PL182868B1

PL182868B1 - Przeciwciała monoklonalne specyficzne dla różnych epitopów ludzkiego gp39 oraz sposoby ich stosowania w diagnozie i terapii

Info

Publication number: PL182868B1
Application number: PL96323565A
Authority: PL
Inventors: Anthony W. Siadak; Diane Hollenbaugh; Lisa K. Gilliland; Marcia L. Gordon; Jurgen Bajorath; Alejandro A. Aruffo; Linda J. Harris
Original assignee: Bristol Myers Squibb
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 2002-03-29
Also published as: CA2210419A1; HUP9802401A3; FI973120A; NZ303375A; EP0807175A2; WO1996023071A3; MX9705610A; EP1728864B1; ES2391101T3; IL116882A; PL323565A1; AU4966996A; EP1728864A1; FI973120A0; AU692074B2; CZ233997A3; IL116882A0; WO1996023071A2; NO973447D0; HUP9802401A2

Abstract

1. Przeciwciala monoklonalne, fragment wiazacy antygen lub ich rekombinowane bialko wiazace, znam ienne tym, ze jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiaze sie ze zmu- towana postacia ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobna zachlannoscia, przy czym mu- tant zawiera tyrozyne 145, asparagine 180 lub fenyloalanine 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alanine, (b) posiada slaba zachlannosc wiazania z mutantem gp39, w porówna- niu z zachlannoscia wiazania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postac gp39 zawie- ra kwas glutaminowy 129, seryne 131 i treonine 135 lub lizyne 143 zam ienione na alanine, i (c) nie reaguje z gp39 w tescie Western blot. 2. Przeciwcialo monoklonalne wedlug zastrz. 1, znam ienne tym , ze przeciwcialo jest wydzielane przez hybrydome 39-1.3 oznaczona ATCC H B11822,39-1.122 oznaczona ATCC HB 11816 lub 39-1.138 oznaczona ATCC HB 11821. 3. Fragment wiazacy antygen wedlug zastrz. 1, znam ienny tym , ze fragment pochodzi od przeciwciala wydzielonego przez hybrydome 39-1.3 oznaczona ATCC HB11822, 39-1.122 oznaczona ATCC HB 11816 lub 39-1.138 oznaczona ATCC HB 11821. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne, fragment wiązący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp391 (a) wiąże się ze zmutowanąpostacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością przy czym mutant zawiera tyrozynę 145, asparagmę 180 lub fenyloalanmę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 1311 treoninę 135 lub lizynę 143 zamienione na alaninę, i (c) me reaguje z gp39 w teście Western biot.

182 868

Przeciwciało monoklonalne według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało jest wydzielane przez hybrydomę 39-1.3 oznaczoną ATCC HB11822, 39-1.122 oznaczoną ATCC HB 11816 lub 39-1.138 oznaczoną ATCC HB 11821. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomę 39-1.3 oznaczoną ATCC HB 11822,39-1.122 oznaczoną ATCC HB 11816 lub 39-1.138 oznaczoną ATCC HB 11821. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, F(ab')₂ lub Fv. Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomę 39-1.3 oznaczoną ATCC HB11822, 39-1.122 oznaczoną ATCC HB 11816 lub 39-1.138 oznaczoną ATCC HB 11821.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, które jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 z nieco zredukowaną zachłannością w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalamnę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135 lub lizynę 143 zamienione na alaninę, i (c) nie reaguje z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-1.59 oznaczoną ATCC HB 11815. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielanego przez hybrydomę 39-1.59 oznaczoną ATCC HB 11815 Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, F^b^ lub Fv. Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że białkiem jest sFv, lub rekombinowane białko obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomę 39-1.59 oznaczoną ATCC HB 11815.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, charakteryzujące się tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 z nieco zredukowaną zachłannością wiązania w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera serynę 131 itreoninę 135, tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp3 9 zawiera kwas glutaminowy 129 lub lizynę 145 zamienione na alaninę, i (c) nie reaguje z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.37 oznaczoną ATCC HB 11813 lub 39-1.132 oznaczoną ATCC HB 11809. Fragment wiążący antygen według wynalazku charakteryzuje się tym, ze fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomy 39-1.37 oznaczoną ATCC HB 11813 lub 39-1.132 oznaczoną ATCC HB 11809. Fragment wiążący antygen według wynalazku charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, F/ab^ lub Fv. Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.37 oznaczoną ATCC HB11813 lub 39-1.132 oznaczoną ATCC HB 11809.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 z nieco zredukowaną zachłannością wiązania w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera serynę 131 i treoninę 135, tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 2011 kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu,

182 868 przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129 lub lizynę 143 zamienione na alaninę, i (c) reaguje z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku charakteryzuje się tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.124 oznaczoną ATCC HB 11819 lub 39-1.156 oznaczoną ATCC HB 11817. Fragment wiążący antygen według wynalazku charakteryzuje się tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomy 39-1.124 oznaczoną ATCC HB 11819 lub 39-1.156 oznaczoną ATCC HB 11817. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, Fiab^ lub Fv. Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, ze białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.24 oznaczoną ATCC HB 11819 lub 39-1.156 oznaczoną ATCC HB 11817.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 z nieco zredukowaną lub podobną zachłannością wiązania w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135, tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, obejmując lizynę 143 zamienionąna alaninę, i (c) nie wiąże z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku charakteryzuje się tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomy 39-1 7 oznaczoną ATCC HB 11812, 39-1.128 oznaczoną ATCC HB 11818 lub 39.1.26 oznaczoną ATCC HB 11820. Fragment wiążący antygen według wynalazku charakteryzuje się tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomy 39-1.7 oznaczoną ATCC HB 11812,39-1.128 oznaczoną ATCC HB 11818 lub 39-1.26 oznaczoną ATCC HB 11820. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, F/ab^ lub Fv Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.7 oznaczoną ATCC HB 11812,39-1.128 oznaczoną ATCC HB 11818 lub o39-1.26 znaczona ATCC HB 11820.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, charakteryzujące się tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp391 gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością wiązania, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 1311 treoninę 135, tyrozynę 145, asparaginę 180 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, obejmując fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę i (c) posiada nieco zredukowaną, zachłanność wiązania, porównując zachłanność wiązania z mutantem gp39, z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera lizynę 143 zamienioną na alaninę, oraz (d) wiąże się z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.77 oznaczoną ATCC HB 11814 lub 39-1.106 oznaczoną ATCC HB 11811 lub39-1.134 oznaczoną ATCC HB 11810. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomy 39-1 77 oznaczoną ATCC HB 11814 lub 39-1.106 oznaczoną ATCC HB 11811 lub 39-1.134 oznaczoną ATCC HB 11810. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, F^b^ lub Fv. Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.77 oznaczoną ATCC HB11814, 39-1.106 oznaczoną ATCC HB 11811 lub 39-1 134 oznaczoną ATCC HB 11810. Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że białkiem jest 106 sFv-Ig, 7 sFv-Ig, humanizowane 106 sFv-Ig lub

182 868 humanizowane 7 sFv-Ig. Rekombmowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, ze białkiem jest humanizowane przeciwciało monoklonalne 106.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombmowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp391 (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością wiązania, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treomnę 135, lizynę 143, tyrozynę 145, lub asparaginę 180 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę i (c) wiąże się z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-1.29 oznaczoną ATCC HB 11808. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomę 39-1.29 oznaczoną ATCC HB 11808. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, F(ab')₂ lub Fv Rekombmowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombmowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, wytworzonego przez hybrydomę 39-1.29 oznaczoną ATCC HB11808.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombmowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135, tyrozynę 145, lub asparagmę 180 zamienione na alaninę, (b) posiada nieco zredukowaną słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z gp39 dzikiego typu, przy czym mutant gp39 zawiera lizynę 143 zamienioną na alaninę, i (c) nie wiąże się z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-7.3E12 oznaczoną ATCC HB 11823. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomę 39-7.3E12 oznaczoną ATCC HB 11823 Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, F(ab9₂ lub Fv. Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała wytworzonego przez hybrydomę 39-7.3E12 oznaczoną ATCC HB11823

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombmowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością przy czym mutant zawiera kwas kwas glutaminowy 129, zamieniony na alaninę, (b) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 z nieco zredukowaną zachłannością w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera serynę 131 i treoninę 135,asparaginę 180, lub fenyloalaninę 2011 kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, i (c) posiada słabą zachłanność wiązania, z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp 39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera lizynę 143 lub tyrozynę 145 zamienione na alaninę, oraz (d) nie reaguje z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, ze przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-5.6E9 oznaczoną ATCC HB 12016. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielanego przez hybrydomę 39-5.6E9 oznaczoną ATCC HB 12016. Fragment wiążący antygen według zastrz. wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, F(ab')₂ lub Fv. Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombmowane białko,

182 868 obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomę 39-5.6E9 oznaczoną ATCC HB 12016.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 z podobną lub nieco nieco zredukowaną zachłannością w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp3 9 zawiera kwas glutamino wy 129, serynę 131 itreoninę 135, lizynę 143, tyrozynę 145, asparaginę 180, lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) reaguje z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-9.246 oznaczoną ATCC HB 12018. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielanego przez hybrydomę 39-9.246 oznaczoną ATCC HB 12018. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, Ffab^ lub Fv. Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomę 39-9.246 oznaczoną ATCC HB 12018

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością, przy czym mutant zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 13 5, tyrozynę 145 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada nieco zredukowaną zachłanność w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera hzynę 143 zamienioną na alaninę, i (c) posiada słabą zachłanność wiązania, z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp 39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać zawiera asparaginę 180 zamienioną na alaninę, oraz (d) nie reaguje z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-9.11 oznaczoną ATCC HB 12019. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielanego przez hybrydomę 39-9.11 oznaczoną ATCC HB 12019. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, F^b^ lub Fv. Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomę 39-9.11 oznaczoną ATCC HB 12019.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością, przy czym mutant zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 1311 treoninę 135, tyrozynę 145 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada nieco zredukowanązachłanność w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera lizynę 143 zamienioną na alaninę, i (c) posiada słabą zachłanność wiązania, z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp 39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać zawiera asparaginę 180 zamienioną na alaninę, oraz (d) nie reaguje z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-9.274 oznaczoną ATCC HB 12017. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielanego przez hybrydomę 39-9.274 oznaczoną ATCC HB 12017. Fragment wiążący antygen według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że fragmentem jest Fab, F^b^ lub Fv.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, charakteryzujące się tym, że przeciwciało jest rea

182 868 ktywne z ludzką gp39, lecz nie jest wysoko reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, przy czym kwas glutaminowy w pozycji 129 jest zamieniony na alaninę. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez wiązanie z gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do rozpoznawania ludzkiej gp39 w teście Western biot.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, charakteryzujące się tym, że przeciwciało jest reaktywne z ludzką gp39, lecz nie jest wysoko reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, przy czym serynę w pozycji 131 i treoninę w pozycji 135 zamieniono na alaninę. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez wiązanie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen z ludzką gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do rozpoznawania ludzkiej gp39 w teście Western biot.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że przeciwciało, fragment wiążący antygen lub rekombinowane białko wiążące jest reaktywne z ludzką gp39, lecz me jest podobnie reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, w którym lizynę w pozycji 143 zamieniono na alaninę. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do wiązania gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążącewedhig wynalazku korzystnie charakteryzujące się tym, ze przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do wiązania gp39 w teście Western biot.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że przeciwciało, fragment wiążący antygen lub rekombinowane białko wiążące jest reaktywne z ludzką gp39, lecz nie jest wysoko reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, w którym tyrozynę w pozycji 145 zamieniono na alaninę. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do wiązania gp39 w teście Western biot.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że przeciwciało, fragment wiążący antygen lub rekombinowane białko wiążące jest reaktywne z ludzką gp39, lecz nie jest podobnie reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, w którym asparaginę w pozycji 180 zamieniono na alaninę. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do wiązania gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez zdolność do wiązania gp39 w teście Western biot.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzujące się tym, że przeciwciało, fragment

182 868 wiążący antygen lub rekombinowane białko wiążące jest reaktywne z ludzką gp39, lecz me jest wysoko reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, przy czym fenyloalaninę w pozycji 2011 kwas glutaminowy w pozycj i202 zamieniono na alaninę Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do wiązania gp39 w teście Western biot. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do wiązania gp39 w teście Western biot.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania zespołu hiper IgM związanego z X obejmujący a) izolację limfocytów z krwi obwodowej, od pacjenta, b) aktywację izolowanych limfocytów z krwi obwodowej, c) utrwalenie i uczynienie przepuszczalnymi izolowanych i aktywowanych limfocytów z krwi obwodowej, d) domieszanie przeciwciała monoklonalnego, fragmentu wiązącego antygen lub ich rekombinowanego fragmentu wiążącego według wynalazku, z aktywowanymi, utrwalonymi i przepuszczalnymi limfocytami z krwi obwodowej, e) wykrycie przeciwciała związanego z komórkami.

Sposób według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowany fragment wiążący sprzęga się z wykrywalnym znacznikiem. Sposób według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że sposób zawiera dalej etap dodania znakowanego wtórnego przeciwciała specyficznego dla pierwszego przeciwciała, fragmentu wiążącego antygen lub ich rekombinowanego fragmentu wiążącego, po etapie (d). Sposób według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że znacznikiem jest fluorofor, izotop radioaktywny, enzym lub chromofor. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku sprzężone z wykrywalnym markerem. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że wykrywalnym markeremjest fluor, izotop radioaktywny, enzym lub chromotor. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzujesiętym, że przeciwciało sprzężonejest ze środkiem terapeutycznym. Przeciwciało monoklonalne, białko wiążące antygen lub rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że środkiem terapeutycznym jest radioozotop, toksyna lub środek chemioterapeutyczny. Rekombinowane białko wiążące według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że rekombinowane białko wiążące zawiera region zmienny zdolny do wiązania z antygenem i toksyna białkową lub środkiem terapeutycznym w postaci białka połączonego.

Przedmiotem wynalazku jest także hybrydoma HB 11808, HB 11809, HB 11810, HB 11811,HB 11812,HB 11813,HB11814,HB 11815,HB 1181.6,HB 11817,HB 11818,HB 11819, HB 11820,HB 11821,HB 11822,HB 11823, HB 12016, HB 12017, HB 12018ΪΗΒ 12019którą zdeponowano w American Type Culture Collection.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowana i oczyszczona sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobuhny, posiadająca sekwencję reszty aminokwasowej zgodnąz Sequence ID# 12. Sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest taka jak Sequence ID# 11.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowana i oczyszczona sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuhny, posiadająca sekwencję reszty aminokwasowej zgodnąz Sequence ID# 14. Sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest taka jak Sequence ID# 13.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowana i oczyszczona sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobuhny, posiadająca sekwencję reszty aminokwasowej zgodnąz Sequence ID# 16. Sekwencja kwasu nukleinowego według

182 868 według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest taka jak Sequence ID# 15.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowana i oczyszczona sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, posiadająca sekwencję reszty aminokwasowej zgodnąz Sequence ID# 18. Sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest taka jak Sequence ID# 17.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, obejmująca przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowany fragment wiążący według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, obejmująca przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowany fragment wiążący według wynalazku sprzężone z wykrywalnym markerem i farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, obejmująca przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowany fragment wiążący według wynalazku sprzężone z wykrywalnym terapeutycznym i farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem

Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny do inhalacji aktywacji komórek B, co w szczególności zapobiega odrzuceniu przeszczepionego narządu, schorzeniom związanym z odrzuceniem przeszczepu, odpowiedzi alergicznej, odpowiedzi zapalnej, lub odpowiedzi autoimmunologicznej takiej jak łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów, układowy liszaj rumieniowaty lub cukrzyca charakteryzujący się tym że jako czynnik aktywny zawiera przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, które jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością, przy czym mutant zawiera tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, a zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135 lub lizynę 143 zamienionąna alaninę, i (c) me reaguje z gp39 w teście Western biot.

Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny do inhibicji wzrostu komórek guza nowotworowego, wykazujących ekspresję antygenu gp39, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik charakteryzujący się, że jako czynnik aktywny zawiera przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, którejest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością, przy czym mutant zawiera tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalamnę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, a zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135 lub lizynę 143 zamienione na alaninę, i (c) nie reaguje z gp39 w teście Western biot, przy czym przeciwciało to jest sprzężone ze środkiem terapeutycznym. Środek według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że środkiem terapeutycznym jest izotop radioaktywny lub toksyna.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób zobrazowania komórek, wykazujących ekspresję gp39 na ich powierzchni u pacjenta, obejmujący: a) podanie pacjentowi kompozycji farmaceutycznej według wynalazku w warunkach, pozwalających na utworzenie kompleksu białko wiążące/antygen na powierzchni komórek, wykazujących ekspresję gp39, oraz b) obecności kompleksu białko wiążące/antygen na powierzchni komórek, co wskazuje się przez obecność wykrywalnego markera.

Streszczenie wynalazku

Wynalazek zapewnia przeciwciała monoklonalne zdolne do wiązania się z co najmniej dwunastoma oddzielnymi epitopami na ludzkiej gp39. Wynalazek zapewnia dalej fragmenty, wiążące się z antygenem i rekombinowane białka wiążące, pochodzące od przeciwciał monoklonalnych według niniejszego wynalazku, które także wiążąsię z gp39. Zapewnia także specyficz

182 868 ne hybrydomy, które wydzielają przeciwciała monoklonalne, wiążące się z dwunastoma epitopami na ujawnionym gp39.

W jednej postaci realizacji niniejszego wynalazku, przeciwciało monoklonalne, fragment, łączący się z antygenem lub jego rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, ze wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością, gdy mutanty gp 39 zawierają alaninę w miejsce tyrozyny 145, asparaginy 180 lub fenyloalamny 201 i kwasu glutaminowego 202, a także posiada słabą zachłanność wiązania w stosunku do zmutowanej postaci gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania w stosunku do gp39 dzikiego typu, gdy mutant zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135 lub lizynę 143 zamienione na alaninę; i dalej, nie reaguje z gp39 w teście Western biot. Specyficznymi przykładami przeciwciał monoklonalnych, posiadających te cechy są wydzielane przez hybrydomy takie jak 39-1.3 oznaczone ATCC HB 11822, 39-1,122 oznaczone ATCC HB 11816 lub 39-1,138 oznaczone ATCC HB 11821.

W drugiej postaci realizacji, przeciwciało monoklonalne, fragment łączący się z antygenem lub jego rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, że wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiego gp39 z nieco zredukowaną zachłannością w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu gdy postać zmutowana gp39 zawiera tyrozynę 145, asparagmę 180 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, i dalej posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 1311 treomnę 135 lub lizynę 143 zamienione na alaninę, a także nie reaguje z gp39 w teście Western biot Specyficznym przykładem przeciwciała monoklonalnego, posiadającym te cechy jest wydzielane przez hybrydomę 39-1.59 oznaczone ATCC HB 11815.

W trzeciej postaci realizacji niniejszego wynalazku, przeciwciało monoklonalne, fragment łączący się z antygenem lub ich rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, ze wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkich gp39 z nieco zredukowaną zachłannością wiązania w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, gdy mutant gp39 zawiera serynę 131 i treoninę 135, tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę Przeciwciało monoklonalne charakteryzuje się dalej tym, że posiada słabą zachłanność wiązania ze zmutowanągp39 w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, gdy mutant zawiera kwas glutaminowy 129, lub lizynę 145, zamienione na alaninę Dalej przeciwciało nie reaguje z gp39 w teście Western biot. Specyficznymi przykładami przeciwciał monoklonalnych, posiadających te cechy są wydzielane przez hybrydomy 39-1.37 oznaczone ATCC HB 11813 lub 39-1.132 oznaczone ATCC HB 11809.

W innej postaci realizacji niniejszego wynalazku, przeciwciało monoklonalne, fragment łączący się z antygenem lub jego rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, że wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkich gp39 z nieco zredukowaną zachłannością wiązania w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, gdy postać zmutowana gp39 zawiera serynę 131 itreoninę 135,tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę; i dalej posiada słabą zachłanność wiązania ze zmutowaną gp3 9 w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, gdy zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, lub lizynę 143, zamienione na alaninę. Przeciwciała z tej grupy reagują z gp39 w teście Western biot. Specyficznymi przykładami przeciwciał monoklonalnych, posiadających te cechy są wydzielane przez hybrydomy 39-1.24 oznaczone HB ATCC HB 11819 139-1.156 oznaczoną ATCC HB 11817.

W dalszej postaci realizacji niniejszego wynalazku, przeciwciało monoklonalne, fragment łączący się z antygenem lub ich rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, że wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkich gp39 z nieco zredukowaną lub podobną zachłannością wiązania w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, gdy postać zmutowana gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135, tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę; i dalej posiada słabą zachłanność wiązania ze zmutowaną gp39 zawierającą lizynę 143, zamienioną na alaninę, w po20

182 868 równaniu z gp39 dzikiego typu. Przeciwciało charakteryzuje się dalej niemożnością wiązania z gp39 w teście Western biot. Specyficznymi przykładami przeciwciał monoklonalnych, posiadających te cechy sąwydzielane przez hybrydomy 39-1.7 oznaczone 11812,39-1.128 oznaczone ATCC HB 11818 i 39-1.26 oznaczone ATCC HB 11820.

W jeszcze innej postaci realizacji niniejszego wynalazku, przeciwciało monoklonalne, fragment łączący się z antygenem lub jego rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, że wiąże się ono ze zmutowaną postacią ludzkiego gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością wiązania, gdy mutant zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135, tyrozynę 145, lub asparaginę 180 zamienione na alaninę. Przeciwciało charakteryzuje się dalej posiadaniem słabej zachłanności wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, gdy postać zmutowana zawiera fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę i posiada nieco zredukowaną, zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, gdy postać zmutowana zawiera lizynę 143 zamienioną na alaninę. Przeciwciało monoklonalne wiąże się także z gp39 w teście Western biot. Specyficznymi przykładami przeciwciał monoklonalnych, posiadających te cechy są wydzielane przez hybrydomy 39-1.77 oznaczone ATCC HB 11814 i 39-1.106 oznaczone ATCC HB 11811 i 39-1.134 oznaczone ATCC HB 11810.

W dalszej postaci realizacji niniejszego wynalazku, przeciwciało monoklonalne, fragment łączący się z antygenem lub ich rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, że wiąże się ono ze zmutowaną postacią ludzkiego gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością wiązania, gdy mutanty gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135, lizynę 143, tyrozynę 145, asparaginę 180 zamienione na alaninę i posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39 w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, gdy postać zmutowana gp39 zawiera fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamieniony na alaninę. Przeciwciało charakteryzuje się dalej jego zdolnością do wiązania z gp39 w teście Western biot. Specyficznym przykładem przeciwciała monoklonalnego, posiadającego te cechy jest przeciwciało monoklonalne wydzielane przez hybrydomy 39-1,29 oznaczone ATCC HB 11808.

W innej postaci realizacji niniejszego wynalazku, przeciwciało monoklonalne, fragment łączący się z antygenem lub jego rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, że wiąże się ono ze zmutowanąpostacią ludzkiego gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością wiązania, gdy zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 1311 treoninę 135, tyrozynę 145, lub asparaginę 180 zamienione na alaninę. Przeciwciało charakteryzuje się posiadaniem nieco zredukowanej zachłanności wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, gdy mutant zawiera lizynę 143 zamieniona na alaninę, a także nie wiąże się z gp39 w teście Western biot. Specyficznym przykładem przeciwciała monoklonalnego, posiadającego te cechy jest przeciwciało monoklonalne wydzielane przez hybrydomę 39-7.3E12 oznaczone HB 11823.

W jeszcze innej postaci realizacji niniejszego wynalazku, przeciwciało monoklonalne, fragment łączący się z antygenem lub jego rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, że wiąże się ono ze zmutowanąpostacią ludzkiego gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością wiązania, gdy postać zmutowana gp39 zawiera kwas glutaminowy 129 zamieniony na alaninę. Przeciwciało charakteryzuje się również posiadaniem nieco zredukowanej zachłanności wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z gp39 dzikiego typu, gdy postać zmutowana zawiera serynę 1311 treoninę 135, asparaginę 180, lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę oraz posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39 w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, gdy postać zmutowana gp39 zawiera lizynę 143 lub tyrozynę 145 zamienioną na alaninę. Przeciwciało jest także niezdolne do wiązania z gp39 w teście Western biot. Specyficznym przykładem przeciwciała monoklonalnego, posiadającego te cechy jest przeciwciało monoklonalne 39-5.6E9 oznaczone ATCC HB.

W dalszej postaci realizacji przeciwciało monoklonalne, fragment łączący się z antygenem lub jego rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, że wiąże się ono ze zmutowaną postacią ludzkiego gp39 i gp39 dzikiego typu z nieco zredukowaną lub podobną

182 868 zachłannością wiązania, gdy postać zmutowana gp3 9 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131i treoninę 135, lizynę 143, tyrozynę 145, asparginę 180, lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę. Przeciwciało charakteryzuje się wiązaniem z gp39 w teście Western biot. Specyficznym przykładem przeciwciała monoklonalnego, posiadającego te cechy jest przeciwciało monoklonalne wydzielane przez hybrydomę 39-9.246 oznaczone ATCC HB___

W jeszcze dalszej postaci realizacji niniejszego wynalazku, przeciwciało monoklonalne, fragment łączący się z antygenem lub jego rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, że wiąże się ono ze zmutowaną postacią ludzkiego gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannościąwiązania, gdy postać zmutowana gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131i treoninę 135, tyrozynę 145 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę Przeciwciało, fragment, łączący się z antygenem lub jego rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się również posiadaniem nieco zredukowanej zachłanności wiązania z mutantem gp39 w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, gdy mutant zawiera lizynę 143 zamienioną na alaninę oraz posiadaniem słabej zachłanności wiązania, gdy mutant gp39 zawiera asparaginę 180 zamienioną na alaninę. Przeciwciało charakteryzuje się także niezdolnością wiązania z gp39 w teście Western biot. Specyficznym przykładem przeciwciała monoklonalnego, posiadającego te cechy jest przeciwciało monoklonalne wydzielane przez hybrydomę 39-9.11 oznaczone ATCC HB.

W jeszcze dalszej postaci realizacji niniejszego wynalazku, przeciwciało monoklonalne, fragment, łączący się z antygenem lub jego rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, że wiąże się ono ze zmutowaną postacią ludzkiego gp39 i gp39 dzikiego typu, z podobną zachłannościąwiązania, gdy postać zmutowana gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131i treoninę 135, tyrozynę 145, lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę. Przeciwciało charakteryzuje się także zdolnością wiązania z gp39 w teście Western biot. Specyficznym przykładem przeciwciała monoklonalnego, posiadającego te cechy jest przeciwciało monoklonalne wydzielane przez hybrydomę 39-9.274 oznaczone ATCC HB__.

W jeszcze dalszej postaci realizacji mniejszego wynalazku, przeciwciało monoklonalne, fragment, łączący się z antygenem lub jego rekombinowane białko wiążące, charakteryzuje się tym, że nie jest wysoko reaktywne ze zmutowaną ludzką gp3 9 gdy mutant zawiera kwas gluatminowy w pozycji 129, serynę w pozycji 131 i treoninę w pozycji 135, tyrozynę w pozycji 145 lub fenyloalaninę 2011 kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę. Albo, przeciwciało monoklonalne charakteryzuje się tym, że nie jest podobnie reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, gdy mutant zawiera asparaginę w pozycji 180 lub lizynę w pozycji 143 zamienione na alaninę. Przeciwciała te mogą także charakteryzować się ich wiązaniem lub brakiem wiązania z gp39 w teście Western biot.

Każda z grup przeciwciał monoklonalnych rozpoznaje epitopy gp391 może być manipulowana albo chemicznie albo metodami rekombinacyjnymi, żeby wytworzyć albo fragmenty wiążące antygen albo rekombinowane białka wiążące. Przykładami fragmnetów wiążących antygen sąFab, (Fab')₂ lub Fv tworzone przez trawienie enzymem całego przeciwciała. Rekombinacyjne białka wiążące według niniejszego wynalazku obejmują każdą cząsteczkę, która utrzymuje specyficzność antygenową przeciwciała pierwotnego i została rekombinowana z innymi pozostałymi sekwencjami aminokwasowymi. Przykłady obejmują przeciwciała chimeryczne, sFvs, przeciwciała humanizowane i cząsteczki połączone.

W jeszcze innej postaci realizacji niniejszego wynalazku przeciwciała monoklonalne lub rekombinowane białka wiążące można sprzęgać z możliwym do wykrycia markerem lub środkiem terapeutycznym. Przykłady wykrywalnych markerów obejmują fluorofory, izotopy radioaktywne, enzymy lub chromofory. Środki terapeutyczne brane pod uwagę w niniejszym wynalazku mogą obejmować radioizotopy, toksynę, lub środek chemioterapeutyczny, taki jak lek cytotoksyczny W dodatku do technik sprzęgania, rekombinowane białka wiążące według niniejszego wynalazku można konstruować do postaci białek połączonych, które zawierają region

182 868 zmienny, pochodzący od przeciwciała monoklonalnego według niniejszego wynalazku i enzym, toksynę białkową lub białkopodobny środek terapeutyczny.

W jeszcze innej postaci realizacji niniejszego wynalazku ujawnia się sposób detekcji zespołu hiper IgM związanego z X. Sposób obejmuje etapy izolacji limfocytów z krwi obwodowej od pacjenta podejrzanego o posiadanie symptomów, towarzyszących zespołowi, aktywacji limfocytów z krwi obwodowej, utrwalenia i uczynienia przepuszczalnymi izolowanych i aktywowanych limfocytów z krwi obwodowej, domieszania opisanego przeciwciała monoklonalnego do aktywowanych, utrwalonych i przepuszczalnych limfocytów z krwi obwodowej, oraz wykrycia przeciwciała związanego z komórką. Przeciwciało można znakować możliwym do wykrycia markerem lub można me znakować. Gdy stosuje się nieznakowane, przed etapem detekcji przeprowadza się dalszy etap dodania drugorzędowego przeciwciała (które jest znakowane) specyficznego dla pierwszego przeciwciała. Wykrywalnym markerem może być np. fluorofor, izotop radioaktywny, enzym lub chromofor.

Dalej, niniejszy wynalazek dostarcza hybrydom, które wydzielają specyficzne przeciwciała, reaktywne wobec każdego z epitopów opisanych w niniejszym wynalazku. Każdą z tych hybrydom złożono w American Type Culture Colletion, 12301 Parklawn Dnve, Rockville, MD 20852, 20 stycznia 1995 na warunkach umowy z Budapesztu.

W jeszcze innej postaci realizacji niniejszego wynalazku, opisuje się w niniejszym wynalazku izolowane i oczyszczone sekwencje kwasu nukleinowego, która koduje sekwencje aminokwasowe ciężkiego i lekkiego łańcucha immunoglobuliny w cząsteczkach immunoglobuhny, rozpoznającej epitopy ludzkiej gp39. W szczególności, sekwencja kwasu nukleinowego koduje sekwencję aminokwasową regionu zmiennego lekkiego łańcucha immunoglobuliny przedstawiona w sekwencji ID# 12 i w sekwencji ID# 16. Ujawnia się także specyficzne sekwencje nukleotydowe, które kodują te sekwencje aminokwasowe. Są one przedstawione w sekwencji ID # 11115. Dostarcza się także sekwencji kwasu nukleinowego, które kodująregiony zmienne ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, posiadające sekwencję reszty aminokwasowej przedstawionej w sekwencji ID# 14 i sekwencji ID# 18. Poszczególnych sekwencji nukleotydowych, które kodują sekwencje reszt aminokwasowych dostarcza się w sekwencji ID# 15 i sekwencji ID# 17.

Niniejszy wynalazek dostarcza także kompozycji farmaceutycznych, zawierających przeciwciała monoklonalne, fragmenty wiążące antygen lub ich rekombinowane białka wiążące opisane tutaj, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Kompozycje te mogą obejmować przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub rekombinowane białko wiążące sprzężone z wykrywalnym markerem lub środkiem terapeutycznym.

Dostarcza się także sposobów stosowania tych kompozycji farmaceutycznych, w celu zahamowania odpowiedzi przeciwciała na antygen zależny od komórki T u zwierzęcia, przez podawanie skutecznej ilości jednej z kompozycji opisanych powyżej. Zwierzę któremu podaje się kompozycję może obejmować małpy i ludzi. Inhibicja odpowiedzi przeciwciała na antygen zależny od komórki T, może zapobiec odpowiedzi autoodpomościowej, odrzuceniu przeszczepionego narządu, chorobie wiązanej z odrzuceniem przeszczepu przez gospodarza, odpowiedzi alergicznej lub odpowiedzi zapalnej. Schorzeniami autoimmunologicznymi, którym można zapobiec przy użyciu tego sposobu, może obejmować między innymi łuszczycę, reumatoidalne zapalenie stawów, układowy liszaj rumieniowaty lub cukrzycę.

Dalej, niniejszy wynalazek dostarcza sposobów zobrazowania komórek, na których powierzchni zachodzi ekspresja gp39, obejmujących podawanie pacjentowi kompozycji farmaceutycznej, zawierającej przeciwciało monoklonalne opisane powyżej, sprzężone z wykrywalnym markerem w warunkach, pozwalających na tworzenie kompleksu przeciwciało/antygen na powierzchni komórek, w których zachodzi ekspresja gp39, oraz wykrywanie obecności kompleksu przeciwciało/antygen, co wskazuje się przez obecność wykrywalnych markerów.

Opis rysunków

Figury 1A do D ukazująprzłączanie mysich przeciwciał monoklonalnych 7 (39-1.7) 1106 (39 1-106) przeciwciał ludzkichgp39, do aktywowanych ludzkich i makakowych limfocytów T.

182 868

Rozetę E pozytywnych limfocytów T oddzielono od komórek jednojądrzastych z krwi obwodowej, aktywowano PMA i jonomycyną przez sześć godzin i następnie inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi 7 i 106 przeciw ludzkich gp39, lub z negatywnym przeciwciałem kontrolnym. Następnie komórki inkubowano z poliklonalną surowicą odpornościową zawierającąFITC kozy przeciw mysim IgG, a potem z mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciw ludzkiej CD4 znakowanym fikoerytryną. Komórki bramkowano pod względem komórek CD4⁺1 następnie analizowano pod względem barwienia anty-gp39, przy użyciu FACScan. Fig 1A11B ludzkie limfocyty T. Fig. 1C i ID limfocyty T makaka.

Figury 2A do 2C ukazują inhibicję ludzkiego CD40-Ig wiążącego aktywowanie ludzkie i makakowe limfocyty T, przez mysie przeciwciała monoklonalne 7 i 106, przeciw ludzkiej gp39 Rozetę E pozytywnych limfocytów T izolowano przez komórki jednojądrzaste z krwi obwodowej i stymulowano PMA i jonomycynąprzez 6 godzin. Aktywowane limfocyty T inkubowano z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi 7 (39-1.7) lub 106 (39-1.106) anty ludzkiej gp39, o stężeniu 5pg/ml, po czym inkubowano z ludzkim CD40-Ig (20 pg/ml). Po inkubacji komórki barwiono przy użyciu koziej IgG przeciw ludzkiej, znakowanej fikoerytryną i analizowano na FACScan. Figura 2A ludzkie limfocyty T i przeciwciało monoklonalne 7. Fig. 2B ludzkie limfocyty T i przeciwciało monoklonalne 106. Fig. 2C limfocyty T makaka i przeciwciało monoklonalne 7. Fig. 2D limfocyty T makaka i przeciwciało monoklonalne 106.

Figura 3 ukazuje zdolność mysich przeciwciał monoklonalnych 7 i 106 przeciw ludzkiej gp39, do inhibicji wytwarzania IgG i IgM przez limfocyty B makaka, stymulowane przez aktywowane limfocyty T makaka.

Figury 4A i 4B ukazują zdolność białek wiążących gp39 do supresji odpowiedzi immunologicznej u makaków na owcze krwinki czerwone. Surowicę zbierano przez tydzień i (fig 4A) miana IgM anty-SRBC i (fig. 4B) miana IgG antySRBC oceniono przez test ELISA. Wartości przedstawiają średnią + SEM dla 4 małp na grupę. Strzałka wskazuje czas wtórnej immumzacji. Wartość przytoczona jest mianem jakie określono przez rozcieńczenie surowicy, wykazującej wartości absorbancji pięć razy wartość tła, gdzie tło określono jako pomiar absorbancji zapisany przy nieobecności surowicy.

Figura 5 ukazuje zdolność makaków traktowanych białkami wiążącymi gp39, do wytworzenia odpowiedzi IgG na KLH. Miana specyficznego małpiego przeciwciała w surowicy określono przez ELISA. Wyniki są przeciętną od wszystkich małp w każdej grupie. Wartość przytoczona jest mianem jakie określono przez rozcieńczenie surowicy, wykazującej wartości absorbancji pięć razy wartości tła, gdzie tło określono jako pomiar absorbancji zapisany przy nieobecności surowicy. '

Figura 6 stanowi sekwencję nukleotydowądla 106 VL (seq.ID# 11) i wyprowadzoną sekwencję ammokwasową(seq. ID# 12). Fig. IB stanowi sekwencje nukleotydowądla 106 VH (seq ID# 13) i wyprowadzonąsekwencję aminokwasową(seq. ID# 14). Sekwencja hderajest cyrkulizowana i regiony określające komplementamość pokazano w ramkach. VL jest członkiem mysiej podrodziny kappa V, a segment genu V został ponownie uporządkowany z Jk5 (fig 6A, podkreślone). VH jest członkiem mysiej podgrupy III(D). Łańcuch ciężki genu V został ponownie uporządkowany z JH2 (fig. 6B, podkreślone).

Figura 7 stanowi sekwencję nukleotydowądla 7 VL (seq. ID# 15) i wyprowadzoną sekwencję aminokwasową (seq. ID# 16). Fig. 2B stanowi sekwencję nukleotydowądla 7 VH (seq ID# 17) i wyprowadzonąsekwencję aminokwasową (seq. ID# 18). Sekwencja hderajest cyrkuhzowana i regiony określające komplementamość pokazano w ramkach. VL jest członkiem mysiej podrodziny kappa Π, a segment genu V został ponownie uporządkowany z Jk4 (fig.7A, podkreślone). VH jest członkiem mysiej podgrupy II(A). Łańcuch ciężki genu V został ponownie uporządkowany z JH2 (fig. 7B, podkreślone).

Figury 8A i 8B ukazują miano supematantów komórek transfekcyjnych 106 sFv-Ig i 7 sFv-Ig COS, wiążących się z unieczynnioną ludzką gp39. Płytki 96-studzienkowe z płaskim spodem powleczone białkami połączonymi anty-mysimi Lyt-2a i Lyt-2A-gp39, użyto do przesiewu supematantów komórek COS pod względem funkcjonalnych anty-gp39 10617 sFv-IG. Pokaza

182 868 no dwukrotne rozcieńczenie reprezentatywnego klonu dla każdego sFv-Ig. Podczas gdy sztuczny supematant transfekcyjny (do komórek COS nie dodano DNA) wykazuje brak aktywności, 106 sFv-Ig i 7 sFv i -Ig przyłączony do unieczynnionej gp39 przy rozcieńczeniu ponad 1:100 (dla 106 sFv-Ig, wiązanie mogło być wykryte przy rozcieńczeniu poniżej 1:1000 supematantu transfekcyjnego). W porównaniu, sFv anty-mysiej gp39 (MR1 sFv-Ig) nie przyłączał ludzkiej gp39, mimo, że przyłącza się dobrze do płytek powleczonych białkami połączonymi anty-mysimi Lyt2a i mysimi Lyt-2A-gp39. 106 sFv-Ig i 7 sFv-Ig wykazały małą lub brak reaktywności na płytkach powleczonych białkami połączonymi ant-mysimi Lyt-2a-gp39.

Figury 9A i 9B ukazują porównawcze przyłączenie biwalentnego przeciwciała monoklonalnego 106 i 106 sFv-Ig do komórek Jurkat, z natury wykazujących ekspresję gp39. Jodowany biwalentny 106 mAb porównano z jodowanym 106 sFv-Ig, wiążącym gp39, której ekspresja zachodzi na komórkach Jurkat BMS-10. Wyliczone zachłanności wynosiły Kd = 4x 10 ’¹⁰ ± 6 x 10’ dla biwalentnego 106 mAb (fig. 9A)iKd= 1,6 x 10'⁹±3,3 x 10¹⁰dla 106 sFv-Ig (fig. 9B). Transformacja scatchard wykazała, że zarówno biwalentny 106 mAb jak i 106 sFv-Ig przyłączyły w przybliżeniu 10 000 miejsc na komórkę (fig. (9A i 9B).

Figura 10 przedstawia matrycę humanizacji 106 VL. Oryginalną sekwencję mysią pokazano w czwartym rzędzie (ml06, seq. ID# 27) z sekwencjąmysiej linii zarodkowej pod spodem. Wybraną ludzką sekwencję matrycy pokazano w drugim rzędzie (ludzka matryca, seq.. ID# 29) z jej ludzkąsekwencjąkonsensusu powyżej. Sekwencję humanizowaną 106 VL (hl06, seq.. ID# 28) pokazano między ludzką matrycą a mysią sekwencją 106 VL. Składa się ona zasadniczo z ludzkich reszt zrębowych i mysich reszt hiperzmiennych. Regiony hiperzmienne, jak określono przez Kabata i in., (Seguences of Proteins of immunological Interest. wyd. 4, US Health and Humań Services, Waszyngton D.C. (1987) pokazano zakreślone podwójnąhnią Pętle LI, L2 i L3 zakreślono limą pojedynczą a determinanty strukturalne, określone przez Chothia, zaznaczono gwiazdkami (Chothia i Lesk, 1987) J.Mol.Biol.196, 901). Reszty ludzkie lub mysie różniące się od humanizowanych 106 VL, podkreślono podwójnie. Ludzki Jk wybrano na podstawie homologn do 106 Jk. Figura 11 przedstawia matrycę humanizacji 106 VH. Oryginalną mysią sekwencją pokazano w czwartym rzędzie (ml 06, seq.. ID# 30) z najbliższą sekwencją pod spodem (odpowiednia sekwencja linii zarodkowej, posiadająca tylko trzy reszty w pętli H2 była niedostępna; zamiast niej wybrano sekwencję powtórnie uszeregowaną która posiadała ogólną wysoką homologię do 106 VH i także posiadała pętlę H2 o trzech resztach).

