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Die
Erfindung betrifft die medizinische Wissenschaft, insbesondere die
Behandlung von erworbenen hyperkoagulierbaren Zuständen mit
aktiviertem Protein C, die mit einer Sepsis assoziiert sind.
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Protein
C ist eine Serinprotease und ein natürlich vorkommendes Antikoagulans,
das eine Rolle bei der Regulation der Hämostase durch dessen Fähigkeit
zur Blockade der Thrombinbildung die Inaktivierung der Faktoren
Va und VIIIa in der Gerinnungskaskade spielt. Humanes Protein C
wird in vivo primär
in der Leber als einzelnes Polypeptid mit 461 Aminosäuren gebildet.
Dieses Vorläufermolekül durchläuft mehrfach
posttranslationale Modifikationen einschließlich 1) Abspaltung einer 42
Aminosäure
langen Signalsequenz, 2) proteolytische Spaltung des einkettigen
Zymogens zwischen dem Lysinrest an der Position 155 und dem Argininrest
an der Position 156 unter Bildung einer zweikettigen Zymogenform
des Moleküls
(das heißt
eine leichte Kette mit 155 Aminosäureresten ist über eine
Disulfidbrücke
an die die Serinprotease enthaltende schwere Kette mit 262 Aminosäureresten
gebunden), 3) Vitamin-K abhängige
Carboxylierung von neun Glutaminsäureresten die in den ersten
42 Aminosäuren
der leichten Kette vorkommen, was zu 9 γ-Carboxyglutaminsäureresten
führt und
4) Kohlenhydratanfügung
an vier Stellen (eine in der leichten Kette und drei in der schweren Kette).
Die schwere Kette enthält
die gut etablierte Serinproteasentriade aus Asp 257, His 211 und
Ser 360. Schließlich
wird das zirkulierende zweikettige Zymogen in vivo durch Thrombin
an einer Phospholipidoberfläche
in Gegenwart von Calciumionen aktiviert. Die Aktivierung kommt durch
die Entfernung eines Dodecapeptids am N-Terminus der schweren Kette
unter Bildung des aktivierten Protein C (aPC) zustande, das eine
enzymatische Aktivität
besitzt.
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Zusammen
mit anderen Proteinen fungiert aPC vermutlich als der wichtigste
Dämpfer
der Blutgerinnung, was zu einem Schutz gegen Thrombose führt. Zusammen
mit den Antikoagulationsfunktionen hat aPC durch die Wirkung über die
Hemmung der Cytokinerzeugung (beispielsweise TNF und IL-1) antiinflammatorische
Effekte und zeigt auch profibrinolytische Eigenschaften, die die
Gerinnselauflösung
erleichtern. Daher stellt das Protein C Enzymsystem einen physiologischen
Hauptmechanismus der Gerinnungshemmung, Entzündungshemmung und Fibrinolyse
dar.
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Sepsis
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Die
Sepsis wird als systemische Entzündungsreaktion
auf eine Infektion definiert, die mit der Aktivierung von mehreren
Wirtsabwehrmechanismen assoziiert ist und hierdurch vermittelt wird,
einschließlich
dem Cytokinnetzwerk, Leukozyten und den Komplement- und Gerinnungs-
/ Fibrinolysesystemen. [Mesters et al., Blood, 88: 881-886, 1996].
Die disseminierte, intravaskuläre
Koagluation [DIC] mit einer weitverbreiteten Ablagerung von Fibrin
in der Mikrovaskulatur von verschiedenen Organen ist eine frühe Manifestation
der Sepsis / des septischen Schocks. Die DIC ist ein wichtiger Mediator
bei der Entwicklung des Multiorganversagens und trägt zur schlechten
Prognose für
Patienten mit septischem Schock bei. [Fourrier et al., Chest 101:
816-823, 1992].
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Es
wurden mehrere ermunternde präklinische
Studien mittels Protein C in verschiedenen Tiermodellen der Sepsis
berichtet. Eine Studie in einem Pavian-Sepsismodell von Taylor et
al., [J. Clin. Invest. 79: 918-925, 1987] verwendet von Plasma stammendes
humanes, aktiviertes Protein C. Die Tiere werden prophylaktisch behandelt
(das heißt
das aPC wird zum Start der 2 Stunden dauernden Infusion der LD100 E. coli verabreicht). 5 von 5 Tieren überlebten
7 Tage und werden im Experimentalprotokoll als dauerhafte Überlebende
betrachtet. In Kontrolltieren sterben 5 von 5 Tiere, die eine identische
Infusion mit E. coli erhalten, innerhalb von 24 bis 32 Stunden.
Die wirksame Dosis beträgt
7 bis 8 mg/kg.
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In
einem Sepsismodell mit Lipopolysaccharid (LPS, E. coli) in Ratten
[Murakami et al., Blood 87: 642-647, 1996] wird die durch LPS induzierte
vaskuläre
Lungenverletzung durch aus Humanplasma stammendes aktiviertes Protein
C mit einer Dosis von 100 μg/kg
gehemmt. Ferner wurde in einem Ligations- und Punktionssepsismodell
in Kaninchen, Okamoto et al., [Gastroenterology 106: A747, 1994],
gezeigt, dass von Plasma stammendes humanes aktiviertes Protein
C beim Schutz der Tiere vor einer Koagulopathie und einem Organversagen
mit einer Dosis von 12 μg/kg/h
für 9 Stunden
wirksam ist. Aufgrund der Speziesspezifität von aPC sind die in diesen
Tieren erhaltenen Ergebnisse nicht notwendigerweise auf die Behandlung
im Menschen übertragbar.
