DE69829721T2

DE69829721T2 - Verwendung von aktiviertem Protein-C zur Behandlung überschiessender Blutgerinnung bei Sepsis

Info

Publication number: DE69829721T2
Application number: DE69829721T
Authority: DE
Inventors: Brian William Indianapolis Grinnell; Daniel Lawrence Indianapolis Hartman; Sau-Chi Betty Indianapolis Yan
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1997-10-20
Filing date: 1998-10-15
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2018-10-16
Also published as: JP2005097313A; US6426071B2; HU224901B1; JP2001520199A; SI0913156T1; PL340096A1; US6008199A; WO1999020293A1; EP0913156A1; ES2239382T3; TR200001059T2; UA72194C2; US6037322A; IL135712A0; HUP0001237A2; BR9812965A; KR20010031217A; ZA989385B; EP1449537A3; MY117655A

Description

Die Erfindung betrifft die medizinische Wissenschaft, insbesondere die Behandlung von erworbenen hyperkoagulierbaren Zuständen mit aktiviertem Protein C, die mit einer Sepsis assoziiert sind.
Protein C ist eine Serinprotease und ein natürlich vorkommendes Antikoagulans, das eine Rolle bei der Regulation der Hämostase durch dessen Fähigkeit zur Blockade der Thrombinbildung die Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa in der Gerinnungskaskade spielt. Humanes Protein C wird in vivo primär in der Leber als einzelnes Polypeptid mit 461 Aminosäuren gebildet. Dieses Vorläufermolekül durchläuft mehrfach posttranslationale Modifikationen einschließlich 1) Abspaltung einer 42 Aminosäure langen Signalsequenz, 2) proteolytische Spaltung des einkettigen Zymogens zwischen dem Lysinrest an der Position 155 und dem Argininrest an der Position 156 unter Bildung einer zweikettigen Zymogenform des Moleküls (das heißt eine leichte Kette mit 155 Aminosäureresten ist über eine Disulfidbrücke an die die Serinprotease enthaltende schwere Kette mit 262 Aminosäureresten gebunden), 3) Vitamin-K abhängige Carboxylierung von neun Glutaminsäureresten die in den ersten 42 Aminosäuren der leichten Kette vorkommen, was zu 9 γ-Carboxyglutaminsäureresten führt und 4) Kohlenhydratanfügung an vier Stellen (eine in der leichten Kette und drei in der schweren Kette). Die schwere Kette enthält die gut etablierte Serinproteasentriade aus Asp 257, His 211 und Ser 360. Schließlich wird das zirkulierende zweikettige Zymogen in vivo durch Thrombin an einer Phospholipidoberfläche in Gegenwart von Calciumionen aktiviert. Die Aktivierung kommt durch die Entfernung eines Dodecapeptids am N-Terminus der schweren Kette unter Bildung des aktivierten Protein C (aPC) zustande, das eine enzymatische Aktivität besitzt.
Zusammen mit anderen Proteinen fungiert aPC vermutlich als der wichtigste Dämpfer der Blutgerinnung, was zu einem Schutz gegen Thrombose führt. Zusammen mit den Antikoagulationsfunktionen hat aPC durch die Wirkung über die Hemmung der Cytokinerzeugung (beispielsweise TNF und IL-1) antiinflammatorische Effekte und zeigt auch profibrinolytische Eigenschaften, die die Gerinnselauflösung erleichtern. Daher stellt das Protein C Enzymsystem einen physiologischen Hauptmechanismus der Gerinnungshemmung, Entzündungshemmung und Fibrinolyse dar.
Sepsis
Die Sepsis wird als systemische Entzündungsreaktion auf eine Infektion definiert, die mit der Aktivierung von mehreren Wirtsabwehrmechanismen assoziiert ist und hierdurch vermittelt wird, einschließlich dem Cytokinnetzwerk, Leukozyten und den Komplement- und Gerinnungs- / Fibrinolysesystemen. [Mesters et al., Blood, 88: 881-886, 1996]. Die disseminierte, intravaskuläre Koagluation [DIC] mit einer weitverbreiteten Ablagerung von Fibrin in der Mikrovaskulatur von verschiedenen Organen ist eine frühe Manifestation der Sepsis / des septischen Schocks. Die DIC ist ein wichtiger Mediator bei der Entwicklung des Multiorganversagens und trägt zur schlechten Prognose für Patienten mit septischem Schock bei. [Fourrier et al., Chest 101: 816-823, 1992].
Es wurden mehrere ermunternde präklinische Studien mittels Protein C in verschiedenen Tiermodellen der Sepsis berichtet. Eine Studie in einem Pavian-Sepsismodell von Taylor et al., [J. Clin. Invest. 79: 918-925, 1987] verwendet von Plasma stammendes humanes, aktiviertes Protein C. Die Tiere werden prophylaktisch behandelt (das heißt das aPC wird zum Start der 2 Stunden dauernden Infusion der LD₁₀₀ E. coli verabreicht). 5 von 5 Tieren überlebten 7 Tage und werden im Experimentalprotokoll als dauerhafte Überlebende betrachtet. In Kontrolltieren sterben 5 von 5 Tiere, die eine identische Infusion mit E. coli erhalten, innerhalb von 24 bis 32 Stunden. Die wirksame Dosis beträgt 7 bis 8 mg/kg.
