PL180609B1 - Zwiazek L-walinian2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-1-propanylu, sposób jego wytwarzania oraz zawierajace go kompozycje farmaceutyczne PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1 . Zwiazek, L-walinian 2-(2-amino-1 ,6-di- hydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydro- ksy-1-propanylu albo jego farmaceutycznie do- puszczalna sól, w postaci diastereomerów (R) albo (S), albo w postaci mieszanin tych dwóch diaste- reomerów. Wzór 1 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest L-walinian 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu, sposób jego wytwarzania oraz zawierające go kompozycje farmaceutyczne.

Wynalazek dotyczy nowego leku przeciwwirusowego, zwłaszcza aminokwasowego estru pochodnej puryny, a w szczególności estru pochodzącego od gańcieloviru i L-waliny, oraz jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli. Wynalazek dotyczy także związków pośrednich, syntetycznych sposobów wytwarzania związku-leku przeciwwirusowego, zawierających go kompozycji farmaceutycznych mających zastosowanie do leczenia przeciwwirusowego i związanych z tym chorób.

Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy estru L-mono-walinowego pochodzącego od 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l,3-propano-diolu oraz jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Brytyjski opis patentowy nr 1523865 opisuje przeciwwirusowe pochodne puryny o acyklicznym łańcuchu w pozycji 9. Wśród tych pochodnych 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-l,6-dihydro-puryn-9-ylo)-metoksy-etanol o ΪΝΝ-nazwie acyclovir wykazuje dobrą aktywność przeciwko wirusom opryszczki, takiej jak opryszczka zwykła. Chociaż acyclovir okazał się bardzo skuteczny przy podawaniu miejscowym lub pozajelitowym, to jest tylko umiarkowanie absorbowany podczas podawania doustnego.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4355032 opisuje związek 9-[(2-hydroksy-l-hydroksymetylo-etoksy)-metylo]-guaninę albo 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l,3-propanodiol o INN-nazwieganciclovir. Ganciclovir jest wysoce skuteczny przeciwko wirusom z rodziny opryszczki, na przykład wobec opryszczki zwykłej i wirusa cytomegalii. Wykazuje on stosunkowo niski stopień absorpcji przy podawaniu doustnym i na tej drodze musi być stosowany w wysokich dawkach. Ganciclovir podaj e się zazwyczaj drogą dożylnej infuzji. Ten sposób podawania ma tę wadę, że jest bardzo niewygodny dla pacjenta, często wymaga usług lekarza, pielęgniarki lub innych profesjonalistów ochrony zdrowia. Występuje tu też pewne ryzyko infekcji, które jest szczególnie problematyczne dla pacjentów, z obniżoną odpornością, którzy sątraktowani ganciclovirem i mogą mieć małą odporność wobec infekcji. W związku z tym jest wysoce pożądane, aby uzyskać ganciclovir o polepszonym profilu absorpcji doustnej.

Brytyj ski opis patentowy GB 2122618 opisuj e pochodne 9-(2-hydroksyetoksymetylo)-guaniny o ogólnym wzorze 7, w którym X oznacza atom tlenu lub siarki, R¹ oznacza grupę hydroksylową lub aminową R² oznacza atom wodoru albo grupę o wzorze -CH2OR³a, a R³ i R³a mogą być jednakowe lub różne i oznaczaj ągrupę acylową aminokwasu, oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole. Związki te można stosować do leczenia infekcji wirusowych i wykazująone wysoką rozpuszczalność w wodzie, co jest cenne przy sporządzaniu wodnych preparatów farmaceutycznych. Chociaż wzór ogólny brytyjskiego opisu patentowego obejmuje związki, w których R² oznacza grupę -CH2OR³ _a, specyficzne związki z tej grupy nie są ujawnione. Ten opis patentowy podaj e również, że preparaty z zastosowaniem tych związków o polepszonej rozpuszczalności w wodzie obejmują preparaty doustne, doodbytnicze, donosowe, miejscowe, dopochwowe lub pozajelitowe.

Brytyjski opis patentowy GB 2104070 opisuje przeciwwirusowe związki o wzorze 8, w którym R oznacza grupę hydroksylową lub aminową a X oznacza atom tlenu lub siarki, oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole i estry. Ten wzór ogólny obejmuje ganciclovir oraz jego farmaceutycznie dopuszczalne sole i estry. Estry obejmują związki zawierające grupę formyloksylową estrową grupę C;.₁₆ (na przykład C|.₆)-alkanoiloksylową (np. acetoksylową lub propionyloksylową), ewentualnie podstawioną grupę aralkanoiloksylową (np. grupę feny

ISO 609 lo-C_M-alkanoiloksylową taką jak grupa fenyloacetoksylowa) albo ewentualnie podstawioną grupę aroiloksylową (np. grupę benzoiloksylową lub naftoiloksylową) przy jednej lub obydwu końcowych pozycjach łańcucha bocznego w położeniu 9 związku o powyższym wzorze ogólnym. Wyżej wymienione aralkanoiloksylowe albo aroiloksylowe grupy estrowe mogą być podstawione, na przykład przez jeden lub więcej atomów chlorowca (np. atomów chloru lub bromu), albo przez grupy aminowe, nitrylowe albo sulfamidowe, a grupa arylowa tych reszt korzystnie zawiera 6-10 atomów węgla.

Europejskie zgłoszenie patentowe, publikacja nr 375329, opisuje związki prodrug o wzorze 9, w którym R i R¹ są niezależnie wybrane spośród atomów wodoru i grup aminoacylowych, przy czym co najmniej jeden z podstawników R i R¹ oznacza acylowągrupę aminokwasu, a B oznacza grupę o wzorze 10 lub 11, w której R² oznacza C ^-prostą C₃.₆-rozgałęzionąalbo C₃.₆-cykliczną grupę alkoksylową albo grupę hydroksylową lub aminową albo atom wodoru, oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole. Te związki prodrug wykazują korzystną biodostępność przy podawaniu drogą doustną co skutkuje wysokim poziomem związku macierzystego w organizmie.

Przykład 3b) europejskiego opisu patentowego, publikacja nr 375329, opisuje wytwarzania bis-(L-izoleucynowego) estru gancicloviru w postaci białej piany. Przykład 4b) opisuje wytwarzanie bis-(glicynowego) estru gancicloviru w postaci białej substancji stałej. Przykład 5b) opisuje wytwarzanie bis-(L-walinowego) estru gancicloviru w postaci substancji stałej. Przykład 6b) opisuje wytwarzanie bis-(L-alaninowego) estru gancicloviru w postaci syropu zawierającego 90% bis-estru i 10% monoestru. Opisane bis-estry są substancjami nie-krystalicznymi, które są trudne do obróbki przy wytwarzaniu doustnych farmaceutycznych postaci do dawkowania.

Brytyjski opis patentowy nr 8829571 opisuje aminokwasowe estry związków o wzorze 12, w którym R oznacza grupę hydroksylową lub aminową albo atom wodoru, oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole. Jako przykłady korzystnych aminokwasów wymienia się kwasy alifatyczne, np. zawierające do 6 atomów węgla, takie jak glicyna, alanina, walina i izoleucyna. Estry aminokwasów obejmują zarówno mono- jak i diestry. Jednakże to zgłoszenie patentowe, jak również europejskie zgłoszenie patentowe, publikacja nr 375329 oraz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5043339 nie ujawniają wytwarzania monoestró w, a tym bardziej jakichkolwiek danych sugerujących ich zastosowanie.

Jensen i inni, Acta Pharm. Nord. 3(4) 243-247 (1991) opisują syntezę, enzymatyczną hydrolizę i właściwości fizykochemiczne N-podstawionych 4-(aminometylo)-benzoesanowych diestrowych związków prodrug gancicloviru o wzorze 13, w którym R może oznaczać grupę o wzorze 14, 15, 16 i 17.

Estry te wytwarza się i ocenia za pomocą ulepszonych charakterystyk gancicloviru. Estry ulegaj ąhydrolizie enzymatycznej w osoczu ludzkim do leku macierzystego, przy czym hydroliza przebiega poprzez utworzenie odpowiedniego monoestru. Autorzy oceniają te estry pod kątem ich stopnia enzymatycznej hydrolizy, lipofdności i stwierdzają że właściwości tych estrów czynią diestry obiecującym typem prodrug dla gancicloviru w celu podwyższenia jego charakterystyki dla np. podawania pozajelitowego.

Martin i inni, J. Pharm. Sci, 76(2), 180-184 (1987) opisująmono- i diacylowe estry gancicloviru, które poddaj e się testowaniu w celu zbadania ich biodostępności po podaniu doustnym. Autorzy wskazują że ester dipropionianowy wykazuje około 42% wyższą biodostępność niż sam ganciclovir.

Europejskie zgłoszenie patentowe, publikacja nr 158847, podaje między innymi, że 6-dezoksy-acyclovir i 6-dezoksyganciclovir można łatwo przeprowadzać in vivo za pomocą enzymów odpowiednio w acyclovir i ganciclovir. Na podstawie doświadczeń na szczurach wynalazcy stwierdzają że w wyniku doustnego podawania tych 6-dezoksy-prodrug uzyskuje się skuteczną absorpcję z układu żołądkowo-j elitowego oraz wysoki poziom w osoczu macierzystych leków.

Maudgal i inni, Arch. Ophthalmol. 102,140-142 (1984) ujawniają że ester glicyny acycloviru j est skuteczny w miej scowym leczeniu nabłonkowego i zrębowego opryszczkowego zapale

180 609 nia rogówki i związanego z tym zapalenia tęczówki, w przypadku podawania królikom w postaci 1% preparatu kropli do oczu. Autorzy ujawniają estry glicyno we, alanino we, β-alaninowe i sukcynilowe acycloviru i wskazują, że rozpuszczalność estru glicynowego jest około 30-krotnie większa niż rozpuszczalność samego acycloviru, co pozwala na stosowanie estru glicynowego kroplach do oczu o stężeniach do 6%, podczas gdy sam acyclovir stosuje się jako maść, którajest zaledwie skuteczna w chorobie zrębowej lub zapaleniu tęczówki.

Colla i inni, J. Med. Chem. 98, 602-604 (1983) opisują szereg rozpuszczalnych w wodzie estrowych pochodnych acycloviru oraz ich soli jako związków prodrug acycloviru. Autorzy wskazują, że acycloviru nie można stosować w postaci kropli do oczu albo iniekcji domięśniowych ze względu na jego ograniczoną rozpuszczalność w wodzie i w związku z tym zsyntetyzowali pochodne acycloviru, które są lepiej rozpuszczalne w wodzie niż związek macierzysty. Autorzy opisują chlorowodorek estru glicylowego, chlorowodorek estru alanylowego, chlorowodorek estru β-alanylowego, sól sodową estru sukcynylowego i ester azydooctanowy. W testach na pierwotnych kulturach komórkowych nerek królika wobec różnych szczepów wirusa. opryszczki zwykłej typu 1 i typu 2, według autorów, pierwsze cztery estry okazywały się prawie tak aktywne jak sam acyclovir. Autorzy sugerują, że te estry acycloviru powinny być bardziej praktyczne w zastosowaniu klinicznym niż związek macierzysty do miejscowego traktowania w postaci kropli do oczu i do systemicznego traktowania infekcji wirusem opryszczki, co dobrze odpowiada dożylnemu leczeniu acyclovirem. W przeciwieństwie do acycloviru, estry te można podawać w znacznie mniej szych obj ętościach i w związku z tym drogąiniekcj i domięśniowych.

Beauchamp i inni, Antiviral Chemistry and Chemotherapy 3, 157-164 (1992) opisują 18 aminokwasowych estrów przeciwopryszczkowego leku acyclovir i ich skuteczności jako substancji prodrug acycloviru, co ocenia się na szczurach drogąpomiaru odzysku acycloviru w moczu. Dziesięć substancji prodrug wytwarzało większe ilości leku macierzystego w moczu niż sam acyclovir: a mianowicie ester glicylowy, D,L-alanylowy, L-alanylowy, L-2-aminomasłowy, D,L-walilowy, L-waliło wy, DL-izoleucylowy, L-izoleucylowy, L-metionylowy i L-prolilowy. Estry L-aminokwasów są lepszymi substancjami prodrug niż odpowiednie izomery D albo D,L, sugerując udział stereoselektywnego transportera. Z tablicy 1 tej publikacji, która podaje dane chemiczne i doustną biodostępność osiemnastu estrów aminokwasowych, wynika, że estry D-aminokwasów wykazują niższą doustną biodostępność niż sam acyclovir. Tak więc, ponieważ estry D-aminokwasów nie wykazują korzyści w porównaniu z acyclovirem, nie są one użyteczne jako substancje prodrug acycloviru. Jednak achiralny ester glicylowy acycloviru wykazuje wyższądoustnąbiodostępność niż acyclovir (w próbie odzysku w moczu odzyskuje się 30% acycloviru dawkowanego jako ester glicylowy, podczas gdy przy podawaniu acycloviru odzyskuje się 19% acycloviru). Według autorów L-waliłowy ester acycloviru był najlepszą substancją prodrug spośród zbadanych estrów.

Europejskie zgłoszenie patentowe, publikacjanr 308065, opisuje estry waliny i izoleucyny acycloviru, korzystnie w postaci L, jako wykazujące duży wzrost w absorpcji z jelita po podaniu doustnym w porównaniu z innymi estrami i acyclovirem.

Obecnie wiodącym lekiem w leczeniu infekcji wirusem cytomegalii jest ganciclovir. Jednakże jego bardzo ograniczona doustna biodostępność i konieczność powolnej codziennej dożylnej infuzji leku (albo śródszklistkowych iniekcji lub implantów) wskazuje na pilną potrzebę znalezienia doustnej postaci do dawkowania o polepszonej biodostępności.

Wynalazek dotyczy trwałych prodrugowych preparatów gancicloviru o polepszonej absorpcji doustnej i niskiej toksyczności. Cechy takie są w szczególności cenne dla zwalczania infekcji opryszczkowych u pacjentów o obniżonej odporności, gdzie podawanie doustne jest terapeutycznie korzystnym wyborem. Dodatkowo substancje czynne wykazują farmakopealne właściwości, które pozwalająna ich ulepszoną charakteryzację i postępowanie farmaceutyczne. Nieoczekiwanie stwierdzono, że L-monowalinowy ester gancicloviru oraz jego farmaceutycznie dopuszczalne sole wykazują pożądane właściwości.