Wybraną ludzką sekwencję matrycy pokazano w drugim rzędzie (ludzka matryca, seq.. ID# 32) zjej ludzką sekwencją konsensusu powyżej (ludzka VHIII/JH4 konsensus). Humanizowaną sekwencję 106 VH (hl06, seq. ID# 31) pokazano między ludzką matrycą i mysią sekwencją 106 VH. Składa się ona zasadniczo z ludzkich reszt zrębowych i mysich reszt hiperzmiennych (zakreślone podwójną linią). Pętle Η1, H2 i H3 zakreślono liniąpojedynczą a determinanty strukturalne, określone przez Chothia (jak wyżej), zaznaczono gwiazdkami. Reszty ludzkie lub mysie różniące się od humanizowanych 106 VH, podkreślono podwójnie. Ludzki JH wybrano na podstawie homologii do 106 JH.

Figura 12 przedstawia montowanie ośmiu humanizowanych 106 VH. Dwa fragmenty DNA namnożono drogą PCR z pierwszych 149 zasad mysiej 106 VH, przy użyciu pnmerów sensownych, kodujących Hindlll tuż przed sekwencją 106 VH, zawierającą zmiany trzech (106 vh T-59 lub czterech (106 yhA-S') reszt mysich na reszty ludzkie, i primera antysensownego, kodujący unikatowe miejsca restrykcji (Nhel, EcoRI, Pstl orazXbaI). Fragmenty te trawiono za pomocą Hindlll i Xbal i poddano ligacji do pUC19, tworząc dwa wektory 106 vhA-NEP i 106 vhT-NEP. Trzy pary syntetyzowanych ohgonukleotydów kodowały zmiany przy jednej lub dwóch pozycjach (106 vh SY, 106 vh DY, 106 vh SS) podczas gdy 106 vh DS zachowała oryginalną sekwencję mysią przy resztach 55 i 56. Wszystkie cztery pary kodowały także dodatkowe reszty humanizowane Ile57, Ala60, Lys641 Lys75, których nie zilustrowano dla uproszczenia. W dodatku, zmontowano je z nawiasami (O/H) Nhel i Pstl i unikatowym miejscem Xhol do trawienia diagnostycznego. Fragmenty DNA stworzone przez oligonukleotydy poddano ligacji do

182 868 wektorów vhal06vhA-NEP i 106 vhT-NEP w miejscachNhdi Pstl. Wytworzono końcowy fragment PCR, przy użyciu startera sensownego 106 vh Pst5' i startera antysensownego 106 vh Xba3', stosując mysią 106 VH jako matrycę. Te dwa oligonukleotydy kodowały o cztery więcej zmian, z sekwencji mysiej do ludzkiej. Fragment DNA klonowano do poprzedniej konstrukcji, przy użyciu miejsc restrykcji Pstl i Xbal.

Figura 13 przedstawia inhibicję ekspresji selektyny E na komórkach śródbłonkowych. Czarne słupki pokazują poziomy ekspresji selektyny E. Podczas gdy mysi 106 sFv-Ig wykazuje silną inhibicję, negatywna próba kontrolna L6 sFv-Ig wykazuje brak inhibicji. HuVL/106 vhADY („ADY”), huVL/106vhA-SY (”ASY”) i huVL/106 vhT-DS („TDS”) powoduje inhibitację ekspresji selektyny E, chociaż me tak skutecznie jak mysi 106 sFv-Ig. Supematanty z transfekcjami hu VL/106vhT-SY („TSY”; brak białka) i huVL/106vhT-SS („TSS”; białko aberacyjne), nie wykazały żadnej aktywności.

Figura 14 przedstawia analizę Biacore™ humanizowanych białek 106 sFv-Ig, wiążących się z ludzka gp39. Ludzkągp39 powleczono na płytkach i testowano pod względem wiązania różne humanizowane supematanty transfekcyjne 106 sFv-Ig. Oryginalny mysi 106 sFv-Ig wiązał się bardzo mocno (nie obserwowano wartości spoza zakresu, jak ukazano prze Imię poziomą) Białka z supematantów transfekcyjnych HuVL/106 vhA-DY („ADY 12-3”), huVL/106 vhA-SY (,,ASY21 -7”) i hu VL/106 vhT-DS („TDS46-17”) także wiązały się mocno przy braku wykrywalnych wartości spoza zakresu. Supematanty z transfekcji hu VL/106vhT-SY („TSY26-9”; brak białka) i huVL/106vhT-SS („TSS36-13”; białko aberacyjne) nie wiązały się z płytkami powleczonymi gp39.

Figura 15 stanowi przedstawienie kompletnego plazmidu ekspresji pD16-hK8.Ll łańcucha lekkiego hl06.

Figura 16 przedstawia sekwencje kwasu nukleinowego (seq. ID# 76) i reszty aminokwasowej (seq.# 77) dla wtrętu łańcucha lekkiego immunoglobuliny hl06, który koduje peptyd sygnałowy hl06, region zmienny i towarzyszące regiony, znajdujące się po obu stronach.

Figura 17 stanowi przedstawienie kompletnego wektora ekspresji pD 17-hKl .Η 1 łańcucha ciężkiego hl06.

Figura 18 przedstawia sekwencje kwasu nukleinowego (seq ID#78) i reszty aminokwasowej (seq ID#79) dla wtrętu łańcucha ciężkiego hl06, który koduje peptyd sygnałowy h 106, region zmienny i towarzyszące regiony, znajdujące się po obu stronach.

Figura 19 stanowi dane dla inhibicji proliferacji limfocytów B przez sgp39 w obecności przeciw-ludzkiej IgM. Spoczynkowe limfocyty B z migdałka hodowano w obecności sgp39, króliczych ciałek odpornościowych przeciw-ludzkiej IgM, oraz wskazanych ilości przeciwciał monoklonalnych w ciągu 72 godzm. Płytki następnie poddano pulsacyjnie działaniu [³H]-tymidyny i inkubowano przez dodatkowe 16 godzin. Po inkubacji komórki zebrano i określono przyłączenie [³H]-tymidyny. Wszystkie testy przeprowadzono trzykrotnie. Wyniki wyrażono jako procent inhibicji porównany z hodowlami, zawierającymi tylko pożywkę.

Figura 20 porównuje zdolność różnych humanizowanych białek przeciwciała 106 do inhibicji produkcji przeciwciał przez ludzkie komórki B stymulowane aktywowanymi komórkami T Ludzkie komórki jednojądrzaste z krwi obwodowej, pozbawiono monocytów i naturalnych komórek zabójców, a następnie rozdzielono do pozytywnej rozety E (komórki T) i negatywnej rozety E (komórki B). Następnie komórki T traktowano mitomycyną C i hodowano wspólnie z komórkami B w studzienkach powleczonych przeciwciałem monoklonalnym anty-CD3, na płytce o 96 studzienkach, w obecności wskazanej ilości przeciwciała monoklonalnego. Wszystkie testy przeprowadzono trzykrotnie. Wyniki wyrażono jak procent inhibicji porównany z hodowlą zawierającą tylko pożywkę (brak przeciwciała monoklonalnego anty-gp39).

Figura 21 porównuje zdolność różnych humanizowanych białek przeciwciała 106, do inhibicji indukcji ekspresji selektyny E na komórkach śródbłonkowych przez linię limfocytów T gp39⁺. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pękowej, hodowano z komórkami BMS-2, linią Jurkat, o której wiadomo, że wykazuje ekspresję gp39, w obecności oznaczonej ilości przeciw

182 868 ciała. Po czterech godzinach, poziom ekspresji selektyny E zmierzono testem ELISA. Słupki błędów są mniejsze niż symbole wykresu.

Szczegółowy opis wynalazku

Aby wynalazek tu opisany mógł być pełniej zrozumiały, przedstawia się następujący opis

Niniejszy wynalazek odnosi się do grupy przeciwciał monoklonalnych, rozpoznających specyficzne epitopy ghkoproteiny błonowej komórek T, gp39, oraz do hybrydom, które wytwarzaj ąi wydzielają te przeciwciała monoklonalne. Niniejszy wynalazek obejmuje także inne przeciwciała monoklonalne, które można wytworzyć, konkurencyjnie hamujące wiązanie szczegółowo opisanych przeciwciał monoklonalnych z ich epitopami. Fragmenty przeciwciał monoklonalnych i białek rekombinacyjnych, posiadających region zmienny, opisanych przeciwciał monoklonalnych, także włącza się do niniejszego wynalazku, jak również sposoby użycia przeciwciał monoklonalnych, fragmentów i rekombinacyjnych białek wiążących, w diagnozowaniu zespołu hiper IgM, w innych oznaczeniach adhezji komórkowej i komórek T, oraz w sposobach modulowania odpowiedzi immunologicznych u gospodarza.

Wytworzenie przeciwciał monoklonalnych może być przeprowadzone przez unieśmiertelnienie linii komórkowej, produkującej przeciwciała specyficzne pod względem epitopu dla gp39. Typowo, przeciwciało monoklonalne według niniejszego wynalazku można wytworzyć przy użyciu dobrze określonych technik dla hybrydom, wprowadzonych pierwszy raz przez Kohlera i Milsteina. Patrz Kohler i Milstein, 1975,Naturę 256,495. Patrz także Brown i in., 1981, J.Immunol 127,539; Yehiin., \979, Proc.NatAcad.Sci.USA 76,297;Hellstromnn., 1990, Cancer Research 50, 2183.

Techniki te obejmują infekcję immunogenu (np. komórek lub ekstraktów komórkowych, zawierających antygen gp39 lub oczyszczoną gp39, albo jako białko natywne, fragment, zawierający miejsce epitopu, albo białko połączone) do zwierzęcia tak, aby wywołać żądaną odpowiedź immunologiczną u tego zwierzęcia. Zwierzęta zazwyczaj używane obejmują wiele ssaków np. mysz, szczur, krowa, koza, owca, królik itd. Immunogen jest zazwyczaj podawany zwierzęciu z adjuwantem np. kompletnym adjuwantem Freunda, żelem wodorotlenku glinu lub temu podobnymi. Zwierzęciu można następnie puścić krew i użyć ja do izolowania przeciwciał monoklonalnych. Ewentualnie limfocyty knvi obwodowej, limfocyty śledziony (komórki B) lub limfocyty węzłów chłonnych można użyć do fuzji z odpowiednią komórką szpiczaka, aby unieśmiertelnić geny, kodujące przeciwciała monoklonalne specyficzne dla pg39.

W niniejszym wynalazku, przeciwciała monoklonalne charakteryzuje się częściowo przez ich wiązanie do serii mutantów gp39. Zachłanność wiązania (siłę wiązania) przeciwciał z mutantem gp39 porównywano z zachłannością wiązania przeciwciała z gp39 dzikiego typu. Zachłanność wiązania określono jako słabą, jeśli porównanie zachłanności wiązania i poszczególnym mutantem była mniejsza niż 25-30% zachłanności wiązania z gp39 dzikiego typu; słabą lub mniejszą całkowitą redukcję reaktywności, uzyskano, jeśli zachłanność wiązania z mutantem była 25-30% do 50-55% zachłanności wiązania z gp39 dzikiego typu; nieco zredukowana reaktywność uzyskano, jeśli zachłanność wiązania z mutantem była 50-55% do 75-80% zachłanności wiązania z gp39 dzikiego typu; oraz podobna lub równoważną reaktywność uzyskano, jeśli zachłanność wiązania z mutantem była 75-80% lub większa od zachłanności wiązania z mutantem Przeciwciała według niniejszego wynalazku scharakteryzowano także przez ich izotypy, wiązanie z gp39 przez Western biot, zdolność supresji proliferacji komórek B i zdolność supresji wytwarzania immunoglobulin.

Mimo, iż wynalazek opisany jest przez przykłady, stosujące mysie przeciwciała monoklonalne, wynalazek me jest do tego ograniczony i obejmuje użycie, np. ludzkich hybrydom (Cote i in., 1983, Proc.Nat 1 .Acad.Sci. USA 80,2026) lub przez transformowanie ludzkich komórek B (np. wirusem Epsteina Barra (EBV) in vitro} (Cole i in., 1985, w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss str. 77-96).

Przeciwciała monoklonalne mogą należeć do każdej z klas lub podklas immunoglobulin, takich jak IgM, IgD, IgA, IgE lub podklas IgG znanych u każdego gatunku zwierząt. Generalnie,

182 868 przeciwciała monoklonalne można stosować uszkodzone lub jako fragmenty wiążące się z epitopem, takie jak Fv, Fab lub F(ab')₂.

Linie komórkowe według niniejszego wynalazku mogą znaleźć zastosowanie inne niż przy bezpośrednim wytwarzaniu przeciwciał monoklonalnych. Linie komórkowe można łączyć z innymi komórkami (takimi jak odpowiednio znakowane lekiem komórki ludzkiego szpiczaka, szpiczaka mysiego, lub ludzkiego chłoniaka złośliwego), aby wyprodukować hybrydomy i w ten sposób zapewnić je do przeniesienia genów, kodujących przeciwciała monoklonalne. Ewentualnie, linie komórkowe można użyć jako źródło chromosomów, lub genów, kodujących immunoglobuhny, szczególnie te regiony genów, kodujących regiony zmienne lub wiążące epitopy w immunoglobulinach, które można izolować i przenosić do komórek przy użyciu technik innych niż łączenie. Można to zwłaszcza osiągnąć przez sporządzenie bibliotek cDNA (na podstawie mRNA), kodujących immunoglobuliny i wolnych od mtronów, następnie izolację i umieszczenie DNA w odpowiednich prokariotycznych lub eukariotycznych wektorach ekspresji. Sposobów dla wektorów ekspresji można następnie użyć do przekształcenia gospodarza, aby produkował immunoglobuliny lub fragmenty wiążące się z epitopami. Patrz, zwłaszcza US nr 4 172 124; 4 350 683; 4 363 799; 4 381 292 i 4 423 147. Patrz także Kennet i m., 1980, Monoclonal Antibodies, Plenum Press, Nowy Jork, i odnośniki tam cytowane.

Szczególniej, zgodnie z technologią hybryd DNA, immunoglobulina lub fragment wiążący się z epitopem według niniejszego wynalazku można wytworzyć w bakterii (patrz Boss i in., 1984, Nucl.AcidRes, 12, 3791 i Wood i in., 1985, Naturę 314, 446). np. informacyjny RNA przepisany z genu kodującego lekki i ciężki łańcuch przeciwciał monoklonalnych, wytwarzanych przez linię komórkową według niniejszego wynalazku, można izolować przez różnicową hybrydyzację cDNA, z użyciem zdegenerowanych sond cDNA, pochodzących z sekwencji DNA znanych jako powszechne dla dojrzałych cząsteczek immno globulin z komórek typu rodzicielskiego. mRNA, który nie hybrydyzuje, będzie bogaty w informacje, kodujące żądane łańcuchy immunoglobuhn. Jeśli potrzeba, proces można powtarzać, dla dalszego wzmocnienia żądanych poziomów mRNA. Odjętą kompozycję mRNA można następnie poddać odwrotnej transkrypcji, aby zapewnić mieszaninę cDNA wzbogaconą żądanymi sekwencjami. RNA można hydrolizować odpowiednią RN-azą i ssDNA uczynić DNA o podwójnym łańcuchu, za pomocą polimerazy DNA I oraz losowych starterów, np. losowo podzielonego DNA grasicy cielęcia. Otrzymany dsDNA można następnie klonować przez insercję do odpowiedniego wektora, np. wektorów wirusowych, takich jak wektor λ lub wektorów plazmidowych (takiego jak pBR322, pACYC 184, itd). Poprzez sondy rozwijające na osnowie sekwencji znanych pod względem regionów stałych łańcuchów lekkiego i ciężkiego, te klony cDNA, posiadające gen, kodujący żądane lekkie i ciężkie łańcuchy, można identyfikować przez hybrydyzację. Później, gen można wyciąć z plazmidu, manipulować, aby usunąć zbędny DNA, a następnie wprowadzić do odpowiedniego wektora, w celu transformacji gospodarza i ostatecznej ekspresji genu. Inne sposoby dobrze znane w tej dziedzinie można stosować, w celu izolacji sekwencji genu, który koduje cząsteczki immunoglobulin.

W niniejszym zgłoszeniu, izolowano RNA i wytworzono cDNA, stosując techniki PCR, z regionami stałymi immunoglobulin jako starterami. Fragmenty VH i VL namnożone przez PCR, poddano selekcji, klonowano i stosowano do określenia sekwencji nukleotydów dla regionów zmiennych.

Dogodnie do przetwarzania łańcuchów immunoglobulinowych (np. do łączenia łańcuchów lekkiego i ciężkiego) można używać gospodarzy, będących ssakami (np. komórek myszy), w celu wytworzenia uszkodzonej immunoglobuliny; i dalej jeśli trzeba, wydzielenia immunoglobuliny wolnej od jakiejkolwiek sekwencji liderowej. Ewentualnie, można użyć mikroorganizmów jednokomórkowych do produkcji dwóch łańcuchów, w których mogą być wymagane dalsze manipulacje, w celu usunięcia sekwencji DNA kodujących lidera wydzielniczego i sygnałów przetwarzania, podczas dostarczania kodonu inicjacyjnego przy końcu 5' sekwencji kodującej łańcuch ciężki. W ten sposób, immunoglobuliny można sporządzić i przetworzyć tak, aby były złożone i ghkozylowane w komórkach innych niż komórki ssaków.

182 868

Jeśli trzeba, każdy z łańcuchów można okroić, tak, aby zachować co najmniej region zmienny, którym następnie można manipulować, aby zapewnić inne rekombinowane białka wiążące specyficzne dla epitopu gp39, rozpoznawanego przez przeciwciało rodzicielskie.

Jednym takim rekombinowanym białkiem wiążącym jest chimeryczne przeciwciało, w którym regiony zmienne przeciwciała rodzicielskiego są rekombinowane ze stałymi regionami przeciwciał, pochodzących od różnych gatunków (np. mysie regiony zmienne rekombinowane z ludzkimi regionami stałymi). Typowo region zmienny przeciwciała monoklonalnego według niniejszego wynalazku będzie łączony z regionem stałym przeciwciała ludzkiego. Przeciwciała chimeryczne, które w kompozycji sa w większości ludzkie, są znacznie mniej immunogenne niż przeciwciała mysie.

Innym rekombinowanym białkiem wiążącym się z epitotem jest przeciwciało o pojedynczym łańcuch. W takiej konstrukcji, czasami zwanej sFv, jeden region zmienny zarówno z łańcucha lekkiego jak i ciężkiego przeciwciała rodzicielskiego, jest kowalencyjnie związany poprzez łącznik peptydowy tak, że region wiążący się z epitopem jest przekształcony. Można także skonstruować wielowartościowe przeciwciała o pojedynczym łańcuchu, zawierające regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego, specyficzne dla jednego lub więcej epitopów gp39. Patrz EP 0 610 046 i WO 94/13806, pod względem możliwości skonstruowania takich rekombinowanych białek wiążących.

Jeszcze innym typem rekombinowanego białka wiążącego jest humanizowane przeciwciało, w którym kodony w regionie zrębowym nie ludzkiego przeciwciała monoklonalnego, są zmieniane różnymi metodami mutagenezy punktowej, w celu kodowania reszt aminokwasów, aby uczynić zrąb mysi bardziej podobnym do ludzkiego regionu zrębowego. Patrz EP 0 578 515, EP 0 592 106, Jones i in., 1986 Naturę 321, 522; Riechmann i in., 1988, Naturę 32, 323. Zmiany można wykonać także dla regionów determinujących dopasowanie (CDR), aby uczynić cały region zmienny bardziej podobnym do powierzchniowego charakteru przeciwciała ludzkiego. Zamierzeniem wykonania różnych rekombinowanych białek wiążących jest zmiana albo immunogenności przeciwciała, albo aktywności dodatkowej, związanej z reginem stałym lub innąaktywnączęściąrekombinowanąz reginem wiążącym się z epitopem, oraz zachowanie specyficzności wiązania się z epitopem gp39 oryginalnego przeciwciała rodzicielskiego.

Wynalazek ten dostarcza dalej kompozycji przeciwciał monoklonalnych i rekombinowanych białek wiążących według niniejszego wynalazku. Kompozycje te mogą obejmować przeciwciała monoklonalne i rekombinowane białka wiążące według niniejszego wynalazku znakowane wykrywalnym markerem, np. izotopem radioaktywnym, enzymem, fluoroforem, chloroformem itd. Inne kompozycje mogą obejmować przeciwciała monoklonalne lub rekombinowane białka wiążące według niniejszego wynalazku, sprzężone lub połączone ze środkiem terapeutycznym, takim jak radioizotop, toksyna, (to jest Pseudomonas exotoxin) lub środkiem chemioterapeutycznym.

Sprzężenie lub połączenie przeciwciała lub rekombinowanego białka wiążącego według niniejszego wynalazku z wykrywalnym markerem lub środkiem terapeutycznym, może zajść środkami wiązania kowalencyjnego lub innego wiązania chemicznego. Czynniki wiązania chemicznego mogą obejmować np. aldehyd glutarowy, czynniki łączące heterobifunkcyjne i homobifunkcyjne. Czynniki heterobifunkcyjne mogą obejmować np. SMPT (sukcynoimidylooksykarbonylo-oc-metylo-a(2-pirydyloditiono)-toluen, SPDP (N-sukcynoimidylo-3-(2-pirydylilotio)propionian i SMCC (sukcynoimidylo-4-(N-malenoimidometylo)cykloheksano-l-karboksylan. Czynniki homobifunkcyjne mogą obejmować np. DMP (dimetylopimehnoimidan), DMA (dimetylosuberynoimidan) i DTBP dimetylo-3,3'-ditio-bispropionoimidan.

Pewne wykrywalne markery białek i środki terapeutyczne można łączyć rekombmacyjnie z regionami zmiennymi przeciwciał monoklonalnych według niniejszego wynalazku, w celu skonstruowania kompozycji, będących białkami połączonymi, w których regiony zmienne przeciwciał monoklonalnych utrzymują ich specyficzność wiązania i wykrywalny marker lub środek terapeutyczny zachowująich aktywność. Metody rekombinacyjne do konstruowania tych białek połączonych są dobrze znane w tej dziedzinie.

182 868

Niniejszy wynalazek zawiera kompozycje farmaceutyczne, obejmujące przeciwciała monoklonalne lub rekombinowane białka wiążące, albo sprzężone albo me sprzężone. Kompozycja farmaceutyczna może zawierać przeciwciało monoklonalne i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Do celów według niniejszego wynalazku, „farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem” może być każdy ze standardowych nośników, dobrze znanych w te dziedzinie. Np. odpowiednie nośniki mogą obejmować roztwory, soli buforowanej fosforanem, emulsje, takie jak emulsje olej/woda, i różne typy środków zwilżających. Inne nośniki mogą także obejmować sterylne roztwory, tabletki, tabletki powlekane i kapsułki.

Typowo, takie nośniki mogą zawierać zarobki, takie jak skrobia, mleko, cukier, typy gliny, żelatyna, kwas stearynowy lub jego sole, stearynian magnezu lub wapnia, talk, tłuszcze roślinne lub oleje, gumy, glicerole, lub inne znane zarobki. Takie nośniki mogą także obejmować dodatki zapachowe lub barwiące, konserwanty lub inne składniki. Kompozycje, zawierające takie nośniki sąpreparowane dobrze znanymi konwencjonalnymi środkami. Patrz Remington's Pharmaceuticals Science, wyd. 15 Much Publisłnng Company, Easton, Pensylwania (1980).

Przeciwciała monoklonalne i rekombinacyjne białka wiążące według niniejszego wynalazku znajdują wiele zastosowań in vitro i in vivo. Np. kompozycje według niniejszego wynalazku mogą znaleźć zastosowanie in vitro do izolowania rozpuszczalnej ludzkiej gp391 białek z mutacjami w ludzkiej gp39, związanych z chorobą ludzi, takąjak zespół hiper IgM związany z chromosomem X. Kompozycje mogą także znaleźć zastosowanie w metodach diagnostycznych odróżniania hiper IgM związanego z chromosomem X, i CVI.

Do celów diagnostycznych, przeciwciała monoklonalne i rekombinacyjne białka wiążące można albo znakować albo można ich nie znakować. Typowo, oznaczenia diagnostyczne obejmują wykrycie tworzenia kompleksu poprzez wiązanie przeciwciała monoklonalnego lub rekombinacyjnego białka wiążącego z ludzką gp39, albo na powierzchni komórki, albo wewnątrz aktywowanej komórki T. Gdy są nieznakowane, przeciwciała monoklonalne i rekombinacyjne białka wiążące znajdujązastosowanie w oznaczeniach aglutynacyjnych. W dodatku, nieznakowane przeciwciała można użyć w połączeniu z innymi znakowanymi przeciwciałami (drugie przeciwciała), które są specyficznie reaktywne z przeciwciałami monoklonalnymi lub rekombinacyjnymi białkami wiążącymi, takimi jak przeciwciała specyficzne dla immunoglobuIm. Ewentualnie, przeciwciała monoklonalne i rekombinacyjne białka wiążące można znakować bezpośrednio. Można wykorzystać szeroką różnorodność znaczników, takich jak radionuklidy, środki fluoryzujące, enzymy, substraty enzymów, kofaktory enzymów, inhibitory enzymów, hgandy (zwłaszcza hapteny), itd. Liczne rodzaje oznaczeń immunologicznych są dobrze znane w tej dziedzinie.

Zazwyczaj, przeciwciała monoklonalne i rekombinacyjne białka wiążące według niniejszego wynalazku stosuje się w oznaczeniach fluorescencyjnych, gdzie przedmiotowe przeciwciała lub rekombinacyjne białka wiążące sprzęga się z cząsteczką fluorescencyjną, takąjak izotiocyjanian fluoresceiny (FITC). Ponieważ wiele zmutowanych postaci ludzkiej gp39 nie jest transportowanych na powierzchnię komórki, komórki T izoluje się z przedmiotu, aktywuje, a następnie powoduje się, że komórki stają się przepuszczalne, aby umożliwić znakowanemu przeciwciału lub rekombinowanemu białku wiążącemu, penetrację komórki i wiązanie się ze zmutowaną gp39, gdziekolwiek jest ona obecna w komórce. Wiązanie się przeciwciał monoklonalnych z wewnątrzkomórkową gp39 i niezdolność do wiązania się z rozpuszczalną postacią CD40 na powierzchni komórkowej, wskazuje, że obecność pewnych mutacji punktowych w ludzkiej gp39 zapobiegała umiejscowieniu cząsteczki gp39 na powierzchni komórkowej. Może się to wiązać z chorobą ludzi, takąjak hiper IgM związaną z chromosomem X. Obecność związanego przeciwciała można wykryć przez sorter aktywowanych fluorescencyjnie komórek, po wymyciu nadmiaru znakowanego przeciwciała lub białka wiążącego. Można wykorzystać inne konwencjonalne techniki, dobrze znane fachowcom.

Można także dostarczyć zestawy do użytku z kompozycjami przedmiotowych przeciwciał i rekombinowanych białek wiążących, do wykrywania obecności cząsteczek zmutowanej ludzkiej gp39 w roztworze lub na aktywowanych komórkach T. Tak więc, przedmiotowe kompozycje

182 868 przeciwciała monoklonalnego i rekombinowanego białka wiążącego według mniejszego wynalazku, można zapewnić, zazwyczaj w postaci liofilizowanej albo indywidualnie, albo w połączeniu z przeciwciałami, które wiążą się z innymi specyficznymi mutantami ludzkiej gp39 Przeciwciała i rekombinowane białka wiążące, które można sprzęgać, w celu znakowania, lub można ich nie sprzęgać, wchodzą w skład zestawów z buforami, takimi jak Tns, fosforan, węglan itd., stabilizatorami, biocydami, białkami obojętnymi, np. albuminą surowicy bydlęcej, lub podobnymi. Generalnie, materiały te będą obecne w ilości mniejszej niż 5% wagowych w oparciu o ilość aktywnego przeciwciała, a zwykle obecne w całkowitej ilości co najmniej około 0,001% Wagowego w oparciu znowu o stężenie przeciwciała. Często, będzie pożądane włączenie obojętnego rozcieńczalnika lub zarobki, aby rozcieńczyć składniki aktywne, gdzie zaróbka może być obecna od około 1 do 99% wagowych całości kompozycji. Jeśli wykorzystuje się drugie przeciwciało zdolne do wiązania z przeciwciałem monoklonalnym lub rekombinowanym białkiem wiążącym, jest ono zwykle obecne w oddzielnej folce. Drugie przeciwciało jest zwykle sprzężone ze znacznikiem i spreparowane w sposób analogiczny do preparatów omawianych powyżej.

Przeciwciała monoklonalne, zwłaszcza rekombinowane białka wiążące, przeciwciała o jednym łańcuchu, przeciwciała chimeryczne i przeciwciała humanizowane według niniejszego wynalazku, można także włączać jako komponenty kompozycji farmaceutycznych, zawierających skuteczną ilość białka wiążącego, np. do modulowania odpowiedzi immunologicznej (to jest odpowiedzi autoimmunologicznej lub reakcji alergicznej), z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Adjuwanty farmaceutycznie dopuszczalne (środki buforujące, środki dozujące) można także włączyć do kompozycji farmaceutycznej. Takie kompozycje mogą zawierać pojedyncze przeciwciało monoklonalne lub rekombinowane białko wiążące specyficzne dla ludzkiej gp39. Ewentualnie, kompozycja farmaceutyczna może zawierać inne cząsteczki biologicznie aktywne, np. limfokiny, cytokiny, inne przeciwciała monoklonalne lub białka połączone (to jest CD28-Ig, CTLA4-Ig).

Przeciwciała monoklonalne, rekombinowane białka wiążące i ich kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku, są szczególnie użyteczne do podawania doustnego lub pozajelitowego. Korzystnie, kompozycje farmaceutyczne można podawać pozajelitowo, to jest podskórnie, domięśniowo lub dożylnie. Tak więc, wynalazek ten dostarcza kompozycji do podawania pozajelitowego, obejmujących roztwór przeciwciała monoklonalnego lub rekombinowanego białka wiążącego, rozpuszczonego w dopuszczalnym nośniku, korzystnie nośniku wodnym. Można stosować różne wodne nośniki, np. wodę, wodę buforowaną maltozę, 0,4% roztwór soli, 0,3% roztwór glicyny i podobne. Roztwory te są jałowe i generalnie pozbawione substancji złożonej z cząstek stałych. Kompozycje te można sterylizować konwencjonalnymi, dobrze znanymi technikami. Kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, jakich wymagają przybliżone warunki fizjologiczne, takie jak środki regulujące pH i buforujące, środki regulujące toksyczność i temu podobne, np. octan sodu, chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek wapnia, mleczan sodu itd. Stężenie przeciwciała lub rekombinowanego białka wiążącego w tych preparatach może się szeroko zmieniać, to jest od mniej niż około 0,5%, zwykle przy lub co najmniej 1 % do tak dużo jak 15 do 20% wagowych i będzie wybrane przede wszystkim w oparciu o objętość płynną lepkość itd., korzystnie ze względu na szczegółowy sposób wybranego podawania.

Tak więc, typowa kompozycja farmaceutyczna do wstrzyknięć domięśniowych może być wykonana do zawartości 1 ml jałowej wody buforowanej i około 50 mg przeciwciała monoklonalnego. Typowa kompozycja do wlewu dożylnego może być wykonana do zawartości np. 250 ml jałowego roztworu Ringera i 150 mg przeciwciała monoklonalnego lub rekombinowanego białka wiążącego. Aktualne metody sporządzania kompozycji możliwych do podawania pozajelitowego będą znane lub widoczne dla fachowców i opisano je bardziej szczegółowo np. w Remington^ Pharmaceutical Science, wyd. 15, Mech Publishing Company, Easton Pensylwania (1980), który załącza się tu jako odnośnik.

Przeciwciała monoklonalne i rekombinowane białka wiążące według tego wynalazku można liofilizować w celu przechowania i przywracać do poprzedniej postaci na odpowiednim noś

182 868 mku, przed użyciem. Fachowiec doceni, że liofilizacja i rekonstytucja może prowadzić do zmieniającego się stopnia utraty aktywności przeciwciała i że stosowane poziomy muszą być wyregulowane w celu kompensacji.

Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku znajdują zastosowanie in νινο do inhibicji interakcji CD40/gp39. Blokowanie tej interakcji ogranicza odpowiedzi zarówno pierwotnego jak i drugorzędowego przeciwciała, na antygeny zależne od komórek T i produkcję przeciwciała specyficznego dla tych antygenów. Dlatego przeciwciała monoklonalne, fragmenty wiążące antygen i rekombinowane białka wiążące można stosować do inhibicji aktywacji komórek B, modulacji lub inhibicji chorób autoimmunologicznych (to jest łuszczycy, reumatoidalnego zapalenia stawów, układowego liszaju rumieniowatego, cukrzycy itd), odpowiedzi alergicznych, odrzucania przeszczepu lub chorób związanych z odrzucaniem przeszczepu. Kompozycje można także stosować do zobrazowania guzów nowotworowych, w których zachodzi ekspresja gp39, gdy kompozycje są znakowane wykrywalnym markerem. Jeśli sprzęga się je ze środkiem terapeutycznym lub jako białko połączone ze środkiem terapeutycznym, przeciwciała monoklonalne, fragment wiążący antygen lub rekombinowane białka wiążące można także stosować do nacelowama środka terapeutycznego na komórki guza nowotworowego.

Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku znajdują zastosowanie in vivo do inhibicji interakcji CD40/gp39. Blokowanie tej interakcji ogranicza odpowiedzi zarówno pierwotnego jak i drugorzędowego przeciwciała, na antygeny zależne od komórek T i produkcję przeciwciała specyficznego dla tych antygenów.

Wynalazek ten ilustruje się w przykładach które następują. Tączęść przykładową przewidziano, aby pomóc w zrozumieniu wynalazku, lecz nie jest w zamiarze i me powinno się jej interpretować jako ograniczającą wynalazek wjakikolwiek sposób, jak tylko przedstawiono w zastrzeżeniach, które następują.

Przykład I.

Wytworzenie i początkowa charakteryzacja przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla gp39 - fuzja 1

A. Immunizacja

Samice myszy rasy Balb/c, w wieku sześciu do ośmiu tygodni, immunizowano początkowo śródotrzewnowo 30 pg białka połączonego gp39-CD8 (sgp39, Hollenbaugh i in., 1992, EMBOJ 11,4313-4321) w objętości 100 μΐ kompletnego adjuwanta Freunda. W przybliżeniu dwa tygodnie później, myszy poddano podobnej injekcji, z wyjątkiem użytego podłoża, którym był niekompletny adjuwant Freunda. Trzy tygodnie później, myszy otrzymały dożylną przedftizyjnąinjekcję pomocniczą 23 pg sgp39 w objętości 100 pl roztworu soli buforowanej fosforanem (PBS).

B. Fuzja

Trzy dni po przedfuzyjnej dawce pomocniczej, wycięto śledzionę i węzły chłonne (pachowe, podkolanowe, pachwinowe i krezkowe). Pocięto je skalpelem na małe kawałki i następnie delikatnie wciśnięto między końce matowego szkła szkiełek przedmiotowych, w obecności niekompletnej pożywki Iscove'a (pożywka Dulbecco modyfikowana przez Iscove'a uzupełniona w penicylinę i streptomycynę do końcowego stężenia, odpowiednio 100 U/ml 1100 pg/ml), w celu utraty limfocytów z tkanki łącznej. Zawiesinę delikatnie pipetowano w celu dalszej utraty z niej komórek, a następnie zawiesinę przepuszczono przez filtr komórkowy (Falcon 2350), w celu usunięcia grudek resztek tkanki łącznej. Zawiesinę komórkową następnie przemyto dwukrotnie, wirując przy 200 g przez 10 minut, po czym zawieszono ponownie granulki komórkowe w niekompletnej pożywce Iscove'a. Po przemyciu zdolną do życia całkowitą ilość leukocytów określono przez wykluczenie błękitu trypanowego.

Procedurę fuzji oparto o metody Lane'a i in., 1986 (Methods Enzymol 121, 183-192) Komórki szpiczaka (X63-Ag8.653, Keameyiin., \919,J.Immunol. 123, 1548-1550) w fazie wzrostu logarytmicznego przemyto dwukrotnie przez wirowanie przy 200 g przez 5 minut, po czym

182 868 zawieszono ponownie grudki komórek w niekompletnej pożywce Iscove'a. Następnie komórki łączono z przemytymi leukocytami w plastykowej rurce do wirowania o objętości 50 ml, w stosunku 1:4 komórek szpiczaka do leukocytów i wirowano przy 200 g przez 10 minut. Po aspiracji pożywki, w rurkę delikatnie stukano, dotąd aż grudki komórkowe ponownie zawiesiły się w pozostającej małej ilości pożywki. Po inkubacji rurki w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 1 minutę, dodano do komórek 1,5 ml świeżo sporządzonego roztworu glikolu polietylenowego w sulfotlenku dimetylu o temperaturze 37°C [50% (stężenie wagowe) Kodak 1450 glikol polietylenowy, 5% (stężenie objętościowe) sulfotlenku dimetylu, i 45% (stężenie objętościowe) roztworu soli buforowej fosforanem, me zawierającego wapnia czy magnezu, pH 8,0], przez okres 45 sekund ze stałym obracaniem się rurki w łaźni wodnej o temperaturze 37°. Mieszaninę fuzyjną rozcieńczono następnie 50 ml kompletnej pożywki Iscove'a o temperaturze 37°C ((niekompletna pożywka Iscove'a zaopatrzona w dodatkowe 2 mM L-glutaminy i 15% (stężenie objętościowe) surowicy płodu cielęcego(FCS)) przez okres 90 sekund jak następuje: 3 ml przez pierwsze 30 sekund, 9 ml przez następne 30 sekund i reszta przez ostatnie 30 sekund. Rurkę inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 minut, po czym wirowano ją przy 200 g przez 5 minut, supematant aspirowano a następnie komórki zawieszono ponownie w 120 ml pożywki hybrydomowej [kompletna pożywka Iscove'a zaopatrzona w hipoksantynę (1 x 10‘⁴ M stężenia końcowego), aminopterynę (4 χ ΙΟ’⁷ M stężenia końcowego), tymidynę (1,6 χ 10'⁷ M stężenia końcowego), i 10% (stężenie objętościowe) czynnika klonowania hybrydomy (Boehringer Monachium)]. Zawiesinę komórkowąpowleczono na 6 płytkach do hodowli, o 96 studzienkach (200 μΐ/studzienkę), czego wynikiem była gęstość powlekania 243 000 całkowitej ilości komórek (przed fuzją) na studzienkę. Studzienki odżywiano na 3 i 5 dzień po fuzji, przez wymianę połowy supematantu na świeżą pożywkę hybrydomową i oznaczano pod względem specyficznego przeciwciała anty-gp39 w dniu 8.

C Przesiewanie

Supematanty ze studzienek hodowlanych, posiadających komórki rosnące, przesiano początkowo pod względem reaktywności z białkiem immunogennym sgp39 jak następuje. Płytki Dynatech Immulon 2 El A powleczono 1 pg/ml (100 μΐ/studzienkę) przeciwciała 53-6 (szczurze przeciwmysiej CD*, ATCC TIB 105) w 0,05 M buforu węglan sodu/kwaśny węglan sodu, pH 9,6. Płytki uszczelniono i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Wszystkie następne etapy przeprowadzano w temperaturze pokojowej. Środek powlekający usunięto i studzienki zablokowano odczynnikiem blokującym [(rozcieńczalnikiem wzorcowym (Genetic System Corp., Seattle, WA) rozcieńczoną 1:10 w wodzie dejomzowanej)] na jedną godzinę. Odczynnik blokujący usunięto i supematant komórkowy COS, zawierający białko sgp39 rozcieńczony 1.4 w kompletnej pożywce Iscove'a, zawierającej 2% FCS (2% FCS-Iscove'a) dodano (100 μΐ/studzienkę) i inkubowano przez jedną godzinę. Białko połączone usunięto i studzienki przemyto raz 200 μΐ PBS-Tween (PBS, zawierające 0,05% (stężenie objętościowe) Tween 20).Następnie dodano supematant hodowli komórkowej (50 μΐ/studzienkę) i inkubowano przez jedną godzinę. Supematant hodowli komórkowej usunięto i studzienki przemyto raz PBS-Tween przed dodaniem znakowanej peroksydazą chrzanową (HRP) koziej IgG przeciw-mysiej (Jackson Immunological Laboratories) rozcieńczonej 1:100000 w odczynniku blokującym, po czym inkubowano przez jedną godzinę. Nadmiar znakowanego przeciwciała usunięto i studzienki przemyto trzykrotnie PBS-Tween. Po tym nastąpiło dodanie 100 μΐ/studzienkę tetrametylobenzydyny (Genetic System Corp.) rozcieńczonej 1:100 w 0,1 M buforze cytrynianowym, pH 5,5, zawierającej 0,015% 30% roztworu H₂O₂. Płytki inkubowano przez 15 minut i zatrzymano reakcję przez dodanie 3 N kwasu siarkowego (50 μΐ/studzienkę). Zmierzono gęstość optycznąprzy 450/630 nm na Bio-Tek Instruments EL312 Microplate Reader.

