CN1276726A - 治疗血凝过快状态或获得性c蛋白不足的方法 - Google Patents

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Abstract

一种治疗具有获得性血凝过快状态或获得性蛋白C不足人类患者的方法,其中的状态与不足是与脓毒症、暴发性紫癜、脑膜炎双球菌脓毒症、骨髓与其它移植、严重烧伤、妊娠、大型手术、严重创伤或ARDS伴随产生的,该方法包括施用活化的蛋白C从而提供一种高度选择性的治疗剂,使出血并发病发生的可能性低。

Description

治疗血凝过快状态或获得性C蛋白不足的方法
本发明涉及医学,尤其是用活化的C蛋白剂治血凝过快状态或获得性C蛋白不足。
C蛋白是一种丝氨酸蛋白酶和自然存在的抗凝剂,其通过失活凝血级联系统中的因子Va和VIIIa而阻止凝血酶产生的能力而在止血调节中发挥作用。人类C蛋白主要在体内肝脏中作为461个氨基酸的单个多肽而得到制备。该前体分子经历多次翻译后修饰,包括1)切割42个氨基酸的信号序列;2)从一条链酶原的位置155蛋白水解去除赖氨酸残基并在位置156去除精氨酸残基从而制备双链形式的分子,(即,通过二硫桥附着到262个氨基酸残基含有丝氨酸蛋白酶重链上的155个氨基酸残基的轻链);3)集中在该轻链头42个氨基酸中的九个谷氨酸残基的维生素K-依赖性羧化作用,得到9个γ-羧基谷氨酸残基;和4)在四个位点的碳水化合物附着(其中一个位于轻链且另三个位于重链上)。该重链含有良好确立的Asp257,His211和Ser360丝氨酸蛋白酶三联体。最后,该循环的双链酶原在钙离子存在下于磷脂表面由凝血酶在体内活化。活化是由于去除该重链N-末端的十二肽,产生具有酶促活性的活化C蛋白(aPC)。
与其它蛋白一起,aPC可能与导致阻止凝血的大多数重要的血液凝固下调因子一样而发挥作用。除了其抗凝血功能外,aPC还通过其抑制细胞因子(例如,TNF和IL-1)的产生而具有抗炎效应并且也发挥促进凝血块裂解的纤溶酶水解特性。因此,C蛋白酶系统代表抗凝、抗炎和纤维蛋白溶解的主要生理机制。
                         脓毒症
脓毒症定义为一种对感染的系统性炎症反应,该反应与许多宿主防御机制包括细胞因子网络、白细胞、和补体及凝血/纤维蛋白溶解系统的活化有关并由此所介导。[Mesters等,血液88:881-886,1996]。在各种器官的微血管中具有广泛血纤蛋白储积的弥漫性血管内凝血[DIC]是脓毒/脓毒性休克的早期表现。DIC是多器官衰竭综合症形成中重要的中间因素并且导致脓毒性休克患者不良的预后。[Fourrier等,Chest101:816-823,1992]。
已经报导了数例用C蛋白在各种脓毒症动物模型中令人鼓舞的临床前研究。Taylor等的狒狒脓毒症模型研究[临床研究杂志79:918-25,1987]使用了来源于血浆的人活化C蛋白。动物进行防御性治疗(即,在灌注LD100大肠杆菌开始前的2小时施以aPC)。5只动物中的5只均存活7天并应是对该实验方法的永久存活者。在接受相同大肠杆菌灌注的对照动物中,5只动物中的5只在24到32小时死亡。有效剂量为7到8mg/kg。
在大鼠的脂多糖(LPS;大肠杆菌)脓毒病模型中[Murakami等,血液87:642-647,1996],由LPS诱导的肺血管损伤受100μg/kg剂量的人血浆来源的活化蛋白C所抑制。此外,在Okamoto等的免连接和穿刺脓毒症模型[胃肠道学106:A747,1994 ]中,显示9小时的12μg/kg/小时剂量的血浆来源的人活化C蛋白在保护动物免受凝血病和器官衰竭中是有效的。由于aPC的种特异性,故在这些动物中获得的结果对于人类的治疗不一定具有预见性。依据选定的动物模型,人类活化C蛋白的有效剂量水平是极其多变且不可预计的。例如,在人类中人活化的C蛋白血清半寿期为30到40分钟,相比之下在狒狒中为8到10分钟且在兔中为90分钟。
近来有许多尝试来治疗人类脓毒症,其中大部分使用阻滞与该疾病病生理学有关的炎症介质的药物。然而,用各种阻滞炎症介质药物的临床研究已是不成功的[综述于Natanson等,国际医学年鉴120:771-783,1994;Gibaldi,药物疗法13:302-308,1993]。由于参与炎症介质中的许多具有补偿反应,且因素具有治疗效应,有些研究人员提出阻滞它们的作用可能是不适当的[例如,Parrillo,N.Engl.J.Med.328:1471-1477,1993]。
最近,已提出阻滞DIC作为脓毒症临床测试中的一个新的靶向[例如,Levi等,JAMA270:975-979,1993]。然而,简单地阻滞脓毒病中的凝血不足可能是不充分的。正如Esmon所综述的,[动脉硬化与凝血12:135-145,1992],数种抗血栓剂在狒狒的脓毒症模型中没有显示出效率,其中包括封闭活性位点的因子Xa[Taylor等,血液78:364-368,1991],蛭素和蛭素类似物(hirulog)[Maraganore,药物发现与设计展望1:461-478,1994]。这些抗血栓剂中的每种能够阻断动物中的消耗性凝血病但不能够提高其存活。此外,日本研究人员[专利申请JP7097335A]提出用血浆来源的活化C蛋白治疗与肝衰竭相伴的有可能形成DIC样综合症的凝血病。