180 609

W pierwszym aspekcie, wynalazek dotyczy związku o wzorze 1 oraz jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Związek nosi nazwę L-walinian 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l -propanylu albo mono-L-walino-ganciclovir.

W drugim aspekcie, wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, która zawiera mono-L-walinowy ester gancicloviru albo jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub diastereomer, korzystnie w mieszaninie z jednym lub więcej odpowiednimi podłożami lub nośnikami, do stosowania w leczeniu przeciwwirusowym i związanych z tym chorób.

W trzecim aspekcie, wynalazek dotyczy sposobu leczenia lub zapobiegania w przypadku infekcji wirusowych lub chorób pokrewnych, który polega na podawaniu mono-L-walinowego estru gancicloviru albo jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli albo kompozycji je zawierającej osobnikowi wymagającemu takiego leczenia lub zapobiegania.

W czwartym aspekcie, wynalazek dotyczy związków, które są użytecznymi związkami pośrednimi do wytwarzania mono-L-walino-gancicloviru i jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli o wzorze 2, w którym P¹ oznacza grupę hydroksyochronną, a P² oznacza grupę aminoochronną.

Piątym aspektem wynalazku jest sposób wytwarzania pródrugOwego związku według wynalazku oraz jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Sposób teń obejmuje estryfikację gancicloviru i jego pochodnych, usuwanie grup ochronnych od gancicloviru zestryfikowanego L-waliną, częściową hydrolizę bis-L-walinowego estru gancicloviru do estru mono-L-walinowego o wzorze 1, kondensację guaniny z podstawioną gliceryną, optyczny rozkład związku o wzorze 1 i utworzenie soli substancji prodrug o wzorze 1. Szczegóły procesu opisane sąponiżej.

Jeśli nie podano inaczej, następujące terminy stosowane w opisie i zastrzeżeniach mają znaczenie niżej podane:

„Alkil” oznacza prostą lub rozgałęzioną nasyconą grupę węglowodorową o liczbie atomów węgla od jednego do podanej liczby atomów węgla. Na przykład C].₇-alkil oznacza grupę alkilową zawierającą co najmniej jeden, lecz nie więcej niż siedem atomów węgla, np. metyl, etyl, izopropyl, n-propyl, b-butyl, n-pentyl, n-heptyl i tym podobne.

„Niższy alkil” oznacza grupę alkilową o 1-6 atomach węgla.

„Aryl” oznacza grupę organiczną pochodzącą od aromatycznego węglowodoru przez usunięcie jednego atomu wodoru. Korzystne grupy arylowe zawierają6-l 2 atomów węgla jako pierścieniowe atomy węgla w aromatycznym węglowodorze.

„Aralkil” oznacza grupę organiczną pochodzącą od aralkanu, w której atom wodoru grupy alkilowej jest podstawiony przez wyżej określoną grupę arylową.

„Acyl” oznacza grupę organiczną pochodzącą od kwasu organicznego przez usunięcie grupy hydroksylowej, np. CH₃CO- jest grupą acylową od CH₃COOH, albo acetyl. Innymi przykładami dla takich grup acylowych sąpropionyl, albo benzoil i tym podobne. Termin „acyl” obejmuje termin „alkanoil”, który jest grupą organiczną RCO-, w której R oznacza grupę alkilową, jak wyżej podano.

„Grupa niż.alkoksylowa”, „grupa (niż.alkilo)-aminowa”, „grupa di-(niż.alkilo)-aminowa”, „grupa (niż.alkanoilo)-aminowa” i podobne określenia oznaczają grupy alkoksylowe, alkiloaminowe, dialkiloaminowe, alkanoiloaminowe itp., w których grupa alkilowa lub każda grupa alkilowa oznacza „niższą grupę alkilową”, jak wyżej opisano.

„Chlorowiec” oznacza fluor, chlor, brom lub jod.

Zgodnie z Hackh's Chemical Dictionary, McGraw-Hill Book Company, 1969, „pochodna” związku oznacza związek dający się otrzymać z pierwotnego związku za pomocą prostego procesu chemicznego.

„Aktywowana pochodna” związku oznacza reaktywną formę pierwotnego związku, która czyni związek aktywnym w żądanej reakcji chemicznej, w której pierwotny związek jest tylko umiarkowanie reaktywny albo nie-reaktywny. Aktywowanie uzyskuje się przez utworzenie pochodnej albo grupy chemicznej w cząsteczce o wyższej zawartości wolnej energii niż w związku pierwotnym, co czyni postać akty wowaną bardziej podatną do reakcji z innym reagentem. W kontekście niniejszego wynalazku aktywowanie grupy karboksylowej ma szczególne zna

180 609 czenie i odpowiednie środki aktywujące albo ugrupowania, które aktywujągrapę karboksylową, są opisane niżej bardziej szczegółowo. Jako przykład aktywowanej pochodnej L-waliny wymienia się związek o wzorze 3, w którym P² oznacza grupę amino-ochronną, a A oznacza grapę aktywującą grapę karboksylową, na przykład chlorowiec albo niższą grapę acyloksylową. Dalszym przykładem jest bezwodnik aminokwasu, który jest aktywowaną formą aminokwasu, która czyni aminokwas (zwłaszcza L-walinę) podatnym na estryfikację. Innym przykładem jest UNCA, co opisano szczegółowo poniżej.

„Grapa ochronna” oznacza grapę chemiczną, która (a) chroni grupę reaktywną przed udziałem w niepożądanej reakcji chemicznej i (b) może być łatwo usunięta, gdy ochrona grapy reaktywnej nie jest już dłużej potrzebna. Na przykład grapa benzylowa jest grapą ochronną dla pierwszorzędowej funkcji hydroksylowej.

„Grapa amino-ochronna” oznacza grupę ochronną, która chroni reaktywną grapę aminową, która inaczej uległaby modyfikacji przez niektóre reakcje chemiczne. Definicja ta obejmuje grapę formylową albo niższe grapy alkanoilowe o 2-4 atomach węgla, w szczególności grapę acetyIową lub propionylową, grapy trytylowe lub podstawione trytylowe, takie jak grapa monometoksy-trytylowa, grapy dimetoksytrytylowe, takie jak grapa 4,4'-dimetoksytrytylowa albo 4,4'-dimetoksytrifenylometylowa, grapa trifluoroacetylowa i grapa N-(9-fluorenylometoksykarbonylowa) albo grapa „FMOC”, grupa alliloksykarbonylowa, albo inne grapy ochronne pochodzące od chlorowcowęglanów, takie jak niż.alkilo-węglany (C₆-C₁₂)-arylowe (takie jak grupa N-benzyloksykarbonylowa pochodząca od chlorowęglanu benzylowego), albo grapy pochodzące od chlorowcowęglanów bifenyloalilowych, albo chlorowcowęglanów III-rz.alkilowych, takich jak chlorowcowęglany III-rz.butylowe, a w szczególności chlorowęglan III-rz.butylowy, albo diwęglany di-(niż.)-alkilowe, zwłaszcza diwęglan di-(III-rz.butylowy), oraz grapa ftalilowa.

„Grapa hydroksy-ochronna” oznacza grapę ochronną, która chroni grapę hydroksylową, która inaczej uległaby modyfikacji przez pewne reakcje chemiczne. Odpowiednie grapy hydroksy-ochronne obejmują grapy tworzące eter, które można łatwo usuwać po zakończeniu wszystkich innych etapów reakcji, takie jak grapa benzylowa albo grupa trytylowa ewentualnie podstawiona w pierścieniu fenylowym. Inne odpowiednie grapy hydroksy-ochronne obejmują grapy eterów alkilowych, grapę tetrahydropiranylową, grapę sililową, grapy eteru trialkilosililowego i grupę allilową.

„Grapa odszczepialna” oznacza nietrwałą grapę, która może zostać zastąpiona w reakcji chemicznej przez inną grapę. Przykładami grap odszczepialnych są chlorowce, ewentualnie podstawiona grapa benzyloksylowa, grupa izopropyloksylowa, grapa mesyloksylowa, grapa tosyloksylowa albo grupa acyloksylowa.

Wszelkie środki aktywujące i chroniące stosowane do wytwarzania związku o wzorze 1 muszą spełniać następujące warunki: (1) ich wprowadzanie powinno następować ilościowo i bez racemizacji składnika L-walinowego; (2) grapy ochronne obecne podczas żądanej reakcji powinny być trwałe w stosowanych warunkach reakcji; i (3) grapa musi być łatwa do usunięcia w warunkach, w których wiązanie estrowe jest trwałe i w których nie następuje racemizacja L-walinowego składnika estru.

Termin „chiralność” oznacza właściwość prawo- i lewoskrętności przypisaną cząsteczce związaną z elementami symetrii cząsteczki (lub brakiem elementów symetrii). Cząsteczki, w których występuje brak elementów symetrii, są„chiralne”. Cząsteczka, w której brak wszelkich elementów symetrii, nawet włączając prostą oś, określa się jako „asymetryczną”.

Termin „achiralny” oznacza obecność co najmniej jednego elementu symetrii w cząsteczce, takiego jak prosta oś.

„Izomeria” dotyczy związków mających tę samą masę atomową i liczbę atomową, lecz różniących się jedną lub więcej właściwościami fizycznymi lub chemicznymi. Różne typy izomerów są opisane poniżej.

„Stereoizomer” dotyczy związku chemicznego mającego tę samą masę cząsteczkową, skład chemiczny i budowę, jak inny, lecz z atomami inaczej zgrupowanymi. To jest, pewne

180 609 identyczne grupy chemiczne mają różną orientację w przestrzeni i w związku z tym, gdy czyste, majązdolność do skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Jednakże niektóre czyste stereoizomery mogą mieć skręcalność optyczną tak słabą, że jest niewykry walna za pomocą obecnego oprzyrządowania.

„Izomer optyczny” opisuje jeden typ stereo-izomerii, która objawia się skręcalnością, tak że izomer, czysty lub w roztworze, działa na płaszczyznę światła spolaryzowanego. W wielu przypadkach jest to spowodowane przez przyłączenie czterech różnych chemicznych atomów lub grup do co najmniej jednego atomu węgla w cząsteczce, albo inaczej wyraża się w wyżej opisanej chiralności cząsteczki.

Stereoizomery lub izomery optyczne, które sąodbiciem lustrzanym jeden wobec drugiego określa się jako „enancjomery” i można powiedzieć, że są enanćjomeryczne. Grupy chiralne, które sąodbiciem lustrzanym jedna wobec drugiej, określa się jako grupy enancjomeryczne.

Enancjomery, których absolutna konfiguracja nie jest znana, można rozróżniać jako prawoskrętne (prefiks +) albo lewoskrętne (prefiks -) w zależności od kierunku, w którym w specyficznych warunkach doświadczalnych skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego.

Jeżeli razem występują równe ilości cząsteczek enancjomerycznych, produkt określa się jako racemiczny, niezależnie czy jest on krystaliczny, ciekły czy gazowy. Jednorodna faza stała składająca się z równomolowych ilości cząsteczek enancjomerycznych określana jest związkiem racemicznym. Mieszanina równomolowych ilości cząsteczek enancjomerycznych występujących jako odrębne fazy stałe określa się jako mieszaninę racemiczną. Jakąkolwiek fazę jednorodną zawierającąrównomolowe ilości cząsteczek enancjomerycznych określa się jako racemat.

Związki, które majądwa asymetryczne atomy węgla (centra chiralności), mają cztery stereoizomery, które tworzą dwie pary enancjomerów. Podczas gdy enancjomery jednej pary są wzajemnym odbiciem lustrzanym, enancjomery dwóch oddzielnych par nie są wzajemnym odbiciem lustrzanym i nazywane są „diastereomerami”. Diastereomery mają podobne, lecz nie identyczne właściwości chemiczne i wykazująróżne właściwości fizyczne, np. temperatury topnienia, rozpuszczalność itp.

Optycznie czynne związki można oznaczać za pomocą różnych konwencji; to jest według reguł kolejności R- i S- według Cahna i Preloga; izomery erytro i treo; izomery D i L; izomery d i 1; i izomery (+) i (-), które wskazująkierunek obrotu płaszczyzny światła spolaryzowanego przez strukturę chemiczną, czystą lub w roztworze. Konwencje te są znane i opisane szczegółowo w publikacji E.L. Eliel, Stereochemistry of Carbon Compounds, opublikowanej przez McGraw Hill Book Company, Inc., Nowy Jork, 1962, oraz w cytowanych tam odnośnikach. Tak więc, izomery te mogą być opisane jako d-, 1- albo para dj; albo D-, L- albo para D,L; albo R-, S-, albo para R,S; w zależności od zastosowanego systemu nomenklatury. Na ogół w mniejszym zgłoszeniu stosuje się oznaczenia (D), (L) i (D,L) dla aminokwasu (walina), oraz oznaczenia (R), (S) i (R,S) dla asymetrycznego węgla w cząsteczce gancicloviru w celu rozróżnienia pomiędzy nimi.

Związek o wzorze 1 i związki o wzorze 2 majądwa asymetryczne centra (2 atomy węgla), jedno w składniku walinowym, a drugie w alifatycznym łańcuchu bocznym składnika gancicloviru. Ten ostatni stanowi atom węgła 2 grupy propanylowej. Tak więc związek o wzorze 1 i związki o wzorze 2 występująjako diastereomery i jako mieszaniny diastereomerów. Jeśli chodzi o związki według wynalazku, to można stosować każdy diastereomer lub mieszaninę diastereomerów, a zastrzeżenia obejmują zarówno poszczególne diastereomery jak i ich mieszaniny, jeśli nie podano inaczej. Wzór 1 obejmuje obydwa diastereomery wzoru 1, jak również ich mieszaniny.

