ES2391101T3 - Anticuerpos monoclonales específicos para diferentes epítopes de GP39 humana y procedimientos para su uso en diagnóstico y terapia - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo, que es específico para gp39 humana, en el que el anticuerpo es el secretado por el hibridoma 39-1.7 designado ATCC HB 11812, 39-1.128 designado ATCC HB 11818 ó 39-1.26 designado ATCC HB 11820.

Description

Anticuerpos monoclonales específicos para diferentes epítopes de gp39 humana y procedimientos para su uso en diagnóstico y terapia

Antecedentes de la invención

Una respuesta inmunitaria satisfactoria requiere la interacción coordinada de múltiples tipos de células. La interacción entre linfocitos T colaboradores (Th) y células presentadoras de antígeno (APC) tal como linfocitos B, monocitos y células dendríticas resulta de complejas comunicaciones que implican señales recibidas por citocinas solubles o proteínas unidas a membrana, además de interacciones adhesivas. Muchas de estas señales no son específicas para una respuesta inmunitaria dirigida y las proteínas están ampliamente distribuidas.

Se han identificado varias proteínas de la superficie de linfocitos T importantes que participan en las interacciones célula-célula, que incluyen CD2, CD4, CD8, CD28, LFA-1 CTLA-4 y gp39. Estas proteínas participan en el contacto célula-célula uniéndose a sus contra-receptores sobre APC y proporcionan señales coestimulantes importantes a linfocitos T que modulan señales recibidas por el receptor de antígeno de linfocitos T. Estas señales coestimulantes son necesarias para el linfocito T para que se comprometa completamente y exprese tanto factores unidos a membrana como factores solubles requeridos para la apropiada activación de las células efectoras dependientes de linfocitos T (linfocitos B, linfocitos citolíticos espontáneos, monocitos, neutrófilos, etc.). El par ligando de linfocitos T/receptor de linfocitos B gp39/CD40 desempeña una función crítica en la respuesta inmunitaria humoral. Estudios in vitro han mostrado que este par de receptor/ligando participa en la proliferación de linfocitos B, producción de anticuerpos y citocinas y viabilidad celular. Estudios in vivo, tanto por bloqueo con un anticuerpo monoclonal como por observación de un defecto genético en gp39, han validado los resultados in vitro, y los han extendido al requisito de una gp39 funcional para la formación de centros germinales durante la respuesta inmunitaria a antígeno.

CD40 es una glucoproteína de membrana de tipo I de 50 kDa expresada por linfocitos B, macrófagos, células dendríticas foliculares, epitelio tímico, epitelio basal normal, algunas líneas celulares derivadas de carcinoma y de melanoma (Clark y Ledbetter 1986, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 83:4494; Paerlie y col., 1985, Cancer Immunol. Immunother. 20:23, Ledbetter y col., 1987, J. Immunol. 138:788; Young y col., 1989, Int. J. Cancer 43:786; Galy y Spits 1992, J. Immunol. 149:775, Alderson y col., 1993, J. Exp. Med. 178:669) y recientemente se ha informado que se expresa en linfocitos T (Armitage y col., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 2326). Se ha mostrado que es una molécula de señalización importante con un intervalo de efectos en la dirección 3' en múltiples sistemas. Estudios previos mostraron que CD40 participó en la activación de linfocitos B. La reticulación de CD40 con anticuerpo monoclonal anti-CD40 induce la agregación de linfocitos B por LFA-1 (Gordon y col., 1988, J. lmmunol. 140:1425, Barrett y col., 1991, J. Immunol. 146:1722), aumenta la fosforilación de Ser/Thr (Gordon y col., 1988, arriba) y Tyr (Uckun y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:17478) de varios sustratos intracelulares y proporciona una señal de “competencia” que permite que los linfocitos B proliferen y experimenten cambio de clase cuando se estimulan con la segunda señal apropiada. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-CD40 puede sinergizar con PMA (Gordon y col., 1987, Eur. J. Immunol. 17:1535) o el anticuerpo monoclonal anti-CD20 (Clark y Ledbetter 1986, arriba) para inducir la proliferación de linfocitos B, con IL-4 para inducir la proliferación de linfocitos B (Gordon y col., 1987, arriba; Rousset y col., 1991,

J. Exp. Med. 172:705) y secreción de IgE (Jabara y col., 1990, J. Exp. Med. 172:1861; Gascan y col., 1991, J. lmmunol. 147:8; Rousset y col., 1991, arriba: Zhang y col., 1991, J. Immunol. 146:1836, Shapira y col., 1992, J. Exp. Med. 175:289) y con IL-10 y TGF-� para inducir la secreción de IgA por linfocitos B slgD+ (DeFrance y col., 1992. J. Exp. Med. 175:671).

El aislamiento del clon de ADNc que codifica CD40 humana (Stamenkovic y col., 1989. EMBO J. 8:1403) muestra que CD40 tiene una homología significativa con la familia de receptores del factor de crecimiento nervioso. Usando una forma soluble de CD40 se encontró que la proteína de fusión CD40-inmunoglobulina (CD40-Ig) (Armitage y col., 1992. Nature 357:80; Lane y col., 1992. Eur. J. Immunol. 22:2573; Noelle y col., 1992, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:6550), el ligando de CD40 (gp39, CD40-L), una proteína de aproximadamente 39 kDa, se expresó por linfocitos T humanos y murinos activados. Además, estudios de bloqueo con CD40-Ig (Fanslow y col., 1992, J. Immunol. 149:655; Noelle y col., 1992, arriba) o un anticuerpo monoclonal anti-gp39 murina (MR1) Noelle y col., 1992, arriba) mostraron que la prevención de la unión gp39-CD40 produjo la inhibición de las respuestas biológicas de linfocitos

B.

El ADN complementario que codifica gp39 tanto murina (Armitage y col., 1992, Nature 357:80) como humana (Hollenbaugh y col., 1992, EMBO J. 11:4313; Spriggs y col., 1992, J. Exp. Med. 176:1543) o una forma recombinante soluble de gp39 y IL-4 o gp39 e IL-10 puede accionar linfocitos B humanos para secretar IgE y IgA, o IgG e IgM, respectivamente (Aruffo y col., 1993. Cell 72:291). Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que gp39 puede ser un “cambio” de linfocitos T responsable de algunos aspectos de la diferenciación de linfocitos B y el cambio de isotipo (Noelle y col., 1992, Immunol. Today 13:431).

Recientemente, el gen que codifica gp39 se mapeó a Xq26, la región del cromosoma X en la que previamente se había mapeado el gen responsable de síndrome de hiper-lgM (HIM) (Aruffo y col., 1993, Cell 72:291). Se encontró que las moléculas de gp39 en pacientes con HIM eran funcionalmente anormales. Se ha encontrado que los linfocitos T activados producen niveles normales de ARNm, pero gp39 codificada es defectuosa (Aruffo y col., 1993, arriba; DiSanto y col., 1993, Nature 361:541).

El síndrome de hiper-IgM es una de las al menos siete inmunodeficiencias heredadas mapeadas al cromosoma X (Kinnon y Levinsky 1992, J. Inherit. Metab Dis. 15:674). La enfermedad se caracteriza por niveles bajos o ausentes de IgG, IgA e IgE, niveles normales o elevados de IgM, números normales de linfocitos B recirculantes, susceptibilidad a infecciones bacterianas y oportunistas (incluyendo Pneumocystic carinii), sin centros germinales, autoinmunidad, neutropenia, formas ligadas a X y autosómicas y defectos del gen ligando gp39 en la forma ligada a X de la enfermedad. La inmunodeficiencia variable común (IVC) es otro grupo de trastornos de la inmunodeficiencia caracterizada por respuestas anormales de anticuerpos e infecciones bacterianas recurrentes. Las presentaciones clínicas de la IVC son diversas, ya que los trastornos descritos por el término incluyen una amplia variedad de defectos todavía sin caracterizar. Estados de enfermedad descritos como IVC comúnmente muestran IgG e IgA en suero reducida o ausente, mientras que los niveles de IgM pueden ser normales o reducidos. Aunque la mayoría de los pacientes con IVC tienen números y respuestas de linfocitos T normales, algunos pueden tener números reducidos, relaciones de células CD4/CD8 anormales o función de linfocitos T anormal. También hay una elevada probabilidad de anticuerpos autoinmunitarios en esta población de pacientes.

Las mutaciones en el gen que codifica gp39 producen deleciones que dan lugar a desplazamientos del marco y a codones de terminación prematuros, o mutaciones puntuales que producen sustituciones de aminoácidos (Allen y col., 1993, Science 259:990. DiSanto y col., 1993, arriba; Fuleichan y col., 1993, arriba, Korthauer y col., 1993, arriba; Aruffo y col., 1993, arriba; Collard y col., 1993. Immunol. Today 14:559). El efecto de estas mutaciones sobre la expresión de gp39 por linfocitos T activados se ha examinado usando CD40-Ig soluble, anticuerpo policlonal producido contra una proteína de fusión bacteriana gp39 (anti-TRAP) (Graf y col., 1992. Eur. J. Immunol 22:3191; Korthauer y col., 1993, Nature 361:539) y un anticuerpo monoclonal específico para gp39 5c8 (Lederman y col., 1992, J. Exp. Med. 175:1091). Tiñendo con CD40-Ig soluble se encontró que la expresión de gp39 estaba ausente, mientras que para anti-TRAP era normal en linfocitos T de uno de los tres pacientes probados, que se confirmó usando el anticuerpo monoclonal. Estos resultados muestran que la expresión de gp39 es variable en pacientes con HIM y se ha sugerido que se necesita más trabajo para determinar si la variación en la expresión de la superficie de las formas mutantes de gp39 establece una correlación con la gravedad de la enfermedad de HIM. En ausencia de una historia familiar de X-HIM, la enfermedad es difícil de distinguir de la IVC. Los procedimientos actualmente usados para identidad un defecto en gp39 como el agente causante en X-HIM incluyen la secuenciación de nucleótidos que comprenden el gen gp39 del ADNc formado a partir de ARNm aislado de linfocitos activados in vitro que no se unen a CD40, pero que contienen ARNm que codifica gp39. Este procedimiento se ha usado para mostrar que un paciente diagnosticado con IVC en realidad padece síndrome hiper-IgM. Sin embargo, los procedimientos son laboriosos y serían muy caros de usar en una base más generalizada.

Lo que se necesita en la materia son anticuerpos monoclonales adicionales reactivos con diferentes epítopes de gp39 que puedan usarse fácilmente para ensayar formas mutantes de gp39 y para otros fines en diagnósticos para distinguir entre inmunodeficiencia variable común e hiper-IgM ligado a X, y en procedimientos terapéuticos para modular estados de enfermedad sensibles a interacciones entre CD40 y su ligando gp39.

Resumen de la invención

En el presente documento se describen anticuerpos monoclonales que pueden unirse a al menos doce epítopes separados sobre gp39 humana. Adicionalmente se describen fragmentos de unión a antígeno y proteínas de unión recombinantes, derivadas de los anticuerpos monoclonales de la presente invención, que también se unen a gp39. También se describen hibridomas específicos que secretan anticuerpos monoclonales que se unen a los doce epítopes sobre gp39 desvelados.

En el presente documento se describen el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal o proteína de unión recombinante del mismo se caracteriza por la unión a una forma mutante de gp39 humana con una avidez de unión similar o algo reducida cuando se compara con la avidez de unión a gp39 natural cuando la forma mutante de gp39 comprende ácido glutámico 129, serina 131 y treonina 135, tirosina 145, asparagina 180 o fenilalanina 201 y ácido glutámico 202 sustituido por alanina, y adicionalmente tiene una mala avidez de unión a un mutante de gp39 que comprende lisina 143 sustituida por alanina que con gp39 natural. El anticuerpo se caracteriza adicionalmente por la incapacidad de unir gp39 en una transferencia Western. Ejemplos específicos de anticuerpos monoclonales que tienen estas características son aquellos secretados por los hibridomas 39-1.7 designados 11812, 39-1.128 designados ATCC HB 11818 y 39-1.26 designados ATCC HB 11820. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo que es específico para gp39 humana, en el que el anticuerpo es el secretado por el hibridoma 39-1.7 designado ATCC HB 11812, 39-1.128 designado ATCC HB 11818 ó 39-1.26 designado ATCC HB 11820.

Cada uno de los grupos de anticuerpos monoclonales reconoce epítopes de gp39 y pueden manipularse tanto químicamente como por procedimientos recombinantes que generan tanto fragmentos de unión a antígeno como proteínas de unión recombinantes. Ejemplos de fragmentos de unión a antígeno son Fab, (Fab')2 o Fv creados por la digestión enzimática de anticuerpo completo. Las proteínas de unión recombinantes de la presente invención incluyen cualquier molécula que mantenga la especificidad por antígenos del anticuerpo parental y se haya recombinado con otras secuencias de residuos de aminoácido. Ejemplos incluyen anticuerpos quiméricos, sFv, anticuerpos humanizados y moléculas de fusión.

En todavía otra realización mas de la presente invención, los anticuerpos monoclonales o proteínas de unión recombinantes pueden conjugarse con un marcador detectable o un agente terapéutico. Ejemplos de marcadores detectables incluyen fluoróforos, isótopos radiactivos, enzimas o cromóforos. Agentes terapéuticos contemplados por la presente invención puede incluir radioisótopos, toxina o un agente quimioterapéutico, tal como un fármaco citotóxico. Además de las técnicas de conjugación, las proteínas de unión recombinantes de la presente invención pueden construirse para formar proteínas de fusión que comprenden una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de la presente invención y una enzima, toxina de proteína o agente terapéutico proteináceo.

En otra realización más de la presente invención se desvela un procedimiento in vitro para la detección de síndrome hiper-IgM ligado a X. El procedimiento comprende las etapas de proporcionar linfocitos de sangre periférica aislados de un paciente del que se sospecha que tiene síntomas asociados al síndrome, activar los linfocitos de sangre periférica, fijar y permeabilizar los linfocitos de sangre periférica aislados y activados, mezclar un anticuerpo monoclonal descrito con los linfocitos de sangre periférica activados, fijados y permeabilizados y detectar el anticuerpo unido a las células. El anticuerpo puede marcarse con un marcador detectable o puede estar sin marcar. Cuando se usa sin marcar, antes de la etapa de detección se lleva a cabo otra etapa de añadir un anticuerpo secundario (que está marcado) específico para el primer anticuerpo. El marcador detectable puede ser, por ejemplo, un fluoróforo, isótopo radiactivo, enzima o cromóforo.

Además, la presente invención proporciona hibridomas que secretan anticuerpos específicos reactivos con cada uno de los epítopes descritos por la presente invención. Cada uno de estos hibridomas se depositó en la Colección americana de cultivos tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, el 20 de enero de 1995 en las condiciones del Tratado de Budapest.

En otra realización más de la presente invención, una secuencia de ácidos nucleicos aislada y purificada que codifica secuencias de aminoácidos para cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina de moléculas de inmunoglobulina que reconocen epítopes de gp39 humana se describen por la presente invención. En particular, la secuencia de ácidos nucleicos codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina representada en SEC ID Nº 16. También se desvelan secuencias de nucleótidos específicas que codifican estas secuencias de aminoácidos. Aquellas se representan en y 15. Por tanto, se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de la cadena pesada de la inmunoglobulina que tienen la secuencia de residuos de aminoácidos representada en y SEC ID Nº 18. Secuencias de nucleótidos particulares que codifican las secuencias de residuos de aminoácido se proporcionan en y SEC ID Nº 17.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno o proteínas de unión recombinantes de los mismos descritos en el presente documento combinadas con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden incluir el anticuerpo monoclonal, fragmento de unión un antígeno o proteína de unión recombinante conjugada con un marcador detectable o agente terapéutico.

Además, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno o fragmentos de unión recombinantes de los mismos de la invención conjugados con un marcador detectable para su uso en la obtención de imágenes de células que expresan gp39 sobre su superficie en un paciente que comprende administrar a un paciente una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de la invención descrito anteriormente conjugado con un marcador detectable en condiciones que permiten la formación del complejo anticuerpo/antígeno sobre la superficie de las células que expresan gp39, y detectar la presencia del complejo anticuerpo/antígeno como se indica por la presencia de los marcadores detectables.

Descripción de las figuras

Las Figuras 1A a 1D demuestran la unión de anticuerpos monoclonales murinos anti-gp39 humana 7 (39-1.7) y 106 (39.1-106) a linfocitos T humanos y de macaco activados. Se aislaron linfocitos T positivos para rosetas E de células mononucleares de sangre periférica, se activaron con PMA e ionomicina durante seis horas y luego se incubaron con anticuerpos monoclonales anti-gp39 humana 7, 106 o un anticuerpo de control negativo. Entonces, las células se incubaron con un FITC-antisuero policlonal de cabra anti-IgG murina seguido de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD4 humana marcada con ficoeritrina. Las células se seleccionaron para células CD4- y posteriormente se analizaron para tinción anti-gp39 usando FACScan. Figuras 1A y 1B Linfocitos T humanos. Figuras 1C y 1D Linfocitos T de macaco.

Las Figuras 2A a 2C demuestran la inhibición de la unión de CD40 humana-Ig a linfocitos T humanos y de macaco activados por anticuerpos monoclonales murinos anti-gp39 humana 7 y 106. Se aislaron linfocitos T positivos para rosetas E de células mononucleares de sangre periférica y se estimularon con PMA e ionomicina durante 6 horas. Los linfocitos T activados se incubaron con anticuerpos monoclonales murinos anti-gp39 humana 7 (39-1.7) o 106 (39-1.106) a una concentración de 5 μg/ml seguido de CD40 humana-Ig (20 μg/ml). Después de la incubación, las células se tiñeron con anti-IgG humana de cabra marcada con ficoeritrina y se analizaron en FACScan. Figura 2A Linfocitos T humanos y anticuerpo monoclonal 7. Figura 2B Linfocitos T humanos y anticuerpo monoclonal 106. Figura 2C Linfocitos T de macaco y anticuerpo monoclonal 7. Figura 2D Linfocitos T de macaco y anticuerpo monoclonal 106.

La Figura 3 demuestra la capacidad de anticuerpos monoclonales murinos anti-gp39 humana 7 y 106 para inhibir la producción de IgG e IgM por linfocitos B de macaco estimulados por linfocitos T de macaco activados.

La Figura 4A y 4B demuestra la capacidad de proteínas de unión gp39 para suprimir una respuesta inmunitaria en macacos a glóbulos rojos de oveja. Se recogió suero semanalmente y se evaluaron (Fig. 4A) títulos de anti-IgM SRBC y (Fig. 4B) títulos de anti-IgG de SRBC por ELISA. Los valores representan media + EEM para 4 monos por grupo. La flecha indica el momento de la inmunización secundaria. El valor indicado es el título como se ha determinado por la dilución de suero dando valores de absorbancia cinco veces el valor de referencia, en el que la referencia se determina como la absorbancia medida registrada en ausencia de suero.

La Figura 5 demuestra la capacidad de macacos tratados con proteínas de unión gp39 para generar una respuesta de IgG a KLH. Los títulos del suero de anticuerpo de mono específico se determinaron por ELISA. Los resultados son el promedio de todos los monos en cada grupo. El valor informado es el título como se ha determinado por la dilución de suero dando valores de absorbancia cinco veces el valor de referencia, en el que la referencia se determina como la absorbancia medida registrada en ausencia de suero.

La Figura 6 proporciona la secuencia de nucleótidos para VL de 106 (SEC ID Nº 11) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº 12). La Figura 1B proporciona la secuencia de nucleótidos para VH de 106 (SEC ID Nº 13) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº 14). Las secuencias líder están rodeadas y las regiones determinantes de la complementariedad se muestran en recuadros. VL es un miembro de la subfamilia V kappa murina y el segmento del gen V se ha reorganizado con JK5 (Figura 6A, subrayada). VH es un miembro del subgrupo III(D) murino. El gen V de la cadena pesada V se ha reorganizado con JH2 (Figura 6B, subrayada).

La Figura 7 proporciona la secuencia de nucleótidos para VL de 7 (SEC ID Nº 15) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº 16). La Figura 2B proporciona la secuencia de nucleótidos para VH de 7 (SEC ID Nº 17) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº 18). Las secuencias líder están rodeadas y las regiones determinantes de la complementariedad se muestran en recuadros. VL es un miembro de la subfamilia II kappa murina y el segmento del gen V se ha reorganizado con JK4 (Figura 7A, subrayada). VH es un miembro del subgrupo II(A) murino. El gen V de la cadena pesada V se ha reorganizado con JH2 (Figura 7B, subrayada).

Las Figuras 8A y B demuestran una valoración de sobrenadantes de transfección en células COS sFv-Ig de 106 y sFv-Ig de 7 que se unen a gp39 humana inmovilizada. Placas de 96 pocillos de fondo plano recubiertas con anti-Lyt-2a de ratón y proteína de fusión Lyt-2a-gp39 se usaron para cribar sobrenadantes de células COS para anti-gp39 106 y sFv-Ig de 7 funcionales. Se muestran diluciones de dos veces de un clon representativo para cada sFv-Ig. Mientras que el sobrenadante de transfección con vector vacío (sin ADN añadido a las células COS) no mostró actividad, sFv-Ig de 106 y sFv-Ig de 7 unidas a gp39 inmovilizada a diluciones superiores a

1:100 (para sFv-Ig de 106, la unión podría detectarse hasta una dilución 1:1000 de sobrenadante de transfección). En comparación, un sFv de anti-gp39 de ratón (MR1 sFv-Ig) no se unió a gp39 humana, aunque se unió bien a placas recubiertas con anti-Lyt-2a de ratón y proteína de fusión Lyt 2a-gp39 murina. sFv-Ig de 106 y sFv-Ig de 7 mostraron de poca a ninguna reactividad sobre placas recubiertas con anti-Lyt-2a de ratón y proteína de fusión Lyt 2a-gp39 murina.

Las Figuras 9A y 9B muestran la unión comparativa de anticuerpo monoclonal 106 bivalente y sFv-Ig de 106 a células Jurkat que expresa constitutivamente gp39. Se comparó mAb 106 bivalente yodado con sFv-Ig de 106 yodado para unirse a gp39 expresada sobre células Jurkat BMS-10. Las afinidades calculadas fueron Kd=4 x 10-10 ± 6 x 10-11 para mAb 106 bivalente (Figura 9A) y Kd=1,6 x 10-9 ± 3,3 x 1010 para sFv-Ig de 106 (Figura 9B). La transformación de Scatchard mostró que tanto el mAb 106 bivalente como sFv-Ig de 106 se unieron a aproximadamente 10.000 sitios por célula (Figuras 9A y 9B).

La Figura 10 representa el molde de humanización de VL de 106. La secuencia murina original se muestra en la cuarta fila (m106, SEC ID Nº 27) con la secuencia de la línea germinal murina debajo. La secuencia molde humana elegida se muestra en la segunda fila (molde humano, SEC ID Nº 29) con su secuencia consenso humana encima. La secuencia de VL de 106 humanizado (h106, SEC ID Nº 28) se muestra entre el molde humano y la secuencia de VL de 106 murino. Consiste esencialmente en residuos de la región estructural humana y residuos hipervariables murinos. Las regiones hipervariables como se definen por Kabat y col., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª ed., U.S. Health and Human Services, Washington, D.C. (1987)) se muestran subrayadas con una línea doble. Los bucles L1, L2 y L3 están subrayados con una única línea y los determinantes estructurales definidos por Chothia se muestran por asteriscos (Chothia y Lesk, 1987,

J. Mol. Biol. 196: 901). Los residuos humanos o murinos que se diferencian de VL de 106 humanizado están doblemente subrayados. Se eligió JK humano basándose en la homología con 106 JK.

La Figura 11 representa el molde de humanización de VH de 106. La secuencia murina original se muestra en la cuarta fila (m106, SEC ID Nº Nº30) con la secuencia murina más próxima debajo (no estuvo disponible una secuencia de la línea germinal adecuada que sólo tuviera tres residuos en el bucle H2; en su lugar se eligió una secuencia reorganizada que tenía una alta homología global con VH de 106 y también tenía un bucle H2 de tres residuos). La secuencia molde humana elegida se muestra en la segunda fila (molde humano, SEC ID Nº 32) con su secuencia consenso humana encima (consenso VH III/JH 4 humana). La secuencia de VH de 106 humanizado (h106, SEC ID Nº31) se muestra entre el molde humano y la secuencia de VH de 106 murino. Consiste esencialmente en residuos de la región estructural humana y residuos hipervariables murinos (subrayados con una línea doble). Los bucles H1, H2 y H3 están subrayados con una única línea y los determinantes estructurales como se definen por Chothia (arriba) se muestran por asteriscos. Los residuos humanos o murinos que se diferencian de VH de 106 humanizado están doblemente subrayados. Se eligió JH humano basándose en la homología con 106 JH.

La Figura 12 representa el ensamblaje de la ocho VH de 106 humanizado. Dos fragmentos de ADN se amplificaron por PCR de las 149 primeras bases de VH de 106 murino usando cebadores de sentido directo que codificaron un sitio HindIII inmediatamente antes de la secuencia de VH de 106 que contiene cambios de tres (106vhT-5') o cuatro (106vhA-5') de los residuos murinos a residuos humanos, y un cebador de sentido contrario que codifica sitios de restricción únicos (Nhel, EcoRI, PstI y XbaI). Estos fragmentos se digirieron con HindIII y XbaI y se ligaron en pUC19, creando los dos vectores 106vhA-NEP y 106vhT-NEP. Tres pares de oligonucleótidos sintetizados codificaron cambios en una o dos posiciones (106vh SY, 106vh DY, 106vh SS) mientras que 106vh DS mantuvo la secuencia murina original en los residuos 55 y 56. Los cuatro pares también codificaron residuos humanizados adicionales de Ile57, Ala60, Lys64 y Lys75 que no se ilustran por simplicidad. Además, se manipularon con oligonucleótidos protuberantes Nhel y Pstl (O/H) y un único sitio Xhol para los digestos de diagnóstico. Los fragmentos de ADN generados por estos oligonucleótidos se ligaron en los vectores 106vhA-NEP y 106vhT-NEP en los sitios Nhel y Pstl. Se generó un fragmento de PCR final usando el cebador de sentido directo de 106vh Pst5' y el cebador de sentido contrario 106vh Xba3' usando 106vh murino como molde. Estos dos oligonucleótidos codificaron cuatro cambios más de la secuencia murina a humana. El fragmento de ADN se clonó en las construcciones previas usando sitios de restricción Pstl y Xbal.

La Figura 13 demuestra la inhibición de la expresión de E-selectina en células endoteliales. Las barras negras muestran niveles de expresión de E-selectina. Mientras que sFv-lg de 106 murino muestra una fuerte inhibición, el control negativo L6 sFv-Ig no muestra inhibición. HuVL/106vhA-DY (“ADY”), huVL/106vhA-SY (“ASY”) y hu VL/106vhT-DS (“TDS”) inhiben la expresión de E-selectina, aunque no tan eficazmente como sFv-Ig de 106 murino. Los sobrenadantes de las transfecciones de hu VL/106vhT-SY (“TSY”; sin proteína) y huVL/106vhT-SS (“TSS”; proteína aberrante) no mostraron ninguna actividad.