到目前为止,血浆来源的人C蛋白酶原已在25名具有细菌性脓毒症的暴发性紫癜患者处理中用作是进攻性传统治疗中的成功的辅助手段,其中22名患者存活(Gerson等,儿科学91:418-422,1993;Smith等,Thromh.Haemost,PS1709,p419,1997;Rintala等,柳叶刀347:1767,1996;Rivard等,儿科杂志126:646-652,1995)。Gerson等,[1993]描述了一例未能对进攻性传统治疗作出反应的格兰氏阳性菌血病和暴发性紫癜患儿的治疗研究。该患者用血浆来源的人C蛋白酶原加以治疗(280μg/kg大丸剂+40μg/kg/hr灌注),导致凝血病和DIC有关的校正和脓毒性休克有关的暴发性紫癜形成临床迹象的终止。Rintala等,[1996]报导了治疗2名表现出爆发性紫癜的脑膜炎双球菌败血症成年患者。这些患者用血浆来源的C蛋白酶原从每6小时400μg/kg大丸剂治疗8-10天。一名患者死亡且另一名存活下来。Rivard等,[1995]报导了用人C蛋白酶原治疗后同样表现为爆发性紫癜的4名脑膜炎球菌血症患者均存活下来。这些患者用每6小时400μg/kg大丸剂的剂量加以治疗。尽管这些研究的样品量小,但是与表现出爆发性紫癜的脑膜炎球菌血症有关的死亡率高于50%[Powars等,临床传染性疾病17:254-261,1993]。然而,因为这些研究用人类C蛋白酶原进行,所以它们对建立用活化C蛋白治疗的剂量和时间几乎没提供什么提示。
除了脑膜炎球菌血症外,爆发性紫癜和/或DIC也与众多的细菌、病毒或原生动物感染有关,这些感染包括但不限于由立克次体(Rickettsia)所导致的感染(落矶山斑疹热、蜱咬热、斑疹伤寒等)[Graybill等,南部医学杂志,66(4):410-413,1973;Loubser等,热带儿科学年刊13:277-280,1993];由沙门氏菌导致的感染(斑疹伤寒、鼠咬热)[Koul等,血液学报,93:13-19,1995];肺炎球菌所致的感染[Cerpenter等,Scand J Infect Dis,29:479-483,1997];由鼠疫杆菌所致的感染(腹股沟淋巴结炎(Bubonic plague))[Butler等,传染病杂志,129:578-584,1974];由侵肺军团菌(Legionellapneumophila)所致的感染(军团病(Legionaires Disease));Plasmodium falciparum所致的感染(脑型疟)[Lercari等,Journal ofClinical Apheresis,7:93-96,1992];类鼻疽假单胞菌(Burkholderia pseudomallei)所致的感染(类鼻疽);类鼻疽假单胞菌所致的感染(Melioidosis)[Puthucheary等,热带医药与卫生皇家学会会报,86:683-685,1992];链球菌所致的感染(牙原性感染)[Ota,Y.,日本传染病学会会刊,68:157-161];带状疱疹病毒所致的感染[Nguyen等,欧洲儿科学杂志,153:646-649,1994];炭疽杆菌所致的感染(炭疽)[Franz等,美国医学会会刊,278(5):399-411,1997];问号钩端螺旋体所致的感染(钩端螺旋体病)[Hill等,呼吸感染研讨班,12(1):44-49,1997];葡萄球菌所致的感染[Levin,M.,小儿肾病学,8:223-229];埃及嗜血菌所致的感染(巴西紫癜热);奈瑟氏球菌所致的感染(淋球菌血症,脑膜炎球菌血症);和结核分枝杆菌所致的感染(粟粒性结核)。
尽管爆发性紫癜、DIC或脓毒症/脓毒性休克或其它感染中的获得性C蛋白不足状态已如上述进行了详细记录,但几乎没有数据是关于如何用活化的C蛋白治疗这些患者。由于C蛋白生物学作用的物种特异性特性,故用活化的人C蛋白在动物模型中治疗而产生的临床前药理数据确立人的剂量水平是困难的。
                         移植
多种移植有关的血栓栓塞并发症在骨髓移植(BMT)、肝脏、肾脏或其它器官移植后可能会出现[Haire等,JAMA 274:1289-1295,(1995);Harper等,柳叶刀924-927(1988);和Sorensen等,国际医学杂志226:101-105(1989);Gordon等,骨髓移植11:61-65,(1993)]。已报导循环C蛋白水平的下降在BMT后[Bazardachi等,Nouv Rev Fr Hematol 35:135-140(1993);Gordon等,骨髓移植11:61-65(1993)],肾脏移植后[Sorensen等,国际医学杂志226:101-105(1989)]和肝脏移植后[Harper等,柳叶刀924-927(1988)]出现。C蛋白的这种不足促进了血凝过快的状态,从而将病者置于血栓栓塞并发症的风险中。