In einem Sepsismodell mit Lipopolysaccharid (LPS, E. coli) in Ratten [Murakami et al., Blood 87: 642-647, 1996] wird die durch LPS induzierte vaskuläre Lungenverletzung durch aus Humanplasma stammendes aktiviertes Protein C mit einer Dosis von 100 μg/kg gehemmt. Ferner wurde in einem Ligations- und Punktionssepsismodell in Kaninchen, Okamoto et al., [Gastroenterology 106: A747, 1994], gezeigt, dass von Plasma stammendes humanes aktiviertes Protein C beim Schutz der Tiere vor einer Koagulopathie und einem Organversagen mit einer Dosis von 12 μg/kg/h für 9 Stunden wirksam ist. Aufgrund der Speziesspezifität von aPC sind die in diesen Tieren erhaltenen Ergebnisse nicht notwendigerweise auf die Behandlung im Menschen übertragbar. Der wirksame Dosislevel von humanem aktiviertem Protein C ist in Abhängigkeit des ausgewählten Tiermodells extrem variabel und unverhersagbar. Beispielsweise beträgt die Serumhalbwertszeit von humanem aktiviertem Protein C in Menschen 30 bis 40 Minuten im Vergleich zu einer Halbwertszeit von 8 bis 10 Minuten in Pavianen und 90 Minuten in Kaninchen.
Es gab kürzlich mehrere Versuche, Sepsis beim Menschen zu behandeln, meistens unter Verwendung von Mitteln, die die Entzündungsmediatoren blockieren, die mit der Pathophysiologie der Erkrankung zusammenhängen. Jedoch waren klinische Studien mit einer Vielzahl an Mitteln, die Entzündungsmediatoren blockieren, nicht erfolgreich [zusammengefasst in Natanson et al., Ann. Intern. Med. 120: 771-783, 1994, Gibaldi, Pharmacotherapy 13: 302-308, 1993]. Da viele Mediatoren, die bei der Entzündung beteiligt sind, kompensatorische Reaktionen sind und daher heilende Wirkungen haben, haben einige Forscher vorgeschlagen, dass die Blockierung ihrer Wirkung nicht geeignet sein könnte [beispielsweise N. Parrillo Engl. J. Med. 328: 1471-1477, 1993].
Kürzlich wurde die Blockierung der DIC als neues Ziel für klinische Versuche bei Sepsis vorgeschlagen [beispielsweise Levi et al., JAMA 270: 975-979, 1993]. Jedoch könnte die einfache Hemmung des Koagulationsdefekts bei der Sepsis nicht ausreichend sein. Wie dies von Esmon zusammengefasst wurde [Arteriosklerosis & Thromb. 12: 135-145, 1992] haben mehrere Antithrombotika keine Wirksamkeit im Pavian Sepsismodell gezeigt, einschließlich des die aktive Stelle blockierenden Faktors Xa [Taylor et al., Blood 78: 364-368, 1991], Hirudin und Hirulog [Maraganore, Perspective in Drug Discovery and design 1: 461-478, 1994]. Jedes dieser Antithrombotika ist zur Blockierung der verbrauchenden Koagulopathie in den Tieren fähig, aber sie sind nicht fähig, das Überleben zu verlängern. Zusätzlich haben Forscher in Japan [ JP 7097335A ] vorgeschlagen, die mit der Leberinsuffizienz assoziierte Koagulopathie, die das Potential zur Entwicklung von DIC-ähnlichen Symptomen aufweist, mit aus Plasma stammendem aktiviertem Protein C zu behandeln.
Bisher wurde aus Plasma stammendes humanes Protein C Zymogen als erfolgreiches Zusatzmittel zur aggressiven herkömmlichen Therapie bei der Behandlung von 25 Patienten mit Purpura fulminans mit bakterieller Sepsis verwendet, von denen 22 überlebt haben (Gerson et al., Pediatrics 91: 418-422, 1993, Smith et al., Thromb. Haemost, PS1709, p419, 1997, Rintala et al., Lancet 347: 1767, 1996, Rivard et al., J. Pediatr. 126: 646-652, 1995). Gerson et al., [1993] beschrieben eine Fallstudie einer Behandlung eines Kindes mit einer bewiesenen grampositiven Bakteriämie und Purpura fulminans, das auf die aggressive herkömmliche Behandlung nicht ansprach. Der Patient wurde mit aus Plasma stammendem humanem Protein C Zymogen (280 μg/kg Bolus + 40 μg/kg/h Infusion) behandelt, was zu einer assoziierten Korrektur der Koagulopathie und der DIC und zum Anhalten der klinischen Anzeichen der Entwicklung einer mit einem septischen Schock zusammenhängenden Purpura fulminans führte. Rintala et al., [1996] berichten von der Behandlung von 2 Erwachsenen mit einer Meningokokkenseptikämie, die sich als Purpura fulminans präsentierte. Die Patienten wurden mit aus Plasma stammendem Protein C Zymogen mit 400 μg/kg Bolus alle 6 Stunden für 8-10 Tage behandelt. Einer starb und einer überlebte. Rivard et al., [1985] berichten von der Behandlung von vier Patienten mit Meningokokkenämie, die sich auch mit einer Purpura fulminans präsentiert, die alle nach einer Therapie mit humanem Protein C Zymogen überlebten. Diese Patienten werden mit einer Dosis von 400 μg/kg Bolus alle 6 Stunden behandelt. Obwohl die Fallzahl aus diesen Studien gering ist, beträgt die mit einer Meningokokkenämie, die mit einer Purpura fulminans zum Ausdruck kommt, mehr als 50 % [Powars et al., Clin. Infectious Diseases 17: 254-261, 1993]. Da jedoch die Studien mit humanem Protein C Zymogen ausgeführt werden, geben sie nur wenig Anhaltspunkte für die Ermittlung der Dosis und der Therapiedauer mit aktiviertem Protein C.
