CZ290511B6 - 2-(2-Amino-1,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-1-propanyl-L-valinát a jeho pouľití, meziprodukt a farmaceutická kompozice - Google Patents

Abstract

2-(2-Amino-1,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-1-propanyl-L-valin t nebo jeho farmaceuticky akceptovateln s l, ve form (R)- nebo (S)-diastereomeru nebo ve form sm s t chto dvou diastereomer . Pou it tohoto L-valin tu pro p° pravu farmaceutick²ch kompozic pro l en virov²ch a p° buzn²ch nemoc a tyto kompozice. Meziprodukt pro v²robu tohoto valin tu, vzorce II, kde P.sup.1.n. je vod k, nebo hydroxy-chr nic skupina a P.sup.2.n. je amino-chr nic skupina.\

Description

(57) Anotace:

2-(2-Amino-1,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3hydroxy-l-propanyl-L-valinát nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, ve formě (R)- nebo (S)-diastereomeru nebo ve formě směsí těchto dvou diastereomerů. Použití tohoto L-valinátu pro přípravu farmaceutických kompozic pro léčení virových a příbuzných nemocí a tyto kompozice. Meziprodukt pro výrobu tohoto valinátu, vzorce II, kde P¹ je vodík, nebo hydroxy-chránicí skupina a P² je amino-chránicí skupina.

CO m o σ> CN

N O

o

(II)

2-(2-Amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-L-valinát a jeho použití, meziprodukt a farmaceutická kompozice

Oblast techniky

Vynález se týká určitého esteru aminokyseliny purinového derivátu, který je odvozen od gancikloviru. Zejména se týká 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy1-propanyl-L-valinátu a jeho farmaceuticky akceptovatelných solí, použití těchto látek pro výrobu léčiv, meziproduktu pro jejich přípravu a farmaceutických kompozic na jejich bázi.

Dosavadní stav techniky

Britský patent 1523865 popisuje antivirové purinové deriváty s acyklickým řetězcem v poloze 9. Mezi těmito deriváty, jak bylo zjištěno, 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxo-l,6-dihydropurin-9yl)methoxyethanol s INN názvem acyklovir má dobrou účinnost vůči virům herpes jako je herpes simplex.

Zatímco acyklovir, jak bylo zjištěno, je velice účinný při topickém nebo parenterálním podání, je jenom mírně absorbován po orálním podání.

Patent US 4 355 032 zveřejňuje sloučeninu 9-[(2-hydroxy-l-hydroxymethylethoxy) methyl]guanin nebo 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l,3-propandiol s INN názvem ganciklovir.

Ganciklovir je vysoce účinný vůči virům rodu herpes, například vůči herpes simplex a cytomegaloviru. Má relativně nízkou míru absorpce když se podává orálně a musí být použit ve vysokých dávkách, když se podává touto cestou. Ganciklovir se nejčastěji podává intravenózní infuzí. Tento způsob podání má nevýhodu, zeje velmi nevýhodný vůči pacientovi, přičemž často vyžaduje pomoc lékaře, sestry nebo jiného zdravotního profesionála. Je zde také určité riziko infekce, která je zvlášť problematická u imunokompromisních pacientů, kteří jsou léčeni ganciklovirem a mohou mít malou odolnost vůči infekcím. Tudíž je velmi žádoucí vytvořit ganciklovir se zlepšeným orálním absorpčním profilem.

Britská přihláška vynálezu GB 2 122 618 zveřejňuje deriváty 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guaninu generického vzorce

CH-XCHCH-OR^{3 2} 1 ²

R kde X představuje atom kyslíku nebo síry, R¹ představuje hydroxy nebo aminoskupinu, R² představuje atom vodíku nebo skupinu vzorce -CIUOR³³ a R³ a R^3a mohou být totožné nebo

-1 CZ 290511 B6 rozdílné, přičemž každý představuje acylový zbytek aminokyseliny a jeho fyziologicky akceptovatelné soli.

Tylo sloučeniny jsou užitečné pro léčení virových infekcí a mají vysokou rozpustnost ve vodě, což jim dává hodnotu při formulacích vodných farmaceutických přípravků.

Zatímco generický vzorec v britské přihlášce vynálezu zahrnuje sloučeniny, ve kterých R² je skupina -CH₂OR^3a, specifické sloučeniny této skupiny nejsou zveřejněny. Tato přihláška vynálezu také zveřejňuje ty formulace, použité s těmito sloučeninami, se zlepšenou rozpustností ve vodě včetně orálních, rektálních, nasálních a topických, vaginálních nebo parenterálních.

Britská přihláška vynálezu GB 2 104 070 zveřejňuje antivirové sloučeniny vzorce

CH_nXCHCH„OH ² I ²

CH₂OH kde Rje hydroxy nebo aminoskupina a X je kyslík nebo atom síry, a fyziologicky akceptovatelné soli a estery’.

Obecný vzorec zahrnuje ganciklovir a fyziologicky akceptovatelné soli a estery. Estery zahrnují ty, které obsahují formyloxyskupinu, Cmí (například Ci-é) alkanoyloxy (například acetoxy nebo propionyloxy), volitelně substituovaný aralkanoyloxy (například fenyl-Ci_4alkanoyloxy jako je fenylacetoxy) nebo volitelně substituovaný aroyloxy (například benzoyloxy nebo naftoyloxy esterové seskupení na jedné nebo obou terminálních polohách 9 postranního řetězce sloučenin tohoto obecného vzorce.

Výše zmíněné aralanoyloxy nebo aroyloxyesterové skupiny mohou být substituovány například jedním nebo více halogeny, (například atomy chrómu nebo bromu) nebo amino nebo nitrilovými nebo sulfaminovými skupinami, přičemž arylový zbytek tohoto seskupení výhodně obsahuje 6 až 10 atomů uhlíku.

Evropská přihláška vynálezu 375 329 zveřejňuje prekurzorové sloučeniny následujícího vzorce

B

I

C^OCHCf^OR¹ ch₂or

-2CZ 290511 B6 kde R a R¹ jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku a aminoacylového zbytku za předpokladu, že alespoň jeden substituent R a R¹ představuje acylový zbytek aminokyseliny a B představuje skupinu vzorců

ve kterých R² představuje Ci_6 nerozvětvený řetězec, C₃_6 rozvětvený řetězec nebo C₃_6 cyklickou alkoxylovou skupinu nebo hydroxy nebo aminoskupinu nebo atom vodíku a jejich fyziologicky akceptovatelné soli. Tyto prekurzorové sloučeniny jsou popsány tím způsobem, že mají výhodnou biodostupnost když jsou podány orálně, což má za následek vyšší hladinu výchozí sloučeniny v těle.

Příklad 3 b) Evropské přihlášky vynálezu o publikačním čísle 375 329 zveřejňuje přípravu bis(L— isoleucinát)esteru gancikloviru jako bílé pěny. Příklad 4 b) zveřejňuje přípravu bis(glycinát)esteru gancikloviru jako bílé tuhé látky. Příklad 5 b) zveřejňuje přípravu bis(L-valinát)esteru gancikloviru jako tuhé látky. Příklad 6 b) zveřejňuje přípravu bis(L-alaninát)esteru gancikloviru 15 jako sirupu obsahujícího 90 % bisesteru a 10 % monoesteru. Popsané bisestery jsou nekrystalické materiály, které jsou obtížné ke zpracování pro výrobu orálních farmaceutických dávkovačích forem.