Te supematanty hodowli komórkowej, które okazały się pozytywne pod względem wiązania z sgp39, testowano następnie pod względem wiązania z białkiem połączonym CD72-CD8 (sCD72), aby oszacować raczej przeciwciała specyficzne dla gp39 niż mysią część CD8 białka połączonego. Opis konstrukcji genu chimerycznego, kodującego sCD72 i ekspresji białka

182 868 połączonego krótkotrwale w komórkach COS, zamieszano w Hollenbaugh i m., 1992 (włączonego tu w całości jako odnośnik). Test ELISA dla wiązania z sCD72 był identyczny z opisanym powyżej dla sgp39 z wyjątkiem tego, że w miejsce sgp39 użyto nierozcieńczonych komórek COS, zawierających sCD72.

Wszystkie supematanty, które były reaktywne z sgp39 i nie były z sCD72 testowano następnie pod względem ich zdolności inhibicji wiązania białka połączonego CD40-Igz sgp39. Krótko, płytki Dynatech Immunol 2 E1A powleczono przeciwciałem 53-6 jak opisano powyżej. Studzienki zablokowano i przemyto jak powyżej, a supematant z komórki COS, zawierający sgp39 rozcieńczony 1:4 w 2% FCS-Iscove;a dodano (100 μΐ/studzienkę) i inkubowano przez 1 godzinę. Usunięto sgp39 i płytki przemyto 200 μΐ PBS-Tween. Dodano następnie supematanty hodowlane (50 μΐ/studzienkę) i inkubowano przez 1 godzinę, usunięto i studzienki przemyto raz PBS-Tween. Oczyszczone białko połączone CD40-IG (EP 555880) rozcieńczono następnie do 2 pg/ml w 2% FCS-Iscove'a, dodano do wszystkich studzienek (50 μΐ/studzienkę) i płytki inkubowano przez jedną godzinę. Nadmiar białka połączonego usunięto i studzienki przemyto ponownie raz PBS-Tween przed dodaniem znakowanej HRP koziej IgG przeciw-ludzkiej (Jackson Immunological Laboratories) rozcieńczonej 1:10 000 w odczynniku blokującym (50 μΐ/studzienkę). Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, znakowany HRP odczynnik usunięto i płytki przemyto trzy razy PBS-Tween. Opis związanego odczynnika znakowanego HRP i pomiar otrzymanej gęstości optycznej był taki jak podano w testach ELISA opisanych powyżej.

D. Kloning

Ustalono liczbę studzienek, które zawierały przeciwciało specyficzne dla gp39 i które wykazywały inhibicję interakcji gp39 z jej ligandem CD40 w teście ELISA. Komórki hodowane w tych studzienkach klonowano następnie i poddano dodatkowym kryteriom przesiewu.

Zapoczątkowano kloning za pomocą procedury „minikloningowej”, w której komórki od wyznaczonych komórek ze studzienek pierwotnych powleczono najpierw przy gęstości 10 lub 20 komórek na studzienkę w 96-studzienkowej płytce do hodowli komórek, o płaskim spodzie. Jedną lub dwie płytki ustalono pod względem każdej studzienki pierwotnej w pożywce hodowlanej, którą była kompletna pożywka Iscove'a uzupełniona w 10% (stężenie objętościowe) czynnik kloningu hybrydomy (pożywka kloningowa) o objętości 200 μΐ/studzienke. Komórki hodowano przez 7 do 8 dni, w którym to czasie supematanty testowano ponownie pod względem reaktywności gp39 i zdolności po inhibicji wiązania CD40-Ig z białkiem połączonym gp39-CD8 przez test ELISA (opisany powyżej). Ze studzienek w każdym urządzeniu do miniklonowania, które odpowiadały tym kryteriom, jedną studzienkę klonowano. Komórki usunięto z wybranej studzienki i rozcieńczono do stężenia w pożywce do klonowania, które zapewniłoby obliczoną gęstość jednej komórki na każde dwie studzienki. Komórki powleczono na połowie powierzchni dwóch 96-studzienkowych płytek do hodowli komórek (Costar) w objętości 100 lub 150 μΐ/studzienkę.

Po czterech lub pięciu dniach hodowli, studzienki przebadano w mikroskopie inwersyjnym i studzienki, zawierające pojedynczy klon, oznaczono. Po dalszych trzech czterech dniach hodowli, supematanty ze wszystkich studzienek przetestowano pod względem reaktywności gp39 (ELISA białka połączonego gp39-CD8, opisany powyżej) i zdolności inhibicji wiązania CD40-Ig z gp39-CD8 za pomocą ELISA (opisany powyżej). Supematanty ze studzienek, które były reaktywne z gp39-CD8, blokowały iterakcję CD40-Ig z gp39-CD8, i pochodziły ze studzienek oznaczonych jako zawierające pojedyncze klony, przebadano dalej pod względem ich zdolności wiązania z limą komórkowąJurkat komórek T, która z natury wykazywała ekspresję gp39 na swej powierzchni (BMS-10, R.Mittler, Bristol-Myers Squibo), oraz blokowania wiązania białka połączonego CD40-Ig z tymi komórkami. Klony, które odpowiadały tym dwóm ostatnim kryteriom, wybrano do dalszych badań.

Wiązanie przeciwciała z komórkami BMS-10 określono przez anahzę fluorescencyjną komórek. Krótko, odliczono 250 000 komórek BMS-10, dodano do każdej rurki i wirowano przy 250 g przez 5 minut. Pożywkę hodowlaną aspirowano i 100 μΐ każdego supematantu, zawie

182 868 rającego przeciwciało reaktywne z gp39-CD8 w teście ELISA dodano do rurki. Próby kontrolne zawierały tylko pożywkę hodowlaną lub pożywkę hodowlaną zawierającą kontrolne negatywne przeciwciało monoklonalne myszy. Mieszaninę inkubowano w lodzie przez 30 minut i następnie dodano 2 ml 2% FCS-Iscove'a. Rurki wirowano przy 250 g przez 5 minut i usnięto supematant. Znakowaną FITC kozią F(ab% IgG anty-mysią F/ab^ (Jackson Immunological Laboratories)) rozcieńczono 1:500 w 2% FCS-Iscove'a i dodano 100 μΐ do każdej rurki. Po 30 minutach inkubacji w lodzie, komórki przemyto dwukrotnie 1 ml 2% FCS-Iscove'a i ponownie zawieszono w 250 μΐ 2% FCS-Iscove'a przed analizą na FACSca™ Becton Dickinson.

Do oszacowania zdolności przeciwciał do blokowania wiązania CD40-Ig z komórkami BMS-10, użyto powyższej procedury z wyjątkiem tego, że po wymyciu mezwiązanego przeciwciała anty-gp39, do każdej rurki dodano CD40-Ig, rozcieńczono do 20 pg/ml w 10% FCS-Iscove'a, po 100 μΐ/rurkę. Po 30 minutach inkubacji w lodzie, do każdej rurki dodano 2 ml 2% FCS-Iscove'a, rurki wirowano przez pięć minut przy 250 g i supematanty aspirowano, w celu usunięcia niezwiązanych CD40-Ig. Zamiast znakowanego FITC odczynnika anty-mysiego, dodano następnie do każdej rurki odpowiednio rozcieńczoną znakowaną PE lub FITC kozią IgG anty-mysią F/ab^ (Jackson Immunological Laboratories), w celu wykrycia związanych CD40-Ig. W przeciwnym wypadku test zakończono i komórkę analizowano jak opisano powyżej.

Postępując według procedur zaznaczonych powyżej, otrzymano całkowitą ilość mysich przeciwciał monoklonalnych 23 anty-ludzkiej gp39. Każde z przeciwciał monoklonalnych izotypowano, aby określić jego podklasę IgG i dalej scharakteryzowano ich zdolność do rozpoznawania gp39. Przeprowadzono także analizę różnic specyficzności epitopowej między przeciwciałami monoklonalnymi, jak również zdolność przeciwciał do inhibicji proliferacji komórek B zależnych od komórek T, oraz produkcji immunoglobulin.

Przykład II

Wytworzenie i początkowa charakteryzacja przeciwciał monoklonalnych szczura specyficznych dla gp39-fuzja 5.

A. Immunizacja

Czterotygodniową samicę szczura rasy Lewis immunizowano 50 pg białka połączonego gp39-CD8 (Hollenbaugh i in.,) zawieszonego w całkowitej ilości 400 μΐ adjuwanta Ribi (Ribi Immunochem) zgodnie z instrukcjami producenta Z tej objętości, 200 μΐ podano śródotrzewnowo (IP), a pozostałą objętość podzielono równo między dwa miejsca podskórne. Trzy tygodnie później, zwierzę to immunizowano powtórnie IP 300 μΐ PBS, zawierającego 50 μΐ białka połączonego gp39-CD8. Jeden miesiąc później, szczura immunizowano ponownie IP 300 μΐ PBS, zawierającego 30 μg gp39-CD8. Trzy i pół tygodnia później szczur ten otrzymał dożylnie (IV) injekcję pomocniczą poprzedzającą fuzję, 30 pg gp39-CD8 w objętości 300 pi PBS.

B. Fuzja i przesiewanie

Trzy dni później przeprowadzono wycięcie, preparację oraz fuzję komórek śledziony i węzłów chłonnych szczura z komórkami szpiczaka myszy, jak dla fuzji 1 opisanej w przykładzie 1 z następującymi modyfikacjami. Leukocyty szczura połączono z odmianąlinn komórkowej szpiczaka myszy X63-Ag8.653 określonej H10, którą transformowano z genem odporności G⁴¹⁸Zawiesinę komórkową z każdej fuzji posiano na siedem 96-studzienkowych płytek hodowlanych, przy gęstości powlekania 236 000 całkowitej ilości komórek (przed fuzją) na studzienkę i hodowano w pożywkach dla hybrydom uzupełnionych genetycyną o końcowym stężenie 0,25 mg/ml.

Supematanty ze studzienek do hodowli komórkowej w fuzji 39-5, przesiano pod względem reaktywności z gp39, przy użyciu testu ELISA białka połączonego gp39-CD81CD72-CD8 jak opisano w przykładzie 1, z następującymi dwiema modyfikacjami. Mysie przeciwciało monoklonalne anty-mysim CD8 wytworzone z hybrydomy 116-13.1 (ATCC HB 129), o stężeniu 5 pg/ml, użyto jako przeciwciała wychwytowego dla białek połączonych, zamiast przeciwciała 53-6, i znakowanąHRP mysiąlgG anty-mysią(specyficznądla FC) (Jackson Immunological Laboratories), przy rozcieńczeniu 1:20 000, użyto jako przeciwciała wskaźnikowego, w celu wykrycia związanego przeciwciała przeciw białku połączonemu, zamiast koziej IgG anty-mysiej znakowanej HRP. Cztery studzienki określono jako zawierające przeciwciało specyficzne dla

182 868 białka połączonego gp39-CD8 i niespecyficzne dla białka połączonego CD72-CD8. Z nich, tylko jedno (39-5.6E9) określono jako barwiące gp39+linia komórkowa BMS-10, podczas badania drogą cytometrii przepływowej j ak opisano wcześniej. Supematant z tej studzienki określono następnie pod względem całkowitego bloku wiązania CD40-Ig z gp39-CD8, przy użyciu testu ELISA blokującego, opisanego wcześniej i pod względem całkowitej inhibicji wiązania CD40-Ig z komórkami BMS-10, podczas szacowania drogą cytometrii przepływowej. Linię komórkową klonów, posiadających wszystkie powyższe cechy otrzymano poprzez proces minikloningu/kloningu opisanego wcześniej.

Przykład III

Wytworzenie i początkowa charakteryzacja przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla gp39 - fuzja 7

A.Immunizacja

Samicę myszy rasy Balb/c w wieku sześciu do ośmiu tygodni, immunizowano początkowo podskórnie w czterech miejscach całkowitą ilością 30 pg białka połączonego gp39-CD8 w kompletnym adjuwancie Freunda. Około dwa i pięć tygodni później, myszy tej wstrzyknięto podobnie odpowiednio, 30 pg i 25 pg gp39-CD8 z wyjątkiem tego, że nośnikiem dla antygenu był niekompletny adjuwant Freunda. Pięć miesięcy później po początkowej immunizacji, myszy tej wstrzyknięto śródotrzewnowo 10 pg białka połączonego w niekompletnym adjuwancie Freunda. Dwa tygodnie później, mysz otrzymała dożylną poprzedzającą fuzję injekcję pomocmczą30 pg białka połączonego gp39-CD8 w PBS.

B Fuzja i przesiew

Trzy dni potem przeprowadzono wycięcie, preparację i fuzję mysich komórek śledziony i węzłów chłonnych z komórkami mysiego szpiczaka jak dla fuzji 39-1 z wyjątkiem tego, ze do połączenia komórek użyto tylko 1 ml glikolu polietylenowego. Zawiesinę komórkową będącą wynikiem tej fuzji posiano na 10 płytek do hodowli komórek o 96 studzienkach, przy gęstości powlekania 183 000 całkowitej ilości komórek (przed fuzją) na studzienkę. Studzienki odżywiano w dniu 3 i 6 po fuzji, przez wymianę połowy supematantu na świeżąpożywkę dla hybrydom i oznaczono pod względem specyficznego przeciwciała anty-gp39, w dniu 9.

Supematanty przesiano początkowo pod względem specyficzności anty-gp 39 w teście ELISA opartym o oznaczenie wiązania komórek. Płytki Falcon lub Costar o 96 studzienkach z płaskim spodem, powleczono 3,5 pg/cm² Cell-Tak (Collaborative Biomedical Product) rozcieńczony w 0,1 M kwaśnego węglanu sodu, pH 8,0. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Niezwiązane Cell-Tak aspirowano i studzienki przemyto dwukrotnie 150 pl/studzienkę wodą destylowaną w szkle. Komórki BSM-10 wirowano i ponownie zawieszono do stężenia 2 x 10⁶ komórek/ml w pożywce Iscove'a wolnej od surowicy. Pięćdziesiąt μΐ tej zawiesiny komórkowej dodano do każdej studzienki i płytki wirowano przez 5 minut przy 250 g. Płytki następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, po czym pożywkę aspirowano ze studzienek, przy użyciu ośmiokanałowego przewodu rurowego (Drummond). Supematanty hodowlane powleczono następnie ponownie na płytki testowe, 50 μΐ/studzienkę, i płytki inkubowano przez 1 godzinę Supematanty aspirowano i płytki przemyto raz 150 μΐ/studzienkę PBS, zawierającego 1% FCS. Dodano znakowane HRP szczurze IgG anty-mysie (Zymed), rozcieńczone w PBS, zawierającym 5% FCS, 50 μΐ/stidzienkę. Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, odczynnik znakowany HRP usunięto i płytki przemyto trzy razy PBS, zawierającym 1% surowicy z płodu cielęcia. Opis związanego odczynnika znakowanego HRP i pomiar otrzymanej gęstości optycznej był taki jak opisano w innych testach ELISA, wyszczególnionych powyżej.

Jako drugi przesiew, supematanty ze studzienek pozytywnych w powyższym teście ELISA komórek BMS-10, oznaczono pod względem reaktywności w stosunku do sgp39 i sCD72, przy użyciu odpowiednich testów ELISA białek połączonych, opisanych wcześniej. W tym teście, znakowaną HRP szczurzą IgG anty-mysią (Zymed) zastąpiono kozią IgG anty-mysią użytą we wcześniej opisanym oznaczeniu. Przeprowadzono następnie potwierdzenie specyficznej reaktywności z komórkami BMS-10 pozytywnymi wobec gp39, za pomocą pośredniej immunoflu

182 868 orescencji i analizy FACS jak opisano wcześniej. Supematanty testowano także pod względem ich zdolności inhibicji wiązania CD40-Ig z sgp39, przy użyciu blokującego testu ELIS A opisanego wcześniej. Supematanty analizowano dalej co do ich izotypów, z użyciem ELISA gp39-CD8, z wyjątkiem jednej modyfikacji. Każdy supematant testowano poczwórnie i śledzono następnie związane przeciwciało anty-gp39 czterema różnymi odczynnkami znakowanymi HRP specyficznymi dla izotypów anty-mysiego (Zymed, szczura anty-mysie odpowiednio, IgGl, IgG2a lub IgG2b, #04-6120,04-6220 i 04-6320 oraz królicze IgG3 anty-mysie, #61-0420). Cała ta analiza zidentyfikowała jedną studzienkę, która zawierała przeciwciało specyficzne dla ekspresji gp39 na powierzchni komórkowej, które blokowało wiązanie CD40-Ig z gp39-CD8 i było izotypem IgG2a Odpowiednie studzienki z komórkami, produkującymi przeciwciało, oznaczone 39-7.3E12, 39-7.7.G4 i 39-7.4C1 miniklonowano i klonowano jak opisano wcześniej.

Przykład IV

Wytworzenie i początkowa charakteryzacja przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla gp39 - fuzja 9

A.Immunizacja

Samicę myszy rasy Balb/c w wieku sześciu do ośmiu tygodni immunizowano początkowo podskórnie w czterech miejscach całkowitą ilością 30 μg biała połączonego gp39-CD8 w kompletnym adjuwancie Freunda. Dwa, pięć, 28 i 30,5 tygodni potem zwierzę immunizowano podobnie odpowiednio, 30 pg, 25 pg i 25 pg białka połączonego gp39-CD8 w niekompletnym adjuwancie Freunda. Trzy tygodnie, potem, zwierzę otrzymało injekcję pomocniczą IV poprzedzającą fuzję 35 pg gp39-CD8 w PBS.

B Fuzja i przesiew

Trzy dni potem przeprowadzono wycięcie, preparację i fuzję mysich komórek śledziony i węzłów chłonnych z komórkami mysiego szpiczaka X63-Ag8.653, jak dla fuzji 39-1, z wyjątkiem tego, ze stosunek komórek szpiczaka do leukocytów był 1 3 zamiast 1:4. Zawiesinę komórkową z tej fuzji powleczono na 15 płytkach do hodowli, o 96 studzienkach, przy gęstości 187 000 całkowitej ilości komórek (przed fuzją) na studzienkę.

Supematanty ze studzienek z hodowlą komórek w fuzji 39-9, przesiano pod względem przeciwciała anty-gp39, przy użyciu testu ELISA, wiążącego komórki BMS-10, opisanego wcześniej. Wszystkie supematanty pozytywne w tym przesiewie przebadano następnie pod względem ich zdolności blokowania wiązania CD40-Ig z gp39-CD8, stosując poprzednio opisany test ELISA blokujący. Zauważono liczne studzienki pozytywne pod względem obu kryteriów.

W celu identyfikacji tych studzienek, które zawierały przeciwciało ze specyficznością epitopu gp39 inną niż ta z wcześniej zidentyfikowanych przeciwciał monoklonalnych anty-gp39, każde z blokujących CD40-Ig, supematanty pozytywne BMS-10 badano przesiewano testem ELISA na seriach zmutowanych białek gp39 opisanych wcześniej dla analizy epitopowej przeciwciał z fuzji 1. Ten przesiew zidentyfikował kilka studzienek, włączając 39-9.27, 39-9.68, 39-9 246 i 39-9.274, dla któiych nie wykazano istotnej utraty wiązania z którymkolwiek z badanych mutantów.

W dodatku, jedna studzienka, oznaczona 39-9.11 demonstrowała znacznie zredukowane wiązanie z mutantami K143/A, a szczególnie N180/A, model nie oglądany poprzednio. Okazało się także w tym oznaczeniu, że każdy z tych supematantów rozpoznawał natywne sgp39 i nie rozpoznawał negatywnej próby kontrolnej białka połączonego sCD72. W każdej z tych pięciu studzienek otrzymano linię komórkową klonów, wydzielających odpowiednie przeciwciało, drogą kloningu z organiczonym rozcieńczeniem jak opisano wcześniej. Następująca potem analiza cytometm przepływowej klonowanego przeciwciała monoklonalnego z każdej linii komórkowej wykazała, że wszystkie one specyficznie reagowały z liniąkomórkowąBMS-10 i wszystkie były zdolne do blokowania interakcji CD40-Ig z tąliniąkomórkową. Każde z tych przeciwciał monolonalnych izo typowano jak opisano następnie i wszystkie z wyjątkiem 39-9.36, która była mysią IgG2b określono jako mysie IgGl.

182 868

Przykład V

Charakteryzacja przeciwciał monoklonalnych anty-gp39

A. Izotypowanie

Każde z mysich przeciwciał monoklonalnych otrzymanych w wyniku powyższych procedur, izotypowano, w celu identyfikacji jego podklasy IgG, stosując Isotype Ab-Stat Kit™ (SangStat Medical Corporation, Menlo Park, CA) lub zestaw ISOStnp™ (Boehringer Manneheim) zgodnie z instrukcją producenta. Izotyp przeciwciała monoklonalnego szczura otrzymany w fuzji 5 (39-5.6E9) ustalono, stosując test ELISA białka połączonego gp39-CD8 opisanego powyżej z wyjątkiem tego, że wykorzystano indywidualnie przeciwciała monoklonalne znakowane peroksydazą chrzanową, specyficzne dla szczurzej IgGl, IgG2a, IgG2b i IgG2c (Zymed Laboratories, San francisco, CA) przy rozcieńczeniu 1:1000, jako przeciwciała wskaźnikowe. Jedynym przeciwciałem wskaźnikowym, które wiązało 39-5.6E9 było przeciwciało przeciw szczurze IgG2a, wskazujące, że przeciwciałem monoklonalnym była IgG2a.

Przeciwciała monoklonalne otrzymane w fuzji 7 analizowano co do ich izotypów, stosując test ELISA dla sgp39, z wyjątkiem jednej modyfikacji. Każdy supematant testowano poczwórnie i związane przeciwciało anty-gp39 wyszukiwano następnie czterema różnymi znakowanymi HRP izotypowo specyficznymi przeciw mysimi odczynnikami (Zymed, szczurze przeciw mysie odpowiednio, IgGl, IgG2a lub IgG2b, oraz królicze IgG3 pzeciw mysie). Izotypy przeciwciał monoklonalnych według mniejszego wynalazku pokazano w tabeli 1.

B. Western biot i immunoprecypitacja

Przeprowadzono ocenę metodą Western biot za pomocą dwóch różnych procedur. W jednej, 1,5 pg oczyszczonego białka połączonego sgp39 w 300 μΐ barwnika obciążającego [250 mM Tris, 0,002% (stężenie objętościowe) błękitu bromofenolowego, 40% (stężenie objętościowe) glicerolu, pH 6,8,15 μΐ 20% SDS, 10 μΐ 2-merkaptoetanolu] poddano elektroforezie na 12% żelu pohakrylamidowym z SDS, przy 150 voltach przez 1 godzinę. Oddzielone białka przeniesiono na papier nitrocelulozowy za pomocą aparatu do przenoszenia mim-blot Βίο-Rad zgodnie z instrukcjami producenta. Po przeniesieniu, nitrocelulozę pozostawiono do wysuszenia w temperaturze pokojowej, a następnie każdą linię odcinano od arkusza jako szerokie, pionowe prążki, które umieszczano indywidualnie w studzienkach urządzenia Bio-Rad o płytkich studzienkach. Prążki inkubowano w 10 ml roztworu blokującego soli buforowanej Tris, zawierającego 5% (stężenie wagowe) odtłuszczonego wysuszonego mleka (TBS-T), przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, na urządzeniu kołyszącym z płaską powierzchnią. Po inkubacji roztwór blokujący aspirowano i prążki przepłukano dwukrotnie TBS-T.

Przeciwciało monoklonalne anty-gp39 rozcieńczono do stężenia około 12 pg/ml w TBS-T i dodano 3 ml roztworu przeciwciała do każdego prążka, jedno przeciwciało na prążek, na 2 godziny w temperaturze pokojowej, przy kołysaniu. Nadmiar roztworu przeciwciała aspirowano z każdej studzienki i prążki przemyto pięć razy 10 ml TBS-T. Po przemyciu, do każdej studzienki dodano 10 ml rozcieńczonej 1:3000 w TBS-T, każdej Ig (Tago) przeciw mysiej, znakowanej HRP. Prążki inkubowano przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przemyto pięć razy jak opisano powyżej.

Przeprowadzono wykrywanie związanego przeciwciała sprzężonego z HRP, stosując odczynniki do detekcji ECL (Amersham) zgodnie z instrukcjami producenta. Roztwór detekcyjny aspirowano i nadmiar płynu na prążkach usunięto, dotykając koniec prążka do ręcznika papierowego. Prążki ustawiono w prostej linii wewnątrz ochraniacza o plastykowych stronach i ochraniacz uszczelniono. Uszczelniony ochraniacz poddano następnie ekspozycji błonie do autoradiografn przez różne okresy czasu (1 sekunda do 15 minut) i następnie błonę wywołano.

-W drugiej producenta, 200 μΐ zużytego supematantu z komórek COS transfekowanych sgp39, rozcieńczono 25 μΐ barwnika obciążającego, ogrzano do 100°C przez 5 minut, ochłodzono w lodzie i poddano elektroforezie na 10% żelu poliakrylamidowym z SDS. Oddzielone białko przeniesiono na membranę Bio-Rad PVDF™, stosując półsuchy aparat do przenoszenia Hoeffer zgodnie z instrukcjami producenta. Po przeniesieniu oddzielonych białek na membrany, mem

182 868 brany pozostawiono do wysuszenia w temperaturze pokojowej, a potem postępowano według procedury opisanej powyżej, aby wybarwić membrany.

Przeciwciała anty-gp39 testowano także pod względem zdolności do immunoprecypitacji gp39 albo z transfekowanych komórek COS, albo z aktywowanych komórek T. Krótko, komórki COS transfekowano z cDNA, kodującego ludzką gp39, za pomocą procedury dekstranowej DEAE, stosując dziesięć 150 mm płytek, przy blisko 70% konfluencji. Następnego dnia na komórki COS podziałano trypsynę i ponownie powleczono na płytkach w ośmiu T-kolbach o objętości 150 cm³. Po inkubacji przez noc, pożywki usunięto i komórki przemyto raz modyfikowaną pożywkę Eagle'a bez cysteiny lub metioniny (Gibco Select-amine Kit) i dodano 20 ml świeżych pożywek wolnych od cysteiny/metiomny, zawierających 0,02 mCi/ml znacznika Tran ³⁵S (ICN, Costa Messa, CA) i komórki inkubowano przez noc. Następnego dnia pożywki usunięto i komórki przepłukano raz PBS i do każdej kolby dodano 2 ml buforu do lizy (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% deoksycholanu), zawierającego 1 nM sulfonylofluorku fenylometylowego (PMSF) 125 pg/ml trasylolu. Kolby umieszczono w lodzie na 10 minut, po których bufor usunięto. Sporządzono równe porcje i wirowano w mikro wirówce w temperaturze 4°C przy prędkości maksymalnej, przez dwie minuty. Supematanty zlano i przechowywano w temperaturze -70°C przed immunoprecypitacją.

Przeprowadzono immunoprecypitację przez rozmrożenie lizatów transfekowanych komórek COS w lodzie i podzielenie całkowitej objętości na 10 równych porcji. Do ośmiu rurek dodano 10 pg przeciwciała anty-gp39, podczas gdy jedna rurka otrzymała CD40 Ig jako pozytywną próbę kontrolnąi jedna otrzymała środek nie precypitujący jako negatywnąpróbę kontrolną. Próbki inkubowano w lodzie przez 4 godziny, po których do każdej rurki dodano 100 μΐ Protein G Sepharose FF™ (Pharmacia). Rurki inkubowano w lodzie przez 1 godzinę, mieszając co 10 do 15 minut. Próbki poddano wirowaniu impulsowemu w mikrowirówce i supematant brakowano Grudki przemyto przez ponowne zawieszenie i granulowanie trzy razy zimnym buforem do hzy, potem raz zimnym PBS. Po ostatnim przemyciu, dodano do każdej rurki 30 μΐ buforu do ładowania z SDS, zawierającego β-merkaptoetanol. Próbki ogrzewano w temperaturze 95°C przez 5 minut, wirowano impulsowo i supematant załadowano na 12% żel poliakrylamidowy z SDS. Na końcu elektroforezy, żel umieszczono w 10% metanolu, 10% kwasie octowym w wodzie na dwie godziny. Potem żel umieszczono w środku fluorograficznym Amplify™ (Amersham), zawierającym 10% glicerolu, na 15 minut. Żel wysuszono na papierze Whatman 3M pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze 80°C, przez 45 minut i poddano ekspozycji błonie rentgenowkiej w temperaturze -70°C przez 1 do 7 dni. Wyniki testu streszczono w tabeli 1. Immunoprecypitaty pozytywne wskazano dzięki obecności pasma przy tym samym ciężarze cząsteczkowym jak próba kontrolna CD40-Ig.

Przeprowadzono radioimmunoprecypitację gp39 z aktywowanych ludzkich komórek T z krwi obwodowej, jak następuje. Świeżo heparynizowaną krew całkowitą rozcieńczono 1 · 1 PBS 140 ml nałożono na 10 ml Lymphocyte Separation Media™ (Organon Teknika) jak opisano powyżej. Próbkę wirowano przez 30 minut przy 220 g. Izolowane limfocyty przemyto PBS i ponownie zawieszono w modyfikowanej pożywce Eagle'a bez cysteiny i metioniny, zawierającej 10% dializowanej surowicy płodu bydlęcego i 0,02 mCi/ml Tran ³⁵S Label™ przy końcowej gęstości komórkowej 3 χ 10⁶ komórek/ml. Komórki aktywowano, dodając PMA (10 ng/ml) i jonomycyny (1 pg/ml) przez dziewięć godzin, po których komórki granulowano, pożywki usunięto i komórki poddano lizie buforem do lizy, zawierającym PMSF i trasylol. Komórki inkubowano z buforem do lizy przez 10 minut, w lodzie, przed przeniesieniem próbki do rurek mikrowirówki i wirowaniem przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Supematanty zlano i przechowywano w temperaturze -70°Ć do dalszych obróbek. Przeprowadzono precypitację, jak opisano powyżej dla transfekowanych komórek COS i wyniki streszczono w tabeli 1.

182 868

Tabela 1

Krótkie zestawienie mAb przeciw ludzkim gp39

mAb	Izotyp	Wiązanie gp39 + komórki Jurkat	Inhibicja wiązania CD40-Ig z gp 39 4- komórki Jurkat	Western biot s gp39	Precypitacja radioimmunologiczna
39-1 3	IgGl	4-	4-	-	+(a)
39-1.7	IgG2b	+	4-	-	+(a,b)
39-1 21	IgGl	4-	4-	-	ND
39-1 25	IgGl	4-	ND	-	ND
39-1 26	IgGl	+	+	-	+(a,b)
39-1 29	IgG2a	4-	4-	4-	+(a)
39-1.37	IgGl	4-	+	-	ND
39-1.52	IgGl	4-	4-	4-	ND
39-1 59	IgGl	4-	4-	-	ND
39-1 61	IgGl	4-	4-	4-	+(b)
39-1 63	IgGl	4-	+	-	ND
39-1 77	IgGl	4-	4-	4-	+(a,b)
39-1 93	IgGl	+	+	4-	ND
39-1.106	IgGl	4-	4-	4-	+(b)
39-1 109	IgGl	4-	4-	4-	ND
39-1.122	IgG2b	4-	4-	-	ND
39-1.123	IgGl	4-	4-	*	ND
39-1 124	IgGl	4-	4-	4-	ND
39 1.128	IgG2b	4-	4-	-	4-
39-1 132	IgG2b	4-	4-	-	4-
39-1.134	IgGl	4-	4-	4-	4-
39-1 138	IgGl	4-	4-	-	ND
39-1.156	IgGl	4-	4-	4-	ND
39-7 E12	IgG2a	4-	4-	-	ND
39-5.6E9	IgG2a	4-	4-	-	ND
39-7 7G4	IgG2a	4-	4-	4-	ND
39-9 27	IgGl	+	4-	4-	ND
39-7.4C1	IgG2b	4-	4-	4-	ND
39-9 68	IgG2b	4-	4-	+	ND
39-9 246	IgGl	4-	4-	4-	ND
39-9.11	IgGl	4-	4-	-	ND
39-9 274	IgGl	4-	4-	4-	ND

a - poddano precypitacji immunologicznej z komórek COS transfekowanych gp39 b - poddano precypitacji imunologicznej i ludzkich aktywowanych komórek T ND - nie wykonano

182 868

C. Badanie wiązania przeciwciał monoklonałnych przeciw ludzkiej gp 39 z aktywowanymi i nieaktywowanymi normalnymi ludzkimi komórkami T

Oszacowano reaktywność różnych przeciwciał monoklonałnych przeciw ludzkiej gp39 z aktywowanymi i nieaktywowanymi normalnymi ludzkimi komórkami T, drogą pośredniej immunofluorescencji, po której nastąpiła analiza FACS. Komórki jednojądrzaste z ludzkiej krwi (PBMCs) izolowano, rozcieńczając całkowitą ilość krwi 1:1 PBS, nakładając 25 ml na 10 ml Lymphocyte Separation Medium (LSM, Organon Teknika) i wirując przez 25 minut przy 450 g Komórki na granicy faz zebrano i przemyto raz w PBS. Komórki T izolowano przez inkubację PBMCs z 150-krotnym AET-SRBS (czerwone krwinki owcy traktowane 0,143 M bromkiem 2-aminoetyloizotiouroniowym (Sigma)) przez 5-10 minut, w lodzie. Rozetę E pozytywnych komórek T (E⁺-komórek T) oddzielono od pozostałych komórek przez podłożenie zimnego LSM i wirowanie przy 450 g przez 25 minut. Grudki (zawierające komórki T uformowane w rozetkę) zebrano, a krwinki czerwone owcy poddano lizie zapomocą0,83% chlorku amonu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Otrzymane komórki T przemyto raz w 2% FCS-Iscove'a i inkubowano przez noc w 10% FCS-Iscove'a przy 1-3 χ 10⁶ komórek/ml w nawilżonym inkubatorze 37°C/6% CO₂. Komórki T aktywowano następnie, dodając 10 ng/ml 13-octanu 12-mirystynianu forbolu (PMA) (Sigma) i 1 pg/ml jonomycyny (Sigma) i dalej inkubując komórki przez 5-6 godzin. Część komórek T nie otrzymało PMA i jonomycyny lecz inkubowano je przez dalsze 5-6 godzin i są tu przedstawione jako komórki T nieaktywowane. Przeprowadzono pośrednią immunofluorescencję i analizę FACS mAb przeciw ludzkiej gp39 na tych aktywowanych i meaktywowanych komórkach T, jak opisano wcześniej dla analizy FACS przeciwciał anty-gp39 na komórkach BMS-10 z wyjątkiem tego, że jako odczynnika drugiego etapu użyto znakowanej FITC koziej IgG przeciw mysiej (Becton Dickinson). Dodatkowo użyto przeciwciała monoklonalnego mysiego przeciw ludzkiego CD69 (Becton Dickinson), jako pozytywnej próby kontrolnej przy aktywacji komórek T. W ten sposób przebadano wszystkie mAb anty-gp39. Okazało się, że wszystkie barwiły aktywowane komórki T i dalej okazały się być kompletnie niereaktywne z niereaktywowanymi komórkami T.

Przykład VI

Konstrukcja zmutowanych białek połączonych gp39

A. Selekcja reszt gp39, będących obiektem substytucji:

Reszty, będące obiektami mutagenezy gp39, wyselekcjonowano na podstawie poprzednio wyprowadzonego białkowego modelu porównawczego zewnątrzkomórkowego regionu gp39 (Aruffo i in., 1993 Celi 72, 291-300), na podstawie opartych o strukturę uszeregowań sekwencji gp39 przeciw TNF-β i na podstawie odnotowanych kontaktów krystalograficznych w strukturze kompleksu ΤΝΡ-β/TNFR (Banner i in., 1993 Celi 73,431 -445). Przeprowadzono analizę grafiki komputerowej modelu gp39, przy użyciu Insight II™ (biosym Technologies Inc., San Diego, CA) na stanowisku roboczym Silicon Graphics Indigo™. Sekwencje uszeregowo początkowo, stosując programy GCG (Genetic Computer Group Inc, Madison, WI) i ręcznie modyfikowano, biorąc pod uwagę informacje trójwymiarowe i ograniczenia TNF-β (Eck i in., 1992 J.Biol. Chem 267, 2119-2122) oraz strukturę kryształu ΤΝΡ-β/TNFR (Banner i in„ jak wyżej).

B. Konstruowanie mutantów gp39

Do fragmentów cDNA, kodujących zewnątrzkomórkową domenę gp39, wprowadzono substytucje aminokwasowe i ciche mutacje dla miejsc rozszczepienia diagnostycznych enzymów restrykcyjnych, stosując protokół przedłużenia nakładającego PCR (Ho i in., 1989, Gene 77, 51-59). Sporządzono geny połączone, kodujące zmutowane białka rozpuszczalne gp39 (sgp39), przez podklonmg mutantów zewnątrzkomórkowej domeny gp39 namnożonych drogą PCR, do wektora ekspresji ssaka, zawierającego fragment cDNA, kodujący zewnątrzkomórkową domenę mysiej CD8 (Lyt2a) (Hollenbaugh i in., 1992, EMBO J. 11,4313-4321) Pnmery współbieżne i przeciwbieżne PCR stosowane do konstruowania gp39, opisano poprzednio (Hollenbaugh i in Jak wyżej).

182 868

Pnmerami PCR stosowanymi dla mutantów gp39 są:

E129/A

5'AATCCTCAAAATGCGGCACATGTGATCAGTGCGGCC

AGCA GTAAAACAACA 3' SEQ ID #1

S131/A-T135/A

5' CAAATGCGGCACATGTGATCAGTGAGGCCGCCAG

TAAAACAGCATCTGTGTTACAGTGGGCT 3 ' SEQ ID #2

K143/A

5'AGTAAAACAACATCTGTGCTGCAGTGGGCTGAAGCA GGAY ACTACACCATGAGC3 ’ SEQ ID #3

Y145/A ' AGTAAAACAACATCiTGTGCTGCAGTGGGCTGAAAAA GGAG CCTACACCATGAGCAACACT3' SEQ ID #4,

N180/A

5'CAAGTCACCTTCTGTTCCGCTCGGGAGGCTTCGAGTC /LAG CTCCA3' SEQ ID #5 oraz F201/A-E202/A ' AGCCTCTGCCTAAAGTCCCCCGGGAGAGCCGCGAGA

ATCT TACTCAGAGCT3 SEQ ID #6.

Odpowiadające primery przeciwbieżne są przeciwbieżnymi odpowiednikami sekwencji wypisanych powyżej. Zmiany zasady, które kodują alaninę pokazano czcionką pogrubioną. Diagnostyczne miejsca restrykcji dodane lub usunięte sa podkreślone.

C Wytwarzanie i charakteryzacja białek gp39 dzikiego typu i zmutowanych.

Wytworzono białka gp39 dzikiego typu i zmutowane, z przejściowo transfekowanymi komórkami COS, jak opisano gdzie indziej (Hollenbaugh i in., 1992jak wyżej; Noelle i in., 1992, Proc.Natł.Acad.Sci.USA 89, 6550-6554). Komórki COS transfekowano przy użyciu dekstranu DEAE. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji, supematant hodowlany, zawierający rozpuszczalną gp39 dzikiego typu lub rozpuszczalną gp39 zmutowaną zebrano i użyto w teście, w celu wiązania przeciwciała monoklonalnego i determinacji specyficzności epitopowej ludzkiej gp39

D. Test immunoenzymatyczny dla wiązania przeciwciała monokłonałnego ze zmutowanymi białkami gp39.

Wyniki oznaczeń Western biot wskazują że rozpoznane zostały co najmniej dwa różne epitopy na ludzkim białku połączonym gp39-CD8. Odkryto, że przeciwciała monoklonalne 39-1.29, 39-1.52, 39-1.61,39-1.77, 39-1.93, 39-1.106,39-1.109, 39-1.124, 39-1.124, 39-1.134, 39-1.156,39-7.7G4,39-9.274, 39-9.27,39-7.4C1, 39-9.68 i 39-9.246 wiązały gp-39-CD8 w teście Western biot, natomiast pozostałe przeciwciała nie. W celu określenia dalszych epitopów rozpoznawanych przez wytworzone przeciwciała monoklonalne, każde testowano pod względem wiązania, zapomocątestu ELISA, z seriami zmutowanych białek gp39, zawierających pojedyncze lub podwójne mutacje punktowe, które zamieniają natywną resztę aminokwasową na alaninę.

182 868

Przeprowadzono test ELISA, użyty jak następuje. Płytki Immunol 2E1A powleczono 100 μΐ/studzienkę 0,8 pg/ml roztworu przeciwciała monoklonalnego specyficznego dla mysiej Lyt2 lub 2.1 (53-6(ATCC TIB 105) lub 116.13-1 (ATCC HB 129) dla fuzji 5) rozcieńczonego w 0,05 M buforu węglan sodowy/kwaśny węglan sodowy, pH 9,6. Płytki uszczelniono i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Po inkubacji, niezwiązane przeciwciało usunięto i płytki blokowano przez 1 godzinę z rozcieńczalnikiem wzorowym (Genetic Systems Corporation) rozcieńczonym 1:10 w wodzie dejonizowanej. Po usunięciu środka blokującego, dodano 50 μΐ/studzienkę odpowiednio rozcieńczonych (patrz poniżej) supematantów komórek COS, zawierających białko połączone gp39-CD8 dzikiego typu lub zmutowane, albo negatywną próbę kontrolną białka połączonego sCD72. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej, białka połączone usunięto, a płytki przemyto raz 200 μ/studzienkę PBS-Tween. Supematanty hodowlane, zawierające przeciwciała specyficzne wobec gp39 rozcieńczono odpowiednio (patrz poniżej) w 10% FCS-Iscove'a i dodano każdego (50 μΐ/studzienkę), w podwójnej kopii, do studzienek, zawierających każde z białek połączonych gp39 lub próby kontrolnej. Jako próbę kontrolną do każdej studzienki, zawierającej inne białko połączone, dodano 50 μΐ/studzienkę biotynylowanej szczurzej CD8 anty-mysiej (patrz poniżej), w celu potwierdzenia, że prawie równe ilości każdego białka połączonego, by obecne we wszystkich studzienkach. Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej, usunięto niezwiązane przeciwciała, a płytki przemyto raz PBS-Tween. Dla przeciwciał z fuzji 1, 7 i 9, szczurzą IgG anty-mysią znakowaną HRP (Zymed) i znakowaną HRP streptoawidynę (Yector Laboratories), rozcieńczono odpowiednio w odczynniku blokującym i dodano, w ilości 50 μΐ/studzienkę, do studzienek, które poprzednio otrzymały odpowiednio, przeciwciało anty-gp39 i anty-mysie CD8. Dla przeciwciał z fuzji 5, dodano znakowaną HRP mysie IgG anty-szczura (Jackson ImmunologicalLaboratories) rozcieńczone 1:40 000 w odczynniku blokującym. Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, odczynniki znakowane HRP usunięto, a płytki przemyto trzy razy PBS-Tween. Opis związanych odczynników znakowanych HRP i pomiar uzyskanej gęstości optycznej był taki jak opisano w innym teście ELISA wyszczególnionym powyżej.