„Ewentualny” lub „ewentualnie” oznacza, że opisany przypadek lub okoliczności mogą występować, lub mogą nie występować i że opis obejmuje możliwości, w których dany przypadek lub okoliczność występuje i możliwości, w których nie występuje. Na przykład „ewentualnie podstawiony fenyl” oznacza, że fenyl może być lub może nie być podstawiony i że opis obejmuje zarówno niepodstawiony fenyl jak i fenyl podstawiony; „ewentualnie następnie przeprowadza się wolną zasadę w sól addycyjnąz kwasem” oznacza, że ta konwersja może być lub może nie być

180 609 przeprowadzona w sposobie opisanym w ramach wynalazku i że wynalazek obejmuje sposoby, w których wolną zasadę przeprowadza się w sól addycyjną z kwasem i sposoby, w których się tego nie czyni.

„Farmaceutycznie dopuszczalny” oznacza, że nadaje się do stosowania przy wytwarzaniu kompozycji farmaceutycznej, że jest ogólnie bezpieczny i nie-toksyczny i że nadaje się do stosowania zarówno w weterynarii jak i w medycynie.

„Farmaceutycznie dopuszczalne sole” oznaczają sole, które wykazują żądaną aktywność farmakologiczną! które nie są niepożądane pod względem biologicznym lub jakimkolwiek innym. Sole takie obejmują sole addycyjne z kwasami utworzone z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy, kwas fosforowy itp; albo z kwasami organicznymi, takimi jak kwas octowy, kwas propionowy, kwas kapronowy, kwas enantowy, kwas cyklopentanopropionowy, kwas glikolowy, kwas pirogronowy, kwas mlekowy, kwas malonowy, kwas bursztynowy, kas jabłkowy, kwas maleinowy, kwas fumarowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, kwas benzoesowy, kwas o-(4-hydroksy-benzoilo)-benzoesowy, kwas cynamonowy, kwas migdałowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas 1,2-etano-disulfonowy, kwas 2-hydroksyetano-sulfonowy, kwas benzenosulfonowy, kwas p-chlorobenzenosulfonowy, kwas 2-naftalenosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy, kwas kamforosulfonowy, kwas 4-metylo-bicyklo(2.2.2)okt-2-eno-l-karboksylowy, kwas gluko-heptonowy, kwas 4,4'-metylenobis-(3-hydroksy-2-naftoesowy), kwas 3-fenylopropionowy, kwas trimetylooctowy, kwas III-rz.butylooctowy, kwas laurylosiarkowy, kwas glukonowy, kwas glutaminowy, kwasy hydroksynaftoesowe, kwas salicylowy, kwas stearynowy, kwas mukonowy, i tym podobne. Korzystne sąfarmaceutycznie dopuszczalne sole z kwasem solnym, siarkowym, fosforowym, z kwasem octowym lub metanosulfonowym, kwasem etanosulfonowym, kwasem 1,2-etanodisulfonowym, kwasem 2-hydroksyetanosulfonowym, kwasem benzenosulfonowym, kwasem p-chlorobenzenosulfonowym i kwasem 2-naftalenosulfonowym, kwasem p-toluenosulfonowym, kwasem kamforosulfonowym.

„Osobniki” obejmująludzi, nie-człowiecze ssaki (takie jak psy, koty, króliki, bydło, konie, owce, kozy, świnie i zwierzyna płowa) oraz nie-ssaki, takie jak ptaki, ryby i tym podobne.

„Choroba” specyficznie obejmuje wszelkie niezdrowe stany osobnika lub jego części. Tak więc „choroba” obejmuje tu wszelkie choroby wirusowe i pokrewne, które dają się traktować mono-L-walino-ganciclovirem albo jego farmaceutycznie dopuszczalnymi solami.

„Traktowanie” oznacza wszelkie traktowanie chorób u osobnika i obejmuje:

(1) zapobieganie występowaniu choroby u osobnika, który może być predysponowany do choroby, lecz nie ma jeszcze objawów doświadczalnych lub widocznych tej choroby; np. zapobieganie powstaniu objawów klinicznych;

(2) hamowanie choroby, np. wstrzymanie jej rozwoju; albo (3) łagodzenie choroby, np. powodując ustępowanie objawów choroby.

„Skuteczna ilość” do traktowania choroby oznacza taką ilość, która po podaniu osobnikowi tego wymagającemu jest wystarczająca do skutecznego leczenia, jak wyżej podano, tej choroby.

Jeżeli nie podano inaczej, reakcje tu opisane prowadzi się pod ciśnieniem atmosferycznym w temperaturze w zakresie od 5°C do 170°C (korzystnie 10-50°C, zwłaszcza w temperaturze „pokojowej” lub „otoczenia”, np. 20-30°C). Jednak sąoczywiście pewne reakcje, w których temperatura stosowana w reakcji chemicznej będzie powyżej lub poniżej tego zakresu temperatury. Ponadto, jeśli nie podano inaczej, czas trwania reakcji i jej warunki są przybliżone, np. reakcję prowadzi się pod ciśnieniem w przybliżeniu atmosferycznym w zakresie temperatury od około 5°C do około 100°C (korzystnie od około 10°C do około 50°C; zwłaszcza około 20°C) w ciągu od około 1 do około 100 godzin (korzystnie około 5-60 godzin). Parametry podane w przykładach są raczej specyficzne, nie przybliżone.

Wyodrębnianie i oczyszczanie związków i produktów pośrednich tu opisanych można prowadzić, jeśli to pożądane, za pomocą dowolnego odpowiedniego sposobu rozdzielania lub oczyszczania, takiego jak na przykład sączenie, ekstrakcja, krystalizacja, chromatografia

180 609 kolumnowa, chromatografia cienkowarstwowa albo chromatografia grubowarstwowa, albo za pomocą kombinacji tych sposobów. Specyficzne ilustracje odpowiednich metod rozdzielania i wyodrębniania są podane w poniższych przykładach. Jednak można oczywiście stosować inne równoważne sposoby rozdzielania i wyodrębniania.

Związek o wzorze 1 albo jego farmaceutycznie dopuszczalne sole można wytwarzać za pomocą różnych metod. Propozycje syntezy wynikają z zaznaczonych linii przerywanych [(a) do (f)] w podanym na rysunku schemacie. Linie przerywane wskazują schematycznie odpowiednie miejsca reakcji, a podana niżej tabela krótko opisuje różne metody, które są poniżej opisane bardziej szczegółowo. Symbole w nawiasach dotyczą odpowiedniego etapu w procesie w opisie/zastrzeżeniach.

Tabela

Etap	Metoda
(a)	usuwanie grup ochronnych
(b)	tworzenie soli
(c)	estryfikacja
(d)	kondensacja
(e)	częściowa hydroliza
(f)	rozdzielanie optyczne/oddzielanie diastereomerów

Tak więc, sposób wytwarzania związku o wzorze 1 albo jego farmaceutycznie dopuszczanej soli obejmuje jeden lub więcej następujących etapów:

(a) usuwanie grup amino- i/lub hydroksyochronnych ze związku o wzorze 4, w którym P¹ oznacza grupę hydroksy-ochronną albo atom wodoru, P² oznacza grupę amino-ochronną a P³ oznacza atom wodoru, albo ma znaczenie podane dla P², w celu otrzymania związku o wzorze 1; albo (b) konwersja związku o wzorze 1 w farmaceutycznie dopuszczalną sól; albo (c) estryfikacj a 2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-1,3 -propanodiolu (gancicloviru) albo jego soli za pomocą aktywowanej pochodnej L-waliny; albo (d) kondensacja ewentualnie podstawionej guaniny o wzorze 5, ewentualnie w postaci persililowanej, w którym P³ oznacza atom wodoru albo grupę amino-ochronną z 2-podstawionągliceryną o wzorze 6, w którym Y¹ i Y² niezależnie oznaczają atomy chlorowca, niższe grupy acyloksylowe, niższe grupy alkiloksylowe albo grupy aralkiloksylowe, a Z oznacza grupę odszczepialną wybraną spośród niższej grupy acyloksylowej, grupy metoksylowej, grupy izopropyloksylowej, grupy benzyloksylowej, chlorowca, grupy mesyloksylowej lub tosyloksylowej, i tym podobne; ewentualnie w obecności katalizatora z kwasu Lewisa, otrzymując związek o wzorze 1; albo (e) częściowa hydroliza bis-estru bis-(L-walinianu) 2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l,3-propanodiylu albo jego soli w celu otrzymania monoestru o wzorze 1; albo (f) optyczne rozdzielanie albo oddzielanie diastereomerów związku o wzorze 1.

Związek o wzorze 1 i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole wykazująaktywność farmaceutyczną a w szczególności aktywność przeciwwirusową. Jako takie związki te i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole nadają się do stosowania w leczeniu szerokiego zakresu stanów chorobowych u różnych osobników, zwłaszcza ludzi.

Jako przykłady stanów chorobowych, które można traktować z zastosowaniem związków i soli według wynalazku, wymienia się infekcje opryszczkowe, takie jak opryszczka typu 1,2 i 6, ospa wietrzna, półpasiec, wirus Eppstein-Barr, a w szczególności wirus cytomegalii i wirus zapalenia wątroby B oraz wirusy pokrewne, u ludzi lub osobników nie-człowieczych, zwłaszcza u ludzi. Jako przykłady schorzeń klinicznych spowodowanych przez te wirusy wymienia się

180 609 opryszczkowe zapalenie rogówki, opryszczkowe zapalenie mózgu, opryszczka warg, infekcje genitaliów (powodowane przez opryszczkę zwykłą), ospa wietrzna, półpasiec (powodowany przez varicella Zoster), CMV-zapalenie płuc i -rogówki, zwłaszcza u pacjentów o obniżonej odporności włącznie z przeszczepobiorcami (na przykład przeszczepy serca, nerek i szpiku kostnego) oraz pacjentów z zespołem nabytego niedoboru odpornościowego (AIDS), zakaźna mononukleoza powodowana wirusem Eppstein-Barr. Związki według wynalazku nadają się również do leczenia niektórych raków i chłoniaków wywołanych przez albo uzależnionych od infekcji wirusowych, takich jak rak nosowo-gardłowy, chłoniak immunoblastyczny, chłoniak Burkitta i włosowate rogowacenie białe.

Reasumując, innym aspektem wynalazku jest sposób leczenia osobników (korzystnie ludzi) wykazujących schorzenie, w którym odgrywa rolę wyżej opisana infekcja wirusowa, albo profilaktycznego traktowania osobników, u których przewiduje się infekcję wirusową, drogą traktowania przez lekarza lub weterynarza. Sposób ten polega na podawaniu terapeutycznie skutecznej ilości mono-L-walino-gancicloviru albo jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli takiemu osobnikowi. Terapeutycznie skuteczna ilość związku albo jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli stanowi ilość, która jest skuteczna w leczeniu schorzenia, to jest choroby. Dokładna ilość podawana może się zmieniać w szerokim zakresie w zależności od stopnia danego leczonego schorzenia, wieku i wagi osobnika, względnego stanu zdrowia osobnika i innych czynników (takich jak typ preparatu). Do podawania doustnego terapeutycznie skuteczna ilość może się zmieniać od około 1 do 250 mg na kg wagi ciała dziennie, korzystnie około 7 do 100 mg/kg wagi ciała dziennie. Najkorzystniej terapeutyczna ilość skuteczna wynosi około 10 do 50 mg/kg dziennie, zwłaszcza do leczenia CMV - zapalenia rogówki i zapalenia płuc. Tak więc, dla człowieka 70 kg terapeutycznie skuteczna ilość wynosi od około 70 mg dziennie do około 7 g dziennie, korzystnie około 500 mg dziennie do około 5 g dziennie, najkorzystniej 700 mg dziennie do 3,5 g dziennie. Dla śródszklistkowego implantu jednakże dawka substancji prodrug wynosi w zakresie od 0,5 mg do 25 mg, korzystnie od 5 do 10 mg na implant. Jest oczywiste dla fachowca, że różne postacie do dawkowania substancji prodrug według wynalazku wymagają różnych zakresów dawkowania.

Ganciclovir jest sprawdzonym lekiem przeciwwirusowym. Użyteczność substancji prodrug gancicloviru według wynalazku stwierdzono przez oznaczanie poziomu stężeń gancicloviru we krwi w testach na zwierzętach (szczur i małpa), po podaniu substancji prodrug per os. Poziom stężenia w osoczu krwi oznacza się według metod opisanych w przykładach IX i X, i sąto zmodyfikowane sposoby opisane przez Sommadossi i innych w Reviews of Infectious Diseases 10(3), str. 507 (1988) i w Journal of Chromatography, Biomedical Applications 414, 429-433 (1987).

Związek według wynalazku albo jego farmaceutycznie dopuszczalne sole można podawać dowolnym stosowanym i dopuszczalnym znanym sposobem, albo pojedynczo, albo w zestawieniu z innym środkiem leczniczym. Na ogół związek według wynalazku i jego sole podaje się w postaci kompozycji farmaceutycznej z farmaceutycznie dopuszczalnym podłożem i podaje się doustnie, systemicznie (np. poprzezskómie albo w postaci czopków) albo pozajelitowo (np. domięśniowo (im), dożylnie (iv), podskórnie (sc)), albo śródszklistkowo jako implant. Związek według wynalazku można więc podawać w postaci kompozycji, a mianowicie w postaci kompozycji półstałej, proszku, aerozolu, roztworu, zawiesiny albo innych odpowiednich kompozycji, jak niżej omówiono. Korzystne są doustne kompozycje farmaceutyczne.

Kompozycja farmaceutyczna zawiera związek o wzorze 1 albo jego farmaceutycznie dopuszczalne sole korzystnie w zestawieniu z farmaceutycznie dopuszczalnym podłożem. Podłoże takie musi być nietoksyczne. Podłoże takie może stanowić dowolne podłoże stałe, ciekłe, półstałe, gazowe (w przypadku aerozolu), które jest na ogół znane fachowcom i które nie wpływa szkodliwie na aktywność substancji czynnej..