Britská přihláška vynálezu 8829571 zveřejňuje estery aminokyselin sloučenin vzorce

kde R představuje hydroxy nebo aminoskupinu nebo atom vodíku, a jejich fyziologicky akceptovatelné soli.

Příklady výhodných aminokyselin zahrnují alifatické kyseliny, například obsahující až 6 atomů 5 uhlíku jako je glycin, alanin, valin a isoleucin. Estery aminokyselin zahrnují jak monoestery, tak diestery.

Avšak tato přihláška vynálezu stejně jako evropská přihláška vynálezu publikační číslo 375 329 a patent US 5 043 339 zveřejňují přípravu monoesterů a mnohem méně jakýchkoli údajů o jejich ío užitečnosti.

Jensen a kol., Acta Pharm. Nord. 3(4) 243-247 (1991) uvádějí syntézu, enzymatickou hydrolýzu a fyzikochemické vlastnosti N-substituovaných 4-(aminomethyl)benzoátdiesterových prekurzorů gancikloviru vzorce

ch₂ ^0R

CH₂OR kde R může být

-4CZ 290511 B6

ch₂---n(ch₃)₂

Tyto estery byly syntetizovány a vyhodnoceny s cílem zlepšit podávači vlastnosti gancikloviru. Tyto estery byly enzymaticky hydrolyzovány lidskou plazmou na mateřské léčivo, přičemž tato hydrolýza probíhala přes tvorbu odpovídajícího monoesteru. Autoři vyhodnotili tyto estery pokud jde o míru jejich enzymatické hydrolýzy, lipofilnosti a vyvodili, že vlastnosti těchto esterů působí, že tyto diestery jsou nadějným prekurzorem pro ganciklovir k zlepšení jeho podávačích vlastností, například pro parenterální podání.

Martin a kol., J. Pharm. Sci. 76(2), 180-184 (1987) zveřejňují mono- a diacylestery gancikloviru, které byly testovány k vyzkoušení jejich biodostupnosti po orálním podání.

Autoři uvádějí, že dipropionátester je asi o 42 % biodostupnější než ganciklovir samotný.

Evropská přihláška vynálezu 158 847 zveřejňuje mimo jiné, že 6-deoxyacyklovir a 6-deoxyganciklovir mohou být snadno převedeny in vivo působením enzymů na acyklovir a ganciklovir. Z experimentů na krysách vynálezci zjistili, že orální podání těchto 6-deoxyprekurzorů vede k účinné absorpci z gastrointestinálního traktu a k vysokým plazmatickým hladinám mateřských léčiv.

Maudgal a kol., Arch. Ophthalmol. 102, 140-143 (1984) zveřejňují glycinester acykloviru jako účinný při topickém léčení epitelové a stromální herpes simplex keratitidy přidružené iritidy, když se podává jako 1% oční kapky králíkům. Autoři zveřejňují glycin, alanin, beta-alanin a sukcinylestery acykloviru a indikují, že rozpustnost glycinesteru je asi 30x vyšší než rozpustnost samotného acykloviru, což umožňuje použití glycinesteru pro oční kapky s koncentracemi až 6 %, zatímco acyklovir samotný se používá jako mast, která je sotva účinná při stromální nemoci nebo iriditě.

-5CZ 290511 B6

Colla a kol., J. Med. Chem. 98. 602-604 (1983) zveřejňují některé ve vodě rozpustné esterové deriváty acykloviru a jejich soli jako prekurzory acykloviru. Autoři uvádějí, že acyklovir nemůže být dáván jako oční kapky nebo intramuskulámí injekce vzhledem ke své omezené rozpustnosti ve vodě a tudíž syntetizovali deriváty acykloviru, které jsou více ve vodě rozpustné než mateřská sloučenina. Autoři zveřejňují, chlorovodíkovou sůl glycylesteru, chlorovodíkovou sůl alanylesteru, chlorovodíkovou sůl beta-alanyl esteru, sodnou sůl sukcinylesteru a azidoacetátester.

Když byly zkoušeny na primárních králičích ledvinových buněčných kulturách vůči různým herpes simplex virům kmene typu 1 a typu 2, podle autorů, se přeni čtyři estery ukázaly být tak aktivní jako acyklovir samotný. Autoři navrhují, že tyto estery acykloviru by měly být praktičtější pro klinická použití než mateřská sloučenina pro topické léčení jako oční kapky a pro systemické léčení infekcí virem herpes, což dobře koresponduje s intravenózním acyklovirovým léčením. V kontrastu s acyklovirem tyto estery by měly být dávány v mnohem menších objemech a tudíž cestou intramuskulámích injekcí.

Beauchamp a kol. Antiviral Chemistry and Chemotherapy 3, 157-164 (1992) zveřejňují 13 esterů aminokyselin antiherpetického léčivého acykloviru a jejich účinnosti jako prekurzorů acykloviru, vyhodnocené u krys měřením urinámího zisku acykloviru.

prekurzorů léčiva vytvořilo větší množství mateřského léčiva v moči než samotný acyklovir: glycyl, D,L-alanyl, L-alanyl, L-2-aminobutyrát, D,L-valyl, L-valyl, DL-isoleucyl, L-isoleucyl, L-methionyl a L-prolylester. L-aminokyselinové estery byly lepšími prekurzory než odpovídající D- nebo D,L-izomery, čímž doporučují zahrnutí stereoselektivního transportéru.

Z tabulky 1 této publikace, která uvádí chemická data a orální biodostupnost těchto 18 aminokyselinových esterů, vyplývá, že estery D-aminokyselin mají nižší orální biodostupnost než samotný acyklovir. Tudíž, poněvadž estery D-aminokyselin nemají žádnou výhodu před acyklovirem, nejsou užitečné jako prekurzory acykloviru.

Achirální glycylester acykloviru však má vyšší orální biodostupnost než acyklovir (při urinámím ziskovém posouzení bylo získáno 30 % dávkovaného acykloviru ve formě glycylesteru, zatímco při dávkování acykloviru bylo získáno 19 % acykloviru). Podle autorů je L-valylester acykloviru nejlepším prekurzorem ze zkoumaných esterů.

Evropská přihláška vynálezu, publikační číslo 308 065 zveřejňuje valinové a isoleucinové estery acykloviru výhodně v L-formě jako vykazující velký vzrůst absorpce ze střeva po orálním podání ve srovnání s jinými estery acykloviru.