Der wirksame Dosislevel von humanem aktiviertem Protein C ist in
Abhängigkeit
des ausgewählten
Tiermodells extrem variabel und unverhersagbar. Beispielsweise beträgt die Serumhalbwertszeit
von humanem aktiviertem Protein C in Menschen 30 bis 40 Minuten
im Vergleich zu einer Halbwertszeit von 8 bis 10 Minuten in Pavianen
und 90 Minuten in Kaninchen.
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Es
gab kürzlich
mehrere Versuche, Sepsis beim Menschen zu behandeln, meistens unter
Verwendung von Mitteln, die die Entzündungsmediatoren blockieren,
die mit der Pathophysiologie der Erkrankung zusammenhängen. Jedoch
waren klinische Studien mit einer Vielzahl an Mitteln, die Entzündungsmediatoren
blockieren, nicht erfolgreich [zusammengefasst in Natanson et al.,
Ann. Intern. Med. 120: 771-783, 1994, Gibaldi, Pharmacotherapy 13:
302-308, 1993]. Da viele Mediatoren, die bei der Entzündung beteiligt
sind, kompensatorische Reaktionen sind und daher heilende Wirkungen
haben, haben einige Forscher vorgeschlagen, dass die Blockierung
ihrer Wirkung nicht geeignet sein könnte [beispielsweise N. Parrillo
Engl. J. Med. 328: 1471-1477, 1993].
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Kürzlich wurde
die Blockierung der DIC als neues Ziel für klinische Versuche bei Sepsis
vorgeschlagen [beispielsweise Levi et al., JAMA 270: 975-979, 1993].
Jedoch könnte
die einfache Hemmung des Koagulationsdefekts bei der Sepsis nicht
ausreichend sein. Wie dies von Esmon zusammengefasst wurde [Arteriosklerosis & Thromb. 12: 135-145,
1992] haben mehrere Antithrombotika keine Wirksamkeit im Pavian
Sepsismodell gezeigt, einschließlich
des die aktive Stelle blockierenden Faktors Xa [Taylor et al., Blood
78: 364-368, 1991], Hirudin und Hirulog [Maraganore, Perspective
in Drug Discovery and design 1: 461-478, 1994]. Jedes dieser Antithrombotika
ist zur Blockierung der verbrauchenden Koagulopathie in den Tieren
fähig,
aber sie sind nicht fähig,
das Überleben
zu verlängern.
Zusätzlich
haben Forscher in Japan [
JP
7097335A ] vorgeschlagen, die mit der Leberinsuffizienz
assoziierte Koagulopathie, die das Potential zur Entwicklung von
DIC-ähnlichen Symptomen
aufweist, mit aus Plasma stammendem aktiviertem Protein C zu behandeln.
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Bisher
wurde aus Plasma stammendes humanes Protein C Zymogen als erfolgreiches
Zusatzmittel zur aggressiven herkömmlichen Therapie bei der Behandlung
von 25 Patienten mit Purpura fulminans mit bakterieller Sepsis verwendet,
von denen 22 überlebt
haben (Gerson et al., Pediatrics 91: 418-422, 1993, Smith et al.,
Thromb. Haemost, PS1709, p419, 1997, Rintala et al., Lancet 347:
1767, 1996, Rivard et al., J. Pediatr. 126: 646-652, 1995). Gerson
et al., [1993] beschrieben eine Fallstudie einer Behandlung eines
Kindes mit einer bewiesenen grampositiven Bakteriämie und
Purpura fulminans, das auf die aggressive herkömmliche Behandlung nicht ansprach.
Der Patient wurde mit aus Plasma stammendem humanem Protein C Zymogen
(280 μg/kg
Bolus + 40 μg/kg/h
Infusion) behandelt, was zu einer assoziierten Korrektur der Koagulopathie
und der DIC und zum Anhalten der klinischen Anzeichen der Entwicklung
einer mit einem septischen Schock zusammenhängenden Purpura fulminans führte. Rintala
et al., [1996] berichten von der Behandlung von 2 Erwachsenen mit
einer Meningokokkenseptikämie,
die sich als Purpura fulminans präsentierte. Die Patienten wurden mit
aus Plasma stammendem Protein C Zymogen mit 400 μg/kg Bolus alle 6 Stunden für 8-10 Tage
behandelt. Einer starb und einer überlebte. Rivard et al., [1985]
berichten von der Behandlung von vier Patienten mit Meningokokkenämie, die
sich auch mit einer Purpura fulminans präsentiert, die alle nach einer
Therapie mit humanem Protein C Zymogen überlebten. Diese Patienten
werden mit einer Dosis von 400 μg/kg
Bolus alle 6 Stunden behandelt. Obwohl die Fallzahl aus diesen Studien
gering ist, beträgt
die mit einer Meningokokkenämie,
die mit einer Purpura fulminans zum Ausdruck kommt, mehr als 50
% [Powars et al., Clin. Infectious Diseases 17: 254-261, 1993].
Da jedoch die Studien mit humanem Protein C Zymogen ausgeführt werden,
geben sie nur wenig Anhaltspunkte für die Ermittlung der Dosis
und der Therapiedauer mit aktiviertem Protein C.