La Figura 14 representa el análisis Biacore™ de proteínas sFv-Ig de 106 humanizado que se unen a gp39 humana. gp39 humana se recubrió sobre chips y los diversos sobrenadantes de transfección de sFv-Ig de 106 humanizado se probaron para la unión. sFv-Ig de 106 murino original se unió muy fuertemente (no se observó constante de disociación, como se muestra por la línea horizontal). Las proteínas de los sobrenadantes de transfección de huVL/106vhA-DY (“ADY12-3”), huVL/106vhA-SY (“ASY21-7”) y huVL/106vhT-DS (TDS46-17”) también se unieron fuertemente con constante de disociación no detectable. Los sobrenadantes de las de transfecciones de huVL/106vhT-SY (“TSY26-9”; sin proteína) y hu VL/106vhT-SS (“TSS36-13”; proteína aberrante) no se unieron a chips recubiertos con gp39.

La Figura 15 proporciona una representación del plásmido de expresión de la cadena ligera de h106 completo pD16-hK8.L1.

La Figura 16 representa las secuencias de ácidos nucleicos (SEC ID Nº 76) y de residuos de aminoácidos (SEC ID Nº 77) para el inserto de la cadena ligera de la inmunoglobulina h106 que codifica el péptido señal h106, región variable y las regiones flanqueantes asociadas.

La Figura 17 proporciona una representación del vector de expresión de la cadena pesada de h106 completo humano pD17-hK1.H1.

La Figura 18 representa las secuencias de ácidos nucleicos (SEC ID Nº 78) y de residuos de aminoácidos (SEC ID Nº 79) para el inserto de la cadena pesada de h106 que codifica el péptido señal de h106, región variable y las regiones flanqueantes asociadas.

La Figura 19 proporciona datos para la inhibición de la proliferación de linfocitos B por sgp39 en presencia de IgM antihumana. Se cultivaron linfocitos B tonsilares en reposo en presencia de sgp39, inmunoperlas de conejo anti-IgM humana y las cantidades indicadas de anticuerpo monoclonal durante 72 horas. Entonces, las placas se pulsaron con [3H]-timidina y se incubaron durante 16 horas adicionales. Después de la incubación, las células se recogieron y se determinó la incorporación de [3H]-timidina. Todas las pruebas se realizaron por triplicado. Los resultados se expresan como inhibición en porcentaje en comparación con cultivos que sólo contenían medio.

La Figura 20 compara la capacidad de las diversas proteínas del anticuerpo 106 humanizado para inhibir la producción de anticuerpos por linfocitos B humanos estimulados con linfocitos T activados. Las células mononucleares de sangre periférica humana se agotaron de monocitos y linfocitos citolíticos espontáneos y luego se separaron en positivos para rosetas E (linfocitos T) y negativos para rosetas E (linfocitos B). Los linfocitos T se trataron posteriormente con mitomicina C y se cocultivaron con linfocitos B en pocillos recubiertos con anticuerpo monoclonal anti-CD3 de una placa de 96 pocillos en presencia de la cantidad indicada de anticuerpo monoclonal. Todas las pruebas se ejecutaron por triplicado. Los resultados se expresan como inhibición en porcentaje en comparación con cultivos que sólo contuvieron medio (sin anticuerpo monoclonal anti-gp39).

La Figura 21 compara la capacidad de las diversas proteínas del anticuerpo 106 humanizado para inhibir la inducción de la expresión de E-selectina en células endoteliales por una línea de linfocitos T de gp39. Células endoteliales de la vena umbilical humana se cultivaron con células BMS-2, una línea de Jurkat conocida por expresar gp39, en presencia de la cantidad indicada de anticuerpo. Después de cuatro horas, el nivel de la expresión de E-selectina se midió por ELISA. Las barras de error son más pequeñas que los símbolos gráficos.

Descripción detallada de la invención

La siguiente descripción se expone con el fin de que la invención descrita en el presente documento pueda entenderse más completamente.

La presente invención se refiere a un grupo de anticuerpos monoclonales que reconocen epítopes específicos de la glucoproteína de membrana de linfocitos T gp39, y a los hibridomas que producen y secretan estos anticuerpos monoclonales. También están englobados por la presente invención otros anticuerpos monoclonales que pueden prepararse que inhiben competitivamente la unión de los anticuerpos monoclonales específicamente desvelados a sus epítopes. Los fragmentos de los anticuerpos monoclonales y proteínas recombinantes que tienen la región variable de los anticuerpos monoclonales desvelados también están incluidos en la presente invención, ya que son procedimientos de uso de los anticuerpos monoclonales, fragmentos y proteínas de unión recombinantes en el diagnóstico de síndrome hiper-IgM, en otros ensayos de adhesión a células y linfocitos T, y en procedimientos de modulación de respuestas inmunitarias en un huésped.

La preparación de anticuerpos monoclonales puede llevarse a cabo inmortalizando una línea celular que produce anticuerpo específico para un epítope sobre gp39. Normalmente, un anticuerpo monoclonal de la presente invención puede producirse usando técnicas de hibridomas bien establecidas introducidas por primera vez por Kohler y Milstein. Véase Kohler y Milstein, 1975, Nature 256:495. Véase, por tanto, Brown y col., 1981, J. Immunol. 127:539. Yeh y col., 1979, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 76:297; Hellstrom y col., 1990. Cancer Research 50:2183.

Estas técnicas implican la inyección de un inmunogén (por ejemplo, células o extractos celulares que contienen el antígeno de gp39 o gp39 purificada, tanto como proteína nativa, un fragmento que contiene un sitio epitópico como una proteína de fusión) en un animal de forma que se provoque una respuesta inmunitaria deseada en ese animal. Los animales comúnmente usados incluyen muchos mamíferos, por ejemplo, ratón, rata, vaca, cabra, oveja, conejo, etc. El inmunogén se presenta comúnmente al animal con un adyuvante, por ejemplo, adyuvante completo de Freund, gel de hidróxido de aluminio o similares. El animal puede luego sangrarse y emplearse la sangre para el aislamiento de anticuerpos policlonales. Alternativamente, los linfocitos de sangre periférica, linfocitos esplénicos (linfocitos T) o linfocitos de los ganglios linfáticos pueden emplearse para la fusión con una célula de mieloma apropiada para inmortalizar los genes que codifican anticuerpos monoclonales específicos para gp39.

En la presente invención, los anticuerpos monoclonales se caracterizan parcialmente por su unión a una serie de mutantes de gp39. La avidez de unión (fuerza de unión) de los anticuerpos a la gp39 mutante se comparó con la avidez de unión del anticuerpo a gp39 natural. La avidez de unión se caracterizó como mala si la comparación de la avidez de unión con un mutante particular era inferior al 25-30% de la avidez de unión con gp39 natural; se obtuvo una reducción débil o menos profunda en la reactividad si la avidez de unión con un mutante era del 25 al 30% al 5055% de la avidez de unión con gp39 natural; se obtuvo una reactividad algo reducida si la avidez de unión con el mutante era del 50-55% al 75-80% de la avidez de unión con natural; y se obtuvo reactividad similar o equivalente si la avidez de unión con un mutante era del 75-80% o superior a la avidez de unión a un mutante. Los anticuerpos de la presente invención también se caracterizaron por su isotipo, unión a gp39 por transferencia Western, capacidad para suprimir la proliferación de linfocitos B y capacidad para suprimir la producción de inmunoglobulinas.

Aunque la invención se describe a modo de ejemplos usando anticuerpos monoclonales murinos, la invención no se limita así y engloba el uso de, por ejemplo, hibridomas humanos (Cote y col., 1983, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 80:2026) o por linfocitos B humanos transformantes (por ejemplo, con virus de Epstein-Barr (EBV) in vitro) (Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77-96).

Los anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquiera de las clases o subclases de inmunoglobulinas, tales como IgM, IgD, IgA, IgE o subclases de IgG conocidas para cada especie de animal. Generalmente, los anticuerpos monoclonales pueden usarse intactos o como fragmentos de unión a epítope, tales como Fv, Fab o F(ab')2.

Las líneas celulares de la presente invención pueden encontrar un uso distinto al de la producción directa de los anticuerpos monoclonales. Las líneas celulares pueden fusionarse con otras células (tal como mieloma humano marcado adecuadamente con fármaco, mieloma de ratón o células linfoblastoides humanas) para producir hibridomas y, por tanto, proporcionar la transferencia de genes que codifica los anticuerpos monoclonales. Alternativamente, las líneas celulares pueden usarse como fuente de los cromosomas, o genes, que codifican las inmunoglobulinas, particularmente aquellas regiones de los genes que codifican las regiones variables o de unión a epítope de la inmunoglobulina, que pueden aislarse y transferirse a células por técnicas distintas de la fusión. Esto puede llevarse particularmente a cabo preparando bibliotecas de ADNc a partir de ARNm, codificando la inmunoglobulina y libre de intrones, luego aislando y disponiendo el ADN en vectores de expresión procariotas o eucariotas adecuados. Los procedimientos para los vectores de expresión pueden usarse luego para transformar un huésped para la producción de inmunoglobulina o fragmentos de unión a epítope. Véanse generalmente los documentos U.S. nº 4.172.124, 4.350.683; 4.363.799; 4.381.292; y 4.423.147. Véase, por tanto, Kennet y col., 1980, Monoclonal Antibodies, Plenum Press, New York, y referencias citadas en su interior.

Más específicamente, según tecnología de ADN híbrido, la inmunoglobulina o fragmentos de unión a epítope de la presente invención pueden producirse en bacterias (véanse, Boss y col., 1984, Nucl. Acid Res. 12:3791 y Wood y col., 1985. Nature 314:446). Por ejemplo, el ARN mensajero transcrito a partir de los genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos monoclonales producidos por una línea celular de la presente invención puede aislarse por hibridación de ADNc diferencial empleando sondas de ADNc degeneradas derivadas de secuencias de ADN conocidas por ser comunes a moléculas de inmunoglobulina maduras del tipo de célula parental. El ARNm que no se hibrida será rico en mensajeros que codifican las cadenas de inmunoglobulina deseadas. Según sea necesario, este procedimiento puede repetirse para potenciar adicionalmente los niveles de ARNm deseados. La composición de ARNm restada puede entonces transcribirse inversamente para proporcionar una mezcla de ADNc enriquecida en las secuencias deseadas. El ARN puede hidrolizarse con una ARNasa apropiada y el ADNmc hacerse bicatenario con ADN polimerasa I y cebadores al azar, por ejemplo, ADN de timo bovino fragmentado al azar. El ADNbc resultante puede entonces clonarse por inserción en un vector apropiado, por ejemplo, vectores de virus, tales como vectores lambda o vectores de plásmido (tales como pBR322, pACYC 184, etc.). Desarrollando sondas basadas en secuencias conocidas para las regiones constantes de las cadenas ligeras y pesadas, aquellos clones de ADNc que tienen el gen que codifica las cadenas ligeras y pesadas deseadas pueden identificarse por hibridación. Después, los genes pueden escindirse de los plásmidos, manipularse para eliminar ADN superfluo y luego introducirse en un vector apropiado para la transformación de un huésped y finalmente la expresión del gen. Pueden usarse otros procedimientos muy conocidos en la técnica para aislar secuencias de genes que codifican moléculas de inmunoglobulina.

En la presente solicitud se aisló ARN y el ADNc se generó usando técnicas de PCR con regiones constantes de la inmunoglobulina como cebadores. Los fragmentos VH y VL amplificados por PCR se seleccionaron, se clonaron y se usaron para determinar las secuencias de nucleótidos para las regiones variables.

Convenientemente pueden emplearse huéspedes de mamífero (por ejemplo, células de ratón) para procesar las cadenas de inmunoglobulina (por ejemplo, unir las cadenas pesadas y ligeras) para producir una inmunoglobulina intacta; y además, secretar la inmunoglobulina libre de cualquier secuencia líder, si se desea. Alternativamente, puede usarse un microorganismo unicelular para producir las dos cadenas, pudiendo requerirse manipulación adicional para eliminar las secuencias de ADN que codifican la líder secretora y las señales de procesamiento, a la vez que se proporciona un codón de iniciación en el extremo 5' de la secuencia que codifica la cadena pesada. De este modo, las inmunoglobulinas pueden prepararse y procesarse de manera que se ensamblen y glucosilen en células distintas de células de mamífero.

Si se desea, cada una de las cadenas puede truncarse de forma que se retenga al menos la región variable, que puede entonces manipularse para proporcionar otras proteínas de unión recombinantes específicas para el epítope de gp39 reconocido por el anticuerpo parental.

Una proteína de unión recombinante tal es un anticuerpo quimérico, en el que las regiones variables de un anticuerpo parental se recombinan con las regiones constantes de anticuerpos derivados de una especie diferente (por ejemplo, regiones variables murinas recombinadas con regiones constantes humanas). Normalmente, la región variable de un anticuerpo monoclonal de la presente invención se unirá con la región constante de un anticuerpo humano. Los anticuerpos quiméricos que son ampliamente humanos en composición son sustancialmente menos inmunogénicos que los anticuerpos murinos.

Otra proteína de unión a epítope recombinante es el anticuerpo monocatenario. En una construcción tal, algunas veces llamada sFv, una región variable de tanto la cadena pesada como la cadena ligera del anticuerpo parental se liga covalentemente por un péptido ligador de forma que se vuelve a formar la región de unión a epítope. También pueden construirse anticuerpos monocatenarios multivalentes que comprenden regiones variables de la cadena pesada y ligera específicas para uno o más epítopes de gp39. Véanse los documentos EP 0 610.046 y WO 94/13806 para cómo pueden construirse tales proteínas de unión recombinantes.

Otro tipo mas de proteína de unión recombinante es el anticuerpo humanizado en el que los codones dentro de la región estructural de un anticuerpo monoclonal no humano se cambian por diversos procedimientos de mutagénesis puntual para codificar residuos de aminoácidos para hacer que la región estructural murina se parezca más a la región estructural humana. Véanse los documentos EP 0 578.515, EP 0 592.106. Jones y col., 1986, Nature 321:522; Riechmann y col., 1988. Nature 332:323. También puede hacerse cambios en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) para hacer que la región variable entera se parezca más al carácter superficial de un anticuerpo humano. La intención de preparar las diversas proteínas de unión recombinantes es alterar tanto la inmunogenicidad del anticuerpo como una actividad accesoria relacionada con la región constante u otro resto activo recombinado con la región de unión a epítope y retener la especificidad de unión al epítope de gp39 del anticuerpo parental original.

La presente invención proporciona además composiciones de los anticuerpos monoclonales y proteínas de unión recombinantes de la presente invención. Estas composiciones pueden comprender los anticuerpos monoclonales y las proteínas de unión recombinantes de la presente invención marcados con un marcador detectable, por ejemplo, un isótopo radiactivo, enzima, fluoróforo, cromóforo, etc. Otras composiciones puede comprender los anticuerpos monoclonales o las proteínas de unión recombinantes de la presente invención conjugados o ligados a un agente terapéutico tal como un radioisótopo, una toxina (es decir, exotoxina de Pseudomonas), o un agente quimioterapéutico.

La conjugación o enlace del anticuerpo o proteína de unión recombinante de la presente invención con el marcador detectable o agente terapéutico pueden ser por medios de unión covalente u otros medios químicos. Los medios de unión químicos pueden incluir, por ejemplo, glutaraldehído, agentes de enlace heterobifuncionales y homobifuncionales. Los agentes de enlace heterobifuncionales pueden incluir, por ejemplo, SMPT (succinimidiloxicarbonil-ametil-a(2-piridildition)-tolueno, SPDP (3-(2-piridililitio)propionato de N-succinimidilo) y SMCC (4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo). Los agentes de enlace homobifuncionales pueden incluir, por ejemplo, DMP (pimelimidato de dimetilo), DMA (suberinidato de dimetilo) y DTBP 3,3'-ditiobispropionimidato de dimetilo.

Ciertos marcadores detectables de proteína y agentes terapéuticos pueden combinarse recombinantemente con las regiones variables de los anticuerpos monoclonales de la presente invención para la construcción de composiciones que son proteínas de fusión en las que las regiones variables del anticuerpo monoclonal mantienen su especificidad de unión y el marcador detectable o agente terapéutico retiene su actividad. Los procedimientos recombinantes para la construcción de estas proteínas de fusión son muy conocidos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpo monoclonal o proteínas de unión recombinantes, tanto conjugados como sin conjugar, están englobados por la presente invención. Una composición farmacéutica puede comprender el anticuerpo monoclonal y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Para los fines de la presente invención, un “vehículo farmacéuticamente aceptable” puede ser cualquiera de los vehículos convencionales muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, vehículos adecuados pueden incluir disoluciones de solución salina tamponada con fosfato, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Otros vehículos también pueden incluir disoluciones estériles, comprimidos, comprimidos recubiertos y cápsulas.

Normalmente, tales vehículos pueden contener excipientes tales como almidón, leche, azúcar, tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico, o sales del mismo, estearato de magnesio o de calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, gliceroles u otros excipientes conocidos. Tales vehículos también pueden incluir aromas y aditivos de color, conservantes u otros componentes. Las composiciones que comprenden tales vehículos se formulan por medios convencionales muy conocidos. Véase Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed., Marck Publishing Company, Easton, Pensilvania (1980).

Los anticuerpos monoclonales y proteínas de unión recombinantes de la presente invenciones encuentran muchos usos in vitro e in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden usarse in vitro para aislar gp39 humana soluble y proteínas que tienen mutaciones en gp39 humana asociadas a la enfermedad humana, tales como síndrome hiper-IgM ligado a X. Las composiciones también pueden usarse en procedimientos de diagnóstico para diferenciar entre hiper-IgM ligado a X e IVC.

Para fines de diagnóstico, los anticuerpos monoclonales y proteínas de unión recombinantes pueden estar tanto marcados como sin marcar. Normalmente, los ensayos de diagnóstico implican detectar la formación de un complejo por la unión del anticuerpo monoclonal o proteína de unión recombinante a la gp39 humana tanto en la superficie celular como dentro del linfocito T activado. Cuando están sin marcar, los anticuerpos y proteínas de unión recombinantes se usan en ensayos de aglutinación. Además, los anticuerpos sin marcar pueden usarse en combinación con otros anticuerpos marcados (segundos anticuerpos) que son específicamente reactivos con el anticuerpo monoclonal o proteína de unión recombinante, tal como anticuerpos específicos para inmunoglobulina. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales y proteínas de unión recombinantes pueden marcarse directamente. Puede emplearse una amplia variedad de marcas, tal como radionúclidos, agentes que fluorescen, enzimas, sustratos de enzima, cofactores de enzima, inhibidores de enzima, ligandos (particularmente haptenos), etc. Numerosos tipos de inmunoensayos son muy conocidos en la técnica.

Comúnmente, los anticuerpos monoclonales y proteínas de unión recombinantes de la presente invención se usan en ensayos fluorescentes, en los que los anticuerpos o proteínas de unión recombinantes objeto están conjugados con una molécula fluorescente, tal como isotiocianato de fluoresceína (FITC). Debido a que muchas formas mutantes de gp39 humana no son transportadas a la superficie celular, los linfocitos T se aíslan de un sujeto, se activan y luego las células son permeabilizadas para permitir que el anticuerpo marcado o proteína de unión recombinante penetre en la célula y se una a gp39 mutante, siempre que esté presente en la célula. La unión de los anticuerpos monoclonales a gp39 intracelular y una incapacidad para unirse a una forma soluble de CD40 en la superficie celular demuestra que la presencia de ciertas mutaciones puntuales en gp39 humana ha prevenido la localización de la molécula de gp39 en la superficie celular. Esto puede asociarse a enfermedad humana, tal como hiper-IgM ligado a X. La presencia del anticuerpo unido puede detectarse por un citómetro de flujo activado por fluorescencia después de lavarse el anticuerpo o la proteína de unión marcada en exceso. también puede utilizarse Otras técnicas convencionales muy conocidas para aquellos expertos en la materia.

También pueden suministrarse kits para su uso con las composiciones de los anticuerpos y proteínas de unión recombinantes objeto para detectar la presencia de moléculas de gp39 humana mutante en disolución o sobre linfocitos T activados. Por tanto, las composiciones de anticuerpo monoclonal y de proteína de unión recombinante objeto de la presente invención pueden proporcionarse normalmente en una forma liofilizada tanto individualmente como en combinación con anticuerpos que se unen a otros mutantes de gp39 humana específicos. Los anticuerpos y proteínas de unión recombinantes, que pueden conjugarse con una marca o no conjugarse, están incluidos en los kits con tampones, tales como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, por ejemplo, albúmina de suero bovino, o similares. Generalmente, estos materiales estarán presentes en menos de aproximadamente el 5% en peso basado en la cantidad de anticuerpo activo, y normalmente presentes en la cantidad total de al menos aproximadamente el 0,001% en peso basado de nuevo en la concentración de anticuerpo. Frecuentemente, se deseará incluir una sustancia de relleno inerte o excipiente para diluir los principios activos, en la que el excipiente puede estar presente de aproximadamente el 1 al 99% en peso de la composición total. Si se emplea un segundo anticuerpo que puede unirse al anticuerpo monoclonal o proteína de unión recombinante, este estará normalmente presente en un vial separado. El segundo anticuerpo está normalmente conjugado con una marca y se formula de un modo análogo con las formulaciones tratadas anteriormente.

Los anticuerpos monoclonales, particularmente las proteínas de unión recombinantes, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados, de la presente invención también pueden incorporarse como componentes de composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad de proteína de unión que es eficaz, por ejemplo, para modular una respuesta inmunitaria (es decir, una respuesta autoinmunitaria o reacción alérgica) con un vehículo farmacéuticamente aceptable. También pueden incorporarse adyuvantes farmacéuticamente aceptados (agentes de tamponamiento, agentes de dispensación) en la composición farmacéutica. Tales composiciones pueden contener un único anticuerpo monoclonal o proteína de unión recombinante específica para gp39 humana. Alternativamente, una composición farmacéutica puede contener otras moléculas biológicamente activas, por ejemplo, linfocinas, citocinas, otros anticuerpos monoclonales o proteínas de fusión (es decir, CD28-lg, CTLA4-lg).

Los anticuerpos monoclonales, proteínas de unión recombinantes y composiciones farmacéuticas de los mismos de la presente invención son particularmente útiles para administración oral o parenteral. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse parenteralmente, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente o intravenosamente. Por tanto, la presente invención proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden una disolución del anticuerpo monoclonal o proteína de unión recombinante disuelta en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso. Puede usarse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, maltosa, 0,4% de solución salina, 0,3% de glicina y similares. Estas disoluciones son estériles y generalmente libres de materia particulada. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales muy conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc. La concentración de anticuerpo o proteína de unión recombinante en estas formulaciones puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,5%, normalmente a o al menos de aproximadamente el 1%, a como máximo el 15 o el 20% en peso y se seleccionará principalmente basándose en volúmenes de líquido, viscosidades, etc., preferentemente para el modo de administración particular seleccionado.

Por tanto, podría prepararse una composición farmacéutica típica para inyección intramuscular que contuviera 1 ml de agua tamponada estéril y aproximadamente 50 mg de anticuerpo monoclonal. Podría prepararse una composición típica para infusión intravenosa que contuviera, por ejemplo, 250 ml de disolución de Ringer estéril y 150 mg de anticuerpo monoclonal o proteína de unión recombinante. Los procedimientos actuales para preparar composiciones parenteralmente administrables serán conocidos o evidentes para aquellos expertos en la materia y se describen en más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania (1980).

Los anticuerpos monoclonales y proteínas de unión recombinantes de la presente invención pueden liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de uso. Se apreciará por aquellos expertos en la materia que la liofilización y reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad del anticuerpo y que los niveles usados pueden tener que ajustarse para compensarse.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se usan in vivo para inhibir la interacción CD40/gp39. El bloqueo de esta interacción limita tanto respuestas de anticuerpos primarios como secundarios a antígenos dependientes de linfocitos T y la producción de anticuerpos específica para estos antígenos. Por tanto, los anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno y proteínas de unión recombinantes pueden usarse para inhibir la activación de linfocitos B, modular o inhibir enfermedad autoinmunitaria (es decir, psoriasis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus, etc.), respuestas alérgicas, rechazo de órgano o enfermedad de injerto frente a huésped. Las composiciones también pueden usarse para la obtención de imágenes de tumores que expresan gp39, cuando están marcados con un marcador detectable. Cuando están conjugados con un agente terapéutico o como una proteína de fusión con un agente terapéutico, los anticuerpos monoclonales, fragmento de unión a antígeno o proteínas de unión recombinantes también pueden usarse para elegir como diana el agente terapéutico para células tumorales.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se usan in vivo para inhibir la interacción CD40/gp39. El bloqueo de esta interacción limita tanto respuestas de anticuerpos primarios como secundarios a antígenos dependientes de linfocitos T y la producción de anticuerpos específica para estos antígenos.

La presente invención se ilustra en los ejemplos que siguen. Esta sección de ejemplos se proporciona para ayudar en el entendimiento de la invención, pero no pretende limitar, y no debe interpretarse que limite, de ningún modo la invención como se expone en las reivindicaciones que siguen.

Ejemplo 1

Generación y caracterización inicial de anticuerpos monoclonales específicos para gp39 - Fusión 1

A. Inmunización

Un ratón BALB/c hembra de seis a ocho semanas de edad se inmunizó inicialmente intraperitonealmente con 30 μg de una proteína de fusión gp39-CD8 (sgp39, Hollenbaugh y col., 1992, EMBO J. 11:4313-4321) en un volumen de 100 μl de adyuvante completo de Freund. Aproximadamente dos semanas después, el ratón se inyectó similarmente, excepto que el vehículo usado fue adyuvante incompleto de Freund. Tres semanas después el ratón recibió una inyección de refuerzo pre-fusión intravenosa con 23 μg de sgp39 en un volumen de 100 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS).

B. Fusión

Tres días después del refuerzo pre-fusión se recogieron el bazo y los ganglios linfáticos (axilares, poplíteos,inguinales y mesentéricos). Éstos se cortaron en trozos pequeños con un escalpelo y luego se presionaron suavemente entre los extremos de vidrio congelados de portaobjetos de microscopio de vidrio en presencia de medio incompleto de Iscove (medio Dulbecco modificado con Iscove complementado con penicilina y estreptomicina a una concentración final de 100 U/ml y 100 μg/ml, respectivamente) para soltar los linfocitos de tejido conjuntivo. La suspensión se pipeteó suavemente para soltar adicionalmente las células entre sí y la suspensión se pasó luego por un filtro celular (Falcon 2350) para eliminar terrones de residuos de tejido conjuntivo. La suspensión de células se lavó dos veces por centrifugación a 200 g durante 10 minutos, seguido de resuspensión del sedimento de células en medio incompleto de Iscove. Después de lavar se determinó un recuento de leucocitos total viable por exclusión con azul de tripano.