例如,肝静脉闭塞(VOD)是BMT移植前治疗方案的主要剂量限制性并发症。VOD可能是由于纤维蛋白在血管内的储积而造成肝脏内少部分小静脉丢失的结果。[Faioni等,血液81:3548-3462(1993)]。此外,VOD导致BMT后相当多的发病率和致死率[Collins等,Throm.and Haemo 72:28-33(1994)]。已报导C蛋白水平的下降与VOD峰值发生率同步[Harper等,骨髓移植5:39-42(1990)]并且可能是该疾病发生的促进因子。
BMT后包括肺、中枢神经系统、肝脏或肾脏的器官功能异常是在移植患者中高百分比出现的并发病[Haire等,JAMA 274:1289-1295,(1995)]。BMT中单个器官功能异常是多器官功能异常综合症(MODS)的强烈的先兆,后者又是BMT患者中的主要死亡原因。由于大量凝血系统的活化和纤维蛋白在各种器官微脉管系统中的广泛储积而造成的弥漫性血管内凝血(DIC)是MODS形成中重要的媒介[Fourrier等,Chest 101:816-823(1992)]。因此,经历骨髓移植或其它器官移植患者中C蛋白水平的不足导致血凝过快状态,从而这些患者注定要发生静脉血栓栓塞并发症及器官功能异常。目前存在这样的必要,即测定用活化的C蛋白治疗具有与器官移植有关血凝过快状态的人类患者的方法。
                         烧伤
长时间以来便认识到严重烧伤的患者具有与血凝过快有关的并发症[Curreri等,外科学年刊181:161-163(1974)]。烧伤患者具有超常的体外凝血活性和频繁形成DIC,其特征在于突然出现弥漫性出血;纤维蛋白原、血小板和因子VIII活性的消耗;血管内溶血;继发性纤维蛋白溶解;和活检小血栓的证据[McManis等,创伤杂志13:416-422,(1973)]。最近,有报导C蛋白水平在严重烧伤患者中剧烈下降并且此天然抗凝剂的减少可能导致DIC风险的增加[Lo等,烧伤20:186-187(1994)]。此外,Ueyama等在讨论烧伤早期的DIC发病机理时总结出大批凝血酶的产生和抗凝剂活性的下降可能与烧伤的严重性成比例发生[Ueyama等,Nippon Geka Gakkai Zasshi 92:907-12(1991)]。DIC是一种严重烧伤患者中常见的并发症。
如上所述已记录到严重烧伤患者的C蛋白不足,然而,几乎没有关于是否C蛋白替代治疗将会有效或如何用活化C蛋白治疗这些患者的数据。
                         妊娠
众所周知妊娠导致凝血系统中的多种变化从而可能导致血凝过快状态。例如,在妊娠与产后期间,静脉形成血栓的风险几乎较非妊娠状态高出5倍。此外,凝血因子增加,天然的凝血抑制剂减少,纤维蛋白水解系统出现变化,静脉停滞增加,以及从胎盘分离运送、破腹产术或感染中血管损伤增加[Barbour等,Obstet Gynecol 86:621-633,1995]。
虽然由于在没有任何风险因子的妇女中的这种血凝过快所致的并发症风险小,但是具有血栓栓塞史的妇女在妊娠时复发风险增加。此外,经历过血凝过快状态的妇女,包括最近发现对活化C蛋白具有遗传抗性的血凝过快妇女也具有更高的复发风险[Dahlback,血液85:607-614,1995]。
因此,已提出发现具有抗凝血酶-III、C蛋白或S蛋白不足并具有静脉血栓栓塞史的妇女具有适当的血栓形成复发的风险并且应当考虑进行预防性抗凝治疗[Conrad等,Throm Haemost 63:319-320,1990]。
孕妇中的子痫前期和子痫病似乎是增加了的凝血病病情,其表现为纤维蛋白形成的增加、纤维蛋白水解系统的活化、血小板活化和血小板数目的减少[临床妇产科学35:338-350,1992]。子痫前期被认为是由于胎盘“血管插入”的异常而导致的子宫胎盘局部缺血的结果。子痫前期的后果包括高血压以及导致众多微血栓释放的DIC从而导致胎盘、肾脏、肝脏和大脑损伤[法国妇产科学综述86:158-163,1991]。此外,子痫前期可能导致称为HELLP综合症的严重且威胁生命的疾病,被定义为并发有血小板减少、溶血和打乱肝脏功能的子痫前期[Rathgeber等,Anasth Intensivther Notfallmed 25:206-211,1990]。此外,已记录到与正常妊娠妇女相比,具有严重子痫前期的妊娠妇女中C蛋白水平下降[De Stefano等,Thromb Haemost 74:793-794,1995]。
因此,在孕妇,尤其是具有栓塞史的妇女中出现的静脉栓塞并发症风险是一个主要的考虑。虽然严重的并发症如子痫前期或DIC的可能性相对较低,但是已表明一旦诊断开始有对活化凝血系统抑制时开始DIC的治疗是必需的[Rathgeber等,Anasth Intensivther Notfallmed 25:206-211,1990]。子痫前期或DIC的并发症类似于在脓毒症中出现的情况因为存在血凝过快状态和C蛋白水平的下降。
                         大型手术/创伤