Nyní je hlavním léčivem pro léčení cytomegalovirových infekcí ganciklovir. Avšak jeho velmi omezená orální biodostupnost a potřeba pomalé denní intravenózní infuze léčiva (nebo pro intravitreální injekce nebo implantáty) ukazují naléhavou potřebu orální dávkovači formy se zlepšenou biodostupností.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje stabilní prekurzorovou formulaci gancikloviru se zlepšenou orální absorpcí a nízkou toxicitou. Tyto vlastnosti jsou zvlášť hodnotné pro potlačení herpetických infekcí u imunokompromisních pacientů, kde orální podání je terapeuticky výhodnou volbou. Navíc aktivní složky vykazují farmakologické vlastnosti, které dovolují jejich zlepšenou charakterizaci a farmaceutické zpracování. Překvapivě bylo zjištěno, že L-monovalinester gancikloviru a jeho farmaceuticky akceptovatelné soli vykazují tyto požadované vlastnosti.

-6CZ 290511 B6

Předmětem vynálezu je 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-lpropanyl-L-valinát nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, ve formě (R)~ nebo (S)—diastereomeru nebo ve formě směsí těchto dvou diastereomerů. Výše uvedený L-valinát je zde také označován názvem mono-L-valin-ganciklovir a lze ho znázornit vzorcem I

Ve výhodném provedení může být výše uvedený L-valinát tvořen směsí obsahující stejná množství (R)- a (S)-diastereomerů.

V jiném výhodném provedení je farmaceuticky akceptovatelnou solí tohoto L-valinátu hydrochlorid nebo acetát. L-Valinát podle vynálezu je s výhodou v krystalické formě.

Předmětem vynálezu je také farmaceutická kompozice obsahující výše uvedený L-valinát a popřípadě také farmaceuticky akceptovatelný základ nebo nosný materiál. Tato farmaceutická kompozice je s výhodou ve formě pro intravenózní podávání.

Dále je předmětem vynálezu také výše uvedený L-valinát pro použití jako léčivo, zejména jako léčiva pro léčení virových a příbuzných nemocí.

Předmětem vynálezu je rovněž použití tohoto L-valinátu pro přípravu farmaceutických kompozic, zejména farmaceutických kompozic pro léčení virových a příbuzných nemocí.

-7CZ 290511 B6

Konečně je předmětem vynálezu také meziprodukt pro přípravu výše uvedeného L-valinátu, obecného vzorce II

o (II) , kde

P¹ je vodík, nebo hydroxy-chránicí skupina a

P² je amino-chránicí skupina.

Způsob přípravy L-valinátu podle vynálezu a jeho farmaceuticky akceptovatelných solí zahrnuje esterifikaci gancikloviru a jeho derivátů, odstranění chránících skupin z gancikloviru esterifikovaného L-valinem, částečnou hydrolýzu bis-L-valinesteru gancikloviru na mono-L-valinester vzorce-I, kondenzaci guaninu substituovaným glycerolem, optické štěpení sloučeniny vzorce I a tvorbu solí prekurzoru vzorce I. Detaily tohoto způsobu jsou popsány dále.

Pokud není uvedeno jinak, následující výrazy, použité v popisu vynálezu a v patentových nárocích mají dále uvedené významy:

„Alkyl“ znamená nerozvětvenou nebo rozvětvenou nasycenou uhlovodíkovou skupinu, která má jeden a více určených atomů uhlíku. Například Cj.7 alkyl je alkyl, který má alespoň jeden, ale ne více než 7 atomů uhlíku, například methyl, ethyl, isopropyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, n-heptyl apod.

„Nižší alkyl“ znamená alkyl s jedním až 6 atomy uhlíku.

„Aryl“ znamená organickou skupinu odvozenou z aromatického uhlovodíku odstraněním jednoho atomu vodíku. Výhodné arylové skupiny mají 6 až 12 atomů uhlíku jako kruhových atomů v aromatickém uhlovodíku.

„Aralalkyl“ znamená organickou skupinu odvozenou z aralkanu, ve kterém je alkylový atom vodíku substituován výše definovanou arylovou skupinou.

„Acyl“ znamená organickou skupinu odvozenou od organické kyseliny odstraněním hydroxylové skupiny, například CH₃CO- je acylová skupina z CH₃COOH neboli acetyl. Jiné příklady pro takovéto acylové skupiny jsou propionyl nebo benzoyl atd. Výraz „acyl“ zahrnuje výraz „alkanoyl“, který je organickou skupinou R.CO-, ve které Rje alkylová skupina definovaná výše.

-8CZ 290511 B6 „Nižší alkoxy“, „(nižší alkyl)amino“, „di(nižší alkyljamino“, „(nižší alkanoyl)amino“, a podobné výrazy znamenají alkoxy, alkylamino, dialkylamino, alkanoylamino atd., ve kterých alkvlová skupina nebo každá alkylová skupina je „nižší alkyl“ jak je popsáno výše.

„Halogen“ znamená fluor, chlor, brom nebo jod.

Podle Hack’ova Chemical Dictionary, McGraw-Hill Book Company, 1969, „derivát“ sloučeniny znamená sloučeninu získatelnou z původní sloučeniny jednoduchým chemickým postupem.

„Aktivovaný derivát“ sloučeniny znamená reaktivní formu původní sloučeniny, která činí sloučeninu aktivní v požadované chemické reakci, ve které původní sloučenina je jen mírně reaktivní nebo nereaktivní. Aktivace se dosáhne tvorbou derivátu nebo chemického seskupení v molekule s vyšším obsahem volné energie než je u původní sloučeniny, což činí aktivovanou formu přístupnější vůči reakci s dalším reagentem.

V kontextu tohoto vynálezu má aktivace karboxyskupiny zvláštní důležitost a odpovídající aktivační prostředky nebo seskupení, které aktivují karboxyskupinu jsou detailněji popsány dále.

Příkladem aktivovaného derivátu L-valinu je sloučenina vzorce III

H (III) , ve kterém P² je amino-chránicí skupina a A je karboxy-aktivační skupina například halogen nebo nižší acyloxyskupina.

Dalším příkladem je anhydrid aminokyseliny, který je aktivovanou formou aminokyseliny, která způsobuje, že aminokyselina (zejména L-valin) je schopna esterifikace. Dalším příkladem je UNCA jak je popsáno dále detailněji.

Chrániči skupina znamená chemickou skupinu, která (a) ochraňuje reaktivní skupinu od účasti v nežádoucí chemické reakci a (b) může být snadno odstraněna, když není ochrana reaktivní skupiny dále vyžadována. Například benzylová skupina je chránící skupinou pro primární hydroxylovou funkční skupinu.

„Amino-chránicí skupina“ znamená chránící skupinu, která ochraňuje reaktivní aminoskupinu, která by jinak byla modifikována určitými chemickými reakcemi. Tato definice zahrnuje formylovou skupinu nebo nižší alkanoylovou skupinu se 2 až 4 atomy uhlíku, zejména acetylovou nebo propionovou skupinu, tritylovou nebo substituovanou tritylovou skupinu, jako monomethoxytritylová skupina, dimethoxytritylové skupiny jako je 4,4’-dimethoxytritylová nebo 4,4’-dimethoxytrifenylmethylová skupina, trifluoracetyl, a N-(9-fluorenylmethoxykarbonyl) nebo „FMOC“ skupina, alyloxykarbonylová skupina nebo jiné chránící skupiny odvozené od halogenuhličitanů jako jsou (C₆-Ci2)arylnižšíalkylkarbonáty, jako jsou terciární butylhalogen

-9CZ 290511 B6 karbonáty, zejména terciární butylchlorkarbonát, nebo di(nižší)alkyldikarbonáty, zejména di(t.butyl)dikarbonát, a ftalylová skupina.