El procedimiento de fusión se basó en los procedimientos de Lane y col., 1986 (Methods Enzymol. 121:183-192). Células de mieloma (X63-Ag8.653, Kearney y col., 1979, J. Immunol. 123:1548-1550) en crecimiento de fase logarítmica se lavaron dos veces por centrifugación a 200 g durante 5 min, seguido de resuspensión del sedimento de células en medio incompleto de Iscove. Entonces, las células se combinaron con los leucocitos lavados en un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml a una relación 1:4 de células de mieloma con respecto a leucocitos y se centrifugaron a 200 g durante 10 minutos. Tras la aspiración del medio, al tubo se le dieron cuidadosamente golpecitos hasta que el sedimento de células se resuspendió en la pequeña cantidad de medio restante. Después de la incubación del tubo en un baño de agua a 37ºC durante 1 min, a las células se añadieron 1,5 ml de disolución de polietilenglicol-sulfóxido de dimetilo a 37ºC recientemente preparada [50% (peso/volumen) de polietilenglicol Kodak 1450, 5% (v/v) de sulfóxido de dimetilo y 45% (v/v) de solución salina tamponada con fosfato que no contiene calcio ni magnesio, pH 8,0] durante un periodo de 45 segundos con arremolinamiento constante del tubo en un baño de agua a 37ºC. Entonces, la mezcla de fusión se diluyó con 50 ml de medio completo de Iscove a 37ºC (medio incompleto de Iscove complementado con L-glutamina 2 mM y 15% (v/v) de suero bovino fetal (SBF) adicional) durante un periodo de 90 segundos del siguiente modo: 3 ml durante los 30 primeros segundos, 9 ml durante los 30 siguientes segundos, y el resto durante los 30 últimos segundos. El tubo se incubó a 37ºC durante 10 minutos, después de lo cual se centrifugó a 200 g durante 5 minutos, el sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 120 ml de medio de hibridoma [medio completo de Iscove complementado con hipoxantina (concentración final 1 x 10-1 M), aminopterina (concentración final 4 x 10-7 M), timidina (concentración final 1,6 x 10-7 M) y 10% (v/v) de factor de clonación de hibridomas (Boehringer Mannheim)]. La suspensión de células se sembró en seis placas de cultivo celular de 96 pocillos (200 μl/pocillo) produciendo una densidad de siembra de 243.000

células totales (pre-fusión) por pocillo. Los pocillos se alimentaron en los días 3 y 5 después de la fusión por sustitución de la mitad del sobrenadante con medio de hibridoma fresco y se ensayó para anticuerpo específico antigp39 en el día 8.

C. Cribado

Los sobrenadantes de pocillos de cultivo celular que tenían células en crecimiento se cribaron inicialmente para la reactividad con el inmunogén de la proteína sgp39 del siguiente modo. Placas para EIA Dynatech Immulon 2 se recubrieron con 1 μg/ml (100 μl/pocillo) de anticuerpo 53-6 (anti-CD8 de ratón de rata, ATCC TIB 105) en tampón carbonato sódico/bicarbonato sódico 0,05 M, pH 9,6. Las placas se taparon y se incubaron durante la noche a 4ºC. Todas las etapas posteriores se realizaron a temperatura ambiente. El agente de recubrimiento se eliminó y los pocillos se bloquearon con reactivo de bloqueo [(diluyente del espécimen (Genetic Systems Corp., Seattle, WA) diluido 1:10 en agua desionizada)] durante una hora. El reactivo de bloqueo se eliminó y se añadió el sobrenadante de células COS que contenía la proteína sgp39, diluida 1:4 en medio completo de Iscove que contenía 2% de SBF (2% de SBF-Iscove) (100 μl/pocillo) y se incubó durante una hora. La proteína de fusión se eliminó y los pocillos se lavaron una vez con 200 μl de PBS-Tween (PBS que contenía 0,05% (v/v) de Tween 20). Entonces se añadió el sobrenadante de cultivo de celular (50 μl/pocillo) y se incubó durante una hora. El sobrenadante de cultivo celular se eliminó y los pocillos se lavaron una vez con PBS-Tween antes de la adición de anti-IgG de ratón de cabra marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immunological Laboratories) diluida 1:100.000 en reactivo de bloqueo, seguido de una hora incubación. El anticuerpo marcado en exceso se eliminó y los pocillos se lavaron tres veces con PBS-Tween. Esto fue seguido de la adición de 100 μl/pocillo de tetrametilbencidina (Genetic Systems Corp.) diluida 1:100 en tampón citrato 0,1 M, pH 5,5, que contenía 0,015% de una disolución de H2O2 al 30%. Las placas se incubaron durante 15 minutos y la reacción se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico 3 N (50 μl/pocillo). La densidad óptica se midió a 450/630 nm en un lector de microplacas Bio-Tek Instruments EL312.

Entonces, aquellos sobrenadantes de cultivo celular encontrados que eran positivos para unirse a sgp39 se probaron para unirse a la proteína de fusión CD72-CD8 (sCD72) para evaluar anticuerpos específicos para gp39 en vez de la porción de CD8 murina de la proteína de fusión. La descripción de la construcción del gen quimérico que codifica sCD72 y la expresión de la proteína de fusión transitoriamente en células COS se describe en Hollenbaugh y col., 1992 (incorporado por referencia en el presente documento en su totalidad). El ensayo de ELISA para unirse a sCD72 fue idéntico al descrito anteriormente para sgp39, excepto que se usó el sobrenadante de células COS sin diluir que contenía sCD72 en lugar de sgp39.

Todos los sobrenadantes que fueron reactivos con sgp39 y no con sCD72 se probaron luego para su capacidad para inhibir la unión de la proteína de fusión CD40-Ig a sgp39. Brevemente, placas para EIA Dynatech Immulon 2 se recubrieron con anticuerpo 53-6 como se ha descrito anteriormente. Los pocillos se bloquearon y se lavaron como antes y se añadió el sobrenadante de células COS que contenía sgp39 diluido 1:4 en 2% de SBF-Iscove (100 μl/pocillo) y se incubó durante 1 hora. La sgp39 se eliminó y las placas se lavaron con 200 μl de PBS-Tween. Entonces se añadieron los sobrenadantes de cultivo (50 μl/pocillo) y se incubaron durante 1 hora, se eliminaron y los pocillos se lavaron una vez con PBS-Tween. Entonces, la proteína de fusión CD40-Ig purificada (documento EP 555880) se diluyó a 2 μg/ml en 2% de SBF-Iscove, se añadió a todos los pocillos (50 μl/pocillo) y las placas se incubaron durante una hora. La proteína de fusión en exceso se eliminó y los pocillos se lavaron de nuevo una vez con PBS-Tween antes de añadir anti-IgG humana de cabra marcada con HRP (Jackson Immunological Laboratories) diluida 1:10.000 en reactivo de bloqueo (50 μl/pocillo). Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente, el reactivo marcado con HRP se eliminó y las placas se lavaron tres veces con PBS-Tween. La divulgación de reactivo marcado con HRP unido y la medición de la densidad óptica resultante fue como se describe en los ensayos de ELISA anteriormente descritos.

D. Clonación

Se encontró que varios pocillos contenían anticuerpo específico para gp39 y que inhibieron la interacción de gp39 con su ligando CD40 en un ELISA. Entonces, las células que se cultivaron en estos pocillos se clonaron y se sometieron a criterios de cribado adicionales.

La clonación se inició con un procedimiento de “mini-clonación” en el que células de pocillos maestro designados se sembraron primero a una densidad de 10 ó 20 células por pocillo en placas de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos. Una o dos placas se establecieron para cada pocillo maestro en un medio de cultivo de medio completo de Iscove complementado con 10% (v/v) de factor de clonación de hibridomas (medio de clonación) a un volumen de 200 μl/pocillo. La células se cultivaron durante 7 a 8 días, momento en el que los sobrenadantes se probaron de nuevo para reactividad de gp39 y la capacidad para inhibir la unión de CD40-Ig a la proteína de fusión gp39-CD8 por ELISA (descrito anteriormente). De los pocillos en cada conjunto de miniclones que satisficieron estos criterios se clonó un pocillo. Las células se sacaron del pocillo seleccionado y se diluyeron a una concentración en medio de clonación que proporcionaría una densidad calculada de una célula para cada dos pocillos. Las células se sembraron en dos placas de cultivo celular de 96 pocillos de la mitad de área (Costar) en un volumen de 100 ó 150 μl/pocillo.

Después de cuatro o cinco días de cultivo, los pocillos se examinaron en un microscopio invertido y se marcaron aquellos pocillos que contenían un único clon. Después de otros tres-cuatro días de cultivo, los sobrenadantes de todos los pocillos se probaron para la reactividad de gp39 (ELISA de la proteína de fusión gp39-CD8, descrito anteriormente) y la capacidad para inhibir la unión de CD40-Ig a gp39-CD8 por ELISA (descrito anteriormente). Los sobrenadantes de los pocillos que fueron reactivos con gp39-CD8 bloquearon la interacción de CD40-Ig con gp39-CD8, y que procedían de pocillos marcados que contenían un único clon, se examinaron adicionalmente para su capacidad para unirse a una línea de linfocitos T de Jurkat que expresó constitutivamente gp39 sobre su superficie (BMS-10, R. Mittler, Bristol-Myers Squibb) y para bloquear la unión de la proteína de fusión CD40-Ig a estas células. Los clones que satisficieron los dos últimos criterios se seleccionaron para el estudio posterior.

La unión del anticuerpo a células BMS-10 se determinó por análisis de células fluorescentes. Brevemente, 250.000 células BMS-10 se contaron, se añadieron a cada tubo y se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos. El medio de cultivo se aspiró y 100 μl de cada sobrenadante que contenía anticuerpo reactivo con gp39-CD8 por ELISA se añadieron a un tubo. Los controles incluyeron medio de cultivo solo o medio de cultivo que contenía un anticuerpo monoclonal de ratón de control negativo. La mezcla se incubó sobre hielo durante 30 minutos y luego se añadieron 2 ml de 2% de SBF-Iscove. Los tubos se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos y el sobrenadante se eliminó. F(ab')2 marcado con FITC, F(ab')2 de cabra anti-IgG de ratón (Jackson Immunological Laboratories), se diluyó 1:500 en 2% de SBF-Iscove y a cada tubo se añadieron 100 μl. Después de una incubación de 30 minutos sobre hielo, las células se lavaron dos veces con 1 ml de 2% de SBF-Iscove y se resuspendieron en 250 μl de 2% de SBF-Iscove antes del análisis en un FACScan™ Becton Dickinson.

La evaluación de la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de CD40-Ig a células BMS-10 usó el procedimiento anterior, excepto que después del lavado de anticuerpo anti-gp39 sin unir, CD40-Ig, diluida a 20 μg/ml en 10% de SBF-Iscove, se añadió a cada tubo, 100 μl/tubo. Después de una incubación de 30 minutos sobre hielo se añadieron 2 ml de 2% de SBF-Iscove a cada tubo, los tubos se centrifugaron durante cinco minutos a 350 g y los sobrenadantes se aspiraron para eliminar CD40-Ig sin unir. Entonces, en lugar de un reactivo anti-Ig de ratón marcada con FITC, a cada tubo se añadió un F(ab')2 de cabra anti-IgG humana marcada con PE o FITC apropiadamente diluido (Jackson Immunological Laboratories) para detectar CD40-Ig unida. Por lo demás, el ensayo se completó y la célula se analizó como se ha descrito anteriormente.

Siguiendo los procedimientos brevemente explicados anteriormente se derivó un total de 23 anticuerpos monoclonales de ratón anti-gp39 humana. Cada uno de los anticuerpos monoclonales se isotipó para identificar su subclase de IgG y adicionalmente se caracterizó su capacidad para reconocer gp39. También se llevó a cabo un análisis de diferencias de especificidad de epítopes entre los anticuerpos monoclonales, como era la capacidad de los anticuerpos para inhibir la proliferación de linfocitos B dependiente de linfocitos T y la producción de inmunoglobulinas.

Ejemplo 2

Generación y caracterización inicial de anticuerpos monoclonales de rata específicos para gp39 - Fusión 5

A. Inmunización

Una rata Lewis hembra de cuatro semanas de edad se inmunizó con 50 μg de una proteína de fusión gp39-CD8 (Hollenbaugh y col.) suspendida a un total de 400 μl en adyuvante Ribi (Ribi Immunochem) según instrucciones del fabricante. De este volumen, 200 μl se administraron interperitonealmente (IP) y el volumen restante se dividió igualmente entre dos sitios subcutáneos. Tres semanas después, el animal se re-inmunizó IP con 300 μl de PBS que contenía 50 μl de proteína de fusión gp39-CD8. Un mes después, la rata se inmunizó de nuevo IP con 300 μl de PBS que contenía 30 μg de gp39-CD8. Tres semanas y media después, esta rata recibió una inyección de refuerzo pre-fusión intravenosa (IV) de 30 μg de gp39-CD8 en un volumen de 300 μl de PBS.

B. Fusión y cribado

Tres días después se realizaron la recogida, preparación y fusión de células del ganglio linfático con células de mieloma de ratón como para la fusión 1 descrita en el Ejemplo 1 con las siguientes modificaciones. Los leucocitos de rata se fusionaron con una variante de la línea de células de mieloma de ratón X63-Ag8.653 llamada H10 que había sido transformada con el gen de resistencia G418. Las suspensiones de células de cada fusión se sembraron en siete placas de cultivo celular de 96 pocillos a una densidad de siembra de 236.000 células totales (pre-fusión) por pocillo y se cultivaron en medio de hibridoma complementado con una concentración final de 0,25 mg/ml de geneticina.

Los sobrenadantes de los pocillos de cultivo celular en la fusión 39-5 se cribaron para reactividad específica con gp39 usando gp39-CD8 y ELISA de la proteína de fusión CD72-CD8 como se describe en el Ejemplo 1 con las dos siguientes modificaciones. Se usó anticuerpo monoclonal murino anti-CD8 murina producido a partir del hibridoma 116-13.1 (ATCC HB 129) a una concentración de 5 μg/ml como anticuerpo de captura para las proteínas de fusión en lugar del anticuerpo 53-6 y se usó anti-IgG de rata murino marcada con HRP (específico para Fc) (Jackson Immunological Laboratories) a una dilución 1:20.000 como anticuerpo trazador para detectar anticuerpo anti-proteína de fusión unido en lugar de anti-IgG de ratón de cabra marcada con HRP. Se encontró que cuatro pocillos contenían anticuerpo específico para gp39-CD8 y no proteína de fusión CD72-CD8. De estos, el anticuerpo es el único (395.6E9) que se encontró que teñía la línea celular gp39+ BMS-10 cuando se examinó por citometría de flujo como se describe anteriormente. Posteriormente se determinó que el sobrenadante de este pocillo bloqueaba completamente la unión de CD40-Ig a gp39-CD8 usando el ELISA de bloqueo descrito anteriormente y que inhibía completamente la unión de CD40-Ig a células BMS-10 cuando se evaluó por citometría de flujo. Se obtuvo una línea celular clónica que poseía todas las características anteriores por el procedimiento de mini-clonación/clonación descrito anteriormente.

Ejemplo 3

Generación y caracterización inicial de anticuerpos monoclonales específicos para gp39 - Fusión 7

A. Inmunización

Un ratón BALB/c hembra de seis a ocho semanas de edad se inmunizó inicialmente subcutáneamente en cuatro sitios con un total de 30 μg de una proteína de fusión gp39-CD8 en adyuvante completo de Freund. Aproximadamente dos y cinco semanas después, este ratón se inyectó similarmente con 30 μg y 25 μg, respectivamente, de gp39-CD8, excepto que el vehículo para el antígeno fue adyuvante incompleto de Freund. Cinco meses después de la inmunización inicial, este ratón se inyectó intraperitonealmente con 10 μg de proteína de fusión en adyuvante incompleto de Freund. Dos semanas después, el ratón recibió una inyección de refuerzo prefusión intravenosa de 30 μg de proteína de fusión gp39-CD8 en PBS.

B. Fusión y cribado

Tres días después se realizaron la recogida, preparación y fusión de células del bazo de ratón y de ganglio linfático con células de mieloma de ratón como para la fusión 39-1, excepto que sólo se usó 1 ml de polietilenglicol para fusionar las células. La suspensión de células resultantes de esta fusión se sembró en 10 placas de cultivo celular de 96 pocillos a una densidad de siembra de 183.000 células totales (pre-fusión) por pocillo. Los pocillos se alimentaron en los días 3 y 6 después de la fusión por sustitución de la mitad del sobrenadante con medio de hibridoma fresco y se ensayó para anticuerpo específico anti-gp39 en el día 9.

Los sobrenadantes se cribaron inicialmente para especificidad anti-gp39 en un ensayo de unión a célula basado en ELISA. Placas de fondo plano de 96 pocillos Falcon o Costar se recubrieron con 3,5 μg/cm2 de Cell-Tak (Collaborative Biomedical Products diluido en bicarbonato sódico 0,1 M, pH 8,0). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Cell-Tak sin unir se aspiró y los pocillos se lavaron dos veces con 150 μl/pocillo de agua destilada en vaso. Las células BMS-10 se centrifugaron y se resuspendieron a una concentración de 2 x 106 células/ml en medio de Iscove sin suero. Cincuenta μl de esta suspensión de células se añadió a cada pocillo y las placas se centrifugaron durante 5 minutos a 250 g. Entonces, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, después de lo cual el medio se aspiró de los pocillos usando un colector de ocho canales (Drummond). Entonces, los sobrenadantes de cultivo se sembraron de forma reproducible sobre las placas de ensayo, 50 μl/pocillo, y las placas se incubaron durante 1 hora. Los sobrenadantes se aspiraron y las placas se lavaron una vez con 150 μl/pocillo de PBS que contenía 1% de SBF. Se añadió anti-IgG de ratón de rata marcado con HRP (Zymed) diluido en PBS que contenía 5% de SBF, 50 μl/pocillo. Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente, el reactivo marcado con HRP se eliminó y las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía 1% de suero bovino fetal. La divulgación del reactivo marcado con HRP unido y la medición de la densidad óptica resultante fue como se describe en otros ensayos de ELISA anteriormente detallados.

Como cribado secundario, los sobrenadantes de los pocillos positivos en el ELISA de células BMS-10 anterior se ensayaron para reactividad para sgp39 y sCD72 usando los ELISA de proteínas de fusión respectivos descritos anteriormente. En este ensayo, anti-IgG de ratón de rata marcado con HRP (Zymed) sustituyó el anti-IgG de ratón de cabra usado en el ensayo anteriormente descrito. Entonces, la confirmación de la reactividad específica con células BMS-10 positivas para gp39 se realizó usando inmunofluorescencia indirecta y análisis de FACS como se describe anteriormente. Los sobrenadantes también se probaron para su capacidad para inhibir la unión de CD40-Ig a sgp39 usando el ELISA de bloqueo descrito anteriormente. Los sobrenadantes se analizaron adicionalmente en cuanto a su isotipo usando el ELISA de gp39-CD8, excepto por una modificación. Cada sobrenadante se probó por cuadruplicado y el anticuerpo anti-gp39 unido se rastreó entonces con cuatro reactivos específicos para anti-isotipo de ratón marcado con HRP diferente (Zymed, anti-IgG1, IgG2a o IgG2b de ratón de rata nº 04-6120, 04-6220 y 046320, respectivamente, y anti-IgG3 de ratón de conejo, nº 61-0420). Este análisis global identificó un pocillo que contenía anticuerpo específico para gp39 expresado en la superficie celular, bloqueó la unión de CD40-Ig a gp39-CD8 y fue del isotipo IgG2a. Se miniclonaron células productoras de anticuerpos apropiadas de pocillos designados 39-7.3E12, 39-7.7G4 y 39-7.4C1 y se clonaron como se describe anteriormente.

Ejemplo 4

Generación y caracterización inicial de anticuerpos monoclonales específicos para gp39 - Fusión 9

A. Inmunización

Un ratón BALB/c hembra de seis a ocho semanas de edad se inmunizó inicialmente subcutáneamente en cuatro sitios con un total de 30 μg de una proteína de fusión gp39-CD8 en adyuvante completo de Freund. Dos, cinco, 28 y 30,5 semanas después, el animal se inmunizó similarmente con 30 μg, 25 μg, 25 μg y 25 μg, respectivamente, de proteína de fusión gp39-CD8 en adyuvante incompleto de Freund. Tres semanas después, el animal recibió una inyección de refuerzo pre-fusión IV de 35 μg de g39-CD8 en PBS.

B. Fusión y cribado

Tres días después se realizaron la recogida, preparación y fusión de células del bazo de ratón y de ganglio linfático con células de mieloma de ratón X63-Ag8.653 como para la fusión 39-1, excepto que la relación de células de mieloma se realizó como para la fusión 39-1, excepto que la ración de células de mieloma con respecto a leucocitos fue 1:3 en lugar de 1:4. La suspensión de células de esta fusión se sembró en 15 placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 187.000 células totales (pre-fusión) por pocillo.

Los sobrenadantes de los pocillos de cultivo celular en la fusión 39-9 se cribaron para anticuerpo anti-gp39 usando el ELISA de unión a células BMS-10 descrito anteriormente. Todos los sobrenadantes positivos en este cribado se examinaron luego para su capacidad para bloquear la unión de CD40-Ig a gp39-CD8 usando el ELISA de bloqueo previamente descrito. Se observaron numerosos pocillos positivos para ambos criterios.

Con el fin de identificar aquellos pocillos que contenían anticuerpo con una especificidad de epítope de gp39 diferente de la de los anticuerpos monoclonales anti-gp39 anteriormente identificados, cada uno de los sobrenadantes positivos para BMS-10 de bloqueo de CD40-Ig se cribó por ELISA en la serie de proteínas mutantes gp39 descritas anteriormente para el análisis de epítopes de anticuerpos de la fusión 1. Este cribado identificó varios pocillos, que incluyen 39-9.27. 39-9.68, 39-9.246 y 39-9.274, para los que no hubo una pérdida significativa de unión a cualquiera de los mutantes examinados.

Además, un pocillo designado 39-9. II demostró unión significativamente reducida a los mutantes K143/A y especialmente a los mutantes N180/A, un patrón no previamente observado. También se mostró en este ensayo que cada uno de estos sobrenadantes reconoció sgp39 nativa y no la proteína de fusión sCD72 de control negativo. Se obtuvo un anticuerpo apropiado que secretaba la línea celular clónica para cada uno de estos cinco pocillos por clonación por dilución limitada como se ha descrito anteriormente. El posterior análisis por citometría de flujo del anticuerpo monoclonal clonado de cada una de las líneas celulares mostró que todos reaccionaron específicamente con la línea celular BMS-10 y todos pudieron bloquear la interacción de CD40-Ig con esta línea celular. Cada uno de estos anticuerpos monoclonales se isotipó como se describe posteriormente y se encontró que todos, excepto 39

9.36 que era una IgG2b murina, eran IgG1 murina.

Ejemplo 5

Caracterización de los anticuerpos monoclonales anti-gp39

A. Isotipado

Cada uno de los anticuerpos monoclonales murinos obtenidos mediante los procedimientos anteriores se isotipó para identificar su subclase de IgG usando un kit Isotype Ab-Stat Kit™ (SangStat Medical Corporation, Menlo Park, CA) o un kit ISOStrip™ (Boehringer Mannheim) según instrucciones del fabricante. El isotipo del anticuerpo monoclonal de rata obtenido en la fusión 5 (39-5.6E9) se estableció usando el ELISA de la proteína de fusión gp39-CD8 descrito anteriormente, excepto que se emplearon individualmente anticuerpos monoclonales marcados con peroxidasa de rábano picante específicos para IgG1, IgG2a, IgG2b y IgG2c de rata (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) a una dilución de 1:1.000 como anticuerpos trazadores. El único anticuerpo trazador que se unió a 39-5.6E9 fue el anticuerpo anti-IgG2a de rata que indica que este anticuerpo monoclonal era una IgG2a.

Los anticuerpos monoclonales obtenidos en la fusión 7 se analizaron en cuanto a su isotipo usando el ELISA de sgp39, excepto para una modificación. Cada sobrenadante se probó por cuadruplicado y el anticuerpo anti-gp39 unido se rastreó luego con cuatro reactivos específicos para anti-isotipo de ratón marcado con HRP diferentes (Zymed, anti-IgG1, IgG2a, o IgG2b de ratón de rata, respectivamente, y anti-IgG3 de ratón de conejo). Los isotipos de los anticuerpos monoclonales de la presente invención se muestran en la Tabla 1.

B. Transferencia Western e inmunoprecipitación

La evaluación de la transferencia Western se realizó por dos procedimientos diferentes. En uno, 1,5 μg de proteína de fusión de sgp39 purificada en 300 μl de colorante de carga [Tris 250 mM, 0,002% (v/v) de azul de bromofenol, 40% (v/v) de glicerol, pH 6,8, 15 μl de 20% de SDS, 10 μl de 2-mercaptoetanol] se sometieron a electroforesis sobre 12% de gel de SDS-poliacrilamida a 150 V durante 1 hora. Las proteínas separadas se transfirieron a papel de nitrocelulosa con un aparato de transferencia Bio-Rad mini-blot según instrucciones del fabricante. Después de la transferencia, la nitrocelulosa se dejó secar a temperatura ambiente y entonces cada carril se cortó de la hoja como tiras vertical anchas que se colocaron individualmente en los pocillos de una unidad de pocillos poco profundos Bio-Rad. Las tiras se incubaron en 10 ml de una disolución de bloqueo de solución salina tamponada con Tris que contenía 5% (peso/volumen) de leche desnatada en polvo (TBS-T) durante 2 horas a temperatura ambiente sobre una agitador de balanceo de superficie plana. Después de la incubación, la disolución de bloqueo se aspiró y las tiras se aclararon dos veces con TBS-T.

El anticuerpo monoclonal anti-gp39 se diluyó a una concentración de aproximadamente 12 μg/ml en TBS-T y se añadieron 3 ml de disolución de anticuerpo a cada tira, un anticuerpo por tira, durante 2 horas a temperatura ambiente con balanceo. La disolución de anticuerpo en exceso se aspiró de cada pocillo y las tiras se lavaron cinco veces con 10 ml de TBS-T. Después de lavar, 10 ml de una dilución 1:3.000 de anti-Ig de ratón de cabra marcada con HRP (Tago) en TBS-T se añadieron a cada pocillo. Las tiras se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente y luego se lavaron cinco veces como se ha descrito anteriormente.

La detección del anticuerpo conjugado con HRP unido se realizó usando reactivos de detección de ECL (Amersham) según instrucciones del fabricante. La disolución de detección se aspiró y el líquido en exceso sobre las tiras se eliminó tocando el extremo de las tiras sobre una toalla de papel. Las tiras se alinearon dentro de un protector de páginas de plástico y el protector se cerró. Entonces, el protector cerrado se expuso a película de autorradiografía durante periodos de tiempo variables (1 segundo a 15 minutos) y las películas se procesaron posteriormente.