Na ogół kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera terapeutycznie skutecznąilość związku albo jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli w zestawieniu z co najmniej jednym podłożem. W zależności od typu preparatu, wielkości dawki jednostkowej, rodzaju

180 609 podłoża i innych czynników znanych fachowcom z dziedziny farmacji ilość związku według wynalazku może się zmieniać w szerokim zakresie w kompozycji. Na ogół końcowa kompozycja zawiera około 1% do około 99,5% wagowych związku według wynalazku, przy czym pozostałość stanowi podłoże lub podłoża. Korzystnie ilość substancji czynnej wynosi około 10,0% wagowych do około 99% wagowych, a zwłaszcza około 50% wagowych do około 99% wagowych, przy czym pozostałość stanowi odpowiednie podłoże lub podłoża. Stosowane farmaceutyczne podłoża do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej mogą być stałe, półstałe, ciekłe lub gazowe. Tak więc kompozycje mogą mieć postać tabletek, pigułek, kapsułek, proszków, czopków, plastrów poprzezskómych, preparatów o przedłużonym działaniu, implantów śródszklistkowych, roztworów, zwłaszcza roztworów dożylnych, zawiesin, eliksirów, aerozoli i tym podobne. Stałe farmaceutyczne rozcieńczalniki obejmują skrobie, takie jak skrobia kukurydziana, celulozę, talk, glukozę, laktozę, sacharozę,· żelatynę, słód, ryż, mąkę, kredę, żel krzemionkowy, stearynian magnezu, stearynian sodu, kwas stearynowy, monostearynian gliceryny, chlorek sodu, sproszkowane chude mleko, i tym podobne. Jako ciekłe i półstałe rozcieńczalniki wymienia. się wodę, etanol, glicerynę, glikol propylenowy, różne oleje, włącznie z olejami z ropy naftowej, olejami zwierzęcymi, roślinnymi lub pochodzenia syntetycznego, na przykład olej arachidowy, olej sojowy, olej mineralny, olej sezamowy i tym podobne. Woda, solanka, wodna dekstroza i glikole są korzystnymi ciekłymi nośnikami, zwłaszcza do roztworów iniekcyjnych. Inne odpowiednie farmaceutyczne podłoża i nośniki oraz ich preparaty są opisane w „Remingtońs Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Company, Easton, Pensylwania (1980) przez E.W. Martin, co włącza się tu jako odnośnik.

Korzystnie kompozycję farmaceutyczną podaje się w postaci pojedynczej dawki jednostkowej, zwłaszcza w postaci do doustnego dawkowania, do traktowania ciągłego albo jako pojedynczą dawkę jednostkową ad libitum, gdy szczególnie pożądane jest osłabienie objawów.

Podczas gdy najszersza definicja tego wynalazkujest podana wyżej jako związek o wzorze 1 i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole, korzystna jest mieszanina (R,S) i niektóre sole.

Do tworzenia farmaceutycznie dopuszczalnych soli ze związkiem o wzorze 1 korzystnie stosuje się następujące kwasy: kwas solny, kwas siarkowy, kwas fosforowy, kwas octowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas 1,2-etanodisulfonowy, kwas 2-hydroksyetanosulfonowy, kwas benzenosulfonowy, kwas p-chlorobenzenosulfonowy, kwas 2-naftalenosulfónowy, kwas p-toluenosulfonowy i kwas kamforosulfonowy. Najbardziej korzystne są mocne kwasy nieorganiczne, takie jak kwas solny, kwas siarkowy lub kwas fosforowy.

Najbardziej korzystnymi związkami są chlorowodorek i octan L-wałinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu. Związki te można wytwarzać w postaci krystalicznych substancji i w związku z tym można je łatwo przerabiać na trwałe preparaty do stosowania doustnego. Korzystne sąpreparaty doustne i dożylne. Preparaty doustne majątę zaletę, że wykazują wysoką biodostępność; preparaty dożylne majątę zaletę, że substancja prodrug według wynalazku, inaczej niż dożylne preparaty gancicloviru, może być wytwarzana z zastosowaniem fizjologicznie bardziej akceptowanego pH (4-6). Dożylne preparaty gancicloviru wymagająpH 11, co powoduje podrażnienie.

Rozumie się, że związki te są szczególnie użyteczne w kompozycjach farmaceutycznych i sposobach leczenia według wynalazku.

W opisanych tu procesach odnośniki do wzoru 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 dotyczą takich wzorów, w których P¹, P² i P³, A, Y¹, Y² i Z maj ąznaczenie podane podane wyżej dla ich naj szerszej definicji, przy czym procesy odnoszą się w szczególności do korzystnych rozwiązań.

Korzystna kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera farmaceutycznie dopuszczalną sól substancji prodrug o wzorze 1. W związku z tym, jeżeli wytwarzanie preparatów farmaceutycznych obejmuje dokładne mieszanie farmaceutycznego podłoża i substancji czynnej w postaci soli, wówczas korzystnie stosuje się farmaceutyczne podłoża, które nie mającharakteru zasadowego, to jest są albo kwasowe, albo obojętne.

Korzystny sposób wytwarzania związku o wzorze 1 obejmuje etap (a), który korzystnie prowadzi się z równoczesnym wytwarzaniem soli związku o wzorze 1, albo etap (c), albo kombi

180 609 nację etapów (a) i (c). (Patrz opis etapów III i IV poniżej). Wytwarzanie monoestru według etapu (a) wymaga selektywnej ochrony jednej z dwóch pierwotnych funkcji hydroksylowych gancicloviru lub jego pochodnej. To zazwyczaj wymaga lub nie wymaga ochrony grupy aminowej w pozycji 2 zasady guaninowej (patrz szczegółowy opis poniżej etapów I do III dla przypadku, gdy proces prowadzi się z chronionągrupąaminową). Dodatkowo przed estryfikacją(etap III) należy ochronić grupę aminowąreagentu aminokwasowego, w celu zapobieżenia nakładania się w reakcji estryfikacji (tworzenie amidu). Ochrona grupy aminowej jest opisana poniżej.

Na ogół, przy prowadzeniu sposobu według wynalazku te grupy aminowe, hydroksylowe lub karboksylowe, które nie biorą udziału w reakcji syntezy muszą być chronione aż do chwili, gdy (1) w wyniku usunięcia grupy ochronnej otrzymuje się produkt końcowy; albo (2) specyficznie chroniona grupa będzie brała udział w następnym etapie syntezy; albo (3) obecność niechronionych grup w następnych etapach reakcji prowadzących do produktu końcowego nie modyfikowałaby założonej sekwencji reakcji. Jako przykład wymogów (1) wymienia się grupę benzylową przy wytwarzaniu monoestru według wynalazku, która chroni jedną pierwotną funkcję hydroksylową gancicloviru aż do jej usunięcia w etapie usuwania grup ochronnych. Jako przykład wymogów (2) wymienia się drugągrupę benzylową chronioną drugąpierwotną funkcję hydroksylową gancicloviru, którą usuwa się dopiero przed etapem estryfikacji. Jako przykład wymogów (3) wymienia się grupę acetylową, albo grupę trytylowąlub monometoksytrytylową chroniącą grupę aminową guaninowego układu pierścieniowego gancicloviru, ponieważ niechroniona grupa aminowa nie nakłada się na estryfikację (etap III).

Na ogół kwalifikowanie potencjalnych środków blokujących, które nadająsię do stosowania przy wytwarzaniu związku o wzorze 1 obejmuje:

(1) Ich wprowadzanie powinno przebiegać ilościowo i gładko bez racemizacji L-waliny;

(2) Blokowany związek pośredni musi być trwały wobec warunków reakcji stosowanych do chwili, gdy pożądane jest usunięcie grupy ochronnej;

(3) Grupa blokuj ąca musi być podatna na łatwe usuwanie j ej w warunkach, które nie zmieniaj ą chemicznego charakteru pozostałej cząsteczki i nie powodująracemizacji składnika L-walinowego.

Wszystkie substancje wyjściowe (ganciclovir i L-walina) oraz reagenty chroniące i aktywujące grupę karboksylową stosowane do wytwarzania związku o wzorze 1 są znane. Również znane są różne amino-chronione pochodne L-waliny, takie jak N-benzyloksy karbonylo-L-walina, BOC-L-walina i FMOC-L-walina, N-formylo-L-walina i bezwodnik N-benzyloksykarbonylo-N-karboksy-L-waliny, które to związki są dostępnymi w handlu związkami pośrednimi albo opisanymi w literaturze, jak N-ałliloksykarbonylo-L-walina.

Korzystnym chronionym związkiem wyjściowym gancicloviru do wytwarzania korzystnego związku według wynalazku jest N2-acetylo-bis-O-benzylo-ganciclovir (N2-acetylo-2-)2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-1,3-bis(benzyloksy)propan), który jest opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4355032. Innymi korzystnymi chronionymi substancjami wyjściowymi gancicloviru są N²-trytylo-9-[(3-hydroksy-2-propoksy-1 -trytyloksy)-metylo]-guanina [N²-trytylo-2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-pury n-9-ylo)-metoksy-l-trytyloksy-propan-3-ol] i N²-monometoksytrytylo-9-[(3-hydroksy-2-propoksy-l-monometoksytrytyloksy)-metylo]-guanina, której wytwarzanie jest opisane w J. Pharm. Sci. 76(2), 180-184 (1987), co jest tu włączone jako odnośnik. Bis-(L-walinian) 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l,3-propanodiylu, który jest związkiem wyjściowym do etapu częściowej hydrolizy, jest opisany w europejskim zgłoszeniu patentowym, publikacja nr 375329.

Przed przeprowadzaniem etapu III (etap estryfikacji) należy chronić grupę aminowąL-waliny dla zapobieżenia interferencji z estryfikacjąprzez niepożądane utworzenie amidu. Stosuje się następujące grupy amino-ochronne: chlorowcowęglany, takie jak węglany (C₆-C₁₂)-aryloniż.alkilowe (takie jak grupa karbobenzyloksylowa pochodząca od chlorowęglanu benzylowego), albo chlorowcowęglany bifenyłoalkilowe, albo chlorowcowęglany III-rz.alkilowe, takie jak chlorowcowęglany III-rz.butylowe, w szczególności chlorowęglan III-rz.butylowy, albo diwęglany di-(niż.)-alkilowe, w szczególności diwęglan di-(III-rz.butylowy), halogenki trifenylo

180 609 metylowe, takie jak chlorek trifenylometylowy, i bezwodnik trifluorooctowy. Etap ochrony prowadzi się przez rozpuszczane lub zawieszanie L-waliny w alkalicznym roztworze wodnym, który może zawierać niższy alkanol. Mieszaninę reakcyjną chłodzi się, podczas gdy reagent chroniący, taki jak chlorowcowęglan, korzystnie w roztworze wodnym lub w niższym alkanolu dodaje się równocześnie w małych porcjach. W czasie tego dodawania mieszaninę reakcyjną utrzymuje się w temperaturze 0-30°C, korzystnie 0-5°C w ciągu kilku godzin aż do osiągnięcia temperatury pokojowej. Mieszaninę reakcyjną zatęża się do sucha, a pozostałość rozdziela pomiędzy fazę organiczną! wodę. Fazę wodną zakwasza się i ekstrahuje rozpuszczalnikiem organicznym dla chronionego aminokwasu. Fazę organicznąprzemywa się wodą, a następnie solanką i suszy nad siarczanem magnezu, po czym odparowuje do sucha iN-chroniony aminokwas wyodrębnia się i oczyszcza za pomocą konwencjonalnych technik wyodrębniania i oczyszczania.

Wytwarzanie mono-L-walino-gancicloviru

Etap I: Ganciclovir z ewentualnie chronioną grupą 2-aminową i chronionymi obydwoma pierwotnymi funkcjami hydroksylowymi poddaje się częściowemu usuwaniu grup ochronnych, na przykład drogą uwodorniania do gancicloviru z grupą 2-aminową utrzymaną w postaci chronionej i jedną chronioną pierwotną funkcją hydroksylową. Odpowiednimi grupami amino-ochronnymi są niższe grupy alkanoilowe o 2-4 atomach węgla, zwłaszcza grupa acetylowa lub propionylowa. Innymi odpowiednimi grupami amino-ochronnymi są grupa trytylowa albo podstawione grupy trytylowe, takie jak grupa monometoksytrytylowa i grupa 4,4'-dimetoksytrytylowa.

Odpowiednimi grupami hydroksy-ochronnymi są grupy tworzące eter, które można łatwo usuwać po zakończeniu wszystkich innych etapów reakcji. Te hydroksy-ochronne grupy eterowe obejmujągrupę benzylową albo tritylową. Grupy te mogąbyć podstawione w pierścieniu fenylowym. Innymi odpowiednimi grupami hydroksy-ochronnymi są eter allilowy, tetrahydropiranyl, silił, etery trialkilosililowe, które można usuwać za pomocąfluorowodoru w sposób znany dla fachowca.

Uwodornianie w celu usunięcia jednej grupy hydroksy-ochronnej prowadzi się korzystnie drogąrozpuszczania chronionego gancicloviru w układzie rozpuszczalników, który uwalnia wodór w obecności katalizatora, takiego jak związek palladu, w szczególności wodorotlenek palladu, drogą transferowego uwodorniania albo za pomocą innych konwencjonalnych sposobów uwodorniania. Innymi odpowiednimi katalizatorami uwodorniania sąkatalizatory uwodorniania zasadniczo takiej ak Pd, Pd na węglu i j ednorodne katalizatory uwodorniania. Układ rozpuszczalników obejmuje niższy alkanol, taki jak metanol lub etanol i cykloheksan. Na ogół reakcję prowadzi się w temperaturze od temperatury pokojowej do temperatury wrzenia układu rozpuszczalników pod chłodnicą zwrotną, na przykład we wrzącym etanolu i cykloheksenie w obojętnej atmosferze i z wyłączeniem tlenu z powietrza, korzystnie w atmosferze azotu. Katalizator odzyskuje się drogąsączenia. Przesącz można zmniejszyć objętościowo przez odparowanie nadmiaru rozpuszczalnika. Otrzymana surowa mieszanina reakcyjna na ogół zawiera niezmieniony materiał wyjściowy i 2-amino-chroniony ganciclovir z jedną chronioną alifatyczną grupą hydroksylową jak o produkty główne. Rozdzielanie tych dwóch produktów prowadzi się zazwyczaj drogą znanych piocesów wyodrębniania, często metodami chromatograficznymi, korzystnie na żelu krzemionkowym, po czym stosuje się eluowanie za pomocą odpowiednich eluentów, takich jak mieszaniny niższego alkanolu z chlorowcowanym niższym alkanem (korzystnie etanol i dichlorometan), otrzymując 2-amino-chroniony ganciclovir z jedną chronioną alifatyczną grupą hydroksylową.