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Zusätzlich zur
Meningokokkenämie
sind Purpura fulminans und/oder DIC mit mehreren bakteriellen, viralen
oder protozoalen Infektionen assoziiert, die unter anderem Infektionen
umfassen, welche durch Rickettsia verursacht werden (Rocky Mountain
Spotted Fieber, Zeckenbissfieber, Typhus etc.) [Graybill et al., Southern
Medical Journal, 66 (4): 410-413, 1973, Loubser et al., Annals of
Tropical Paediatrics 13: 277-280, 1993], Salmonella (Typhusfieber,
Rattenbissfieber), [Koul et al., Acta Haematol, 93: 13-19, 1995],
Pneumococci [Carpenter et al., Scand. J. Infect. Dis., 29, 479-483,
1997], Yersinia pestis (Pest) [Butler et al., The Journal of Infectious
Disease, 129: 578-584, 1974], Legionella pneumophila (Legionärserkrankung),
Plasmodium falciparum (cerebrale Malaria), [Lercari et al., Journal
of Clinical Apheresis, 7: 93-96, 1992], Burkholderia pseudomallei
(Melioidose), Pseudomonas pseudomallei (Melioidose), [Puthucheary
et al., Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and
Hygiene, 86: 683-685, 1992], Streptococci (odontogene Infektionen)
[Y. Ota, J. Japanese Assoc. Infect. Dis., 68: 157-161], Zoster Virus
[Nguyen et al., Eur. J. Pediatr., 153: 646-649, 1994], Bacillus
anthracis (Anthrax) [Franz et al., Journal of the American Medical
Assoc, 278 (5): 399-411, 1997], Leptospira interrogans (Leptospirose)
[Hill et al., Seminars in Respiratory Infections, 12 (1): 44-49, 1997],
Staphylococci [M. Levin, Pediatric Nephrology, 8: 223-229], Haemophilus
aegyptius (Brazilian purpuric Fieber), Neisseria (Gonokokkenämie, Meningokokkenämie) und
Mykobakterium tuberculosis (Milartuberkulose).
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Obwohl
die Purpura fulminans, DIC oder erworbene Protein C Defizienzzustände bei
der Sepsis / dem septischen Schock oder anderen Infektionen sehr
gut dokumentiert wurden, wie dies oben angegeben ist, gibt es wenig
Daten, wie diese Patienten mit aktiviertem Protein zu behandeln
sind. Die Etablierung von humanen Dosismengen mittels der präklinischen
Pharmakologiedaten, die aus der Behandlung mit aktiviertem humanem
Protein C in Tiermodellen erzeugt wurden, ist aufgrund der Speziesspezifitätseigenschaften
der biologischen Wirkungen von Protein C schwierig.
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Die
Charakterisierung und neue Reinigung von rekombinanten Protein C,
das in HEK293 Zellen exprimiert wird, wird von S.C. Betty Yan et
al. (1990), Biotechnology (8), 655-661 (XP008028568) beschrieben.
Die Behandlung der Paviansepsis mit aus Plasma stammendem aktiviertem
Protein C ist in
US
5 009 889 A beschrieben.
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Um
die Dosismengen von Protein C, die in der Literatur und den Patentdokumenten
angegeben sind, leichter zu vergleichen, zeigt die Tabelle 1 normalisierte
Dosismengen von mehreren Studien beim Menschen oder bei nicht-humanen
Primaten. Diese Daten etablieren Dosismengen, die höher oder
niedriger sind als die Dosismengen, die in der vorliegenden Erfindung
bereitgestellt werden. Signifikanterweise wurden die Humanstudien
unter Verwendung von aus Plasma stammendem Protein C Zymogen gemacht,
wobei die nicht-humane Primatenstudie rekombinantes humanes aPC
verwendete.
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Trotz
dieser Berichte bleibt jedoch der Dosisplan für eine sichere und effiziente
Therapie bei Menschen unbekannt, die an einem erworbenen hyperkoagulierbaren
Zustand leiden, der mit einer Sepsis assoziiert ist. Diese Studien
sagen nichts über
die Verwendung von rekombiantem, aktiviertem Protein C der vorliegenden Erfindung
bei der Behandlung von hyperkoagulierbaren Zuständen beim Menschen aus.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von aPC in einer
klinischen Studie bei Patienten mit schwerer Sepsis. Bei diesen
Patienten zeigt die mit r-aPC behandelte Gruppe eine statistische
Verbesserung der Organfunktionen, eine Verringerung der DIC Marker
und eine Verringerung der Mortalität im Vergleich zu Plazebokontrollgruppe.
Die Dosen an aPC, die bei Patienten mit schwerer Sepsis verwendet
wird, betragen 12, 18, 24 und 30 μg/kg/h
bei einer 48 Stunden dauernden Infusion. Die Dosen mit 12 und 18 μg/kg/h sind
bei dieser Studie nicht wirksam. Überraschenderweise sind die
in der Studie verwendeten Dosen von 24 und 30 μg/kg/h wirksam und beträchtlich
und unerwarteterweise gering im Vergleich zu den veröffentlichten
präklinischen
pharmakologischen Daten.
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Zusätzlich wurde
festgestellt, dass die präklinischen
Toxikologiestudien bei nicht-humanen Primaten bezüglich der
Sicherheit von aPC bei einer 96 Stunden dauernden Infusion zeigen,
dass diese auf eine Maximaldosis um die 50 μg/kg/h beschränkt ist.
Diese Daten sind auch unerwartet, wenn man sie mit dem Stand der
Technik vergleicht. Tatsächlich
liegen die Dosismengen von r-aPC für Menschen, die auf den vorherigen präklinischen
und klinischen Studien basieren, über dem toxikologischen Bereich,
der in den obigen toxikologischen Studien etabliert wurde.