Zusätzlich zur Meningokokkenämie sind Purpura fulminans und/oder DIC mit mehreren bakteriellen, viralen oder protozoalen Infektionen assoziiert, die unter anderem Infektionen umfassen, welche durch Rickettsia verursacht werden (Rocky Mountain Spotted Fieber, Zeckenbissfieber, Typhus etc.) [Graybill et al., Southern Medical Journal, 66 (4): 410-413, 1973, Loubser et al., Annals of Tropical Paediatrics 13: 277-280, 1993], Salmonella (Typhusfieber, Rattenbissfieber), [Koul et al., Acta Haematol, 93: 13-19, 1995], Pneumococci [Carpenter et al., Scand. J. Infect. Dis., 29, 479-483, 1997], Yersinia pestis (Pest) [Butler et al., The Journal of Infectious Disease, 129: 578-584, 1974], Legionella pneumophila (Legionärserkrankung), Plasmodium falciparum (cerebrale Malaria), [Lercari et al., Journal of Clinical Apheresis, 7: 93-96, 1992], Burkholderia pseudomallei (Melioidose), Pseudomonas pseudomallei (Melioidose), [Puthucheary et al., Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 86: 683-685, 1992], Streptococci (odontogene Infektionen) [Y. Ota, J. Japanese Assoc. Infect. Dis., 68: 157-161], Zoster Virus [Nguyen et al., Eur. J. Pediatr., 153: 646-649, 1994], Bacillus anthracis (Anthrax) [Franz et al., Journal of the American Medical Assoc, 278 (5): 399-411, 1997], Leptospira interrogans (Leptospirose) [Hill et al., Seminars in Respiratory Infections, 12 (1): 44-49, 1997], Staphylococci [M. Levin, Pediatric Nephrology, 8: 223-229], Haemophilus aegyptius (Brazilian purpuric Fieber), Neisseria (Gonokokkenämie, Meningokokkenämie) und Mykobakterium tuberculosis (Milartuberkulose).
Obwohl die Purpura fulminans, DIC oder erworbene Protein C Defizienzzustände bei der Sepsis / dem septischen Schock oder anderen Infektionen sehr gut dokumentiert wurden, wie dies oben angegeben ist, gibt es wenig Daten, wie diese Patienten mit aktiviertem Protein zu behandeln sind. Die Etablierung von humanen Dosismengen mittels der präklinischen Pharmakologiedaten, die aus der Behandlung mit aktiviertem humanem Protein C in Tiermodellen erzeugt wurden, ist aufgrund der Speziesspezifitätseigenschaften der biologischen Wirkungen von Protein C schwierig.
Die Charakterisierung und neue Reinigung von rekombinanten Protein C, das in HEK293 Zellen exprimiert wird, wird von S.C. Betty Yan et al. (1990), Biotechnology (8), 655-661 (XP008028568) beschrieben. Die Behandlung der Paviansepsis mit aus Plasma stammendem aktiviertem Protein C ist in US 5 009 889 A beschrieben.
Um die Dosismengen von Protein C, die in der Literatur und den Patentdokumenten angegeben sind, leichter zu vergleichen, zeigt die Tabelle 1 normalisierte Dosismengen von mehreren Studien beim Menschen oder bei nicht-humanen Primaten. Diese Daten etablieren Dosismengen, die höher oder niedriger sind als die Dosismengen, die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. Signifikanterweise wurden die Humanstudien unter Verwendung von aus Plasma stammendem Protein C Zymogen gemacht, wobei die nicht-humane Primatenstudie rekombinantes humanes aPC verwendete.
Trotz dieser Berichte bleibt jedoch der Dosisplan für eine sichere und effiziente Therapie bei Menschen unbekannt, die an einem erworbenen hyperkoagulierbaren Zustand leiden, der mit einer Sepsis assoziiert ist. Diese Studien sagen nichts über die Verwendung von rekombiantem, aktiviertem Protein C der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von hyperkoagulierbaren Zuständen beim Menschen aus.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von aPC in einer klinischen Studie bei Patienten mit schwerer Sepsis. Bei diesen Patienten zeigt die mit r-aPC behandelte Gruppe eine statistische Verbesserung der Organfunktionen, eine Verringerung der DIC Marker und eine Verringerung der Mortalität im Vergleich zu Plazebokontrollgruppe. Die Dosen an aPC, die bei Patienten mit schwerer Sepsis verwendet wird, betragen 12, 18, 24 und 30 μg/kg/h bei einer 48 Stunden dauernden Infusion. Die Dosen mit 12 und 18 μg/kg/h sind bei dieser Studie nicht wirksam. Überraschenderweise sind die in der Studie verwendeten Dosen von 24 und 30 μg/kg/h wirksam und beträchtlich und unerwarteterweise gering im Vergleich zu den veröffentlichten präklinischen pharmakologischen Daten.
Zusätzlich wurde festgestellt, dass die präklinischen Toxikologiestudien bei nicht-humanen Primaten bezüglich der Sicherheit von aPC bei einer 96 Stunden dauernden Infusion zeigen, dass diese auf eine Maximaldosis um die 50 μg/kg/h beschränkt ist. Diese Daten sind auch unerwartet, wenn man sie mit dem Stand der Technik vergleicht. Tatsächlich liegen die Dosismengen von r-aPC für Menschen, die auf den vorherigen präklinischen und klinischen Studien basieren, über dem toxikologischen Bereich, der in den obigen toxikologischen Studien etabliert wurde.
Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung eines rekombinanten aktivierten Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention eines erworbenen hyperkoagulierbaren Zustands, der mit Sepsis assoziiert ist, das einem Patienten durch kontinuierliche Infusion mit einer Dosierung von 20 μg/kg/h bis 50 μg/kg/h an humanem, aktiviertem Protein C über 24 bis 144 Stunden verabreicht wird, worin das aktivierte Protein C durch Expression von Protein C Zymogen in HEK 293 Zellen, gefolgt von einer Aktivierung in vitro erhältlich ist.
Die Erfindung liefert ferner die Verwendung eines rekombinanten, aktivierten Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines erworbenen hyperkoagulierbaren Zustands, der mit Sepsis assoziiert ist, bei einem Patienten, wobei das Arzneimittel in einer Menge verabreicht wird, um einen Plasmaspiegel von 50 ng/ml nach 24 Stunden zu erreichen, worin das aktivierte Protein C durch Expression von Protein C Zymogen in HEK 293 Zellen, gefolgt von einer Aktivierung in vitro erhältlich ist.
Daher etabliert die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung von aPC bei der Behandlung des hyperkoagulierbaren Zustands, der mit Sepsis assoziiert ist, bei Humanpatienten.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht wird, werden die folgenden Ausdrücke wie im folgenden definiert.
aPC oder aktiviertes Protein C bezieht sich auf rekombinantes aktiviertes Protein C. aPC umfasst und ist vorzugsweise humanes Protein C, obwohl aPC auch andere Spezies oder Derivate mit vollen proteolytischen, amidolytischen, esterolytischen und biologischen (gerinnungshemmenden und profibrinolytischen) Aktivitäten von Protein C umfassen kann. Beispiele für Protein C Derivate sind von Gerlitz et al., US 5 453 373 A und Foster et al US 5 516 650 A beschrieben. Rekombinantes, aktiviertes Protein C kann durch die Aktivierung von rekombinantem, humanem Protein C Zymogen in vitro oder durch direkte Sekretion der aktivierten Form von Protein C hergestellt werden. Protein C kann aus humanen 293 Nie renzellen als Zymogen hergestellt und dann durch Techniken aktiviert werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Behandeln – beschreibt das Management und die Sorge für einen Patienten, um eine Erkrankung, einen Zustand oder eine Störung zu bekämpfen und umfasst die prophylaktische Verabreichung von aPC, um das Einsetzen der Symptome oder Komplikationen der Erkrankung, des Zustands oder der Störung zu verhindern oder die Verabreichung von aPC zur Eliminierung der Erkrankung, des Zustands oder der Störung.
Kontinuierliche Infusion – die im wesentlichen ununterbrochene Fortsetzung der Einführung einer Lösung in eine Vene für einen bestimmten Zeitraum.
Bolusinjektion – die Injektion eines Arzneimittels in einer definierten Menge (Bolus genannt) über einen Zeitraum von bis zu etwa 120 Minuten.
Zur Verabreichung geeignet – eine lyophilisierte Formulierung oder Lösung, die zur Verabreichung als therapeutisches Mittel geeignet ist.
Behältnis – ein Behälter, wie ein Gläschen oder eine Flasche, die verwendet wird, um das bestimmte Material, beispielsweise aPC zu enthalten.
Einheitsdosierungsform – bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die für einzelne Dosierungen für Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktivem Material enthält, die zur Herstellung des gewünschten therapeutischen Effekts berechnet ist, zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoff.
Hyperkoagulierbare Zustände – übermäßige Koagulabilität, die mit einer disseminierten intravaskularen Koagulation, präthrombotischen Zuständen, Aktivierung der Koagulation oder einer angeborenen oder erworbenen Defizienz der Gerinnungsfaktoren wie aPC assoziiert ist.
Zymogen – Protein C Zymogen bezieht sich, wie es hierin verwendet wird, auf sekretierte, inaktive Formen, ob mit einer Kette oder mit zwei Ketten, von Protein C.
Jugendlicher – ein humaner Patient, einschließlich unter anderem Neugeborene, Kleinkinder und Kinder, die jünger als 18 Jahre sind.
Wirksame Menge – eine therapeutisch wirkungsvolle Menge einer pharmazeutischen Verbindung.
Purpura fulminans – ecchymotische Hautläsionen, Fieber, Hypotension, die mit bakterieller Sepsis, viralen, bakteriellen oder protozoalen Infektionen assoziiert sind. Gewöhnlich ist eine disseminierte, intravaskuläre Koagulation gegenwärtig.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung oder Prävention von hyperkoagulierbaren Zuständen, die mit Sepsis assoziiert sind, mit aktiviertem Protein C. Das aPC kann durch in der Technik gut bekannte Verfahren unter Verwendung von HEK 293 Zellen hergestellt werden, wie dies beispielsweise in Grinnell in US 5 681 932 A beschrieben ist. Ferner sind Beispiele für eine transgene Produktion von rekombinanten Proteinen in Drohan et al., in US 5 589 604 A und Archibald et al., US 5 650 503 A beschrieben.
Um unter den vorliegenden Methoden voll aktiv und funktionsfähig zu sein, muss das durch eines dieser Verfahren hergestellte aPC posttranslationalen Modifikationen unterzogen werden, wie der Anfügung von 9 gamma-Carboxyglutamaten (gamma-Carboxylierung, das heißt Gla Gehalt), der Anfügung von einem Erythro-beta-hydroxy-Asp (beta-Hydroxylierung), der Anfügung von 4 Asn-gebundenen Oligosacchariden (Glykosylierung), der Entfernung der Signalsequenz (42 Aminosäureresten) und der Entfer nung des Dipeptids Lys 156-Arg 157. Ohne diese posttranslationalen Modifikationen ist aPC nicht voll funktionsfähig oder nicht funktionsfähig.