Dwa ważne parametry powyższego testu miały zademonstrować, że na płytkach testowych użyto (to jest związano) podobnych ilości każdego z różnych białek połączonych oraz że użyto nie nasycających stężeń pzeciwciał anty-gp39 tak, że odczyty gęstości optycznej wypadły wewnątrz liniowej części krzywej odpowiedzi. Aby znormalizować ilość białka połączonego we wszystkich studzienkach, oceniono seryjne rozcieńczenia każdego supematantu komórek COS, zawierającego białko połączone, w oznaczeniu opisanym powyżej, i do końcowego oznaczenia wybrano każde rozcieńczenie, które dawało wartość gęstości optycznej w liniowej części krzywej odpowiedzi (zwykle między 0,3 i 0,9 jednostek absorbancji), która zawierała się±10% obserwowanej dla sgp39 dzikiego typu, przy śledzeniu biotynylowaną szczurzą CD8 anty-mysią po czym streptoawidyną znakowaną HRP. Optymalne rozcieńczenie każdego supematantu, zawierającego przeciwciało, które miało być użyte w końcowym oznaczeniu, określono przez oszacowanie seryjne rozcieńczeń każdego supematantu z białkiem połączonym sgp39 dzikiego typu, w teście ELISA opisanym powyżej. Jako optymalne rozcieńczenie określono to, dla którego następne dwukrotne rozcieńczenie dało wzrost uzyskanej wartości gęstości optycznej. Rozcieńczenie optymalne, a także jego dwa seryjne dwukrotne rozcieńczenia, oszacowano w teście końcowym dla każdego z białek połączonych, jak opisano powyżej.

Reaktywność każdego z mAb anty-gp39 dla każdego z sześciu zmutowanych białek połączonych sgp39 ukazano w tabeli 2. Wartości przedstawiają intensywność wiązania dla każdego mutanta, w stosunku do obserwowanej dla dzikiego typu (wyrażone jako procent) i przedstawiają przeciętną z podwójnych określeń ± standardowy błąd średniej (SEM). Ukazano tylko dane z tych oznaczeń, w których ilości różnych białek połączonych na płytkach testowych, były rzeczywiście podobne (jak ukazano przez śledzenie anty-CD8) i które uzyskano przy stężeniu mAb anty-gp39 nie nasycającym (zwykle dwukrotne rozcieńczenie rozcieńczenia optymalnego jak określono powyżej).

182 868

W oparciu o całkowite podobieństwo profilu wiązania dla każdego z mutantów gp39, połączonego z wynikami Western biot, 32 mAb anty-gp39 podzielono na 12 grup. Każdą grupę charakteryzuje unikatowy model wiązania, który sugeruje, że rozpoznawany epitop w każdej grupie przeciwciał jest inny. Grupa 1, składająca się z mAb 39-1.3, 39-1.21, 39-1.25, 39-1.63, 39-1.122, 39-1.123 i 39-1.138 ma zauważalny defekt w rozpoznawaniu mutantów E129/A i S131/A-T135/A. Te mAb przedstawiają także nieco mniej głęboki niedobór wiązania dla mutanta KI 43/A. Reaktywność tych mAb z mutantami Y145/A, NI 80/A i F201/A-E202/A jest podobna do gp39 dzikiego typu. Grupa 2 reprezentowana jest przez pojedynczy mAb, 39-1 59 Przeciwciało to jest podobne do tych z grupy 1 ze względu na silnie zredukowane wiązanie z mutantami E129/A, S131/A-T135/A i KI43/A lecz różni się w tym, że wykazywało także nieco słabsze wiązanie dla mutantów Y 145/A, NI 80/A i F201/A-E202A. Przeciwciało w grupie 3 (39-1.37 i 39-1.132) i grupie 4 (39-1.124 39-1.156) są całkiem podobne do siebie w tym, że rozpoznawały mutanta E129/A całkiem słabo i wykazały głęboki niedobór wiązania dla mutanta K143/A. Reaktywność tych mAb z innymi mutantami była albo trochę słabsza albo równoważna z obserwowanąu gp39 dzikiego typu. Grupy 3 i 4 wyraźnie różnią się jedna od drugiej, jednak jak wskazują rozbieżne wyniki obserwowane w analizie Western biot, gdzie 39-1.37 i 39-1.132 są negatywne, natomiast 39-1.124 i 39-1.156 są pozytywne. Przeciwciała w grupie 5 obejmują 39-1.7,39-1.128 i 39-1.26. Są one podobne do mAb w grupach 3 i 4 w tym, że demonstrują porównywalną utratę wiązania dla mutanta K143/A lecz różnią się jak tego dowodzi lepsze rozpoznawanie mutanta E129/A. Wiązanie tych przeciwciał z mutantami S131/A-T135/A, Y145/A, N180/A i F201/A-E202/A było zasadniczo równoważne z obserwowanym dla dzikiego typu gp39. grupa 6, składająca się z mAb 39-1.52, 39-1.61, 39-1.77, 39-1.93 39-1.106, 39-1.109 i 39-1.134 są odróżniane od innych mAb anty-gp39 przez prawie całkowity brak reaktywności z mutantem F201/A-E202/A. W dodatku te przeciwciała demonstrowały ostateczną, chociaż nie istotne zmniejszenie w reaktywności dla mutanta K143/A. Reaktywność tej grupy przeciwciał z innymi mutantami w grupie była podobna do obserwowanej dla gp39 dzikiego typu. Grupa 7 obejmuje pojedyncze przeciwciało, 39-1.29. To mAb jest bardzo podobne do tych z grupy 6 z wyjątkiem tego, że okazało się, że rozpoznaje mutanta K143/A prawie tak dobrze jak dzikiego typu gp39. Pojedyncze przeciwciało, 39-7.2E12 reprezentuje grupę 8. To przeciwciało jest zauważalnie różne od wszystkich innych prze to, że reagowało z wszystkimi mutantami całkiem dobrze z lekką utratą reaktywności dla mutanta KI43/A w porównaniu z gp39 dzikiego typu [Dołączyć omówienie grup 9-12].

Grupa 9 składa się z pojedynczego przeciwciała, 39-5.6E9. To przeciwciało wykazuje podobną zachłanność wiązania z mutantem E129/Ajak obserwowana dla gp39 dzikiego typu i nieco zredukowanązachłanność wiązania dla mutantów S131/A-T135/A, N180/A i F201/A - E202/A niz obserwowana dla gp39 dzikiego typu. Tym, co odróżnia tę grupę od innych jest słaba zachłanność wiązania w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu dla mutantów KI43/A i Y 145/A. To przeciwciało było także niezdolne do wiązania z gp39 w teście Western biot.

Grupa 10 zilustrowana przez przeciwciała 39-7.7G4,39-9.27,39-7.4Cl,39-9.68 i 39-9.246 charakteryzuje się podobną lub nieco zredukowaną zachłannością wiązania z wszystkimi mutantami w porównaniu z zachłannością wiązania dla gp39 dzikiego typu. Wszystkie przeciwciała były także zdolne do wiązania w teście Western biot.

Grupy 11 i 12, przeciwciała 39-9.11 i 39-9.274 są podobne w modelu reaktywności dla zmutowanych białek gp39, lecz różnią się zdolnością wiązania gp39 w teście Western biot. Przeciwciało 39-9.11 było niezdolne do wiązania gp39, natomiast 39-9.274 wiązało w teście Western biot. Model reaktywności obu przeciwciał dla zmutowanych białek gp39 charakteryzował się podobieństwem do gp39 dzikiego typu dla E129/A, S131/A-T135/A, Y145/A i F201/A-E202/A. Zachłanność wiązania była nieco zredukowana dla mutanta KI43/A w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu i słaba dla mutanta NI80/A.

Razem, dane reaktywności mutanta gp39 połączone z wynikami Western biot, określające najmniej 12 różnych profili rozpoznania, a więc 12 różnych specyficzności epitopowych wśród 32 mAb anty-ludzkich gp39. Jak określono powyżej, okazało się, że mAb w grupach 1,2, 3, 5, 8, 9111 rozpoznająepitopy, które sąnieciągłe lub konformacyjne w charakterze, natomiast specyficzność w grupach 4,6,7,10112 okazała się specyficzna dla nieciągłych lub liniowych sekwencji gp39.

182 868

Tabela 2

Skrótowe zestawienie przeciwciał monoklonalnych anty-ludzkich gp39

Grupa przeciwciała	Przeciwciało	Izotyp	Reaktywność przeciwciała z mutantami punktowymi gp39
El 29/A	S131/A T135/A	K143/A	Y145/A	N180/A	F201/A E202/A	Western biot
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1	39-1 3	G1	2 ±0,3	8± 1,7	27 ± 0,8	109 ±2,9	87 ±5,3	106 ±3,4	-
39-1 21	G1	11 ± 0,4	13 ±0,2	61 ±6,9	142 ± 11,9	126 ± 13,6	103 ± 1,1	-
39-1.25	G1	0±0,8	7± 1,2	63 ± 8,8	135 ±0,3	124 ±7,7	114 ±8,4	-
39-1.63	G1	12 ± 3,1	14 ± 1,8	26 ± 0,6	122 ± 1,5	98 ± 9,2	84 ± 10,5	-
39-1.122	G2b	4 ±0,9	4± 1,8	60 ± 7,9	109 ± 17,7	83 ± 11,2	88 ±9,3	-
39-1.23	G1	16 ± 1,4	22 ± 0,0	59 ± 0,7	95 ±3,8	114 ±31,0	101 ±2,1	-
39-1.138	G1	-4 ± 0,2	-3 ± 0,7	54 ± 3,5	116 ± 7,1	99 ± 4,3	124 ±6,6	-
2	39-1.59	G1	4 ±3,5	14 ± 1,0	38 ±4,1	74 ± 6,9	55 ±6,8	59 ± 7,4	-
3	39-1.137	G1	8 ±0,2	97 ± 4,4	6 ±0,1	111 ±5,9	98 ± 11,2	90 ± 8,5	-
	39-1.132	G2b	23 ±2,1	77 ± 0,6	5 ±0,6	94 ± 4,2	82 ± 0,2	93 ± 11,2	-
4	39-1 124	G1	25 ± 1,2	69 ± 6,7	4 ±0,7	90 ± 9,3	75 ± 1,5	85 ± 2,0	4-
	39-1 156	G1	31 ±0,8	84 ± 16,7	8± 1,0	100 ± 25,6	73 ± 10,7	75 ±2,5	+
5	39-1.7	G2b	70 ± 2,9	89 ± 0,5	5 ±0,1	106 ±4,3	93 ± 1,4	112 ±5,0	-
	39-1.128	G2b	52 ± 0,0	116 ±6,6	7 ± 1,8	123 ±5,6	133 ±23,1	102 ±4,7	-
	39-1 26	G1	96 ± 3,7	103 ± 6,3	6 ±0,3	128 ± 1,9	137 ± 16,3	111 ± 4,3	-
6	39-1.52	G1	124 ±0,6	109 ± 6,8	68 ± 3,0	148 ± 15,8	144 ±7,5	1 ±0,9	4-
39-1.61	G1	94 ± 4,6	81 ±0,1	53 ±3,0	92 ± 2,4	92 ±3,1	0±0,5	4-
39-1.77	G1	128 ±35,0	117± 21,5	75 ± 10,3	122 ± 22,8	147 ± 2,6	3 ±1,0	4-
39-1 93	G1	99 ±2,1	81 ±6,5	46 ± 3,6	103 ± 8,9	114± 11,4	6± 1,1	+
39-1.106	G1	130± 10,6	113 ±6,0	52 ± 16,6	124 ± 1,5	144 ±25,1	9± 1,3	4-
39-1.109	G1	96 ± 1,8	72 ± 0,6	54 ± 8,5	108 ± 13,6	82 ± 7,9	4 ±4,5	4-
39-1.134	G1	109 ±0,8	79 ± 0,0	53 ± 3,2	98 ± 4,6	82 ± 7,7	3 ±0,2	4-
7	39-1.29	G2a	109 ± 14,5	105 ±7,1	91 ±0,6	125 ± 10,6	122 ±2,2	1 ±0,2	+
8	39-7.3E12	G2a	102 ± 1,1	82 ±5,5	67 ± 3,0	114 ±6,4	99 ± 5,8	94 ± 1,3	-
9	39-5.6E9	G2a	101 ±9,3	65 ± 3,0	3 ±6,0	20 ± 1,9	54 ± 4,5	49 ± 3,7	-
10	39-7.7G4	G2a	87 ± 0,5	73 ± 5,0	55 ±5,5	95 ±5,1	84 ± 6,9	61 ±2,0	4-
	39-9.27	G1	117 ±26,5	89 ± 13,5	60 ± 10,6	139 ±6,9	63 ± 0,3	88 ± 1,2	4-
	39-7.4C1	G2b	100 ±0,7	89 ± 8,8	64 ±3,4	116 ±0,0	11 ± 7,0	81 ±5,7	4-
	39-9.68	G2b	93 ± 17,3	78 ± 7,9	78 ±4,7	85 ±3,5	81 ±0,8	79 ± 10,0	4-

182 868 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	39-9 246	G1	118 ±4,9	100 ±5,4	80 ±5,3	117 ± 11,2	124 ±23,5	101 ±3,1	+
11	39-9 11	G1	88 ±4,8	84 ± 11,1	58± 1,1	118 ±6,8	8± 1,8	89 ±5,5	-
12	39-9.274	G1	107 ± 0,8	100 ±9,1	67 ± 5,9	129 ± 17,8	20 ± 2,2	130 ± 1,2

* Średnia ± SD trzech niezależnych doświadczeń

Przykład VII

Inhibicj a proliferacj i komórek B zależnych od komórek T i wytwarzania immunoglobuhn

Aktywowane komórki T mogą indukować komórki B w stanie spoczynku, do proliferacji i różnicowania w komórki wydzielające immunoglobuliny. Ponadto, zetknięcie komórkowe aktywowanych komórek T z komórkami B, wymagane jest do tego, aby komórki B przestawiły się z wytwarzania IgM na wytwarzanie IgG, IgA lub IgE. Jako, że interakcja między CD40 i jej hgandem uważana jest za odgrywaj ącąkrytyczną rolę w tym procesie, przewidywano, że przeciwciała monoklonalne anty-gp39 byłyby zdolne do zakłócania tych postaci komórek T „pomocniczych”.

Wpływ hamujący przeciwciał monoklonalnych anty-gp39 na aktywację i różnicowanie ludzkich komórek B, oceniono w układzie testów in vitro proliferacji i syntezy immunoglobuhn komórek B zależnych od komórek T. W tym układzie (Hirohata i in., 1988, J.Immunol. 140, 3736-3744), aktywowane komórki T indukują aktywację komórek B, proliferację i produkcję poliklonalnych przeciwciał (IgG, IgM i IgA) w sposób nie ograniczony przez MHC i nie specyficzny wobec Ig. Aby obserwowane dla komórek B zdarzenia miały miejsce, wymaga to bezpośredniego kontaktu komórek B i T, i uważa się, że przedstawiony system in vitro,}^X odpowiedni do badania interakcji komórek B/komórek T, prowadzących do wytwarzania Ab.

W skrócie, komórki jednojądrzaste (PBMCs) z ludzkiej krwi, izolowano przez rozcieńczenie całkowitej krwi PBS 1:1, nałożenie 25 ml na 10 ml pożywki do separacji limfocytów (LSM, Organon, Teknika) i wirowanie przez 25 minut przy 450 g. Komórki na granicy faz zebrano i przemyto raz PBS. Izolowane komórki rozcieńczono do 5 x 10⁶/ml w 2% FCS-Iscove'a, zawierającym 0,25 M wodorobromku estru metylowego L-leucyno-Leucyny (Leu-LeuOmE, Sigma) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 munut, aby zabić monocyty i komórki NK (Ohlin i in., 1989, Immunology 66, 485-490). Traktowane komórki przemyto dwukrotnie 2% FCS-Iscove'a przed separacją komórek T i B.

Komórki T izolowano przez inkubowanie komórek traktowanych Leu-LeuOMe ze 150-krotnym AET-SRBC (krwinki czerwone owcy traktowane 0,143 M bromkiem 2-aminoetyloizotiouroniowym (Sigma) przez 5-10 minut, w lodzie. Rozetę E pozytywnych komórek T (E⁺ - komórek T) odseparowano od pozostałych komórek przez podłożenie zimnym LSM i wirowanie przy 450 gprzez 25 minut. Grudki (zawierające komórki T w postaci rozety) zebrano i krwinki czerwone owcy poddano lizie 0,83% chlorkiem amonu przez 5 minut, w temperaturze pokojowej. Uzyskane komórki T przemyto raz w 2% FCS-Iscove'a. Komórki te traktowano następnie mitomycyną C (5 x 10⁶ E⁺-komórek T i 40 pg mitomycyny C/ml) przez 40 minut, w temperaturze 37°C, a następnie przemyto trzy razy 2% FCS-Iscove'a. Komórki B otrzymano z granicy rozdziału faz rurek, w których E⁺-komórki T izolowano od AET-SRBC traktowanych PBMCs przez wirowanie na podkładce LSM (opisanej powyżej). Komórki te przemyto raz w 2% FCS-Iscove'a i ponownie przeprowadzono w rozetę za pomocą AET-SRBC jak opisano powyżej, aby usunąć jakiekolwiek pozostałości komórek T i znów wirowano na podkładce LSM. Komórki na granicy rozdziału faz zebrano, przemyto raz w 2% FCS-Iscove'a i omówiono tu jako komórki B.

Płytki Costar o 96 studzienkach powleczono 50 μΐ/studzienkę 2 pg/ml roztworu przeciwciała monoklonalnego anty-CD3 64.1 (Hansen i in., In Leucocyte Typing, Springer-Verlag, Inc.

182 868 str. 195-212 (1984) w pożywce Iscove'a pozbawionej surowicy, przez minimum cztery godziny, w temperaturze pokojowej. Nadmiar przeciwciała aspirowano ze studzienek i do każdej studzienki dodano 100 000 komórek T traktowanych mitomycynąC i 2000 komórek B dwukrotnie przeprowadzonych w rozetę, w całkowitej objętości 150 μΐ pożywki do hodowli (pożywka Iscove'a modyfikowana przez Dulbecco, uzupełniona 10% FCS). Supematanty zebrane z hybrydom, produkujących przeciwciało monoklonalne anty-gp39 albo negatywne przeciwciało monoklonalne kontrolne, dodano następnie do każdej z trzech studzienek, 100 μΐ/studzienkę. Dodatkowe studzienki otrzymały taką samą objętość tylko pożywki do hodowli. Po sześciu dniach hodowli w temperaturze 37°C, w inkubatorze, zawierającym 6% CO₂, każdy z zestawu potrójnych studzienek, oszacowano pod względem proliferacji komórek B i całkowitej ilości ludzkich IgG i IgM.

Proliferację komórek B zmierzono przez pobór tymidyny irytowanej. Po usunięciu 100 μΐ/studzienkę supematantu dla zanalizowania IgG i IgM (patrz poniżej, do każdej studzienki dodano 50 μΐ pożywki hodowlanej, zawierającej 1 pCi [³H]-tymidyny (New EnglandNuclear). Po dalszych 18 godzinach hodowli w temperaturze 37°Ć, płytki zamrożono, odmrożono i komórki zebrano na maty filtrujące z włókna szklanego, za pomocą urządzenia do zbierania pełnych płytek komórkowych Tomtec. Przyłączenie [³H]-tymidyny zmierzono za pomocą licznika scyntylacyjnego dla płynów LKB Wallace Beta-Plate. Zliczenia z potrójnych studzienek uśredniono i przedstawiono w tabeli 3 jako procent ± 1 SD wartości obserwowanych dla studzienek kontrolnych tylko z pożywką.

Ludzkie IgG i IgM oceniono ilościowo przez powleczenie płytek Immulon 2EIA (Dynatech) 100 μΐ/studzienkę roztworu 1 pg/ml koziej IgG anty-ludzkiej (Southern Biotechnology Associates) w 0,05 M buforze węglan sodu/kwaśny węglan sodu, pH 9,6. Płytki uszczelniono i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Nadmiar przeciwciała usunięto i płytki blokowano w teście Elisa jak opisano wcześniej. Po blokowaniu, wszystkie studzienki otrzymały 50 μΐ/studzienkę 2ΧΡΤΒ (2XPBS, zawierający 2% albumin z surowicy bydlęcej (Intergen) i 1% Tween 20)). Supematanty hodowlane rozcieńczone pożywką hodowlaną 1:10 (dla analizy IgG) i 1 40 (dla analizy IgM) dodano do studzienek, w ilości 50 μΐ/studzienkę, i inkubowano przez jednągodzinę w temperaturze pokojowej. Rozcieńczenia te wywnioskowano w poprzedzających doświadczeniach, przy użyciu seryjnych rozcieńczeń supematantów ze studzienek, zawierających tylko pożywkę hodowlaną i wybierając to rozcieńczenie(a), które uzyskało optymalne wartości gęstości, bliskie górnej granicy najbardziej liniowej części krzywej odpowiedzi dla IgG i IgM. Supematanty usunięto, płytki przemyto dwa razy PBS-Tween i do odpowiednich studzienek dodano znakowane HRP kozie IgG lub IgM anty-ludzkie (Jackson Immunological Laboratories) i stosowanie rozcieńczone 1 x PTB (2 x PTB rozcieńczone 1:1 PBS), 100 μΐ/studzienkę. Po jednej godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej, odczynniki znakowane HRP usunięto i płytki przemyto trzy razy PBS-Tween. Opis związanych odczynników znakowanych HRP i pomiar uzyskanej gęstości optycznej opisano w innym teście ELISA, wyszczególnionym powyżej Wartości gęstości optycznej i potrójnych studzienek uśredniono i przedstawiono w tabeli 3 jako procent ± 1 SD wartości obserwowanych dla studzienek kontrolnych, zawierających tylko pożywkę

Jak ukazano w tabeli 3, każde z testowanych przeciwciał monoklonalnych anty-gp39 było zdolne do znacznego hamowania proliferacji komórek B wywołanej przez komórki T, co dało w wyniku wartości tylko 2-4% wartości obserwowanych w studzienkach, które nie otrzymały przeciwciała specyficznego dla gp39 Jednocześnie, wytwarzanie IgG i IgM było także istotnie zahamowane.

Hamujący wpływ różnych przeciwciał monoklonalnych anty-gp39 na produkcję immunogobuhn przez ludzkie komórki B zależne od komórek T, badano dalej w sposób bardziej ilościowy, z użyciem określonych stężeń oczyszczonego przeciwciała. Przeciwciała oczyszczono przez powinowactwo, z supematantów hodowlanych na kolumnach Protem A Sepharose lub Gamma Bind Plus Sepharose (Pharmacia), zgodnie z instrukcjami producenta, i oceniono ilościowo przez absorbancję gęstości optycznej, przy użyciu współczynnika ekstynkcji 1,4. Doświadczenia przeprowadzono jak opisano powyżej z następującymi modyfikacjami. Wykorzystano połowę powierzchni płytek Costar o 96 studzienkach, a stężenie przeciwciała anty-CD3 użytego do powleczenia studzienek, wynosiło 4 pg/ml. Wszystkie studzienki otrzymały 150 000 komórek T

182 868 traktowanych mitomycynąC i 20 000 komórek B, w całkowitej objętości 100 μΐ pożywki do hodowh. Przeciwciała anty-gp391 kontrolne negatywne, rozcieńczono do 60,6 i 0,6 pg/ml w pożywce do hodowli i do każdej z trzech studzienek dodano 50 μΐ każdego rozcieńczenia, aby otrzymać końcowe stężenie każdego przeciwciała w studzienkach do hodowli, wynoszące 20,21 0,2 pg/ml. Studzienki kontrolne otrzymały 50 μΐ/studzienkę tylko pożywki hodowlanej Komórki hodowano przez całkowity okres 10 dni w inkubatorze o 37°C/6% CO₂, w którym to czasie supematanty z potrójnych studzienek zlano i oszacowano pod względem całkowitej ilości ludzkiej IgG i IgM. Pomiar ludzkiej IgG i IgM był taki jak opisano powyżej, z wyjątkiem tego, że każdy zlany supematant oznaczono trzykrotnie, supematanty rozcieńczono w 2% FCS-Iscove'a do znacznie wyższych rozcieńczeń, dających dłuższy okres hodowli komórek (i przez to produkcję przeciwciał), studzienki na płytkach do oznaczenia nie otrzymały 2 x PTB przed dodaniem rozcieńczonych supematantów, a odczynniki HRP rozcieńczono w buforze blokującym.

Tabela 3

Supresja in vitro proliferacji komórek B i wytwarzania przeciwciał przez mAb przeciw ludzkiej gp39

mAb	Przyłączenie [³H]-tymidyny (% pożywki kontrolnej)	Wytworzona IG (% pożywki kontrolnej)
		IgM	IgG
39-1 3	3,5 ± 0,7	33,5 ±15,4	60,2 ± 3,6
39-1 7	3,3 ±0,5	13,9 ± 9,1	31,8 ±9,6
39-1 26	2,1 ±0,1	10,0 ±3,7	24,0 ± 8,3
39-1 29	3,9 ± 0,7	43,4 ± 11,4	39,8 ± 6,4
39-1 37	2,4 ± 0,2	20,2 ±4,1	44,8 ± 10,9
39-1 61	3,4 ± 0,6	10,6 ±4,6	32,2 ± 15,0
39-1.77	2,1 ±0,6	11,7 ±2,1	41,9 ±2,1
39-1.106	2,9 ± 0,3	17,9 ±4,9	28,6 ±8,3
39-1.124	3,5 ± 0,6	17,0 ±5,7	36,5 ± 16,9
39-1 128	3,1 ±0,5	21,7 ±9,5	53,3 ± 6,2
39-1.132	3,3 ± 0,4	13,0 ±4,7	50,1 ±2,0
39-1 134	2,3 ± 0,8	12,5 ±4,1	33,5 ± 10,2
39-1 156	2,7 ±0,1	12,2 ±4,8	26,9 ± 5,6
Kontrola negatywna	87,9 ± 7,9	87,9 ± 13,8	114,9 ±28,5

Dane z tych doświadczeń przedstawiono w tabeli 4. Przy najwyższym stężeniu użytego przeciwciała, wynoszącym 20 pg/ml, wszystkie przeciwciała anty-gp39 istotnie hamowały produkcję zarówno IgG jak i IgM. Przy tym stężeniu, poziomy wytworzonego ludzkiego przeciwciała wynosiły zasadniczo 10-30% poziomu obserwowanego tylko w obecności pożywki. Gdy wzrastało stężenie przeciwciała anty-gp39, wzrastał również zwykle, poziom inhibicji Przy dwóch najniższych stężeniach użytych przeciwciał anty-gp39, wynoszących 2 i 0,2 pg/ml, było całkiem jasne, że pewne przeciwiała anty-go39, włączając zwłaszcza 39-1.7, 39-1.26, 39-1.77, 39-1.106, 39-1.134,39-7.3E12139-5.6E9 były znacznie bardziej efektywne w hamowaniu produkcji ludzkiej IgG i IgM niż inne. Ta obserwacja sugeruje, że specyficzność epitopowa i/lub zachłanność przeciwciała jest ważnym parametrem dla stopnia, w jakim przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw gp39, mogą zakłócać interakcję z gp39-CD40.

182 868

Tabela 4

Porównanie supresji wytwarzania przeciwciał przez komórki B in vitro i przeciwciał monoklonalnych przeciw ludzkiej gp39

Przeciwciało monoklonalne	____________Inhibicja syntezy przeciwciała in vitro % pożywki kontrolnej ± SD*
IgG	IgM
20 pg/ml	2 μg	0,2 pg/ml	20 pg/ml	2 pg/ml	0,2 pg/ml
39-1 3	9±7	53 ± 16	91 ±7	23 ±3	63 ± 17	94 ± 15
39-1 122	13 ± 1	28 ±6	70 ± 12	20 ±23	60± 18	84 ±6
39-1 138	21 ±4	60 ± 14	90 ±9	29 ±23	91 ±29	101 ±22
39-1 59	21 ±6	57 ± 10	85 ±22	34 ±25	82 ±35	84 ± 13
39-1.37	18 ± 4	39 ±23	74 ± 16	26 ± 16	62 ± 14	91 ± 12
39-1.132	11 ± 1	25 ± 17	66 ± 10	23 ±24	60 ±20	102 ±23
39-1.124	11 ± 1	20 ±8	54 ±20	21 ±28	47 ±31	76 ± 13
39-1 156	11 ±6	15 ± 13	43 ±22	14 ± 6	28 ± 10	81 ±8
39-1.7	17 ± 8	12 ± 7	34 ± 19	20 ±6	27 ± 12	58 ± 15
39-1 128	19 ± 1	19 ± 3	55 ± 18	26 ± 11	46 ±22	85 ±21
39-1 26	22 ± 18	15 ± 9	41 ± 14	26 ± 13	27 ±28	78 ±2
39-1 77	11 ±6	16 ± 5	38 ± 16	23 ±39	28 ±24	68 ±34
39-1 106	8±2	11 ±5	21 ± 12	27 ±23	22 ±21	41 ± 14
39-1 134	10±4	15 ± 5	28 ±7	23 ± 13	27 ±26	65 ±32
39-1.29	10± 1	13 ± 3	49 ±23	23 ± 16	37 ± 11	86 ±9
39-7 3E12	9± 1	12 ± 4	37 ± 16	11 ±2	18± 16	72 ± 10
39-5 6E9	16±4	11 ±5	20 ± 15	27 ±4	14± 12	33 ± 5
39-7 7G4	12 ± 1	10 ± 6	57 ± 10	19 ±3	27 ±25	80 ± 14
39-9.11	30 ±6	31 ± 17	72 ± 16	75 ±35	74 ±23	105 ±40
39-9 274	8± 1	14 ±6	81 ± 17	7±8	38± 19	77 ±8
39-9.27	13±4	19± 11	79 ±28	28 ± 14	41 ±28	108 ±23
39-7.4C1	13±4	31 ±7	74 ± 19	22 ±8	49 ±27	87 ±4
39-9.68	29 ±8	64 ± 15	91 ± 17	50 ± 17	88 ± 21	114 ± 17
39-9 246	12 ±7	21 ± 6	71 ± 16	29 ± 16	43 ±29	99 ±35

Średnia ± SD z trzech niezależnych doświadczeń, z wyjątkiem danych zebranych przy stężeniu przeciwciała, wynoszącym 20 pg/ml, dla których były tylko dwa doświadczenia.

Przykład VIII

Wykrywanie zmutowanych gp39 u pacjentów z hiper IgM związanym z X.

Przeciwciała monoklonalne z różnymi charakterystykami wiązania ze zmutowaną ludzką gp39, użyto do określenia, czy mutacje punktowe w gp39 możnaby rozpoznać w próbce krwi pobranej od pacjenta z hiper IgM, związanym z X. W tym oznaczeniu, o pacjentach, których komórki wykazywały pozytywne zabarwienie z przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi dla gp39, lecz nie barwiące się z CD40Ig, normalnym ligandem, wiadomo, że wykazują ekspresję proteiny gp39, która nie jest funkcjonalna i których możnaby zdiagnozować jako Χ-ΗΙΜ. Stosowanie zestawu przeciwciał monoklonalnych, ze znanymi różnicami w epitopach, zapewnia większą liczbę różniących się mutacji, które można wykryć w próbce Χ-ΗΙΜ. Stosując to ozna182 868 czenie, me jest całkowicie możliwe wykluczenie powszechnego zmiennego niedoboru odporności jako diagnozy, ale oczekuje się, że znaczny procent pacjentów z Χ-ΗΓΜ możnaby wykryć w taki sposób. Nie można także potwierdzić w ten sposób podgrupy pacjentów z Χ-ΗΙΜ, tych, u których defekt gp39 przejawia się barkiem wewnętrznej ekspresji, spowodowanej np. mutację wczesnego kodonu przestankowego w sekwencji, kodującej gp39.

Krótko, komórki T izoluje się z próbki limfocytów z krwi obwodowej, od pacjenta, przez wirowanie w gradiencie Ficolla, po czym rozetowanie, stosując krwinki czerwone owcy. Barwienie utrwalonych, przenikalnych komórek przeprowadzono przy użyciu metod Junga i in , (J Immunol. Methods 159, 197-207 (1993)) z modyfikacjami, jak opisano.

Izolowane komórki T stymulowano PMA (10 ng/ml) i jonomycyną(lpg/ml) w obecności monenzyny (monensin), o 3 mM przez 3 godziny. Stymulowane komórki przemyto następnie PBS i utrwalono przez inkubowanie w 4% paraformaldehydzie w zrównoważonym roztworze soh Hanka, przez 10 minut, w temperaturze 4°C. Utrwalone komórki przemyto raz PBS, potem uczyniono je przepuszczalnymi i blokowano, inkubując w buforze blokującym (0,1% saponiny, 10% koziego osocza w PBS) przez 10 minut, w temperaturze pokojowej.

Komórki granulowano i ponownie zawieszono w 0,1% saponiny, 2% płodowej surowicy bydlęcej w PBS i sporządzono równe porcje do barwienia, przy gęstości, wynoszącej w przybliżeniu 1 χ 10⁷ komórek/ml. Dodano przeciwciała monoklonalne do stężenia końcowego, wynoszącego 10 pg/ml i komórki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed dwukrotnym przemyciem buforem blokującym i ponownym zawieszeniem w buforze blokującym, zawierającym kozie Fc anty-mysie, sprzężone z FITC. Po dodatkowych 20 minutach mkukacji w temperaturze pokojowej, komórki przemyto dwa razy 2% FCS w PBS i analizowano, za pomocą cytometrii przepływowej.

Jako próbę kontrolnąi do testowania łatwości przeprowadzenia wykrywania gp39 we wnętrzu komórki, izolowano normalne komórki T i traktowano jak powyżej, z wyjątkiem tego, że przed utrwaleniem komórki traktowano przez 5 minut trypsyną, aby usunąć gp39, której ekspresja zachodzi na powierzchni. Potem komórki utrwalono i barwiono jak wyżej. Porównanie barwienia komórek T nieaktywowanych z aktywowanymi, pozwala na zademonstrowanie specyficznego barwienia w normalnych komórkach T.

W tabeli 5 podaj e się krótkie zestawienie barwienia uzyskanego z komórkami T izolowanymi od pacjenta z Χ-ΗΙΜ, przy użyciu przeciwciał monoklonalnych anty-gp39.

Tabela 5

Krótkie zestawienie barwmenia komórek T uzyskanych od pacjenta z Χ-ΗΙΜ, z mAb anty-gp39

Przeciwciało	CD¹	NC²	Western	Izotyp
39-1 3	-	4-	-	G1
39-1 122	-	4-	-	G2b
39-1.138	-	4-	-	G1
39-1.124	-	4-	4-	G1
39-1.7	-	4-	-	G2b
39-1.26	-	4-	-	G2b
39-1 106	4-	4-	4-	G1
39-1 134	4-	4-	4-	G1

'pacjent z Χ-ΗΙΜ CD (Aruffo i in., 1992, Celi 72, 291) ²kontrola normalna

182 868

Przykład IX

Biologiczna aktywność przeciwciał monoklonalnych anty-gp39 u małp Cynomolgus

W tym przykładzie, dwa mysie przeciwciała monoklonalne, wiążące różne epitopy ludzkiej gp39, przebadano pod względem testowania ich zdolności do wiązania z aktywowanymi komórkami T, blokowania wiązania ludzkiej CD40-Ig z aktywowanymi komórkami T oraz hamowania produkcji immunoglobulin zależnych do komórek T, przy użyciu limfocytów z krwi obwodowej, izolowanych z małp Cynomolgus Macaccafascicularis i Macacca nemestrina Wyniki, z użyciem PBL od tych naczelnych, nie będących ludźmi, były podobne do uzyskanych przy użyciu ludzkich PBL, opierając się o użycie makaka jako odpowiedniego modelu zwierzęcego.

Aby przetestować zdolność przeciwciał do wiązania komórek T makaka, komórki jednojądrzaste z krwi obwodowej Macacca nemestrina i Macacca fascicularis (PBMC) izolowano przez rozcieńczenie krwi całkowitej 1:1 w PBS i nałożenie 25 ml na 10 ml 95% pożywki do separacji limfocytów (Organon, Teknika)5% PBS i wirowanie przez 25 minut, przy 450 g, zebrano komórki z granicy faz i przemyto raz w PBS. Komórki T izolowano przez inkubację PBMC w lodzie z 150 x AET-SRBC (krwinki czerwone owcy) traktowane 0,143 M wodorobromku bromku 2-aminoetyloizotiouroniowego (Sigma) przez 5 do 10 minut. Rozetę E pozytywnych komórek T odseparowano przez podłożenie zimnego LSM i wirowanie przy 450 g przez 25 minut. SRBC w grudce poddano lizie przy użyciu 0,83% chlorku amonu, przez 5 minut w temperaturze pokojowej Uzyskane komórki T przemyto i inkubowano przez noc, w 10% pożywce FCS-Iscove'a, przy 1 do 3 χ 10⁶ komórek ml, w nawilżonym inkubatorze, o 37°C/6% CO₂ Potem komórki T stymulowano PMA (Sigma) i jonomycyną(Sigma) w ilości odpowiednio, 10 ng/ml 11 pg/ml, w 10% FCS-Iscove'a, przez 5 do 6 godzin, w nawilżonym inkubatorze, w temperaturze 37°C. 2,5 χ 10⁵ aktywowanych komórek T na rurkę o wymiarach 11 x75 mm, wirowano przy 250 g, przez 5 minut i aspirowano pożywkę hodowlaną.

Supematanty (100 μΐ) zebrane od hodowanych hybrydom, zawierające przeciwciała 106 lub 7, albo negatywne przeciwciało kontrolne, dodano następnie d każdej rurki i inkubowano w lodzie, przez 30 minut. Do każdej rurki dodano dwa mililitry 2% pożywki FCS-Iscove'a i rurki wirowano przy 250 g, przez 5 minut, przed aspirowaniem supematantu. Do każdej rurki dodano znakowane FITC szczurze antysera poliklonalne IgG przeciw mysie (Zymed) rozcieńczone 1 50 w 2% pożywki FCS-Iscove'a, w ilości 100 μΐ/rurkę i inkubowano w lodzie przez 30 minut. Komórki w każdej rurce przemyto dwukrotnie 1 ml 2% pożywki FCS-Iscove'a. Następnie komórki barwiono z mysim, znakowanym fikoerytryną, przeciwciałem monoklonalnym przeciw ludzkim CD4, przemyto i na koniec zawieszono w ilości 250 μΐ/rurkę 2% pożywki FCS-Iscove'a, przed analizą na FACScan Becton Dickmson. Jak można zauważyć w fig. 1, przeciwciała monoklonalne 7 (39-1.7) 1106 (39.1.106) były zdolne do rozpoznawania aktywowanych ludzkich (fig 1A i IB) oraz makakowych (fig. 1 C i ID) komórek T CD4⁺.

Przeciwciała monoklonalne 7 i 106 testowano także pod względem ich zdolności blokowania wiązania białka połączonego CD-40-Ig z aktywowanymi komórkami makaka. Komórki T izolowano i aktywowano jak opisano powyżej. Po aktywacji, do rurek o 11 x 75 mm dodano 2,5 χ 10⁶ komórek T i wirowano przy 250 g przez 5 minut. Pożywkę do hodowli usunięto przez aspirację i potem do każdej rurki dodano 100 μΐ supematantu, zawierającego przeciwciało monoklonalne 7 lub 106 anty-gp39, tylko pożywkę lub kontrolne przeciwciało negatywne, na 30-minutową inkubację w lodzie. Supematanty rozcieńczono potem 2 ml 2% pożywki FCS-Iscove'a, rurki wirowano przy 250 g przez 5 minut i supematanty usunięto przez aspirację. CD40-Ig rozcieńczone do 20 pg/ml w 10% pożywce FCS-Iscove'a dodano następnie do każdej rurki, w ilości 100 μΐ/rurkę i inkubowano przez 30 minut w lodzie. Do każdej rurki dodano dwa ml 2% pożywki FCS-Iscove'a i rurki wirowano przy 250 g przez 5 minut. Supematanty usunięto przez aspiracje i znakowane fikoerytryną lub fluoresceiną kozie Ffab')² przeciw ludzkim IgG(Fc) (Jackson Laboratories) rozcieńczono odpowiednio, 1:5000 lub 1:500 w 10% pożywce FCS-Iscove'a i dodano do komórek. Po 30 minutach inkubacji w lodzie, komórki przemyto dwa razy po 1 ml 2% pożywki FCS-Iscove'a i na koniec zawieszono w 250 μΐ 2% pożywki FCS-Iscove'a na rurkę, przed analizą na FACScan Becton Dickinson. Dane są wykreślone na fig. 2 i przedstawiają, że oba mysie

182 868 przeciwciała monoklonalne 7 i 106 anty-gp39, były zdolne do inhibicji wiązania ludzkiej CD40-Ig z aktywowanymi ludzkimi (fig.2A i 2B) i makakowymi (fig. 2C i 2D) komórkami T

Aby przetestować zdolność przeciwciał monoklonalnych 7 i 106 do blokowania zdolności komórek B do wytwarzania przeciwciał po kontakcie z aktywowanymi komórkami T, komórki jednojądrzaste z krwi obwodowej (PBMC) izolowano od małp Macacca fascicularis jak opisano wyżej.