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Die
vorliegende Erfindung liefert die Verwendung eines rekombinanten
aktivierten Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung
oder Prävention
eines erworbenen hyperkoagulierbaren Zustands, der mit Sepsis assoziiert
ist, das einem Patienten durch kontinuierliche Infusion mit einer
Dosierung von 20 μg/kg/h
bis 50 μg/kg/h
an humanem, aktiviertem Protein C über 24 bis 144 Stunden verabreicht
wird, worin das aktivierte Protein C durch Expression von Protein
C Zymogen in HEK 293 Zellen, gefolgt von einer Aktivierung in vitro
erhältlich
ist.
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Die
Erfindung liefert ferner die Verwendung eines rekombinanten, aktivierten
Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines
erworbenen hyperkoagulierbaren Zustands, der mit Sepsis assoziiert
ist, bei einem Patienten, wobei das Arzneimittel in einer Menge
verabreicht wird, um einen Plasmaspiegel von 50 ng/ml nach 24 Stunden
zu erreichen, worin das aktivierte Protein C durch Expression von
Protein C Zymogen in HEK 293 Zellen, gefolgt von einer Aktivierung
in vitro erhältlich
ist.
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Daher
etabliert die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung von
aPC bei der Behandlung des hyperkoagulierbaren Zustands, der mit
Sepsis assoziiert ist, bei Humanpatienten.
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Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht
wird, werden die folgenden Ausdrücke
wie im folgenden definiert.
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aPC
oder aktiviertes Protein C bezieht sich auf rekombinantes aktiviertes
Protein C. aPC umfasst und ist vorzugsweise humanes Protein C, obwohl
aPC auch andere Spezies oder Derivate mit vollen proteolytischen,
amidolytischen, esterolytischen und biologischen (gerinnungshemmenden
und profibrinolytischen) Aktivitäten
von Protein C umfassen kann. Beispiele für Protein C Derivate sind von
Gerlitz et al.,
US 5
453 373 A und Foster et al
US 5 516 650 A beschrieben. Rekombinantes,
aktiviertes Protein C kann durch die Aktivierung von rekombinantem,
humanem Protein C Zymogen in vitro oder durch direkte Sekretion
der aktivierten Form von Protein C hergestellt werden. Protein C
kann aus humanen 293 Nie renzellen als Zymogen hergestellt und dann
durch Techniken aktiviert werden, die dem Fachmann bekannt sind.
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Behandeln – beschreibt
das Management und die Sorge für
einen Patienten, um eine Erkrankung, einen Zustand oder eine Störung zu
bekämpfen
und umfasst die prophylaktische Verabreichung von aPC, um das Einsetzen
der Symptome oder Komplikationen der Erkrankung, des Zustands oder
der Störung
zu verhindern oder die Verabreichung von aPC zur Eliminierung der
Erkrankung, des Zustands oder der Störung.
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Kontinuierliche
Infusion – die
im wesentlichen ununterbrochene Fortsetzung der Einführung einer
Lösung
in eine Vene für
einen bestimmten Zeitraum.
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Bolusinjektion – die Injektion
eines Arzneimittels in einer definierten Menge (Bolus genannt) über einen Zeitraum
von bis zu etwa 120 Minuten.
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Zur
Verabreichung geeignet – eine
lyophilisierte Formulierung oder Lösung, die zur Verabreichung
als therapeutisches Mittel geeignet ist.
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Behältnis – ein Behälter, wie
ein Gläschen
oder eine Flasche, die verwendet wird, um das bestimmte Material,
beispielsweise aPC zu enthalten.
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Einheitsdosierungsform – bezieht
sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die für einzelne Dosierungen für Menschen
geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktivem
Material enthält,
die zur Herstellung des gewünschten
therapeutischen Effekts berechnet ist, zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen
Hilfsstoff.
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Hyperkoagulierbare
Zustände – übermäßige Koagulabilität, die mit
einer disseminierten intravaskularen Koagulation, präthrombotischen
Zuständen,
Aktivierung der Koagulation oder einer angeborenen oder erworbenen
Defizienz der Gerinnungsfaktoren wie aPC assoziiert ist.
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Zymogen – Protein
C Zymogen bezieht sich, wie es hierin verwendet wird, auf sekretierte,
inaktive Formen, ob mit einer Kette oder mit zwei Ketten, von Protein
C.
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Jugendlicher – ein humaner
Patient, einschließlich
unter anderem Neugeborene, Kleinkinder und Kinder, die jünger als
18 Jahre sind.
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Wirksame
Menge – eine
therapeutisch wirkungsvolle Menge einer pharmazeutischen Verbindung.
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Purpura
fulminans – ecchymotische
Hautläsionen,
Fieber, Hypotension, die mit bakterieller Sepsis, viralen, bakteriellen
oder protozoalen Infektionen assoziiert sind. Gewöhnlich ist
eine disseminierte, intravaskuläre
Koagulation gegenwärtig.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung oder Prävention
von hyperkoagulierbaren Zuständen,
die mit Sepsis assoziiert sind, mit aktiviertem Protein C. Das aPC
kann durch in der Technik gut bekannte Verfahren unter Verwendung
von HEK 293 Zellen hergestellt werden, wie dies beispielsweise in
Grinnell in
US 5 681
932 A beschrieben ist. Ferner sind Beispiele für eine transgene
Produktion von rekombinanten Proteinen in Drohan et al., in
US 5 589 604 A und
Archibald et al.,
US
5 650 503 A beschrieben.