„Hydroxy-chránicí skupina“ znamená chránící skupinu, která ochraňuje hydroxyskupinu, která by jinak byla modifikována určitými chemickými reakcemi.

Vhodné hydroxy-chránicí skupiny zahrnují ether-tvořící skupiny, které mohou být snadno odstraněny po dokončení všech jiných reakčních kroků, jako je benzylová nebo tritylová skupina, volitelně substituované v jejich fenylovém kruhu. Jiné vhodné hydroxy-chránicí skupiny zahrnují alkyletherové skupiny, tetrahydropyranyl, silyl, trialkylsilyletherové skupiny a alylovou skupinu.

„Odstupující skupina“ znamená labilní skupinu, která je nahrazena při chemické reakci další skupinou. Příklady odstupujících skupin jsou halogen, volitelně substituovaná benzyloxyskupina, isopropyloxyskupina, mesyloxyskupina, tosyloxyskupina nebo acyloxyskupina.

Všechny aktivační a chránící prostředky, použité při přípravě sloučeniny vzorce I musí dosáhnout následujících kvalifikací:

(1) jejich zavedení by mělo proběhnout kvantitativně a bez racemizace L-valinové složky, (2) chránící skupina přítomná během požadované reakce by měla být stabilní vůči reakčním podmínkám, které se mají použít a (3) skupina musí být snadno odstraněna za podmínek, při kterých je esterová vazba stabilní a za kterých se nevyskytuje racemizace L-valinové složky esteru.

„Chiralita“ znamená vlastnost pravolevé symetrie připsané molekule, která vystihuje symetrické elementy molekuly (nebo absenci elementů symetrie), molekuly, které postrádají elementy symetrie, jsou „chirální“. Chirální molekula postrádající všechny elementy symetrie, dokonce včetně prosté osy, je označena jako „asymetrická“.

Výraz „achirální“ znamená přítomnost alespoň jednoho elementu symetrie, jako je prostá osa.

„Izomerie“ se týká sloučenin, které mají stejnou atomovou hmotnost a atomové číslo, ale liší se v jednom nebo více fyzikálních nebo chemických vlastnostech. Různé typy izomerů zahrnují následující:

„Stereoizomer“ označuje chemickou sloučeninu, které má stejnou molekulovou hmotnost,, chemické složení a stavbu jako další sloučenina, ale s atomy rozdílně uskupenými. To znamená, že určité identické chemické skupiny jsou v rozdílných orientacích v prostoru a tudíž, když je tato sloučenina čistá, mají schopnost otáčet rovinu polarizovaného světla. Avšak některé čisté stereoizomery mohou mít optickou rotaci, která je tak slabá, že je nezjistitelná současným vybavením.

„Optický izomer“ popisuje jeden typ stereoizomerie, který se manifestuje otáčením, které tento izomer buď čistý, nebo v roztoku, vkládá do roviny polarizovaného světla. To je vyvoláno v mnoha případech připojením čtyř rozdílných chemických atomů nebo skupin do alespoň jednoho atomu uhlíku v molekule, nebo vyjádřeno alternativně, výše popsanou chiralitou molekuly.

Stereoizomery nebo optické izomery, které jsou zrcadlovými obrazy jeden druhého jsou označeny jako „enantiomery“ a mohou být označeny jako enantiomemí. Chirální skupiny, které jsou zrcadlovými obrazy jedna druhé, jsou označeny jako enantiomemí skupiny.

- 10CZ 290511 B6

Enantiomery, jejichž absolutní konfigurace nejsou známy, mohou být diferenciovány jako pravotočivé (předpona +) nebo levotočivé (předpona -) v závislosti na směru, ve kterém za určitých experimentálních podmínek otáčejí rovinu polarizovaného světla.

Když jsou stejná množství enantiomemích molekul přítomna společně, pak se produkt označuje jako racemický, nezávisle na tom, zdaje krystalický, kapalný nebo plynný. Homogenní tuhá fáze, tvořená ekvimolámími množstvími enantiomemích molekul, se označuje jako racemická sloučenina. Směs ekvimolámích množství enantiomemích molekul přítomných jako separátní tuhá fáze, se označuje jako racemická směs. Jakákoli homogenní fáze obsahující ekvimolámí množství enantiomemích molekul se označuje jako racemát.

Sloučeniny, které mají dva asymetrické atomy uhlíku (chirální centra), mají 4 stereoizomery, které tvoří dva páry enantiomerů. Zatímco enantiomery páru jsou zrcadlovými obrazy jeden druhého, enantiomery dvou separátních párů nejsou zrcadlovými obrazy jeden druhého a jsou nazývány „diastereomery“. Diastereomery mají podobné, ale ne identické chemické vlastnosti a mají rozdílné fyzikální vlastnosti, například teploty tání, rozpustnost a tak dále.

Opticky aktivní sloučeniny zde mohou být označeny pomocí konvencí, to je R- a S-sekvenovací systém Cahna a Preloga; erythro a threoizomery; D a L-izomery; d- a 1-izomery; a (+) a (-) izomery, které indikují, že směr roviny polarizovaného světla se otáčí chemickou strukturou buď čistou nebo v roztoku.

Tyto konvence jsou dobře známy v dosavadním stavu techniky a jsou popsány detailně E.L. Elielem v Stereochemistry of Carbon Compounds, vydané McGraw Hill Book Company, lne. zNew Yorku v roce 1962 a odkazy tam citovanými. Tak tyto izomery mohou být popsány jako d-, 1-, nebo d, 1—pár, nebo D-, L-, nebo D,L-pár nebo R-, S-, nebo R,S-pár, v závislosti na použitém nomenklaturním systému.

Obecně tato přihláška vynálezu bude používat (D), (L) a (D,L) označení pro aminokyselinu (valin) a (R), (S) a (R,S) označení pro asymetrický uhlík v ganciklovirové skupině, aby se dosáhlo odlišení mezi těmito dvěma skupinami.

Sloučenina vzorce I a sloučeniny vzorce II mají dvě asymetrická centra (2 atomy uhlíku), jedno ve valinové složce a druhé v alifatickém postranním řetězci ganciklovirové složky. Druhé centrum je atom uhlíku 2 propanylové skupiny. Tudíž sloučenina vzorce I a sloučeniny vzorce II existují jako diastereoizomery nebo jako směsi diastereomerů.

Pokud se týká sloučenin tohoto vynálezu, jakýkoli diasteromer nebo směs diastereomerů mohou být použity a patentové nároky jsou určeny k pokrytí jednotlivých diastereomerů a jejich směsí pokud to není jinak omezeno. Vzorec I zahrnuje dva diastereomery vzorce I, stejně jako jejich směsi.