Frakcję komórek T traktowano mitomycyną C (5 χ 10⁶ komórek t i 40 pg mitomycyny C (Sigma) na ml) przez 40 minut, po czym przemyto trzy razy 10% pożywkąFCS-Iscove'a. Frakcję komórek B (warstwa z pogranicza faz z wirowania na LSM) ponownie rezetowano z użyciem AET-SRBC, aby usunąć jakiekolwiek pozostałości komórek T. Połowę powierzchni 96-studzienkowych płytek (Costar) powleczono 50 μΐ roztworem 4 μΐ/ml przeciwciała anty-CD3 (FN-18,E.A. Ciarki in. 1987, Eur.J.Immunol. 17, 1799-1805) w pożywce Iscove'a wolnej od surowicy, przez minimum cztery godziny, w temperaturze pokojowej. Nadmiar przeciwciała aspirowano ze studzienek i dodano 1,5 χ 10⁵ komórek T traktowanych mitomycyną C i 5 χ 10³dwukrotnie rozetowanych komórek B w 10% pożywce FCS-Iscove'a. Oczyszczone przeciwciała anty-gp39 i kontrolne, rozcieńczono w 10% pożywce FCS-Iscove'a do końcowego stężenia w hodowli, wynoszącego 10, Im 04 i 0,1 pg/ml i dodano do studzienek. Po 10 dniach zlano supematant hodowlany z potrójnych studzienek i oszacowano pod względem całkowitej ilości IgG i IgM makaka.

IgG i IgM makaka oceniono ilościowo jak opisano dla ludzkiej IgG i IgM, z wyjątkiem tego, że supematanty rozcieńczono odpowiednio, 1:640 i 1:40, w celu analizy IgG i IgM Wyniki oznaczenia, gdy użyto stężenia 0,4 pg/ml są widoczne na fig. 3 i są wyrażone jako procent całkowitej ilości IgG i IgM w porównaniu z hodowlami traktowanymi tylko pożywką do hodowli, przy nieobecności przeciwciała. Przeciwciała Exa i IVA7 są kontrolnymi, dopasowanymi izotypami dla przeciwciał monoklonalnych odpowiednio, 106 i 7. Powyższe oba przeciwciała monoklonalne 7il06, były zdolne do inhibicji wytwarzania przeciwciał IgG i IgM zależnych do komórek T, przez komórki B makaka, w sposób bardzo podobny do obserwowanego u komórek ludzkich. Dane te sugerują że małpy Cynomolgus byłyby odpowiednim nie ludzkim modelem zwierzęcym, do ocenienia aktywności in vivo przeciwciał monoklonalnych przeciw ludzkiej gp39

Przykład X

Zdolność mysich przeciwciał monoklonalnych przeciw ludzkiej gp39 do supresji odpowiedzi przeciwciała zależnego od komórek T u małp Cynomolgus.

W tym przykładzie, oceniono trzy białka wiążące gp39, mysie przeciwciała monoklonalne 7il06i ludzkie rekombinowane białko połączone CD40-Ig, pod względem ich zdolności do supresji pierwotnej odpowiedzi przeciwciała zależnego od komórek T na antygeny, po podaniu dożylnym mapie Cynomolgus Macacca fascicularis. Przy nieoptymalizowanym poziomie testowanej dawki, przeciwciało monoklonalne 106 hamowało odpowiedź humoralną demonstrując skuteczność podawania anty-gp39 do supresji odpowiedzi humoralnej zależnej od komórek T, u naczelnych.

Cztery grupy, składające się z jednego samca i trzech samic makaka, traktowano 4 mg/kg przeciwciał monoklonalnych 7 lub 106, lub przeciwciała kontrolnego IGI (specyficznego dla \Aa&a.F Pseudomonas aeruginosa) alboCD40-Ig, w dniu 1,3,5,8,10 i 12 (kurs 1) w dniu 50,52, 54,57,59161 (kurs 2). W dodatku, każde zwierzę immunizowano dożylnie w dniu 1 (immunizacja pierwotna) i w dniu 50 (immunizacja wtórna) 1,7 ml/kg 10% mieszaniny krwinek czerwonych owcy, antygenu zależnego od komórek T. Po eliminacji wszystkich białek wiążących gp39 z surowic zwierząt, poniżej wykrywalnych poziomów, każde zwierzę ponownie immunizowano owczymi krwinkami i równocześnie immunizowano 10 mg/zwierzę neoantygenem hemocyjaniny skałotocza o kształcie dziurki od klucza (keyhole hmpet hemocyanin) (KLH).

Surowicę zbierano przez tydzień i oceniono przeciwciało przeciw krwinkom czerwonym owcy i przeciwciało przeciw KLH (IgG i IgM) testem ELISA. Miana przeciwciał przeciw owczym krwinkom czerwonym oszacowano powlekając płytki Immulon I z membranami SRBC przy stężeniu, wynoszącym 5 pg/ml w PBS i inkubując 12 do 18 godzin w temperaturze 4°C.

182 868

Nadmiar roztworu usunięto i płytki przemyto PBS-Tween. Po myciu, płytki blokowano PBS-Tween, przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej. Próbki surowicy rozcieńczono seryjnie w PBS-Tween i 60 μΐ przeniesiono do każdej studzienki płytki powleczonej antygenem. Rozcieńczone próbki surowicy inkubowano z antygenem przez 1,5 godziny i nadmiar próbki usunięto przed przemyciem płytek PBS-Tween. Do odpowiednich studzienek dodano kozich IgG lub IgM przeciw ludzkiemu fragmentowi F(ab')₂ (Jackson Laboratories) rozcieńczone 1:10 000, w ilości 100 μΐ, i inkubowano przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej. Po inkubacji studzienki przemyto PBS-Tween i dodano tetrametylobenzydynę (Genetic Systems Corporation) rozcieńczoną 1:100 w buforze substratowym (Genetic Systems Corporation). Substrat pozostawiono do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed dodaniem 1 N H₂SO₄, aby zatrzymać reakcję, wartości absorbancji zapisano przy 450 nm/630 nm, przy użyciu czytnika płytek do mikromianowania.

Określono miana przeciwciał wobec KLH w podobnym oznaczeniu jak powyżej. Krótko, płytki Immulon II powleczono KLH (Pacific BioMarine Labs) w ilości 10 μ/ml, w 0,05 M buforze węglan/kwaśny węglan, pH 9,6, przez 12-18 godzin w temperaturze 4°C. Płytki przemyto PBS-Tween i blokowano wzorcowym rozcieńczalnikiem (Genetic Systems Corporation) rozcieńczonym 1:100 wodą destylowaną, przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej. Próbki surowicy rozcieńczono seryjnie czterokrotnie w rozcieńczalniku wzorcowym, poczynając od 1/50. Sześćdziesiąt μ/studzienkę każdego rozcieńczenia próbki przeniesiono na płytki powleczone antygenem i inkubowano przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej. Przeprowadzono resztę oznaczenia, jak opisano powyżej, z wyjątkiem tego, że kozie IgG i IgM przeciw ludzkiemu fragmentowi F(ab')₂ rozcieńczono 1:5000.

Na figurach 4A i 4B przedstawione są dane, które demonstrują, że przy testowanej dawce nieoptymalizowanej, przeciwciało monoklonalne 106 było zdolne do supresji in vivo zdolności makaka do budowania pierwotnej odpowiedzi na owcze krwinki czerwone. Supresja nie była kompletna, ale wynosiła blisko 10 do 15 razy więcej niż obserwowana dla innych testowanych białek blokujących anty-gp39. Po wtórnej immunizacji żadne z białek nie wykazało wyraźnej oznaki supresji, chociaż miana anty-SRBC w grupie traktowanej 106 były znacznie niższe niż w innych traktowanych grupach. Małpy we wszystkich grupach otrzymały 10 ng KLH domięśniowo jako immunizację pierwotną, w dniu 106, w celu zbadania zdolności małp do odpowiedzi na nowy antygen. Fig. 5 ukazuje, że wszystkie grupy małp były zdolne do budowania silnej odpowiedzi na KLH, wykazując, że traktowanie białkami wiążącymi anty-gp39 nie było niespecyficznie immunosupresyjne.

W innym badaniu, przeciwciało monoklonalne 106 przeciw ludzkiej gp39, podano małpom Cynomolgus w ilości 20 mg/kg, w dniu 1,3 i 5. Skojarzone mysie przeciwciało monoklonalne przeciw guzom nowotworowym, L6 ATCC HB 8677 stosowano jako negatywną próbę kontrolną. Wszystkie zwierzęta immunizowano dożylnie w dniu 1, zawiesiną owczych krwinek czerwonych (1,7 ml/kg 10% zawiesiny) tuż przed podaniem testowanego związku. Próbki krwi podano przed podaniem owczych krwinek czerwonych lub mysich przeciwciał monoklonalnych, w dniu 8,15,22,29,36 i 43. Próbki surowicy testowano pod względem mian przeciwciał IgG i IgM, wobec owczych krwinek czerwonych.

Dane z tego doświadczenia, jak widać w tabelach 6 i 7, pokazują, że mysie przeciwciało monoklonalne 106 przeciw ludzkiej gp39, znacznie redukowało zdolność małp do budowania odpowiedzi immunologicznej zależnej od komórek T, wobec owczych krwinek czerwonych. Dane te potwierdzają wyniki doświadczeń przeprowadzonych na myszach z przeciwciałem 106 specyficznym dla mysiej gp39 oraz badania in vitro z małpimi i ludzkimi limfocytami z krwi obwodowej z mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciw ludzkiej gp39.

182 868

Tabela 6

Odpowiedź IgG przeciw krwinkom czerwonym owcy

	Zwierzę #	Płeć	Dawka poprzedzająca	Dzień 8	Dzień 15	Dzień 22	Dzień 29	Dzień 36	Dzień 43
	223	samiec	30’	30	30	10	<10	10	01
Grupa 1	224	samiec	90	90	90	30	90	90	90
mAb 106	225	samica	10	<10	<10	<10	<10	810	2430
	226	samica	10	10	<10	<10	<10	90	90

	227	samiec	10	270	810	810	810	810	270
Grupa 2	228	samiec	30	270	2430	810	810	810	810
mAb L6	229	samica	30	2430	7290	2430	2430	810	810
	230	samica	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND

1. Miana przeciwciał, przytoczone końcowe miano określono jako odwrotność rozcieńczenia, większego niz dwa razy powyżej średniej płytki tła

2. ND, nie wykonano.

Tabela 7

Odpowiedź IgM na owcze krwinki czerwone

	Zwierzę #	Płeć	Dawka poprzedzająca	Dzień 8	Dzień 15	Dzień 22	Dzień 29	Dzień 36	Dzień 43
	223	samiec	90'	810	270	90	30	30	30
Grupa 1	224	samiec	30	810	810	270	270	90	90
mAb 106	225	samica	30	270	90	90	90	2430	2430
	226	samica	90	270	270	270	810	2430	2430

	227	samiec	270	810	2430	810	810	810	270
Grupa 2	228	samiec	30	21870	21870	7290	7290	2430	2430
mAb L6	229	samica	90	7290	7290	2430	2430	2430	810
	230	samica	90	2430	2430	2430	810	810	810

Miana przeciwciał, przytoczone końcowe miano określono jako odwrotność rozcieńczenia, większego niz dwa razy powyżej średniej płytki tła.

Przykład 11. Konstrukcja rekombinowanych regionów zmiennych o pojedynczym łańcuchu anty-gp39.

W tym przykładzie określa się i izoluje sekwencje nukleotydowe łańcucha ciężkiego regionu zmiennego (VH) i lekkiego łańcucha regionu zmiennego (VL) dwóch przeciwciał monoklonalnych przeciw ludzkiej gp39 [39-1.7(7) i 39-1 106(106)]. Fragmenty DNA, kodujące VH i VL każdego z przeciwciał monoklonalnych zmontowano następnie do ciągłych kaset ekspresji, przy użyciu sekwencji interweniujących, kodujących łącznik (Gly₄Ser)₃. Ekspresja tych kaset zachodziła w komórkach ssaków i określała aktywność funkcjonalną cząsteczek rekombinacyjnego przeciwciała o pojedynczym łańcuchu (sFv).

A Izolacja RN A, synteza cDNA i namnożenie PCR

Izolowano RNA z klonu 106 lub klonu 7 5 x 10⁷ komórek hybrydomy, przy użyciu zestawu do izolacji mRNA (Stratagene, LaJolla, CA). cDNA wytworzono z RNA, przy użyciu zestawu StrataStnpt RT-PCR (Stratagene, LaJolla, CA) i primerów antysensownych, specyficznych dla regionów stałych immunoglobuliny. Pnmer specyficzny dla C_K był komplementarny dla sek

182 868 wencji nukleotydowej 228 do 257 mysiego lekkiego łańcucha kappa regionu stałego. Primera tego użyto do pierwszej syntezy łańcucha zarówno klonu 106, jak i klonu 7 VL cDNA. Primera antysensownego, specyficznego dla IgG 1 lub primera antysensownego, specyficznego dla IgG_2bużyto do wytworzenia, odpowiednio, klonu 106 i klonu 7 cDNA VH. Primer antysensowny, specyficzny dla IgG₍ był komplementarny do nukleotydów 100 do 121 regionu CHI mysiej IgG_ba primer antysensowny, specyficzny dla IgG_2b był komplementarny do nukleotydów 101 do 123 regionu CHI mysiej lgG_2b. Pierwszą reakcję łańcucha przeprowadzono przy użyciu 300 ng primera antysensownego i 0,5 pg mRNA.

cDNA oczyszczono przy użyciu GeneClean™ (BiolOl, LaJolla, CA) i następnie wytwarzano ogonki o wielu G, za pomocą 10 mM dGTP i terminalnej deoksynukleotydylotransferazy (Stratagene) przez 1 godzinę, w temperaturze 37°C. cDNA z ogonkami o wielu G oczyszczono znów stosując GeneClean™. Dwa μΐ każdego cDNA namnożono przez PCR kotwiczącą(Saiki i in., 1988 Science 239,487-491) w całkowitej objętości 100 μΐ, za pomocą20 pMoli dNTP na każdy, 100 pM primerów sensownych i antysensownych oraz 2 jednostek polimerazy Taq. Primery sensowne zawierał region komplementarny do ogonka o wielu G (Loh i in., 1989 Science 243, 217-220) i miejsce Xbal (podkreślone).

5'-CGTCGATCTAGAGCATGTGCAAGTCCGATGAGTCCCCCCCCCCCCCC-3'SEQ ID nr 7

Pnmery antysensowne były primerami zagnieżdżającymi, zawierającymi miejsce Hindlll (podkreślone) oraz poddane annealingowi z którymkolwiek nukleotydem 101-125 mysiego C_K5'-CGTCATAAGCTTCAGGAAGCACACGACTGAGGCAC-3' Seq ID nr 8 lub nukleotydami 47-69 CHI mysiej IgGj

5'-CGTCATAAGCTTGTCACCATGGAGTTAGTTTG-3' Seq ID nr 9 lub z nukleotydami 38-62 CHI mysiej IgG_2b 5'-CGTCATAAGCTTGAACCAGTTGTATCTCCACACCCAG-3' Seq ID nr 10.

Reakcję przeprowadzono w cyklerze cieplnym Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT) z użyciem programu 33-cyklowego o 30 sekundach denaturacji w temperaturze 94°C, 90 sekundach annealingu w temperaturze 45°C i 90 sekundach wydłużenia w temperaturze 72°C.

Fragmenty VL i VH namnożone przez PCR trawiono enzymami Xbal i Hindlll, włączono do wektora pUC 19 i transformowano w DH5a£. coli. Klony, zawierające VL lub VH identyfikowano przez sekwencjonowanie DNA. Sekwencje konsesusowe dla klonu 106 (fig. 6A i fig. 6B) lub klonu 7 (fig. 7A i fig. 7B) określono przez analizowanie sekwencji klonów wielokrotnych VL lub VH i uszeregowanie wyprowadzonych sekwencji aminokwasowych z użycie poprzednio publikowanych sekwencji mysich VL i VH (Kabat i in., 1987 US Department ofHealth and Humań Services). Sekwencja mikieotydowa i wprowadzona aminokwasowa dla klonu 106 VL i VH są przedstawione na fig. 6A i fig. 6B (Seq ID nr 11 do 14), a sekwencja nukleotydowa i wyprowadzona aminokwasowa dla 7 VL i VH sąprzedstawione na fig. 7A i fig. 7B (Seq ID nr 15 do 18).

B. Konstruowanie kasety ekspresji klonu 7 i klonu 106 sFv.

sFv o pojedynczym łańcuchu skonstruowano w orientacji VL-VH dla obu 7 i 106, przy czym każda kaseta zawiera linker interwencyjny (Gly₄Ser)₃ (Huston i in., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85,5879-5883). Aby utworzyć kasetę 106 VL-VH, gen klonu 106 VL ponownie namnożono z konstrukcji sekwencyjnej pUC19, przy użyciu sensownego primera PCR (106γ\SalI), który kodował miejsce Sali tuż przed sekwencją kodującą pierwszą resztę dojrzałego VL. Primer antysensowny (106γ 1 vlLK3') był komplementarny do sekwencji, kodującej ostatnie dziewięć reszt VL i pierwsze 12 reszt linkera (Gly₄Ser)₃. Dodatkowo, 106 VH ponownie namnożono z konstrukcji sekwencyjnej pUC19, przy użyciu primera sensownego (106γ 1 vhLK5'), który kodował ostatnie 11 reszt linkera (Gly₄Ser)₃, po czym pierwsze dziewięć reszt dojrzałego VH i primera antysensownego (106vhBclI) komplementarnego do sekwencji, kodującej ostatnie dziewięć reszt regionu VH i miejsce Bell. Zmodyfikowane produkty PCR VL i VH oczyszczono następnie, stosując GeneClean™ (BiolOl, LaJolla, CA) i dodano do pojedynczej reakcji PCR, w obecności nadmiaru primerów sensownego VL (106γ \SalI) i antysensow

182 868 nego VH (106vhBc 11) tak, że DNA, kodujące indywidualne domeny 106 VH i VL były włączone do pojedynczego regionu kodującego, poprzez nakładające się wydłużanie PCR.

Podobnie, aby wytworzyć kasetę 7 VL-VH sFv, gen 7 VL ponownie namnożono z konstrukcji sekwencyjnej pUC19, przy użyciu sensownego primera PCR (7 y2bSalI), który kodował miejsce Sali tuż przed sekwencją, kodującą pierwszą resztę dojrzałego VL; oraz antysensownego primera (7y2bvlLK3') komplementarnego do sekwencji, kodującej ostatnie dziewięć reszt VL i pierwsze 12 reszt linkera (Gly₄Ser)₃. DNA, kodujące 7 VH ponownie namnożono z konstrukcji sekwencyjnej pUC19 z primerem sensownym (7y2bvhLK5'), kodującym ostatnie 11 reszt linkera (Gly₄Ser)₃, po czym pierwsze dziewięć reszt dojrzałego VH oraz primerem antysensownym (7y2bvhBclI) komplementarnym do sekwencji, kodującej ostatnie dziewięć reszt aminokwasowych regionu VH i miejsce Bell. DNA, kodujące 7 VH i VL przyłączono do pojedynczego regionu kodującego poprzez nakładające się wydłużanie PCR, stosując nadmiar primerów sensownego VL (7y2bSalI) i antysensownego VH (7y2bvhBclI) PCR.

Tabela 8

Pnmery użyte do konstruowania kaset ekspresji klonu 7 i klonu 6 sFv

Pnmer	Sekwencja (5' do 3')^

7y2bSaU	ATCGTCTAGGTCGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTCC SEQID #19
7y2bVlLK3'	GCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCCCGTCTTAT TTCCAACTTTGTCCC SEQ ID #20
7Y2bVhLK5'	TCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTCCAGCTG CAACAGTCTGGACCT SEQ ID #21
7γ2όΒΗΙ	TCAGTGCTGATCAGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCC SEQ ID #22
106ylSalI	ATCGTCTAGGTCGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCC SEQ ID #23
106yIVILK3'	GCCACCCGACCCACCACCGCCAGCGCCACCGCCACCCCGTTTCAG CTCCAGCTTGGTCCCC SEQ ID #24
106YlVhLK5'	TCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAAGTGAAGCTG GTGGAGTCTGGGGGA SEQ ID #25
106y1Bc1I	TCAGTGCTGATCAGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACC SEQ ID #26

Miejsce restrykcji podkreślono

Kasety genu sFv 106 i 7 VL połączonego z VH, zmontowano dla ekspresji sFv-Ig w wariancie pUC 19 zwanym pUC-Ig, która została przeprowadzona przez szczep dam E. coli (NEB 208), aby umożliwić enzymowi restrykcyjnemu cięcie w miejscu Bel I. Wektor ten zawierał sekwencję liderowąLó V_K, wtrąconąjako fragment Hindlll-Salloraz miejsce Bell, poprzedzającą sekwencję, kodującązawias-CH₂CH₃ ludzkiej IgG 1 jako cDNA, po czym kodon przestankowy i miejsceXbal. Reszty cysteiny w regionie zawiasowym zmutowano do seryn, aby umożliwić wytwarzanie monomerycznych sFv!g (Hayden i in., 1994, Therapeutic Immunol. 1, 3-15). Kasety genu sFv 106 i 7 VL połączonego z VH cięto Sali i Bell i włączono do pUC19. DH5a£. coli transformowano za pomocą konstrukcji i kolonie przesiano pod względem insertów.

182 868

Całe kasety lider L6V_K/VL połączone z VH sFv/ludzka Ig, zarówno dla 106 jak i dla 7 sFv, odcięto od pUC-Ig, stosując Hindlll i Xbal i przeniesiono do wektora ekspresji ssaka pCDM8. Po ligacji kaset ekspresji 7 i 106 sFv do modyfikowanego wektora pCDM8, plazmidy namnożono w komórkach MC1061/p3 E. coli, a DNA odzyskano i oczyszczono, w celu transfekcji do komórek COS.

C. Transfekcja komórek COS, oczyszczenie i charakterystyka białek połączonych sFv-Ig

Komórki COS trasfekowano plazmidami ekspresji, jak opisano poprzednio (Linsley i in., 1991, J. Exp. Med. 173, 721-730; Aruffo i Seed, 1987, Proc. Naił Acad. Sci. USA 84, 8573-8577) Plazmidowy DNA dodano do pożywek transfekcyjnych, w ilości 1 pg/ml w całkowitej objętości 12 ml/płytkę o 150 mm/. Po 7 do 10 dniach hodowli, supematant hodowlany zlano i osad komórkowy usunięto przez wirowanie z niską prędkością.

106i7 sFv-Ig oczyszczono, dodając klarownego supematantu do kolumny unieczynnionego białka A (Repligen Corp. Cambridge, MA) zrównoważonego 0,05 M cytrynianu sodu, pH 8,0 (Linsley i in., 1991, J. Exp. Med. 173, 721-730). Na 500 ml supematantu, użyto 1 ml objętości upakowanego złoża białka A. Po obciążeniu kolumny (1 ml/minutę), kolumnę przemyto 100 mM fosforanu potasu, pH 8,0 i związane białko eluowano 0,05 M cytrynianem sodu, pH 3,0. Frakcję zobojętniono, zlano i dializowano przeciw PBS. Stężenie białka określono, przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do oznaczania białka (Bio-Rad, Richmond, CA) na osnowie techniki Lowr/ego).

Poziomy ekspresji i wielkość cząsteczek białek połączonych, określono przez immunoprecypitację z białkiem A i SDS-Page, po czym test Western blotting. Żele poliakryloamidowe, tworzące liniowy 6-15% gradient z 4% stakerem (stacker) poddano przez noc działaniu 10 miliamperów. Żele odciśnięto immunologicznie na membranach nitrocelulozowych, przy użyciu aparatu Western do półsuchego przenoszenia (Ellard Instruments, Seattle, WA) przy 3 miliamperach/cm², przez 1 godzinę. Odciski zablokowano 2% mlekiem odtłuszczonym plus 0,1% Tween w PBS (bufor blokujący) na 1 do 2 godzin, a następnie inkubowano z kozią IgG przeciw ludzką sprzężoną z alkaliczną fosfatazą (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) przy rozcieńczeniu 1:1500, w buforze blokującym, przez 1 godzinę. Odciski przemyto potem trzy razy buforem blokującym i wywołano w błękicie Western (Promega, Madison, WI) przez 5-15 minut przed zatrzymaniem wywoływania barwy przez wypłukanie w wodzie destylowanej.

Białka 7 sFv-Ig i 106 sFv-Ig testowano pod względem wiązania z ludzką gp39, za pomocą testu ELISA. Krótko, giętkie 96-studzienkowe płytki do mikromianowania, z płaskim spodem (Falcon) powleczono na noc przeciwciałem monoklonalnym 53-6 szczura przeciw mysim Lyt2a, w ilości 2 pg/ml, w PBS, w temperaturze 4°C. Po usunięcia nadmiaru przeciwciała przeciw mysiego Lyt2a, do płytek dodano sgp39, jak opisano wcześniej (100 μΐ/studzienkę) i inkubowanoprzez noc w temperaturze 4°C. Nadmiar sgp39 usunięto przez przemycie i dodano białka klonu 7 sFv-Ig lub klonu 106 sFv-Ig (100 μΐ/studzienkę). Płytki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i przemyto dwa razy PBS, zawierającym 0,1% BSA. Dodano kozią przeciw ludzką IgG sprzężoną z peroksydazą chrzanową (American Qualex, AnaHeim, CA) (100 μΐ na studzienkę), w buforze do sprzęgania (Genetic Systems, Seattle, WA) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Niezwiązany koniugant usunięto dwukrotnym przemyciem PBS, zawierającym 0,1% BSA i do studzienek dodano 100 μΐ na studzienkę rozcieńczonego 1:100 EIA Buffered Substrate (Genetic Systems). Reakcję barwienia zatrzymano 30 μΐ na studzienkę 3 M H₂SO₄ i zmierzono gęstość optyczną przy 450-595 nm, za pomocą czytnika płytek o wielu studzienkach Titertek.

Supematanty transfekcyjne klonu 106 sFv-Ig i klonu 7 sFv-Ig wiązały się dobrze z ludzką gp39 i reagowały bardzo słabo (106) albo wcale (7) z mysią gp39. Reprezentatywne wyniki wiązania 106 i 7 sFv-Ig ukazano na fig. 8. Przeprowadzono określenie powinowactwa wiązania dla sFv-lg przeciw natywnemu przeciwciału monoklonalnemu 106 sFv-Ig, przy użyciu oczyszczonego znakowanego radiologicznie białka. Krzywe nasycenia wiązania ukazane na fig. 9 wykazały, że znakowane natywne przeciwciało monoklonalne 106 (fig. 9A) wiązało się z komórkami Jurkat z natury wykazującymi ekspresję gp39, z blisko trzykrotnie większym powi

182 868 nowactwem niż 106 sFv-Ig (fig. 9B). Jednakże powinowactwo 106 sFv-Ig było wciąż całkiem wysokie (zmierzone Kd = 1,6 x 10‘⁹). Ustalono, że natywne przeciwciało monoklonalne 106, wiązało 10000 miejsc na komórkę w transformacji Scatchard, co jest całkowicie zgodne z liczbą miejsc na komórkę związaną przez 106 sFv-Ig (fig. 9A i 9B).

Oszacowano zdolność 7 sFv-Ig i 106 sFv-Ig do inhibicji wytwarzania IgG o IgM w układzie in vitro wytwarzania przeciwciał przez komórki B zależne od komórek T i porównano ten efekt z obserwowanym dla rodzicielskich przeciwciał 39-1.7 i 39-1.106, jak opisano wcześniej dla przeciwciał rodzicielskich, z kilkoma pomniejszymi modyfikacjami. Hodowle komórkowe inicjowano za pomocą 100000 komórek T traktowanych mitomycyną C i 2000 komórek B w połowie powierzchni płytek Costar. Oczyszczone przeciwciała rodzicielskie i ich odpowiadające oczyszczone sFv-Ig oceniono ilościowo, za pomocą zestawu Βίο-Rad Protein Assay. Każde przeciwciało rodzicielskie testowano przy końcowych stężeniach, wynoszących 1, 0,5, 0,25 i 0,125 pg/ml. Każde sFv-Ig oceniono przy końcowych stężeniach, wynoszących 0,68,0,34,0,17 i 0,085 pg/ml. Mimo, że stężenie przeciwciała rodzicielskiego i jego odpowiadające sFv-Ig, w kategorii pg/ml, były różne, stężenie każdego z nich, ze względu na liczbę fragmentów wiążących antygen, było równoważne, gdy brano pod uwagę całkowitą wartościowość (dwa na przeciwciało rodzicielskie, jeden dla jego sFv-Ig) i ciężar cząsteczkowy (160000 kDa dla przeciwciała rodzicielskiego, 55000 kD dla sFv-Ig). Tak więc, końcowe stężenia fragmentów wiążących antygen (miejsca wiązania) porównane w tym doświadczeniu, wynosiły 7,53,3,76,1,88 i 0,94 χ 10¹²miejsc wiązania/ml.

Po dodaniu przeciwciała i sFv-Jg, płytki hodowano w nawilżonym inkubatorze o 37°C/6% CO₂, przez 10 dni, po których supematanty hodowlane z potrójnych studzienek zlano i oszacowano pod względem całkowitej ilości ludzkich IgG i IgM, jak opisano wcześniej. Dane przedstawiono w tabeli 9, gdzie poziomy Ig wyrażono jako procent poziomu obserwowanego tylko dla pożywki kontrolnej (brak przeciwciała anty-gp39). Jak pokazano w tabeli 9, zarówno 7 sFv-Jg jak i 106 sFv-Jg były zdolne do istotnej supresji wytwarzania zarówno IgG jak i IgM przez ludzkie komórki B. Interesujące jest to, że ich zdolność do supresji była co najmniej równoważna, a przy niektórych stężeniach nawet lepsza niż obserwowana dla przeciwciał rodzicielskich.

Tabela 9

Supresja wytwarzania przeciwciał in vitro przez całe przeciwciała monoklonalne przeciw ludzkiej gp39 i ich pochodne sFv-Ig

Stężenie Ab (miejsca wiązania χ 10¹²)	Inhibicja Syntezy IgG % tylko pożywki kontrolnej	Inhibicja Syntezy IgM % tylko pożywki kontrolnej
	7 7sFv-Ig 106 106sFv-Ig	7 7sFv-lg 106 106sFv-Ig
7,53	12 18 11 14	1421 25 12
3,76	17 1924 12	24 19 19 12
1,88	11 24 26 10	29 34 27 12
0,94	60 12 37 21	64 32 34 19

Przykład 12. Humanizacja przeciwciała monoklonalnego przeciw ludzkiej gp39.

A. Określenie ludzkich matryc dla 106 VL i VH.

Użyto mysich sekwencji 106 VL (kappa) i VH, do przeszukiwania podzbioru sekwencji immunoglobuhn z GenBank dla sekwencji nukleotydowych mysiej linii zarodkowej, z najbliższą homologią do 106 VL za pomocą przeszukiwania FASTA, używając tylko nukleotydów, kodujących dojrzały peptyd. Przeszukiwanie to wytworzyło dwie mysie sekwencje, po czym wiele sekwencji ludzkich, o najbliższym dopasowaniu, oznaczone „Musigva” (dostęp nr J00545). Homologię między odczytanym 106 VL i odczytanym J00545 (linia zarodkowa 106) ukazano na fig. 10. Wydrukowano tylko różnice dla sekwencji linii zarodkowej. Różnice te są

182 868 prawdopodobnymi miejscami mutacji somatycznych. Jednakże jest możliwe, że 106 VL pochodzi z genu jeszcze nieokreślonej mysiej linii zarodkowej.

Określono sekwencję aminokwasową ludzkiej linii zarodkowej z najbliższąhomologią do 106 VL, przeprowadzając przeszukiwanie FASTA w bazie danych sekwencji białek immunoglobulinowych. Ten zbiór danych zawierał sekwencje zarówno linii zarodkowej jak i ponownie uszeregowaną. Po brakowaniu sekwencji ponownie uszeregowanych, znaleziono najlepsze dopasowanie homologii do sekwencji linii zarodkowej, oznaczone „02” (dostęp nr Χ59312) i „012” (dostęp nr Χ59315). Zauważono, że zachowano wszystkie, z wyjątkiem jednej (Leu90) determinanty strukturalne dla pętli CDR, tak samo jak wielkość pętli CDR między mysim 106 VL i ludzką matrycą. Zauważono także, że wszystkie pętle CDR w łańcuchach lekkich sekwencji mysiej i ludzkiej matrycy, należą do tej samej kanonicznej klasy strukturalnej.

Określono także mysią sekwencję nukleotydowąz najbliższąhomologią do 106 VH, przeprowadzając przeszukiwanie FASTA podzbioru sekwencji immunoglobulinowych z GeneBank, używając tylko nukleotydów, kodujących dojrzały peptyd jako sekwencję pytajnika (query sequence). Przeszukiwanie dało w wyniku umiejscowienie dwóch mysich sekwencji, po czym wielu sekwencji ludzkich. Mysie sekwencje oznaczone „Musighin” (dostęp nr M21520) wykazały znacznie lepsząhomologię niż inne mysie sekwencje. Przypis GeneBank dla M21520 umieszcza ją w spisie, jako sekwencję ponownie uszeregowaną. Do celu odszukania prawdopodobnych miejsc mutacji somatycznych, użyto M21520 jako substytutu linii zarodkowej i różnice między nią a 106 VH ukazano w dolnym zbiorze linii, na fig. 11.

Określono sekwencję aminokwasową ludzkiej linii zarodkowej z najściślejsząhomologią do 106 VH, przeprowadzając przeszukiwanie FASTAna podzbiorze danych o sekwencji immunoglobulinowej. Po brakowaniu sekwencji ponownie uszeregowanych, znaleziono najlepiej dopasowanąz „Hhg4” sekwencją linii zarodkowej (dostęp nr Χ62129). Zauważono, że wielkość pętli CDR była zabezpieczona między 106 VH i ludzką matrycą i że zachowane były wszystkie, z wyjątkiem dwóch determinant strukturalnych dla pętli CDR. Żadna z innych wysoko homologicznych sekwencji nie dała lepszego dopasowania do determinant strukturalnych. Odkryto także, że pętle HI mysiej sekwencji i ludzkiej matrycy, należą do tej samej kanonicznej klasy strukturalnej.

B Oczyszczanie matryc humanizacji 106 VL i VH.

Zidentyfikowano kanoniczne struktury pętli, dla pętli wiążących antygen LI, L2 i L3 domeny VL oraz HI i H2 domeny VH i reszty określone jako determinanty strukturalne (Chothia i Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196,901; Lesk i Tramontano, In Antibody Engineering, W.H. Freeman i Co , str. 1-38 (1992)) zachowano jak reszty mysie.

Mysich sekwencji aminokwasowych 106 VL i VH użyto do przeszukiwania banku danych Brookhaven, pod względem sekwencji homologicznych, w których rozwiązano kwestię struktury krystalicznej. Wyselekcjonowano VL z wiążącego przeciwciała monoklonalnego anty lizozymowego D1.3, jako matrycę strukturalną do ustalenia modelu 106 VL. Wybrano VH z przeciwciała monoklonalnego anty peptydowego 17/9 jako matrycę strukturalną do ustalenia modelu 106 VH. Struktury te połączono, aby zapewnić matrycę kompzytowądo ustalenia modelu 106, stosując zbiór me różniących się reszt na granicy rozdziału faz VL-VH. Z modelu określono trzy dodatkowe reszty zrębowe, które okazały się ważne dla utrzymania struktury miejsc wiążących antygen W VL odkryto, że Ile48 jest ważne strukturalnie i zachowano je jako sekwencję mysią. W VH dwie reszty (Ala49 i Ile 77) także zachowano jako sekwencję mysią. Model 106 nie był rozstrzygający, czy ludzka lub mysia reszta była odpowiednia w pozycjach 24, 55 i 56 106 VH.

C. Determinacja matryc z regionem J.

Wyselekcjonowano najlepszą sekwencję J^, przez homologię do mysiej sekwencji J_K u Kabata i in. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie 4, US Health and Humań Services, Waszyngton, D.C. (1987). Podobnie wybrano najlepszą ludzką sekwencję JH, przez homologię do mysiej sekwencji JH u Kabata i in. (jak wyżej).

D. Humanizacja 106 VL

Pnmery oligonukleotydowe użyte do humanizowania 106 VL wymieniono w tabeli 8. Zakodowano pierwsze trzy zmiany (Ala w pozycji 9 na Ser, Glu w pozycji 17 na Asp i Thr w pozycji 18 na Arg), na primerze sensownym PCR Hul 06VLAre2. Dodano miejsce Hindlll tuż przy 5' se

182 868 kwencji, kodującej dojrzały VL, w celu kloningu ostatecznego humanizowanego VL do pUC19. Zakodowano następnie cztery zmiany w primerze antysensownym PCR Hu 106 VLB2 (Gin w pozycji 40 na Pro, Arg w pozycji 42 na Lys, Ser w pozycji 43 na Ala i Gin w pozycji 45 na Lys). Stosując HulO6VLAre2 i HulO6VLB2 z mysim 106 sFv-Ig/CDM8 jako matrycę, otrzymano pierwszy humanizowany fragment, drogąPCR. Primera sensownego PCR Hu 106VLC i antysensownego primera PCR Hul06VLD użyto do humanizacji drugiego fragmentu. Sekwencja Hu 106 VLC zachodziła na Hu 106 VLB2 tak, że te same cztery zmiany kodowano na Hu 106 VLC (Gin w pozycji 40 na Pro, Arg w pozycj i 42 na Lys, Ser w pozycj i 43 na Ala i Gin w pozycji 45 na Lys). W dodatku, wbudowano miejsce Spel do HulO6VLC, jako miejsce diagnostyczne. Zmiana ta me zmieniła sekwencji białka. Primer 2 HulO6VLD kodował następne cztery zmiany (Gin w pozycji 70 na Asp, Ser w pozycji 72 na Thr, Lys w pozycji 74 na Thr i Asn w pozycji 76 na Ser). Stosując HulO6VLC i HulO6VLD z mysim 106 sFv-Ig/CDM8 jako matrycą, otrzymano, drogą PCR, drugi humani zowany fragment.

Tabela 10

Pnmery użyte do humanizacji 1Ό6 VL

Hindlll

Hu 106 VL Are2 5'-ATCGTCTAGAAGCTTGTCGACATCC AGATGACTC AGTCT

96-meryczny CCATCATCCCTATCTGCATCTGTGGGAGATCGAGTCACCAT sensowny CACATGTCGAGCAAGT-3' SEQ ID #33

Hu 106 VLB2 5’-TAGTAGCTTAGGTGCCTTTCCAGGTTTCTGCTGATACC AA

45-meryczny GCTAA-3’ SEQ ID #34 antysensowny

Spel

Hu 106 VLC 5’-CCTGGAAAGGCACCTAAGCTACTAGTCTATAATGCAAAA

60-meryczny ACCTTAGCAAAAACCTTAGCA-3' SEQ ID #35 antysensowny

2Hu 106VLD 5'-GAGATCGTCAGTGTAAAGTCTGTGCCTGATCCACTGCCAC

45-meiyczny TGAAC-3' SEQ ID #36 antysensowny

Hu 106 VLE 5’-GACTTTACACTGACGATCTCAAGCCTGC AGCCTGAAGATT

75-meryczny TTGCAACTTATTACTGTCAACATCATTATAATACT-3' sensowny SEQ ID #37

Xbal

Hu 106 VLF 5'-TC AGTGCTLCTAGAGCC ACCCCGTTTGATCTCGACCTTGG 82-meryczny TCCCTCCACC GAACGTGAGC GGAGTATTAT AATGATGTTG antysensowny AC-3' SEQ ID #38

Hul06VLA2

24-meryczny 5'-ATCGTCTAGAAGCTTGTCGACATC-3' SEQ ID #39 sensowny

Hul06VLF2

24-meryczny 5'-TCAGTGCTTCTAGAGCCACCCCGT-3' SEQ ID #40 antysensowny

182 868

Otrzymano ostateczny humanizowany fragment VL, stosując sensowny primer PCR Hul 06VLE i antysensowny primer PCR Hul06VLF z mysim 106 sFv-Ig/CDM8 jako matrycą. HulO6VLE częściowo nachodził na 2HulO6VLD tak, że kodował te same cztery zmiany (Gin w pozycji 70 na Asp, Ser w pozycji 72 na Thr, Lys w pozycji 74 na Thr i Asn w pozycji 76 na Ser). Dodatkowo, Hu 106 VLE kodował dwie dodatkowe zmiany (Gly w pozycj i 84 na Ala i Ser w pozycji 85 na Thr). HulO6VLF kodował ostatnie cztery zmiany (Thr w pozycji 100 na Gly, Leu w pozycji 104 na Val i Leu w pozycji 106 na Ile). HulO6VLF kodował również miejsce Xbal tuż przy 3' sekwencji VL do celów kloningu. Humanizowane fragmenty 2 i 3 zmontowano następnie i namnożono za pomocą PCR, przez zmieszanie dwóch humanizowanych DNA razem, w obecności pnmera sensownego HulO6VLC i primera antysensownego HulO6VLF. Kawałek ten oczyszczono, zmieszano z humanizowanym fragmentem 1 i ponownie namnożono drogąPCR w obecności sensownego primera HulO6VLA2 i primera antysensownego HulO6VLF2 tak, że uzyskano pojedynczy fragment PCR. Namnożony humanizowany 106 VL cięto następnie HindIH '\XbaI\ poddano ligacji do pUC19. Transformowano E. coli (szczep DH5a) jak zwykle i sekwencjonowano plazmid DNA z indywidualnych klonów, aby zweryfikować skład właściwego fragmentu humanizowanego 106 VL. Jeden indywidualny klon oznaczono hul06VL klon 10 i użyto w późniejszych konstrukcjach.