Das aPC kann gemäß bekannter Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch brauchbaren Zusammensetzungen formuliert werden. Das aPC wird parenteral verabreicht, um die Abgabe an den Blutstrom in einer wirksamen Form durch die Injektion der geeigneten Dosis als kontinuierliche Infusion für 24 bis 144 Stunden sicherzustellen. Die Menge an verabreichtem aPC beträgt 20 μg/kg/h bis 50 μg/kg/h. Bevorzugter beträgt die Menge an verabreichtem aPC 22 μg/kg/h bis 40 μg/kg/h. Noch bevorzugter beträgt die Menge an verabreichtem aPC 22 μg/kg/h bis 30 μg/kg/h. Die am meisten bevorzugten Mengen an verabreichtem aPC betragen 24 μg/kg/h oder 30 μg/kg/h.
Alternativ wird das aPC durch die Injektion eines Teils (1/3 bis 1/2) der geeigneten Dosis pro Stunde als Bolusinjektion über einen Zeitraum von 5 Minuten bis 120 Minuten gefolgt von der kontinuierlichen Infusion der geeigneten Dosis für 23 Stunden bis 144 Stunden verabreicht, was zur geeigneten Dosis führt, die über 24 Stunden bis 144 Stunden verabreicht wird.
Nur nach sorgfältig kontrollierten klinischen Studien und ausgiebigen Experimentalstudien wurde festgestellt, dass die Dosierungen von 20 μg/kg/h bis 50 μg/kg/h als kontinuierliche Infusion für 24 Stunden bis 144 Stunden zu einer wirksamen Therapie führen. Die am meisten bevorzugte Dosierung von aPC, das zur Behandlung von Humanpatienten mit einem erworbenen hyperkoagulierbaren Zustand verabreicht wird, beträgt, wie hierin beschrieben, 24 μg/kg/h.
Präparation 1
Herstellung von humanem Protein C
Rekombinantes humanes Protein C (r-hPC) wird in humanen 293-Nierenzellen durch Techniken hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind, wie die, die in Yan, US 4 981 952 A beschrieben sind. Das für humanes Protein C kodierende Gen ist beschrieben und beansprucht in Bang et al., US 4 775 624 A . Das zur Expression von humanem Protein C in 293-Zellen verwendete Plasmid ist pLPC, das in Bang et al., US 4 992 373 A beschrieben ist. Die Konstruktion des Plasmids pLPC ist auch in der EP 0 445 939 A und in Grinnell et al., 1987, BioTechnology 5: 1189-1192 beschrieben. Kurz gesagt wird das Plasmid in 293-Zellen transfiziert und dann werden stabile Transformanden identifiziert, subkultiviert und in serumfreiem Medium angezogen. Nach der Fermentation wird zellfreies Medium durch Mikrofiltration erhalten.
Das humane Protein C wird aus der Kulturflüssigkeit durch eine Anpassung an die Techniken von Yan US 4 981 952 A abgetrennt. Das geklärte Medium wird auf 4 mM EDTA gebracht, bevor es an eine Anionenaustauscherharzsäule adsorbiert wird (Fast-Flow Q, Pharmacia). Nach dem Waschen mit 4 Säulenvolumina 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 und 2 Säulenvolumina 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 wird das gebundene rekombinante humane Protein C Zymogen mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂ pH 7,4 eluiert. Das eluierte Protein ist zu mehr als 95 % rein nach der Elution, wie dies durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese beurteilt wird.
Eine weitere Reinigung des Proteins wird durch Aufstocken des Proteins auf 3 M bezüglich NaCl gefolgt von einer Adsorption an ein hydrophobes Wechselwirkungsharz (Toyopearl Phenyl 650M, Toso-Haas) erreicht, das mit 20 mM Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl₂ pH 7,4 äquilibriert ist. Nach dem Waschen mit 2 Säulenvolumina des Äquilibrierungspuffers ohne CaCl₂ wird das rekombinante humane Protein C mit 20 mM Tris pH 7,4 eluiert.
Das eluierte Protein wird durch die Entfernung des restlichen Calciums auf die Aktivierung vorbereitet. Das rekombinante humane Protein C passiert eine Metallaffinitätssäule (Chelex-100, Bio-Rad), um Calcium zu entfernen und wird erneut an einen Anionenaustauscher gebunden (Fast Flow Q, Pharmacia). Diese beiden Säulen werden in Reihe angeordnet und mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 7,4 äquilibriert. Nach der Beladung mit Protein wird die Chelex-100 Säule mit einem Säulenvolumen desselben Puffers gewaschen, bevor sie aus der Reihe genommen wird. Die Anionenaustauschersäule wird mit 3 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor das Protein mit 0,4 M NaCl, 20 mM Tris-Acetat pH 6,5 eluiert wird. Die Proteinkonzentrationen der Lösungen an rekombinantem humanem Protein C und rekombinantem aktiviertem Protein C werden jeweils durch Extinktion bei UV von 280 nm und mit E^0,1% = 1,85 oder 1,95 gemessen.