从大型手术或偶发性创伤恢复的患者由于诱导的血凝过快状态而经常遇到血液凝固并发症[Watkins等,Klin Wochenschr 63:1019-1027,1985]。血凝过快状态在手术患者中越来越被看作是静脉血管栓塞的原因[Thomas等,美国外科杂志158:491-494,1989;LeClerc,J.R.,临床应用血栓形成/淤血3(3):153-156,1997]。此外,此血凝过快状态可能导致具有DIC样综合症的并发症,该并发症虽不常遇到但是,确是破坏性的并且当其发生时经常是致命的。[Collins等,美国外科杂志124:375-380,1977]。
此外,经过冠状动脉分流嫁接(CABG)[Menges等,J CerdiothorVasc An.10:482-489,1996]、大型脊柱手术[Mayer等,ClinOrthop245:83-89,1989]、大型腹部手术[Blamey等,ThrombHaemost54:622-625,1985]、下肢大型矫形外科或关节成形手术[LeClerc,1997]或其它类型手术[Thomas等,美国外科杂志158:491-494,1989]的患者偶尔形成静脉血管栓塞并发症。此外,日本研究人员提出用血浆来源的C蛋白以成年人1-10mg/天的剂量,或者优选以2.6mg以1-2次作为大丸剂施用或静脉内灌注来治疗与脊索损伤有关的微血管栓塞[专利申请JP8325161A]。
已表明抗凝剂治疗作为预防大型手术或创伤患者静脉栓塞的预防性治疗是重要的[Thomas等,1989,LeClerc,1997]。例如,许多死于肺部栓塞的患者没有栓塞前的临床表现并且在做出诊断并建立治疗方案前死亡[LeClerc,1997]。现存的预防性方法例如,华法令、低分子量肝素具有不足,如邻近残余的栓塞(residual proximal)或需要频繁调整剂量。
                         ARDS
成年呼吸窘迫综合症[ARDS]特征在于肺部水肿、小血栓、炎症细胞浸润和晚期纤维化。这些多细胞及炎症反应的关键是凝血的活化从而导致血凝过快状态。常见的ARDS-有关的凝血病包括血管内凝血和纤维蛋白水解的抑制。由凝血系统活化和纤维蛋白水解的抑制而形成的纤维蛋白可能导致急性肺部损伤的病理发生。脓毒症、创伤及其它关键疾病是导致ARDS的重要危险因子[Hasegawa等,Chest105(1):268-277,1994]。
ARDS与凝血活化及纤维蛋白水解抑制有关。对于肺血管小栓塞的存在,有众多的类似于DIC中存在的血凝过快的临床证据存在。因此,目前存在一种有效治疗与ARDS有关的该血凝过快的必要。
为了利于文献中陈述的C蛋白剂量水平与专利文本中的剂量水平进行比较,表I列出了在人类或非人类灵长类中的数个研究的标准化剂量水平。这些数据确立了较本发明中提供的剂量水平更高或更低的剂量水平。重要的是,人类研究用血浆来源的C蛋白酶原进行而非人类灵长类研究用重组的人aPC。
                                   表I
参考文献 公开的剂量 标准化剂量+
Taylor等,美国专利No.5,009,839 IV施用2到64μg aPC/kg/分钟;另外可能再施用1到10mg的aPC大丸剂。[5栏,14-19行] 120μg/kg/hr到3800μg/kg/hr灌注8到10个小时
Rivard等,儿科学杂志126:646,1995 IV在急性期期间每6小时的15到20分钟期间以100IU*/kg血浆来源的C蛋白酶原施用且然后每天施用1到2次进行9天。[p.648,1栏,第1段] 在15到20分钟中400μg/kg
Gerson等,儿科学91:418-422,1993 IV以每6小时70IU*/kg血浆来源的C蛋白酶原的大丸剂剂量施用。随后,以10IU/kg/hr连续灌注11天。[p.419,2栏,第一段] 每6小时280μg/kg大丸剂,然后以40μg/kg/hr连续灌注11天
Rintala等,柳叶刀347:1767,1996 IV允许后3小时开始施用并且持续7天。每6小时100IU*/kg血浆来源的C蛋白酶原并且后来调整剂量至血浆C蛋白活性[p.1767,2栏,第二段] 第6和7天400μg/kg大丸剂
Smith等,Thromb.Haem..PS-1709,1997 每名患者具有100IU*/kg血浆来源C蛋白酶原的负荷剂量后继续以5IU/kg灌注。[p.419,1栏,PS-1709] 400μg/kg大丸剂+60μg/kg/hr(没有给出灌注时间)
+标准化剂量是报导的剂量到相当的μg/kg/hr命名的转换。*1IU相当于大约4μg的PC
                                   续表I
参考文献 公开的剂量 标准化剂量
Fujiwara等,日本专利JP7097335A 通常剂量为20-1000 U**血浆来源的APC/kg体重/天,或更为优选50-300U/kg分1-2次施用。作为施用方法,使用静脉内灌注最为合适。[p.9,0016段] 4μg/kg到200μg/kg。灌注时间没有给出
Okajima等,日本专利JP8325161A 对于成年人血浆来源的PC或APC的有效剂量为1-10mg/天,或者优选2-6mg分1-2次施用。作为施用方法,人们可使用大丸剂施用(以单次施用)或静脉内灌注。[p.10,0013段] 42μg/hr到420μg/hr