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Um
unter den vorliegenden Methoden voll aktiv und funktionsfähig zu sein,
muss das durch eines dieser Verfahren hergestellte aPC posttranslationalen
Modifikationen unterzogen werden, wie der Anfügung von 9 gamma-Carboxyglutamaten
(gamma-Carboxylierung, das heißt
Gla Gehalt), der Anfügung
von einem Erythro-beta-hydroxy-Asp (beta-Hydroxylierung), der Anfügung von
4 Asn-gebundenen Oligosacchariden (Glykosylierung), der Entfernung
der Signalsequenz (42 Aminosäureresten)
und der Entfer nung des Dipeptids Lys 156-Arg 157. Ohne diese posttranslationalen
Modifikationen ist aPC nicht voll funktionsfähig oder nicht funktionsfähig.
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Das
aPC kann gemäß bekannter
Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch brauchbaren Zusammensetzungen
formuliert werden. Das aPC wird parenteral verabreicht, um die Abgabe
an den Blutstrom in einer wirksamen Form durch die Injektion der
geeigneten Dosis als kontinuierliche Infusion für 24 bis 144 Stunden sicherzustellen.
Die Menge an verabreichtem aPC beträgt 20 μg/kg/h bis 50 μg/kg/h. Bevorzugter
beträgt die
Menge an verabreichtem aPC 22 μg/kg/h
bis 40 μg/kg/h.
Noch bevorzugter beträgt
die Menge an verabreichtem aPC 22 μg/kg/h bis 30 μg/kg/h. Die
am meisten bevorzugten Mengen an verabreichtem aPC betragen 24 μg/kg/h oder
30 μg/kg/h.
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Alternativ
wird das aPC durch die Injektion eines Teils (1/3 bis 1/2) der geeigneten
Dosis pro Stunde als Bolusinjektion über einen Zeitraum von 5 Minuten
bis 120 Minuten gefolgt von der kontinuierlichen Infusion der geeigneten
Dosis für
23 Stunden bis 144 Stunden verabreicht, was zur geeigneten Dosis
führt,
die über
24 Stunden bis 144 Stunden verabreicht wird.
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Nur
nach sorgfältig
kontrollierten klinischen Studien und ausgiebigen Experimentalstudien
wurde festgestellt, dass die Dosierungen von 20 μg/kg/h bis 50 μg/kg/h als
kontinuierliche Infusion für
24 Stunden bis 144 Stunden zu einer wirksamen Therapie führen. Die
am meisten bevorzugte Dosierung von aPC, das zur Behandlung von
Humanpatienten mit einem erworbenen hyperkoagulierbaren Zustand
verabreicht wird, beträgt, wie
hierin beschrieben, 24 μg/kg/h.
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Präparation 1
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Herstellung von humanem
Protein C
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Rekombinantes
humanes Protein C (r-hPC) wird in humanen 293-Nierenzellen durch
Techniken hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind, wie die, die
in Yan,
US 4 981 952
A beschrieben sind. Das für humanes Protein C kodierende
Gen ist beschrieben und beansprucht in Bang et al.,
US 4 775 624 A . Das zur Expression
von humanem Protein C in 293-Zellen verwendete Plasmid ist pLPC,
das in Bang et al.,
US
4 992 373 A beschrieben ist. Die Konstruktion des Plasmids
pLPC ist auch in der
EP
0 445 939 A und in Grinnell et al., 1987, BioTechnology
5: 1189-1192 beschrieben. Kurz gesagt wird das Plasmid in 293-Zellen
transfiziert und dann werden stabile Transformanden identifiziert,
subkultiviert und in serumfreiem Medium angezogen. Nach der Fermentation
wird zellfreies Medium durch Mikrofiltration erhalten.
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Das
humane Protein C wird aus der Kulturflüssigkeit durch eine Anpassung
an die Techniken von Yan
US
4 981 952 A abgetrennt. Das geklärte Medium wird auf 4 mM EDTA
gebracht, bevor es an eine Anionenaustauscherharzsäule adsorbiert
wird (Fast-Flow Q, Pharmacia). Nach dem Waschen mit 4 Säulenvolumina 20
mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 und 2 Säulenvolumina 20 mM Tris, 150
mM NaCl, pH 7,4 wird das gebundene rekombinante humane Protein C
Zymogen mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl
2 pH
7,4 eluiert. Das eluierte Protein ist zu mehr als 95 % rein nach
der Elution, wie dies durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese beurteilt
wird.
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Eine
weitere Reinigung des Proteins wird durch Aufstocken des Proteins
auf 3 M bezüglich
NaCl gefolgt von einer Adsorption an ein hydrophobes Wechselwirkungsharz
(Toyopearl Phenyl 650M, Toso-Haas)
erreicht, das mit 20 mM Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl2 pH
7,4 äquilibriert
ist. Nach dem Waschen mit 2 Säulenvolumina
des Äquilibrierungspuffers
ohne CaCl2 wird das rekombinante humane
Protein C mit 20 mM Tris pH 7,4 eluiert.
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Das
eluierte Protein wird durch die Entfernung des restlichen Calciums
auf die Aktivierung vorbereitet. Das rekombinante humane Protein
C passiert eine Metallaffinitätssäule (Chelex-100,
Bio-Rad), um Calcium zu entfernen und wird erneut an einen Anionenaustauscher
gebunden (Fast Flow Q, Pharmacia). Diese beiden Säulen werden
in Reihe angeordnet und mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA pH
7,4 äquilibriert.