Präparation 2
Aktivierung von rekombinantem humanem Protein C
Rinderthrombin wird an aktivierte CH-Sepharose 4B (Pharmacia) in Gegenwart von 50 mM HEPES pH 7,5 bei 4°C gekuppelt. Die Kupplungsreaktion wird mittels etwa 5000 Einheiten Thrombin/ml Harz auf Harz ausgeführt, das bereits in eine Säule gepackt ist. Die Thrombinlösung zirkuliert für etwa 3 Stunden durch die Säule, bevor MEA in einer Konzentration von 0,6 ml/l der zirkulierenden Lösung zugegeben wird. Die MEA enthaltende Lösung wird für weitere 10-12 Stunden zirkuliert, um die vollständige Blockierung der nicht-abreagierten Amine auf dem Harz sicherzustellen. Nach der Blockierung wird das mit Thrombin-gekuppelte Harz mit 10 Säulenvolumina an 1 M NaCl, 20 mM Tris pH 6,5 gewaschen, um das gesamte nicht-spezifisch gebundene Protein zu entfernen und wird in Aktivierungsreaktionen nach der Äquilibrierung in Aktivierungspuffer verwendet.
Gereinigtes r-hPC wird auf 5 mM EDTA gebracht (um restliches Calcium zu binden) und mit 20 mM Tris, pH 7,4 oder 20 mM Tris-Acetat pH 6,5 auf eine Konzentration von 2 mg/ml verdünnt. Dieses Material passiert eine Thrombinsäule, die bei 37°C mit 50 mM NaCl und entweder 20 mM Tris pH 7,4 oder 20 mM Tris-Acetat pH 6,5 äquilibriert ist. Die Flussrate wird so eingestellt, dass eine Kontaktzeit von etwa 20 Minuten zwischen dem r-hPC und dem Thrombinharz ermöglicht wird. Der Effluent wird gesammelt und sofort auf amidolytische Aktivität getestet. Falls das Material keine spezifische Aktivität (amidolytisch) im Vergleich zu einem etablierten Protein C Standard aufweist, wird es über die Thrombinsäule zurückgeführt, um das r-hPC vollständig zu aktivieren. Danach erfolgt eine 1:1 Verdünnung des Materials mit 20 mM Puffer wie oben mit einem pH zwischen 7,4 und 6,0 (der niedrigere pH ist bevorzugt, um eine Autodegradation zu verhindern) um das Protein C bei geringeren Konzentrationen zu halten, während es auf den nächsten Aufarbeitungsschritt wartet.
Die Entfernung des ausgelaugten Thrombins vom Protein C Material wird durch Bindung des Protein C an ein Anionenaustauscherharz erreicht (Fast Flow Q, Pharmacia), das in einem Aktivierungspuffer mit 150 mM NaCl äquilibriert ist (entweder 20 mM Tris pH 7,4 oder vorzugsweise 20 mM Tris-Acetat pH 6,5). Thrombin passiert die Säule und eluiert während eines Waschschritts mit 2-6 Säulenvolumina mit einem 20 mM Äquilibrierungspuffer. Gebundenes aPC wird mit einem Stufengradienten mittels 0,4 M NaCl entweder in 5 mM Tris-Acetat pH 6,5 oder 20 mM Tris pH 7,4 eluiert. Größervolumige Waschschritte der Säule erleichtern die vollständige Entfernung des Dodecapeptids. Das Material, das aus dieser Säule eluiert, wird entweder in einer gefrorenen Lösung (-20°C) oder als lyophilisiertes Pulver gelagert.
Die amidolytische Aktivität (AU) von aPC wird durch die Freisetzung von p-Nitroanilin aus dem synthetischen Substrat N-D-Phe-Pip-Arg-p-Nitroanilid (S-2238) von Kabi Vitrum mittels eines Beckmann DU-7400 Diodenarryspektrometer bestimmt. Eine Einheit des aktivierten Protein C wird als die Menge an Enzym definiert, das zur Freisetzung von 1 μmol an p-Nitroanilid in 1 Minute bei 25°C und pH 7,4 unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten für p-Nitroanilid bei 405 nm von 9620 M^-1cm^-1 erforderlich ist.
Die Antikoagulansaktivität des aktivierten Protein C wird durch Messen der Verlängerung der Gerinnungszeit im aktivierten partiellen Thromboplastinzeittest (APTT) bestimmt. Es wird eine Standardkurve in Verdünnungspuffer (1 mg/ml Radioimmuntest-reines Rinderserumalbumin [BSA], 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃) hergestellt, die von 125-1000 ng/ml reicht, wobei die Proben in mehreren Verdünnungen in diesem Konzentrationsbereich hergestellt werden. Zu jeder Probenküvette werden 50 μl kaltes Pferdeplasma und 50 μl des rekonstituierten Reagenzes für die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT Reagenz, Sigma) gegeben und bei 37°C für 5 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation werden 50 μl der geeigneten Proben oder Standards zu jeder Küvette gegeben. Verdünnungspuffer wird anstelle der Probe oder des Standards verwendet, um die basale Gerinnungszeit zu bestimmen. Der Timer des Fibrometers (CoA Screener Hemostasis Analyser, American Labor) wird unmittelbar nach der Zugabe von 50 μl 30 mM CaCl₂ mit 37°C zu jeder Probe oder zu jedem Standard gestartet. Die Konzentration des aktivierten Protein C in den Proben wird aus der linearen Regressionsgleichung der Standardkurve berechnet. Die hierin angegebenen Gerinnungszeiten sind das Mittel von minimal drei Parallelansätzen, einschließlich der Proben für die Standardkurve.
Die obigen Beschreibungen ermöglichen es dem Fachmann aPC herzustellen und zur Behandlung von hyperkoagulierbaren Zuständen zu verwenden.
Beispiel 1
Humanplasmaspiegel von aPC
Sechs Patienten erhalten eine i.v. Infusion mit aPC mit 1 mg/m²/Stunde oder etwa 0,024 mg/kg/h über einen Zeitraum von 24 Stunden. Die aPC Verabreichung ist eine lyophilisierte Formulierung, die 10 mg aPC, 5 mM Tris-Acetat-Puffer und 100 mM Natriumchlorid enthält und mit 2 ml Wasser rekonstiuiert und auf pH 6,5 eingestellt wurde.