Okajima等,美国血液学杂志,33:277-278(1990) 施用血浆来源的APC(3mg/天2天,然后以6mg/天进行3天)。[p.278,1栏,第一完整段] 2μg/kg/hr和4μg/kg/hr。
Bang等,美国专利4,775,624 作为负载剂量,活化C蛋白的剂量范围为1-10mg,然后以3-30mg/天的量连续灌注。[19栏,55-59行] 1.8到18μg/kg/hr。灌注时间没有给出。
**1U定义为使正常人血浆中的活化凝血酶原时间(APTT)加倍的量。这换算成大约5单位/μg APC。
然而,尽管这些报导,在患与脓毒症、移植、烧伤、妊娠、大型手术、创伤或ARDS相伴的获得性血凝过快状态或获得性C蛋白不足的人中安全而有效的剂量方案仍然不知道。这些研究没能预示本发明的重组活化C蛋白在治疗人类中血凝过快状态或获得性C蛋白不足中的用途。
本发明公开了aPC在严重脓毒症患者临床试验中的使用。在这些患者中,与安慰剂对照组相比,r-aPC治疗组在器官功能、降低DIC标记和减少致死率方面显示出统计学改进。在严重脓毒症患者中使用的aPC剂量为在48小时灌注中的12、18、24和30μg/kg/hr。在该研究中12和18μg/kg/hr的剂量不是有效的。令人惊奇的是,用于该研究中的24和30μg/kg/hr的剂量有效但与公开的临床前药理学数据相比是相当且出人意料地低效。
此外,本申请人发现在非人灵长类中的临床前毒物学研究表明aPC96小时灌注的安全性局限于大约50μg/kg/hr的上限剂量。这些数据与先有技术相比时也是出乎意料的。实际上,基于先前临床前和临床研究的用于人的r-aPC剂量水平将高于在上述毒物学研究中确立的毒物学范围。
本发明提供了治疗具有获得性血凝过快状态或获得性C蛋白不足人类患者的方法,包括通过连续灌注大约24到144小时而施用至患者大约20μg/kg/hr到50μg/kg/hr的活化的C蛋白。
本发明进一步提供了治疗具有获得性血凝过快状态或获得性C蛋白不足的人类患者的方法,其包括施用至所述患者有效量的活化的C蛋白从而达到2ng/ml到200ng/ml范围的活化的C蛋白血浆水平。
因此,本发明建立了在治疗与人类患者中脓毒症、暴发性紫癜和脑膜炎球菌血症有关的血凝过快状态或C蛋白不足中使用aPC的方法。
本发明建立了用aPC治疗与严重烧伤有关的血凝过快状态或C蛋白不足的方法。
本发明建立了用aPC治疗与骨髓及其它器官移植有关的血凝过快状态或C蛋白不足的方法。
本发明建立了用aPC治疗与经历或从大型手术或严重创伤中恢复人类患者有关的血凝过快状态或C蛋白不足的方法。
本发明建立了用aPC治疗与妊娠期间并发症有关的血凝过快或蛋白C不足的方法。
本发明进一步提供了治疗具有与ARDS有关的获得性血凝过快状态或获得性C蛋白不足的人类患者的方法。
为了本发明的目的,正如在此所公开和要求保护的,以下的术语定义如下。
aPC或活化的C蛋白指重组活化的C蛋白。aPC包括并且优选为人类C蛋白尽管aPC也可包括具有全长C蛋白蛋白水解、酰胺水解、酯水解和生物学(抗凝或纤维蛋白酶原酶解)活性的其它种类或衍生物。C蛋白衍生物的实例由Gerlitz等在美国专利No.5,453,373中和Foster等在美国专利No.5,516,650中描述过,在此引用完整讲义供参考。重组活化的C蛋白可通过在体外活化重组的人C蛋白酶原或通过直接分泌活化形式的C蛋白而加以制备。C蛋白可在细胞、真核细胞、转基因动物或转基因植物中制备,包括,例如,从人类肾293细胞作为酶原分泌后通过技术人员已知的技术加以纯化和活化。
治疗-描述为了抵御疾病、病情或紊乱的目的而管理和照顾患者并且包括预防性施用aPC从而预防该疾病、病情或紊乱的综合症或并发症的出现。或施用aPC从而排除该疾病、病情或紊乱。
连续灌注-基本上不间断地持续导入溶液至静脉中一段具体的时间。
大丸剂注射-以一定的量(称为大丸剂)注射药物达大约120分钟的时间。
适于施用-适于作为治疗剂给药的冻干制剂或溶液。
容器-用于接受指定材料,例如,aPC的容器如小瓶或瓶子。
单位剂量形式-指物理上分离的适用作人类对象的单位剂量的单位、每单位含有计算成产生所需治疗效应的预定量的活性物质与适当的药物赋形剂。
血凝过快状态-与弥漫性血管内凝血、凝血前病情、凝血活化或先天性或获得性凝血因子如aPC不足有关的过度凝血状态。
酶原-这里使用的C蛋白酶原指分泌的无论单链或双链的无活性形式的C蛋白。
青少年-包括但不限于新生儿、婴儿和小于18岁儿童的人类患者。
有效量药物化合物治疗上有效的量。
爆发性紫癜-与细菌脓毒症、病毒、细菌或原生动物感染有关的瘀斑性皮肤损伤、发热、低血压。弥漫性血管内凝血通常出现。
本发明涉及用活化的C蛋白治疗或预防与脓毒症、移植、烧伤、妊娠、大型手术、创伤或ARDS有关的血凝过快状态或获得性C蛋白不足。aPC可用真核细胞系、转基因动物或转基因植物由本领域中众所周知的技术制备。技术人员将容易地理解适当的宿主真核细胞系包括但不限于HEPG-2、LLC-MK2、CHO-K1、293、或AV12细胞,其中的实例由Grinnell在美国专利No.5,681,932中描述过,在此引用供参考。此外,重组蛋白转基因制备的实例由Drohan等在美国专利No.5,589,604和Archibald等,在美国专利No.5,650,503中描述过,在此引用供参考。