Etap II: Ganciclovir z chronioną grupą 2-aminową i jedną chronioną alifatyczną grupąhydroksylowąpoddaje się procesowi usuwania grupy chroniącej grupę aminową. W tym etapie, jeżeli grupą amino-ochronną jest niższa grupa alkanoilowa, stosuje się warunki zasadowe (pH pomiędzy 9 i 14) w celu usunięcia grupy ochronnej. Na przykład N2-acetylomono-O-benzylo-ganciclovir traktuje się reagentem alkalicznym, takim jak wodorotlenek amonu, węglan sodu lub potasu albo wodorotlenek sodu lub potasu, aż do zakończenia usuwania grupy acetylowej. Na ogół reakcję tę prowadzi się w obecności odpowiedniego rozpuszczalnika, takiego jak

180 609 niższy alkanol. Korzystnie związek wyjściowy rozpuszcza się w metanolu i dodaje stechiometryczny nadmiar wodorotlenku amonu. Temperaturę reakcji utrzymuje się pomiędzy 0 i 50°C, korzystnie w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji (co można określić za pomocąTLC) dodaje się inny rozpuszczalnik dla ułatwienia wyodrębniania produktu z usuniętą grupą ochronną, taki jak eter etylowy, który prowadzi do wytrącania de-acylowanego produktu, który można odsączać i wyodrębniać z zastosowaniem konwencjonalnych metod oddzielania.

Etap III: W tym etapie aktywowaną pochodną amino-chronionej L-waliny o wzorze 3 poddaje się estryfikacji za pomocą chronionej pochodnej gancicloviru otrzymanej w etapie II. Odpowiednimi grupami amino-ochronnymi dla L-waliny są grupa N-benzyloksykarbonylowa, grupa ftalilowa, grupa III-rz.butyloksykarbonylowa i grupa N-(9-fluorenylometoksykarbonylowa) albo „FMOC”.

Na początku stosuje się co najmniej 1 równoważnik chronionego aminokwasu i 1 równoważnik odpowiedniego środka sprzęgającego albo środka odwadniającego, na przykład 1,3-dicykIo-heksylokarbodiimidu albo soli takich diimidów z grupami zasadowymi. Można też stosować inne karbodiimidy, takie jak Ν,Ν'-karbonylo-diiniidazol. Jako środki odwadniające stosuje się dalej bezwodnik kwasu trifluorooctowego, mieszane bezwodniki, chlorki kwasowe, heksafluorofosforan l-benzotriazoliloksy-tris-(dimetyloamino)-fosfoniowy, PYBOP, 1-hy droksy benzotriazol, 1-hydroksy-4-azabenzotriazol, l-hydroksy-7-azabenzotriazol, chlorowodorek N-etylo-N'-(3 -(dimetyloamino)-propylo)-karbodiimidu, 3-hydroksy-3,4-dihydro-4-okso-1,2,3 -benzotriazynę, heksafluorofosforan O-(benzotriazol-l-ilo)-l,1,3,3,-tetrametylouroniowy, heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-1 -ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy, tetrafluoroboran O-(7-azabenzotriazol-1 -ilo)-1,1,3,3 -tetrametylouroniowy, heksafluorofosforan O-( 1 H-benzotriazol-1 -ilo)-1,1,3,3 -bis-(tetrametyleno)-uroniowy albo heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-l-ilo)-l,l,3,3-bis-(tetrametyleno)-uroniowy. Opis tych środków sprzęgających można znaleźć w J. Am. Chem. Soc. 115,4397-4398 (1993). Nadająsię również do tego celu uretanochronione N-karboksy-bezwodniki aminokwasów (UNCA), które są opisane przez Fullera i innych, J. Am. Chem. Soc. 112, 7414-7416 (1990), które są tu włączone jako odnośnik. Reasumując, jako środek sprzęgający można stosować każdy inny reagent, który wytwarza bezwodnik lub inną aktywowaną pochodną chronionego aminokwasu w łagodnych warunkach.

Amino-chroniony aminokwas rozpuszcza się w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak chlorowcowany niższy alkan, korzystnie dichlorometan, w obojętnej atmosferze, na przykład w atmosferze azotu, i dodaje środek sprzęgający (korzystnie 1,3-dicykloheksylokarbodiimid). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze 0-50°C, korzystnie w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną sączy się i wyodrębnia produkt reakcji (bezwodnik chronionego aminokwasu). Otrzymany produkt rozpuszcza się w bezwodnym obojętnym rozpuszczalniku, takim jak bezwodny dimetyloformamid (DMF) i umieszcza w atmosferze azotu. Roztwór równoważnej ilości produktu z etapu II w obojętnym rozpuszczalniku dodaje się do powyższego roztworu bezwodnika. Reakcję prowadzi się w temperaturze 0-50°C, korzystnie w temperaturze w przybliżeniu pokojowej w ciągu 5-90 godzin. Produkt reakcji można wyodrębniać i oczyszczać, stosując metody konwencjonalne, takie jak chromatografia. Produkt zazwyczaj zawiera nieprzereagowany N-chroniony aminokwas, który można usunąć przez traktowanie nie mieszającego się z wodą roztworu (faza organiczna) produktu wodnym roztworem alkaliów, takich jak wodorowęglan sodu, węglan sodu, solanka i ich mieszaniny. Z fazy organicznej ester L-walinowy gancicloviru z chronioną alifatyczną grupą hydroksylową i N-chronionym aminokwasem można wyodrębniać i oczyszczać za pomocą konwencjonalnych technik wyodrębniania i oczyszczania.

Etap IV: (Końcowe usuwanie grup ochronnych w celu otrzymania produktu o wzorze 1): Dwie grupy ochronne produktu z etapu III usuwa się za pomocą reakcji usuwania grup ochronnych, korzystnie w środowisku kwaśnym albo w rozpuszczalniku, najkorzystniej drogą uwodorniania. Korzystne jest usuwanie grup ochronnych w warunkach kwasowych, ponieważ to zapewnia, że grupy aminowe uwolnione w reakcj i usuwania grup ochronnych będąprotonowane, to znaczy, że zasada o wzorze 1, tak jak się utworzy w wyniku reakcji usuwania grup ochronnych, zostanie wychwycona przez co najmniej stechiometryczną ilość kwasu obecnego

180 609 w środowisku. Wyodrębnianie związku o wzorze 1 jako soli addycyjnej z kwasami chroni pożądaną stereokonfigurację związku o wzorze 1. Tak więc, podane niżej przykłady, które ilustrują etap usuwania grup ochronnych (a) ilustrują także równoczesny etap tworzenia soli (b).

Reakcję usuwania grup ochronnych pro wadzi, się drogą rozpuszczania produktu z etapu estryfikacji w obojętnym rozpuszczalniku, korzystnie w rozpuszczalniku kwasowym, stosując katalizator uwodorniania, taki jak pallad na węglu, platyna, z zastosowaniem podwyższonego ciśnienia wodoru 1 -2000 x 0,7 kG/cm², korzystnie 20-200 x 0,7 kG/cm². Zakończenie reakcji można monitorować, stosując konwencjonalną analizę chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Uwodornianie prowadzi się dalej aż do zakończenia konwersji, jeśli to pożądane, z dodatkiem dalszego katalizatora uwodorniania. Katalizator usuwa się i przemywa. Połączone przesącze z sączenia i przemywania zatęża się i liofilizuje w celu wyodrębnienia estru L-walinowego gancicloviru. Oczyszczanie produktu i wyodrębnianie krystalicznego estru prowadzi się drogą przekrystalizo wania albo za pomocąinnych technik oczyszczania, takich jak technika chromatografii cieczowej.

Jeżeli jako grupę amino-ochronną stosuje się grupę III-rz.butyloksykarbonylową usuwa się ją za pomocą kwasu, takiego jak HC1 i izopropanolu jako rozpuszczalnika albo za pomocą kwasu trifluorooctowego.

Inaczej, jeżeli etap estryfikacji był prowadzony z pochodną gancicloviru chronioną za pomocągrupy tritylowej lub podstawionej grupy tritylowej, to takie grupy ochronne można usuwać przez traktowanie wodnym kwasem alkanokarboksylowy, takim jak kwas trifluorooctowy, albo kwasem solnym w temperaturze od -20°C do 100°C, na przykład za pomocą wodnego kwasu octowego.

Grupy allilowe usuwa się drogą izomeryzacji do grup eteru winylowego za pomocąkatalizatorów rodu lub palladu, i następną kwasową wodną hydrolizę.

Inne metody wytwarzania (etapy (b), (d) i (e))

Dla fachowca jest oczywiste, że związek o wzorze 1 można wytwarzać w postaci soli addycyjnej z kwasami albo jako odpowiednią wolną zasadę. Jeśli związek został wytworzony jako sól addycyjna z kwasem, to można go przeprowadzać w wolną zasadę przez traktowanie odpowiednią zasadą taką jak roztwór wodorotlenku amonu, wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu i tym podobne. Jednak należy podkreślić, że wolna zasada o wzorze 1 jest trudniejsza do scharakteryzowania niż jej sole addycyjne z kwasami. W przypadku przeprowadzania wolnej zasady w sól addycyjnąz kwasem związek poddaje się reakcji z odpowiednim organicznym lub nieorganicznym kwasem (opisanym wyżej). Reakcje te prowadzi się drogą traktowania co najmniej stechiometryczną ilością odpowiedniego kwasu (w przypadku wytwarzania soli addycyjnej z kwasami) albo zasady (w przypadku uwalniania wolnego związku o wzorze 1). W etapie tworzenia soli według wynalazku zazwyczaj wolną zasadę rozpuszcza się w polarnym rozpuszczalniku, takim jak woda albo niższy alkanol (korzystnie izopropanol) i ich mieszaniny i dodaje kwas w żądanej ilości w wodzie albo niższym alkanolu. Temperaturę reakcji utrzymuje się na ogół w zakresie około 0-50°C, korzystnie w temperaturze w przybliżeniu pokojowej. Odpowiednia sól wytrąca się spontanicznie albo można jąusunąć z roztworu przez dodanie mniej polarnego rozpuszczalnika, usuwanie rozpuszczalnika drogą odparowania w próżni albo przez chłodzenie roztworu.

Warunki reakcji etapu kondensacji (d) są opisane w europejskim zgłoszeniu patentowym, publikacja nr 187297. Ten etap kondensacji jest jedną z korzystnych metod wytwarzania diastereomerów monoestru. W tym etapie kondensacji guaninę, korzystnie z chronioną grupą 2-aminową poddaje się reakcji z pochodną gliceryny. Pochodną gliceryny, taką jak l-chlorowco-3-benzyloksy-2-acyloksymetoksy gliceryną poddaje się reakcji z guaniną albo podstawioną pochodną guaniny w aprotycznym rozpuszczalniku węglowodorowym (takim jak benzen lub toluen, albo ksyleny) albo DMF z heksa-niż.alkilosilazanem, na przykład heksametylosilazanem, heksaetylosilazanem lub tym podobnymi, i z katalizatorem w temperaturze od 30°C do temperatury wrzenia pod chłodnicą zwrotną Katalizatorem jest sól kwasu Lewisa, taka jak sól trialkilosililową taka jak siarczan albo trifluoroalkilo-sulfonian, chlorosilan albo siarczan

180 609 amonu i pirydyna. W celu bardziej szczegółowego ujawnienia warunków reakcji w etapie kondensacji (d) patrz europejskie zgłoszenie patentowe, publikacja nr 187297, które włącza się tu jako odnośnik. Na ogół Y¹ i Y² dobiera się tak, aby umożliwić otrzymanie estru mono-L-walinowego o wzorze 1. Y¹ może oznaczać amino-chronioną grupę L-walinylowąalbo grupę dającą się przeprowadzać w grupę L-walinylową.

Związek według wynalazku można również wytwarzać z bis-(L-walinianu) 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l,3-propanodiylowego, który jest opisany w europejskim zgłoszeniu patentowym, publikacja nr 375329. Konwersję do L-walinianu 2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3 -hy droksy-1 -propanylu prowadzi się drogą częściowej hydrolizy (etap (e)) jednej estrowej grupy L-waliny w warunkach kontrolowanych, zczego wynika preferencyjne rozszczepianie tylko jednej acylowej reszty aminokwasu. Sól bisL-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-9H-puryn-9-ylo)-metoksy-l,3-propanodiylowego, korzystnie sól bis-octanową, rozpuszcza się wodjonizowanej wodzie i częściowo zobojętnia słabą zasadą, takąjak rozcieńczony roztwór wodorotlenku amonu. Mieszaninę utrzymuje się w temperaturze pokojowej w ciągu jednego do kilku dni, korzystnie 48-72 godzin.

Do przeprowadzania częściowej hydrolizy można też stosować enzymatyczną hydrolizę za pomocąesterazy, takiej j ak esteraza świńska, albo peptydazy, takiej j ak karboksypeptydaza.

Monoester można oddzielać od bis-estru za pomocą preparaty wnej chromatografii w warunkach słabo kwaśnych (wartość pH 3-5, korzystnie pH 4). Rozpuszczalnik stosowany do chromatograficznego rozdzielania usuwa się i wyodrębnia sól L-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-9H-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-1 -propanylu jako mieszaninę dwóch diastereomerów.

Wyodrębnianie stereoizomerów

Ze wzoru 1 wynika, że związek według wynalazku ma jeden asymetryczny atom węgla (centrum chiralności) w łańcuchu propanylowym, dodatkowo do asymetrycznego atomu węgla w L-walinie. Tak więc występujądwie formy diastereomeryczne, postać (R) i (S), jak określono regułą Cahn i innych.

Do rozdzielania diastereomerów można stosować liczne metody, lecz korzystne metody wykorzystujątechniki, które biorąpod uwagę różne właściwości fizyczne obydwóch diastereomerów. Na ogół diastereomery rozdziela się drogą chromatografii, lecz korzystnie stosuje się techniki rozdzielania/rozkładu zależne od różnic w rozpuszczalności, takie jak frakcjonowana krystalizacja.