En un segundo procedimiento, 200 μl de sobrenadante gastado de células COS transfectadas con sgp39 se diluyó con 25 μl de colorante de carga, se calentó a 100ºC durante 5 minutos, se enfrió sobre hielo y se sometió a electroforesis sobre un gel de 10% de SDS-poliacrilamida. La proteína separada se transfirió a una membrana Bio-Rad PVDF™ usando un aparato de transferencia semi-seca Hoeffer según instrucciones del fabricante. Después de que las proteínas separadas se transfirieran a las membranas, las membranas se dejaron secar a temperatura ambiente y luego se siguió el procedimiento como se ha descrito anteriormente para teñir las membranas.

Los anticuerpos anti-gp39 también se probaron para la capacidad para inmunoprecipitar gp39 de tanto células COS transfectadas como linfocitos T activados. Brevemente, células COS se transfectaron con un ADNc que codificaba gp39 humana por el procedimiento de DEAE-dextrano usando diez placas de 150 mm a aproximadamente el 70% de confluencia. Al día siguiente, las células COS se tripsinaron y se sustituyeron en ocho matraces T de 150 cm2. El medio se eliminó después de incubar durante la noche y las células se lavaron una vez con medio de Eagle modificado sin cisteína o metionina (kit Gibco Select-amine) y luego se añadieron 20 ml de medio fresco sin cisteína/metionina que contenía 0,02 mCi/ml de marca Tran35S (ICN, Costa Mesa, CA) y las células se incubaron durante la noche. Al día siguiente, el medio se eliminó y las células se aclararon una vez con PBS y se añadieron 2 ml de tampón de lisis (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,25% de desoxicolato) que contenía sulfonilfluoruro de fenilmetilo 1 nM (PMSF) y 25 μg/ml de aprotinina a cada matraz. Los matraces se colocaron sobre hielo durante 10 minutos, después de lo cual el tampón se eliminó. Se prepararon alícuotas y se centrifugaron en una microcentrífuga a 4ºC a velocidad máxima durante dos minutos. Los sobrenadantes se reunieron y se guardaron a -70ºC antes de la inmunoprecipitación.

La inmunoprecipitación se llevó a cabo descongelando los lisados de células COS transfectados sobre hielo y dividiendo el volumen total en 10 alícuotas. A ocho tubos se añadieron 10 μg de un anticuerpo anti-gp39, mientras que un tubo recibió CD40-Ig como control positivo y uno no recibió agente precipitante como control negativo. Las muestras se incubaron sobre hielo durante 4 horas, después de lo cual se añadieron 100 μl de proteína G-Sepharose FF™ (Pharmacia) a cada tubo. Los tubos se incubaron sobre hielo durante 1 hora con mezcla cada 10 a 15 minutos. Las muestras se centrifugaron por pulsos en una microcentrífuga y el sobrenadante se desechó. Los sedimentos se lavaron por resuspensión y se sedimentaron tres veces con tampón de lisis frío, luego una vez con PBS frío. Tras el último lavado, 30 μl de tampón de carga SDS que contenía �-mercaptoetanol se añadieron a cada tubo. Las muestras se calentaron a 95ºC durante 5 minutos, se centrifugaron por pulsos y el sobrenadante se cargó sobre un gel de 12% de SDS-poliacrilamida. Al completarse la electroforesis, el gel se dispuso en 10% de metanol, 10% de ácido acético en agua durante dos horas. Entonces, el gel se dispuso en agente fluorográfico Amplify™ (Amersham) que contenía 10% de glicerol durante 15 minutos. El gel se secó sobre papel Whatman 3M a vacío a 80ºC durante 45 minutos y se expuso a película de rayos X a -70ºC durante 1 a 7 días. Los resultados del ensayo se resumen en la Tabla 1. Las inmunoprecipitaciones positivas se indicaron por la presencia de una banda en el mismo peso molecular que el control de CD40-lg.

La radioinmunoprecipitación de gp39 de linfocitos T de sangre periférica humana activados se llevó a cabo del siguiente modo. Sangre completa heparinizada fresca se diluyó 1 : 1 con PBS y 40 ml se recubrieron sobre 10 ml de Lymphocyte Separation Media™ (Organon Teknika) como se ha descrito anteriormente. La muestra se centrifugó durante 30 minutos a 220 g. Los linfocitos aislados se lavaron con PBS y se resuspendieron en medio de Eagle modificado que carecía cisteína y metionina que contenía 10% de suero bovino fetal dializado y 0,02 mCi/ml de Tran 35S Label™ a una densidad de células final de 3 x 106 células/ml. Las células se activaron mediante la adición de PMA (10 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) durante nueve horas, después de las cuales las células se sedimentaron, el medio se eliminó y las células se lisaron con tampón de lisis que contenía PMSF y aprotinina. Las células se incubaron con tampón de lisis durante 10 minutos sobre hielo antes de transferir la muestra a tubos de microcentrífuga y centrifugar durante 2 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se reunieron y se guardaron a -70ºC hasta el posterior procesamiento. La precipitación se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente para células COS transfectadas y los resultados se resumen en la Tabla 1.

TABLA 1 (continuación)

Resumen de mAb anti-gp39 humana

mAb

Isotipo Unión a células Jurkat gp39+ Inhiben la unión de CD40-Ig a células Jurkat gp39+ Transferencia Western de sgp39 Radioinmunoprecipitación

39-1.3

IgG1 + + - + (a)

39-1.7

IgG2b + + - + (a.b)

39-1.21

IgG1 + + - SH

39-1.25

IgG1 + SH - SH

39-1.26

IgG1 + + - + (a.b)

39-1.29

IgG2a + + + + (a)

39-1.37

IgG1 + + - SH

39-1.52

IgG1 + + + SH

39-1.59

IgG1 + + - SH

39-1.61

IgG1 + + + + (b)

39-1.63

IgG1 + + - SH

39-1.77

IgG1 + + + + (a.b)

39-1.93

IgG1 + + + SH

391.106

IgG1 + + + + (b)

391.109

IgG1 + + + SH

391.122

IgG2b + + - SH

391.123

IgG1 + + - SH

391.124

IgG1 + + + SH

391.128

IgG2b + + - +

391.132

IgG2b + + - +

391.134

IgG1 + + + +

391.138

IgG1 + + - SH

391.156

IgG1 + + + SH

397.3E12

IgG2a + + - SH

395.6E9

IgG2a + + - SH

Resumen de mAb anti-gp39 humana

mAb

Isotipo Unión a células Jurkat gp39+ Inhiben la unión de CD40-Ig a células Jurkat gp39+ Transferencia Western de sgp39 Radioinmunoprecipitación

397.7G4

IgG2a + + + SH

39-9.27

IgG1 + + + SH

397.4C1

IgG2b + + + SH

39-9.68

IgG2b + + + SH

399.246

IgG1 + + + SH

39-9.11

IgG1 + + - SH

399.274

IgG1 + + + SH

a - radioinmunoprecipitado a partir de células COS transfectadas con gp39 b - radioinmunoprecipitado a partir de linfocitos T humanos activados SH - sin hacer

C. Examen de unión de anticuerpos monoclonales anti-gp39 humana a linfocitos T humanos normales activados y no activados.

La reactividad de los diversos anticuerpos monoclonales anti-gp39 humana con linfocitos T humanos normales

5 activados y no activados se evaluó por inmunofluorescencia indirecta seguido de análisis de FACS. Células mononucleares de sangre humana (PBMC) se aislaron diluyendo sangre completa 1 : 1 con PBS, recubriendo 25 ml sobre 10 ml de medio de separación de linfocitos (LSM, Organon Teknika) y centrifugando durante 25 minutos a 450

g. Las células en la interfase se recogieron y se lavaron una vez en PBS. Los linfocitos T se aislaron incubando las PBMC con 150 veces AET-SRBC (glóbulos rojos de oveja tratados con bromuro de 2-aminoetilisotiouronio 0,143 M 10 (Sigma)) durante 5-10 minutos sobre hielo. Los linfocitos T positivos para rosetas E (E'-linfocitos T) se separaron de las células restantes por subyacimiento con LSM frío y centrifugando a 450 g durante 25 minutos. El sedimento (que contenía linfocitos T roseteados) se recogió y los glóbulos rojos de oveja se lisaron con 0,83% de cloruro de amonio durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los linfocitos T resultantes se lavaron una vez en 2% de SBF-Iscove y se incubaron durante la noche en 10% de SBF-Iscove a 1-3 x 106 células/ml en una estufa de incubación 15 humidificada a 37º/6% de CO2. Entonces, los linfocitos T se activaron mediante la adición de 10 ng/ml de forbol 12miristato 13-acetato (PMA) (Sigma) y 1 μg/ml de ionomicina (Sigma) e incubación adicional de las células durante 5 6 horas. Una parte de los linfocitos T no recibió PMA e ionomicina, pero se incubó durante otras 5-6 horas y se denominan aquí linfocitos T no activados. La inmunofluorescencia indirecta y el análisis de FACS de los mAb antigp39 humana sobre estos linfocitos T activados y no activados se realizó como se ha descrito anteriormente para

20 análisis de FACS de anticuerpos anti-gp39 sobre células BMS-10, excepto que se usó reactivo de cabra anti-IgG de ratón marcada con FITC (Becton Dickinson) como reactivo de la segunda etapa. Adicionalmente, un anticuerpo monoclonal anti-CD69 humana murino (Becton Dickinson) se usó como control positivo para la activación de los linfocitos T. De este modo se examinaron todos los mAb anti-gp39. Se encontró que todos teñían linfocitos T activados y se mostró adicionalmente que eran completamente no reactivos con linfocitos T no activados.

25 Ejemplo 6

Construcción de proteínas de fusión mutantes gp39

A. Selección de residuos de gp39 elegidos como diana para la sustitución:

Residuos elegidos como diana para mutagénesis en gp39 se seleccionaron basándose en un modelo de proteína comparativo previamente derivado de la región extracelular de gp39 (Aruffo y col., 1993 Cell 72:291-300), 30 basándose en los alineamientos de secuencias basados en la estructura de gp39 frente a TNF-� y basándose en los contactos cristalográficos informados en la estructura del complejo TNF-�/TNFR (Banner y col., 1993 Cell 73:43 1445). El análisis de gráficas por ordenador del modelo de gp39 se llevó a cabo usando Insight II™ (BIOSYM Technologies Inc., San Diego, CA) en una estación de trabajo Silicon Graphics Indigo™. Las secuencias se alinearon inicialmente usando los programas de GCG (Genetics Computer Group Inc., Madison. WI) y se

modificaron manualmente teniendo en cuenta información tridimensional y limitaciones de las estructuras cristalinas de TNF-� (Eck y col., 1992 J. Biol. Chem. 267:2119-2122) y TNF-�/TNFR (Banner y col., arriba).

B. Construcción de mutantes de gp39

Se introdujeron sustituciones de aminoácidos y mutaciones silenciosas para el diagnóstico de sitios de escisión de

5 enzimas de restricción en fragmentos de ADNc que codificaban el dominio extracelular de gp39 usando un protocolo de PCR de extensión por superposición (Ho y col., 1989. Gene 77:51-59). Los genes de fusión que codificaban las proteínas gp39 solubles (sgp39) mutantes se prepararon por subclonación de los mutantes del dominio extracelular de gp39 amplificados por PCR en un vector de expresión de mamífero que contenía un fragmento de ADNc que codificaba el dominio extracelular de CD8 murina (Lyt2a) (Hollenbaugh y col., 1992. EMBO J. 11:4313-4331). Los

10 cebadores de PCR directos e inversos usados para las construcciones de gp39 se han descrito previamente (Hollenbaugh y col., arriba).

Los cebadores de PCR usados para los mutantes de gp39 son:

Los cebadores inversos correspondientes son el complemento inverso de las secuencias enumeradas anteriormente. Los cambios de bases que codifican la alanina se muestran en negrita. Los sitios de restricción de diagnóstico añadidos o delecionados están subrayados.

20 C. Producción y caracterización de proteínas gp39 naturales y mutantes.

Se produjeron proteínas gp39 naturales y mutantes a partir de células COS transitoriamente transfectadas como se describe en cualquier parte (Hollenbaugh y col., 1992 arriba: Noelle y col., 1992. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:6550-6554). Células COS se transfectaron usando DEAE-dextrano. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, los sobrenadante de cultivo que contenían gp39 natural soluble o gp39 mutante soluble se recogieron y

25 se usaron en ensayos para la unión de anticuerpo monoclonal y la determinación de especificidades de epítopes en gp39 humana.

D. Enzimoinmunoanálisis de adsorción para la unión de anticuerpo monoclonal a proteínas mutantes gp39.

Los resultados de ensayos de transferencia Western indicaron que se reconocieron al menos dos epítopes diferentes en la proteína de fusión gp39 humana-CD8. Se encontró que los anticuerpos monoclonales 39-1.29, 391.52, 39-1.61, 39-1.77, 39-1.93, 39-1.106, 39-1.109, 39-1.124, 39-1.134, 39-1.156, 39-7.7G4, 39-9.274, 39-9.27, 397.4C1, 39-9.68 y 39-9.246 se unieron a gp39-CD8 en transferencia Western, aunque no el resto de los anticuerpos. Con el fin de definir adicionalmente los epítopes reconocidos por los anticuerpos monoclonales generados, cada uno se probó para la unión por ELISA a una serie de proteínas mutantes gp39 que contenían mutaciones puntuales únicas o dobles que sustituyeron un residuo de aminoácido nativo con alanina.

El ensayo de ELISA usado se llevó a cabo del siguiente modo. Placas para EIA Immulon 2 se recubrieron con 100 μl/pocillo de una disolución de 0,8 μg/ml de un anticuerpo monoclonal específico para Lyt2 murina o 2.1 (53-6 (ATCC TIB 105) o 116.13-1 (ATCC HB 129) para la fusión 5) diluido en tampón carbonato sódico/bicarbonato sódico 0,05 M, pH 9,6. Las placas se taparon y se incubaron durante la noche a 4ºC. Tras la incubación, el anticuerpo sin unir se eliminó y las placas se bloquearon durante 1 hora con diluyente de espécimen (Genetic Systems Corporation) diluido

1 : 10 en agua desionizada. Después de eliminar el agente de bloqueo se añadieron 50 μl/pocillo de sobrenadantes de células COS apropiadamente diluidos (véase más adelante) que contenían proteína de fusión gp39-CD8 natural o mutante o una proteína de fusión de sCD72 de control negativo. Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, las proteínas de fusión se eliminaron y las placas se lavaron una vez con 200 μl/pocillo de PBS-Tween. Los sobrenadantes de cultivo que contenían anticuerpos específicos para gp39 se diluyeron apropiadamente (véase más adelante) en 10% de SBF-Iscove y cada uno se añadió (50 μl/pocillo) por duplicado a pocillos que contenían cada una de las proteínas de fusión de gp39 o de control. Como control, 50 μl/pocillo de anti-CD8 de ratón de rata biotinilada (véase más adelante) se añadieron a cado una de los diferentes pocillos que contenían proteína de fusión con el fin de confirmar que cantidades aproximadamente iguales de cada proteína de fusión estaban presentes en todos los pocillos. Después de una incubación de dos horas a temperatura ambiente, los anticuerpos sin unir se eliminaron y las placas se lavaron una vez con PBS-Tween. Para los anticuerpos de las fusiones 1, 7 y 9, anti-IgG de ratón de rata marcada con HRP (Zymed) y estreptavidina marcada con HRP (Vector Laboratories) se diluyeron apropiadamente en reactivo de bloqueo y 50 μl/pocillo se añadieron a los pocillos que habían recibido previamente anticuerpo anti-gp39 y anti-CD8 de ratón, respectivamente. Para los anticuerpos de la fusión 5 se añadió anti-IgG de rata de ratón marcada con HRP (Jackson Immunological Laboratories) diluida

1:40.000 en reactivo de bloqueo. Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente, los reactivos marcados con HRP se eliminaron y las placas se lavaron tres veces con PBS-Tween. La divulgación de los reactivos marcados con HRP unidos y la medición de la densidad óptica resultante fue como se describe en otros ensayos de ELISA anteriormente detallados.

Dos parámetros importantes del ensayo anterior fueron para demostrar que cantidades similares de cada una de las diferentes proteínas de fusión se usaron sobre (es decir, unidas a) las placas de ensayo y que no se usaron concentraciones no saturantes de anticuerpos anti-gp39, de forma que las lecturas de densidad óptica se encontraron dentro de la parte lineal de la curva de respuesta. Para normalizar la cantidad de proteína de fusión en todos los pocillos, las diluciones seriadas de cada proteína de fusión que contenía sobrenadante de células COS se evaluaron en el ensayo descrito anteriormente y se eligió una dilución de cada una para los ensayos finales que dio un valor de densidad óptica en la porción lineal de la curva de respuesta (normalmente entre 0,3 y 0,9 unidades de absorbancia) que estuvo dentro de ± 10% del observado en sgp39 natural cuando se rastreó con anti-CD8 de ratón de rata biotinilada seguido de estreptavidina marcada con HRP. La dilución óptima de cada uno de los sobrenadantes que contenían anticuerpo que iban a usarse en los ensayos finales se determinó evaluando diluciones seriadas de cada sobrenadante sobre la proteína de fusión sgp39 natural en el ELISA descrito anteriormente. La dilución óptima se definió como aquella para la que una dilución de dos veces posterior dio una disminución en el valor de densidad óptica resultante. La dilución óptima, además de dos diluciones de dos veces seriadas de la misma, se evaluó en ensayos finales en cada una de las proteínas de fusión como se ha descrito anteriormente.

La reactividad de cada uno de los mAb anti-gp39 en las seis proteínas de fusión sgp39 mutantes se muestra en la Tabla 2. Los valores representan la intensidad de unión de cada mutante con respecto a la observada en la natural (expresados como un porcentaje) y representan los promedios de determinaciones duplicadas ± el error estándar de la media (EEM). Sólo se muestran los datos de aquellos ensayos en los que las cantidades de las diferentes proteínas de fusión en las placas de ensayo fueron de hecho similares (como se muestra por el rastreo de anti-CD8) y que se alcanzaron con una concentración no saturante de mAb anti-gp39 (normalmente una dilución de dos veces de la dilución óptima como se define anteriormente).

Basándose en una similitud global del perfil de unión de cada uno de los mutantes de gp39 combinado con resultados de transferencia Western, los 32 mAb anti-gp39 se han dividido en 12 grupos. Cada grupo se caracteriza por un patrón de unión único que sugiere que el epítope reconocido en cada grupo de anticuerpos es diferente. El grupo 1, que comprende los mAb 39-1.3, 39-1.21, 39-1.25, 39-1.63, 39-1.122, 39-1.123 y 39-1.138, tiene un notable defecto en el reconocimiento de los mutantes E129/A y S131/A-T135/A. Estos mAb también demuestran una deficiencia de unión algo menos profunda sobre el mutante K143/A. La reactividad de estos mAb con mutantes Y145/A, N180/A y F201/A-E202/A es similar a gp39 natural. El grupo 2 está representado por un único mAb, 39-1.59 Este anticuerpo se diferencia de aquellos en el grupo 1 con respecto a la unión fuertemente reducida a mutantes E129/A, S11/A-T135/A y K143/A, pero se diferencia en que también muestra unión algo más débil sobre los mutantes Y145/A, N180/A y F201/A-E302A. Los anticuerpos en el grupo 3 (39-1.37 y 39-1.132) y el grupo 4 (39

1.124 y 39-1.156) son bastante similares entre sí ya que reconocieron el mutante E129/A bastante malamente y mostraron una profunda deficiencia de unión sobre el mutante K 143/A. La reactividad de estos mAb con los otros mutantes fue tanto ligeramente más débil como equivalente a la observada con gp39 natural. Sin embargo, los grupos 3 y 4 son claramente diferentes entre sí, como se indica por los resultados divergentes observados en el análisis de transferencia Western en los que 39-1.37 y 39-1.132 son negativos por transferencia, mientras que 39

1.124 y 39-1.156 son positivos por transferencia. Los anticuerpos en el grupo 5 incluyen 39-1.7, 39-1.128 y 39-1.26. Son similares a los mAb en los grupos 3 y 4 en los que demostraron una pérdida comparable de unión sobre el mutante K 143/A, pero se diferencian como se evidencia por el mejor reconocimiento del mutante E129/A. La unión de estos anticuerpos a los mutantes S131/A-T135/A, Y145/A, N180/A y F20/A-E202/A fue esencialmente equivalente a la observada sobre gp39 natural. El grupo 6, que comprende los mAb 39-1.52, 39-1.61, 39-1.77, 391.93, 39-1.106, 39-1.109 y 39-1.134, se distingue de los otros mAb anti-gp39 por la ausencia casi total de reactividad con el mutante F201/A-E202/A. Además, estos anticuerpos demostraron una reducción definitiva, aunque no tan significativa, en la reactividad sobre el mutante K143/A. La reactividad de este grupo de anticuerpos con los otros mutantes en el panel fue similar a la observada sobre gp39 natural. El grupo 7 incluye un único anticuerpo, 39-1.29. Este mAb es muy similar a aquellos en el grupo 6, excepto que parece que reconoce el mutante K 143/A casi tan bien como gp39. Un único anticuerpo, 39-7.3E12, representa el grupo 8. Este anticuerpo es notablemente diferente de todos los otros ya que reaccionó con todos los mutantes bastante bien con sólo una ligera pérdida de reactividad sobre el mutante K143/A con respecto a gp39 natural. [Añadir la discusión de los grupos 9-12.]

El grupo 9 incluye un único anticuerpo, 39-5.6E9. Este anticuerpo muestra una avidez de unión similar a la del mutante E129/A como se observa sobre gp39 natural y una avidez de unión algo reducida sobre los mutantes S131/A-T135/A, N180/A y F201/A-E2002/A con respecto a la observada sobre gp39 natural. Lo que particularmente distingue este grupo de los otros es una mala avidez de unión cuando se compara con la avidez de unión con gp39 natural sobre los mutantes K143/A y Y145/A. Este anticuerpo tampoco pudo unirse a gp39 sobre una transferencia Western.

El grupo 10 como se ejemplifica por los anticuerpos 39-7.7G4, 39-9.27. 39-7.4C1, 39-9.68 y 39-9.246 se caracteriza por su avidez de unión similar o algo reducida con todos los mutantes cuando se compara con la avidez de unión sobre gp39 natural. Por tanto, todos los anticuerpos pudieron unirse a gp39 sobre transferencia Western.

Los grupos 11 y 12, anticuerpos 39-9.11 y 39-9.274, son similares en su patrón de reactividad sobre las proteínas gp39 mutantes, pero se diferencian en su capacidad para unirse a gp39 sobre la transferencia Western. El anticuerpo 39-9.11 no pudo unirse a gp39, pero sí 39-9.274, sobre la transferencia Western. El patrón de reactividad para ambos anticuerpos sobre las proteínas gp39 mutantes se caracterizó como similar al de gp39 natural para E129/A, S131/AT135/A, Y145/A y F201/A-E202/A. La avidez de unión fue algo reducida sobre el mutante K143/A cuando se comparó con la avidez de unión sobre gp39 natural y mala sobre el mutante N180/A.

En conjunto, los datos de reactividad del mutante gp39 acoplados con los resultados de transferencia Western definen al menos 12 perfiles de reconocimiento diferentes y, por tanto, 12 especificidades de epítope diferentes entre los 32 mAb anti-gp39 humana. Como se define anteriormente, los mAb en los grupos 1, 2, 3, 5, 8, 9 y 11 parecen reconocer epítopes que son de naturaleza discontinua o conformacional, mientras que la especificidad de aquellos en los grupos 4, 6, 7, 10 y 12 parece ser específica para secuencias continuas o lineales de gp39.

TABLA 2(continuación)

Resumen de anticuerpos monoclonales anti-gp39 humana

Grupo deanticuerpos

Anticuerpo Isotipo Reactividad del anticuerpo con mutantes puntuales de gp39* Transferencia Western

E129/A

S131/A T135/A K143/A Y145/A N180/A F201/A E202/A

1

39-1.3 39-1.21 39-1.25 39-1.63 39-1.122 39-1.23 39-1.138 G1G1G1G1G2bG1G1 2 ± 0,311 ± 0,40 ± 0,812 ± 3,14 ± 0,916 ± 1,4-4 ± 0,2 8 ± 1,713 ± 0,27 ± 1,214 ± 1,84 ± 1,822 ± 0,0-3 ± 0,7 27 ± 0,861 ± 6,963 ± 8,826 ± 0,660 ± 7,959 ± 0,754 ± 3,5 109 ± 2,9142 ± 11,9 135 ± 0,3122 ± 1,5109 ± 17,7 95 ± 3,8116 ± 7,1 87 ± 5,3126 ± 13,6 124 ± 7,798 ± 9,283 ± 11,2114 ± 31,0 99 ± 4,3 106 ± 3,4103 ± 1,1114 ± 8,484 ± 10,588 ± 9,3101 ± 2,1124 ± 6,6 -------

2

39-1.59 G1 4 ± 3,5 14 ± 1,0 38 ± 4,1 74 ± 6,9 55 ± 6,8 59 ± 7,4 -

3

39-1.137 39-1.132 G1G2b 8 ± 0223 ± 2,1 97 ± 4,477 ± 0,6 6 ± 0,15 ± 0,6 III ± 5,994 ± 4,2 98 ± 11,282 ± 0,2 90 ± 8,593 ± 11 ,2 --

4

39-1.124 39-1.156 G1G1 25 ± 1,231 ± 0,8 69 ± 6,784 ± 16,7 4 ± 0,78 ± 1,0 90 ± 9,3100 ± 25,6 75 ± 1,573 ± 10,7 85 ± 2,076 ± 2,5 ++

5

39-1.739-1.128 39-1.26 G2bG2bG1 70 ± 2,952 ± 0,096 ± 3,7 89 ± 0,5116 ± 6,6103 ± 6,3 5 ± 0,17 ± 1,86 ± 0,3 106 ± 43 123 ± 5,6128 ± 19 93 ± 1,4133 ± 23,1 137 ± 16,3 112 ± 5,0102 ± 4,7111 ± 4,3 ---

Resumen de anticuerpos monoclonales anti-gp39 humana

Grupo deanticuerpos

Anticuerpo Isotipo Reactividad del anticuerpo con mutantes puntuales de gp39* Transferencia Western

E129/A

S131/A T135/A K143/A Y145/A N180/A F201/A E202/A

6

39-1.5239-1.6139-1.7739-1.9339-1.10639-1.10930-1.134 G1G1G1G1G1G1G1 124 ± 0,694 ± 4,6128 ± 35,099 ± 2,1130 ± 10,696 ± 1,8109 ± 0,8 <>,8 109 ± 6,881 ± 0,1117 ± 21,581 ± 6,5113 ± 6,072 ± 0,679 ± 0,0 68 ± 3,053 ± 3,075 ± 10,346 ± 3,652 ± 16,654 ± 8,553 ± 3,2 148 ± 15,892 ± 2,4122 ± 22,8103 ± 8,9124 ± 1,5108 ± 13,6 3,698 ± 4,6 144 ± 7,592 ± 3,1147 ± 2,6114 ± 11,4144 ± 25,1 182 ± 7,982 ± 7,7 1 ± 0,90 ± 0,53 ± 1,06 ± 1,19 ± 1,34 ± 4,53 ± 0,2 +++++++

7

39-1.29 G2a 109 ± 14,5 105 ± 7,1 91 ± 0,6 125 ± 10,6 122 ± 2,2 1 ± 0,2 +

8

39-7.3E12 G2a 102 ± 1,1 82 ± 5,5 67 ± 3,0 114 ± 6,4 99 ± 5,8 94 ± 1,3 -

9

39-5.6E9 G2a 101 ± 9,3 65 ± 3,0 3 ± 6,0 20 ± 1,9 54 ± 4,5 49 ± 3,7 -

10

39-7.7G439-9.27 39-7.4C1 39-9.687 39-9.246 G2aG1G2bG2bG1 87 ± 0,5117 ± 26,5 100 ± 0,793 ± 17,3118 ± 49 9 73 ± 5,089 ± 13,589 ± 8,878 ± 7,9100 ± 5,4 55 ± 5,560 ± 10,664 ± 3,478 ± 4,780 ± 5,3 95 ± 5,1139 ± 6,9116 ± 0.85 ± 3,5117 ± 11,2 84 ± 6,963 ± 0,3111 ± 7,081 ± 0,8124 ± 23,5 61 ± 2,088 ± 1,281 ± 5,779 ± 10,0101 ± 3,1 I +++++

11

39-911 G1 88 ± 4,8 94 ± 11,1 58 ± 1,1 118 ± 6,8 8 ± 1,8 89 ± 5,5 -

12

39-9.274 G1 107 ± 0,8 100 ± 9,1 67 ± 5,9 129 ± 17,8 20 ± 2,1 130 ± 1,2 +

* Promedio: DE de tres experimentos independientes

Ejemplo 7

Inhibición de la proliferación de linfocitos B dependiente de linfocitos T y producción de inmunoglobulinas

Los linfocitos T activados pueden inducir que linfocitos B en reposo proliferen y se diferencien en células secretoras de inmunoglobulina. Además, se requiere el contacto de células entre linfocitos T activados y linfocitos B para que los linfocitos B cambien de producción de IgM a IgG, IgA o IgE. Como se cree que la interacción entre CD40 y su ligando desempeña una función crítica en estos procedimientos, se anticipó que estos anticuerpos monoclonales anti-gp39 podrían interferir con estas formas de “ayuda” de linfocitos T.