Nach der Beladung mit Protein wird die Chelex-100 Säule mit
einem Säulenvolumen
desselben Puffers gewaschen, bevor sie aus der Reihe genommen wird.
Die Anionenaustauschersäule
wird mit 3 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer
gewaschen, bevor das Protein mit 0,4 M NaCl, 20 mM Tris-Acetat pH
6,5 eluiert wird. Die Proteinkonzentrationen der Lösungen an
rekombinantem humanem Protein C und rekombinantem aktiviertem Protein C
werden jeweils durch Extinktion bei UV von 280 nm und mit E0,1% = 1,85 oder 1,95 gemessen.
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Präparation 2
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Aktivierung
von rekombinantem humanem Protein C
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Rinderthrombin
wird an aktivierte CH-Sepharose 4B (Pharmacia) in Gegenwart von
50 mM HEPES pH 7,5 bei 4°C
gekuppelt. Die Kupplungsreaktion wird mittels etwa 5000 Einheiten
Thrombin/ml Harz auf Harz ausgeführt,
das bereits in eine Säule
gepackt ist. Die Thrombinlösung
zirkuliert für
etwa 3 Stunden durch die Säule,
bevor MEA in einer Konzentration von 0,6 ml/l der zirkulierenden
Lösung
zugegeben wird. Die MEA enthaltende Lösung wird für weitere 10-12 Stunden zirkuliert,
um die vollständige
Blockierung der nicht-abreagierten Amine auf dem Harz sicherzustellen.
Nach der Blockierung wird das mit Thrombin-gekuppelte Harz mit 10 Säulenvolumina
an 1 M NaCl, 20 mM Tris pH 6,5 gewaschen, um das gesamte nicht-spezifisch
gebundene Protein zu entfernen und wird in Aktivierungsreaktionen
nach der Äquilibrierung
in Aktivierungspuffer verwendet.
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Gereinigtes
r-hPC wird auf 5 mM EDTA gebracht (um restliches Calcium zu binden)
und mit 20 mM Tris, pH 7,4 oder 20 mM Tris-Acetat pH 6,5 auf eine
Konzentration von 2 mg/ml verdünnt.
Dieses Material passiert eine Thrombinsäule, die bei 37°C mit 50
mM NaCl und entweder 20 mM Tris pH 7,4 oder 20 mM Tris-Acetat pH
6,5 äquilibriert
ist. Die Flussrate wird so eingestellt, dass eine Kontaktzeit von
etwa 20 Minuten zwischen dem r-hPC und dem Thrombinharz ermöglicht wird.
Der Effluent wird gesammelt und sofort auf amidolytische Aktivität getestet.
Falls das Material keine spezifische Aktivität (amidolytisch) im Vergleich
zu einem etablierten Protein C Standard aufweist, wird es über die
Thrombinsäule
zurückgeführt, um
das r-hPC vollständig
zu aktivieren. Danach erfolgt eine 1:1 Verdünnung des Materials mit 20
mM Puffer wie oben mit einem pH zwischen 7,4 und 6,0 (der niedrigere
pH ist bevorzugt, um eine Autodegradation zu verhindern) um das
Protein C bei geringeren Konzentrationen zu halten, während es
auf den nächsten
Aufarbeitungsschritt wartet.
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Die
Entfernung des ausgelaugten Thrombins vom Protein C Material wird
durch Bindung des Protein C an ein Anionenaustauscherharz erreicht
(Fast Flow Q, Pharmacia), das in einem Aktivierungspuffer mit 150 mM
NaCl äquilibriert
ist (entweder 20 mM Tris pH 7,4 oder vorzugsweise 20 mM Tris-Acetat pH 6,5). Thrombin passiert
die Säule
und eluiert während
eines Waschschritts mit 2-6 Säulenvolumina
mit einem 20 mM Äquilibrierungspuffer.
Gebundenes aPC wird mit einem Stufengradienten mittels 0,4 M NaCl
entweder in 5 mM Tris-Acetat pH 6,5 oder 20 mM Tris pH 7,4 eluiert.
Größervolumige
Waschschritte der Säule
erleichtern die vollständige
Entfernung des Dodecapeptids. Das Material, das aus dieser Säule eluiert,
wird entweder in einer gefrorenen Lösung (-20°C) oder als lyophilisiertes
Pulver gelagert.
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Die
amidolytische Aktivität
(AU) von aPC wird durch die Freisetzung von p-Nitroanilin aus dem
synthetischen Substrat N-D-Phe-Pip-Arg-p-Nitroanilid (S-2238) von
Kabi Vitrum mittels eines Beckmann DU-7400 Diodenarryspektrometer
bestimmt. Eine Einheit des aktivierten Protein C wird als die Menge
an Enzym definiert, das zur Freisetzung von 1 μmol an p-Nitroanilid in 1 Minute
bei 25°C
und pH 7,4 unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten für p-Nitroanilid
bei 405 nm von 9620 M-1cm-1 erforderlich
ist.