Szczegóły dotyczące techniki rozdzielania dającej się zastosować do wytwarzania diastereomerów o wzorze 1 są opisane w publikacji Jean Jacąues, Andre Collet, Samuel H. Wilen, Enantiomers, Racemetes and Resolutions, John Wiley and Sons, Inc. (1981), co jest tu włączone jako odnośnik.

Inaczej związek według wynalazku można wytwarzać, stosując reagenty optycznie czynne. Jeżeli wytwarza się czyste diastereomery mono-L-walino-gancicloviru, etap kondensacji (d) jest korzystną metodą syntezy. Jednak jeżeli stosuje się reagenty optycznie czynne, ważne jest omijanie zakresu pH powyżej 6, gdyż przy wyższym zakresie pH zachodzi interkonwersja wolnego związku o wzorze 1. Na przykład przy wartości pH 7 i w temperaturze 40°C mieszaniny diastereomeryczne o wzorze 1 wykazują okres połowicznej przemiany mniejszy niż jedna godzina.

Stereokonfigurację przy drugim centrum chiralności związku o wzorze 1 można ustalić za pomocąkołowego dichroizmu, korzystnie za pomocąmonokryształowej analizy rentgenowskiej pochodnej ciężkiego atomu, albo drogą korelacji z materiałem otrzymanym przez całko witą syntezę z pojedynczego enancjomeru gliceryny o znanej konfiguracji.

Wytwarzanie krystalicznego L-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puiyn-9-ylo)-metoksy-3 -hydroksy-1 -propany lu

Związek według wynalazku można wytwarzać w postaci krystalicznej. Jest to decydująca korzyść w porównaniu ze związkami ze znanego stanu techniki, które opisano jako substancje nie-krystaliczne. Korzyść wynika z faktu, że preparaty farmaceutyczne można łatwiej wytwarzać z materiału krystalicznego. Krystaliczny materiał można skuteczniej poddawać obróbce i

180 609 jest bardziej podatny na powtarzalność charakterystyki niż substancja nie-krystaliczna, a jakość krystalicznej substancji według wynalazku można łatwiej ustalić niż w przypadku materiału nie-krystalicznego.

Do otrzymywania substancji krystalicznej korzystnie stosuje się sól L-walinianu 2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-1 -propanylu. Korzystnymi krystalicznymi solami są octan i chlorowodorek. Korzystnie zapoczątkowuje się krystalizację soli drogą rozpuszczania chlorowodorku lub octanu w wodzie i dodaje rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą, taki jak metanol, etanol, izopropanol, tetrahydrofuran lub acetonitryl. Można też krystalizować chlorowodorek z bezwodnego roztworu niższego alkanolu, takiego j ak metanol, etanol, przez dodawanie innych rozpuszczalników organicznych, takich jak octan etylu, izopropanol, tetrahydrofuran lub toluen.

Następujące przykłady bliżej wyjaśniająwynalazek. Nie ograniczają one zakresu wynalazku, lecz raczej służąjego ilustracji.

Przykład I. Wytwarzanie (S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3 -benzyloksy-propan-1 -olu

A. (R)-( 1 -chloro-2-acetoksymetoksy-3-benzyloksy)-propan

Gazowy HC1 (wysuszony przez przepuszczanie przez stężony H₂SO₄) przepuszcza się, mieszając, przez mieszaninę 500 mg (3,06 mmoli) (S)-(+)-benzyloksymetylo-oksiranu i 201 mg (6,71 mmoli) paraformaldehydu w 8 ml dichlorometanu w temperaturze 0°C aż do rozpuszczenia całej substancji stałej (około 45 minut). Otrzymany roztwór przechowuje się w temperaturze 0°C w ciągu 16 godzin. Po wysuszeniu siarczanem magnezu rozpuszczalnik odparowuje się, otrzymując (R)-(l-chloro-2-chloro-metoksy-3-benzyloksy)-propan. Ten pośredni eter chlorometylowy rozpuszcza się w 3 ml acetonu i wkrapla do mieszaniny 2,1 g (21,4 mmoli) octanu potasu w 7 ml acetonu. Mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 16 godzin. Osad odsącza się, a przesącz zatęża. Pozostałość roztwarza się w 20 ml toluenu i przemywa 10 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i wodą (2 x 20 ml). Warstwę organiczną suszy się nad siarczanem sodu. Następnie sączy się, przesącz zatęża, a pozostałość oczyszcza drogąszybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym (heksany/octan etylu = 7/1), otrzymując 810 mg (2,97 mmoli) (R)-(l-chloro-2-acetoksymetoksy-3-benzyloksy)-propanu w postaci bezbarwnego oleju z wydajnością 97% (stosunek izomerów wynosi 12:1).

B. (R)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l-chloro-3-benzyloksy-propan

Roztwór 1,09 g (2,95 mmoli) persililowanej guaniny w 3,2 ml DMF wprowadza się do 810 mg (R)-(l-chloro-2-acetoksy-metoksy-3-benzyloksy)-propanu. Roztwór miesza się w temperaturze 130°C w ciągu 1 godziny, po czym wprowadza się trifluorometanosulfonian trimetylosililu. Miesza się dalej w tej samej temperaturze w ciągu 4 godzin. Mieszaninę chłodzi się do temperatury pokojowej i rozdziela pomiędzy wodę i octan etylu. Warstwę wodną ekstrahuje się wyczerpująco octanem etylu. Połączone warstwy organiczne suszy się nad siarczanem magnezu, sączy i zatęża. Pozostałość oczyszcza się drogą chromatografii na żelu krzemionkowy, otrzymuj ąc (R)-2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-1 -chloro-3 -benzyloksy-propan wraz z jego izomerem N-7. Stosunek izomeru N-9 do N-7 wynosi około 2,3:1.

C. (R)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l-acetoksy-3-benzyloksy-propan

Mieszaninę produktu z poprzedniego etapu, octanu potasu (duży nadmiar) i DMF ogrzewa się do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w ciągu 5 godzin. Otrzymaną brunatną mieszaninę chłodzi się do temperatury pokojowej i sączy przez wkładkę z celitu. Złoże filtru przemywa się metanolem. Przesącz odparowuje się, a pozostały DMF usuwa w próżni. Surowy produkt oczyszcza się drogąszybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym (CH₂C1₂ - metanol = 10:1), otrzymując (R)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l-acetoksy-3-benzyloksy-propan w postaci blado żółtej substancji stałej.

180 609

D. (S)-2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-1 -benzyloksy-propan-3-ol Mieszaninę (R)-2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-1 -acetoksy-3-benzyloksy-propanu w 30% amoniaku/metanolu (1:2) miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 18 godzin. Rozpuszczalnik odparowuje się, a pozostałość rozciera z małą ilością metanolu. Blado żółty osad odsącza się, otrzymując (S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l-benzyloksy-propan-3-ol. Ług macierzysty zatęża się, a pozostałość przekrystalizowuje z gorącego metanolu, otrzymując drugi rzut produktu.

Przykład II. Wytwarzanie 2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-1 -benzyloksy-propan-3-olu

A. 54,2 g (114 mmoli) N2-acetylo-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l,3-bis-(benzyloksy)-propanu, rozpuszcza się w 815 ml wrzącego etanolu i dodaje 610 ml cykloheksenu w atmosferze azotu. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się zawiesinę 16 g wodorotlenku palladu w 50 ml etanolu i mieszaninę ogrzewa pod chłodnicą zwrotną w ciągu 1,5 godziny. Gorącą mieszaninę sączy się przez celit, a przesącz zatęża na wyparce rotacyjnej. Otrzymaną surową mieszaninę reakcyjną poddaj e się chromatografii na żelu krzemionkowym. Po eluowaniu za pomocą 8% metanolu/92% dichlorometanu, a następnie 10% metanolu/90% dichlorometanu otrzymuje się 18,6 g (16%) N2-acetylo-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l,3-bis-(benzyloksy)-propanu (materiał wyjściowy) i 17,6 g (40%) N2-acetylo-2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-1 -benzyloksy-propan-3-olu.

B. 21,9 g (56,5 mmoli) N2-acetylo-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l-benzyloksy-propan-3-olu rozpuszcza się w 200 ml metanolu i dodaje 101 ml wodorotlenku amonu. Mieszaninę miesza się przez noc w temperaturze pokojowej. Do białej zawiesiny dodaje się 400 ml eteru etylowego i mieszaninę sączy się. Osad przemywa się kolejno 100 ml eteru etylowego, 100 ml wody i 100 ml eteru etylowego i suszy przez noc w wysokiej próżni, otrzymując 15,9 g (46,13 mmoli, 82%)2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l-benzyloksy-propan-3-olu. Następnie przesącz odparowuje się i otrzymany osad zawiesza się w 200 ml eteru etylowego, po czym sączy się i suszy w wysokiej próżni, otrzymując dodatkowo 2,3 g (6,7 mmoli, 12%) produktu.

Analiza dla C₁₆H₁₉N₅O₄ (345,36):

obliczono: C 55,65 H 5,55 N 20,28 znaleziono: C 55,25 H 5,60 N 20,12

Przykład ΠΙ. Wytwarzanie L-walinianu2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy- 3 -hy droksy-1 -propany lu

A. N-(benzyloksykarbonylo)-L-walinian 2-((2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puiyn-9-ylo)-metoksy)-3 -benzyloksy-1 -propany lu

43,66 g (0,174 mola, 3 równoważniki) N-benzyloksykarbonylo-L-waliny zawiesza się w 72 ml dichlorometanu i dodaje 14,34 g (69,5 mmoli, 1,2 równoważniki) 1,3-dicykloheksylokarbodiimidu. Mieszaninę miesza się w atmosferze azotu w ciągu 48 godzin. Mieszaninę sączy się przez topione szkliwo i białą stałą pozostałość przemywa się 75 ml dichlorometanu. Połączony przesącz miesza się w atmosferze azotu i dodaje zawiesinę 20 g (57,91 mmoli, 1 równoważnik) 2-(2-amino-l ,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-benzyloksy-propan-1 -olu w 90 ml dimetyloformamidu, a następnie 1,77 g (14,4 mmoli, 0,25 równoważników) 4-dimetyloaminopirydyny. Mieszaninę miesza się w atmosferze azotu w ciągu 18 godzin, wprowadza do wody w ilości 1200 ml i ekstrahuje mieszaniną350 ml octanu etylu i 350 ml toluenu. Warstwę wodną oddziela się, a warstwę organiczną przemywa 600 ml połowicznie nasyconego wodorowęglanu sodu, a następnie 200 ml wody. Warstwę organiczną suszy się nad siarczanem magnezu i zatęża pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość wytrąca się z mieszaniny octanu etylu i cykloheksanu i otrzymuje się N-(benzyloksykarbonylo)-L-walinian 2-((2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy)-3-benzyloksy-1-propanylu w postaci bezpostaciowej substancji stałej.

180 609

B. Chlorowodorek L-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-1 -propany lu

224,8 g (0,39 mola) N-(benzyloksykarbonylo)-L-walinianu 2-((2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy)-3-benzyloksy-l-propanylu rozpuszcza się w 1,2 litra metanolu i wkrapla 32,4 ml (0,39 mola) stężonego kwasu solnego. Mieszaninę umieszcza się w atmosferze azotu i dodaje 67,4 g palladu na węglu. Mieszaninę uwodornia się w bombie Parra w atmosferze wodoru (ciśnienie 40-100 x 0,7 kG/cm², średnie ciśnienie 80 x 0,7 kG/cm²) w ciągu 48 godzin. Następnie dodaj e się dodatkowo 5 g palladu na węglu i mieszaninę uwodornia pod ciśnieniem 100 x 0,7 kG/cm² w ciągu 24 godzin. Mieszaninę sączy się przez wkładkę z celitu, a pozostałość przemywa 1 litrem metanolu. Przesącz odparowuje się do sucha pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszcza się w 150 ml wody i ogrzewa do temperatury 60°C. Powoli, mieszając, wkrapla się 830 ml izopropanolu, utrzymując temperaturę 60-70°C. Roztwór powoli chłodzi się do temperatury pokojowej w ciągu 16 godzin. Otrzymany krystaliczny roztwór ogrzewa się do temperatury 30°C i dodaje się dodatkowo 220 ml izopropanolu. Mieszaninę pozostawia się do powolnego ochłodzenia do temperatury końcowej -11 °C w ciągu 4 godzin. Kryształy odsącza się i przemywa 200 ml zimnego układu 2% woda/izopropanol, otrzymując 120,5 g (wydajność 79%) chlorowodorku L-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu. W związku zachodzi przemiana fazowa w temperaturze 142°C i rozkład w temperaturze 175°C.

Przykład IV. Wytwarzanie krystalicznej soli L-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propany lu

150 g chlorowodorku L-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-1-propanylu rozpuszcza się w 150 ml wody i ogrzewa do temperatury 50-60°C. Powoli, mieszając, wkrapla się 830 ml izopropanolu, przy czym temperatura słabo wzrasta do 60-70°C. Roztwór powoli chłodzi się do 25°C w ciągu 20 godzin. Otrzymany krystaliczny roztwór ogrzewa się do temperatury 30°C i dodaje dodatkowo 220 ml izopropanolu. Mieszaninę pozostawia się do powolnego ochłodzenia do temperatury końcowej -11°C w ciągu 6 godzin. Kryształy odsącza się i przemywa 200 ml zimnego 2% układu woda/izopropanol, otrzymując 135 g (90% wydajności) kryształów chlorowodorku L-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-1-propanylu. W związku zachodzi przemiana fazowa w temperaturze 142°C i rozkład w temperaturze powyżej 175°C.

W analogiczny sposób można wytwarzać octan L-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-1-propanylu w postaci krystalicznej.