E. Humanizacja 106 VH.

Ponieważ mysi model 106 nie rozstrzygał, czy ludzka lub mysia reszta była odpowiednia w pozycjach 24,55 i 56 humanizowanego łańcucha VH, uczyniono próbę wyprodukowania wszystkich 23 wersji. Humanizowane geny VH montowano w trzech etapach. W pierwszym etapie wytworzono fragmenty PCR, kodujące obie z 2 wersji (odpowiadające Ala lub Thr w pozycji aminokwasu 24) sekwencji aminokwasowej w pozycji 1 do pozycji 51 i wtrącono do miejsc Hindllli Xbal pUC19. Te produkty PCR obejmowały wprowadzenie unikatowego miejsca Nhel (w pozycji nukleotydu 146), po czym miejscaEcoRI, PstI\XbaI do dalszych insercji innych fragmentów. Zmiany te nie wpływały na sekwencję białka 106 VH. W drugim etapie, oligonukleotydy, kodujące każdą z czterech różnych wersji (odpowiadających Asp-Ser, AspTyr, Ser-Ser i Ser-Tyr w pozycjach reszt aminokwasowych 55 i 56) reszt aminokwasowych 49 do 80, poddano annealingowi i wtrącono do miejsc Me/i Pstlobu wektorów wytworzonych w etapie I. Izolowano siedem z ośmiu możliwych różnych wektorów (postacie Ala-Asp-Ser nie). W trzecim etapie, wytworzono pojedynczy produkt PCR, kodujący reszty aminokwasowe 80 do 112, który zawierał sekwencję nukleotydową, kodującąpozostałe reszty dla humanizowanego 106 VH (fig. 12) i wtrącono do miejsc PstHXbaI siedmiu wektorów wytworzonych w etapie 2.

Tabela 11

Pnmery użyte do humanizacji 106 VH

HindUI

106vhT-5’ 5’-ATCGTCTAGAAGCTTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGA

106-meryczny GGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCCTG sensowny TGCA4CCTCTGGATTCACTTTCAATA-3' SEQ ID #41

Hindlfi 106 VHA-5' 5’-ATCGTCTAGAAGCTTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAG 106-meryczny GAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCCTG sensowny TGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAATA-3' SEQ ID #42

Xbal Pstl EcoRI Nhel 106 vhNEP-3' 5*-TCAGTGCTCTAGAACCCTGCAGATCGAATTCAATGCTAGC

87-meryczny GACCCACTCCAGTCCCTTACCTGGTGCCTGGCGAACCCAA antysensowny GACATGG-3' SEQ ID #43

182 868

106vhSY-5' 97-meryczny sensowny

106vhSY-3' 89-meryczny anty sensowny

106vhDY-5' 97-meryczny sensowny

106vhDY-3' 89-meryczny antysensowny

106vhSS-5' 97-meryczny sensowny

106vhSS-3' 89-meryczny antysensowny

106vhDS-5' 97-meryczny sensowny

106vhDS-3' 89-meryczny antysensowny

106vhPst5' 78-meryczny sensowny

106vhXba3' 69-meryczny antysensowny

Nhel

5'-CTAGC ATT AGT AGTGGT4 GTTA CATCTACT ATGCTGAC AG TGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCGAGAGATAATGCCAAAA ACATCCTGTATCTGCA-3' Xhol SEQ ID #44

Pstl

Xhol

5’-GATACAGGATGTTTTTGGCATTATCTCTCGAGATGGTGAA TCGGCCTTTCACACTGTCAGCATAGTAGATGTA4CTACCA CTACTAATG-3' SEQ ID #45

Nhel

5'-ęTĄGCATTAGTAGTGGTG47T4CATCTACTATGCTGACAG TGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCGAGAGATAATGCCAAA AACATCCTGTATCTGCA-3' Xhol SEQ ID #46

Pstl

Xhol

5'-GATACAGGATGTTTTTGGCATTATCTCTCGAGATGGTGAA TCGGCCTTTCACACTGTCAGCATAGTAGATGT/MTCACCA CTACTAATG-3' SEQ ID #47

Nhel

5’-CTAGCATTAGTAGTGGTJGZ4GCATCTACTATGCTGACAG TGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCGAGAGATAATGCCAAA AACATCCTGTATCTGCA-3' Xhol SEQ ID #48

Pstl

Xhol

5’-GATACAGGATGTTTTTGGCATTATCTCTCGAGATGGTGAA TCGGCCTTTCACACTGTCAGCATAGTAGATGC7/1CTACCA CTACTAATG-3' SEQ ID #49

Nhel

5'-ęTĄGCATTAGTAGTGGTG4T/iGCATCTACTATGCTGACAG TGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCGAGAGATAATGCCAAA AACATCCTGTATCTGCA-3' Xhol SEQ ID #50

Pstl Xhol

5'-GATACAGGATGTTTTTGGCATTATCTCTCGAGATGGTGAA TCGGCCTTTCACACTGTCAGCATAGTAGATGCr^TCACCA CTACTAATG-3' SEQ ID #51

Pstl

5'-ATCGTCTAGCTGCAGATGAACAGTCTGAGGGCAGAGGACA CGGCCGTCTATTACTGTGCAAGGCACTATGATTACGAC-3'

SEQ ID #52

Xbal Bell

S^TCAGTGCTCTAGATGATCAGAGGAGACGGTGACCAGGGTT CCTTGACCCCAGTAGTCCATAGCATAGCT-3' SEQ ID #53

182 868

Bardziej szczegółowo, zapoczątkowano konstruowanie dwóch wektorów, przez wytworzenie dwóch fragmentów PCR, stosując 106 sFv-Ig/CDM8 jako matrycę i albo 106vhT-5' albo 106vhA-5' jako primer sensowny oraz 106vhNEP-3'jako primer antysensowny. Primery sensowne kodowały miejscaHindlll tuż przy 5' VH i pierwsze trzy zmiany humanizowanego VH (Lys w pozycji 3 na Gin, Lys w pozycji 19 na Arg i Tyr w pozycji 23 na Ala). W dodatku primer sensowny 106vhA-5' humanizował resztę w pozycji 24 na Ala podczas gdy primer sensowny 106vhT-5' utrzymywał resztę jako mysią (Thr). Primer antysensowny kodował zmiany przy resztach 40,42 i 44 (odpowiednio, Thr na Ala, Glu na Gly i Arg na Gly), a także kodował cztery unikatowe miejsca restrykcji (Nhel, EcoRI, Pst i Xbal). Dwa DNA wytworzone w PCR klonowano potem do pUC 19 jako fragmenty HindIII-XbaI i użyto do transformacji DH5a£. coli. Klony, zawierające oba inserty izolowano (106vhA-NEP i 106vhT-NEP) i weryfikowano przez sekwencjonowanie DNA. Plazmidy trawiono następnie enzymami Nhel, EcoRJ i Pstl, a liniowe DNA izolowano i oczyszczono.

Oligonukleotydy sensowne w każdej z czterech par oligonukleotydów, które kodowały zmiany w pozycjach 55 i 56, fosforylowano i poddano annealingowi do odpowiadającego oligonukleotydu anty sensownego. Wytworzono przez to fragmenty dsDNA, które posiadały nawis 5'-Nhel i nawis 3'-Pstl i które zawierały unikatowe miej sca Xhol. Pary primeró w 106vhDS-5'i 106vhDS-3' kodowały mysie reszty w pozycjach 55 i 56 (Asp-Ser); 106vhDY-5' i 106vhDY-3' kodowały mysie i ludzkie reszty w pozycjach 55 i 56, odpowiednio (Asp-Tyr); i 106 vh SS-5' i 106 vh SS-3' kodowały ludzkie i mysie reszty w pozycjach 55 i 56, odpowiednio (Ser-Ser); oraz 106vhSY-5' i 106vhSY-3' kodowały ludzkie reszty w pozycjach 55 i 56 (Ser-Tyr). Wszystkie pary primerów kodowały także cztery dodatkowe zmiany z mysiej do ludzkiej sekwencji (Thr na Ile w pozycj i 57, Pro na Ala w pozycj i 60, Arg na Lys w pozycji 64 i Arg na Lys w pozycji 75). Cztery wytworzone fragmenty poddano następnie ligacji do 106vhANEP/pUC 19il 06vhT-ΝΕΡ/pUC 19 trawione uprzednio enzymami restrykcyjnymi. Plazmidów użyto do transformacji DH5a£ coli i DNA z klonów cięte zapomocąXhoI izolowano i weryfikowano przez sekwencjonowanie DNA. Z ośmiu kombinacji, uzyskano siedem (106vhA-DS, reprezentująca ludzką mysią mysiej sekwencji w pozycjach 24, 55 i 56 nigdy nie izolowano od pUC 19) Siedem plazmidów trawiono PstHXbaIi były one teraz gotowe do otrzymania ostatecznego fragmentu. Trzy z klonów wyselekcjonowano do dalszego użycia i oznaczono jak następuje. V„ASY24-17 (hhh), V_HTDS15-34 (mmm) i V_HADY7-8 (hmh).

Pozostałe reszty, które zmieniono do sekwencji ludzkiej kodowano na primerze sensownym 106vhPst5' (Ser na Asn wpozycji 82a, Ser na Ala w pozycji 84 i Met na Val w pozycji 89 i primerze antysensownym 106 vh Pst3' (Ser na Leu w pozycji 108). Dla celów kloningu, primer 106vhPst5' kodował także miejsce Pstl, a 106vhPst3' kodował miejsce Xbal z miejscem Bell tuż za nim. fragment ten otrzymano drogą PCR, przy użyciu 106 sFv-Ig/CDM8 jako matrycy. Fragment trawiono PstHKbali poddano ligacji do siedmiu plazmidów. Raz jeszcze użyto plazmidów do transformacji DH5a E. coli i DNA z klonów sekwencjonowano w celu weryfikacji insercji.

F. Montaż kaset humanizowanego genu 106 sFv.

Zmontowano kasety ekspresji humanizowanego pojedynczego łańcucha Fv dla 106, jak dla oryginalnego mysiego 106 sFv, lecz przy użyciu następujących primerów.

Tabela 12

Pnmery użyte do konstrukcji kaset humanizowanego genu 106 sFv

Sali hul 06Vj Sali 5’-ATCGTCTAGGTCGACATCCAGATGACTCAGTCTCCATCAT 45-meryczny CC-3’ SEQ ID #54 sensowny hulO6V_T LK3' 5-GCCACCCGACCCACCACCGCCAGCGCCACCGCCACCCCGT 60-meryczny TTGATCTCGACCTTGGTCCC-3' SEQ ID #55 antysensowny

182 868 cd tabeli 12 hul 06V_hLK5' 5’-TCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAAGTGC 60-meryczny AGCTGGTGGAGTCTGGAGGA-3' SEQ ID #56 sensowny

Bell hu 106 V_HBclI 5'-TC AGTGCTGATCAGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTT GA 45-meryczny CC-3' SEQ ID #57 antysensowny

Krótko, DNA, kodujący humanizowany 106 VL wycięto z wektora pUC19, w którym był on montowany. DNA, kodujący siedem humanizowanych 106 VH wycięto także z pUC 19. Fragmenty DNA oczyszczono i użyto w następujących reakcjach PCR. Humanizowany 106 VL namnożono przy użyciu primera sensownego PCR hu!06V_LSalI, który koduje miejsce Sali tuż przed pierwszą resztą dojrzałego VL oraz primera antysensownego (hul06V_LLK3'), który był komplementarny do sekwencji kodującej ostatnie dziewięć reszt VL i pierwsze 12 reszt linkera (Gly₄Ser)₃. Dodatkowo, namnożono siedem humanizowanych 106 VH, stosując primer sensowny (hu 1 06V_hLK5'), kodujący 11 ostatnich reszt linkera (Gly₄Ser)₃, po czym pierwszych dziewięć reszt dojrzałegp VH oraz primer antysensowny (hul06V_HBclI) komplementarny do sekwencji kodującej ostatnich dzewięć reszt regionu VH i miejsce Bell. Modyfikowany 106 VL zmieszano z każdym ze zmodyfikowanych 106 VH DNA, w obecności nadmiaru primera sensownego VL (hu 106V_LLSalI5') i primera sensownego VH (hu 106V_HBclI) tak, że indywidualny humanizowany 106 VL połączony był z każdym z indywidualnych humanizowanych 106 VH do siedmiu pojedynczych regionów, kodujących VL połączonych z VH, przez nakładające się wydłużanie PCR.

Kasety ekspresji humanizowanego genu 106 VL połączonego z VH sFv montowano następnie, w celu ekspresji sFv-Ig, w wektorze pUC-Ig. Wektor ten zawiera sekwencję lidera L6V_K, po niej miejsce Sali i miejsce Bell, poprzedzające sekwencję, kodującą zawias-CH₂CH₃ ludzkiej IgGl i kodon przestankowy oskrzydlony przez miejsce Xbal. Cysteiny zawiasu zmutowano do seryn, aby uprzywilejować monomerycznąekspresję białka połączonego sFv-Ig. Kasety ekspresji genu 106 VL połączonego z VH sFv cięto za pomocąóG// i Bell i poddano ligacji do podobnie trawionego pUC-Ig. DH5a E. coli transformowano konstrukcjami i kolonie przesiano pod względem insertów. Sześć z siedmiu konstrukcji VH wtrącono odpowiednio do pUC-Ig. Całe kasety lider L6V_K/humanizowany 106 VL połączony z VH sFv/ludzka Ig, odcięto od pUC-Ig, stosując Hindlll i Xbal i przeniesiono do wektora ekspresji ssaka pCDM8 oraz namnożono przez transformację w E. coli szczepu MC1061/p3. Z sześciu, pięć wytrącono odpowiednio do pCDM8. Dna odzyskano z każdej konstrukcji, w celu transfekcji komórek COS.

Przeprowadzono transfekcję komórek COS na całą skalę w płytkach do hodowli tkanek o 60 mm, metodą DEAE-dekstranu. Trzy ml supematantu transfekcyjnego odzyskano z każdej płytki, po trzech dniach hodowli i testowano pod względem obecności rozpuszczalnego białka połączonego sFv-Ig testem Western biot i ELISA. W dodatku, przeprowadzono sandwiczowy test ELISA przeciw ludzkiej Ig, aby kwantyfikować ilość białka, którego ekspresja zachodzi w każdej konstrukcji i zmierzono wielkość wiązania różnych białek do gp39 przez analizę Biacore.

G. Wstępna analiza humanizowanego 106 sFv, którego ekspresja zachodzi przez krótkotrwałą transfekcję w komórkach COS

SDS-PAGE i Western biot supematantów transfekcyjnych wykazała, że z pięciu konstrukcji użytych do transfekcji komórek COS (humanizowane 106 sFv, zawierające fragmenty 106 VH: 106vhT-DS, 106vhT-SS, 106vhT-SY, 106vhA-DYi 106vhA-SY), cztery wydzielały białko do supematantu. Nie było białka, z ekspresji humanizowanego 106 sFv, zawierającego 106vhT-SY (huVL/106vhT-SY). Z czterech fragmentów, u trzech zachodziła ekspresja białka o prawidłowej wielkości dla białka połączonego sFv-Ig (55 kDa). HuVL/106vhT-SS wytwarzał białko o błędnej wielkości (blisko 97 kDa). Poziomy ekspresji HuVL/106vhT-DS okazały się podobne do my

182 868 sich 106 sFv, podczas gdy ekspresja HuVL/106vhA-DY i HuVL/106vhA-SY zachodziła przy niższych poziomach.

Poziomy ekspresji kwantyfikowano za pomocą sandwiczowego testu ELISA, aby wykryć ogonek ludzkiej Ig. Płytki ELISA powleczono koziąlg przeciw ludzkąw PBS i blokowano w PBS + 0,1% BSA. Supematanty transfekcyjne inkubowano czyste i w rozcieńczeniu 1:5 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie płytki przemyto i inkubowano z kozią Ig przeciw ludzką, znakowanąperoksydazą chrzanową, w buforze do sprzęgania ELISA, przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej. Płytki przemyto ponownie i dodano rozcieńczenie 1:100 El A Buffered Substrate (Genetic Systems Corporation). Reakcję barwienia zatrzymano za pomocą 3 M H₂SO₄ i zmierzono gęstość optyczną przy 450-595 nm, czytnikiem płytek o wielu studzienkach Titertek Przybliżone stężenia białka określono przez porównanie ze znanym stężeniem CD40Ry 1 (CD40-Ig), które określono za pomocą zestawu do mierzenia stężenia białka Βίο-Rad. Stężenia białek wynosiły:

huVL/106vhA-DY	klon 10	0,62 μβ/ml
huVL/106vhA-DY	klon 12	0,82 μβ/τηΐ
huVL/106vhA-SY	klon 21	0,77 μ^τηΐ
huVL/106vhT-SY	klon 26	0,00 μβ/Γη!
huVL/106vhT-SS	klon 36	0,15 μβ/ιηΐ
huVL/106vhT-DS	klon 46	1,20 μg/ml

Supematanty testowano pod względem ich zdolności do blokowania ekspresji selektyny E na komórkach śródbłonkowych. Komórki ze śródbłonka ludzkiej żyły pępkowej (HuVECs, Clonetics Corporation) hodowano i stymulowano w Ml99 (Medium 199, Gibco BRL) z dodatkami do końcowych stężeń jak następuje: 4 nM glutaminy, 48,5 pg/ml penicyliny, 80 pg/ml streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu (Sigma), 90 pg/ml heparyny (Sigma), 30 pg/ml czynnika uzupełniającego wzrost śródbłonka (Collaborative Biomedical Products) i 20% płodowej surowicy bydlęcej. Komórki śródbłonka hodowane w kolbach do hodowli tkankowej, traktowano 1 % żelatyną i umiejscowiono na płytkach do hodowli tkanek Costar, o 96 studzienkach, o płaskim spodzie, w ilości 1,5 x 10⁴ komórek/studzienkę, które powleczono 1 pg/studzienkę fibronektyny (Collaborative Biomedical Products). Komórki śródbłonka stymulowano 1-2 dni po umiejscowieniu na płytkach. Komórki użyto przy pasażu 4 lub 5.

Dodano sgp39 i supematanty, zawierające humanizowane 106 sFv-Ig w Ml 99 plus dodatki, w ilości 100 μΐ na studzienkę i inkubowano w temperaturze 37°C przez 4 godziny przed oznaczeniem ekspresji selektyny E. Płytki przemyto potem dwukrotnie zimnym PBS, utrwalono przez 10 minut 0,5% aldehydem glutarowym w PBS, w temperaturze 4°C, przemyto cztery razy 3% koziąsurowicą/PBS/20 mM EDTA (bufor blokujący) i blokowano 1 godzinę w temperaturze 37°C lub przez noc w temperaturze 4°C w tym samym buforze. Komórki traktowano 100 μΐ selektyny anty E i P (R & D Systems) w ilości 0,25 pg/ml w buforze blokującym, przez 1 godzinę, w temperaturze 37°C. Płytki przemyto cztery razy buforem blokującym, inkubowano 1 godzinę w temperaturze 37°C z IgG anty-mysią, sprzężoną z peroksydazą chrzanową w buforze blokującym (Jackson ImmunoResearch, 100 μΐ/studzienkę, rozcieńczenie 1:2000) i potem przemyto cztery razy. Płytki wywołano, stosując odczynnik chromogenowy EIA w substracie buforowanym EIA (oba z Genetic Systems, 100 μΐ/studzienkę, rozcieńczenie 1:100) i zatrzymano 100 μΐ/studzienkę 1 N H₂SO₄. Określono absorbancję przy podwójnej długości fali, wynoszącej 450 nm i 630 nm.

HuVL/106vhA-DY, huVL/106vhA-SY i huVL/106vhT-DS, wszystkie hamowały ekspresję selektyny E, mimo że me tak skutecznie jak oryginalne mysie 106 sFv-Ig (fig. 13). Różnice można wytłumaczyć niższą ekspresją białka w huVL/106vhA-DY i huVL/l 06vhA-SY, mimo że huVL/l 06vhT-DS okazał się wykazującym ekspresję na poziomach porównywalnych z oryginalnym mysim 106 sFv-Ig.

182 868

Określono wielkość wiązania różnych białek sgp39, stosując Biacore. Oba HuVL/106vhA-SY i huVL/106vhT-DS wiązały mocno z płytkami powleczonymi gp39, z aktywnością porównywalną z oryginalnym mysim 106 sFv-Ig (fig. 14). Ponieważ białka te nie udały się, nie było jasne, czy powinowactwa tych sFv-Ig były bardzo wysokie (profile wyznaczonych powinowactw wynosiły K_D ~ 10'¹⁰ M lub więcej) albo czy białka były zagregowane i wiązały się wielowartościowo. HuVL/106vhA-DY udało się. Z jego profilu oszacowane powinowactwo wynosiło około Kd= 10'⁷do 10'⁸M. Oryginalny mysi 106 sFv-Ig zmierzono przy Kd = 1,6 χ 10'⁹M tak, że okazało się, że huVL/106vhA-SY i huVL/106vhT-DS są humanizowanym sFv anty-gp39 o wysokim powinowactwie.

Odkryto, że huVL/106vhA-SY i huVL/106vhT-DS wiązały się mocno z ludzkim gp39 i wykazywały aktywność funkcjonalną w hamowaniu ekspresji selektyny E na komórkach śródbłonka. Mimo, że huVL/106vhA-SY wykazał ekspresję o niższych poziomach niż huVL/106 vhT-D Sjest to „najbardziej ludzki” z humanizowanych 106 sFv.

Przykład 13. Wytwarzanie humanizowanego przeciwciała monoklonalnego 106 jako całego przeciwciała.

Przy użyciu humanizowanych 106 sFv-Ig jako matrycy, namnożono zmienne łańcuchy lekkie i trzy postacie zmiennego łańcucha ciężkiego drogąPCR, stosując primery, które wprowadziły sekwencję, kodującą sekwencję sygnałową ludzkiej matrycy przeciwciała. Te produkty PCR wtrącono do wektora, zawierającego sekwencje kodujące regiony stałe ludzkiego kappa (K) lub ludzkiego gamma 1 (γ 1), aby wytworzyć kompletny odpowiednio, łańcuch lekki lub ciężki. Wektory te zawierały także odpowiednie geny odporności na leki dla wytworzenia i namnożenia stabilnej linii komórek z ekspresją białka. Białka z każdej z trzech konstrukcji (patrz tabela 13 pod względem nomenklatury) wytworzono przez krótkotrwałą ekspresję w komórkach COS. Białka te testowano jako surowe supematanty w oznaczeniach inhibicji proliferacji komórek B, przy użyciu rozpuszczalnej gp39 (sgp39), w obecności IgM przeciw ludzkiej, produkcji przeciwciał przez komórki B stymulowane aktywowanymi komórkami T i indukcji ekspresji selektyny E na komórkach śródbłonka, przez linię komórek T gp39⁺.

Dalej, krótko opisuje się konstrukcję wektorów ekspresji dla humanizowanego przeciwciała monoklonalnego 106, anty-gp39, z aminokwasami Thr, Asp, Ser w pozycjach odpowiednio, 24, 55 i 56 (oznaczonych hl06-2). Konstrukcja wektorów ekspresji przebiegała przez serie pośrednich plazmidów, w których manipulowano różnymi regionami fiinkcjonalnymi i miejscami restrykcji. Także, zmontowano różne regiony, kodujące wymagane zmienne i inne domeny immunoglobulinowe.

Tabela 13 Nomenklatura

Sekwencja w pozycji 24, 55, 56	Alternatywne nazwy białek
TDS	mmm	hKl	h 106-2
ADY	hmh	hK6
ASY	hhh	hK8	hl06-l

Krótko, skonstruowano początkowo trzy plazmidy pD 13, pD 16 i pD 17 użyte w konstruowaniu wektorów ostatecznych i kaset ekspresji.

A. KonstrukcjapD13.

Plazmid pDl 3 skonstruowano i otrzymano z plazmidu pcDNA3 (Invitrogen) w dwóch etapach. Najpierw usunięto promotor/wzmacniacz SV40 i gen oporności na neomycynę, przez trawienie Nael i izolację fragmentu o 3,82 kb. Zamieniono go na promotor/wzmacniacz SV40 i gen dhfr z pSV2-dhfr. Sekwencję pSV2-dhfr izolowano jako fragment o 1,93 kb, po trawieniu PvuII i BamHI. Fragmenty o 3,82 i 1,93 kb poddano razem hgacji i użyto do transformowania bakterii MC 1061 po wypełnieniu wystających kodów fragmentu o 1,93 kb z pSV2-dhfr. Prawidłowy produkt (oznaczony pD 12) potwierdzono przez uwolnienie fragmentu o 890 bp, po trawieniu Hindlll.

182 868

W drugim etapie, polihnker zastąpiono alternatywnymi miejscami restrykcji przez trawienie uzyskanego powyżej wektora, za pomocą Asp 718 i Bsp 1201. Oligonukleotydy LH7 (Seq ID # 64) i LH8 (Seq ID # 65) poddano annealingowi i klonowano przez kloning ΕχοΙΙΙ (K. Hsio, 1993, Nuci. Acid. Res. 21,5528-5529) użyto do zakończenia plazmidu pD13. Uzyskany plazmid użyto do transformowania kompetentnego DH5aE·. coli i poprawny produkt potwierdzono przez sekwencjonowanie regionu polilinkera.

B Konstrukcja pD16 i pDl 7.

Plazmid pD16 otrzymano od pcDNA3 (Invitrogen) w seriach etapów, które dodawały (1) sekwencję polilinkera w górę od promotora CMV, w celu linearyzacji, (2) delecję promotora/wzmacniacza SV40 i genu oporności na neomycynę i zastąpienie ich sekwencjąterminacyjną transkrypcji histonu H3, promotorem SV40 (wzmacniacz usunięto) i genem DHFR oraz (3) insercję sekwencji terminacji transkrypcji gastryny w górę od promotora CMV. Plazmid pD17 uzyskano od pD16 przez usunięcie miejsca Nhel z polilinkera linearyzacji.

Plazmid pD 16 uzyskano od pcDNA3 (Invitrogen) najpierw przez trawienie Bglll i ligację oligonukleotydów LH1 (Seq ID # 58) i LH2 (Seq ID # 59) do plazmidu, po poddaniu oligonukleotydów annealingowi. Po ligacji, uzyskany plazmid (pcDNA3-LSI) użyto do transformowania kompetentnego DH5a E. coli i prawidłową konstrukcję potwierdzono przez uwolnienie fragmentu o 230 bp, po trawieniu enzymami restrykcyjnymi Nhel i Nrul.

Plazmid pcDNA3-LSI trawiono następnie NgoMI, Pvul i BsmI. Po trawieniu izolowano fragment NgoMI-PvuI o 2,9 kb. Plazmid pD 12 (opisany wyżej) trawiono Pvuli Spul, aby usunąć wzmacniacz SV40 i izolowano fragment o 3,6 kb. Oligonukleotydy LH3 (Seq ID #60) i LH4 (Seq ID # 61), kodujące sekwencję terminacji transkrypcji histonu H3 poddano annealingowi i następnie poddano ligacj i z fragmentem NgoMI-PvuI o 2,0 kb i fragmentem Pvul-Spul o 3,6 kb. Uzyskany plazmid pcTwD-LSl potwierdzono przez wytworzenie fragmentu o 3,3,0,95,085 i 0,63 kb po trawieniu Nhel [lus NciI i wytworzenie fragmentu o 4, 2, 1,0, 0,26 i 0,23 kb, po trawieniu SphI plus BstEIl.

Insercję sekwencji terminującej transkrypcję gastryny, w celu utworzenia plazmidu pDl 6, uskuteczniono przez trawienie pcTwD-LSl za ^omoc^BssHIUNarl i izolację fragmentu o 5,7 kb oraz ligację z poddanymi annealingowi oligonukleotydami LH5 (Seq ID #62) i LH6 (Seq ID #63). Po hgacji, produkt użyto do transformowania kompetentnego MC 1061 E. coli i prawidłowy produkt potwierdzono przez wytworzenie fragmentów o 4,8,0,66 i 0,31 kb, po trawieniu za pomocą NgoMI plus Spel i wytworzenie fragmentów o 3,3, 1,0, 0,82 i 0,67 kb w następstwie trawienia NgoMI plus Ncol.

Plazmid pD 17 uzyskano z pD 16 przez trawienie Bstll i Nheloraz wypełnienie wystających końców, przy użyciu polimerazy KJenowa. Mieszaninę reakcyjną poddano samoligacji i użyto do transformowania kompetentnego DH5a E. coli. Etap ten usunął miejsce Nhel z polilinkera linearyzacji i był ważny dla późniejszego etapu w konstrukcji pD 17-hG 1 a i pD 17-hK8.H 1 opisanego potem.

C Konstrukcja wektora ekspresji łańcucha lekkiego.

Wektor ekspresji dla lekkiego łańcucha humanizowanego 106, skonstruowano w dwóch fazach. Najpierw konstruuje się kasetę ekspresji łańcucha lekkiego, zawierającą ludzki gen C_K i po tym następuje konstrukcja kompletnego wektora ekspresji łańcucha lekkiego pD16-hK8.Ll (fig. 15).

Krótko, izolowano fragment EcoRI o 2,9 kb z pGk.l 1 (Walls i in., 1993, Nuci. Acid. Res. 21,2921-2929) i poddano go ligacji do plazmidu pDl 3 (opisanego wyżej) wcześniej trawionego EcoRI. Konstrukcję tą (pD13-hCka), zawierającą egzon ludzkiego C_K i sekwencje intronowe oskrzydlające, użyto do transformowania DH5a E. coli i prawidłowy produkt potwierdzono przez trawienie restrykcyjne. Trawienie za pomocąEcoRIdało w wyniku fragmenty o 5,7,2,8 i 0,3 kb, a trawienie SacI dało w wyniku fragmenty o 7,1, 1,1 i 0,5 kb.

Konstrukcję kasety ekspresji łańcucha lekkiego ukończono, usuwając z pD 13 fragment C_Kwzdłuż sekwencji oskrzydlających sekwencję polilinkera i wtrącając go do pD16. Plazmid pDl 3-hCka trawiono za pomocą Asp71811 Bsp 1201, aby uwolnić fragment C_K i sekwencje poli

182 868 linkera. Tych samych enzymów użyto do linearyzacji pD16 i fragment zawierający C_Kprzyłączono do pD 16, aby wytworzyć pD 16-hCka. Po transformacj i DH5a E. coli i namnożeniu, prawidłową konstrukcję potwierdzono przez uwolnienie fragmentu o 2,9 kb po trawieniu za pomocą Asp7181 i Bspl201 oraz linearyzacji, po trawieniu enzymem restrykcyjnym obecnym w pD 16, lecz nie w pD 13. Sekwencję nukleotydowąpotwierdzono także przez sekwencjonowanie różnych regionów konstrukcji.

W fazie drugiej konstrukcji wektora ekspresji łańcucha lekkiego, zmontowano sekwencję ohgonukleotydową, kodującą peptyd sygnałowy i sekwencję hl06 Vk i wtrącono do miejsc EcoRPi Xhol w pDl 6-hCka. Zmontowano sekwencję oligonukleotydową, kodującą sekwencję sygnałową i sekwencję hl06 Vk, przez PCR SOE (składanie przez wydłużanie nakładające się) (S.N. Ho i in., 1989, Gene 77,51 -59), stosując klon 10 hu 106VL jako matrycę i primery LH9 (Seq ID #66), LH10 (Seq ID #67), LH11 (Seq ID #68) i LH12 (Seq ID #69). W połączeniu, primery LH9, LH10 i LH11 kodująmiejsca restrykcji EcoRV, peptyd sygnałowy i koniec 5' w hul06 V_K. Primer LH2 koduje J_k, sekwencje intronowe i miejsca restrykcji Xhol. Do transformacji kompetentnego DH5aE. coli użyto kompletnąkonstrukcję, przez rekombinację homologiczną (Babek i in., 1993 Nuci. Acid. Res. 21, 3601-3602). Plazmid DNA z kolonii przesiano drogą PCR pod względem obecności insertów o 441 bp, w następstwie trawienia za pomocą Asp7181 \XhoI.

Ostateczna konstrukcja plazmidu opisana jest na fig. 15 i została dalej potwierdzona przez sekwencjonowanie całego insertu regionu V i niektórych regionów oskrzydlających. Klony, zawierające fragmenty o prawidłowych wielkościach oznaczono pD16-hK8.L!A, pD16-LK8.L!B, pD16-hK8.LlC. Sekwencjonowanie klonu pD16-hK8.L!A ujawniło jedną mutację w sekwencji nukleotydowej klonu, który nie wykazywał przerwania zdolności sekwencji do ekspresji białka i dawał w wyniku dojrzałe łańcuchy lekkie. Sekwencję kwasu nukleinowego (Seq ID #76) i sekwencję reszty aminokwasowej (Seq ID #77) przedstawiono na fig. 16. Mutacja zmieniła inicjacyjną sekwencję sygnałową metioniny na ATC, ale jest inna niż metionina, kodowana przez dwa kodony aminokwasowe w dół (fig. 16).

D. Konstrukcja wektora ekspresji łańcucha ciężkiego.

Wektory ekspresji humanizowanego łańcucha ciężkiego całego przeciwciała 106 konstruowano także w dwóch fazach. W fazie pierwszej, wprowadzono DNA, kodujące egzony CHI, CH2 i CH3 ludzkiego regionu stałego pasma gamma 1, do pD 17. W fazie drugiej, regiony zmienne przeciwciała monoklonalnego 106 zmontowano i włączono do wektora, zawierającego sekwencje dla stałych regionów łańcucha ciężkiego.

Stosując ρΝγ.12 (Walls i in., 1993, Nuci. Acid. Res. 21,2921-2929) jako matrycę, namnożono gen ludzkiego gamma 1, za pomocąPCR, przy użyciu primerów LH13 (Seq ID #70) i LH14 (Seq ID #71). Primer sensowny (LH 13) zawierał miejsca Ciał, dla kloningu do pIC20R, a po nim sekwencje ludzkiej domeny γ 1 5'CH 1. Zmontowano nukleotydy, kodujące pierwsze dwie reszty aminokwasowe (alanina i seryna) tak, żeby kodować miejsce restrykcji ATieZ(GCTAGC). LH14, primer antysensowny posiadał unikatowe miejsce BstEII w CHI, a po nim miejsce Xholdo kloningu do pIC20R. Fragment PCR o 0,2 kb i pIC20R (przedtem trawione Ciał i Xhoł), krótko traktowano egzonukleazą III i użyto w transformacji DH5a E. coli. Kolonie, zawierające inserty określono drogąPCR i zweryfikowano sekwencję DNA. Uzyskany plazmid oznaczono pIC-hGINhe-Bst.

Pozostałe części ludzkiego genomowego genu immunoglobuliny gamma 1, wtrącono do kasety ekspresji przez trawienie pNg.1.16 (Walls i m., jak wyżej) za pomocąHindllł i BamHI. Miejsce Hindllł jest tuż przy 5'CH1, podczas gdy miejsce BamHIjest przy 3' domeny CH3. pIC-hGlNhe.Bst trawiono Hindllł i BamHI i łączono z fragmentem Hindlll-BamHI w pNgl.16. Transformacja dała w wyniku plazmid, niosący koniec 5' genu gamma 1, a po nim pełny gen gamma. Potwierdzono to przez uwolnienie fragmentów o 3,1 i 2,6 kb, gdy plazmid trawiono EcoRł.

Powtórzona część genu gamma 1 została usunięta przez trawienie BstEII, samoligację plazmidu i transformację. Delecję powtórzenia potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA regionów wokół miejsca BstEII Uzyskany region, oznaczony pIC-hGINhe.Bam, zawiera gen

182 868 ludzkiego gamma 1, rozpoczynający przy kodonie 1 (ze sztucznym miejscem Nhel) poprzez miejsce 3' BamHl domeny CH3 ludzkiej gamma 1.

Następnie trawiono pIC-hGINhe.Bam za pomocąNAe/ i BamHl, aby uwolnić insert gamma 1. Insert gamma 1 przyłączono do pD 13 (opisanego wyżej), który uprzednio trawiono Nhel i BamHl i którego użyto do transformowania DH5a E. coli. Prawidłowy produkt oznaczony pD13-hGla potwierdzono przez wytworzenie fragmentów o 5,1 i 1,54 kb po trawieniu Bglll i wytworzeniu fragmentów o 3,55 i 3,25 kb po trawieniu Bglll i BamHl.

Skonstruowano z pD13-hGla kasetę ekspresji oznaczoną pDl7-hGla przez trawienie pD 13-hG 1 a za pomocą Asp7181 i BamHl i izolowanie fragmentu o 2,7 kb. Fragment ten zawiera gen ludzkiej gamma 1 i oskrzydlające sekwencje polilinkera. Do namnożenia pD 17 użyto bakterii DM1 (Dam ) i izolowany plazmid trawiono Asp7181 i Bell, co dało fragment wektora o 5,6 kb. Fragment, kodujący ludzką gamma 1 o 2,7 kb, dołączono do izolowanego fragmentu wektora i użyto do transformowania kompetentnego DH5a E. coli i właściwą konstrukcję potwierdzono przez uwolnienie fragmentów o 7,13 i 1,26 kg po trawieniu BstEl.

Konstrukcję wektora ekspresji łańcucha ciężkiego zakończono przez insercję fragmentu PCR, kodującego peptyd sygnałowy i sekwencję hl06 Vh ASY, do miejsc Nhel i Xhol pD 17-hG 1 a. Skonstruowano fragment PCR przez złożenie wydłużenia nakładającego, przy użyciu V_hASY24-17 (hhh) jako matrycę oraz primery LH15 (Seq ID #72), LH16 (Seq ID #73), LH17 (Seq ID #74) i LH18 (Seq ID #75). W połączeniu, primery LH15, LH16 i LH17 kodującą miejsce restrykcji EcoR V, peptyd sygnałowy i koniec 5' w h 106 V_K. Primer LH16 koduje część JH genu zmiennego łańcucha ciężkiego poprzez sztuczne miejsce Nhelprzy końcu 5' domeny CH1. Konstrukcja ta zapewnia brak intronów między domenami JH i CH 1. Reakcje PCR powtórzono z dwoma zewnętrznymi primerami (LH15 i LH18), aby zapewnić produkt o pełnej długości. Zewnętrzne primery zapewniają także wystarczające nachodzenie sekwencji wektora w docelowym regionie wektora, aby umożliwić kloning przez rekombinację homologiczną.

Aby wtrącić fragment PCR do pD 17-hG 1 a, użyto EcoR Vi Nhel do linearyzacji wektora i fragmenty łączono oraz użyto do transformacji kompetentnego DH5a£. coli przez rekombinację homologiczną (Babeck i in., 1993 Nuci. Acid. Res. 21, 3601-3602). Obecność insertu określono przez PCR i sekwencjonowanie regionu zmiennego. Fig. 17 jest przedstawieniem ostatecznej konstrukcji pD 17-hK8.H 1. Przeprowadzono sekwencjonowanie DNA dla insertu i regionów oskrzydlających, aby potwierdzić ostateczny produkt. Sekwencje kwasu nukleinowego (Seq ID #78) i reszty aminokwasowej (Seq ID #79) dla sekwencjonowanych regionów przedstawiono na fig. 18.

Skonstruowano także dwie inne konstrukcje, zawierające kodony, które kodują mysie reszty aminokwasowe w pozycjach 24,55 i 56 (pD 17-hKl .Η 1) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i ludzkich reszt aminokwasowych w pozycji 24 i 56 oraz mysią resztę aminokwasową w pozycji 55 (pD 17-hK6.H 1). Konstruowanie przeprowadzono w ten sam sposób jak opisano wyżej, dla pD17-hK8.HI, z wyjątkiem użytych matryc PCR, odpowiednio V_HTDS15-34 (mmm) i V_hADY7-8 (hmh).

Tabela 14

Pnmery użyte w konstruowaniu humanizowanego przeciwciała monoklonalnego 106

LH1 - primer 5' polilinkera miejsca linearyzacji w górę od promotora CMV

5'-GATCTGCTAGCCCGGGTGACCTGAGGCGCGCCTTTGGCGCC-3 ’ Seg ID #58

LH2 - primer 3’ polilinkera miejsca linearyzacji w górę od promotora CMV wpisany w orientacji 3' 5’,

182 868

3'-ACGATCGGGCCCACTGGACGCCGCGCGGAAACCGCGGCTAG-5 ’ Seq ID #59

LH3 - primer 5' sekwencji terminacji transkrypcji histonu H3, '-CCGGGCCTCTCAAAAAAGGGAAAAAAAGCATG-3 ’ Seq ID #60

LH4 - primer 3' sekwencji terminacji transkrypcji histonu H3, 3'-CGGAGAGTTTTTTCCCTTTTTTTC-5’ Seq ID #61

LH5 - primer 5’ sekwencji terminacji transkrypcji gastryny 5 ’ -CGCGCCGGCTTCGAATAGCCAGAGTAACCTTTTTTTTTAATTTTATTTTA

TTTTATTTTTGAGATGGAGTTTGG-3’ Seq ID #62

LH6 - primer 3’ sekwencji terminacji transkrypcji gastryny, 3' -GGCCGAAGCTTATCGGTCTCATTGGAAAAAAAAATTAAAATAAAATAAAA

TAAAAACTCTACCTCAAACCGC-5 ’ Seq ID #63

LH7 - polilinker kloningu dla pD13

5' -TAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCAATTTAAATTGATATCT CCTTAGGTCT

CGAGTCTCTAGATAACCGGTCAATCGATTGGGCTTCTT-3 ’ Seq ID #64

LH8 - polilinker kloningu dla pD13

5' GACACTATAGAATAGGGCCCTTCCGCGGTTGGATCCAACACGTGAAGCTA

GCAAGCGGCCGCAAGAATTCCAATCGATTGACCGGTTA 3' Seq ID #65

LH9 - primer sensowny regionu peptydu sygnałowego hu 106 VI

ATCTCCTTAGGTCTCGAGACCATGGACATGAGGGTTCCGGCTC Seq ID #66 LH10 - primer antysensowny regionu peptydu sygnałowego hu 106 VL

GGAGCCAGAGTAGCAGGAGCCCCAGGAGCTGAGCCGGAACCCTCA Seq ID #67 LH11 - primer sensowny regionu peptydu sygnałowego hu 106

VL

CTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTC

Seq ID #68

182 868

LH12 - primer antysensowny hu 106 VL, intron Jk i 3' GATTGACCGGTTATCTAGAGACTCGAGACT TACGTTTGATCTCGACCTTGG

Seq ID #69 LH13 - primer sensowny fragmentu Nhel do BstEII ludzkiego genu gamma 1, miejsca Ciał i Nhel podkreślono 5 ' GACCATGATTACGAATTCCATCGATGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC 3’

Seq ID #70 LH14 - primer antysensowny fragmentu Nhel do BstEII ludzkiego genu gamma 1, miejsca Xhol i BstEII podkreślono 5' AGCTTTCGCGAGCTCGAGGGTCACCACGCTGCTGAGGGA 3' Seq ID #71 LH15 - primer sensowny regionu peptydu sygnałowego hu 106 VH TTGCGGCCGCTTGCTAGCACCATGGAACTCGGCCTCCGCTGGGTT Seq ID #72 LH16 - primer antysensowny regionu peptydu sygnałowego hu 106 VH CTGGACACCTTCTAAAATAGCAACAAGGAAAACCCAGCGGAGGCCGAG Seq ID #7 3 LH17 - primer sensowny regionu peptydu sygnałowego hu 106 VH ATTTTAGAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG Seq ID #74 LH18 - primer antysensowny hu 106 VH, region JH-CH1 TGGGCCCTTGGTGCTAGCCGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCT Seq ID #75

Przykład 14. Testowanie humanizowanego przeciwciała monoklonalnego 106 pod względem aktywności biologicznej.