为了在本发明方法下完全有活性和可操作,通过这些方法中的任何一个制备的aPC必需经历翻译后修饰如添加9个γ-羧基-谷氨酸(γ-羧化,即Gla内容),添加一个红-β-羟基-Asp(β-羟化),添加四个连接Asn的寡糖(糖基化),去除前导序列(42个氨基酸残基)和去除二肽Lys156-Arg157。没有这种翻译后修饰,aPC没有完全的功能或无功能。
aPC可根据已知的制备药物上有用的组合物方法加以制备。该aPC将通过注射适当剂量大约24到144小时作为持续灌注而肠道外施用从而确保其以有效的形式运送至血流中。施用的aPC量将从大约22μg/kg/hr到40μg/kg/hr。更为优选,该施用的aPC量将从大约22μg/kg/hr到30μg/kg/hr。施用aPC最优选的量将为大约24μg/kg/hr或大约30μg/kg/hr。
作为选择,将通过在大约5分钟到120分钟的时间里每小时注射适当的部分(1/3到1/2)作为大丸剂注射,然后连续灌注适当剂量大约23小时到144小时而施用该aPC,从而得到经24小时到144小时施用的适当剂量。
只有在细心控制的临床研究和彻底的实验研究本申请者才发现持续灌注大约24小时到144小时的大约20μg/kg/hr到50μg/kg/hr的剂量水平得到有效的治疗。待施用的用于治疗这里所述的具有获得性血凝过快状态或获得性C蛋白不足人类患者的最优选aPC剂量水平将是大约24μg/kg/hr。
                         制备1
                      人C蛋白的制备
重组人C蛋白(r-hPC)通过技术人员众所周知的技术如Yan,在美国专利No.4,981,952中(在此引用完整讲义供参考)提出的方法在人类肾293细胞中加以制备。编码人C蛋白的基因公开并被要求权利保护于Bang等,美国专利No.4,775,624中,在此引用完整讲义供参考。用于表达人C蛋白的质粒为Bang等在美国专利No.4,992,373中(在此引用完整讲义供参考)公开的质粒pLPC。质粒pLPC的构建也描述于欧洲专利公开No.0445939以及Grinnell等,1987的生物/技术5:1189-1192中,在此引用讲义供参考。简言之,将质粒转染到293细胞中,然后鉴定出稳定的转化子,传代培养并培养于无血清的培养基中。发酵后,通过微量过滤获得无细胞培养基。
通过对Yan,美国专利No.4,981,952(在此引用讲义供参考)技术的修改从培养液中分离人C蛋白。在其吸附至阴离子交换树脂上之前在EDTA中制备4mM澄清的培养基(Fast-Flow Q,发玛西亚)。以4倍柱床体积的20mM Tris,150mM NaCl,pH7.4及2倍柱床体积的20mM Tris,150mM NaCl,10mM CaCl2,pH7.4洗脱结合的重组人C蛋白酶原。洗脱后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判定该洗脱的蛋白纯度大于95%。
通过在3M NaCl中制备该蛋白后吸附至用20mM Tris,3MNaCl,10mM CaCl2,pH7.4平衡的疏水相互作用树脂(ToyopearlPhenyl 650M,TosoHaas)上而完成对该蛋白的进一步纯化。因2倍柱床体积的无CaCl2的平衡缓冲液清洗后,用20mM pH7.4的Tris洗脱该重组人C蛋白。
为了通过去除残余的钙而活化,制备该洗脱的蛋白。将重组的人C蛋白经过金属亲和柱(Chelex-100,Bio-Rad)以去除钙并再次结合到阴离子交换柱(Fast Flow Q,发玛西亚)上。这两种柱均以系列排列并用20mM Tris、150mM  NaCl、5mM pH6.5的EDTA加以平衡。蛋白上样后,在其从该系列柱上解离前用一倍柱床体积的相同缓冲液清洗Chelex-100柱。在用0.4M NaCl,20mM pH6.5的Tris-乙酸盐洗脱该蛋白前用3倍柱床体积的平衡缓冲液清洗该阴离子交换柱。重组人C蛋白和重组活化C蛋白溶液的蛋白浓度分别通过UV 280nm猝灭E0.1%=1.85或1.95加以测定。
                         制备2
                      重组人C蛋白的活化
在50mM、pH7.5的HEPES存在下于4℃将牛凝血酶偶联至活化的CH-Sepharose 4B(发玛西亚)上。偶联反应用大约5000单位凝血酶/ml树脂在已经包装入柱床中的树脂上进行。在加入MEA至0.6ml/l循环液浓度之前将凝血酶溶液经过柱床循环大约3小时。将含有MEA的溶液再循环10-12小时从而确保完全封闭树脂上未反应的胺。封闭后,用10倍柱床体积的1M NaCl、20mM pH6.5 Tris清洗偶联凝血酶的树脂从而去除所有非特异性结合的蛋白,并且在活化缓冲液中平衡后用于活化反应中。