Los efectos inhibidores de los anticuerpos monoclonales anti-gp39 sobre la activación y diferenciación de linfocitos B humanos se evaluó en un sistema de ensayo de proliferación de linfocitos B dependiente de linfocitos T y de síntesis de inmunoglobulinas in vitro. En este sistema (Hirohata y col., 1988. J. Immunoll. 140:3736-3744), los linfocitos T activados inducen la activación de linfocitos B, proliferación y producción de anticuerpos policlonales (IgG, IgM y IgA) en un modo no específico de Ag no limitado por MHC. Se requiere el contacto directo entre los linfocitos B y T para que se produzcan los acontecimientos de linfocitos B observados y como tales se cree que representan un sistema in vitro relevante para estudiar las interacciones linfocitos B/linfocitos T que conducen a la producción de Ab.

Brevemente, células mononucleares de sangre humana (PBMC) se aislaron diluyendo sangre completa 1 : 1 con PBS, recubriendo 25 ml sobre 10 ml de medio de separación de linfocitos (LSM, Organon Teknika) y centrifugando durante 25 minutos a 450 g. Las células en la interfase se recogieron y se lavaron una vez en PBS. Las células aisladas se diluyeron a 5 x 106/ml en 2% de SBF-Iscove que contenía bromhidrato de éster metílico de L-leucil-Lleucina 0,35 mM (Leu-LeuOMe, Sigma) y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos para destruir los monocitos y linfocitos NK (Ohlin y col., 1989. Immunology 66:485-490). Las células tratadas se lavaron dos veces con 2% de SBF-Iscove antes de la separación de linfocitos T y B.

Los linfocitos T se aislaron incubando las células tratadas con Leu-LeuOMe con 150 veces AET-SRBC (glóbulos rojos de oveja tratados con bromuro de 2-aminoetilisotiouronio 0,143 M (Sigma)) durante 5-10 minutos sobre hielo. Los linfocitos T positivos para rosetas E (E'-linfocitos T) se separaron de las células restantes por subyacimiento con LSM frío y centrifugando a 450 g durante 25 minutos. El sedimento (que contenía linfocitos T roseteados) se recogió y los glóbulos rojos de oveja se lisaron con 0,83% de cloruro de amonio durante cinco minutos a temperatura ambiente. Los linfocitos T resultantes se lavaron una vez en 2% de SBF-Iscove. Estas células se trataron posteriormente con mitomicina C (5 x 106 E'-linfocitos T y 40 μg de mitomicina C/ml) durante 40 minutos a 37ºC y luego se lavaron tres veces con 2% de SBF-Iscove. Los linfocitos B se obtuvieron de la interfase de los tubos en los que E+-linfocitos T se aislaron de PBMC tratadas con AET-SRBC por centrifugación sobre un cojín de LSM (descrito anteriormente). Estas células se lavaron una vez en 2% de SBF-Iscove y se re-rosetearon con AET-SRBC como se ha descrito anteriormente para eliminar cualquier linfocito T residual y de nuevo se centrifugaron sobre un cojín de LSM. Las células en la interfase se recogieron, se lavaron una vez en 2% de SBF-Iscove y aquí se denominan linfocitos B.

Placas Costar de 96 pocillos se recubrieron con 50 μl/pocillo de una disolución de 2 μg/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 64.1 (Hansen y col., en Leucocyte Typing, Springer-Verlag, Inc., pág. 195-212 (1984)) en medio de Iscove libre de suero durante un mínimo de cuatro horas a temperatura ambiente. El anticuerpo en exceso se aspiró de los pocillos y a cada pocillo se añadieron 100.000 linfocitos T tratados con mitomicina C y 2.000 linfocitos B roseteados dos veces en un volumen total de 150 μl de medio de cultivo (medio de Dulbecco modificado con Iscove complementado con 10% de SBF). Entonces, los sobrenadantes recogidos de los hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal anti-gp39 o un anticuerpo monoclonal de control negativo se añadieron a cada uno de los tres pocillos, 100 μl/pocillo. Pocillos adicionales recibieron el mismo volumen de medio de cultivo solo. Después de seis días de cultivo en una estufa de incubación a 37ºC que contenía 6% de CO2, cada conjunto de pocillos por triplicado se evaluó para la proliferación de linfocitos B e IgG e IgM humana total.

La proliferación de linfocitos B se midió por captación de timidina tritiada. Después de sacar 100 μl/pocillo de sobrenadante de cultivo para el análisis de IgG y IgM (véase más adelante), 50 μl de medio de cultivo que contenían 1 μCi de [3H]timidina (New England Nuclear) se añadieron a cada pocillo. Después de otras 18 horas de cultivo a 37ºC, las placas se congelaron, se descongelaron y las células se recogieron sobre esterillas de filtro de fibra de vidrio con un colector de células de placa completa TOMTEC. La incorporación de [3H]timidina se midió con un contador de centelleo líquido LKB Wallace Beta-Plate. Los recuentos de pocillos por triplicado se promediaron y se presentan en la Tabla 3 como porcentaje ± 1 DE de los valores observados con pocillos de control de medio solo.

IgG e IgM humana se cuantificaron por placas para EIA Immulon 2 de recubrimiento (Dynatech) con 100 μl/pocillo de una disolución de 1 μg/ml de anti-Ig humana de cabra (Southern Biotechnology Associates) en tampón carbonato sódico/bicarbonato sódico 0,05 M, pH 9,6. Las placas se taparon y se incubaron durante la noche a 4ºC. El anticuerpo en exceso se eliminó y las placas se bloquearon como se describe en los ensayos de ELISA anteriores. Tras el bloqueo, todos los pocillos recibieron 50 μl/pocillo de 2 X PTB (2 X PBS que contenía 2% albúmina de suero bovino (Intergen) y 1% de Tween 20)). Los sobrenadantes de cultivo diluidos 1:10 (para análisis de IgM) y 1:40 (para análisis de IgG) en medio de cultivo se añadieron a los pocillos, 50 μl/pocillo, y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. A estas diluciones se llegó en un experimento preliminar usando diluciones seriadas de

sobrenadantes de cultivo de pocillos de sólo medio y seleccionando esa(s) dilución (diluciones) que dieron los valores de densidad óptica próximos al extremo superior de la parte más lineal de la curva de respuesta para IgG e IgM. Los sobrenadantes se eliminaron, las placas se lavaron dos veces con PBS-Tween y anti-IgG o IgM humana de cabra marcada con HRP (Jackson Immunological Laboratories), apropiadamente diluida en 1 X PTB (2 X PTB 5 diluido 1 : 1 con PBS), se añadió a los pocillos respectivos, 100 μl/pocillo. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, los reactivos marcados con HRP se eliminaron y las placas se lavaron tres veces con PBS-Tween. La divulgación de los reactivos marcados con HRP unidos y la medición de la densidad óptica resultante fue como se describe en otros ensayos de ELISA anteriormente detallados. Los valores de densidad óptica de los pocillos por triplicado se promediaron y se presentan en la Tabla 3 como un porcentaje ± 1 DE de los valores

10 observados con pocillos de control sólo con medio.

Como se muestra en la Tabla 3, cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-gp39 probados pudo inhibir significativamente la proliferación de linfocitos B accionada por linfocitos T, produciendo valores que sólo fueron del 2-4% de los observados en pocillos que no recibieron anticuerpo específico parar gp39. Concomitantemente, la producción de IgG e IgM también se suprimió significativamente.

15 El efecto inhibidor de los diversos anticuerpos monoclonales anti-gp39 sobre la producción de inmunoglobulinas de linfocitos B humanos dependientes de linfocitos T se investigó adicionalmente en un modo más cuantitativo usando concentraciones definidas de anticuerpo purificado. Los anticuerpos se purificaron por afinidad a partir de sobrenadantes de cultivo sobre columnas de proteína A-Sepharose o GammaBind Plus Sepharose (Pharmacia) según instrucciones del fabricante y se cuantificaron por absorbancia de densidad óptica usando un coeficiente de

20 extinción de 1,4. Los experimentos se establecieron como se ha descrito anteriormente con las siguientes modificaciones. Se utilizaron placas Costar de 96 pocillos de la mitad del área y la concentración de anticuerpo anti-CD3 usado para recubrir los pocillos fue 4 μg/ml. Todos los pocillos recibieron 150.000 linfocitos T tratados con mitomicina C y 20.000 linfocitos B en un volumen total de 100 μl de medio de cultivo. Los anticuerpos anti-gp39 y de control negativo se diluyeron a 60, 6 y 0,6 μg/ml en medio de cultivo y a cada uno de tres pocillos se añadieron 50 μl

25 de cada dilución para una concentración final de cada anticuerpo en los pocillos de cultivo de 20,2 y 0,3 μg/ml. Los pocillos de control recibieron 50 μl/pocillo de medio de cultivo solo. Las células se cultivaron durante un total de 10 días en una estufa de incubación a 37ºC/6% de CO2 en cuyo momento los sobrenadantes de los pocillos por triplicado se reunieron y se evaluaron para IgG e IgM humana total. La medición de IgG e IgM humana fue como se ha descrito anteriormente, excepto que cada sobrenadante reunido se ensayó por triplicado, los sobrenadantes se

30 diluyeron en 2% de SBF-Iscove a diluciones mucho mayores dado el mayor periodo de cultivo celular (y, por tanto, producción de anticuerpo), los pocillos sobre las placas de ensayo no recibieron 2 X PTB antes de la adición de sobrenadantes diluidos y los reactivos de HRP se diluyeron en tampón de bloqueo.

TABLA 3

Supresión de la proliferación de linfocitos B in vitro y producción de anticuerpos por mAb anti-gp39 humana

mAb

Incorporación de [3H]-timidina (% de control de medio) Ig producida (% de control de medio)

IgM

IgG

39-1.3

3,5 ± 0,7 33,5 ± 15,4 60,2 ± 3,6

39-1.7

3,3 ± 0,5 13,9 ± 9,1 31,8 ± 9,6

39-1.26

2,1 ± 0,1 10,0 ± 3,7 24,0 ± 8,3

39-1.29

3,9 ± 0,7 43,4 ± 11,4 39,8 ± 6,4

39-1.37

2,4 ± 0,2 20,2 ± 4,1 44,8 ± 10,9

39-1.61

3,4 ± 0,6 10,6 ± 4,6 32,2 ± 15,0

39-1.77

2,1 ± 0,6 11,7 ± 2,1 41,9 ± 2,1

39-1.106

2,9 ± 0,3 17,9 ± 4,9 28,6 ± 8,3

39-1.124

3,5 ± 0,6 17,0 ± 5,7 36,5 ± 16,9

39-1.128

3,1 ± 0,5 21,7 ± 9,5 53,3 ± 6,2

39-1.132

3,3 ± 0,4 13,0 ± 4,7 50,1 ± 2,0

39-1.134

2,3 ± 0,8 12,5 ± 4,1 335 ± 10,2

39-1.156

2,7 ± 0,1 12,2 ± 4,8 26,9 ± 5,6

Cont. neg.

87,9 ± 7,9 87,9 ± 13,8 114,9 ± 28,5

Los datos de estos experimentos se presentan en la Tabla 4. A la mayor concentración de anticuerpo usada, 20 35 μg/ml, todos los anticuerpos anti-gp39 inhibieron significativamente la producción de tanto IgG como IgM. A esta concentración, los niveles de anticuerpo humano generados fueron coherentemente del 10-30% de los observados

en presencia de medio solo. En general, a medida que disminuyó la concentración de anticuerpo anti-gp39, así fue el nivel de inhibición. A las dos concentraciones más bajas de anticuerpos anti-gp39 empleadas, 2 y 0,2 μg/ml, fue bastante evidente que ciertos anticuerpos anti-gp39 que incluían, en particular, 39-1.7, 39-1.26, 39-1.77, 39-1.106, 39-1.134. 39-7.3E12 y 39-5.6E9, fueron mucho más eficaces en la inhibición de la producción de IgG e IgM humana que los otros. Esta observación sugiere que la especificidad de epítope y/o la avidez del anticuerpo es un parámetro importante en el grado con el que los anticuerpos monoclonales dirigidos a gp39 pueden interferir con la interacción de gp39-CD40.

TABLA 4

Supresión comparativa de la producción de anticuerpos por linfocitos B in vitro por anticuerpos monoclonales antigp39 humana

Anticuerpo monoclonal

Inhibición de la síntesis de anticuerpos in vitro - % de control de medio ± DE*

IgG

IgM

20 μg/ml

2 μg/ml 0,2 μg/ml 20 μg/ml 2 μg/ml 0,2 μg/ml

39-1.3

9 ± 7 53 ± 16 91 ± 7 23 ± 3 63 ± 17 94 ± 15

39-1.122

13 ± 1 28 ± 6 70 ± 12 20 ± 23 60 ± 18 84 ± 6

39-1.138

21 ± 4 60 ± 14 90 ± 9 29 ± 23 91 ± 29 101 ± 22

39-1.59

21 ± 6 57 ± 10 85 ± 22 34 ± 25 82 ± 35 84 ± 13

39-1.37

18 ± 4 39 ± 23 74 ± 16 26 ± 16 62 ± 14 91 ± 12

39-1.132

11 ± 1 25 ± 17 66 ± 10 23 ± 24 60 ± 20) 102 ± 23

39-1.124

11 ± 1 20 ± 8 54 ± 20 21 ± 28 47 ± 31 76 ± 13

39-1.156

11 ± 6 15 ± 13 43 ± 22 14 ± 6 28 ± 10 81 ± 8

39-1.7

17 ± 8 12 ± 7 34 ± 19 20 ± 6 27 ± 12 58 ± 15

39-1.128

19 ± 1 19 ± 3 55 ± 18 26 ± 11 46 ± 22 85 ± 21

39-1.26

22 ± 18 15 ± 9 41 ± 14 26 ± 13 27 ± 28 78 ± 2

39-1.77

11 ± 6 16 ± 5 38 ± 16 23 ± 39 28 ± 24 68 ± 34

39-1.106

8 ± 2 11 ± 5 21 ± 12 27 ± 23 22 ± 21 41 ± 14

39-1.134

10 ± 4 15 ± 5 28 ± 7 23 ± 13 27 ± 26 65 ± 32

39-1.29

10 ± 1 13 ± 3 49 ± 23 23 ± 16 37 ± 11 86 ± 9

39-7.3E12

9 ± 1 12 ± 4 37 ± 16 11 ± 2 18 ± 16 72 ± 10

39-5.6E9

16 ± 4 11 ± 5 20 ± 15 27 ± 4 14 ± 12 33 ± 5

39-7.7G4

12 ± 1 10 ± 6 57 ± 10 19 ± 3 27 ± 25 80 ± 14

39-9.11

30 ± 6 31 ± 17 72 ± 16 75 ± 35 74 ± 23 105 ± 40

39-9.274

8 ± 1 14 ± 6 81 ± 17 7 ± 8 38 ± 19 77 ± 8

39-9.27

13 ± 4 19 ± 11 79 ± 28 28 ± 14 41 ± 28 108 ± 23

39-7.4C1

13 ± 4 31 ± 7 74 ± 19 22 ± 8 49 ± 27 87 ± 4

39-68

29 ± 8 64 ± 15 91 ± 17 50 ± 17 88 ± 21 114 ± 17

39-9.246

12 ± 7 21 ± 6 71 ± 16 29 ± 16 43 ± 29 99 ± 35

* Promedio ± DE de tres experimentos independientes, excepto para los datos recopilados a 20 μg/ml de concentración de anticuerpo para los cuales sólo hubo dos experimentos.

Ejemplo 8

Detección de gp39 mutante en un paciente con hiper-IgM ligado a X

Anticuerpos monoclonales con diferentes características de unión con gp39 humana mutante se usaron para determinar si las mutaciones puntuales en gp39 podrían reconocerse en una muestra de sangre tomada de un 5 paciente con hiper-IgM ligado a X. En este ensayo se sabría que pacientes cuyas células mostraron tinción positiva con los anticuerpos monoclonales específicos para gp39, pero no tinción con CD40-Ig, el ligando normal, expresarían la proteína gp39 que es no funcional y podría diagnosticarse como X-HIM. Usando un panel de anticuerpos monoclonales, con diferencias conocidas en epítopes, se proporciona un mayor número de mutaciones diferentes que pueden detectarse en una muestra de X-HIM. Usando este ensayo no es totalmente posible excluir

10 inmunodeficiencia variable común como un diagnóstico, pero se espera que pueda detectarse un porcentaje significativo de pacientes con X-HIM por este enfoque. Por tanto, por este enfoque no podría confirmarse un subconjunto de pacientes con HIM, aquellos cuyos defectos de gp39 producen una falta de expresión interna debido, por ejemplo, a una mutación en un codón de terminación temprano en la secuencia codificante de gp39.

Brevemente, linfocitos T se aíslan de una muestra de linfocitos de sangre periférica de un paciente por

15 centrifugación en gradiente de Ficoll seguido de roseteado usando eritrocitos de oveja. La tinción de células permeabilizadas fijadas se realizó usando los procedimientos de Jung y col., (J. Immunol. Methods 159:197-207 (1993)) con modificaciones como se ha descrito.

Linfocitos T aislados se estimularon con PMA (10 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) en presencia de monensina 3 mM durante tres horas. Entonces, las células estimuladas se lavaron con PBS y se fijaron por incubación en 4% de

20 paraformaldehído en solución salina equilibrada de Hank durante 10 minutos a 4ºC. Las células fijadas se lavaron una vez con PBS. Entonces, se permeabilizaron y bloquearon por incubación en tampón de bloqueo (0,1% de saponina, 10% de suero de cabra en PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Las células se sedimentaron y se resuspendieron en 0,1% de saponina, 2% de suero bovino fetal en PBS y se prepararon alícuotas para la tinción a una densidad aproximada de 1 x 107 células/ml. Los anticuerpos monoclonales

25 se añadieron a una concentración final de 10 μg/ml y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de lavar dos veces con tampón de bloqueo y resuspensión en tampón de bloqueo que contenía anti-Fc de ratón de cabra conjugada con FITC. Después de una incubación adicional de 20 minutos a temperatura ambiente, las células se lavaron dos veces con 2% de SBF en PBS y se analizaron por citometría de flujo.

Como control y para probar la viabilidad de detectar gp39 en el interior de una célula, linfocitos T normales se

30 aislaron y se trataron como antes, excepto que antes de la fijación las células se trataron durante 5 minutos con tripsina para eliminar gp39 expresada en la superficie. Entonces, las células se fijaron y se tiñeron como antes. Una comparación de la tinción de linfocitos T no activados con activados permite la demostración de la tinción específica dentro de linfocitos T normales.

En la Tabla 5 se proporciona un resumen de la tinción obtenida con linfocitos T aislados de un paciente con X-HIM 35 con anticuerpos monoclonales anti-gp39.

TABLA 5

Resumen de la tinción de linfocitos T obtenidos de paciente con X-HIM con mAb anti-gp39

Anticuerpo

CD1 CN2 Western Isotipo

39-1.3

- + - G1

39-1.122

- + - G2h

39-1.138

- + - G1

39-1.124

- + + G1

39-1.7

- + - G2b

39-1.26

- + - G2b

139-1.106

+ + + G1

39-1.134

+ + + G1

1 Paciente con X-HiM CD (Aruffo y col., 1993. Cell 72:291) 2 Control normal

Ejemplo 9

Actividad biológica de anticuerpos monoclonales anti-gp39 en monos cinomolgos

En este ejemplo, dos anticuerpos monoclonales murinos que se unen a diferentes epítopes de gp39 humana se examinaron para probar su capacidad para unirse a linfocitos T activados, bloquear la unión de CD40 humana-Ig a linfocitos T activados y para inhibir la producción de inmunoglobulinas dependiente de linfocitos T usando linfocitos de sangre periférica aislados de los monos cinomolgos Macacca fascicularis y Macacca nemestrina. Los resultados usando PBL de estos primates no humanos fueron similares a aquellos obtenidos usando PBL humanos, que soporta el uso del macaco como un modelo animal apropiado.

Para probar la capacidad de los anticuerpos para unirse a linfocitos T de macaco, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de Macacca nemestrina y Macacca fascicularis se aislaron diluyendo sangre completa 1:1 en PBS y recubriendo 25 ml sobre 10 ml de 95% de medio de separación de linfocitos (Organon Teknika)/5% de PBS y centrifugando durante 25 minutos a 450 g. Las células en la interfase se recogieron y se lavaron una vez en PBS. Los linfocitos T se aislaron incubando las PBMC sobre hielo con 150 x AET-SRBC (glóbulos rojos de oveja tratados con bromhidrato de bromuro de 2-aminoetil-isotiouronio 0,143 M (Sigma)) durante 5 a 10 minutos. Los linfocitos T positivos para rosetas E se separaron por subyacimiento con LSM frío y centrifugando a 450 g durante 25 minutos. Los SRBC en el sedimento se lisaron con 0,83% de cloruro de amonio durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los linfocitos T resultantes se lavaron y se incubaron durante la noche en 10% de medio SBF-Iscove a 1 a 3 x 106 células/ml en una estufa de incubación humidificada a 37ºC, 6% de CO2. Entonces, los linfocitos T se estimularon con PMA (Sigma) e ionomicina (Sigma) a 10 ng/ml y 1 μg/ml, respectivamente, en 10% de SBF-Iscove durante 5 a 6 horas en una estufa de incubación humidificada a 37ºC. Se centrifugaron 2,5 x 105 linfocitos T activados por tubo de 11 x 75 mm a 250 g durante 5 minutos y el medio de cultivo se aspiró.

Entonces, los sobrenadantes (100 μl) recogidos de los hibridomas en cultivo que contenían anticuerpos 106 ó 7 o un anticuerpo de control negativo se añadieron a cada tubo y se incubaron sobre hielo durante 30 minutos. Se añadieron dos mililitros de 2% de medio SBF-Iscove a cada tubo y los tubos se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos antes de aspirar el sobrenadante. Los antisueros policlonales de rata anti-IgG de ratón marcada con FITC (Zymed) diluidos 1:50 en 2% de medio SBF-Iscove se añadieron a cada tubo a 100 μl/tubo y se incubaron sobre hielo durante 30 minutos. Las células en cada tubo se lavaron dos veces con 1 ml de 2% de medio SBF-Iscove. Entonces, las células se tiñeron con ficoeritrina-anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD4 humana, se lavaron y finalmente se suspendieron en 250 μl/tubo de 2% de medio SBF-Iscove antes del análisis en un FACScan de Becton Dickinson. Como puede apreciarse en la Figura 1, los anticuerpos monoclonales 7 (39-1.7) y 106 (39-1.106) pudieron ambos reconocer linfocitos T CD4 activados humanos (Figuras 1A y 1B) y de macaco (Figuras 1C y 1D).

Los anticuerpos monoclonales 7 y 106 también se probaron para su capacidad para bloquear la unión de una proteína de fusión CD40-Ig a células de macaco activadas. Los linfocitos T se aislaron y se activaron como se ha descrito anteriormente. Tras la activación, 2,5 x 105 linfocitos T se añadieron a tubos de 11 x 75 mm y se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos. El medio de cultivo se eliminó por aspiración y luego se añadieron 100 μl de sobrenadante que contenía anticuerpos monoclonales anti-gp39 7 ó 106, medio solo o anticuerpo de control negativo a cada tubo durante una incubación de 30 minutos sobre hielo. Entonces, los sobrenadantes se diluyeron con 2 ml de 2% de medio SBF-Iscove, los tubos se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos y el sobrenadante se eliminó por aspiración. Lugo se añadió CD40-Ig diluida a 20 μg/ml en 10% de medio SBF-Iscove a cada tubo, 100 μl/tubo, y se incubaron durante 30 minutos sobre hielo. Dos ml de 2% de medio SBF-Iscove se añadieron a cada tubo, y los tubos se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos. Los sobrenadantes se eliminaron por aspiración y antiIgG(Fc) humana de cabra F(ab')2 marcada con ficoeritrina o fluoresceína (Jackson Laboratories) se diluyó 1:5.000 ó 1:500, respectivamente, en 10% de medio SBF-Iscove y se añadió a las células. Después de una incubación de 30 minutos sobre hielo, las células se lavaron dos veces con 1 ml cada vez de 2% de medio SBF-Iscove y finalmente se suspendieron en 250 μl de 2% de medio SBF-Iscove por tubo antes del análisis en un FACScan de Becton Dickinson. Los datos se representan en la Figura 2 y demuestran que ambos anticuerpos monoclonales murinos anti-gp39 7 y 106 pudieron inhibir la unión de CD40 humana-Ig a linfocitos T humanos (Figuras 2A y 2B) y de macaco (Figuras 2C y 2D) activados.

Para probar la capacidad de los anticuerpos monoclonales 7 y 106 para bloquear la capacidad de linfocitos B para producir anticuerpos después del contacto con linfocitos T activados, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de monos Macacca fascicularis como se ha descrito anteriormente.