Przykład V. Wytwarzanie chlorowodorku L-walinianu (S)- 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3 -hydroksy-1 -propanylu

A. N-(benzyloksykarbonylo)-L-walinian (S)- 2-((2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy)-3 -benzyloksy-1 -propanylu

437 mg (1,74 mmoli, 3 równoważniki) N-benzyloksy-L-waliny zawiesza się w 1 ml dichlorometanu i dodaje 143 mg(0,7mmola, 1,2 równoważniki) 1,3-dicykloheksylokarbodiimidu. Mieszaninę miesza się w atmosferze azotu w ciągu 48 godzin. Mieszaninę sączy się przez topione szkliwo i białą stałą pozostałość przemywa 1 ml dichlorometanu. Połączony przesącz miesza się w atmosferze azotu i dodaje zawiesinę 200 mg (0,58 mmoli, 1 równoważnik) (R)- 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-benzyloksy-propan-1-olu w 1,5 ml dimetyloformamidu, a następnie 18 mg (14,4 mmoli, 0,25 równoważnika) 4-dimetyloamino-pirydyny. Mieszaninę miesza się w atmosferze azotu w ciągu 18 godzin, wprowadza do wody w ilości 12 ml i ekstrahuje mieszaniną3,5 ml octanu etylu i 3,5 ml toluenu. Warstwę wodną oddziela się, a warstwę organiczną przemywa 6 ml połowicznie nasyconego wodorowęglanu sodu i następnie 2 ml wody. Warstwę organiczną suszy się nad siarczanem magnezu i zatęża pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość wytrąca się z mieszaniny octanu etylu i cykloheksanu, otrzymując N-(benzyloksykarbonylo)-L-walinian (S)- 2-((2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy)-3-benzyloksy-l-propanylu w postaci substancji stałej.

180 609

B. Chlorowodorek L-walinianu (S)- 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puiyn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-1 -propanylu

225 mg (3,9 moli) N-(benzyloksykarbonylo)-L-walinianu (S> 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy)-3-benzyloksy-l-propanylu rozpuszcza się w 12 ml metanolu i dodaje 0,3 ml (3,9 mmoli) stężonego kwasu solnego. Mieszaninę umieszcza się w atmosferze azotu i dodaje 674 mg palladu na węglu. Mieszaninę uwodornia się w bombie Parra w atmosferze wodoru (ciśnienie 40-100 x 0,7 kG/cm², średnie ciśnienie 80 x 0,7 kG/cm²) w ciągu 48 godzin. Dodaje się dalsze 50 mg palladu na węglu i mieszaninę uwodornia pod ciśnieniem 100 x 0,7 kG/cm² w ciągu 24 godzin. Mieszaninę sączy się przez wkład z celitu i pozostałość przemywa 10 ml metanolu. Przesącz odparowuje się do sucha pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszcza się w wodzie w ilości 1,5 ml i ogrzewa do temperatury 60°C. Powoli, mieszając, dodaje się 8 ml izopropanolu, utrzymując temperaturę 60-70°C. Roztwór powoli chłodzi się do temperatury pokojowej w ciągu 16 godzin. Otrzymany roztwór ogrzewa się do temperatury 30°C i dodaje dodatkowo 2 ml izopropanolu. Mieszaninę pozostawia się do powolnego ochłodzenia do temperatury końcowej -11°C w ciągu· 4 godzin. Kryształy odsącza się i przemywa 2 ml zimnego 2% układu woda/izopropanol, otrzymuj ąc chlorowodorek L-walinianu (S)- 2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3 -hy droksy-1 -propanylu.

Przykład- VI. Wytwarzanie octanu L-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu z bis-octanu bis-(L-walinianu) 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-1,3-propanodiylu

100 mg bis-soli kwasu octowego bis-L-walinianu 2-((2-amino-l,6-dihydro-6-okso9H-puryn-9-ylo)-rrietoksy)-l,3-propanodiylu (liofilizowana próbka zawiera 0,6 równoważnika nadmiaru kwasu octowego, 0,164 mmola)= w sumie 0,426 mmola kwasu octowego)) rozpuszcza się w 0,4 ml odjonizowanej wody i częściowo zobojętnia przez dodanie 24 ml 0,015 M roztworu wodorotlenku amonu (= 0,36 mmola). Mieszaninę pozostawia się w temperaturze pokojowej w ciągu 67 godzin. Próbkę wstrzykuje się w dwóch równych partiach na preparaty wnąkolumnę HPLC z odwróconą fazą (YMC-Pack, ODS-AM DM-33-5,2 x 250 mm; YMC Inc.). Rozdzielanie uzyskuje się za pomocą układu rozpusżczalników 10% metanolu/90% 0,1 M octanu amonu buforowanego do pH 4 za pomocą kwasu octowego, szybkość przepływu: 9,5 ml/minutę i detektor przy 256 nm. Zbiera się produkty z dwóch pików reprezentujących dwa diastereomery produktu monoestrowego. Rozpuszczalnik usuwa się w wysokiej próżni do około 2 ml i pozostałość liofilizuje dwukrotnie z wody zawierającej kwas octowy (0,1%), w celu usunięcia buforu. 45 mg (0,112 mmola = 68%) soli kwasu octowego L-walinianu 2-((2-amino-l,6-dihydro-6-okso-9H-puryn-9-ylo)-etoksy)-3-hydroksy-l-propanylu wyodrębnia się jako mieszaninę dwóch diastereomerów o następujących charakterystycznych pikach widma NMR:

Ή-NMR (300 MHz) roztwór DMSO-d₆: δ 7,78 (1H, s, H C-8), 6,48 i 6,45 (2 br.s., 2H, NH₂), 5,44 (mAB, J= 11 Hz) i 5,43 (s) łącznie 2H, CH₂; 1,91 (s, 3H, CH₃COO-), 0,83 + 0,82 (2d, J = 7 Hz, 3H, CH₃), 0,75 + 0,76 (2d, J = 7 Hz, 3H, CH₃).

Przykład VII. Rozdzielanie L-walinianu (R,S)- 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3 -hy droksy-1 -propanylu

Roztwór L-walinianu (R,S)- 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hy droksy- 1 -propanylu (1,66 g) w 90% 0,1 M octanu amonu, zakwaszony do pH 4 za pomocą kwasu octowego, 10% metanolu (9,60 ml) wprowadza się na kolumnę HPLC YMC-Pack ODS-AM (cat. no. DM-33-5; wielkość: 250 x 20 mm I.D.; cząstki S-5 mm, 120 A) w48 iniekcjach po 200 μΐ z eluowaniem 9,5 ml/minutę z zastosowaniem jako fazy ruchomej 90% 0,1 M octanu amonu zakwaszonego do pH 4 kwasem octowym, 10% metanolu. Piki wykrywa się stosując zestaw Knauer Variable Wavelenght Monitor przy 256 nm i frakcje zbiera ręcznie. Zbiera się 3 zestawy frakcji, pik 1 (czas retencji 24,4 minuty), region nakładający się pomiędzy pikami i pik 2 (czas retencji 27,8 minut). Frakcje z każdego zestawu łączy się, odparowuje pod obniżonym ciśnieniem w celu usunięcia metanolu, po czym liofilizuje w celu usunięcia lotnych składników. Pozostałość rozpuszcza się w wodzie, zakwasza do pH 4 za pomocą kwasu octowego i ponownie liofilizuje pik 1 (1,57 g) i pik 2 (0,91 g). Analiza HPLC produktów z zastosowaniem kolumny YMC-Pack

180 609

ODS-AM (cat. no. RM-33-5; wymiary: 250 x 4,6 mm I.D.; cząstki S-5 mm, 120 A), eluowanie 0,5 ml/minutę z zastosowaniem fazy ruchomej 90% 0,1 M octanu amonu, zakwaszonego do pH 4 kwasem octowym, 10% metanolu wskazuje, że pik 1 (czas retencji 24,4 minut na kolumnie preparatywnej) zawiera mieszaninę 70,8% piku 1 (czas retencji 21,1 minut), 26,4% piku 2 (czas retencji 24,6 minut) i 2,8% całkowicie zhydrolizowanego produktu (czas retencji 12,4 minut); a pik 2 (czas retencji 27,8 minut na kolumnie preparatywnej) zawiera mieszaninę 68,5% piku 2 (czas retencji 22,0 minut), 27,5% piku 1 (czas retencji 20,2 minut) i 4% całkowicie zhydrolizowanego produktu (czas retencji 11,6 minut). Pik 2 (0,91 g) i pik 1 (1,57 g) rozpuszcza się każdorazowo w 90% 0,1 M octanu amonu zakwaszonego do pH 4 kwasem octowym, 10% metanolu (3,60 ml) i ponownie oczyszcza, stosując układ wyżej podany w postaci 18 iniekcji po 200 ml. Dwa zestawy frakcji odpowiadające pikom 1 i 2 zbiera się, łączy, częściowo odparowuje pod obniżonym ciśnieniem w celu usunięcia metanolu, a pozostałość liofilizuje w celu usunięcia pozostałości lotnych składników. Pozostałość z każdego zestawu frakcji rozpuszcza się w wodzie, ostrożnie zakwasza do pH 4 za pomocą kwasu octowego i ponownie liofilizuje. Z frakcji odpowiadających pikowi 1 otrzymuje się białą puszystą substancję stałą (0,70 g), która okazuje się higroskopijna po wystawieniu na powietrze; Analiza HPLC (prowadzona w sposób wyżej podany) wskazuje, że jest to mieszanina zawierająca 94,9% piku 1 (czas retencji 21,1 minut), 4,6% piku 2 (czas retencji 26,7 minut) i 0,5% całkowicie zhydrolizowanego produktu (czas retencji 11,8 minut); analiza Ή-NMR (^d6DMSO, wartości 5 podane wobec tetrametylosilanu jako wzorca wewnętrznego) wykazuje charakterystyczne piki: δ 5,43 (m_AB, 2H, J_AB =11,1 Hz, d_A 5,44, d_B 5,43), 3,02 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 0,82 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,75 (d, 3H, J = 6,8 Hz).

Z frakcji odpowiadających pikowi 2 otrzymuje się białąpuszystąsubstancję stałą(0,81 g), która okazuje się higroskopijna po wystawieniu na powietrze; analiza HPLC (prowadzona w sposób wyżej podany) wskazuje, że jest to mieszanina zawierająca 91,0% piku 2 (czas retencji 29,8 minut), 8,4% piku 1 (czas retencji 28,4 minut) i 0,6% całkowicie zhydrolizowanego produktu (czas retencji 14,4 minut); analiza 'H-NMR(^d6DMSO, wartości δ określone wobec tetrametylosilanu jako wzorca wewnętrznego) wykazuje charakterystyczne piki d 5,43 (s, 2H), 2,99 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 0,83 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,76 (d, 3H, J = 6,8 Hz).

Przykład VIII.A.Wytwarzanie(N-benzyloksykarbonylo)-L-walinianu(R)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu

Do roztworu 327 mg (1,30 mmoli, 3 równoważniki) N-benzyloksykarbonylo-L-waliny w 25 ml dichlorometanu w atmosferze azotu dodaje się 134 mg (0,65 mmoli, 1,5 równoważników) i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 13,5 godzin. Otrzymaną mieszaninę sączy się w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału, a rozpuszczalnik odparowuje pod obniżonym ciśnieniem, stosując wyparkę rotacyjną. Otrzymaną białą pianę rozpuszcza się w 10 ml bezwodnego DMF i dodaje bezpośrednio do roztworu 150 mg (0,43 mmoli, 1 równoważnik) (S)- 2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-benzyloksy-1 -propan- 1 -olu w 10 ml również bezwodnego DMF. Do roztworu DMF dodaj e się 13 mg (0,11 mmola, 0,25 równoważnika) 4,4-dimetylo-amino-pirydyny i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 27 godzin, w którym to momencie analiza TLC wskazuje na zużycie materiału wyjściowego. Mieszaninę reakcyjną odparowuje się pod obniżonym ciśnieniem, a surowy produkt oczyszcza się drogą szybkiej chromatografii, stosując jako fazę ruchomą 95% chlorku metylenu, 5% metanolu i otrzymuje związek tytułowy w postaci bezpostaciowej substancji stałej (158 mg, 63%).

B. Wytwarzanie chlorowodorku L-walinianu (R)- 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-1 -propanylu

158 mg (0,27 mmola) (N-benzyloksykarbonylo)-L-walinianu (R)- 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-benzyloksy-l-propanylu rozpuszcza się w 15 ml metanolu i dodaje 24 ml (0,27 mmola) stężonego kwasu solnego. Mieszaninę umieszcza się w atmosferze azotu i dodaje 48 mg 10% palladu na węglu. Mieszaninę uwodornia się we wstrząsarce Parra w atmosferze wodoru (ciśnienie 50 x 0,7 kG/cm²) w ciągu 5 godzin. Mieszaninę sączy się przez wkład z celitu, a pozostałość przemywa metanolem (25 ml). Po odparowaniu połączonych

180 609 przesączów i przemy wek pod obniżonym ciśnieniem otrzymuje się 107 mg (95%) związku tytułowego. Analiza HPLC produktu z zastosowaniem kolumny YMC-Pack ODS-AM (cat. no. RM-33-5; wymiary 250 x 4,6 mm I.D.; cząstki, S-5 mm, 120 A), eluowanie przy 0,5 ml/minutę z zastosowaniem jako fazy ruchomej 90% 0,1 M octanu amonu zakwaszonego do pH 4 kwasem octowym, 10% metanolu, wskazuje, że jest to mieszanina 85:15 diastereomerów (R) i (S).

Przykład IX. Określanie doustnej absorpcji (biodostępności) u szczura

Następujący test stosuje się do oznaczania doustnej absorpcji (doustnej biodostępności) związku o wzorze 1 (L-monowalinowego estru gancicloviru) i innych aminokwasowych estrów gancicloviru, innych estrów i eterów gancicloviru badanych w celach porównawczych.