在EDTA中制备5mM纯化的r-hPC(以螯合任何残余的钙)并用20mM pH7.4的Tris或20mM,pH6.5的Tris-乙酸盐稀释至2mg/ml的浓度。将该物质流经于37℃用50mM NaCl和20mM pH7.4的Tris或20mM pH6.5的Tris-乙酸盐平衡的凝血酶层析柱。调整流速从而使r-hPC与凝血酶树脂之间的接触时间大约为20分钟。收集疏出物并立即分析其酰胺解活性。如果该物质不具有与确立的aPC标准类似的特异性活性(酰胺解),那么在凝血酶柱上重新循环从而活化r-hPC至完成。然后用无论何地pH为7.4或6.0之间(较低的pH对于预防自我降解是优选的)的上述20mM的缓冲液1∶1稀释该物质从而维持该aPC于较低的浓度,同时其等待下一个处理步骤。
通过将该aPC结合到用具有150mM NaCl的活化缓冲液(或者为20mM,pH7.4的Tris或者优选为20mM,pH6.5的Tris-乙酸盐)平衡的阴离子交换树脂(Fast Flow Q,发玛西亚)而完成从aPC物质中去除沥滤的凝血酶。凝血酶流经层析柱并用20mM的平衡缓冲液在2-6倍柱床体积清洗过程中进行洗脱。结合的aPC用5mM pH6.5的Tris-乙酸盐或20mM,pH7.4 Tris中的0.4M NaCl以分级梯度加以洗脱。更高柱床体积清洗层析柱促进更为彻底去除该十二肽。从该层析柱洗脱出的物质或者于冷冻溶液(-20℃)中储存或者作为冻干粉保藏。
通过用Beckman DU-7400二级管点阵分光光度计测定从KabiVitrum购得的合成底物H-D-Phe-Pip-Arg-对硝基酰苯胺中对硝基苯胺的释放而测定aPC的酰胺解活性(AU)。一单位活化的C蛋白定义为用对硝基苯胺的消光系数于450nm的9620 M-1cm-1时于25℃,pH7.4时1分钟中释放1μmol对硝基苯胺所需的酶量。
通过测定活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)中凝血时间的延长而测定活化C蛋白的抗凝活性。在稀释缓冲液(1mg/ml放免分析级BSA,20mM Tris,pH7.4,150mM NaCl,0.02%NaN3)中制备C蛋白浓度为125-1000ng/ml的标准曲线,同时在该浓度范围中的多个稀释水平制备样品。向每个样品池中,加入50μl冷的马血浆和50μl重新调制的活化的部分促凝血酶原激酶时间试剂(APTT试剂,Sigma)并于37℃温育5分钟。温育后,将50μl适当的样品或标准加入每只样品池中。用稀释缓冲液代替样品或标准以测定基底凝血时间。在加入50μl 37℃ 30mM CaCl2至每种样品或标准中时启始纤维计(CoA Screener瘀血分析仪,American Labor)的计时器。根据标准曲线的线性回归方程计算样品中活化的C蛋白浓度。这里报导的凝血时间为三次重复,包括标准曲线样品最小值的平均值。
上面的描述使具有本领域适当技术的人员能够制备aPC并且利用它治疗与但不限于脓毒症、移植、烧伤、妊娠、大型手术/创伤和ARDS有关的血凝过快状态或获得性C蛋白不足。
                         实施例1
                      人aPC的血浆水平
六名患者在24小时中以1mg/m2/小时或大约0.024mg/kg/hr接受aPC的静脉内灌注。施用的aPC为冻干的制剂,其中含有10mg aPC、5mM Tris乙酸盐缓冲液和100mM氯化钠,用2ml水重新调制并调至pH6.5。
用免疫捕捉  酰胺解分析测定血浆的aPC浓度。在柠檬酸盐抗凝剂和苯甲酰胺,一种aPC可逆的抑制剂的存在下收集血液。通过固定于微滴定板上的aPC特异性鼠单克隆抗体,C3,从血浆中捕获了该酶。通过清洗来去除此抑制剂并且用寡肽生色底物测定酰胺解活性或aPC。37℃温育16-20小时后,测定405nm处的吸收并且通过加权的线性曲线-适合代数分析数据。根据0-100ng/ml浓度范围的标准曲线估计aPC浓度。该分析定量的极限为1.0ng/ml。在大约24小时测定aPC剂量水平和血浆浓度。0.024mg/kg/hr的剂量在24小时产生大约50ng/ml的血浆浓度。
                         实施例2
脓毒症1期人类患者中双盲安慰剂对照试验
该方法为严重脓毒症患者中双时相双盲安慰剂对照试验。在1期中,总共72名患者用重组人活化C蛋白(r-aPC)灌注48小时。
记录评价标准包括脓毒病四项常见已接受评价标准(心率、呼吸努力、增加/降低的体温、增加/降低的白细胞数目)中的三项。这些患者同时必须显示出一定程度的定义为休克、下降的尿产量或低氧压的器官功能异常。使用了四种不同的剂量,12、18、24、30μg/kg/hr。通过持续灌注方法灌注r-aPC48小时。该研究的主要终点为:作为剂量功能和剂量时间的安全性,和,作为剂量功能和剂量时间r-aPC校正凝血病的能力。
致死率信息包括所有剂量,甚至是最低的剂量,除非另有说明。重要的是观察到我们的安慰剂致死率与预期的安慰剂致死率一致。在接受安慰剂患者对接受r-aPC患者中,28天所有原因致死率为终点。
整体观察到的安慰剂致死率为38%(10/26)且整体观察到的r-aPC致死率为20%(9/46)。仅包括上限2种剂量r-aPC(24和30μg/kg/hr)对安慰剂患者的亚组具有13%(3/24)的观察到的致死率。