La fracción de linfocitos T se trató con mitomicina C (5 x 106 linfocitos T y 40 μg de mitomicina C (Sigma) por ml) durante 40 minutos, seguido de tres lavados con 10% de medio SBF-Iscove. La fracción de linfocitos B (la capa de interfase de la centrifugación de LSM) se re-roseteó con AET-SRBC para eliminar cualquier linfocito T residual. Placas de media área de 96 pocillos (Costar) se recubrieron con 50 μl de una disolución de 4 μl/ml de anticuerpo anti-CD3 (FN-18, Clark, E. A. y col., 1987, Eur. J. Immunol. 17:1799-1805) en medio de Iscove sin suero durante un mínimo de cuatro horas a temperatura ambiente. El anticuerpo en exceso se aspiró de los pocillos y se añadieron 1,5 x 105 linfocitos T tratados con mitomicina C y 5 x 103 linfocitos B roseteados dos veces en 10% de medio SBF-Iscove. Los anticuerpos anti-gp39 y de control purificados se diluyeron en 10% de medio SBF-Iscove a una concentración final, en cultivo, de 10, 1, 0,4 y 0,1 μg/ml y se añadieron a los pocillos. Después de 10 días, el sobrenadante de cultivo de pocillos por triplicado se reunió, se diluyó y se evaluó para IgG e IgM de macaco total.

La IgG e IgM de macaco se cuantificaron como se describe para IgG e IgM humana, excepto que los sobrenadantes se diluyeron 1:640 y 1:40 para análisis de IgG e IgM, respectivamente. Los resultados del ensayo cuando se usa una concentración de 0,4 μg/ml se observan en la Figura 3 y se expresan como el porcentaje de IgG e IgM total en comparación con cultivos tratados con medio de cultivo solo en ausencia de anticuerpo. Los anticuerpos Exa e IVA7 son controles del mismo isotipo para los anticuerpos monoclonales 106 y 7, respectivamente. Anteriormente, ambos anticuerpos monoclonales 7 y 106 pudieron inhibir la producción de anticuerpos por IgG e IgM dependiente linfocitos T por linfocitos B de macaco de un modo muy similar al observado con células humanas. Estos datos sugieren que los monos cinomolgos serían un modelo animal no humano adecuado para evaluar la actividad in vivo de los anticuerpos monoclonales anti-gp39 humana.

Ejemplo 10

Capacidad de anticuerpos monoclonales murinos anti-gp39 humana para suprimir la respuesta dependiente de linfocitos T de anticuerpos en monos cinomolgos

En este ejemplo, tres proteínas de unión a gp39, anticuerpos monoclonales murinos 7 y 106 y una proteína de fusión CD40-Ig recombinante humana se evaluaron para su capacidad para suprimir la respuesta primaria de anticuerpos dependiente de linfocitos T a antígenos tras la administración intravenosa al mono cinomolgo Macacca fascicularis. Al nivel de dosis sin optimizar probado, el anticuerpo monoclonal 106 suprimió la respuesta humoral, demostrando la eficacia de la administración de anti-gp39 en suprimir una respuesta humoral dependiente de linfocitos T en primates.

Cuatro grupos que consisten en un macaco macho y tres hembras se trataron con 4 mg/kg de anticuerpos monoclonales 7 ó 106, o un anticuerpo IGI de control (específico para proteína F de Pseudomonas aeruginosa) o CD40-Ig en los días 1, 3, 5, 8, 10 y 12 (ciclo 1) y en los días 50, 52, 54, 57, 59 y 61 (ciclo 2). Además, cada animal se inmunizó intravenosamente en el día 1 (inmunización primaria) y el día 50 (inmunización secundaria) con 1,7 ml/kg de una mezcla de 10% de glóbulos rojos de oveja, un antígeno dependiente de linfocitos T. Tras la eliminación de todas las proteínas de unión a gp39 de los sueros de los animales a niveles por debajo de los detectables, cada animal se re-inmunizó con glóbulos rojos de oveja y se co-inmunizó con 10 mg/animal del neoantígeno hemocianina de lapa californiana (KLH).

Se recogió suero semanalmente y el anticuerpo anti-glóbulos rojos de oveja y los anticuerpos anti-KLH (IgG e IgM) se evaluaron por ELISA. Los títulos de anticuerpos para glóbulos rojos de oveja se ensayaron recubriendo placas Immulon I con membranas de SRBC a una concentración de 5 μg/ml en PBS e incubando 12 a 18 horas a 4ºC. La disolución en exceso se eliminó y las placas se lavaron con PBS-Tween. Después de lavar las placas se bloquearon con PBS-Tween durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras de suero se diluyeron seriadamente en PBS-Tween y 60 μl se transfirieron a cada pocillo de la placa recubierta de antígeno. Las muestras de suero diluido se incubaron con el antígeno durante 1,5 horas y la muestra en exceso se eliminó antes de lavar las placas con PBS-Tween. Se añadieron anti-IgG o IgM humana del fragmento F(ab')2 de cabra (Jackson Laboratories) diluida 1:10.000 100 μl a los pocillos apropiados y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, los pocillos se lavaron con PBS-Tween y se añadió tetrametilbencidina (Genetic Systems Corporation) diluida 1:100 en tampón de sustrato (Genetic Systems Corporation). Se dejó que el sustrato se incubara durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de la adición de H2SO4 1 N para detener la reacción. Los valores de absorbancia se registraron a 450 nm/630 nm usando un lector de placas de microtitulación.

Los títulos de anticuerpos para KLH se determinaron en un ensayo similar como antes. Brevemente, placas Immulon II se recubrieron con KLH (Pacific BioMarine Labs) a 10 μl/ml en tampón carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6, durante 12 a 18 horas a 4ºC. Las placas se lavaron con PBS-Tween y las placas se bloquearon con diluyente de espécimen (Genetic Systems Corporation) diluido 1:100 con agua destilada durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras de suero se diluyeron seriadamente cuatro veces en diluyente de espécimen empezando a 1/50. Sesenta μl/pocillo de cada dilución de muestra se transfirieron a las placas recubiertas de antígeno y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El resto del ensayo se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente, excepto que anti-IgG e IgM humana del fragmento F(ab')2 de cabra se diluyeron 1:5.000.

En las Figuras 4A y 4B se presentan datos que demuestran que a la dosis sin optimizar probada, el anticuerpo monoclonal 106 pudo suprimir in vivo la capacidad de un macaco para organizar una respuesta primaria a los glóbulos rojos de oveja. La supresión no fue completa, pero fue aproximadamente 10 a 15 veces superior a la observada con las otras proteínas de bloqueo anti-gp39 probadas. Tras la inmunización secundaria, ninguna de las proteínas mostró pruebas claras de supresión, aunque los títulos anti-SRBC en el grupo tratado con 106 fueron significativamente inferiores a los de en los otros grupos de tratamiento. Los monos en todos los grupos recibieron 10 mg de KLH intramuscularmente como inmunización primaria en el día 106 para investigar la capacidad de los monos para responder a un nuevo antígeno. La Figura 5 muestra que todos los grupos de monos pudieron organizar una fuerte respuesta a KLH, demostrando que el tratamiento con proteínas de unión anti-gp39 no fue no específicamente inmunosupresor.

En otro estudio, anticuerpo monoclonal anti-gp39 humana 106 se administró a monos cinomolgos a 20 mg/kg en los días 1, 3 y 5. Un anticuerpo monoclonal murino asociado a antitumor, L6 ATCC HB 8677, se usó como control negativo. Todos los animales se inmunizaron intravenosamente en el día 1 con una suspensión de glóbulos rojos de oveja (1,7 ml/kg de una suspensión del 10%) justo antes de la administración del compuesto de prueba. Se tomaron

5 muestras de sangre antes de la administración de los glóbulos rojos de oveja o anticuerpos monoclonales murinos y en los días 8, 15, 22, 29, 36 y 43. Las muestras de suero se probaron para títulos de anticuerpos IgG e IgM para glóbulos rojos de oveja.

Los datos de este experimento como se observa en las Tablas 6 y 7 demuestran que el anticuerpo monoclonal murino anti-gp39 humana 106 redujo significativamente la capacidad de los monos para organizar una respuesta

10 inmunitaria dependiente de linfocitos T a los glóbulos rojos de oveja. Estos datos confirman los resultados de los experimentos llevados a cabo en ratones con anticuerpo 106 específico para gp39 murina y los estudios in vivo con monos y linfocitos de sangre periférica humana con anticuerpo monoclonal murino anti-gp39 humana.

TABLA 6

Respuesta de IgG anti- glóbulos rojos de oveja

Animal nº Sexo Pre-dosis Día 8 Día 15 Día 22 Día 29 Día 36 Día 43

Grupo 1 mAb 106

223 Macho 301 30 30 10 <10 10 01 224 Macho 90 90 90 30 90 90 90 225 Hembra 10 <10 <10 <10 <10 810 2430 226 Hembra 10 10 <10 <10 <10 90 90

Grupo 2 mAb L6

227 Macho 10 270 810 810 810 810 270 228 Macho 30 270 2430 810 810 810 810 229 Hembra 30 2430 7290 2430 2430 810 810 230 Hembra SH SH SH SH SH SH SH

1. Títulos de anticuerpos, el título del punto final informado se define como el recíproco de la dilución que es superior a dos veces por encima de la media de la referencia de la placa. 2. SH. Sin hacer

15 TABLA 7

Respuesta de IgM anti- glóbulos rojos de oveja

Animal nº Sexo Predosis Día 8 Día 15 Día 22 Día 29 Día 36 Día 43

Grupo 1 mAb 106

223 Macho 901 810 270 90 30 30 30 224 Macho 30 810 810 270 270 90 90 225 Hembra 30 270 90 90 90 2430 2430 226 Hembra 90 270 270 270 810 2430 2430

Grupo 2 mAb L6

227 Macho 270 810 2430 810 810 810 810 228 Macho 30 21870 21870 7290 7290 2430 2430 229 Hembra 90 7290 7290 2430 2430 2430 810 230 Hembra 90 2430 2430 2430 810 810 810

1. Títulos de anticuerpos, el título del punto final informado se define como el recíproco de la dilución que es superior a dos veces por encima de la media de la referencia de la placa.

Ejemplo 11

Construcción de regiones variables monocatenarias de anti-gp39 recombinante

En este ejemplo se determinan y se aíslan las secuencias de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) de dos anticuerpos monoclonales anti-gp39 humana [39-1.7 (7) y

5 39-1.106 (106)]. Entonces, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL de cada anticuerpo monoclonal se ensamblaron en un casete de expresión continuo usando una secuencia interviniente que codifica un ligador (Gly4Ser)3. Los casetes se expresaron en células de mamífero y se determinó la actividad funcional de las moléculas de anticuerpo monocatenario (sFv) recombinante.

A. Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y amplificación por PCR

Se aisló ARN a partir de 5 x 107 células de hibridoma del clon 106 o clon 7 usando un kit de aislamiento de ARNm (Stratagene, LaJolla, CA). Se generó ADNc a partir de ARN usando el kit StrataScript RT-PCR (Stratagene, LaJolla, CA) y cebadores de sentido contrario específicos para la región constante de la inmunoglobulina. El cebador específico para Ck fue complementario a la secuencia de nucleótidos 228 a 257 de la región constante de la cadena ligera kappa murina. Esta cebador se usó para la síntesis de la primera cadena de ADNc de VL de tanto el clon 106

15 como del clon 7. Se usaron un cebador de sentido contrario específico para IgG1 o un cebador de sentido contrario específico para IgG2b para generar ADNc de VH de tanto el clon 106 como del clon 7, respectivamente. El cebador de sentido contrario específico para IgG1 fue complementario a los nucleótidos 100 a 12 de la región CH1 de IgG1 murina y el cebador de sentido contrario específico para IgG2b fue complementario a los nucleótidos 101 a 123 de la región CH1 de IgG2b murina. Las reacciones de la primera cadena se establecieron usando 300 ng de cebador de sentido contrario y 0,5 μg de ARNm.

Los ADNc se purificaron usando Geneclean™ (Bio 101, LaJolla, CA) y posteriormente se añadieron colas de poliG con dGTP 10 mM y desoxinucleotidil transferasa terminal (Stratagene) durante 1 hora a 37ºC. Los ADNc con colas de poliG se purificaron de nuevo usando GeneClean™. Dos μl de cada ADNc se amplificaron por PCR de anclaje (Saiki y col., 1988. Science 239:487-491) en un volumen total de 100 μl usando 20 μmoles de cada dNTP, 100 pM

25 de cebadores de sentido directo y contrario y 2U de Taq polimerasa. El cebador de sentido directo contuvo una región complementaria a la cola de poliG (Loh y col., 1989. Science 243:217-220) y un sitio XhaI (subrayado).

Los cebadores de sentido contrario fueron cebadores anidados que contenían un sitio HindIII (subrayado) y se hibridaron con tanto los nucleótidos 101-125 de CK murino

5'-CGTCATAAGCTTCAGGAAGCACACGACTGAGGCAC-3' SEC ID Nº 8

como con los nucleótidos 47-69 de CH1 de IgG1 murina

5'-CGTCATAAGCTTGTCACCATGGAGTTAGTTTG-3' SEC ID Nº 9

como con los nucleótidos 38-62 de CH1 de IgG2b murina

5'-CGTCATAAGCTTGAACCAGTTGTATCTCCACACCCAG-3' SEC ID Nº 10

35 Las reacciones se llevaron a cabo en un ciclador térmico Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT) con un programa de 33 ciclos de 30 s, desnaturalización a 94ºC, 90 s de hibridación a 45ºC y 90 s de extensión a 72ºC.

Los fragmentos de VL y VH amplificados por PCR se digirieron con XbaI y HindIII, se ligaron en el vector pUC 19 y se transformaron en DH5a de E. coli. Los clones que contenían VL o VH se identificaron por secuenciación de ADN. Las secuencias consenso para el clon 106 (Figura 6A y Figura 6B) o el clon 7 (Figura 7A y Figura 7B) se determinaron analizando la secuencia de múltiples clones de VL o VH y el alineamiento de las secuencias de aminoácidos deducidas con secuencias de VL y VH murinas previamente publicadas (Kabat y col., 1987. U.S. Department of Health and Human Services). La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida para VL y VH del clon 106 se representan en la Figura 6A y Figura 6B (SEC ID Nº 11 a 14) y la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida para VL y VH de 7 se representan en la Figura 7A y Figura 7B (SEC ID Nº 15 a 18).

45 B. Construcción de casetes de expresión de sFv del clon 7 y el clon 106

Se construyeron sFv de una única cadena en la orientación VL-VH para tanto 7 como 106, conteniendo cada casete una ligador interviniente (Gly4Ser)3 (Huston y col., 1988. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Para crear el casete VL-VH de 106, el gen VL del clon 106 se reamplificó a partir de la construcción de secuenciación pUC19 usando un cebador de PCR de sentido directo (y1Sall de 106) que codificó un sitio Sall inmediatamente antes de la secuencia que codifica el primer residuo de VL madura. El cebador de sentido contrario (y1vILK3' de 106) fue complementario a la secuencia que codifica los nueve últimos residuos de VL y los 12 primeros residuos del ligador (Gly4Ser)3. Adicionalmente, VH de 106 se reamplificó a partir de la construcción de secuenciación pUC19 usando un cebador de sentido directo (y1vhLK5' de 106) que codificó los 11 últimos residuos del ligador (Gly4Ser)3, seguido de los nueve primeros residuos de VH madura y un cebador de sentido contrario (vhBcII de 106) complementario a la

5 secuencia que codifica los nueve últimos residuos de la región VH y un sitio BcII. Entonces, los productos de PCR de VL y VH modificados se purificaron usando Geneclean™ (Bio 101, LaJolla, CA) y se añadieron a una única reacción de PCR en presencia de cebadores de VL de sentido directo (y1SalI de 106) y de VH de sentido contrario (vhBclI de 106) en exceso de manera que el ADN que codifica los dominios VH y VL de 106 individuales se ligaron en una única región codificante por PCR de extensión por solapamiento.

10 Similarmente, para crear el casete de sFv de VL-VH de 7, el gen VL de 7 se reamplificó a partir de la construcción de secuenciación pUC19 usando un cebador de PCR de sentido directo (y2bSalI de 7) que codificó un sitio SalI inmediatamente antes de la secuencia que codifica el primer residuo de VL de 7 madura; y un cebador de sentido contrario (y2bv1LK3' de 7) complementario a la secuencia que codifica los nueve últimos residuos de VL y los 12 primeros residuos del ligador (Gly4Ser)3. El ADN que codifica VH de 7 se reamplificó a partir de la construcción de

15 secuenciación pUC19 con un cebador de sentido directo (y2bvhLK5' de 7) que codificó los 11 últimos residuos del ligador (Gly4Ser)3, seguido de los nueve primeros residuos de VH madura y un cebador de sentido contrario (y2bvhBclI de 7) complementario a la secuencia que codifica los nueve últimos residuos de aminoácidos de la región VH y un sitio BclI. El ADN que codifica VH y VL de 7 se ligó en una única región codificante por PCR de extensión por solapamiento usando cebadores de VL de sentido directo (y2bSalI de 7) y de VH de sentido contrario (y2bvhBclI

20 de 7) en exceso.

TABLA 8

Cebadores usados para la construcción de casetes de expresión de sFv del clon 7 y el clon 6

Cebador

Secuencia (5' a 3')1

y2bSalI de 7 y2bVILK3' de 7

ATCGTCTAGGTCGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTCC. SEC ID Nº 19

y2bVhLK5' de 7

y2bBclI de 7

TCAGTGCTGATCAGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCC. SEC ID Nº 22

y1SalI de 106 y1VILK3' de 106

ATCGTCTAGGTCGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCC. SEC ID Nº 23

y1VhLK5' de 106

y1BclI de 106

TCAGTGCTGATCAGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACC. SEC ID Nº 26

1 Sitios de restricción subrayados

Los casetes del gen sFv VL-enlace-VH de 106 y 7 se ensamblaron para la expresión de sFv-Ig en una variante de pUC19 llamada pUC-Ig que se había pasado por una cepa dam de E. coli (NEB 208) para permitir el corte de la 25 enzima de restricción en el sitio BclI. Este vector contuvo la secuencia líder de VK L6 insertada como fragmento HindIII-SalI y un sitio BclI precediendo a la secuencia que codifica la bisagra-CH2-CH3 de IgG1 humana como ADNc, seguido de un codón de terminación y un sitio XbaI. Los residuos de cisteína en la región bisagra se mutaron a serinas para favorecer la producción de sFv-lg monomérico (Hayden y col., 1994. Therapeutic Immunol. 1:3-15). Los casetes del gen sFv VL-enlace-VH de 106 y 7 se cortaron con SalI y BcII y se ligaron en pUC-Ig. DH5a de E. coli se

30 transformaron con las construcciones y las colonias se cribaron para insertos.

Los casetes de sFv/Ig humana líder de L6VK/VL-enlace-VH enteros para tanto sFv de 106 como de 7 se cortaron de pUC-Ig usando HindIII y XhaI y se transfirieron al vector de expresión pCDM8 de mamífero. Tras la ligación de los casetes de expresión de sFv de 7 y 106 en el vector pCDM8 modificado, los plásmidos se amplificaron en células MC1061/p3 de E. coli y el ADN se recuperó y se purificó para la transfección en células COS.

35 C. Transfección en células COS, purificación y caracterización de proteínas de fusión sFv-Ig Se transfectaron células COS con plásmidos de expresión como se describe previamente (Linsley y col., 1991. J. Exp. Med. 173:721-730; Aruffo y Seed, 1987. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:8573-8577). Se añadió ADN de plásmido a los medios de transfección a 1 μg/ml en un volumen total de 12 ml/placa de 150 mm. Después de 7 a 10 días, el sobrenadante de cultivo gastado se reunió y el residuo celular se eliminó por centrifugación a baja velocidad.

sFv-Ig de 106 y 7 se purificaron aplicando el sobrenadante clarificado a una columna de proteína A inmovilizada (Repligen Corp., Cambridge, MA) equilibrada con citrato de sodio 0,05 M, pH 8,0 (Linsley y col., 1991. J. Exp. Med. 173:721-730). Para 500 ml de sobrenadante se usó 1 ml de volumen de lecho empaquetado de proteína A. Después de cargar la columna (1 ml/minuto), la columna se lavó con fosfato de potasio 100 mM, pH 8,0, y la proteína unida se eluyó con citrato de sodio 0,05 M, pH 3,0. Las fracciones se neutralizaron, se reunieron y se dializaron contra PBS. La concentración de proteína se determinó usando un kit de ensayo de proteínas comercialmente disponible (Bio-Rad, Richmond, CA) basado en la técnica de Lowry.

Los niveles de expresión y el tamaño molecular de las proteínas de fusión se determinaron por inmunoprecipitación con proteína A y SDS-PAGE, seguido de transferencia Western. Los geles de poliacrilamida que forman un gradiente lineal del 6-15% con un apilador al 4% se ejecutaron durante la noche a 10 mAmp. Los geles se inmunotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa usando un aparato de transferencia semi-seca Western (Ellard Instruments. Seattle. WA) a 3 mAmp/cm2 durante 1 hora. Las transferencias se bloquearon con 2% de leche desnatada más 0,1% de Tween en PBS (tampón de bloqueo) durante 1 a 2 horas y luego se incubaron con anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugada con fosfatasa alcalina (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, IN) a una dilución 1:1500 en tampón de bloqueo durante 1 hora. Entonces, las transferencias se lavaron tres veces con tampón de bloqueo y se revelaron en azul de Western (Promega, Madison. WI) durante 5-15 min antes de detener el revelado del color aclarando con agua destilada.

Las proteínas sFv-Ig de 7 y sFv-Ig de 106 se probaron para la unión a gp39 humana por un ensayo de ELISA. Brevemente, placas de microtitulación de 96 pocillos flexibles de fondo plano (Falcon) se recubrieron durante la noche con anticuerpo monoclonal de rata anti-Lyt2a de ratón 53-6 a 2 μg/ml en PBS a 4ºC. Después de eliminar el anticuerpo anti-Lyt2a de ratón en exceso, sgp39 se añadió como se ha descrito anteriormente a las placas (100 μl por pocillo) y se incubó durante la noche a 4ºC. sgp39 en exceso se eliminó lavando, y se añadieron las proteínas sFv-Ig del clon 7 o sFv-Ig del clon 106 (100 μl por pocillo). Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron dos veces con PBS que contenía 0,1% de BSA. Se añadió anti-IgG humana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (American Qualex, Anaheim, CA) en tampón de conjugado (Genetics Systems, Seattle, WA) (100 μl por pocillo) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El conjugado sin unir se eliminó por dos lavados con PBS que contenía 0,1% de BSA y 100 μl por pocillo de una dilución 1:100 de sustrato tamponado para EIA (Genetic Systems) se añadieron a los pocillos. La reacción de color se detuvo con 30 μl por pocillo de H2SO4 3 M y la densidad óptica se midió a 450-595 nm con un lector de placas de multipocillos Titertek.

Los sobrenadantes de transfección de los varios clones sFv-Ig del clon 106 y sFv-Ig del clon 7 se unieron bien a gp39 humana y reaccionaron muy débilmente (106) o no reaccionaron en absoluto (7) sobre gp39 murina. Resultados representativos de la unión de sFv-Ig de 106 y 7 se muestran en la Figura 8. Se llevaron a cabo determinaciones de la afinidad de unión para sFv-Ig de 106 frente a anticuerpo monoclonal 106 nativo usando proteína radiomarcada purificada. Las curvas de unión de saturación, mostradas en la Figura 9, mostraron que el anticuerpo monoclonal 106 nativo marcado (Figura 9A) se unió constitutivamente a células Jurkat que expresaban gp39 con aproximadamente tres veces mayor afinidad que sFv-Ig de 106 (Figura 9B). Sin embargo, la afinidad de sFv-Ig de 106 todavía fue bastante alta (Kd medida =1,6 x 10-9). Se determinó que el anticuerpo monoclonal 106 nativo se unió a 10.000 sitios por célula por transformación de Scatchard que está totalmente de acuerdo con el número de sitios para célula unida por sFv-Ig de 106 (Figuras 9A y 9B).

La capacidad de sFv-Ig de 7 y sFv-Ig de 106 para inhibir la producción de IgG e IgM en un sistema de producción de anticuerpos por linfocitos B dependientes de linfocitos T in vitro y la comparación de este efecto con el observado para los anticuerpos 39-1.7 y 39-1.106 parentales se evaluó como se ha descrito anteriormente para los anticuerpos parentales con algunas modificaciones menores. Los cultivos celulares se iniciaron con 100.000 linfocitos T tratados con mitomicina C y 2.000 linfocitos B en placas de media área Costar. Los anticuerpos parentales purificados y sus sFv-Ig purificadas respectivas se cuantificaron usando un kit de ensayo de proteínas Bio-Rad. Cada anticuerpo parental se probó a concentraciones finales de 1, 0,5, 0,25 y 0,125 μg/ml. Cada sFv-Ig se evaluó a concentraciones finales de 0,68, 0,34, 0,17 y 0,085 μg/ml. Aunque la concentración de anticuerpo parental y su sFv-Ig respectiva en términos de μg/ml fueron diferentes, la concentración de cada uno con respecto al número de fragmentos de unión a antígeno fue equivalente cuando se tuvieron en cuenta la valencia global (dos por anticuerpo parental, una para su sFv-Ig) y peso molecular (160.000 kD para el anticuerpo parental, 55.000 kD para sFv-Ig). Por tanto, las concentraciones finales de fragmentos de unión a antígeno (sitios de unión) comparados en este experimento fueron 7,53, 3,76, 1,88 y 0,94 x 1012 sitios de unión/ml.

Tras la adición de los anticuerpos y sFv-Ig, las placas se cultivaron en una estufa de incubación humidificada a 37ºC/6% de CO2 durante 10 días, después de lo cual los sobrenadantes de cultivo de los pocillos por triplicado se reunieron y se evaluaron para IgG e IgM humana total como se ha descrito anteriormente. Los datos se presentan en la Tabla 9 en la que niveles de Ig se expresan como un porcentaje del observado con controles de medio solo (sin anticuerpo anti-gp39). Como se muestra en la Tabla 9, tanto sFv-Ig de 7 como sFv-Ig de 106 pudieron suprimir sustancialmente la producción de tanto IgG como IgM por linfocitos B humanos. De forma interesante, su capacidad para suprimir fue al menos equivalente y a algunas concentraciones incluso mejor que la observadas para los anticuerpos parentales.