„Volitelný“ nebo „volitelné“ znamená, že popsaná událost nebo okolnost se může nebo nemusí vyskytnout a že tento popis zahrnuje případy, kdy tato událost nebo okolnost se vyskytuje a případy, ve kterých se nevyskytuje. Například „volitelně substituovaný fenyl“ znamená, že fenyl může nebo nemusí být substituován a že popis zahrnuje jak nesubstituovaný fenyl, tak fenyl, který je substituován; „volitelně následován přeměnou volné báze na adiční sůl s kyselinou“ znamená, že tato konverze může nebo nemusí být provedena, aby tento popsaný postup spadal do rozsahu vynálezu a vynález zahrnuje ty postupy, kde se volná báze převede na adiční sůl s kyselinou a ty postupy, ve kterých k tomu nedojde.

„Farmaceuticky akceptovatelný“ znamená, že to, co je užitečné při přípravě farmaceutické směsi je obecně bezpečné a netoxické a zahrnuje to, co je přijatelné pro veterinární použití stejně jako pro farmaceutické použití u lidí.

-11 CZ 290511 B6 „Farmaceuticky akceptovatelné soli“ znamená soli, které mají požadovanou farmakologickou účinnost a které nejsou ani biologicky, ani jinak nežádoucí. Takové soli zahrnují adiční soli s kyselinami vytvořenými s anorganickými kyselinami jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina dusičná, kyselina fosforečná apod., nebo s organickými kyselinami, jako je kyselina octová, kyselina propionová, kyselina hexanová, kyselina heptanová, kyselina cyklopentanpropionová, kyselina glykolová, kyselina pyrohroznová, kyselina mléčná, kyselina malonová, kyselina jantarová, kyselina jablečná, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina benzoová, o-(4-hydroxybenzoyl)benzoová kyselina, kyselina skořicová, kyselina mandlová, kyselina methansulfonová, kyselina ethansulfonová,

1.2- ethandisulfonová kyselina, 2-hydroxyethansulfonová kyselina, benzensulfonová kyselina, p-chlorbenzensulfonová kyselina, 2-naftalensulfonová kyselina, p-toluensulfonová kyselina, kafrosulfonová kyselina, 4-methylbicyklo[2.2.2]okt-2-en-l-karboxylová kyselina, glukoheptonová kyselina, 4,4’-methylenbis-(3-hydroxy-3-naftoová)kyselina, 3-fenylpropionová kyselina, trimethyloctová kyselina, terciární butyloctová kyselina, laurylsírová kyselina, glukonová kyselina, glutamová kyselina, hydroxynaftoové kyseliny, kyselina salicylová, kyselina stearová, kyselina mukonová apod.

Výhodné farmaceuticky akceptovatelné soli jsou ty, které jsou vytvořeny s kyselinou chlorovodíkovou, sírovou, fosforečnou, octovou nebo methansulfonovou, ethansulfonovou kyselinou,

1.2- ethanbisulfonovou kyselinou, 2-hydroxyethansulfonovou kyselinou, benzensulfonovou kyselinou, p-chlorbenzensulfonovou kyselinou a 2-naftalensulfonovou kyselinou, p-toluensulfonovou kyselinou a kafrsulfonovou kyselinou.

„Živočich“ zahrnuje lidi, jiné savce (jako jsou psi, kočky, králíci, hovězí dobytek, koně, ovce, kozy, vepři a vysoká zvěř) a nesavci jako jsou ptáci, ryby a podobně.

„Nemoc“ specificky zahrnuje jakýkoli nezdravý stav živočicha nebo jeho části. Tak „nemoc“ zde zahrnuje jakoukoli virovou nebo příbuznou nemoc, která je léčitelná mono-L-valinganciklovirem nebo jeho farmaceuticky akceptovatelnými solemi.

„Léčení“ znamená jakékoli léčení nemoci u živočicha a zahrnuje:

(1) prevenci nemoci od jejího výskytu u živočicha, který může být predisponován vůči této nemoci, ale ještě nemá dojem nebo průvodní symptomy této nemoci, například prevenci propuknutí klinických symptomů, (2) inhibici nemoci, například zastavení jejího rozvoje nebo (3) zmírnění nemoci, například vyvolání regrese symptomů této nemoci.

„Účinné množství“ pro léčení nemoci znamená to množství, které, když je podáno živočichu k jeho potřebě, je dostatečné k vyvolání léčení jak je výše uvedeno pro tuto nemoc.

Pokud není uvedeno jinak, zde popsané reakce se uskutečňují při atmosférickém tlaku v teplotním rozmezí od 5 °C do 170 °C (výhodně od 10 °C do 50 °C, nej výhodněji při teplotě „místnosti“ nebo „okolí“, například 20 °C až 30 °C). Avšak jsou zde samozřejmě některé reakce, kde teplotní rozmezí použitá při chemické reakci bude nad nebo pod těmito teplotními rozmezími.

Dále, pokud není stanoveno jinak, reakční doby a podmínky jsou považovány za přibližné. Například se uskutečňují při asi atmosférickém tlaku v teplotním rozmezí asi 5 °C až asi 100 °C (výhodně od asi 10 °C do asi 50 °C, nejvýhodněji asi 20 °C) po dobu asi 1 až asi 100 hodin (výhodně 5 až 60 hodin). Parametry uvedené v příkladech jsou považovány za určité, ne přibližné.

- 12 CZ 290511 B6

Izolace a vyčištění sloučenin a meziproduktů zde popsané mohou být prováděny, když je třeba, jakýmkoli vhodným separačním nebo čisticím postupem, jako je například filtrace, extrakce, krystalizace, sloupcová chromatografie, tenkovrstvá chromatografie nebo chromatografie na tlusté vrstvě nebo kombinací těchto postupů. Konkrétní znázornění vhodných separačních 5 a izolačních postupů může být řešeno odkazem na dále uvedené příklady provedení. Avšak jiné ekvivalentní separační nebo izolační postupy mohou být použity také.

Sloučenina vzorce I nebo její farmaceuticky akceptovatelné soli se připravují různými způsoby. Syntézní kroky jsou zjevné z vyznačených tečkovaných čar /(a) až (f) v dále uvedeném 10 vzorci 1/. Tečkované čáry ukazují schematicky na příslušná reakční místa a následující tabulka podává jasný popis různých způsobů, které budou dále popsány detailněji. Písmenné symboly v závorkách odkazují na příslušný krok v popisovaném způsobu a v patentových nárocích:

krok (a) (b) (c) (d) (e) (f) způsob deprotekce tvorba soli esterifikace kondenzace parciální hydrolýza optické štěpení/separace diastoreomeru

Tudíž způsob přípravy sloučeniny vzorce I nebo její farmaceuticky akceptovatelné soli zahrnuje jeden nebo více následujících kroků:

(a) odstranění amino- a/nebo hydroxy-chránicí skupiny ze sloučeniny vzorce IV

-13 CZ 290511 B6

(IV) ,

kde P¹ je hydroxy-chránicí skupina nebo vodík, P² je amino-chránicí skupina a P³ je vodík nebo P² k poskytnutí sloučeniny vzorce I nebo (b) konverzi sloučeniny vzorce I na její farmaceuticky akceptovatelnou sůl, nebo (c) esterifikaci 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l,3-propandiolu (gancikloviru) nebo jeho soli aktivovaným derivátem L-valinu, nebo (d) kondenzaci volitelně substituovaného guaninu vzorce V