第二个亚组分析包括具有定义为不到60%基线C蛋白活性的获得性C蛋白不足患者。在已知其基线C蛋白活性数据的64名患者中,61名患者或95%患者在登记进入研究时具有获得性C蛋白不足。观察到的C蛋白不足患者的安慰剂致死率为41%(9/22)且观察到的C蛋白不足患者r-aPC致死率为18%(7/39)。
表明用r-aPC低剂量治疗对严重脓毒症患者有利的一条重要信息包括到死亡时安慰剂患者对治疗患者的平均时间。在安慰剂组中死亡的10名患者中,到死亡时的平均时间为6天。在r-aPC治疗的患者中,到死亡时的平均时间为14天。此外,在r-aPC治疗组中死亡的9名患者中的4名存活21天或更长天数并且然后死于与其第一种脓毒症发作无关的发作。四名较晚死亡中有2名发生于低剂量组(12μg/kg/hr)中。这两类患者维持于ICU中并且在整个研究期间机械性吸氧直至死亡(27天)。其它2名较晚期死亡的患者位于高剂量组(30μg/kg/hr)中。这两类患者均显示出最初的改进。在2周内这两类患者均脱离机械吸氧并从ICU中转移出来。要求不活动的“不复苏”(DNR)指令后一名患者一周后死于脓毒症诱导的呼吸窘迫。第二名患者在经历与第二次脓毒症发作有关的肺动脉瓣闭锁不足发作后于28天时死亡。该患者也具有要求的DNR状态且因此没有重新插管。应该注意根据治疗协议用r-aPC再次治疗在28天研究过程中形成第二次严重脓毒症发作的患者没有得到批准。
本研究中的致死率信息是令人吃惊并出乎意料的。没有其它双盲、安慰剂对照脓毒症研究产生显示出在28天所有原因致死率中有如此显著下降的数据。
                         实施例3
                      活化C蛋白制剂
通过下面的方法制备活化C蛋白稳定的冻干制剂,包括冻干含有大约2.5mg/ml活化C蛋白、大约15mg/ml蔗糖、大约20mg/ml NaCl和具有大于5.5但小于6.5pH的柠檬酸钠的溶液。此外,稳定的活化C蛋白冻干制剂包括冻干包括大约5mg/ml活化C蛋白、大约30mg/ml蔗糖、大约38mg/ml NaCl和具有大于5.5但不到6.5pH的柠檬酸钠缓冲液的溶液。
aPC∶盐∶膨胀剂的比例(w∶w∶w)是适用于冷冻干燥方法制备中的重要因素。该比例依据aPC浓度、盐的选择及浓度和膨胀剂的选择及浓度而变化。特别地,大约1部分活化C蛋白对大约7.6部分盐对大约6部分膨胀剂的比例是优选的。
通过混合活化的C蛋白、NaCl、蔗糖和柠檬酸钠缓冲液而制备适用于通过连续灌注施用的活化C蛋白的单位剂量制剂。混合后,将4ml的此溶液转入单位剂量容器中并且冷冻干燥。
将含有大约5mg到大约20mg活化C蛋白、适用于施用大约0.02mg/kg/hr至大约0.05mg/kg/hr的剂量至需要其患者中的剂量单位容器封闭并保存备用。

Claims (17)

1.一种治疗具有获得性血凝过快状态或获得性C蛋白不足人类患者的方法,包括通过连续灌注大约24到大约144小时施用至所述患者大约20μg/kg/hr到大约50μg/kg/hr剂量的人活化C蛋白。
2.根据权利要求1的方法,其中所述的血凝过快状态或C蛋白不足与脓毒症相伴。
3.根据权利要求1的方法,其中所述的血凝过快状态或C蛋白不足与暴发性紫癜相伴。
4.根据权利要求1的方法,其中所述的血凝过快状态或C蛋白不足与脑膜炎球菌血症相伴。
5.根据权利要求4的方法,其中所述的人类患者为青少年。
6.根据权利要求1的方法,其中所述的血凝过快状态或C蛋白不足与烧伤有关。
7.根据权利要求1的方法,其中所述的治疗或预防方法是用于患与骨髓和其它器官移植相伴的静脉血栓栓塞并发症的病人。
8.根据权利要求1的方法,其中所述的治疗或预防方法是用于患与手术或创伤相伴的静脉血栓栓塞并发症的病人。
9.根据权利要求1的方法,其中所述的治疗方法是用于患有妊娠期间并发症相伴的获得性血凝过快状态或C蛋白不足的病人。
10.根据权利要求1的方法,其中所述的血凝过快状态或C蛋白不足与ARDS相伴。
11.根据权利要求1的方法,其中在大丸剂注射人活化C蛋白后接着连续灌注。
12.根据权利要求1的方法,包括通过连续灌注大约36到大约120小时而施用至所述的患者大约20μg/kg/hr到大约50μg/kg/hr剂量的人活化C蛋白。
13.根据权利要求12的方法,包括通过连续灌注大约48到大约96小时而施用至所述患者大约20μg/kg/hr到大约50μg/kg/hr剂量的人活化C蛋白。
14.根据权利要求13的方法,包括施用至所述患者大约22μg/kg/hr到大约30μg/kg/hr的人活化C蛋白。
15.根据权利要求14的方法,包括施用至所述患者大约24μg/kg/hr的人活化C蛋白。
16.治疗具有获得性血凝过快状态或获得性C蛋白不足人类患者的方法,包括通过连续灌注大约24到大约144小时而施用至所述患者有效量的活化C蛋白从而达到2ng/ml到200ng/ml的范围的活化C蛋白血浆水平。
17.通过连续灌注大约24到大约144小时剂量为大约20μg/kg/hr到大约50μg/kg/hr人活化C蛋白而将活化蛋白C用作治疗获得性血凝过快状态或获得性C蛋白不足的药物。
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