TABLA 9

Supresión de la producción de anticuerpos in vitro por anticuerpos monoclonales anti-gp39 humana completos y sus derivados de sFv-Ig

Conc. de Ab (sitios de unión x1012)

Inhibición de la síntesis de IgG - % de control de medio solo Inhibición de la síntesis de IgM - % de control de medio solo

7 sFv-Ig de 7 106 sFv-Ig de 106

7 sFv-Ig de 7 106 sFv-Ig de 106

7,53 3,76 1,88 0,94

12 18 11 14 17 19 24 12 11 24 26 10 60 12 37 21 14 21 25 12 24 19 19 12 29 34 27 12 64 32 34 19

Ejemplo 12

Humanización de anticuerpo monoclonal anti-gp39

A. Determinación de moldes humanos para VL y VH de 106

Las secuencias de VL (kappa) y VH de 106 murino se usaron para buscar un subconjunto de secuencias de

10 inmunoglobulinas de GenBank para las secuencias de nucleótidos de la línea germinal murina con la homología más próxima a VL de 106 con una búsqueda con FASTA usando sólo nucleótidos que codifican el péptido maduro. Esta búsqueda produjo dos secuencias murinas seguidas de muchas secuencias humanas, designándose el mejor apareamiento “Musigkva” (nº de acceso J00545). La homología entre VL de 106 traducida y J00545 traducida (línea germinal de 106) se muestra en la Figura 10. Sólo están impresas las diferencias para la secuencia de la línea

15 germinal. Estas diferencias son sitios probables de mutación somática. Sin embargo, es posible que VL de 106 se derive de un gen de la línea germinal murina todavía no identificado.

La secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana con la homología más próxima a VL de 106 se determinó realizando una búsqueda con FASTA en la base de datos de secuencias de proteínas de inmunoglobulinas. Este conjunto de datos contuvo tanto secuencias de la línea germinal como reorganizadas. Después de desechar las

20 secuencias reorganizadas, el mejor emparejamiento de homología se encontró con secuencias de la línea germinal designadas “02” (nº de acceso X59312) y “012” (nº de acceso X59315). Se observó que se conservaron todos determinantes estructurales para los bucles de CDR, excepto uno (Leu90), como era el tamaño de los bucles de CDR entre VL de 106 murino y el molde humano. También se observó que todos los bucles de CDR en las cadenas ligeras de la secuencia murina y el molde humano pertenecen a la misma clase de estructura canónica.

25 La secuencia de nucleótidos murina con la homología más próxima a VH de 106 también se determinó realizando una búsqueda con FASTA del subconjunto de secuencias de inmunoglobulinas de GenBank usando sólo nucleótidos que codifican el péptido maduro como secuencia de búsqueda. La búsqueda produjo la localización de dos secuencias murinas, seguido de muchas secuencias humanas. Las secuencias murinas designadas “Musighin” (nº de acceso M21520) mostraron homología significativamente mejor que la otra secuencia murina. La anotación de

30 GenBank para M21520 lo enumera como una secuencia reorganizada. Con el fin de encontrar sitios probables de mutación somática, M21520 se usó como sustituto de la línea germinal y diferencias entre él y VH de 106 se muestran en el conjunto inferior de líneas en la Figura 11.

La secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana con la homología más próxima a VH de 106 se determinó realizando una búsqueda con FASTA en el subconjunto de datos de secuencias de inmunoglobulinas. Después de 35 desechar las secuencias reorganizadas, el mejor emparejamiento se encontró con la secuencia de la línea germinal “Hhg4” (nº de acceso X62129). Se observó que el tamaño de los bucles de CDR se preservó entre VH de 106 y el molde humano y que se conservaron todos los determinantes estructurales para los bucles de CDR, excepto dos. Ninguna de las otras secuencias altamente homólogas dio un mejor ajuste en los determinantes estructurales. También se encontró que los bucles H1 de la secuencia murina y el molde humano pertenecían a la misma clase de

40 estructura canónica.

B. Refinamiento de los moldes de humanización de VL y VH de 106.

Se identificaron las estructuras del bucle canónico para los bucles de unión a antígeno L1, L2 y L3 del dominio VL y H1 y H2 del dominio VH, y los residuos que se definieron como determinantes estructurales (Chothia y Lesk, 1987.

J. Mol. Biol. 196-901; Lesk y Tramontano, en Antibody Engineering W.H. Freeman y Co., pág. 1-38 (1992)) se retuvieron como residuos murinos.

5 Las secuencias de aminoácidos de VL y VH de 106 murino se usaron para buscar en el banco de datos Brookhaven para secuencias homólogas en las que se había resuelto la estructura cristalina. Se seleccionó VL del anticuerpo monoclonal D1.3 de unión a anti-lisozima como molde estructural para modelar VL de 106. VH del anticuerpo monoclonal 17/9 anti-péptido se eligió como molde estructural para modelar VH de 106. Estas estructuras se combinaron para proporcionar un molde compuesto para modelar 106 usando el conjunto de residuos invariantes en

10 la interfase VL-VH. A partir del modelo se identificaron tres residuos adicionales de la región estructural que parecieron ser importantes para el mantenimiento de la estructura de los sitios de unión un antígeno. En VL se encontró que Ile48 era estructuralmente importante y se retuvo como secuencia murina. En VH también se retuvieron dos residuos (Ala49 e Ile77) como secuencia murina. El modelo de 106 no fue determinante de si un residuo humano o murino era apropiado en las posiciones 24, 55 y 56 de VH de 106.

15 C. Determinación de moldes de la región J

La mejor secuencia de JK humana se seleccionó por homología con la secuencia JK murina en Kabat y col., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª edición, U.S. Health and Human Services, Washington, D.C. (1987)). Similarmente, la mejor secuencia de JH humana se seleccionó por homología con la secuencia de JH murina en Kabat y col., anteriormente citado.

20 D. Humanización de VL de 106

Los cebadores de oligonucleótidos usados para humanizar VL de 106 se enumeran en la Tabla 8. Los tres primeros cambios (Ala en la posición 9 a Ser, Glu en la posición 17 a Asp y Thr en la posición 18 a Arg) se codificaron en el cebador de PCR de sentido directo Hu106VLAre2. Se añadió un sitio HindIII inmediatamente a 5' de la secuencia que codifica VL madura para la clonación de VL humanizada final en pUC19. Los cuatro siguientes cambios fueron 25 codificados en el cebador de PCR de sentido contrario Hu106VLB2 (Gln en la posición 40 a Pro, Arg en la posición 42 a Lys, Ser en la posición 43 a Ala y Gin en la posición 45 a Lys). Usando Hu106VLAre2 y Hu106VLB2 con sFv-Ig de 106/CDM8 murina como molde, el primer fragmento humanizado se obtuvo por PCR. El cebador de PCR de sentido directo Hu106VLC y el cebador de PCR de sentido contrario 2Hu106VLD se usaron para humanizar el segundo fragmento. La secuencia de Hu106VLC solapó Hu106VLB2 de forma que los cuatro mismos cambios 30 fueron codificados sobre Hu106VLC (Gln en la posición 40 a Pro, Arg en la posición 42 a Lys, Ser en la posición 43 a Ala y Gln en la posición 45 a Lys). Además, se manipuló un sitio SpeI en Hu106VLC como sitio de diagnóstico. Este cambio no alteró la secuencia de proteínas. El cebador 2Hu106VLD codificó los cuatro siguientes cambios (Gln en la posición 70 a Asp, Ser en la posición 72 a Thr, Lys en la posición 74 a Thr y Asn en la posición 76 a Ser). Usando Hu106VLC y 2Hu106VLD con sFv-Ig de 106/CDM8 murina como molde, el segundo fragmento humanizado

35 se obtuvo por PCR.

TABLA 10

Cebadores usados para la humanización de VL de 106

Hu106VLAre2 96-mero de sentido directo

Hu106VLB2 45-mero de sentido contrario

Hu106VLC 60-mero de sentido contrario

2Hu106VLD 45-mero de sentido contrario

Hu106VLE 75-mero de sentido directo

(continuación) Cebadores usados para la humanización de VL de 106

Hu106VLF 82-mero de sentido contrario

Hu 106VLA2 24-mero de sentido 3'-ATCGTCTAGAAGCTTGTCGACATC-3' SEC ID Nº 39 directo

Hu106VLF2 24-mero de sentido 5'-TCAGTGCTTCTAGAGCCACCCCGT-3' SEC ID Nº 40 contrario

El fragmento de VL humanizado final se obtuvo usando el cebador de PCR de sentido directo Hu106VLE y el cebador de PCR de sentido contrario Hu106VLF con sFv-Ig de 106/CDM8 murina como molde. Hu106VLE solapó parcialmente 2Hu106VLD de forma que codificó los cuatro mismos cambios (Gln en la posición 70 a Asp, Ser en la 5 posición 72 a Thr, Lys en la posición 74 a Thr y Asn en la posición 76 a Ser). Adicionalmente, Hu106VLE codificó dos cambios adicionales (Gly en la posición 84 a Ala y Ser en la posición 85 a Thr). Hu106VLF codificó los cuatro últimos cambios (Thr en la posición 100 a Gly, Leu en la posición 104 a Val y Leu en la posición 106 a Ile). Hu106VLF también codificó un sitio XhaI inmediatamente a 3' de la secuencia de VL para los fines de clonación. Entonces, los fragmentos 2 y 3 humanizados se ensamblaron y se amplificaron por PCR mezclando los dos ADN 10 humanizado juntos en presencia del cebador de sentido directo Hu106VLC y del cebador de sentido contrario Hu106VLF. Este trozo se purificó, se mezcló con el fragmento 1 humanizado y se reamplificó por PCR en presencia del cebador de sentido directo Hu106VLA2 y el cebador de sentido contrario Hu106VLF3 de forma que se obtuvo un único fragmento de PCR. Entonces, VL de 106 humanizado amplificado se cortó con HindIII y XbaI y se ligó en pUC19. Se transformaron E. coli (cepa DH5a) como usualmente y el ADN de plásmido de clones individuales se

15 secuenció para verificar el ensamblaje apropiado de fragmentos de VL de 106 humanizado. Un clon individual se designó el clon 10 de hu106VL y se usó en las construcciones posteriores.

E. Humanización de VH de 106

Como el modelo de 106 murino no era determinante de si un residuo humano o murino era apropiado en las posiciones 24, 55 y 56 de la cadena de VH humanizada, se hizo un intento por producir las 23 versiones. Los genes 20 VH humanizados se ensamblaron en tres etapas. En la primera etapa, los fragmentos de PCR que codifican cualquiera de las 2 versiones (correspondientes a Ala o Thr en la posición de aminoácido 24) de la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a la posición 51 se generaron y se insertaron en los sitios HindIII y XhaI de pUC19. Estos productos de PCR incluyeron la introducción de un único sitio NheI (en la posición de nucleótido 146), seguido de sitios EcoRI, PstI y XhaI para la posterior inserción de otros fragmentos. Estos cambios no afectaron las 25 secuencias de proteínas de VH de 106. En la segunda etapa, los oligonucleótidos que codifican cualquiera de las cuatro versiones diferentes (correspondientes a Asp-Ser, Asp-Tyr, Ser-Ser y Ser-Tyr en las posiciones de residuos de aminoácido 55 y 56) de los residuos de aminoácidos 49 a 80 se hibridaron y se insertaron en los sitios NheI y PstI de cualquiera de los vectores generados en la etapa 1. Se aislaron siete de los ocho posibles vectores diferentes (no era la forma Ala-Asp-Ser). En la tercera etapa, un único producto de PCR que codifica los residuos de aminoácidos

30 80 a 112, que contuvo la secuencia de nucleótidos que codifica los residuos restantes para VH de 106 humanizada (Figura 12) se generó y se insertó en los sitios PstI y XbaI de los siete vectores producidos en la etapa 2.

TABLA 11

Cebadores usados para la humanización de VH de 106

106vhT-5' 106-mero de sentido directo

106VHA-5 106-mero de sentido directo

106vhNEP-3' 87-mero de sentido contrario

106vhSY-5' 97-mero de sentido directo

106vhSY-3' 89-mero de sentido contrario

106vhDY-5' 97-mero de sentido directo

106vhDY-3' 89-mero de sentido contrario

106vhSS-5' 97-mero de sentido directo

106vhSS-3' 89-mero de sentido contrario

106vhDS-5' 97-mero de sentido directo

106vhDS-3' 89-mero de sentido contrario

106vhPst5' 78-mero de sentido directo

(continuación) Cebadores usados para la humanización de VH de 106

106vhXba3' 69-mero de sentido contrario

En mayor detalle, la construcción de los dos vectores se inició generando dos fragmentos de PCR usando sFv-Ig de 106/CDM8 como molde y tanto 106vhT-5' como 106vhA-5' como cebador de sentido directo y 106vhNEP-3' como cebador de sentido contrario. Los cebadores de sentido directo codificaron un sitio HindIII inmediatamente a 5' de VH y los tres primeros cambios de VH humanizada (Lys en la posición 3 a Gln, Lys en la posición 19 a Arg y Thr en 5 la posición 23 a Ala). Además, el cebador de sentido directo 106vhA-5' humanizó el residuo en la posición 24 a Ala, mientras que el cebador de sentido directo 106vhT-5' mantuvo el residuo como murino (Thr). El cebador de sentido contrario codificó cambios en los residuos 40, 42 y 44 (Thr a Ala, Glu a Gly y Arg a Gly, respectivamente) y también codificó cuatro únicos sitios de restricción (NheI, EcoRI, PstI y XbaI). Entonces, los dos ADN de PCR se clonaron en pUC 19 como fragmentos de HindIII-XbaI y se usaron para transformar DH5a de E. coli. Los clones que contenían

10 ambos insertos se aislaron (106vhA-NEP y 106vhT-NEP) y se verificaron por secuenciación de ADN. Entonces, los plásmidos se digirieron con NheI, EcoRI y PstI y se aisló y se purificó ADN lineal.

El oligonucleótido de sentido directo en cada uno de los cuatro pares de oligonucleótidos que codificó los cambios en las posiciones 55 y 56 se fosforilaron y se hibridaron con el oligonucleótido de sentido contrario correspondiente. Esto generó fragmentos de ADNbc que tenían un oligonucleótido protuberante en 5' NheI y un oligonucleótido 15 protuberante en 3' PstI, y que contenían un sitio XhoI único. El par de cebadores 106vhDS-5' y 106vhDS-3' codificó residuos murinos en las posiciones 55 y 56 (Asp-Ser); 106vhDY-5' y 106vhDY-3' codificaron residuos murinos y humanos en las posiciones 55 y 56, respectivamente (Asp-Tyr); 106vhSS-5' y 106vhSS-3' codificaron residuos humanos y de ratón en las posiciones 55 y 56, respectivamente (Ser-Ser); y 106vhSY-5' y 106vhSY-3' codificaron residuos humanos en las posiciones 55 y 56 (Ser-Tyr). Todos los pares de cebadores también codificaron cuatro 20 cambios adicionales de secuencia murina a humana (Thr a Ile en la posición 57, Pro a Ala en la posición 60, Arg a Lys en la posición 64 y Arg a Lys en la posición 75). Entonces, los cuatro fragmentos que se generaron se ligaron en 106vhA-NEP/pUC19 y 106vhT-NEP/pUC19 previamente digeridos con enzimas de restricción. Los plásmidos se usaron para transformar DH5a de E. coli y el ADN de clones que se cortaron con XhoI se aislaron y verificaron por secuenciación de ADN. De las ocho combinaciones se obtuvieron siete (106vhA-DS, que representa secuencia

25 humana, de ratón, de ratón en las posiciones 24, 55 y 56, nunca se había aislado de pUC19). Los siete plásmidos se digirieron con PstI y XbaI y ahora ya estuvieron preparados para recibir el fragmento final. Tres de los clones se seleccionaron para uso posterior y se designaron del siguiente modo: VH ASY 24-17 (hhh); VH TDS 15-34 (mmm); y VH ADY 7-8 (hmh).

Los residuos restantes que se cambiaron a secuencia humana se codificaron en el cebador de sentido directo

30 106vhPst5' (Ser a Asn en la posición 82a, Ser a Ala en la posición 84 y Met a Val en la posición 89) y cebador de sentido contrario 106vhPst3' (Ser a Leu en la posición 108). Para fines de clonación, el cebador 106vhPst5' también codificó un sitio PstI y 106vhPst3' codificó un sitio XhaI precediéndolo inmediatamente un sitio BcII. Este fragmento se obtuvo por PCR usando sFv-Ig de 106/CDM8 como molde. El fragmento se digirió con PstI y XbaI y se ligó en los siete plásmidos. De nuevo, los plásmidos se usaron para transformar DH5a de E. coli y se secuenció ADN de clones

35 para verificar la inserción.

F. Ensamblaje de casetes de genes de sFv de 106 humanizado

Los casetes de expresión de Fv monocatenario humanizado para 106 se ensamblaron como para sFv 106 murino original, pero usando los siguientes cebadores:

TABLA 12

Cebadores usados para la construcción de casetes del gen sFv 106 humanizado

hu106VLSall 45-mero de sentido directo

hu106VLLK3' 60-mero de sentido contrario

hu106VHLK5' 60-mero de sentido directo

hu106VHBcII 45-mero de sentido contrario

40 Brevemente, ADN que codifica VL de 106 humanizado se cortó del vector pUC19 en el que se ensambló. ADN que codifica las siete VH de 106 humanizado también se cortaron de pUC19. Los fragmentos de ADN se purificaron y se usaron en las siguientes reacciones de PCR. VL de 106 humanizado se amplificó usando el cebador de PCR de sentido directo hu106VLSalI que codificó un sitio SalI inmediatamente antes del primer residuo de VL madura y un cebador de sentido contrario (hu106VLLK3') que era complementario a secuencia que codifica los nueve últimos residuos de VL y los 12 primeros residuos del ligador (Gly4Ser)3. Adicionalmente, las siete VH de 106 humanizado se amplificaron usando un cebador de sentido directo (hu 106VHLK5') que codificaba los 11 últimos residuos del ligador (Gly4Ser)3, seguido de los nueve primeros residuos de VH madura y un cebador de sentido contrario (hu106VHBclI) complementario a la secuencia que codifica los nueve últimos residuos de la región VH y un sitio BclI. VL de 106 modificada se mezcló con cada uno del ADN de VH de 106 modificada en presencia del cebador de sentido directo (hu106VLSalI 5') de VL en exceso y el cebador de sentido contrario (hu106VHBclI) de VH de manera que la VL de 106 humanizado individual se ligó con cada una de las VH de 106 humanizado individual en siete regiones codificantes individuales de VL-enlace-VH por PCR de extensión por solapamiento.

Entonces, los casetes del gen sFv de VL-enlace-VH de 106 humanizado se ensamblaron para la expresión de sFv-Ig en el vector pUC-Ig. Este vector contiene la secuencia líder L6 VK seguida de un sitio SalI y un sitio BclI que precede a la secuencia que codifica la bisagra-CH2-CH3 de IgG1 humana y un codón de terminación flanqueado por un sitio XbaI. Las cisteínas de la bisagra se mutaron a serinas para favorecer la expresión monomérica de la proteína de fusión sFv-Ig. Los casetes del gen sFv de VL-enlace-VH de 106 humanizado se cortaron con SalI y BclI y se ligaron en pUC-Ig similarmente digerido. DH5a de E. coli se transformaron con las construcciones y las colonias se cribaron para insertos. Seis de las siete construcciones de VH se insertaron apropiadamente en pUC-Ig. Los casetes del líder L6 VK/sFv de VL-enlace-VH de 106 humanizado/Ig humana se cortaron de pUC-Ig usando HindIIII y XbaI y se transfirieron al vector de expresión de mamífero pCDM8 y se amplificaron por transformación en la cepa de E. coli MC1061/p3. De las seis, cinco se insertaron apropiadamente en pCDM8. El ADN se recuperó de cada una para transfecciones en células COS.

Se llevaron a cabo transfecciones en células COS a pequeña escala en placas de cultivo de tejido de 60 mm por el procedimiento de DEAE-dextrano. De cada una se recuperaron tres ml de sobrenadante de transfección después de tres días de cultivo y se probaron para la presencia de la proteína de fusión sFv-Ig soluble por transferencia Western y ELISA. Además, se realizó un ELISA de tipo sándwich de anti-Ig humana para cuantificar la cantidad de proteína expresada por cada construcción y las constantes de asociación de las diferentes proteínas que se unión a gp39 se midieron por análisis de Biacore.

G. Análisis preliminar de sFv de 106 humanizado expresado por transfección transitoria en células COS.

La SDS-PAGE y transferencia Western de los sobrenadantes de transfección mostró que de las cinco construcciones usadas para transfectar células COS (sFv de 106 humanizado que contenía los fragmentos de VH de 106 106vhT-DS, 106vhT-SS, 106vhT-SY, 106vhA-DY y 106vhA-SY), cuatro secretaron proteína en el sobrenadante. No se expresó proteína por sFv de 106 humanizado que contenía 106vhT-SY (huVL/106vhT-SY). De los cuatro expresores, tres expresaron proteína de tamaño correcto para una proteína de fusión sFv-Ig (55 kDa). HuVL/106vhT-SS produjo una proteína de tamaño anómalo (aproximadamente 97 kDa). Los niveles de expresión para HuVL/106vhT-DS parecieron ser similares a sFv de 106 murino mientras que HuVL/106vhA-DY y HuVL/106vhA-SY se expresaron a menores niveles.

Los niveles de proteína se cuantificaron usando un ELISA de tipo sándwich para detectar la cola de Ig humana. Placas de ELISA se recubrieron con anti-Ig humana de cabra en PBS y se bloquearon en PBS + 0,1% de BSA. Los sobrenadantes de transfección se incubaron puros y a una dilución 1:5 durante 1 h a TA. Entonces, las placas se lavaron y se incubaron con anti-Ig humana de cabra-peroxidasa de rábano picante en tampón de conjugado de ELISA durante 1 h a TA. Las placas se lavaron de nuevo y se añadió una dilución 1:100 de sustrato tamponado de EIA (Genetic Systems Corporation). La reacción de color se detuvo con H2SO4 3 M y la densidad óptica se midió a 450-595 nm con un lector de placas de multipocillos Titertek. Las concentraciones aproximadas de proteína se determinaron por comparación con una concentración conocida de CD40Ry1 (CD40-Ig) que había sido determinada con el kit de concentración de proteínas Bio-Rad. Las concentraciones de proteína fueron:

huVL/106vhA-DY (clon 10) 0,62 μg/ml

huV1/106vhA-DY (clon 12) 0,82 μg/ml

huVL106vhA-SY (clon 21) 0,77 μg/ml

huVL/106vhT-SY (clon 26) 0 μg/ml

huVL/106vhT-SS (clon 36) 0,15 μg/ml

huVL/106vhT-DS (clon 46) 1,20 μg/ml

Los sobrenadantes se probaron para su capacidad para bloquear la expresión de E-selectina sobre células endoteliales. Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, Clonetics Corporation) se cultivaron y se estimularon en M199 (medio 199, Gibco BRL) con adiciones a concentraciones finales del siguiente modo: Lglutamina 4 mM, 48,5 μg/ml de penicilina, 80 μg/ml de estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM (Sigma), 90 μg/ml de heparina (Sigma), 30 μg/ml de suplemento de crecimiento endotelial (Collaborative Biomedical Products) y 20% de suero bovino fetal. Las células endoteliales se cultivaron en matraces de cultivo de tejido tratados con 1% de gelatina, y se sembraron a 1,5 x 104 células/pocillo en placas de cultivo de tejido Costar de 96 pocillos de fondo plano que habían sido recubiertas con 1 μg/pocillo de fibronectina (Collaborative Biomedical Products). Las células endoteliales se estimularon 1-2 días después de la siembra. Las células se usaron en el pase 4 ó 5.

sgp39 y sobrenadantes que contenían sFv-Ig de 106 humanizado se añadieron en M199 más adiciones en 100 μl por pocillo y se incubaron a 37ºC durante 4 horas antes de ensayar la expresión de E-selectina. Entonces, las placas se lavaron dos veces con PBS frío, se fijaron durante 10 minutos con 0,5% de glutaraldehído en PBS a 4ºC, se lavaron cuatro veces con 3% de suero de cabra /PBS/EDTA 20 mM (tampón de bloqueo) y se bloquearon 1 hora a 5 37ºC o durante la noche a 4ºC en el mismo tampón. Las células se trataron con 100 μl de anti-E- y P-selectina (R&D Systems) a 0,25 μg/ml en tampón de bloqueo durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron cuatro veces con tampón de bloqueo, se incubaron 1 hora a 37ºC con anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante en tampón de bloqueo (Jackson ImmunoResearch, 100 μl/pocillo, dilución 1:2000), luego se lavaron cuatro veces. Las placas se revelaron usando reactivo cromógeno de EIA en sustrato tamponado de EIA (ambos de

10 Genetic Systems, 100 μl/pocillo, dilución 1:100) y se detuvieron con 100 μl por pocillo de H2SO4 1 N. La absorbancia se determinó a longitudes de onda dobles de 450 nm y 630 nm.

HuVL/106vhA-DY, huVL/106vhA-SY y huVL/106vhT-DS inhibieron todos la expresión de E-selectina, aunque no tan eficazmente como sFv-Ig de 106 murino original (Figura 13). Pueden explicarse diferencias por la menor expresión de proteínas en huVL/106vhA-DY y huVL/106vhA-SY, aunque pareció que huVL/106vhT-DS se expresaba a niveles

15 comparables a los de sFv-Ig de 106 murino original.

Las constantes de asociación de las diferentes proteínas que se unieron a gp39 se determinaron usando Biacore. HuVL/106vhA-SY y huVL/106vhT-DS se unieron ambos estrechamente a chips recubiertos con gp39, con actividad comparable a la de sFv-Ig de 106 murino original (Figura 14). Como estas proteínas no se quitaron, no estuvo claro si las afinidades de estas sFv-Ig fueron o no muy altas (los perfiles indicaron afinidades de Kd ~ 10-10 M o

20 superiores) o si las proteínas se agregaron y se estuvieron uniendo multivalentemente. HuVL/106vhA-DY se quitó. A partir de su perfil se estimó que la afinidad era aproximadamente Kd = 10-7 a 10-8 M. La sFv-Ig de 106 murino original había sido medida a Kd = 1,6 x 10-9 M, por lo que parece que huVL/106vhA-SY y huVL/106vhT-DS son sFv antigp39 humanizado de alta afinidad .

Se encontró que HuVL/106vhA-SY y huVL/106vhT-DS se unieron fuertemente a gp39 humana y muestran actividad

25 funcional en la inhibición de la expresión de E-selectina sobre células endoteliales. Aunque parece que huVL/106vhA-SY se expresa a menores niveles que huVL/106vhT-DS, es “la más humana” de sFv de 106 humanizado.

Ejemplo 13

Generación de anticuerpo monoclonal 106 humanizado como anticuerpo completo

30 Usando sFv-Ig de 106 humanizado como molde, las cadenas ligeras variables y tres formas de la cadena pesada variable se amplificaron por PCR usando cebadores que introdujeron una secuencia que codificaba la secuencia señal del molde de anticuerpo humano molde. Estos productos de PCR se insertaron en un vector que contenía secuencias que codificaban las regiones constantes kappa (K) humana o una gamma 1 (y1) humana para generar la cadena ligera o pesada completa, respectivamente. Estos vectores también incluyeron genes de resistencia a

35 fármaco apropiados para la generación y amplificación de líneas celulares estables que expresan la proteína. Las proteínas de cada una de las tres construcciones (véase la Tabla 13 para la nomenclatura) se produjeron por expresión transitoria en células COS. Estas proteínas se probaron como sobrenadantes brutos en ensayos para la inhibición de la proliferación de linfocitos B usando gp39 soluble (sgp39) en presencia de anti-IgM humana, la producción de anticuerpos por linfocitos B estimulados con linfocitos T activados y la inducción de la expresión de E

40 selectina sobre células endoteliales por una línea de linfocitos T de gp39.