H volitelně v persilylované formě, kde P³ je vodík nebo amino-chránicí skupina s 2-substituovaným glycerolem vzorce VI

(VI) ,

- 14CZ 290511 B6 kde Y¹ a Y² jsou nezávisle halogen, nižší acyloxy, nižší alkvloxy nebo araloxy skupiny a Z je odstupující skupina vybraná ze skupin nižší acyloxy, methoxy, isopropyloxy, benzyloxy, halogen, mesyloxy, nebo tosyloxy a podobně, volitelně v přítomnosti Lewisovy kyseliny jako katalyzátoru, čímž se vytvoří sloučenina vzorce I, nebo (e) parciální hydrolýzu bis-esteru 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l,3propandiyl-bis-(L-valinátu), nebo jeho soli k poskytnutí monoesteru vzorce I, nebo (f) optické štěpení nebo diastereomemí separaci sloučeniny vzorce 1.

Sloučenina vzorce I a její farmaceuticky akceptovatelné soli vykazují farmaceutickou účinnost a zejména antivirovou účinnost. Jako taková tato sloučenina a její farmaceuticky akceptovatelné soli jsou užitečné pro léčení široké oblasti stavů u živočichů, zejména u lidí.

Příklady stavů, které mohou být léčeny použitím sloučeniny a solí tohoto vynálezu zahrnují infekce viry herpes, jako jsou herpes typu 1, 2 a 6, varicella Zoster, Eppstein-Barr virus a zejména cytomegalovirus a hepatitida B a příbuzné viry u lidí a jiných živočichů, zejména u lidí.

Příklady klinických stavů vyvolaných těmito viry jsou herpetická keratitida, herpetická encefalitida, bolesti při nachlazení, genitální infekce (vyvolané virem herpes simplex), plané neštovice, pásový opar (vyvolaný varicellou Zoster), CMV-pneumonie a CMV-retinitida, zejména u pacientů se sníženou imunitou včetně příjemců transplantátů, například srdce, renálních a kostních dřeňových transplantátů, a u pacientů se syndromem získané snížené imunity (AIDS) a infekční mononukleosou vyvolanou Eppstein-Barr virem.

Sloučenina tohoto vynálezu je také užitečná pro léčení určitých karcinomů nebo lymfomů vyvolaných nebo příbuzných virovým infekcím jako je nasofaryngální rakovina, imunoblastický lymfom, Burkittův lymfom a vlasová leukoplakie.

V souhrnu pak tento vynález dále vytváří způsob léčení živočichů (zejména lidí) vykazujících stav, ve kterém výše popsaná virová infekce hraje roli nebo profylaktické léčení živočichů, kde se předchází takovéto virové infekci při léčení lékařem nebe veterinářem. Tento způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství mono-L-valingancikloviru nebo jeho farmaceuticky akceptovatelných solí těmto živočichům.

Terapeuticky účinné množství sloučeniny nebo její farmaceuticky akceptovatelné je množství, které je účinné při léčení tohoto stavu, to je nemoci.

Přesně podávané množství může kolísat v širokém rozmezí v závislosti na stupni závažnosti specifického stavu, který má být léčen, věku a hmotnosti subjektu, relativním zdraví subjektu a jiných faktorech (jako je typ formulace).

Pro orální předpis může terapeuticky účinné množství kolísat od asi 1 do 250 mg na kilogram tělesné hmotnosti na den, výhodně asi 7 až 100 mg na kilogram tělesné hmotnosti a den. Nejvýhodněji je terapeuticky účinné množství v rozmezí asi 10 až 50 mg na kilogram a den, zejména pro léčení CMV retinitidy a pneumonie. Tak pro 70 kg těžkého člověka je terapeuticky účinné množství od asi 70 mg na den do asi 7 g na den výhodně asi 500 mg/den do asi 5 g/den, nejvýhodněji 700 mg/den až 3,5 g/den. Pro intravitreální implantát je však dávka prekurzoru léčiva v rozmezí 0,5 mg až 25 mg, výhodně od 5 mg do 10 mg na implantát. Odborníkům v oboru je dobře známo, že různé dávkovači formy prekurzorů léčiva tohoto vynálezu bude vyžadovat různá dávkovači rozmezí.

Ganciklovir je vyzkoušeným antivirovým léčivem. Užitečnost prekurzoru gancikloviru tohoto vynálezu byla stanovena určováním úrovní koncentrací gancikloviru v krvi u testovaných živočichů (krysa a opice) po podání prekurzoru léčiva. Úroveň koncentrací v krevní plazmě byla

- 15 CZ 290511 B6 určována způsoby popsanými v příkladech 9 a 10, které jsou modifikovanými postupy popsanými Sommadosim a kol. v Reviews of Infectious Diseases 10 (3), S507 (1988) a vJoumal of Chromatography, Biomedical Applications 414, 429-433 (1987).

Sloučenina nebo její farmaceuticky akceptovatelné soli tohoto vynálezu mohou být podávány pomocí jakéhokoli obvyklého a akceptovatelného způsobu známého v dosavadním stavu techniky buď samostatné, nebo v kombinaci s dalším léčebným prostředkem. Obecně se sloučenina nebo soli tohoto vynálezu podávají jako farmaceutická směs s farmaceuticky akceptovatelným základem a podávají se orálně, systemicky (například transdermálně nebo čípky) nebo parenterálně (například intramuskulámě /im/, intravenózně /iv/, subkutánně /sc/) nebo intravitreálně implantátem. Sloučenina tohoto vynálezu může být tak podávána ve směsi, která je polotuhá, práškovitá, ve formě aerosolu, roztoku, suspenze nebo jiné vhodné směsi jak je popsáno dále. Orální farmaceutické směsi mají přednost.

Farmaceutická směs zahrnuje sloučeninu vzorce I nebo její farmaceuticky akceptovatelné soli, výhodně v kombinaci s farmaceuticky akceptovatelným základem. Takovýto základ je ten, který není toxický. Takovýto základ může být jakýkoli tuhý, kapalný, polotuhý, plynný (v případě aerosolu) základ, který je obecně dostupný odborníkům v oboru a neovlivňuje nepříznivě účinnost aktivního prostředku.

Obecně farmaceutická směs tohoto vynálezu bude obsahovat terapeuticky účinné množství sloučeniny nebo jejích farmaceuticky akceptovatelných solí v kombinaci s alespoň jedním základem. V závislosti na typu formulace, velikosti jednotlivé dávky, druhu základů a jiných faktorech známých odborníkům v oboru farmaceutických věd může množství sloučeniny tohoto vynálezu kolísat ve směsi v širokém rozmezí.

Obecně konečná směs bude obsahovat asi 1 % až asi 99,5 % hmotnostních sloučeniny tohoto vynálezu, přičemž zbytek je základ nebo základy. Výhodně úroveň aktivní sloučeniny bude asi 10,0% hmotnostních až asi 99% hmotnostních a nej výhodněji asi 50% hmotnostních až asi 99 % hmotnostních, přičemž zbytek bude vhodný základ nebo základy.