Die Plasmakonzentrationen von aPC werden mittels eines Immunocapture-Amidolytic Assay gemessen. Es wird Blut in Gegenwart eines Citratantikoagulans und Benzamidins, einem reversiblen Inhibitor von aPC gesammelt. Das Enzym wird aus dem Plasma durch einen aPC spezifischen monoklonalen Mausantikörper C3 herausgefangen, der auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert ist. Der Inhibitor wird durch Waschen entfernt und die amidolytische Aktivität oder das aPC wird mittels eines chromogenen Oligopeptidsubstrats gemessen. Nach einer Inkubation für 16-20 Stunden bei 37°C wird die Absorption bei 405 nm gemessen und die Daten werden durch einen gewichteten, linearen Kurvenalgorithmus analysiert. Die aPC Konzentrationen werden aus einer Standardkurve abgeschätzt, die bezüglich der Konzentrationen von 0-100 ng/ml reicht. Das Detektionslimit des Tests beträgt 1,0 ng/ml. Die aPC Dosisspiegel und die Plasmakonzentrationen werden nach etwa 24 Stunden gemessen. Die Dosis von 0,024 mg/kg/h ergibt nach 24 Stunden etwa eine Plasmakonzentration von 50 ng/ml.
Beispiel 2
Doppelt-blinder, Plazebo-kontrollierter Versuch bei Humanpatienten mit Sepsis, Stufe 1 Dieses Protokoll ist ein zweistufiger, doppelt-blinder, Plazebo-kontrollierter Versuch bei Patienten mit schwerer Sepsis. In Stufe 1 erhalten insgesamt 72 Patienten für 48 Stunden eine Infusion mit rekombinantem humanem, aktiviertem Protein C (r-aPC).
Aufnahmekriterien umfassen 3 der 4 herkömmlich akzeptierter Kriterien für Sepsis (Herzfrequenz, respiratorische Anstrengung, erhöhte / verringerte Temperatur, erhöhte / verringerte Zahl weißer Blutkörperchen). Die Patienten müssen auch eine leichte Organdysfunktion zeigen, die entweder als Schock, verringerte Urinausscheidung oder Hypoxämie definiert wird. Es werden vier verschiedene Dosen verwendet: 12, 18, 24, 30 μg/kg/h. Das r-aPC wird für 48 Stunden durch ein kontinuierliches Infusionsverfahren infundiert. Die primären Endpunkte dieser Untersuchung sind: Sicherheit als Funktion der Dosis und der Dosisdauer und die Fähigkeit von r-aPC die Koagulopathie als Funktion der Dosis und der Dosisdauer zu korrigieren.
Die Mortalitätsinformation umfasst alle Dosen, sogar die geringsten Dosen, falls nichts anderes angegeben ist. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Plazebomortalität mit der erwarteten Plazebomortalität übereinstimmt. Eine Mortalität nach 28 Tagen aufgrund aller Ursachen ist der Endpunkt bei Patienten, die Plazebo erhalten gegenüber Patienten, die r-aPC erhalten.
Die insgesamt beobachtete Plazebomortalitätsrate beträgt 38 % (10/26) und die insgesamt beobachtete r-aPC Mortalitätsrate beträgt 20 % (9/46). Eine Untergruppe, die nur die zwei höchsten Dosen von r-aPC (24 und 30 μg/kg/h) umfasst, weist gegenüber Plazebopatienten eine beobachtete Mortalitätsrate von 13 % (3/24) auf.
Eine zweite Untergruppenanalyse umfasst Patienten mit einer erworbenen Protein C Defizienz, die als Grundaktivität des Protein C von wenigstens 60 % definiert ist. Von diesen 64 Patienten, deren Grundaktivitätsdaten von Protein C erhältlich sind, weisen zum Zeitpunkt der Aufnahme in die Studie 61 Patienten oder 95 % eine erworbene Protein C Defizienz auf. Die beobachtete Plazebomortalitätsrate für Protein C-defiziente Patienten beträgt 41 % (9/22) und die beobachtete r-aPC Mortalitätsrate für Protein C-defiziente Patienten beträgt 18 % (7/39).
Eine signifikante Informationsmenge, die nahe legt, dass eine geringdosierte Behandlung mit r-aPC Patienten mit einer schweren Sepsis hilft, umfasst die mittlere Zeit bis zum Tod bei Plazebopatienten gegenüber behandelten Patienten. Von den 10 Patienten, die in der Plazebogruppe sterben, beträgt die mittlere Zeit bis zum Tod 6 Tage. Bei Patienten, die mit r-aPC behandelt werden, beträgt die mittlere Zeit bis zum Tod 14 Tage. Zusätzlich überlebten 4 der 9 Patienten, die in der mit r-aPC behandelten Gruppe gestorben sind, 21 oder mehr Tage und verstarben dann an einem Ereignis, das mit der ersten Sepsisepisode nicht in Zusammenhang stand. Zwei der vier späten Todesfälle traten in der gering dosierten Gruppe auf (12 μg/kg/h). Beide Patienten verblieben in der Intensivstation und wurden während der gesamten Dauer der Studie bis zu ihrem Tod (Tag 27) künstlich beatmet. Die anderen 2 Patienten mit später Todesfolge waren in der hoch dosierten Gruppe (30 μg/kg/h). Beide Patienten zeigen eine anfängliche Besserung. Innerhalb von 2 Wochen konnten beide von der künstlichen Beatmung genommen werden und von der Intensivstation verlegt werden. Ein Patient verstarb eine Woche später an einer Sepsis, die eine Atemnot verursachte, nachdem er einen Wunsch auf Nichterfolgen einer Wiederbelebung geäußert hatte. Der zweite Patient verstarb am Tag 28 nach einer Lungeninsuffizienz, die mit einer zweiten Sep sisepisode zusammenhing. Der Patient hatte ebenfalls einen Nichtwiederbelebungsstatus erbeten und wurde daher nicht reintubiert. Es sollte erwähnt, dass die Wiederbehandlung mit r-aPC von Patienten, die eine zweite schwere Sepsisepisode während der 28 Tage dauernden Studie entwickeln, nicht unter dem Behandlungsprotokoll genehmigt wurde.