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Die
Antikoagulansaktivität
des aktivierten Protein C wird durch Messen der Verlängerung
der Gerinnungszeit im aktivierten partiellen Thromboplastinzeittest
(APTT) bestimmt. Es wird eine Standardkurve in Verdünnungspuffer
(1 mg/ml Radioimmuntest-reines Rinderserumalbumin [BSA], 20 mM Tris,
pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN3) hergestellt,
die von 125-1000 ng/ml reicht, wobei die Proben in mehreren Verdünnungen in
diesem Konzentrationsbereich hergestellt werden. Zu jeder Probenküvette werden
50 μl kaltes
Pferdeplasma und 50 μl
des rekonstituierten Reagenzes für
die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT Reagenz, Sigma)
gegeben und bei 37°C
für 5 Minuten
inkubiert. Nach der Inkubation werden 50 μl der geeigneten Proben oder
Standards zu jeder Küvette
gegeben. Verdünnungspuffer
wird anstelle der Probe oder des Standards verwendet, um die basale
Gerinnungszeit zu bestimmen. Der Timer des Fibrometers (CoA Screener
Hemostasis Analyser, American Labor) wird unmittelbar nach der Zugabe
von 50 μl
30 mM CaCl2 mit 37°C zu jeder Probe oder zu jedem
Standard gestartet. Die Konzentration des aktivierten Protein C
in den Proben wird aus der linearen Regressionsgleichung der Standardkurve
berechnet. Die hierin angegebenen Gerinnungszeiten sind das Mittel
von minimal drei Parallelansätzen,
einschließlich
der Proben für
die Standardkurve.
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Die
obigen Beschreibungen ermöglichen
es dem Fachmann aPC herzustellen und zur Behandlung von hyperkoagulierbaren
Zuständen
zu verwenden.
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Beispiel 1
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Humanplasmaspiegel von
aPC
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Sechs
Patienten erhalten eine i.v. Infusion mit aPC mit 1 mg/m2/Stunde oder etwa 0,024 mg/kg/h über einen
Zeitraum von 24 Stunden. Die aPC Verabreichung ist eine lyophilisierte
Formulierung, die 10 mg aPC, 5 mM Tris-Acetat-Puffer und 100 mM
Natriumchlorid enthält
und mit 2 ml Wasser rekonstiuiert und auf pH 6,5 eingestellt wurde.
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Die
Plasmakonzentrationen von aPC werden mittels eines Immunocapture-Amidolytic
Assay gemessen. Es wird Blut in Gegenwart eines Citratantikoagulans
und Benzamidins, einem reversiblen Inhibitor von aPC gesammelt.
Das Enzym wird aus dem Plasma durch einen aPC spezifischen monoklonalen
Mausantikörper
C3 herausgefangen, der auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert
ist. Der Inhibitor wird durch Waschen entfernt und die amidolytische
Aktivität
oder das aPC wird mittels eines chromogenen Oligopeptidsubstrats
gemessen. Nach einer Inkubation für 16-20 Stunden bei 37°C wird die
Absorption bei 405 nm gemessen und die Daten werden durch einen
gewichteten, linearen Kurvenalgorithmus analysiert. Die aPC Konzentrationen
werden aus einer Standardkurve abgeschätzt, die bezüglich der
Konzentrationen von 0-100 ng/ml reicht. Das Detektionslimit des
Tests beträgt
1,0 ng/ml. Die aPC Dosisspiegel und die Plasmakonzentrationen werden
nach etwa 24 Stunden gemessen. Die Dosis von 0,024 mg/kg/h ergibt
nach 24 Stunden etwa eine Plasmakonzentration von 50 ng/ml.
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Beispiel 2
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Doppelt-blinder,
Plazebo-kontrollierter Versuch bei Humanpatienten mit Sepsis, Stufe
1 Dieses Protokoll ist ein zweistufiger, doppelt-blinder, Plazebo-kontrollierter
Versuch bei Patienten mit schwerer Sepsis. In Stufe 1 erhalten insgesamt
72 Patienten für
48 Stunden eine Infusion mit rekombinantem humanem, aktiviertem
Protein C (r-aPC).
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Aufnahmekriterien
umfassen 3 der 4 herkömmlich
akzeptierter Kriterien für
Sepsis (Herzfrequenz, respiratorische Anstrengung, erhöhte / verringerte
Temperatur, erhöhte
/ verringerte Zahl weißer
Blutkörperchen).
Die Patienten müssen
auch eine leichte Organdysfunktion zeigen, die entweder als Schock,
verringerte Urinausscheidung oder Hypoxämie definiert wird. Es werden
vier verschiedene Dosen verwendet: 12, 18, 24, 30 μg/kg/h. Das
r-aPC wird für
48 Stunden durch ein kontinuierliches Infusionsverfahren infundiert.
Die primären
Endpunkte dieser Untersuchung sind: Sicherheit als Funktion der
Dosis und der Dosisdauer und die Fähigkeit von r-aPC die Koagulopathie
als Funktion der Dosis und der Dosisdauer zu korrigieren.
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Die
Mortalitätsinformation
umfasst alle Dosen, sogar die geringsten Dosen, falls nichts anderes
angegeben ist. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Plazebomortalität mit der
erwarteten Plazebomortalität übereinstimmt.
Eine Mortalität
nach 28 Tagen aufgrund aller Ursachen ist der Endpunkt bei Patienten,
die Plazebo erhalten gegenüber
Patienten, die r-aPC erhalten.
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Die
insgesamt beobachtete Plazebomortalitätsrate beträgt 38 % (10/26) und die insgesamt
beobachtete r-aPC Mortalitätsrate
beträgt
20 % (9/46). Eine Untergruppe, die nur die zwei höchsten Dosen
von r-aPC (24 und 30 μg/kg/h)
umfasst, weist gegenüber
Plazebopatienten eine beobachtete Mortalitätsrate von 13 % (3/24) auf.