Užitečné farmaceutické základy pro přípravu farmaceutických směsí mohou být tuhé látky, polotuhé látky, kapaliny nebo plyny. Tak tyto směsi mohou mít formu tablet, pilulek, tobolek, prášků, čípků, transdermálních náplastí, formulací pro podpůrné uvolňování intravitreálních implantátů, roztoků, zvláště intravenózních roztoků, suspenzí, léčebných nápojů, aerosolů a podobně. Tuhé farmaceutické základy zahrnují škroby, jako je kukuřičný škrob, celulózu, talek, glukózu, laktózu, sacharózu, želatinu, slad, rýži, mouku, křídu, silikagel, stearát hořečnatý, stearát sodný, kyselinu stearovou, glycerolmonostearát, chlorid sodný, sušené odtučněné mléko a podobně. Kapalné a polotuhé základy mohou být vybrány z vody, ethanolu, glycerolu, propylenglykolu, různých olejů včetně olejů z ropy, živočišného, rostlinného nebo syntetického původu například arašídového oleje, sojového oleje, minerálního oleje, sezamového oleje a podobně. Voda, fyziologický roztok, vodný roztok dextrózy a glykoly jsou výhodnými kapalnými nosiči, zejména pro injektovatelné roztoky.

Jiné vhodné farmaceutické základy a nosiče a jejich formulace jsou popsány v „Remington’s Pharmaceutical Sciences“, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980) E.W. Martinem, na což se zde odkazuje.

Výhodně se farmaceutická směs podává v samostatné jednotkové dávkovači formě, výhodněji v orální dávkovači formě, pro kontinuální léčení nebo v samostatné jednotkové dávkovači formě ad libitum, když se specificky vyžaduje zmírnění symptomů.

I když nejširší vymezení vynálezu je shrnuto již výše jako sloučenina vzorce I a její farmaceuticky akceptovatelné soli, dává se přednost směsi (R,S) určitých solí.

- 16CZ 290511 B6

Následující kyseliny jsou výhodné pro tvorbu farmaceuticky akceptovatelných solí se sloučeninou vzorce I:

kyselina chlorovodíková, sírová, kyselina fosforečná, octová, methansulfonová, ethansulfonová, 1,2-ethandisulfonová, 2-hydroxyethansulfonová, benzensulfonová, p-chlorbenzensulfonová, 2-naftalensulfonová, p-toluensulfonová a kafrosulfonová kyselina. Nejvýhodnější jsou silné anorganické kyseliny jako kyselina chlorovodíková, sírová nebo fosforečná.

Nejvýhodnější sloučeniny jsou 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3hydroxy-l-propanyl-L-valináthydrochlorid a acetát. Tyto sloučeniny mohou být připraveny jako krystalické materiály a tudíž mohou být snadno zpracovány do stabilních orálních formulací. Orální a intravenózní formulace mají přednost. Orální formulace mají výhodu vysoké biodostupnosti, intravenózní formulace mají výhodu, že prekurzor léčiva tohoto vynálezu, na rozdíl od intravenózních ganciklovirových formulací se připravuje za použití fyziologicky akceptovatelnějšího pH (4 až 6).

Intravenózní formulace gancikloviru vyžaduje pH hodnotu 11, což vede k podráždění.

Je třeba vědět, že tyto sloučeniny jsou zvlášť užitečné ve farmaceutických směsích a způsobem léčení podle tohoto vynálezu.

V jakémkoli z předešlých procesních kroků zde popsaný odkaz na vzorce I, II, III, IV, V nebo VI se vztahuje na takové vzorce, v nichž P¹, P² a P³, A, Y¹, Y² a Z jsou takové, jak jsou definovány v jejich nejširších vymezeních uvedených výše s procesními aplikacemi zejména vztaženými na současně výhodná provedení.

Výhodné farmaceutické směsi tohoto vynálezu obsahují farmaceuticky akceptovatelnou sůl prekurzoru léčiva vzorce I. Tudíž, jestliže výroba farmaceutických formulací zahrnuje důkladné smíchání farmaceutických základů a aktivní složky v její solné formě, pak je výhodné použít farmaceutických základů, které mají nezásaditou povahu, to je buď kyselých, nebo neutrálních.

V současnosti výhodný postup výroby sloučeniny vzorce I zahrnuje krok (a), výhodně prováděný s průvodní tvorbou soli sloučeniny vzorce I nebo krok (c) nebo kombinaci kroků (a) a (c). (Viz popis kroků III a IV dále uvedených).

Příprava monoesteru podle kroku (a) vyžaduje selektivní ochranu jedné ze dvou primárních hydroxylových funkčních skupin gancikloviru nebo jeho derivátu. To obvykle může nebo nemusí zahrnovat ochranu aminoskupiny v poloze 2 guaninové báze (viz detailní popis kroků I až III uvedený níže pro případ, když se způsob provádí s chráněnou aminoskupinou). Navíc před esterifikací (krok III) aminoskupina reagující aminokyseliny musí být chráněna, aby se zabránilo jejímu rušení (tvorba amidu) při esterifikační reakci. Ochrana aminoskupiny se popisuje dále.

Obvykle, když se provádí způsob tohoto vynálezu, ty amino, hydroxy nebo karboxylové skupiny, které se neúčastní při syntézní reakci, musí být chráněny až do (1) buď deprotekce poskytne finální produkt, nebo (2) specifická chráněná skupina musí být zahrnuta v příštím syntézním kroku, nebo (3) přítomnost nechráněné skupiny při následujících reakčních stupních, vedoucích k finálnímu produktu, by nemodifikovala určené pořadí reakcí.

Příkladem pro poznání požadavku (1) je benzylová skupina při přípravě monoesterů tohoto vynálezu, která chrání jednu primární hydroxylovou funkční skupinu gancikloviru až do jejího odstranění při deprotekčním kroku.

Příkladem pro poznání požadavku (2) je druhá benzylová skupina chránící druhou primární hydroxylovou funkční skupinu gancikloviru, která se odstraní právě před esterifikačním krokem.

- 17CZ 290511 B6

Příkladem pro poznání požadavku (3) je acetylová skupina nebo tritylová nebo monomethoxytritylová skupina chránící aminoskupinu guaninového kruhového systému gancikloviru, protože nechráněná aminoskupina neruší esterifikaci (krok III).

Obvykle způsobilost potenciálních chránících prostředků, která je činí vhodnými pro použití k přípravě sloučeniny vzorce I zahrnuje:

(1) jejich zavedení by mělo proběhnout kvantitativně a hladce bez racemizace L-valinu, (2) chráněný meziprodukt musí být stabilní vůči podmínkám reakcí, které se používají až do požadovaného odstranění chránící skupiny, (3) chránící skupina musí být přístupná tomu, aby se snadno odstranila za podmínek, které nemění chemickou povahu zbytku molekuly, nebo nevyvolávají racemizaci L-valinové složky.