Dla pomiaru doustnej biodostępności związku najpierw oznacza się poziom związku w osoczu u szczurów samców po pojedynczym doustnym (po) podaniu związku. Dla pomiaru doustnej biodostępności substancji pro-drug, najpierw poziom w osoczu substancji czynnej, wtym przypadku gancicloviru, oznacza się u szczurów samców po podaniu pojedynczej dawki (po) substancji pro-drug. Następnie oznacza się poziom w osoczu substancji czynnej, gancicloviru, u szczurów samców po pojedynczym podaniu dożylnej (iv) dawki związku. Dla gancicloviru pojedyncza dawka w każdym przypadku, (po) i (iv), wynosi 10 mg/kg; dla estru pro-drug (włącznie z L-monowalinowym estrem gancicloviru) pojedyncza dawka w każdym przypadku, (po) i (iv), stanowi dawkę równomoIową wobec 10 mg/kg gancicloviru. Z tych dwóch pomiarów po podaniu (po) i (iv) oblicza się doustną biodostępność związku przez podzielenie całkowitego pola pod krzywą stężenie wobec czasu po podaniu (po) przez całkowite pole pod krzywą stężenie wobec czasu po podaniu (iv), odpowiednio poprawione dla dawki, zgodnie z równaniem:

F/_p.o.//%/ = [AUC/_p._oy/AUC/i.v./] x [dawka/i._v.//dawka/p._o./ x 100

Wartości AUC (całkowite pole pod krzywą) oblicza się przez cały zakres czasu, który analizowano z 0-24 godzin.

Podłoże dawki do podawania doustnego i dożylnego zawiera normalną solankę zawierającą 2% kwasu octowego. W obydwu przypadkach stężenie związku jest równoważne do 4,0 mg/ml gancicloviru z dawką równoważną do 10 mg/kg (2,5 ml/kg) gancicloviru. Szczur o wadze 200 g otrzymuje 0,5 ml roztworu leku per os przez zgłębnik albo drogą iniekcji do żyły ogonowej.

Szczury poddaje się aklimatyzacji do środowiska laboratoryjnego w ciągu 3 dni i utrzymuje się je bez pokarmu przez noc przed rozpoczęciem doświadczenia i do 4 godzin po dawkowaniu. Zbiera się krew od 4 szczurów w następujących okresach czasu: minuta 0 (pre-dawka), minuta 5 (tylko iv), 15 minut, 30 minut, 1 godzina, 2 godziny, 3 godziny, 5 godzin, 7 godzin, 10 godzin i 24 godziny. Krew natychmiast wiruje się w celu otrzymania osocza i osocze zamraża się do temperatury -20°C aż do analizy.

Testowanie gancicloviru w osoczu

Próbki osocza (0,50 ml) miesza się z 0,020 ml wzorca wewnętrznego (acyclovir, 15 pg/ml w 10 % metanolu/wodzie) i 3,0 ml acetonitrylu. Mieszaninę poddaje się wirowaniu i otrzymany osad usuwa się po odwirowaniu (4.000 g, 10 minut). Supematant odparowuje się do sucha w atmosferze azotu i roztwarza w 200 μΐ fazy ruchomej HPLC. Próbki (0,05 ml) poddaje się analizie za pomocąHPLC, stosując Keystone Hypersil BDS, kolumna C 18 250 x 4,6 mm. Faza ruchoma zawiera 2% acetonitrylu w 30 mM buforu z fosforanu sodu zawierającego 5 mM kwasu heptanosulfonowego o pH 2,0 i podaje się ją z prędkością 1,0 ml/minutę. Ganciclovir i wzorzec wewnętrzny wykrywa się i mierzy za pomocą absorbancji UV przy 254 nm.

180 609

Doustna biodostępność

Związek	Doustna biodostępność (F %)	Literatura
Ganciclovir (G)	7,9	US 4355032
[2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-1,3-propanodiol] G-bis-ester kwasu propionowego	17,7	J. Phann. Sci. 76, 180-184 (1987)
G-bis-ester L-waliny	52,0	EP 375329
eter benzylowy estru G-L-waliny	nie wykrywalny	-
dioctan G-bis-estru fenyloglicyny	8,18	-
eter dibenzylowy G	nie wykrywalny	-
F,strv aminokwasowe według wynalaz	Ul
octan G-L-walinianu	84,0
chlorowodorek G-L-walinianu	98,1

PrzykładX. Oznaczanie doustnej absorpcj i (biodostępności) na małpach Cynomolgus

Następujący test stosuje się do oznaczania doustnej absorpcji (doustnej biodostępności) związku o wzorze 1 na małpach Cynomolgus.

Zwierzęta, dawkowanie i zbieranie próbek

Stosuje się samce małp Cynomolgus o wadze 5-7 kg. Zwierzęta karmi się karmą dla małp, owocami i wodą i utrzymuje w cyklu 12-godzinnym światła. Testowane związki formułuje się w stężeniu odpowiadającym molowo 10 mg/ml roztworu gancicloviru w solance. Preparat doustny podaje się przez zgłębnik w ilości 1,0 ml/kg do dawki końcowej odpowiadającej molowo dawce 10 mg/kg gancicloviru. Preparat dożylny gancicloviru sporządza się w solance zawierającej 0,2% HC1 w stężeniu 20 mg/ml i podaje w ilości 0,5 ml/kg.

Zwierzętom nie podaje się pożywienia zaczynając od wieczoru przed dawkowaniem do 4 godzin po dawkowaniu. Od każdej małpy pobiera się próbki krwi w punktach czasowych 0 (przed dawkowaniem), 5 minut (tylko iv), 15 minut, 30 minut, 1 godzina, 2 godziny, 3 godziny, 5 godzin, 7 godzin, 10 godzin i 24 godziny po dawkowaniu. Próbki krwi pobiera się w heparynizowanych strzykawkach i natychmiast oddziela osocze drogąodwirowania i zamraża w temperaturze -20°C aż do analizy.

Testowanie gancicloviru w osoczu

Próbki osocza (0,5 ml) miesza się z 0,020 ml wzorca wewnętrznego (acyclovir, 15 pg/ml w 10% metanolu/wodzie) i 3,0 ml acetonitrylu. Mieszaninę miesza się i otrzymany osad usuwa drogąodwirowania (4.000 g, 10 minut). Ciecz znad osadu odparowuje się do sucha w atmosferze azotu i roztwarza w 200 μΐ fazy ruchomej HPLC. Próbki (0,05 ml) poddaje się analizie HPLC z zastosowaniem kolumny C 18, Hypersil BDS, 250 x 4,6 mm. Faza ruchoma zawiera 2% acetonitrylu w 30 mM buforu z fosforanu sodu zawierającego 5 mM kwasu heptanosulfonowego o pH 2,0, i podaje z prędkością 1,0 ml/minutę. Ganciclovir i wzorzec wewnętrzny wykrywa się i mierzy za pomocą absorbancji UV przy 254 nm.

Biodostępność (F) oblicza się według równania podanego w przykładzie IX.

Substancja pro-drug, a mianowicie L-walinian 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu, wykazuje doustną biodostępność wynoszącą 35,7%. Bis-L-walinian2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l,3-propanodiylu wykazuje doustnąbiodostępność 23,5%. Ganciclovir wykazuje biodostępność 9,9%. Przy podawaniu tej samej substancji pro-drug doustnie, a gancicloviru dożylnie tym samym małpom uzyskuje się średnią biodostępność dla substancji pro-drug 41,6%.

Przykład XI. Następujące przykłady kapsułek L-walinowego monoestru gancicloviru zawierają jako podłoże poli winy lopirolidon jako środek wiążący, skrobię kukurydzianą jako środek rozkruszający i kwas stearynowy jako środek smarujący i zwiększający poślizg. Substan

180 609 cjami tymi napełnia się dwuczęściowe twarde kapsułki żelatynowe. Woda stanowi ciecz granulującą! jest zasadniczo usuwana podczas procesu.

Ilościowa kompozycja L-walinowego monoestru gancicloviru Kapsułki (jedna kapsułka trzy razy dziennie)

Składniki	Waga na kapsułkę (mg)	% wag./wag.
Chlorowodorek L-walinowego monoestru gancicloviru	390,00	92,75
Poliwinylopirolidon	12,61	3,00
Skrobia kukurydziana	16,81	4,00
„ t i Kwas stearynowy	1,05	0,25
Całkowita waga wypełnienia (teoretycznie)3	420,47	100,00

Ilość kwasu stearynowego może się zmieniać od 0,1% do 5,0% wagowych.

Ilość wody może się zmieniać tak, aby uzyskiwać dopuszczalne granulowanie i usuwa się ją drogą suszenia.

⁵ Całkowita waga wypełnienia (teoretycznie) nie obejmuje resztek wilgoci, która może być obecna w produkcie końcowym.

Sproszkowaną mieszanką napełnia się łupiny dwuczęściowych twardych kapsułek żelatynowych.

Ilościowa kompozycja L-walinowego monoestru gancicloviru Kapsułki (dwie kapsułki trzy razy dziennie)

Składniki	Waga na kapsułkę (mg)	% wag./wag.
Chlorowodorek L-walinowego monoestru gancicloviru	312,00	92,75
Poliwinylopirolidon	10,09	3,00
Skrobia kukurydziana	13,45	4,00
TZ x i Kwas stearynowy	0,84	0,25
Woda2
Całkowita waga wypełnienia (teoretycznie)3	336,38	100,00

¹ Ilość kwasu stearynowego może się zmieniać od 0,1% do 5,0% wagowych.

² Ilość wody może się zmieniać tak, aby otrzymywać korzystny granulat, i usuwa się ją drogą suszenia.

³ Całkowita waga wypełnienia (teoretycznie) nie obejmuje resztek wilgoci, która może być obecna w produkcie końcowym.

Sproszkowaną mieszaniną napełnia się łupiny dwuczęściowych twardych kapsułek żelatynowych.

Przykład sposobu wytwarzania kapsułek L-walinowego monoestru gancicloviru:

1. Miesza się L-walinowy monoester gancicloviru i część skrobi kukurydzianej w odpowiednim mieszalniku.

2. Poliwinylopirolidon rozpuszcza się, mieszając, w wodzie.

3. Dodaje się (2) do (1), kontynuując mieszanie w celu otrzymania granulatu.

4. Wilgotny granulat miele się, jeśli to konieczne.

5. Wilgotny granulat suszy się w suszarce.

6. Suchy granulat, pozostałą skrobię kukurydzianąi kwas stearynowy miele się w młynie.

7. Miesza się (6) w odpowiednim mieszalniku.

8. Odpowiednią ilość (7) wprowadza się do dwuczęściowych twardych kapsułek żelatynowych.

180 609

180 609

Wzór 2

180 Ó09

Wzór 3

X ρ3ΗΝ^ΛΝ^Ν^?

Η

Wzór 5

180 609

Wzór 6

CH2XCHCH2OR³

Wzór 7

R

CH2XCHCH2OH

CH2OH

Wzór 8

180 609

Β

CHoOCHCHoOR¹ ch₂or

W z dr 9

WzoT 10

Wzdr 11

Wzór 12

180 609

t -O- CH2-N(CH₃)₂

Wzór 14

C Xoy CH₂-N(C₂H₅)2

Wzór 15 i X2>CH₂-N(C₃H₇)2

Wzór 16 ^<oy^cH2“^N2Z°

Wzór 17

180 609

0H

SCHEMAT

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Związek, L-walinian 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-1-propanylu albo jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w postaci diastereomerów (R) albo (S), albo w postaci mieszanin tych dwóch diastereomerów.
2. 2. Związek według zastrz. 1, składający się z tej mieszaniny zawierającej równe ilości diastereomerów (R) i (S).
3. 3. Związek według zastrz. 1, w którym farmaceutycznie dopuszczalna sól stanowi chlorowodorek albo octan.
4. 4. Związek według zastrz. 1, w postaci krystalicznej.
5. 5. Związek według zastrz. 1, który stanowi L-walinian (R)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole.
6. 6. Związek według zastrz. 1, który stanowi L-walinian (S)-2-(2-amino-1,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole.
7. 7. Związek według zastrz. 5 albo 6, w którym soląjest chlorowodorek.
8. 8. Związek według zastrz. 5 albo 6, w którym soląjest octan.
9. 9. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera związek według jednego z zastrz. 1-8 i ewentualnie zawiera farmaceutycznie dopuszczalne podłoże albo nośnik.
10. 10. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 9 do podawania dożylnego.
11. 11. Związek o wzorze 2, w którym P¹ oznacza atom wodoru albo grupę hydroksy-ochronną, a P² oznacza grupę amino-ochronną.
12. 12. Sposób wytwarzania L-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu albo jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli, albo diastereomerów, znamienny tym, że (a) usuwa się grupę amino- i/lub hydroksy-ochronnąod związku o wzorze 4, w którym P¹ oznacza grupę hydroksy-ochronną albo atom wodoru, P² oznacza grupę amino-ochronną, a P³ oznacza atom wodoru albo ma znaczenie podane dla P², przy czym otrzymuje się L-walinian 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propany lu albo jego farmaceutycznie dopuszczalną sól; (b) L-walinian 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalną sól; albo (c) 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l,3-propanodiol (ganciclovir) albo jego sól poddaje się estryfikacji za pomocą aktywowanej pochodnej L-waliny; albo (d) ewentualnie podstawionąguaninę o wzorze 5, ewentualnie w postaci persililowanej, w którym P³ oznacza atom wodoru albo grupę amino-ochronną, poddaj e się kondensacj i z 2-podstawioną gliceryną o wzorze 6, wktórym Y¹ i Y² niezależnie oznaczają atomy chlorowca, niższe grupy acyloksylowe, niższe grupy alkiloksylowe, albo grupy arylo(niż.)alkiloksylowe, a Z oznacza grupę odszczepialną wybraną z grupy niższej acyloksylowej, metoksylowej, izopropoksylowej, benzyloksylowej, chlorowca, grupy mesyloksylowej lub tosyloksylowej; ewentualnie w obecności katalizatora z kwasu Lewisa, przy czym otrzymuje się L-walinian 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu; albo (e) bis-ester, a mianowicie bis-(L-walinian) 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-l,3-propanodiylu albo jego sól poddaje się częściowej hydrolizie, otrzymując monoester, czyli L-walinian 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu albo jego farmaceutycznie dopuszczalną sól; albo (f) prowadzi się diastereomeryczne rozdzielanie L-walinianu 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-okso-puryn-9-ylo)-metoksy-3-hydroksy-l-propanylu na diaste- reomery (R) i (S).

    180 609
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że usuwanie grup amino- i hydroksy-ochronnych prowadzi się w warunkach kwasowych.

    * * *