Die Mortalitätsinformation in dieser Studie ist überraschend und unerwartet. Keine andere doppelt blinde, Plazebo-kontrollierte Sepsisstudie hat Daten generiert, die eine solche deutliche Verringerung der 28 Tage-Mortalität aller Ursachen zeigen.
Beispiel 3
Formulierung von aktiviertem Protein C
Es wird eine stabile lyophilisierte Formulierung von aktiviertem Protein C durch ein Verfahren hergestellt, das die Lyophilisierung einer Lösung umfasst, die etwa 2,5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 15 mg/ml Saccharose, 20 mg/ml NaCl und einen Natriumcitratpuffer mit einem pH von mehr als 5,5 aber weniger als 6,5 enthält. Zusätzlich umfasst die stabile lyophilisierte Formulierung von aktiviertem Protein C die Lyophilisierung einer Lösung, die 5 mg/ml aktiviertes Protein C, 30 mg/ml Saccharose, 38 mg/ml NaCl und einen Citratpuffer mit einem pH von mehr als 5,5 aber weniger als 6,5 enthält.
Das Verhältnis von aPC : Salz : Füllstoff (G:G:G) ist ein wichtiger Faktor in einer Formulierung, die für den Gefriertrocknungsprozess geeignet ist. Das Verhältnis variiert in Abhängigkeit der Konzentration an Protein C, der Auswahl und Konzentration des Salzes und der Auswahl und der Konzentration des Füllstoffs. Insbesondere ist ein Verhältnis von 1 Teil aktiviertem Protein C zu 7,6 Teilen Salz zu 6 Teilen Füllstoff bevorzugt.
Eine Einheitsdosierungsformulierung von aktiviertem Protein C, die zur Verabreichung durch kontinuierliche Infusion geeignet ist, wird durch Mischen von aktiviertem Protein C, NaCl, Saccharose und Natriumcitratpuffer hergestellt. Nach dem Mischen werden 4 ml der Lösung in ein Einheitsdosierungsbehältnis überführt und lyophilisiert. Das Einheitsdosierungsbehältnis, das etwa 5 mg bis 20 mg aktiviertes Protein C enthält und zur Verabreichung einer Dosis von 0,02 mg/kg/h bis etwa 0,05 mg/kg/h an behandlungsbedürftige Patienten geeignet ist, wird verschlossen und bis zur Verwendung gelagert.

Claims

Verwendung eines rekombinanten aktivierten Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention eines erworbenen hyperkoagulierbaren Zustands, der mit Sepsis assoziiert ist, das einem Patienten durch kontinuierliche Infusion mit einer Dosierung von 20 μg/kg/h bis 50 μg/kg/h an humanem, aktiviertem Protein C über 24 bis 144 Stunden verabreicht wird, worin das aktivierte Protein C durch Expression von Protein C Zymogen in HEK 293 Zellen, gefolgt von einer Aktivierung in vitro erhältlich ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Patient ein Jugendlicher ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Arzneimittel zur Verabreichung unter Bereitstellung einer Dosierung von 22 μg/kg/h bis 50 μg/kg/h an humanem, aktiviertem Protein C vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin das Arzneimittel zur Verabreichung unter Bereitstellung einer Dosierung von 22 μg/kg/h bis 40 μg/kg/h an humanem, aktiviertem Protein C vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin das Arzneimittel zur Verabreichung unter Bereitstellung einer Dosierung von 22 μg/kg/h bis 30 μg/kg/h an humanem, aktiviertem Protein C vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin das Arzneimittel zur Verabreichung unter Bereitstellung einer Dosierung von 24 μg/kg/h bis 50 μg/kg/h an humanem, aktiviertem Protein C vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin das Arzneimittel zur Verabreichung unter Bereitstellung einer Dosierung von etwa 24 μg/kg/h an humanem, aktiviertem Protein C vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin das Arzneimittel zur Verabreichung unter Bereitstellung einer Dosierung von etwa 30 μg/kg/h an humanem, aktiviertem Protein C vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin ein Drittel bis die Hälfte der geeigneten Dosis pro Stunde des aktivierten Protein C als Bolusinjektion über eine Zeit von 5 Minuten bis 120 Minuten verabreicht wird, wonach eine kontinuierliche Infusion der geeigneten Dosis für 23 Stunden bis 144 Stunden erfolgt, was zur geeigneten Dosis führt, die über 24 bis 144 Stunden verabreicht wird.
Verwendung eines rekombinanten, aktivierten Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines erworbenen hyperkoagulierbaren Zustands, der mit Sepsis assoziiert ist, bei einem Patienten, wobei das Arzneimittel in einer Menge verabreicht wird, um einen Plasmaspiegel von etwa 50 ng/ml nach 24 Stunden zu erreichen, worin das aktivierte Protein C durch Expression von Protein C Zymogen in HEK 293 Zellen, gefolgt von einer Aktivierung in vitro erhältlich ist.