodin.

17. Použití aktivovaného proteinu C pro přípravu léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C kontinuální infúzí lidského aktivovaného proteinu C po dobu přibližně 24 až přibližně 144 ií - 3 «Φ φφφφ • φ ♦ φ φ ΦΦ • φ • φ φφφ · φφφ φ» ΦΦ • φ φ φ φ φ ΦΦ • φ φ φ • φ φ φ

ΦΦ ΦΦ • Φ ΦΦ • ♦ φ φ φ φ φ φ • φ φ φ • φ φ φ φ φ ΦΦ hodin pro vytvoření hladiny aktivovaného proteinu C v plasmě v rozmezí od 2 ng/ml do 200 ng/ml.

18. Aktivovaný protein C pro použití jak léčivo pro snížení úmrtnosti lidských pacientů trpících těžkou sepsí.

19. Použití podle nároku 18, kdy se podává aktivovaný protein C pacientovi kontinuální infúzí v dávce přibližně 20 μg/kg/hod až přibližně 50 μg/kg/hod po dobu od přibližně 24 hodin do přibližně 144 hodin.

20. Použití podle nároku 18, kdy se podává aktivovaný protein C pacientovi kontinuální infúzí v dávce přibližně 22 μg/kg/hod až přibližně 40 μg/kg/hod.

21. Použití podle nároku 18, kdy se podává aktivovaný protein C pacientovi kontinuální infúzí v dávce přibližně 22 μg/kg/hod až přibližně 30 μg/kg/hod.

22. Použití podle nároku 18, kdy se podává aktivovaný protein C pacientovi kontinuální infúzí v dávce přibližně 30 μg/kg/hod.

23. Použití podle nároku 18, kdy se podává aktivovaný protein C pacientovi kontinuální infúzí v dávce přibližně 24 μg/kg/hod.

24. Použití podle nároků 19,20,21,22 nebo 23 kdy je jednorázová injekce lidského aktivovaného proteinu C podávána před kontinuální infúzí.

25. Použití podle nároku 24, kdy jednorázová injekce je podávána po dobu v rozmezí od asi 5 minut do asi 120 minut.

• to « · • • ···· to • ·· • ·· ·· ·· ·· ·«·· to··· ···· · · · · ·· ·· ·· · -X- to ···· • ··· ♦ ··· ·»·· ·· ·· ·· ·· 26. Použití podle nároků 19,20,21,22 nebo 23 kdy koncentrace proteinu C v plasmě pacienta měřena po dobu 24 hodin je mezi 2

ng/ml a 200 ng/ml.

27. Použití podle nároku 26 kdy koncentrace v plasmě pacienta je 50 ng/ml.