Lo siguiente describe brevemente la construcción de los vectores de expresión para el anticuerpo monoclonal antigp39 humanizado 106 con los aminoácidos Thr, Asp, Ser en las posiciones 24, 55 y 56, respectivamente (designado h106-2). La construcción de los vectores de expresión pasó por una serie de plásmidos intermedios en los que se manipularon diversas regiones funcionales y sitios de restricción. Por tanto, se ensamblaron las diversas regiones

45 que codifican los dominios variables requeridos y de otras inmunoglobulinas.

TABLA 13

Nomenclatura Secuencia en la posición Nombres de proteínas alternativas

24, 55, 56 TDS mmm hK1 h106-2 ADY hmh hK6 ASY hhh hK8 h106-1

Brevemente, se usaron tres plásmidos, pD13, pD16 y pD17, en la construcción de los vectores finales y los casetes de expresión se construyeron inicialmente.

A. Construcción de pD13

El plásmido pD13 se construyó y se derivó del plásmido pDNAc3 (Invitrogen) en dos etapas. Primero, el gen promotor/potenciador del SV40 y de resistencia a neomicina se eliminó por digestión con NaeI y aislamiento delfragmento de 3,82 kb. Éste se sustituyó por el gen promotor/potenciador del SV40 y dhfr de pSV2-dhfr. La secuencia de pSV2-dhfr se aisló como un fragmento de 1,93 kb después de la digestión con PvuII y BamHI. Los fragmentos de 3,82 y 1,93 kb se ligaron juntos y se usaron para transformar bacterias MC1061 tras el llenado en los extremos protuberantes del fragmento de 1,93 kb de pSV2-dhfr. El producto correcto (designado pD12) se confirmó por la liberación de un fragmento de 890 pb tras la digestión con HindIII.

En la segunda etapa, el poliligador se sustituyó con sitios de restricción alternativos digiriendo el vector resultante anterior con Asp718 y Bsp120I. Los oligonucleótidos LH7 (SEC ID Nº64) y LH8 (SEC ID Nº65) se hibridaron y se clonaron por clonación con ExoIII (K. Hsio, 1993, Nucl. Acid. Res. 21:5528-5529) se usó para completar el plásmido pD13. El plásmido resultante se usó para transformar DH5a de E. coli competente y el producto correcto se confirmó por secuenciación de la región del poliligador.

B. Construcción de pD16 y pD17

El plásmido pD16 se derivó del plásmido pDNAc3 (Invitrogen) en una serie de etapas que (1) añaden una secuencia del poliligador en la dirección 5' del promotor del CMV para la linealización, (2) delecionan el gen promotor/potenciador del SV40 y de resistencia a neomicina y lo sustituyen con la secuencia de terminación de la transcripción de la histona H3, el gen promotor del SV40 (potenciador delecionado) y DHFR, y (3) insertan la secuencia de terminación de la transcripción de gastrina en la dirección 5' del promotor del CMV. El plásmido pD17 se derivó de pD16 por la eliminación del sitio Nhel del poliligador de la linealización.

El plásmido pD16 se derivó de pDNAc3 (Invitrogen) digiriendo primero con Bg/II y ligando los oligonucleótidos LH1 (SEC ID Nº 58) y LH2 (SEC ID Nº 59) en el plásmido después de la hibridación de los oligonucleótidos. Después de la ligación, el plásmido resultante (pDNAc3-LSI) se usó para transformar DH5a de E. coli competente y la construcción correcta se confirmó por liberación de un fragmento de 230 pb tras la digestión con enzima de restricción con NheI y NruI.

Entonces, el plásmido pDNAc3-LSI se digirió con NgoMI, PvuI y BsmI. Tras la digestión se aisló un fragmento de NgoMI-PvuI de 2,0 kb. El plásmido pD12 (descrito anteriormente) se digirió con PvuI y SphI para eliminar el potenciador del SV40 y se aisló un fragmento de 3,6 kb. Los oligonucleótidos LH3 (SEC ID Nº 60) y LH4 (SEC ID Nº 61), que codifican la secuencia de terminación de la transcripción de histona H3, se hibridaron y luego se ligaron con el fragmento NgoMI-PvuI de 2,0 kb y el fragmento PvuI-SphI de 3,6 kb. El plásmido resultante pcTwD-LSI se confirmó por la producción de fragmentos de 3,3, 0,95, 0,82 y 0,63 kb después de la digestión con NheI más NciI yla producción de fragmentos de 4,2, 1,0, 0,26 y 0,23 kb después de la digestión con SphI más BstEII.

La inserción de la secuencia de terminación de la transcripción de gastrina para formar el plásmido pD16 se llevó a cabo digiriendo pcTwD-LS I con BssHII y NarI y aislando el fragmento de 5,7 kb y ligándolo con los oligonucleótidos hibridados LH5 (SEC ID Nº 62) y LH6 (SEC ID Nº 63). Después de la ligación, el producto se usó para transformar MC1061 de E. coli competente y la construcción correcta se confirmó por la producción de fragmentos de 4,8, 0,66 y 0,31 kb después de la digestión con NgoMI más SpeI y la producción de fragmentos de 3,3, 1,0, 0,82 y 0,67 kb tras la digestión con NgoMI más NcoI.

El plásmido pD17 se derivó de pD16 por digestión con BstII y NheI y llenando los extremos usando polimerasa de Klenow. La mezcla de reacción se auto-ligó y se usó para transformar DH5a de E. coli competente. Esta etapa eliminó el sitio NheI del poliligador de linealización y fue importante para una etapa posterior en la construcción de pD17-hGla y pD17-hK8.HI I descritos después.

C. Construcción del vector de expresión de la cadena ligera

El vector de expresión para la cadena ligera de 106 humanizado se construyó en dos fases. Primero, el casete de expresión de la cadena ligera que contenía el gen CK humano se construye y esto va seguido de la construcción del vector de expresión de la cadena ligera completo pD16-hK8.L1 (Figura15).

Brevemente, un fragmento EcoRI de 2,9 kb se aisló de pGk.II (Walls y col., 1993. Nucl. Acid. Res. 21:2921-2929) y éste se ligó en el plásmido pD13 (descrito anteriormente) previamente digerido con EcoRI. Esta construcción (pD13hCka) que contenía las secuencias del exón de CK humano y del intrón flanqueantes se usó para transformar DH5a de E. coli y el producto correcto se confirmó por digestión por restricción. La digestión con EcoRI produjo fragmentos de 5,7, 2,8 y 0,3 kb y la digestión con SacI produjo fragmentos de 7,1, 1,1 y 0,5 kb.

La construcción del casete de expresión de la cadena ligera se completó eliminando el fragmento CK junto con las secuencias flanqueantes del poliligador de pD13 e insertándolas en pD16. El plásmido pD13-hCka se digirió con Asp718I y Bsp120I para liberar el fragmento de CK y las secuencias del poliligador. Se usaron las mismas enzimas para linealizar pD16 y el fragmento que contenía CK se ligó en pD16 para formar pD16-hCka. Tras la transformación de DH5a de E. coli y amplificación, la construcción correcta se confirmó por la liberación del fragmento de 2,9 kb tras la digestión con Asp7181 y Bsp120I y linealización tras la digestión con una enzima de restricción presente en pD16, pero no pD13. La secuencia de nucleótidos también se confirmó por la secuenciación de diversas regiones de la construcción.

En la segunda fase de la construcción del vector de expresión de la cadena ligera, una secuencia de oligonucleótidos que codifica un péptido señal y la secuencia de h106Vk se ensambló y se insertó en sitios EcoRV y XhoI de pD16-hCka. La secuencia de oligonucleótidos que codifica la secuencia señal y la secuencia de h106Vk se ensambló por PCR SOEing (corte y empalme por reacciones de extensión por solapamiento) (Ho, S.N. y col., 1989, Gene 77:51-59) usando el clon 10 de hu106VL como molde y los cebadores LH9 (SEC ID Nº 66), LH10 (SEC ID Nº 67), LH11 (SEC ID Nº 68) y LH12 (SEC ID Nº 69). En combinación, los cebadores LH9, LH10 y LH11 codifican un sitio de restricción EcoRV, un péptido señal y el extremo 5' de hu106Vk. El cebador LH12 codifica JK, secuencias del intrón, y un sitio de restricción XhoI. La construcción completa se usó para transformar DH5a de E. coli competente por recombinación homóloga (Babek y col., 1993, Nucl. Acids Res. 21:3601-3602). El ADN de plásmido de colonias se cribó por PCR para la presencia de un inserto de 441 pb tras la digestión con Asp718I y XhoI.

La construcción final del plásmido se representa en la Figura 15 y se confirmó adicionalmente por la secuenciación del inserto de la región V entera y algunas de las regiones flanqueantes. Los clones que contenían los tamaños de fragmento correctos se designaron pD16-hK8.L1A, pD16-LK8.L1B, pD16-hK8.L1C. La secuenciación del clon pD16-hK8.L1A descubrió una mutación en la secuencia de nucleótidos del clon que no pareció alterar la capacidad de la secuencia para expresar proteína y produjo cadenas ligeras maduras. La secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID Nº 76) y la secuencia de residuos de aminoácidos (SEC ID Nº 77) se representan en la Figura 16. La mutación cambió la secuencia señal de metionina de iniciación a ATC, pero hay otra metionina codificada por dos codones de aminoácidos en la dirección 3' (Figura 16).

D. Construcción del vector de expresión de la cadena pesada

Los vectores de expresión para la cadena pesada del anticuerpo completo humanizado 106 también se construyeron en dos fases. En la primera fase, el ADN que codifica los exones para CH1, CH2 y CH3 de la región constante gamma I humana se insertaron en pD17. En la segunda fase, las regiones variables del anticuerpo monoclonal 106 se ensamblaron y se ligaron en el vector que contenía las secuencias para las regiones constantes de la cadena pesada.

Usando pNy1.12 (Walls y col., 1993, Nucl. Acid. Res. 21:2921-2929) como molde, el gen gamma I humano se amplificó por PCR usando los cebadores LH13 (SEC ID Nº 70) y LH14 (SEC ID Nº 71). El cebador de sentido directo (LH13) contuvo un sitio ClaI, para la clonación en pIC20R, seguido de las secuencias del dominio y1 5' CH1 humano. Los nucleótidos que codifican los dos primeros residuos de aminoácidos (alanina y serina) se mutaron de forma que codificaran un sitio de restricción Nhel (GCTAGC). LH14, el cebador de sentido contrario, tuvo un único BstEII en CH 1, seguido de un sitio Xhol para la clonación en pIC20R. El fragmento de PCR de 0,2 kb y pIC20R (previamente digerido con ClalI y XhoI) se trataron brevemente con exonucleasa III y se usaron en la transformación de DH5a de

E. coli. Las colonias que contenían insertos se determinaron por PCR y la secuencia de ADN se verificó. El plásmido resultante se designó pIC-hGINhe.Bst.

Las porciones restantes del gen de inmunoglobulina gamma 1 genómica humana se insertaron en el casete de expresión digiriendo pNg1.16 (Walls y col., arriba) con HindIII y BamHI. El sitio HindIII está justamente 5' de CH1, mientras que el sitio BamHI está 3' del dominio CH3. plC-hGlNhe.Bst se digirió con HindIII y BamHI y se ligó con el fragmento HindIII-BamHI de pNg1.16. La transformación produjo un plásmido que lleva el extremo 5' del gen gamma I seguido del gen gamma I completo. Esto se confirmó por la liberación de fragmentos de 3,1 y 2,6 kb cuando el plásmido se digirió con EcoRI.

La porción repetida del gen gamma 1 se eliminó por digestión con BstEII, auto-ligación del plásmido y transformación. La deleción de la repetición se confirmó por secuenciación de ADN de las regiones alrededor del sitio BstEII. El vector resultante, designado pIC-hGINhe.Bam, contiene el gen gamma 1 humano que empieza en el codón I (con un sitio NheI artificial) hasta el sitio BamHI 3' del dominio CH3 de gamma 1 humano.

Entonces, pIC-hGINhe.Bam se digirió con NheI y BamHI para liberar el inserto de gamma 1. El inserto de gamma 1 se ligó en pD13 (descrito anteriormente), que había sido previamente digerido con NheI y BamHI, y se usó para transformar DH5a de E. coli. El producto correcto designado pD13.hG1a se confirmó por la producción de fragmentos de 5,1 y 3,25 kb después de la digestión con Bg/II y la producción de fragmentos de 3,55, 3,25 y 1,54 kb después de la digestión con BglII y BamHI.

El casete de expresión designado pD17-hG1a se construyó a partir de pD13-hG1a digiriendo pD13-hG1a con Asp718I y BamHI y aislando el fragmento de 2,7 kb. Este fragmento contiene el gen gamma 1 humano y secuencias flanqueantes del poliligador. Se usaron bacterias DM I (Dam.) para amplificar pD17 y el plásmido aislado se digirió con Asp718I y BclI dando un fragmento de vector de 5,6 kb. El fragmento que codifica gamma 1 humana de 2,7 kb se ligó en el fragmento de vector aislado y se usó para transformar DH5a de E. coli competente y la construcción apropiada se confirmó por la liberación de fragmentos de 7,13 y 1,26 kb tras la digestión con BstEII.

La construcción del vector de expresión de la cadena pesada se completó insertando un fragmento de PCR que codifica un péptido señal y la secuencia de h106Vh, ASY, en los sitios NheI y XhoI de pD17-hG1a. El fragmento de PCR se construyó por extensión por solapamiento por corte y empalme usando VHASY 24-17 (hhh) como molde y los cebadores LH15 (SEC ID Nº 72), LH16 (SEC ID Nº 73), LH17 (SEC ID Nº 74) y LH18 (SEC ID Nº 75). En combinación, los cebadores LH15, LH16 y LH 17 codifican un sitio de restricción EcoRV, un péptido señal y el

5 extremo 5' de h106 VK. El cebador LH16 codifica la porción JH del gen de la cadena pesada variable por un sitio Nhel artificial en el extremo 5' del dominio CH1. Esta construcción no proporciona intrón entre los dominios JH y CH1. Las reacciones de PCR se repitieron con los dos cebadores externos (LH15 y LH18) para garantizar un producto de longitud completa. Los cebadores externos también proporcionaron suficiente solapamiento con las secuencias del vector en la región diana del vector para permitir la clonación por recombinación homóloga.

10 Para insertar el fragmento de PCR en pD17-hG1a, EcoRV y NheI se usaron para linealizar el vector y los fragmentos se ligaron y se usaron para transformar DH5a de E. coli competente por recombinación homóloga (Babeck y col., 1993, Nucl. Acids. Res. 21:3601-3602). La presencia de un inserto se determinó por PCR y la secuenciación de la región variable. La Figura 17 es una representación de la construcción final para pD17-hK8.H1. La secuenciación de ADN se llevó a cabo para el inserto y las regiones flanqueantes para confirmar el producto final. Las secuencias de

15 ácidos nucleicos (SEC ID Nº 78) y de residuos de aminoácidos (SEC ID Nº 79) para las regiones secuenciadas se representan en la Figura 18.

También se construyeron otras dos construcciones que contenían codones que codificaban los residuos de aminoácidos murinos en las posiciones 24, 55 y 56 (pD17-hK1.H1) de la región variable de la cadena pesada y los residuos de aminoácidos humanos en las posiciones 24 y 56 y el residuo de aminoácido murino en la posición 55

20 (pD17-hK6.H1). Las construcciones se llevaron a cabo de la misma forma que se ha descrito anteriormente para pD17-hK8.H1, excepto que se usaron los moldes de PCR VHTDS 15-34 (mmm) y VHADY 7-8 (hmh), respectivamente.

TABLA 14

Cebadores usados en la construcción del anticuerpo monoclonal humanizado 106

LH1 - 5' cebador para linealizar el sitio poliligador en la dirección 5' del promotor del CMV

5'-GATCTGCTAGCCCGGGTGACCTGAGGCGCGCCTTTGGCGCC-3' SEC ID Nº58

LH2 - 3' cebador para linealizar el sitio poliligador en la dirección 5' del promotor del CMV escrito en la orientación 3' a 5'

3'-ACGATCGGGCCCACTGGACGCCGCGCGGAAACCGCGGCTAG-5' SEC ID Nº59

LH3 - 5' cebador para la secuencia de terminación de la transcripción de histona H3

5'-CCGGGCCTCTCAAAAAAGGGAAAAAAAGCATG-3' SEC ID Nº60

LH4 - 3' cebador para la secuencia de terminación de la transcripción de histona H3

3'-CGGAGAGTTTTTTCCCTTTTTTTC-5' SEC ID Nº61

LH5 - 5' cebador para la secuencia de terminación de la transcripción de gastrina

LH6 - 3' cebador para la secuencia de terminación de la transcripción de histona H3

LH7 - poliligador de clonación para pD13

LH8 - poliligador de clonación para pD13

(continuación) Cebadores usados en la construcción del anticuerpo monoclonal humanizado 106

LH9 - región del péptido señal del cebador de sentido directo hu106VL

LH10 - región del péptido señal del cebador de sentido contrario hu106VL

LH11 - región del péptido señal del cebador de sentido directo hu 106VL

LH12 - cebador de sentido contrario hu106VL, intrón JK y de 3'

LH13 - cebador de sentido directo para el fragmento NheI a BstEII del gen gamma 1 humano, sitios ClaI y NheI subrayados

LH14 - cebador de sentido contrario para el fragmento NheI a BstEII del gen gamma 1 humano, sitios XhoI y BstEII subrayados 5' AGCTTTCGCGAGCTCGAG GGTCACCACGCTGCTGAGGGA SEC ID Nº71 LH15 - cebador de sentido directo para la región del péptido señal hu106VH

LH16 - cebador de sentido contrario para la región del péptido señal hu106VH

LH17 - cebador de sentido directo para la región del péptido señal hu106VH

LH18 - cebador de sentido contrario hu106VH, región JH-CH1

(continuación) Cebadores usados en la construcción del anticuerpo monoclonal humanizado 106

Ejemplo 14

Prueba de anticuerpo monoclonal humanizado 106 para actividad biológica

En este ejemplo, las tres formas del anticuerpo monoclonal humanizado 106 se produjeron por expresiones

5 transitorias de células COS. Los anticuerpos se probaron para (1) inhibición de la proliferación de linfocitos B, (2) producción de anticuerpos por linfocitos B activados estimulados por linfocitos T y (3) inducción de la expresión de E-selectina sobre células endoteliales.

La transfección en células COS se llevó a cabo como se describe previamente (Linsley y col., 1991. J. Exp. Med. 173:721-730; Aruffo y Seed, 1987. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:8573-8577). Se añadió ADN de plásmido a medios 10 de transfección a 1 μg/ml en un volumen total de 12 ml/placa de 150 mm. Después de siete a 10 días, el medio de cultivo se recogió, se centrifugó para clarificarlo y se pasó sobre una columna de proteína A-Sepharose como se ha descrito anteriormente. Entonces, la columna se lavó con PBS y el anticuerpo unido se eluyó con citrato de sodio 0,05 M, pH 30. Las fracciones se neutralizaron, se reunieron y se dializaron contra PBS frío. El eluato dializado se concentró usando un concentrador Centriprep (Amersham) y la concentración de proteína se determinó por

15 absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción de 1,35 m/mg-1cm-1.

La inhibición de la proliferación de linfocitos B por gp39 soluble (sgp39) y anti-IgM humana se determinó cultivando 5 x 105 células tonsilares humanas en reposo en presencia de sgp39, inmunoperlas de conejo anti-IgM humana y cantidades variables del anticuerpo monoclonal humanizado 106 en placas de 96 pocillos durante 72 horas a 37ºC, 6% de CO2. Entonces, las placas se pulsaron con 1 μCi/pocillo de [3H]-timidina durante 18 horas y se determinó la 20 incorporación de [3H]. Todas las pruebas se realizaron por triplicado y los resultados se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con cultivos mantenidos en medio de cultivo solo. Como se observa en la Figura 19, las tres construcciones de anticuerpo completo humanizado del anticuerpo monoclonal 106 pudieron inhibir la estimulación de la proliferación de linfocitos B por gp39 soluble y anti-IgM humana. La construcción que contenía los residuos de aminoácidos de la secuencia murina en las posiciones 24, 55 y 56 fue la más similar al anticuerpo 106

25 murino original.

La producción de anticuerpos por linfocitos B periféricos humanos estimulados con linfocitos T activados se probó como se ha descrito anteriormente. Brevemente, células mononucleares de sangre periférica humanas se agotaron en monocitos y linfocitos citolíticos espontáneos y luego se separaron en linfocitos T y linfocitos B por roseteado E. Los linfocitos T aislados se trataron con mitomicina C y luego se co-cultivaron con linfocitos B en pocillos recubiertos

30 con anticuerpo monoclonal anti-CD3 de una placa de 96 pocillos en presencia de concentraciones variables de las diferentes formas de anticuerpos monoclonales humanizados 106. Todas las pruebas se ejecutaron por triplicado y los resultados se expresan como porcentaje de inhibición en comparación con cultivos que contenían medio que no contenían ningún anticuerpo monoclonal anti-gp39.

Como puede apreciarse en la Figura 20, todos los anticuerpos pudieron bloquear al menos parcialmente la

35 capacidad de linfocitos T activados para estimular la producción de anticuerpos por linfocitos B. Ninguno de los anticuerpos humanizados fue tan capaz como el anticuerpo monoclonal murino anti-gp39 106 en bloquear la producción de anticuerpos. El anticuerpo que tiene residuos de aminoácidos murinos en las posiciones 24, 55 y 56, h106-2, fue el más satisfactorio.

Las construcciones de anticuerpo completo humanizado también se probaron para su capacidad para prevenir la

40 inducción de la expresión de E-selectina sobre células endoteliales por una línea de linfocitos T de gp39. Como se ha descrito anteriormente, excepto que se co-cultivaron células endoteliales de la vena umbilical humana con células BMS-2 (una línea de Jurkat conocida por expresar constitutivamente gp39) en lugar de sgp39, en presencia de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-gp39. Después de cuatro horas, el nivel de la expresión de E-selectina se midió por ELISA. Figura 21.

45 Los resultados para este ensayo, como con los ensayos previos, demuestran que todas las construcciones de anticuerpo completo humanizado preparadas inhibieron la interacción entre gp39 y CD40 previniendo, en este caso, la inducción de la expresión de E-selectina sobre células endoteliales por linfocitos T activados. Por tanto, como se demuestra por los ensayos anteriores, la construcción que tiene residuos de aminoácidos murinos en las posiciones 24, 55 y 56, h106-2, fue la más similar al anticuerpo monoclonal murino parental 106.

50 Depósitos de líneas celulares

Las siguientes líneas celulares de hibridoma se depositaron en la Colección americana de cultivos tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Mariland 20852-2776, EE.UU., bajo los términos del Tratado de Budapest.

Hibridoma

Designación de la ATCC

39-1.29

HB 11808

39-1.132

HB 11809

39-1.134

HB 11810

39-1.106

HB 11811

39-1.7

HB 11812

39-1.37

HB 11813

39-1.77

HB 11814

39-1.59

HB 11815

39-1.122

HB 11816

39-1.156

HB 11817

39-1.128

HB 11818

39-1.124

HB 11819

39-1.26

HB 11820

39-1.138

HB 11821

39-1.3

HB 11822

39-7.3E12

HB 11823

39-5.6E9

39-9.246

39-9.11

39-9.274

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo, que es específico para gp39 humana, en el que el anticuerpo es el secretado por el hibridoma 39-1.7 designado ATCC HB 11812, 39-1.128 designado ATCC HB 11818 ó 39-1.26 designado ATCC HB 11820.

2. 2.

   El fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en el que el fragmento se deriva del anticuerpo secretado por el hibridoma 39-1.7 designado ATCC HB 11812, 39-1.128 designado ATCC HB 11818 ó 39-1.26 designado ATCC HB 11820.

3. 3.

   El fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en el que el fragmento es Fab, F(ab1)2 o Fv.

4. 4.

   La proteína de unión recombinante de la reivindicación 1, en la que la proteína es sFv, un anticuerpo humanizado

   o una proteína recombinante que comprende una región variable de un anticuerpo de la reivindicación 1.
5. 5. Un procedimiento in vitro para la detección de síndrome hiper-IgM ligado a X que comprende:

   (a)

   linfocitos de sangre periférica aislados proporcionados de un paciente;

   (b)

   activar los linfocitos de sangre periférica aislados;

   (c)

   fijar y permeabilizar los linfocitos de sangre periférica aislados y activados,

   (d)

   mezclar un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 con los linfocitos de sangre periférica activados, fijados y permeabilizados;

   (e)

   detectar el anticuerpo unido a las células.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo está conjugado con una marca detectable.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el procedimiento comprende además la etapa de añadir un anticuerpo secundario marcado específico para el primer anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo, después de la etapa (d).

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la marca es un fluoróforo, isótopo radiactivo, enzima o cromóforo.

9. 9.

   Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con marcador detectable.

10. 10.

    Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el marcador detectable es un fluoróforo, isótopo radiactivo, enzima

    o cromóforo.

11. 11.

    Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo está conjugado con un agente terapéutico.

12. 12.

    Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante de la reivindicación 11, en el que el agente terapéutico es un radioisótopo, una toxina o un agente quimioterapéutico.

13. 13.

    La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína de unión recombinante comprende una región variable que puede unirse al antígeno y una toxina de proteína o agente terapéutico en forma de una proteína de fusión.

14. 14.

    Hibridoma HB 11812, HB 11818, HB 11820 como el depositado en la Colección americana de cultivos tipo.

15. 15.

    Una secuencia de ácidos nucleicos aislada y purificada que codifica una cadena ligera de la inmunoglobulina variable que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de SEC ID Nº 16.

16. 16.

    La secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 15, en la que la secuencia de ácidos nucleicos es la de SEC ID Nº 15.

17. 17.

    Una secuencia de ácidos nucleicos aislada y purificada que codifica una cadena pesada de la región variable de la inmunoglobulina que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de SEC ID Nº 18.

18. 18.

    La secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 17, en la que la secuencia de ácidos nucleicos es la de SEC ID Nº 17.

19. 19.

    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. 20.

    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con un marcador detectable y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. 21.

    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o

    5 fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con un agente terapéutico y un agente farmacéuticamente aceptable.
22. 22. Un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con un marcador detectable para su uso en la obtención de imágenes de células que expresan gp39 sobre su superficie en un paciente que comprende:

    10 (a) administrar a un paciente una composición farmacéutica de la reivindicación 20 en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión proteína/antígeno sobre la superficie de las células que expresan gp39; y

    (b) detectar la presencia del complejo de unión proteína/antígeno sobre la superficie de las células como se indica por la presencia del marcador detectable.