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Eine
zweite Untergruppenanalyse umfasst Patienten mit einer erworbenen
Protein C Defizienz, die als Grundaktivität des Protein C von wenigstens
60 % definiert ist. Von diesen 64 Patienten, deren Grundaktivitätsdaten
von Protein C erhältlich
sind, weisen zum Zeitpunkt der Aufnahme in die Studie 61 Patienten
oder 95 % eine erworbene Protein C Defizienz auf. Die beobachtete
Plazebomortalitätsrate
für Protein
C-defiziente Patienten beträgt
41 % (9/22) und die beobachtete r-aPC Mortalitätsrate für Protein C-defiziente Patienten
beträgt
18 % (7/39).
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Eine
signifikante Informationsmenge, die nahe legt, dass eine geringdosierte
Behandlung mit r-aPC Patienten
mit einer schweren Sepsis hilft, umfasst die mittlere Zeit bis zum
Tod bei Plazebopatienten gegenüber
behandelten Patienten. Von den 10 Patienten, die in der Plazebogruppe
sterben, beträgt
die mittlere Zeit bis zum Tod 6 Tage. Bei Patienten, die mit r-aPC
behandelt werden, beträgt
die mittlere Zeit bis zum Tod 14 Tage. Zusätzlich überlebten 4 der 9 Patienten,
die in der mit r-aPC behandelten Gruppe gestorben sind, 21 oder
mehr Tage und verstarben dann an einem Ereignis, das mit der ersten
Sepsisepisode nicht in Zusammenhang stand. Zwei der vier späten Todesfälle traten
in der gering dosierten Gruppe auf (12 μg/kg/h). Beide Patienten verblieben
in der Intensivstation und wurden während der gesamten Dauer der
Studie bis zu ihrem Tod (Tag 27) künstlich beatmet. Die anderen
2 Patienten mit später
Todesfolge waren in der hoch dosierten Gruppe (30 μg/kg/h).
Beide Patienten zeigen eine anfängliche
Besserung. Innerhalb von 2 Wochen konnten beide von der künstlichen
Beatmung genommen werden und von der Intensivstation verlegt werden.
Ein Patient verstarb eine Woche später an einer Sepsis, die eine
Atemnot verursachte, nachdem er einen Wunsch auf Nichterfolgen einer
Wiederbelebung geäußert hatte.
Der zweite Patient verstarb am Tag 28 nach einer Lungeninsuffizienz,
die mit einer zweiten Sep sisepisode zusammenhing. Der Patient hatte
ebenfalls einen Nichtwiederbelebungsstatus erbeten und wurde daher
nicht reintubiert. Es sollte erwähnt,
dass die Wiederbehandlung mit r-aPC von Patienten, die eine zweite
schwere Sepsisepisode während
der 28 Tage dauernden Studie entwickeln, nicht unter dem Behandlungsprotokoll
genehmigt wurde.
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Die
Mortalitätsinformation
in dieser Studie ist überraschend
und unerwartet. Keine andere doppelt blinde, Plazebo-kontrollierte
Sepsisstudie hat Daten generiert, die eine solche deutliche Verringerung
der 28 Tage-Mortalität
aller Ursachen zeigen.
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Beispiel 3
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Formulierung von aktiviertem
Protein C
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Es
wird eine stabile lyophilisierte Formulierung von aktiviertem Protein
C durch ein Verfahren hergestellt, das die Lyophilisierung einer
Lösung
umfasst, die etwa 2,5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 15 mg/ml Saccharose,
20 mg/ml NaCl und einen Natriumcitratpuffer mit einem pH von mehr
als 5,5 aber weniger als 6,5 enthält. Zusätzlich umfasst die stabile
lyophilisierte Formulierung von aktiviertem Protein C die Lyophilisierung einer
Lösung,
die 5 mg/ml aktiviertes Protein C, 30 mg/ml Saccharose, 38 mg/ml
NaCl und einen Citratpuffer mit einem pH von mehr als 5,5 aber weniger
als 6,5 enthält.
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Das
Verhältnis
von aPC : Salz : Füllstoff
(G:G:G) ist ein wichtiger Faktor in einer Formulierung, die für den Gefriertrocknungsprozess
geeignet ist. Das Verhältnis
variiert in Abhängigkeit
der Konzentration an Protein C, der Auswahl und Konzentration des
Salzes und der Auswahl und der Konzentration des Füllstoffs.
Insbesondere ist ein Verhältnis
von 1 Teil aktiviertem Protein C zu 7,6 Teilen Salz zu 6 Teilen
Füllstoff
bevorzugt.
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Eine
Einheitsdosierungsformulierung von aktiviertem Protein C, die zur
Verabreichung durch kontinuierliche Infusion geeignet ist, wird
durch Mischen von aktiviertem Protein C, NaCl, Saccharose und Natriumcitratpuffer
hergestellt. Nach dem Mischen werden 4 ml der Lösung in ein Einheitsdosierungsbehältnis überführt und
lyophilisiert. Das Einheitsdosierungsbehältnis, das etwa 5 mg bis 20
mg aktiviertes Protein C enthält
und zur Verabreichung einer Dosis von 0,02 mg/kg/h bis etwa 0,05
mg/kg/h an behandlungsbedürftige
Patienten geeignet ist, wird verschlossen und bis zur Verwendung
gelagert.