W tym przykładzie wytworzono trzy postacie humanizowanego przeciwciała monoklonalnego 106, przez krótkotrwałe ekspresje z komórek COS. Przeciwciała testowano pod względem (1) inhibicji proliferacji komórek B, (2) wytwarzania przeciwciał przez aktywowane komórki B stymulowane przez komórki T oraz (3) indukcji ekspresji selektyny E na komórkach śródbłonka.

Przeprowadzono transfekcję komórek COS jak opisano poprzednio (Linsley i in., 1991, J. Exp. Med. 173, 721-730; Aruffo i Seed, 1987, Proc. Natt. Acad. Sci. USA 84, 8573-8577). Do pożywek transfekcyjnych dodano plazmid DNA w ilości 1 pg/ml w całkowitej objętości 12 ml/płytkę o 150 mm. Po 7 do 10 dniach, pożywki hodowlane zebrano, wirowano w celu skalowania i przeprowadzono przez kolumnę sefarozowąz białkiem A, jak opisano powyżej. Potem kolumnę przemyto PBS i związane przeciwciało wymyto za pomocą 0,05 M cytrynianu sodu, pH 3,0. Frakcje zobojętniono, zlano i dializowano przeciw zimnemu PBS. Dializowany produkt elu

182 868 cji zatężono, stosując zatężacz Centriprep (Amersham) i określono stężenie białka, przez absorbancję przy 280 nm, z użyciem współczynnika ekstynkcji o 1,35 mlmg^cm'¹.

Określono inhibicję proliferacji komórek B przez rozpuszczalną gp39 (sgp39) i przeciw ludzką IgM, hodując 5 χ 10⁵ spoczynkowych komórek migdałkowych, w obecności sgp39, króliczych ciał odpornościowych przeciw ludzkich IgM i zmiennych ilości humanizowanego przeciwciała monoklonalnego 106, w 96-studzienkowych płytkach, przez 72 godziny w temperaturze 37°C, przy 6% CO₂. Następnie płytki traktowano w sposób pulsacyjny i 1 pCi/studzienkę [³H]-tymidyny przez 18 godzin i określono przyłączenie [³H]. Wszystkie testy przeprowadzono w trzech powtórzeniach i wyniki wyrażono jako procent inhibicji w porównaniu z hodowlami utrzymywanymi tylko w pożywce hodowlanej. Jak widać na fig. 19, wszystkie trzy humanizowane konstrukcje całego przeciwciała monoklonalnego 106, były zdolne do inhibicji stymulacji proliferacji komórek B przez rozpuszczalną gp39 i IgM przeciw ludzką. Konstrukcje, zawierające reszty aminokwasowe z mysiej sekwencji w pozycjach 24,55 i 56 były najbardziej podobne do oryginalnego mysiego przeciwciała 106.

Produkcję przeciwciał przez ludzkie obwodowe komórki B stymulowane aktywowanymi komórkami T, testowano jak opisano wyżej. Krótko, ludzkie komórki jednojądrzaste z krwi obwodowej , pozbawiono monocytów i komórkowych zabójców, a potem oddzielono do komórek T i komórek B przez rozetowanie E. Izolowane komórki T traktowano mitomycyną C i następnie hodowano wspólnie z komórkami B w studzienkach powleczonych przeciwciałem monoklonalnym anty-CD3, płytki o 96 studzienkach, w obecności zmiennych stężeń różnych postaci humanizowanych przeciwciał monoklonalnych 106. Wszystkie testy przebiegały w trzech powtórzeniach i wyniki wyrażono jako procent inhibicji, w porównaniu z hodowlami, które zawierały pożywkę, me zawierającąjakiegokolwiek przeciwciała monoklonalnego anty-gp39.

Jak widać na fig. 20, wszystkie przeciwciała były zdolne do co najmniej częściowego blokowania zdolności produkcji przeciwciał przez komórki B stymulowane aktywowanymi komórkami T. Żadne z humanizowanych przeciwciał nie było tak samo zdolne do blokowania wytwarzania przeciwciał, jak mysie przeciwciało monoklonalne 106 anty-gp39. Przeciwciało, posiadające mysie reszty aminokwasowe w pozycjach 24, 55 i 56, hl06-2 było najbliższe pełnego sukcesu.

Testowano także humanizowane konstrukcje całego przeciwciała pod względem ich zdolności zapobiegania indukcji ekspresji selektyny E na komórkach śródbłonka, przez linię komórek T gp39⁺. Jak opisano powyżej, z wyjątkiem tego, że ludzkie komórki śródbłonka z żyły pępkowej hodowano wspólnie z komórkami BMS-2 (linia Jurkat znana ze stałej ekspresji gp39) zamiast sgp39, w obecności humanizowanych przeciwciał monoklonalnych anty-gp39. Po czterech godzinach zmierzono poziom ekspresji selektyny E w teście ELISA. Fig. 21.

Wyniki tego oznaczenia, jak w poprzednich oznaczeniach, demonstrują, że wszystkie z humanizowanych konstrukcji całego przeciwciała, powodowały inhibicję interakcji między gp39 i CD40, zapobiegając w tym wypadku, indukcji ekspresji selektyny E na komórkach śródbłonka, przez aktywowane komórki T. Także, jak wykazano przez powyższe oznaczenia, konstrukcja, posiadająca mysie reszty aminokwasowe w pozycji 24,55156,hl06-2 była najbardziej podobna do rodzicielskiego przeciwciała monoklonalnego 106.

Depozyty linii komórkowych.

Następujące hybrydomowe linie komórkowe złożono w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-2776, USA na warunkach Układu Budapeszteńskiego.

182 868

Hybrydoma	Oznaczenie ATCC
39-1 29	HB 11808
39-1 132	HB 11809
39-1.134	HB 11810
39-1.106	HB 11811
39-1 7	HB 11812
39-1 37	HB 11813
39-1 77	HB 11814
39-1 59	HB 11815
39-1 122	HB 11816
39-1 156	HB 11817
39-1.128	HB 11818
39-1 124	HB 11819
39-1.26	HB 11820
39-1.138	HB 11821
39-1 3	HB 11822
39-7.3E12	HB 11823
____________________39-5 6E9_____________________
39-9 246
39-9.11
39-9 274

182 868

WYKAZ SEKWENCJI

1) INFORMACJE OGÓLNE:

i) ZGŁASZAJĄCY: Siadak, Anthony W. Hollenbaugh, Dianę L. Gilliland, Lisa K.

Gordon, Marcia L.

Bajorath, Jurgen Aruffo, Alejandro A. Harris, Linda J.

ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Przeciwciała monoklonalne specyficzne dla różnych epitopów ludzkiej gp39 i sposoby ich użycia w diagnozie i terapii iii) LICZBA SEKWENCJI: 79 iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:

A) ADRES: Bristol-Myers Sguibb Company

B) ULICA: 3005 First Avenue

C) MIASTO: Seattle

D) STAN: Waszyngton

E) KRAJ: USA

F) KOD: 98121

v) POSTAĆ ODCZYTYWALNA PRZEZ KOMPUTER:

A) TYP STEROWANIA: Stacja dyskietek

B) KOMPUTER: Zgodny z IBM PC

C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS

D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Realase #1,0, Wersja #1,25 vi) AKTUALNE DANE ZGŁOSZENIOWE:

A) NUMER ZGŁOSZENIA: PCT US 96/01119

B) DATA WYPEŁNIENIA: 26 styczeń 1996

C) KLASYFIKACJA:

viii)INFORMACJE O PEŁNOMOCNIKU/POŚREDNIKU

A) NAZWISKO: Poor, Brian W.

B) NUMER REJESTRACYJNY: 32 928

C) NUMER ŚWIADECTWA/POZWOLENIA: ON0133A ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:

A) TELEFON: (206) 727-3670

B) TELEFAKS: (206) 727-3601

182 868

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 1:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 51 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 1:

AATCCTCAAA ATGCGGCACA TGTGATCAGT GCGGCCAGCA GTAAAACAAC A

51

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 2:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 63 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa li) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 2:

CAAAATGCGG CACATGTGAT CAGTGAGGCC GCCAGTAAAA	40
CAGCATCTGT GTTACAGTGG GCT	63

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 3:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 54 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 3:

AGTAAAACAA CATCTGTGCT GCAGTGGGCT GAAGCAGGAT	40
ACTACACCAT GAGC	54

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 4:

i) CECHY SEKWENCJI:

182 868 ⁷⁵

A) DŁUGOŚĆ: 60 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 4:

AGTAĄĄACAA CATCTGTGCT GCAGTGGGCT GAAAAAGGAG 4 0

CCTACACCAT GAGCAACACT 60

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 5:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 5:

CAAGTCACCT TCTGTTCCGC TCGGGAGGCT TCGAGTCAAG CTCCA 45

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 6:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 51 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 6:

AGCCTCTGCC TAAAGTCCCC CGGGAGAGCC GCGAGAATCT 40

TACTCAGAGC T 51

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 7:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa

182 868 ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 7:

CGTCGATCTA GAGCATGTGC AAGTCCGATG AGTCCCCCCC CCCCCCC 47

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 8:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 8:

CGTCATAAGC TTCAGGAAGC ACACGACTGA GGCAC 35

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 9:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 9:

CGTCATAAGC TTGTCACCAT GGAGTTAGTT TG 32

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 10:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 10:

CGTCATAAGC TTGAACCAGT TGTATCTCCA CACCCAG

182 868

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 11:

1) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 384 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa li) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 11:

ATGAGTGTGC	CCACTCAGGT	CCTGGGGTTG	CTGCTGCTGT	40
GGCTTACAGG	TGCCAGATGT	GACATCCAGA	TGACTCAGTC	80
TCCAGCCTCC	CTATCTGCAT	CTGTGGGAGA	GACTGTCACC	120
ATCACATGTC	GAGCAAGTGA	GACTATTTAC	AGTTATTTAG	160
CTTGGTATCA	GCAGAAACAG	GGAAGATCTC	CTCAGCTCCT	200
GGTCTATAAT	GCAAAAACCT	TAGCAGAAGG	TGTGCCATCA	240
AGGTTCAGTG	GCAGTGGATC	AGGCACACAG	TTTTCTCTGA	280
AGATCAACAG	CCTGCAGCCT	GAAGATTTTG	GGAGTTATTA	320
CTGTCAACAT	CATTATAATA	CTCCGCTCAC	GTTCGGTACT	360
GGGACCAAGC	TGGAGCTGAA	ACGG		384

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 12:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 128 aminokwasów

B) TYP: aminokwas

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

v) TYP FRAGMENTU: N-termmalny xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 12:

^Mec Ser Val Pro Thr Gin Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr ¹⁵ 10 ₁₅

Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30

182 868

Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Thr 35 4045

Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Arg Ser Pro ⁵⁰ 5560

Gin Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val ProSer ^{65 70} 7580

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys IleAsn

9095

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr ¹⁰⁰ 105110

Asn Thr Pro Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 115 120125

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 13:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 414 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa

11) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 13:

ATGAACTTCG GGTTCAGCTT GATTTTCCTT GTCCTTGTTT TAAAAGGTGT CCAGTGTGAA 60

GTGAAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTA GTGAAGCCTG GAGGGTCCCT GAAACTCTCC 120

TGTACAACCT CTGGATTCAC TTTCAATAAC TATGCCATGT CTTGGGTTCG CCAGACTCCA 180

GAGAAGAGGC TGGAGTGGGT CGCATCCATT AGTAGTGGTG ATAGCACCTA CTATCCAGAC 240

AGTGTGAGGG GCCGATTCAC CATCTCCAGA GATAATGCCA GGAACATCCT GTATCTGCAA 300

ATGAGCAGTC TGAGGTCTGA GGACACGGCC ATGTATTACT GTGCAAGGCA CTATGATTAC 360

GACAGCTATG CTATGGACTA CTGGGGTCAA GGAACCTCAG TCACCGTCTC CTCA 414

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 14:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 138 aminokwasów

B) TYP: aminokwas

D) TOPOLOGIA: liniowa

11) TYP CZĄSTECZKI: białko

V) TYP FRAGMENTU: N-terminalny

182 868

X1) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 14:

Met 1

Asn

Phe

Gly

Phe 5

Ser

Leu

Ile

Phe

Leu 10

Val

Leu

Val

Leu

Lys 15

Gly

Val

Gin

Cys

Glu 20

Val

Lys

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly

Leu 30

Val

Lys

Pro

Gly

Gly 35

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser 40

Cys

Thr

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Asn

Asn 50

Tyr

Ala

Met

Ser

Trp 55

Val

Arg

Gin

Thr

Pro 60

Glu

Lys

Arg

Leu

Glu 65

Trp

Val

Ala

Ser

Ile 70

Ser

Gly

Asp

Ser 75

Thr

Tyr

Pro

Asp 80

Ser

Val

Arg

Gly

Arg 85

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg 90

Asp

Asn

Ala

Arg

Asn 95

Ile

Leu

Tyr

Leu

Gin 100

Met

Ser

Leu

A ref 105

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala 110

Met

Tyr

Cys

Ala 115

Arg

His

Tyr

Asp

Tyr 120

Asp

Ser

Tyr

Ala

Met 125

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin 130

Gly

Thr

Ser

Val

Thr 135

Val

Ser

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 15:

1) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 396 par zasad

3) TY?: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 15:

ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG TTCCACTGGT 60

GACATTGTGC TGACACAGTC TCCTGTTTCC TTAGCTGTAT CTCTGGGGCA GAGGGTCACC 120

ATCTCATGCA GGGCCAGCCA AAGTGTCAGT TCATCTACCA ATAGTTATAT GCACTGGTAC 180

CAACAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC CTCATCAAGT ATGCATCCAA CCTAGAATCT 240

GGGGTCCCTG CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT 300

CCTGTGGAGG AGGAGGATAC TGCAACATAT TACTGTCAGC ACAGTTGGGA GATTCCATTC 360

ACGTTCGGCT CGGGGACAAA GTTGGAAATA AGACGG

396

182 868

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 16:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 132 aminokwasy

B) TYP: aminokwas

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

v) TYP FRAGMENTU: N-terminalny xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 16:

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu 20

Val Ser Leu Gly Gin Arg Val Thr 3540

Val Ser Ser Ser Thr Asn Ser Tyr 5055

Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile 6570

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 85

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu 100

Gin His Ser Trp Glu Ile Pro Phe 115120

Glu Ile Arg Arg

130

Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1015

Thr Gin Ser Pro Val Ser Leu Ala 2530

Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 45

Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 60

Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 7580

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 9095

Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 105110

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 125

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 17:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa

11) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 17:

182 868

ATGGGATGGA GCTGGATCTT TCTCTTTCTC TTGTCAGGAA CTGGAGGTGT CCTCTCTGAG 60

GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTG GTGAAACCTG GGGCTTCAGT GAAGATGTCC 120

TGCAAGGCTT CTGGATTCAC TTTCAATAAC TATGCCATGT CTTGGGTTCG CCAGACTCCA 180

GAGAAGAGGC TGGAGTGGAT TGGAAATATT AATCCTAACA ATGGTGATAC TTTCTTCAAC 240

CAGAAGTTCG AGGGCAAGGC CACGTTGACT GTAGACAAAT CCTCCAGCGC AGCCTACATG 300

CAGCTCAACA GCCTGACATC TGAAGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG AGGGCCTGGG 360

ACGAACTACT TTGACTACTG GGGCCAAGGC ACCACTCTCA CAGTCTCCTC A 411

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 18:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 137 aminokwasów

B) TYP: aminokwas

D) TOPOLOGIA: liniowa

11) TYP CZĄSTECZKI: białko

v) TYP FRAGMENTU: N-terminalny xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 18:

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Gly Gly ¹ 5 1015

Val Leu Ser Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu ValLys

2530

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 4045

Thr Asp Tyr Tyr Met Lys Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 50 5560

Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Phe PheAsn ⁶⁵ 70 7580

Gin Lys Phe Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser SerSer

9095

Ala Ala Tyr Met Gin Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105110

Lys Lys Cys Ala Arg Gly Pro Gly Thr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120125

Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130135

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr

19:

182 868

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 19:

ATCGTCTAGG TCGACATTGT GCTGACACAG TCTCCTGTTT CC 42

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 20:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 60 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 20:

GCCACCCGAC CCACCACCGC CCGAGCCACC GCCACCCCGT 40

CTTATTTCCA ACTTTGTCCC 60

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 21:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 60 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 21:

TCGGGCGGTG GTGGGTCGGG TGGCGGCGGA TCTGAGGTCC 40

AGCTGCAACA GTCTGGACCT 60

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 22:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

182 868

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 22:

TCAGTGCTGA TCAGAGGAGA CTGTGAGAGT GGTGCCTTGG CC 4 2

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 23:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 23:

ATCGTCTAGG TCGACATCCA GATGACTCAG TCTCCAGCCT CC 42

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 24:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 60 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 24:

GCCACCCGAC CCACCACCGC CAGCGCCACC GCCACCCCGT 40

TTCAGCTCCA GCTTGGTCCCC 60

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 25:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 60 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 25:

182 868

TCGGGCGGTG GTGGGTCGGG TGGCGGCGGA TCTGAAGTGA 40

AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA 60

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 26:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 26:

TCAGTGCTGA TCAGAGGAGA CGGTGACTGA GGTTCCTTGA CC 42

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 27:

1) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 108 aminokwasów

B) TYP: aminokwas

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 27:

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

101S

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Thr Ile Tyr Ser Tyr 20 2530

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Arg Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 4045

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 5560

Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu GinPro

70 7580

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asn Thr ProLeu

9095

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100105

182 868

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 28:

1) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 108 aminokwasów

B) TYP: aminokwas

D) . TOPOLOGIA: Liniowa

11

) TYP

CZĄSTECZKI:

białko

Asp

v) TYP xi) OPIS Ile Gin Met

FRAGMENTU: SEKWENCJI: Thr Gin Ser

wewnętrzny SEQ ID nr Pro Ser Ser

28: Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1 Asp

Arg

Val

Thr

5 Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

10 Ser

Glu

Thr

Ile

Tyr

15 Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

20 Tyr

Gin

Lys

Pro

25 Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

30 Leu

Leu

Val

Tyr

Asn

35 Ala

Lys

Thr

Leu

Ala

40 Glu

Gly

Val

Pro

Ser

45 Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50 Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

55 Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

60 Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65 Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

70 Tyr

Tyr

Cys

Gin

His

75 His

Tyr

Asn

Thr

Pro

80 Leu

Thr

Phe

Gly

85 Gly

Thr

Lys

Val

Glu

90 Ile

Lys

Arg

95

100 105

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 29:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 108 aminokwasów

B) TYP: aminokwas

D) TOPOLOGIA: liniowa

11) TYP CZĄSTECZKI: białko

v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny κι) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 29:

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

10 15

182 868

Asp

Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser 30

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp 35

Tyr

Gin

Lys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Ile

Tyr

Ala 50

Ala

Ser

Leu

Gin 55

Ser

Gly

Val

Pro

Ser 60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Leu

Gin

Pro 80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr 85

Tyr

Cys

Gin

Gin 90

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro 95

, Leu

Thr

Phe

Gly

Gly 100

Gly

Thr

Lys

Val

Glu 105

Ile

Lys

Arg

2)

INFORMACJE

0 !

5EQ

ID

nr

3C

I:

1) A B D

CECHY SEKWENCJI: ) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów ) TYP: aminokwas ) TOPOLOGIA: liniowa

ii)

TYP

CZĄSTECZKI: białko

v)

TYP

FRAGMENTU

: wewnętrzny

xi) OPIS

SEKWENCJI

: SEQ ID nr 30

i ;

Glu 1

Val

Lys

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Lys

Leu 20

Ser

Cys

Thr

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Asn 30

Asn

Tyr

Ala

Met

Ser 35

Trp

Val

Arg

Gin

Thr 40

Pro

Glu

Lys

Arg

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala

Ser 50

Ile

Ser

Gly

Asp 55

Ser

Thr

Tyr

Phe 60

Asp

Ser

Val

Arg

Gly 65

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser 70

Arg

Asp

Asn

Ala

Arg 75

Asn

Ile

Leu

Tyr

Leu 80

Gin

Met

Ser

Leu 85

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr 90

Ala

Met

Tyr

Cys 95

Ala

Arg

His

Tyr

Asp 100

Tyr

Asp

Ser

Tyr

Ala 105

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly 110

Gin

Gly

Thr Ser Val Thr Val Ser

115

182 868

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 31:

1) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 115 aminokwasów

B) TYP: aminokwas

D) TOPOLOGIA: liniowa

u) TYP CZĄSTECZKI: białko

v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID nr 31:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser 20

Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro 3540

Ser Ile Ser Ser Gly Ile Tyr Tyr 5055

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 6570

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85

As^ Tyr Asp Ser Tyr Ala Met Asp 100

Thr Val Ser

115

Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15

Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala 25 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 45

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 60

Asn Ile Leu Tyr Leu Gin Met Asn 7580

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Tyr 9095

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 105HO

2^ INFORMACJE 0 SEQ ID nr 32:

l) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 109 aminokwasów

Bi TYP: aminokwas

D) TOPOLOGIA: liniowa

11) TY? CZĄSTECZKI: białko

v) TY? FRAGMENTU: wewnętrzny xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 32:

182 868

Glu Val Gin Leu Val 1 5

Ser Leu Arg Leu Ser 20

Ser Met Asn Trp Val 35

Ser Ser Ile Ser Ser 50

Gly Arg Phe Thr Ile 65

Gin Met. Asn Ser Leu 85

Arg Asp Tyr Trp Gly 100

Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10

Cys Ala Ala Ser Gly Phe 25

Arg Gin Ala Pro Gly Lys 40

Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr 55

Ser Arg Asp Asn Ala Lys 70 75

Arg Ala Glu Asp Thr Ala 90

Gin Gly Thr Leu Val Thr 105

Val Lys Pro Gly Gly 15

Thr Phe Ser Ser Tyr 30

Gly Leu Glu Trp Val 45

Ala Asp Ser Val Lys 60

Asn Ser Leu Tyr Leu 80

Val Tyr Tyr Cys Ala 95

Val Ser

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 33:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 96 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 33:

ATCGTCTAGA AGCTTGTCGA CATCCAGATG ACTCAGTCTC

CATCATCCCT ATCTGCATCT GTGGGAGATC GAGTCACCAT

CACATGTCGA GCAAGT 96

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 34:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 34:

TAGTAGCTTA GGTGCCTTTC CAGGTTTCTG CTGATACCAA GCTAA

182 868

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 35:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 60 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 35:

CCTGGAAAGG CACCTAAGCT ACTAGTCTAT AATGCAAAAA 40

CCTTAGCAAA AACCTTAGCA 60

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 36:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 36:

GAGATCGTCA GTGTAAAGTC TGTGCCTGAT CCACTGCCAC TGAAC 45

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 37:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 75 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 37:

GACTTTACAC TGACGATCTC AAGCCTGCAG CCTGAAGATT 4 0

TTGCAACTTA TTACTGTCAA CATCATTATA ATACT 75

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 38:

i) CECHY SEKWENCJI:

182 868

A) DŁUGOŚĆ: 82 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 38:

TCAGTGCTTC TAGAGCCACC CCGTTTGATC TCGACCTTGG 40

TCCCTCCACC GAACGTGAGC GGAGTATTAT AATGATGTTG AC 82

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 39:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 39:

ATCGTCTAGA AGCTTGTCGA CATC 24

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 40:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 40:

TCAGTGCTTC TAGAGCCACC CCGT 24

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 41:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 106 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

182 868 xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 41:

ATCGTCTAGA	AGCTTGAAGT	GCAGCTGGTG	GAGTCTGGAG	40
GAGGCTTAGT	GAAGCCTGGA	GGGTCCCTGA	GGCTCTCCTG	80
TGCAACCTCT	GGATTCACTT	TCAATA		106

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 42:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 106 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 42:

ATCGTCTAGA	AGCTTGAAGT	GCAGCTGGTG	GAGTCTGGAG	40
GAGGCTTAGT	GAAGCCTGGA	GGGTCCCTGA	GGCTCTCCTG	80
TGCAGCCTCT	GGATTCACTT	TCAATA		106

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 43:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 87 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 43:

TCAGTGCTCT AGAACCCTGC AGATCGAATT CAATGCTAGC 40

GACCCACTCC AGTCCCTTAC CTGGTGCCTG GCGAACCCAA GACATGG 87

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 44:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 97 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa

182 868 ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 44:

CTAGCATTAG TAGTGGTAGT TACATCTACT ATGCTGACAG

TGTGAAAGGC CGATTCACCA TCTCGAGAGA TAATGCCAAA

AACATCCTGT ATCTGCA

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 45:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 89 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 45:

GATACAGGAT GTTTTTGGCA TTATCTCTCG AGATGGTGAA40

TCGGCCTTTC ACACTGTCAG CATAGTAGAT GTAACTACCA8 0

CTACTAATG8 9

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 46:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 97 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 46:

CTAGCATTAG TAGTGGTGAT TACATCTACT ATGCTGACAG40

TGTGAAAGGC CGATTCACCA TCTCGAGAGA TAATGCCAAA80

AACATCCTGT ATCTGCA97

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 47:

i) CECHY SEKWENCJI:

182 868 93

A) DŁUGOŚĆ: 89 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 47:

GATACAGGAT GTTTTTGGCA TTATCTCTCG AGATGGTGAA 40

TCGGCCTTTC ACACTGTCAG CATAGTAGAT GTAATCACCA CTACTAATG 89

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 48:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 97 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 48:

CTAGCATTAG	TAGTGGTAGT AGCATCTACT ATGCTGACAG	40
TGTGAAAGGC	CGATTCACCA TCTCGAGAGA TAATGCCAAA	80
AACATCCTGT	ATCTGCA	97

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 49:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 89 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 49:

GATACAGGAT GTTTTTGGCA TTATCTCTCG AGATGGTGAA40

TCGGCCTTTC ACACTGTCAG CATAGTAGAT GCTACTACCA80

CTACTAATG8 9

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 50:

182 868

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 97 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 50:

CTAGCATTAG TAGTGGTGAT AGCATCTACT ATGCTGACAG40

TGTGAAAGGC CGATTCACCA TCTCGAGAGA TAATGCCAAA80

AACATCCTGT ATCTGCA97

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 51:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 89 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 51:

GATACAGGAT GTTTTTGGCA TTATCTCTCG AGATGGTGAA40

TCGGCCTTTC ACACTGTCAG CATĄGTAGAT GCTATCACCA80

CTACTAATG8 9

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 52:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 78 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 52:

ATCGTCTAGC TGCAGATGAA CAGTCTGAGG GCAGAGGACA 40

CGGCCGTCTA TTACTGTGCA AGGCACTATG ATTACGAC

182 868

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 53:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 53:

TCAGTGCTCT AGATGATCAG AGGAGACGGT GACCAGGGTT 40

CCTTGACCCC AGTAGTCCAT AGCATAGCT 69

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 54:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 54:

ATCGTCTAGG TCGACATCCA GATGACTCAG TCTCCATCAT CC 42

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 55:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 60 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 55:

GCCACCCGAC CCACCACCGC CAGCGCCACC GCCACCCCGT 4 0

TTGATCTCGA CCTTGGTCCC 60

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 56:

i) CECHY SEKWENCJI:

182 868

A) DŁUGOŚĆ: 60 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 56:

TCGGGCGGTG GTGGGTCGGG TGGCGGCGGA TCTGAAGTGC 40

AGCTGGTGGA GTCTGGAGGA 60

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 57:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 57:

TCAGTGCTGA TCAGAGGAGA CGGTGACCAG GGTTCCTTGA CC 42

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 58:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 58:

GATCTGCTAG CCCGGGTGAC CTGAGGCGCG CCTTTGGCGC C 41

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 59:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

182 868 xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 59:

ACGATCGGGC CCACTGGACG CCGCGCGGAA ACCGCGGCTA G 41

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 60:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 60:

CCGGGCCTCT CAAAAAAGGG AAAAAAAGCA TG 32

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 61:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 61:

CGGAGAGTTT TTTCCCTTTT TTTC 24

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 62:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 74 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 62:

CGCGCCGGCT TCGAATAGCC AGAGTAACCT TTTTTTTTAA 60

TTTTATTTTA TTTTATTTTT GAGATGGAGT TTGG

182 868

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 63:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 72 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 63:

GGCCGAAGCT TATCGGTCTC ATTGGAAAAA AAAATTAAAA 40

TAAAATAAAA TAAAAACTCT ACCTCAAACC GC 72

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 64:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 88 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 64:

TAGGGAGACC CAAGCTTGGT ACCAATTTAA ATTGATATCT 40

CCTTAGGTCT CGAGTCTCTA GATAACCGGT CAATCGATTG GGCTTCTT 88

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 65:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 88 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 65:

GACACTATAG AATAGGGCCC TTCCGCGGTT GGATCCAACA 4 0

CGTGAAGCTA GCAAGCGGCC GCAAGAATTC CAATCGATTG ACCGGTTA 88

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 66:

182 868

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 43 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 66:

ATCTCCTTAG GTCTCGAGAC CATGGACATG AGGGTTCCGG CTC 43

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 67:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 67:

GGAGCCAGAG TAGCAGGAGC CCCAGGAGCT GAGCCGGAAC CCTCA 45

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 68:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 52 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 68:

CTGCTACTCT GGCTCCGAGG TGCCAGATGT GACATCCAGA 4 0

TGACTCAGTC TC 52

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 69:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 52 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa

100

182 868 ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 69:

GATTGACCGG TTATCTAGAG ACTCGAGACT TACGTTTGAT 40

CTCGACCTTG G 51

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 70:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 53 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 70:

GACCATGATT ACGAATTCCA TCGATGCTAG CACCAAGGGC 40

CCATCGGTCT TCC 53

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 71:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 71:

AGCTTTCGCG AGCTCGAGGG TCACCACGCT GCTGAGGGA 39

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 72:

1) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 72:

182 868

101

TTGCGGCCGC TTGCTAGCAC CATGGAACTC GGCCTCCGCT GGGTT 45

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 73:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 48 par zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 73:

CTGGACACCT TCTAAAATAG CAACAAGGAA AACCCAGCGG AGGCCGAG 48

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 74:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 44 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: CDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 74:

ATTTTAGAAG GTGTCCAGTG TGAAGTGCAG CTGGTGGAGT CTGG 44

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 75:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 43 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedyncza

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 75:

TGGGCCCTTG GTGCTAGCCG AGGAGACGGT GACCAGGGTT CCT 43

2) INFORMACJE O SEQ ID nr 76:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: paty zasad

102

182 868

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: podwójna

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 76:

CTATAGGGAG ACCCAAGCTT GGTACCAATT TAAATTGATA TCTCCTTAGG TCTCGAGACC ATCGACATGA GGGTTCCGGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT CCGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC TCAGTCTCCA TCATCCCTAT CTGCATCTGT GGGAGATCGA GTCACCATCA CATGTCGAGC AAGTGAGACT ATTTACAGTT ATTTAGCTTG GTATCAGCAG AAACCTGGAA AGGCACCTAA GCTACTAGTC TATAATGCAA AAACCTTAGC AGAAGGTGTG CCATCAAGGT TCAGTGGCAG TGGATCAGGC ACAGACTTTA CACTGACGAT CTCAAGCCTG CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGT CAACATCATT ATAATACTCC GCTCACGTTC GGTGGAGGGA CCAAGGTCGA GATCAAACGT AAGTCTCGAG TCTCTAGATA ACCGGTCAAT CGATTGGAAT TCTAAACTCT GAGGGGGTCG GATG

120

180

240

300

360

420

480

514

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 77:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 146 aminokwasów

B) TYP: aminokwas

D) TOPOLOGIA: liniowa

11) TYP CZĄSTECZKI: białko

v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny

	xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ	ID	nr	77:
He 1	Asp	Ile Ser Leu Gly Leu 5	Glu	Thr	Ile 10	Asp Met Arg Val Pro Ala 15
Gin	Leu	Leu Gly Leu Leu Leu 20	Leu	Trp 25	Leu	Arg Gly Ala Arg Cys Asp 30
Ile	Gin	Met Thr Gin Ser Pro 35	Ser 40	Ser	Leu	Ser Ala Ser Val Gly Asp 45
Arg	Val 50	Thr Ile Thr Cys Arg 55	Ala	Ser	Glu	Thr Ile Tyr Ser Tyr Leu 60

182 868

103

Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val Tyr ⁶⁵ 70 ₇₅'

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 go95

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 100 105110

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr 115 120125

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Lys Ser Arg Val 130 135140

Ser Arg 145

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 78:

i) CECHY SEKWENCJI:

A) DŁUGOŚĆ: 553 pary zasad

B) TYP: kwas nukleinowy

C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: podwójna

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 78:

ACTATAGGGA GACCCAAGCT TGGTACCAAT TTAAATTGAT ATCTCCTTAG GTCTCGAGTC60

TCTAGATAAC CGGTCAATCG ATTGGAATTC TTGCGGCCGC TTGCTAGCAC CATGGAACTC120

GGCCTCCGCT GGGTTTTCCT TGTTGCTATT TTAGAAGGTG TCCAGTGTGA AGTGCAGCTG180

GTGGAGTCTG GGGGAGGCTT AGTGAAGCCT GGAGGGTCCC TGAGGCTCTC CTGTGCAACC240

TCTGGATTCA CTTTCAATAA CTATGCCATG TCTTGGGTTC GCCAGGCACC AGGTAAGGGA3 00

CTGGAGTGGG TCGCTAGCAT TAGTAGTGGT GATAGCATCT ACTATGCTGA CAGTGTGAAA3 60

GGCCGATTCA CCATCTCGAG AGATAATGCC AAAAACATCC TGTATCTGCA GATGAACAGT4 20

CTGAGGGCAG AGGACACGGC CGTCTATTAC TGTGCAAGGC ACTATGATTA CGACAGCTAT4 80

GCTATGGACT ACTGGGGTCA AGGAACCCTG GTCACCGTCT CCTCGGCTAG CACCAAGGGC540

CCATCGGTCT TCC553

2) INFORMACJE 0 SEQ ID nr 79:

i) CECHY SEKWENCJI:

104

182 868

A) DŁUGOŚĆ: 161 aminokwasów

B) TYP: aminokwas

D) TOPOLOGIA: liniowa ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr 79:

Pro Val Asn Arg Leu Glu Phe Leu Arg Pro Leu Ala Ser Thr Met Glu 15 1015

Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly Val Gin 20 2530

Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 35 4045

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn 50 5560

Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu GluTrp

70 7580

Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Asp Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp SerVal

9095

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr 100 105110

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 115 120125

Ala Arg His Tyr Asp Tyr Asp Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 130 135140

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 145 150 155160

Phe

182 868

FIC. 1A

FIC. IB

Liczba komórek ----------Liczba komórek

Logarytm fluorescencji

FIC. ID

Logarytm fluorescencji

182 868

FIG. 2C

Liczba komórek

FIG. 2B

FIG. 2D

Logarytm fluorescencji

182 868

Fig. 3

Miano

—o— mAb 106

.....o mAb 7 —0— Próba kontrolna mAb “’Δ”* CD40-Ig

Fig. 4A

182 868

Miano /00000 η

Fig. 4B

1000000-]

Fig. 5

182 868

Lider (msvptqvlgllllwltgarc) d i ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGTGACATC

1020

QMTQSPASLSASVGETVTITC R CAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAGACTGTCACCATCACATGTCGA

CDR1 3040

ASETIYSYLA WYQQKQGRS P Q L GCAAGTGAGACTATTTACAGTTATTTAGCTTGGTATCAGCAGAAACAGGGAAGATCTCCTCAGCTC

CDR260

L V Y N A K T L A E GVPSRFSGSGSG CTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGC

0 8090

TQFSLKINSLQPEDFGSYYC | Q H

ACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACAT

CDR3100

Η Y N T P L T FGTGTKLELKR CATTATAATACTCCGCTCACGTTCGGTACTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG

JK5

Fig. 6A

182 868 __________________________________Lider 1 (mnfgfsliflvlvlkgvq 7) e V k ATGAACTTCGGGTTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAG

1020

LVESGGGLVKPGGSLKLSCTTS CTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTACAACCTCT

CDR1______40

G F T F N | N Y A M S | WVRQTPEKRLEW

GGATTCACTTTCAATAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGG

50____________________CDR2_____60_________________

V A |SISSGDSTYYPDSVRG R F T I

GTCGCATCCATTAGTAGTGGTGATAGCACCTACTATCCAGACAGTGTGAGGGGCCGATTCACCATC

80 82 a b c

SRDNARNILYLQMSSLRS EDTA

TCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTATCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCC

CDR3______100 a b c

Μ Y Y C A R | Η Y D Y D S Y A M D | Y W G Q G T ATpTATTACTGTGCAAGGCACTATGATTACGACAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC

JH2

110

S V T V S S

TCAGTCACCGTCTCCTCA

Fig. 6B

182 868

SEKWENCJA NUKLEOTYDOWAI WYPROWADZONA AMINOKWASOWA 7 VL

Lider 1 (metdtlllwvlllwvp g s t g) d i

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATT

20 ___

VLTQSPVSLAVSLGQRVTI S C | R

GTGCTGACACAGTCTCCTGTTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGTCACCATCTCATGCAGG

CDR1 27 a b c d________30 40

ASQSVSSSTNSYM h| WYQQKPGQ

GCCAGCCAAAGTGTCAGTTCATCTACCAATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAG

CDR2 60

P P K L L I K | Y A S N L E S | GVPARFSG

CCACCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGC

7080

SGSGTDFTLNIHPVEEEDTATY

AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACATAT

90_____CDR3 100 y c |qhsweipft FGSGTKLEIRR

TACTGTCAGCACAGTTGGGAGATTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAGACGG

JK4

Fig. 7A

182 868

SEKWENCJA NUKLEOTYDOWAI WYPROWADZONA AMINOKWASÓW A 7 VL ____________________________________Lider 1 (m G W S W I FLFLLSGTGGVLS) E V Q

ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCTTGTCAGGAACTGGAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAG

1020

LQQSGPELVKPGASVKMSCKAS CTGCAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAACCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCT _____CDR1______40

G Y T F T | D Y Y Μ K | WVKQSHGKSLEW GGATTCACTTTCAATAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGG

52 a____________CDR2_________60_________________

I G NINPNNGDTFFNQKFEG KAT ATTGGAAATATTAATCCTAACAATGGTGATACTTTCTTCAACCAGAAGTTCGAGGGCAAGGCCACG

80 82 a b c

LTVDKSSSAAYMQLNSLTSEDS TTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCGCAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAAGACTCT

CDR3 100 a

A V V Y C A R GPGTNYFDY W G Q G T T

GCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGGCCTGGGACGAACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACT JH2

110

L T V S S CTCACAGTCTCCTCA

Fig. 7B

182 868

Płytka ELIS A powleczona gp39 myszy

Fig. 8A

OD450

Płytka ELISA powleczona gp39 człowieka

M >075 0 74-0.50

49-0.25

I < 024

106γ1 7y2b mr- 1 PBS

Sztuczne

Fig. 8B

182 868

Nasycenie wiązania (BMS-IO)

Transformacja scatchard

35000 ·

30000

25000 ω 20000 « N

S 15000 E a.

O 10000

5000

500 1000 1500 2000 2500 3000 a gp39 #106 (pM]

FIG 9A-1

- ·

2000 4000 6000 8000 1O000

Mtci<4-aA.o<norkę

FIG 9A-2

FIG. 9B-1

MictscaA.nmorkę

FIG 9B-2

182 868

Pętla LI

	2 3 3 0 0abcdef2 * * * GDRVTITCRAS 0 S I S S Y L N GDRVTITCRASETIYS Y L A G Ę T VTITCRASETIYS Y L A G N Η N_________________		Pętla L2		h h XI Η H m\| 4 (u Cm U« >« r- O Q Ω OQ Η Η H DUO en en en 0 0 0 en en en 4 0 0 O en en en Lu Ul u« er cc cc to o en en en CU CU 04 1 > > > 0 0 0 cniw id o ω ol< < J J l en\|H H enlx x << < en O 1 <12 z		m ca		9 9 0 0 Sabedef 0 * * 2_S YSTP LTFGGGTKVEIKR Η Η Y N T P LTFGGGTKVEIKR HHYNTP LTFGTGTKLELKR F W S A
> > > en en en < < < μ m en •-i o en en to en en <1 CU et et en en en O O O Η Η H r X X O O O q a o -J UD UD a3 3 « ° * o o o b “o £ g 2 O — CC « ^N vj cc ί N E 3 Ό “ > ” ~ «5 -id N Ό 23	3 4 5 0 4 ludzka Vkl/Jk konsensusu ludzka matryca WYQQKPGKAPKLL£Y hl06 WYQQKPGKAPKLLVY ml06 W Y Q Q K g G R S P 2 L L V Y lima zarodkowa ml 06 K		_______O O O__ O O O >· > >· Η H Ml < < d L< Lu Lu q a q ω ω ω 00 O CU CU Οι O O O J U ed Μ Μ M M en ζϊ r- ιη κι m >—< «3 to UD UD □ o o o o C^< rH OJ 03 E £ S E O cc Lid -id CC — -id ·° ^> 2 CC cc Jd N N CQ = J

Fig. 10

182 868

Pętla HI

1 1 Zlcn cn		Μ M h-<
1 * XXX		Η Η H
i <		Im Ui U«
Λ		a: a: a:
		0 0 0
	CO OJ >· > ><			χ x aux
	i w\|z z in			> > >
	no miz z w			ω tn cq
	6 Lu Ui U«		q a o
	Η Η H		ko o < < a·!
	-6 Ui Ut Ui		> >· >·
	♦ O 0 0		>· > >
en cn cn	Η Μ M HI
« < f- <	1 >· CD Z
< < HK		-* i cn no
U o U		< 0 <n\|0 0
cn cn en		Q <n tn en
CM O		u
α; α x	CM		xi
u D	X		(0 4 1
en cn en	Λ	ui oj i en cn ω
U 0 U		Μ »Η M U·
O 0 O	ui o i cn en ω
iL CU CL	cnl< <
O X X XI	> > >
> > >	3: 3:
u u	ω ω ω
rH o 0 0 0	•4 u
0 0 0	0 0 CCI
0 0 0	XXX
en lq cn	0 0 ωι
ω ω ω	CU Cu Cu
> > >	o < < Hl
►4 «-4 »-4	O O O
O O XI	a: o: a:
> > >	> > >
ω ω ω	s 5
3 « ^ω	3 Λ KO ω _Λ
52 Q o o	« υ o o
-4 »—( f—1	3 -i £
e § χ £ e « E § S c τΓ Ό £	= ε E °n C Λ § 2 ί N W ΤΓ Ό ?
I “	-i- .2 -L (L>
Ξζ (Λ	7^ vi
= s	ZZ N
·—' co	X
τ S
> -¾ _ ca	> -O ca ó?
5 c	c
N	Nł
no	“O
3	3

Fig. 11-1

182 868

Pętla H3

Ό ι ι ιι u I X XI

JO i < <I

Λ I >· >«I rH o o i <o eni ι α o i i > > i ι o η i i >« > i i X X I

	4	a a cc < < < u u o >· > >
σ\	o	> >· >
		> > n
		<<<
		Η Η H
		Q Q Q
		U Μ W	en en en
		< < ml	> > >
CD	en	X CC CC	iH r-« O Η Η H
	U	u u	> > >
	Λ	en en in	l J tnu
	<0	z Z sn!	Η Η H
co	(N	XXX	U O O
		o oo	1 O O O
CD	O		0 0 0
		>·>·>·	5
		J J J	!>·>>·
		H WlHH		i—< O ·—< 1 Q Q Q
		Z Z Z		^11 1
		X X 0C\|		*ΓΊ\|\| 1
		en < < <		*H 1 1 1
		__ . ΓΌ
		zzz _x		XII 1
		a O η Λ		θ' 1 1 1

	4	CC cc cc		Ή 1 1 1

r-	O	en en en		0) 1 1 1

Fig. 11-2

182 868

HindUI

2_______R

106vhT-5'

AT

106vhNEP-3'

Nhel Pstl

EcoRI Xbal

106vhA-NEP

HindlU

AA

106uhA-5'

106ohNEP-3'

Nhel Pstl

-M

106vhT-NEP

Nhel O/H

106uhSY para......AGTTAC..

106vhDY para ......GATTAC

106vhSS para ......AGT AGC ..

I Οόυ/iDS para ......G AT AGC .

Pstl

-EcoRI

Xbal

56 Xhol PstIO/H\

106vhA-SY 106vhT-SY 106vhA-DY 106vhT-DY 106vhA-SS 106vhT-SS 106vhA-DS 106vhT-DS

Xbal

106vhPst5‘

106vhXba3'

Bell

Fig. 12

182 868

Abs □ oym (gp39 EUSA)

Η । i (gp39 ELISA)

Ekspresja sdektvnv E

Fig. 13

182 868 (RU) 1400 -r

1200 “

1000 ςχ Mysil06sFvIg

800 -

8.

Ό O

600 -

400 -

200 4 huVU106vhA’DY

Z— hUVU106VhA SY huVU106vhT-SS, huVL/106vhT SY i negatywna próba kontrolna

-200 -0 —ΤΙ 000 —i-----2000

Czas —r3000 “1“

4000 —I

5000 (5)

Fig. 14

Fig. 15

182 868

980 990 1000 1010 10201030

CTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCAATTTAAATTGATATCTCCTTAGGTC GATATCCCTCTGGGTTCGAACCATGGTTAAATTTAACTATAGAGGAATCCAG

LeuEndGlyAspProSerLeuValProIleEndIleAspIleSerLeuGlyLeu

1040 1050 1060 1070 10801090

TCGAGACCATCGACATGAGGGTTCCGGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCC AGCTCTGGTAGCTGTACTCCCAAGGCCGAGTCGAGGACCCCGAGGACGATGAGACCGAGG

GluThrIleAspMetArgValProAlaGlnLeuLeuGlyLeuLeuLeuLeuTrpLeuArg

1100 1110 1120 1130 11401150

GAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCATCATCCCTATCTGCATCTGTGG CTCCACGGTCTACACTGTAGGTCTACTGAGTCAGAGGTAGTAGGGATAGACGTAGACACC

GlyAlaArgCysAspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly

1160 1170 1180 1190 12001210

GAGATCGAGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGACTATTTACAGTTATTTAGCTTGGT CTCTAGCTCAGTGGTAGTGTACAGCTCGTTCACTCTGATAAATGTCAATAAATCGAACCA

AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGluThrIleTyrSerTyrLeuAlaTrpTyr

1220 1230 1240 1250 12601270

ATCAGCAGAAACCTGGAAAGGCACCTAAGCTACTAGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAG TAGTCGTCTTTGGACCTTTCCGTGGATTCGATGATCAGATATTACGTTTTTGGAATCGTC

GlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuValTyrAsnAlaLysThrLeuAlaGlu

1280 1290 1300 1310 13201330

AAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGACTTTACACTGACGATCT TTCCACACGGTAGTTCCAAGTCACCGTCACCTAGTCCGTGTCTGAAATGTGACTGCTAGA

GlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrI leSer

1340 1350 1360 1370 13801390

CAAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACATCATTATAATACTCCGC GTTCGGACGTCGGACTTCTAAAACGTTGAATAATGACAGTTGTAGTAATATTATGAGGCG

SerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnHisHisTyrAsnThrProLeu

1400 1410 1420 1430 14401450

TCACGTTCGGTGGAGGGACCAAGGTCGAGATCAAACGTAAGTCTCGAGTCTCTAGATAAC AGTGCAAGCCACCTCCCTGGTTCCAGCTCTAGTTTGCATTCAGAGCTCAGAGATCTATTG

ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysArgLysSerArgValSerArgEndPro

1460 1470 1480 14901500

CGGTCAATCGATTGGAATTCTAAACTCTGAGGGGGTCGGATG GCCAGTTAGCTAACCTTAAGATTTGAGACTCCCCCAGCCTAC

ValAsnArgLeuGluPheEndThrLeuArgGlySerAsp

Fig. 16

182 868

Fig. 17

182 868

980 990 1000 1010 10201030

ACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCAATTTAAATTGATATCTCCTTAGGTCTCGAG TGATATCCCTCTGGGTTCGAACCATGGTTAAATTTAACTATAGAGGAATCCAGAGCTC ThrIleGlyArgProLysLeuGlyThrAsnLeuAsnEndTyrLeuLeuArgSerArgVal

1040 1050 1060 1070 10801090

TCTCTAGATAACCGGTCAATCGATTGGAATTCTTGCGGCCGCTTGCTAGCACCATGGAAC AGAGATCTATTGGCCAGTTAGCTAACCTTAAGAACGCCGGCGAACGATCGTGGTACCTTG

SerArgEndProValAsnArgLeuGluPheLeuArgProLeuAlaSerThrMetGluLeu

1100 1110 1120 1130 11401150

TCGGCCTCCGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAGAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGC AGCCGGAGGCGACCCAAAAGGAACAACGATAAAATCTTCCACAGGTCACACTTCACGTCG

GlyLeuArgTrpValPheLeuValAlaIleLeuGluGlyValGlnCysGluValGlnLeu

1160 1170 1180 1190 12001210

TGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCAA ACCACCTCAGACCCCCTCCGAATCACTTCGGACCTCCCAGGGACTCCGAGAGGACACGTT

ValGluSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaThr

1220 1230 1240 1250 12601270

CCTCTGGATTCACTTTCAATAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGGCACCAGGTAAGG GGAGACCTAAGTGAAAGTTATTGATACGGTACAGAACCCAAGCGGTCCGTGGTCCATTCC

SerGlyPheThrPheAsnAsnTyrAlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGly

1280 1290 1300 1310 13201330

GACTGGAGTGGGTCGCTAGCATTAGTAGTGGTGATAGCATCTACTATGCTGACAGTGTGA CTGACCTCACCCAGCGATCGTAATCATCACCACTATCGTAGATGATACGACTGTCACACT

LeuGluTrpValAlaSerIleSerSerGlyAspSerIleTyrTyrAlaAspSerValLys

1340 1350 1360 1370 13801390

AAGGCCGATTCACCATCTCGAGAGATAATGCCAAAAACATCCTGTATCTGCAGATGAACA TTCCGGCTAAGTGGTAGAGCTCTCTATTACGGTTTTTGTAGGACATAGACGTCTACTTGT

GlyArgPheThrlleSerArgAspAsnAlaLysAsnlleLeuTyrLeuGlnMetAsnSer

1400 1410 1420 1430 14401450

GTCTGAGGGCAGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGCAAGGCACTATGATTACGACAGCT CAGACTCCCGTCTCCTGTGCCGGCAGATAATGACACGTTCCGTGATACTAATGCTGTCGA

LeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgHisTyrAspTyrAspSerTyr

1460 1470 1480 1490 15001510

ATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCTAGCACCAAGG TACGATACCTGATGACCCCAGTTCCTTGGGACCAGTGGCAGAGGAGCCGATCGTGGTTCC

AlaMetAΞpTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrVal·SerSerAlaSerThrLysGly

15201530

GCCCATCGGTCTTCC

CGGGTAGCCAGAAGG

ProSerValPhe

Fig. 18

182 868

100%

80% *

60%

I (X 40%

20% *

—ο—mAb 106

- ο — hl 06-2 (mmm) —ώ—hmh —hl06-l (hhh)

0%-—— -----—3 01 0 1 1 10 mikrogramy/ml mAb

Fig. 19

100%

mikrogramy/ml mAb

Fig. 20

' ’ BMS-2 (brak mAb) —o— _{hl064 (hhh)}

---O--- hmh

Δ— h 106-2 (mmm)

Stężenie dodanegoprzeciwciała» ng/ml —□— mAb 106 (pierwotne)

-· niestymulowane

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Fig. 21

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Przeciwciała monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombmowane białko wiążące, znamienne tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postaciąludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością przy czym mutant zawiera tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135 lub lizynę 143 zamienione na alaninę, i (c) me reaguje z gp39 w teście Western biot.
2. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest wydzielane przez hybrydomę 39-1.3 oznaczoną ATCC HB11822, 39-1.122 oznaczoną ATCC HB 11816 lub 39-1.138 oznaczoną ATCC HB 11821.
3. Fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomę 39-1.3 oznaczoną ATCC HB11822, 39-1.122 oznaczoną ATCC HB 11816 lub 39-1.138 oznaczoną ATCC HB 11821.
4. Fragment wiążący antygen według zastrz. 3, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, F/ab^ lub Fv.
5. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 1, znamienne tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomę 39-1.3 oznaczoną ATCC HB11822, 39-1.122 oznaczoną ATCC HB 11816 lub 39-1.138 oznaczoną ATCC HB 11821.
6. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowanąpostacią ludzkiej gp39 z nieco zredukowaną zachłannością w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135 lub lizynę 143 zamienione na alaninę, i (c) nie reaguje z gp39 w teście Western biot.
7. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 6, znamienne tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-1 59 oznaczoną ATCC HB 11815.
8. Fragment wiążący antygen według zastrz. 7, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomę 39-1.59 oznaczoną ATCC HB 11815.
9. Fragment wiążący antygen według zastrz. 8, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, FCab^ lub Fv.
10. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 6, znamienne tym, że białkiem jest sFv, lub rekombinowane białko obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomę 39-1.59 oznaczoną ATCC HB 11815.
11. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowanąpostacią ludzkiej gp39 z nieco zredukowaną zachłannością wiązania w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera serynę 1 3 1 i treoninę 135, tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 2011 kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabązachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłanno-

182 868 ściąwiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129 lub lizynę 145 zamienione na alaninę, i (c) nie reaguje z gp39 w teście Western biot.
12. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 11, znamienne tym, ze przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.37 oznaczoną ATCC HB 11813 lub 39-1.132 oznaczoną ATCCHB 11809.
13. Fragment wiążący antygen według zastrz. 11, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomy 39-1.37 oznaczoną ATCC HB 11813 lub 39-1.132 oznaczoną ATCC HB 11809.
14. Fragment wiązący antygen według zastrz. 11, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, F/ab^ lub Fv.
15. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 11, znamienne tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.37 oznaczoną ATCC HB11813 lub 39-1.132 oznaczoną ATCC HB 11809.
16. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiązące, znamienne tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowanąpostacią ludzkiej gp39 z nieco zredukowaną zachłannością wiązania w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera serynę 1311 treomnę 135, tyrozynę 145, asparaginę 1801ubfenyloalaninę201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129 lub lizynę 143 zamienione na alaninę, i (c) reaguje z gp39 w teście Western biot.
17. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 16, znamienne tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.124 oznaczoną ATCC HB 11819 lub 39-1.156 oznaczoną ATCC HB 11817.

18 Fragment wiążący antygen według zastrz. 16, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomy 39-1.124 oznaczoną ATCC HB 11819 lub 39-1.156 oznaczoną ATCC HB 11817.
19. Fragment wiążący antygen według zastrz. 18, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, F/ab^ lub Fv.
20. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 16, znamienne tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.124 oznaczoną ATCC HB11819 lub 39-1.156 oznaczoną ATCC HB 11817.
21. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, żejest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 z nieco zredukowaną lub podobną zachłannością wiązania w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135, tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalamnę 2011 kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, obejmując lizynę 143 zamienioną na alaninę, i (c) nie wiąże z gp39 w teście Western biot.
22. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 21, znamienne tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.7 oznaczoną ATCC HB 11812, 39-1.128 oznaczoną ATCC HB 11818 lub 39-1 26 oznaczoną ATCC HB 11820
23. Fragment wiążący antygen według zastrz. 21, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomy 39-1.7 oznaczoną ATCC HB 11812, 39-1 128 oznaczoną ATCC HB 11818 lub 39-1.26 oznaczoną ATCC HB 11820.
24. Fragment wiążący antygen według zastrz. 23, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, Fiab^ lub Fv.
25. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 21, znamienne tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny prze

182 868 ciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.7 oznaczoną ATCC HB 11812, 39-1.128 oznaczoną ATCC HB 11818 lub 39 - 1.26 oznaczoną ATCC HB 11820.
26. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością wiązania, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135, tyrozynę 145, lub asparaginę 180 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, obejmując fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę i (c) nieco zredukowaną, zachłanność wiązania porównując zachłanność wiązania z mutantem gp39, z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera lizynę 143 zamienioną na alaninę, oraz (d) wiąże się z gp39 w teście Western biot.
27. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 26, znamienne tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.177 oznaczoną ATCC HB 11814 39-1.106 oznaczoną ATCC HB 11811 lub 39-1.134 oznaczoną ATCC HB 11810.
28. Fragment wiążący antygen według zastrz. 26, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomy 39-1.77 oznaczoną ATCC HB 11814 39-1.106 oznaczoną ATCC HB 11811 lub 39-1.134 oznaczoną ATCC HB 11810.
29. Fragment wiążący antygen według zastrz. 26, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, Fiab^ lub Fv.
30. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 26, znamienne tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomy 39-1.77 oznaczoną ATCC HB11814,39-1.106 oznaczoną ATCC HB 11811 lub 39-1.134 oznaczoną ATCC HB 11810.
31. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 30, znamienne tym, że białkiem jest 106 sFv-Ig, 7 sFv-Ig, humanizowane 106 sFv-Ig lub humanizowane 7 sFv-Ig
32. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 30, znamienne tym, że białkiem jest humanizowane przeciwciało monoklonalne 106.
33. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombmowane białko wiążące, znamienne tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp391 (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp391 gp39 dzikiego typu z podobną zachłannościąwiązania, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135, lizynę 143, tyrozynę 145, lub asparaginę 180 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę i (c) wiąże się z gp39 w teście Western biot.
34. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 33, znamienne tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-1.29 oznaczoną ATCC HB 11808.
35. Fragment wiążący antygen według zastrz. 33, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomę 39-1.29 oznaczoną ATCC HB 11808.
36. Fragment wiążący antygen według zastrz. 35, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, F(ab% lub Fv.
37. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 33, znamienne tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, wytworzonego przez hybrydomę 39-1.29 oznaczoną ATCC HB11808.
38. Przeciwciała monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością wiązania, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135, tyrozynę 145, lub asparaginę 180 zamienione na alaninę, (b) posiada nieco zredukowaną zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z gp39 dzikiego typu, przy czym mutant gp39 zawiera lizynę 143 zamienioną na alaninę, i (c) nie wiąże się z gp39 w teście Western biot.

182 868
39. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 38, znamienne tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-7.3E12 oznaczoną ATCC HB 11823.
40. Fragment wiążący antygen według zastrz. 38, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomę 39-7.3E12 oznaczoną ATCC HB 11823
41. Fragment wiążący antygen według zastrz. 40, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, FCab^ lub Fv.
42. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 38, znamienne tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała wytworzonego przez hybrydomę 39-7.3E12 oznaczoną ATCC HB11823.
43. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowanąpostacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością przy czym mutant zawiera kwas glutaminowy 129, zamieniony na alaninę, (b) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 z nieco zredukowaną zachłannością w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera serynę 131 i treoninę 135,asparagmę 180, lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, i (c) posiada słabą zachłanność wiązania, z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannością wiązania z gp 39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera lizynę 143 lub tyrozynę 145 zamienione na alaninę, oraz (d) nie reaguje z gp39 w teście Western biot.
44. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 43, znamienne tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-5.6E9 oznaczoną ATCC HB 12016.
45. Fragment wiążący antygen według zastrz. 43, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomę 39-5.6E9 oznaczoną ATCC HB 12016.
46. Fragment wiążący antygen według zastrz. 45, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, F(ab')₂ lub Fv
47. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 43, znamienne tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomę 39-5.6E9 oznaczoną ATCC HB 12016.
48. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowanąpostacią ludzkich gp39 z podobną lub nieco nieco zredukowaną zachłannością w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135, lizynę 143, tyrozynę 145, asparagmę 180, lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) reaguje z gp39 w teście Western biot.
49. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 48, znamienne tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-9.246 oznaczoną ATCC HB 12018.
50. Fragment wiążący antygen według zastrz. 48, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomę 39-9.246 oznaczoną ATCC HB 12018
51. Fragment wiążący antygen według zastrz. 45, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, F(ab% lub Fv.
52. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 48, znamienne tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomę 39-9.246 oznaczoną ATCC HB 12018.
53. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością, przy czym mutant zawiera kwa glutaminowy 129,serynę 131 itreoninę 135,tyrozynę 145lubfenyloalaninę201 ikwasglutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada nieco zredukowaną zachłanność w porównaniu z zachłannością wiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera lizynę 143 zamienioną na alaninę, i (c) posiada słabą zachłanność wiązania, z mutantem gp39,

182 868 w porównaniu z zachłannością wiązania z gp 39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać zawiera asparaginę 180 zamienionąna alaninę, oraz (d) nie reaguje z gp39 w teście Western biot.
54. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 53, znamienne tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-9.11 oznaczoną ATCC HB 12019.
55. Fragment wiążący antygen według zastrz. 53, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielonego przez hybrydomę 39-9.11 oznaczoną ATCC HB 12019.

56 Fragment wiążący antygen według zastrz. 55, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, Ftyb^ lub Fv.
57. Rekombinowane białko wiążące według zastrz. 53, znamienne tym, że białkiem jest sFv, humanizowane przeciwciało lub rekombinowane białko, obejmujące region zmienny przeciwciała, które jest wydzielane przez hybrydomę 39-9.11 oznaczoną ATCC HB 12019.
58. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością przy czym mutant zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135, tyrozynę 145 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada nieco zredukowaną zachłanność w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać gp39 zawiera lizynę 143 zamienionąna alaninę, i (c) posiada słabą zachłanność wiązania, z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp 39 dzikiego typu, przy czym zmutowana postać zawiera asparaginę 180 zamienionąna alaninę, oraz (d) nie reaguje z gp39 w teście Western biot.
59. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 58, znamienne tym, że przeciwciałem jest wydzielane przez hybrydomę 39-9.274 oznaczoną ATCC HB 12017.
60. Fragment wiążący antygen według zastrz. 58, znamienny tym, że fragment pochodzi od przeciwciała wydzielanego przez hybrydomę 39-9.274 oznaczoną ATCC HB 12017.
61. Fragment wiążący antygen według zastrz. 60, znamienny tym, że fragmentem jest Fab, F(ab% lub Fv.
62. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub jego rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że przeciwciało jest reaktywne z ludzką gp39, lecz nie jest wysoko reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, przy czym kwas glutaminowy w pozycji 129 jest zamieniony na alaninę.
63. Przeciwciało mpnoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 62, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez wiązanie z gp39 w teście Western biot
64. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 62, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub ich rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do rozpoznawania ludzkiej gp39 w teście Western biot.

. 65. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że przeciwciało jest reaktywne z ludzką gp39, lecz me jest wysoko reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, przy czym serynę w pozycji 131 i treoninę w pozycji 135 zamieniono na alaninę.

66 Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 65, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej^sprzez wiązanie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen z ludzką gp39 w teście Western biot.
67. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 65, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do rozpoznawania ludzkiej gp39 w teście Western biot.
68. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący antygen lub rekombinowane

182 868 białko wiążące jestreaktywne z ludzką gp39, lecz nie jest podobnie reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, w którym lizynę w pozycji 143 zamieniono na alaninę.
69. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 68, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do wiązania gp39 w teście Western biot.
70. Przeciwciało monoklonaihe, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 68, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez zdolność do wiązania gp39 w teście Western biot.
71. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący antygen lub rekombinowane białko wiążące jest reaktywne z ludzką gp39, lecz nie jest wysoko reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, w którym tyrozynę w pozycji 145 zamieniono na alaninę.
72. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 71, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do wiązania gp39 w teście Western biot.
73. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący antygen lub rekombinowane białko wiążące jest reaktywne z ludzką gp39, lecz nie jest podobnie reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, w którym asparaginę w pozycji 180 zamieniono na alaninę.
74. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 73, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do wiązania gp39 w teście Western biot.
75. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 73, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez zdolność do wiązania gp39 w teście Western biot.
76. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący antygen lub rekombinowane białko wiążące jest reaktywne z ludzką gp3 9, lecz nie jest wysoko reaktywne z mutantem ludzkiej gp39, przy czym fenyloalaninę w pozycji 201 i kwas glutaminowy w pozycji 202 zamieniono na alaninę.
77. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 76, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do wiązania gp39 w teście Western biot.
78. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 76, znamienne tym, że przeciwciało, fragment wiążący lub rekombinowane białko wiążące charakteryzuje się dalej przez niezdolność do wiązania gp39 w teście Western biot.
79. Sposób wykrywania zespołu hiper IgM związanego z X, znamienny tym, że obejmuje

a) izolację limfocytów z krwi obwodowej od pacjenta,

b) aktywację izolowanych limfocytów z krwi obwodowej,

c) utrwalenie i uczynienie przepuszczalnymi izolowanych i aktywowanych limfocytów z krwi obwodowej,

d) domieszanie przeciwciała monoklonalnego, fragmentu wiążącego antygen lub ich rekombinowanego fragmentu wiążącego według któregokolwiek z zastrz. 1-78, z aktywowanymi, utrwalonymi i przepuszczalnymi limfocytami z krwi obwodowej,

e) wykrycie przeciwciała związanego z komórkami.

182 868
80. Sposób według zastrz. 79, znamienny tym, że przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowany fragment wiążący sprzęga się z wykrywalnym znacznikiem.
81. Sposób według zastrz. 79, znamienny tym, że sposób zawiera dalej etap dodania znakowanego wtórnego przeciwciała specyficznego dla pierwszego przeciwciała, fragmentu wiążącego antygen lub ich rekombinowanego fragmentu wiążącego, po etapie (d).
82. Sposób według zastrz. 81, znamienny tym, że znacznikiem jest fluorofor, izotop radioaktywny, enzym lub chromofor.
83. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według któregokolwiek z zastrz. 1-78, sprzężone z wykrywalnym markerem.
84. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według zastrz. 83, znamienne tym, że wykrywalnym markerem jest fluorofor, izotop radioaktywny, enzym lub chromofor.
85. Przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące według któregokolwiek z zastrz. 1-78, znamienne tym, że przeciwciało sprzężone jest ze środkiem terapeutycznym.
86. Przeciwciało monoklonalne, białko wiążące antygen lub rekombinowane białko wiążące według zastrz 85, znamienne tym, że środkiem terapeutycznym jest radioizotop, toksyna lub środek chemioterapeutyczny.
87. Rekombinowane białko wiążące według któregokolwiek z zastrz. 1-78, znamienne tym, że rekombinowane białko wiążące zawiera region zmienny zdolny do wiązania z antygenem i toksyną białkową lub środkiem terapeutycznym w postaci białka połączonego.
88. Hybrydoma HB 11808, HB 11809, HB 11810, HB 11811, HB 11812, HB 11813, HB11814, HB 11815, HB 11816, HB 11817, HB 11818, HB 11819, HB 11820, HB 11821, HB 11822, HB 11823, HB 12016, HB 12017, HB 120181 HB 12019 którą zdeponowano w American Type Culture Collection.
89. Izolowana i oczyszczona sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobulmy, posiadająca sekwencję reszty aminokwasowej zgodną z Sequence ID# 12.
90. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 89, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest taka jak Sequence ID# 11.
91. Izolowana i oczyszczona sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, posiadająca sekwencję reszty aminokwasowej zgodną z Sequence ID# 14.
92. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 91, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest taka jak Sequence ID# 13.
93. Izolowana i oczyszczona sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobulmy, posiadająca sekwencję reszty aminokwasowej zgodną z Sequence ID# 16.
94. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 93, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest taka jak Sequence ID# 15.
95. Izolowana i oczyszczona sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, posiadająca sekwencję reszty aminokwasowej zgodną z Sequence ID# 18.
96. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 95, znamienna tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest taka jak Sequence ID# 17.
97. Kompozycja farmaceutyczna, obejmująca przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowany fragment wiążący według któregokolwiek z zastrz 1-781 farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
98. Kompozycja farmaceutyczna, obejmująca przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowany fragment wiążący według któregokolwiek z zastrz 1-78 sprzężone z wykrywalnym markerem i farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

182 868
99. Kompozycja farmaceutyczna, obejmująca przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowany fragment wiążący według któregokolwiek z zastrz 1-78 sprzężone ze środkiem terapeutycznym i farmaceutycznie dopuszczalnym środkiem.
100. Środek farmaceutyczny do inhibicji aktywacji komórek B, co w szczególności zapobiega odrzuceniu przeszczepionego narządu, schorzeniom związanym z odrzuceniem przeszczepu, odpowiedzi alergicznej, odpowiedzi zapalnej, lub odpowiedzi autoimmunologicznej takiej jak łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów, układowy liszaj rumieniowaty lub cukrzyca, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, które jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością przy czym mutant zawiera tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, a zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135 lub lizynę 143 zamienioną na alaninę, i (c) me reaguje z gp39 w teście Western biot.
101. Środek farmaceutyczny do inhibicji wzrostu komórek guza nowotworowego, wykazujących ekspresję antygenu gp39, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jego czynnik aktywny zawiera przeciwciało monoklonalne, fragment wiążący antygen lub ich rekombinowane białko wiążące, które jest specyficzne dla ludzkiej gp39 i (a) wiąże się ze zmutowaną postacią ludzkiej gp39 i gp39 dzikiego typu z podobną zachłannością przy czym mutant zawiera tyrozynę 145, asparaginę 180 lub fenyloalaninę 201 i kwas glutaminowy 202 zamienione na alaninę, (b) posiada słabą zachłanność wiązania z mutantem gp39, w porównaniu z zachłannościąwiązania z gp39 dzikiego typu, a zmutowana postać gp39 zawiera kwas glutaminowy 129, serynę 131 i treoninę 135 lub lizynę 143 zamienione na alaninę, i (c) nie reaguje z gp39 w teście Western biot, przy czym przeciwciało to jest sprzężone ze środkiem terapeutycznym.
102. Środek według zastrz. 101, znamienny tym, że środkiem terapeutycznym j est izotop radioaktywny lub toksyna.

103 Sposób zobrazowania komórek, wykazujących ekspresję gp39 na ich powierzchni u pacjenta, obejmujący: a) podanie pacjentowi kompozycji farmaceutycznej według zastrz. 97 w warunkach, pozwalających na utworzenie kompleksu białko wiążące/antygen na powierzchni komórek, wykazujących ekspresję gp39, oraz b) obecności kompleksu białko wiążące/antygen na powierzchni komórek, co wskazuje się przez obecność wykrywalnego markera.

* * *

Zgłoszenie to jest częściową kontynuacją zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych nr 08/379 057, wypełnionego 26 stycznia 1995 i włącza się go w całości.

Powodzenie odpowiedzi immunologicznej wymaga skoordynowanej interakcji wielu typów komórek. Interakcja między komórkami pomocniczymi T (Th) i komórkami, prezentującymi antygen (APC), takimi jak komórki B, monocyty i komórki dendrytyczne, wynika ze złożonej komunikacji, obejmującej sygnały otrzymywane poprzez rozpuszczalne cytokmy lub białka związane z błoną a także interakcje cząstek adhezyjnych. Wiele z tych sygnałów jest niespecyficznych dla bezpośredniej odpowiedzi immunologicznej, a białka są szeroko rozprowadzane.

Zidentyfikowano liczne ważne białka powierzchniowe komórki T, związane z interakcjami między komórkami, włączając CD2, CD4, CD8, CD28, LFA-1, CTLA-4 i gp39. Białka te mają udział w stykaniu się komórek przez wiązanie do nich odpowiednich receptorów na APC i dostarczenie istotnych sygnałów kostymulatorowych do komórek T, które modulują sygnały otrzymane poprzez receptor antygenowy komórki T. Te sygnały kostymulatorowe są niezbędne dla komórki T do pełnego zaangażowania i wykazania ekspresji czynników zarówno związanych z błonąjak i rozpuszczalnych wymaganych dla prawidłowej aktywacji komórek efektorowych

182 868 zależnych od komórek T (komórki B, naturalni zabójcy komórek, monocyty, neutrofile itd.). Para ligand gp39/CD40 komórki T/receptor komórki B, odgrywa krytyczną rolę w humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Badania in vitro pokazały, że ta para receptor/hgand, związana jest z prohferacjąkomórek B, produkcjąprzeciwciał i cytokin oraz żywotnościąkomórkową Badania in vivo, zarówno przez blokowanie za pomocą przeciwciała monoklonalnego jak i drogą obserwacji defektu genetycznego w gp39, potwierdziły wyniki in vitro i poszerzyły je o wymaganie funkcjonalnego gp39, dla tworzenia ośrodka rozmnażania w trakcie odpowiedzi immunologicznej na antygen. CD40 jest glikoproteiną błonową typu 1, o 50 kDa, której ekspresja zachodzi w komórkach B, makrofagach, grudkowych komórkach dendrytycznych, nabłonka grasiczego, normalnego nabłonka podstawowego, linii komórkowych, pochodzących od niektórych raków i czerniaka (Clark i Ledbetter 1986, Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 83,4494; Paerhe i in., 1985, Cancerlmmunol Immunother. 20,23, Ledbetter i in., 1987, J Immunol, 138 788; Young i in., 1989, Int.J Cancer 43, 786; Gały i Spits 1992, J.Immunol. 149, 775; Alderson i in., 1993, J Exp Med. 178, 669) i niedawno donoszono, że ich ekspresja zachodzi na komórkach T (Armitage i in., 1993, Eur.J.Immunol. 23, 2326). Okazało się, że jest to ważna cząsteczka sygnałowa z szeregiem dalszych skutków w wielorakich układach. Wcześniejsze badania pokazały, że CD40 związana była z aktywacją komórki B. Sieciowanie CD40 z monoklonalnym przeciwciałem anty-CD40 indukuje agregację komórki B poprzez LFA-1 (Gordon i in., 1988, J.Immunol. 140, 1425, Barret i in , 1991, J.Immunol. 146, 1722), zwiększa fosforylację Ser/Thr (Gordon i in., 1988, jak wyżej) i Tyr (Uckun i in., 1991, J.Biol.Chem. 266, 17478) licznych substratów wewnątrzkomórkowych oraz dostarcza sygnałów „kompetencji”, które umożliwiają komórkom B proliferację i zmianę klasy, gdy sąone stymulowane odpowiednim drugim sygnałem. Np. przeciwciało monoklonlane anty-CD-40 może współdziałać z PMA (Gordon i in., 1987, Eur.J.Immunol. 17, 1535) albo z przeciwciałem monoklonalnym anty-CD20 (Clark i Ledbetter 1986 jak wyżej), aby indukować proliferację komórek B, z IL-4, aby indukować proliferację komórek B (Gordoniin., 1987, jak wyżej; Roussetim., 1991, J.Exp.Med. 172, 705) i sekrecję IgE (Jabarai in., \999,J.Exp.Med.l72,1861; Gascan i in., 1991, J. Immunol. 147, 8; Rousset i in., 1991,jak wyzej\ Zhang i in., 1991, J.Immunol. 146, 1836; Shapira i in., 1992, J.Exp Med. 175,289) oraz z IL-10 i TGF-β, aby indukować sekrecję IgA przez komórki B s!gD⁺ (DeFrance i m, 1992, J Exp. Med. 175, 671).

Izolacja klonu cDNA, kodującego CD40 (Stamenkovic i in., 1989, EMBOJ 8,1403) pokazuje, że CD40 posiada znaczną homologię do rodziny receptora nerwowego czynnika wzrostu. Przy użyciu rozpuszczalnej postaci CD40, białek połączonych immunoglobuliny-CD40 (CD40-Ig) (Armitage i in., 1992, Naturę 357,80; Lane i in., 1992, J.Eur.Immunol, 22, 2573; Noelle i in., 1992, Proc.NatH.Acad.Sci.USA89,6550), odkryto, że ekspresja ligandu CD40 (gp39, CD40-L), białka o blisko 39 kDa, zachodziła w aktywowanych ludzkich i mysich komórkach T. W dodatku, badania blokowania z CD40-Ig (Fanslow i in., 1992, J.Immunol, 149,655; Noelle i in., 1992, jak wyżej) lub z przeciwciałem monoklonalnym przeciw mysim gp39 (MR1) (Noelle i in., 1992, jak wyżej) pokazały, że zapobiegnięcie połączeniu gp39-CD40 dało w rezultacie inhibitację biologicznych odpowiedzi komórki B.

Komplementarny DNA, kodujący zarówno mysią (Armitage i in., 1992, Naturę 357, 80) jaki ludzką(Hollenbaugh lin., 1992EMBO. J7/,4313;Sprigsiin., 1992,J.Exp.Med. 176,1543) gp39 albo rozpuszczalnąpostać rekombinacyjnągp39 i IL-4 lub gp391 IL-10, może skłonić ludzkie komórki B do sekrecji odpowiednio IgE i IgA, lub IgG i IgM Aruffo i in., 1993, Celi 72,291). Wyniki te, zebrane razem, sugerują że gp39 może być „przełącznikiem” komórki T, odpowiedzialnym za niektóre aspekty różnicowania komórki B i izotyp przełączania (Noelle i in., 1992, Immunol. Today 13, 431).

Ostatnio, gen kodujący gp39 zmapowano do Xq26, regionu chromosomu X, gdzie zmapowany został poprzednio gen odpowiedzialny za zespół hiper IgM (HIM) (Aruffo i in., 1993, Celi 72, 291). Odkryto, że cząsteczki gp39 u pacjentów z HIM są funkcjonalnie nienormalne. Odkryto, że aktywowane komórki T produkowały normalne poziomy mRNA, lecz kodowany gp39 ma defekt (Aruffo i in., 1993, jak wyżej ; DiSanto i in., 1993, Naturę 361, 541).

182 868

Zespół hiper-IgM jest jednym z co najmniej siedmiu dziedziczonych niedoborów immunologicznych mapowanych do chromosomu X (Kinnon i Levinsky 1992, J.Inherit. Metab.Dis. 15, 674). Choroba charakteryzuje się niskim poziomem lub niedogodnością IgG, IgA i IgE, normalnym lub podwyższonym poziomem IgM, normalną liczbą krążących komórek B, wrażliwością na bakteryjne i oportunistyczne infekcje (włączając Pneumocystic carinii), brakiem ośrodków rozmnażania, autoodpomością neutropenią, postaciami związanymi z X i autosomalnymi, i defektami genowymi ligandu gp39 w postaci choroby związanej z X. Zwykły zmienny niedobór odporności (CVI) jest inną grupą zaburzeń niedoboru odporności, charakteryzującą się nienormalnymi odpowiedziami przeciwciał i nawrotowymi infekcjami.

Kliniczne prezentacje CVI sąrozmaite, ponieważ zaburzenia opisane tym terminem obejmują szeroką różnorodność nieokreślonych defektów. Stany chorobowe opisane jako CVI zazwyczaj wykazują zmniejszenie ilości lub nieobecność IgG i IgA w surowicy, podczas gdy poziomy IgM mogą być normalne lub zmniejszone. Mimo, że większość pacjentów z CVI posiada normalną liczbę komórek T i ich odpowiedzi, niektórzy mogą mieć ich mniejszą liczbę, nienormalne stosunki komórkowe CD4/CD8 lub nienormalną funkcję komórek T. Istnieje także zwiększone prawdopodobieństwo przeciwciał autoodpomości w tej populacji pacjentów.

Mutacje w genie, kodującym gp39 wymkająz delacji, dających wzrost zmian fazy odczytu i kodony przedwcześnie zatrzymujące, albo mutacji punktowych, wynikających z substytucji aminokwasowych (Allen i in., Science259,1993,990; DiSanto i in., 1993, jak wyżej; Fuleichen i in., 1993 jak wyżej Korthauer i in., 1993, jak wyżej, Aruffo i in., 1993, jak wyżej, Collard i in., 1993, Immunol Today 14, 559). Wpływ tych mutacji na ekspresję gp39 w aktywowanych komórkach T, przebadano przy użyciu rozpuszczalnych CD40-Ig, przeciwciał poliklonalnych powstałych przeciw bakteryjnym białkom połączonym gp39 (anty-TRAP) (Graf i in., 1992, Eur.J.Immunol 22, 3191; Korthauer i in., 1993, Naturę 361, 539) specyficznych dla gp39 przeciwciał monoklonalnych 5c8 (Lederman i in., 1992, J.Exp.Med. 175,1091). Barwiąc z rozpuszczalnym CD40-Ig, odkryto brak ekspresji gp39, podczas gdy dla anty-TRAP, była ona normalna w komórkach T jednego z trzech testowanych pacjentów, który potwierdził użycie przeciwciała monoklonalnego. Wyniki te pokazują że ekspresja gp39 jest zmienna u pacjentów z HIM i zasugerowano dalszą potrzebę pracy dla określenia czy zmienność w ekspresji powierzchniowej zmutowanych postaci gp39 koreluje z ciężkościąprzebiegu choroby HIM. Przy braku historii rodźmy Χ-ΗΙΜ, choroba jest trudna do odróżnienia od CVI. Metody aktualnie stosowane do identyfikacji defektu w gp39 jako czynnika sprawczego w Χ-ΗΕΜ, obejmują sekwencjonowanie nukleotydów, zawierających gen gp39, z cDNA tworzonego z mRNA izolowanego z aktywowanych in vitro limfocytów, które nie wiążąCD40, lecz zawierająmRNA, kodujący gp39. Metoda ta została użyta, w celu pokazania jednego pacjenta o zdiagnozowanym CVI, aktualnie cierpiącemu z powodu zespołu hiper IgM. Jednakże, metody są pracochłonne i byłyby bardzo drogie do stosowania dla szerszego ogółu.

Tym, czego potrzeba w tej dziedzinie, to dodatkowe przeciwciała monoklonalne reagujące z różnymi epitopami gp39, które można łatwo stosować do oznaczania zmutowanych postaci gp39 i do innych celów w diagniostyce, do odróżniania pospolitego zmiennego niedoboru odporności i hiper-IgM, związanego z X, oraz w metodach terapeutycznych do modulowania stanów chorobowych, odpowiadających na interakcje między CD40 i jego ligandem gp39.

Istota wynalazku