Všechny výchozí materiály (ganciklovir a L-valin) a chránící a karboxylovou skupinu aktivující reagenty použité k přípravě sloučenin vzorce I jsou známy. Jsou také známy různé amino-chráněné L-valinové deriváty jako je N-benzyloxykarbonyl-L-valin, BOC-L-valin a FMOC-L-valin, N-formyl-L-valin a N-benzyloxykarbonyl-N-karboxy-L-valinanhydrid, které jsou všechny komerčně dostupnými meziprodukty nebo jsou popsány v literatuře jako je N-allyloxykarbonyl-L-valin.

Výhodný chráněný ganciklovirový výchozí materiál pro přípravu výhodné sloučeniny tohoto vynálezu je N2-acetyl-bis-O-benzylganciklovir (N2-acetyl-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l,3-bis(benzyloxy)propan), který je popsán v patentu US 4 355 032. Jiné výhodné chráněné ganciklovirové výchozí materiály jsou N²-trityl-9-[(3-hydroxy-2-propoxy-

1- tritv loxy)methyl/guanin, [N²-trityl-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-ltrityloxypropan-3-ol] a N²-monomethoxytrityl-9-[(3-hydroxy-2-propoxy-l-monomethotrityloxy)methyl]guanin, jejichž příprava je popsána v J.Pharm.Sci. 76(2), 180-184 (1987), na který se tímto odkazuje.

2- (2-Amino-l ,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l ,3-propandiylbis(L-valinát), který je výchozím materiálem pro parciální hydrolýzní krok, je popsán v evropské přihlášce vynálezu zveřejňovací číslo 375 329.

Před provedením kroku III (esterifikační krok) musí být aminoskupina L-valinu chráněna, aby se předešlo jejímu narušování při esterifikaci nežádoucí tvorbou amidu.

Následující amino-chránicí skupiny jsou užitečné: halogenkarbonáty, jako je (C₆-i2)arylnižšíalkylkarbonáty (jako je karbobenzyloxyskupina odvozená z benzylchlorkarbonátu) nebo bifenylalkylhalogenkarbonáty, nebo terciární alkylhalogenkarbonáty, jako jsou terciární butylhalogenkarbonáty, zejména terciární butylchlorkarbonát nebo di(nižší)alkyldikarbonáty zejména di(t.butyl)dikarbonát, trifenylmethylhalogenidy jako je trifenylmethylchlorid, a anhydrid kyseliny trifluoroctové.

Chrániči krok se provádí rozpuštěním nebo suspendováním L-valinu v alkalickém vodném roztoku, který může obsahovat nižší alkohol. Reakční směs se ochladí, přičemž se přidá chránící reagent, jako je halogenkarbonát, výhodně ve vodném nebo nižším alkoholovém roztoku současně po malých částech. Během tohoto přídavku se reakční směs udržuje při teplotě 0 °C, výhodně 0 °C až 5 °C po dobu několika hodin, dokud se nedosáhne teploty místnosti. Reakční směs se koncentruje do sucha a zbytek se rozdělí mezi organickou fázi a vodu. Vodná vrstva se okyselí a extrahuje organickým rozpouštědlem pro chráněnou aminokyselinu. Organická fáze se promyje vodou a pak solankou a vysuší nad síranem hořečnatým před odpařením do sucha a izoluje se Nchráněná aminokyselina a vyčistí se konvenčními izolačními a čisticími postupy.

-18CZ 290511 B6

Příprava mono-L-valingancikloviru

Krok I: ganciklovir s volitelně chráněnou 2-aminoskupinou a s chráněnými oběma primárními hydroxylovými funkčními skupinami se parciálně deprotektuje, například hydrogenací gancikloviru s 2-aminoskupinou udržovanou v chráněné formě a jednou chráněnou primární hydroxylovou funkční skupinou. Vhodné aminochránicí skupiny jsou nižší alkanoylové skupiny s 2 až 4 atomy uhlíku, zejména acetylová nebo propionylová skupina.

Jiné vhodné chránící skupiny jsou tritylová nebo substituovaná tritylová skupina jako je monomethoxytritylová skupina a 4,4’-dimethoxytritylová skupina.

Vhodné hydroxy-chránicí skupiny jsou ether tvořící skupiny, které mohou být snadno odstraněny po dokončení všech jiných reakčních stupňů. Tyto hydroxy-chránicí etherové skupiny zahrnují benzylovou nebo tritylovou skupinu. Tyto skupiny mohou být substituovány ve fenylovém kruhu. Jiné vhodné hydroxychránicí skupiny zahrnují allylether, tetrahydropyranyl, silyl, trialkylsilyl ethery, které mohou být odstraněny fluorovodíkem způsobem známým odborníkům v oboru.

Hydrogenace k odstranění jedné hydroxy-chránicí skupiny se výhodně provádí rozpuštěním chráněného gancikloviru v rozpouštědlovém systému, který uvolňuje vodík v přítomnosti katalyzátoru jako je sloučenina palladia, zejména hydroxid palladia, přenosovou hydrogenací nebo jinými konvenčními hydrogenačními postupy. Jiné vhodné hydrogenační katalyzátory zahrnují obvykle hydrogenační katalyzátory obvykle jako je Pd, Pd na uhlí a homogenní hydrogenační katalyzátory.

Rozpouštědlový systém zahrnuje nižší alkanol jako je methanol nebo ethanol a cyklohexen. Obvykle se reakce provádí při teplotách mezi teplotou místnosti a refluxní teplotou rozpouštědlového systému, například v refluxujícím ethanolu a cyklohexenu, pod inertní atmosférou a za vyloučení kyslíku nebo vzduchu, výhodně v dusíkové atmosféře. Katalyzátor se odstraňuje filtrací. Objem filtrátu se může snížit odpařováním přebytku rozpouštědla. Výsledná surová reakční směs obvykle zahrnuje nezměněný výchozí materiál a 2-amino-chráněný ganciklovir s jednou alifatickou hydroxyskupinou chráněnou, jako hlavní produkty.

Separace těchto dvou produktů se obvykle provádí izolačními postupy známými z dosavadního stavu techniky, často chromatografickými postupy, výhodně na silikagelu, načež následuje eluce vhodnými eluenty, jako je směs nižšího alkanolu s halogenovaným nižším alkanem (výhodně ethanol a dichlormethan), čímž se získá 2-amino-chráněný ganciklovir s jednou chráněnou alifatickou hydroxyskupinou.

Krok II: ganciklovir s chráněnou 2-aminoskupinou a chráněnou jednou alifatickou hydroxyskupinou se podrobí deprotekci aminoskupiny. Při tomto kroku, když je amino-chránicí skupina nižší alkanoylová skupina, používají se zásadité podmínky (pHmezi 9 až 14) k odstranění chránící skupiny. Například N2-acetyl-mono-0-benzylganciklovir se zpracuje s alkalickým reagentem jako je hydroxid amonný, uhličitan sodný nebo draselný nebo hydroxid sodný nebo draselný až do úplného odstranění acetylové skupiny. Obvykle se tato reakce provádí v přítomnosti vhodného rozpouštědla, jako je nižší alkanol.

Výhodně se výchozí materiál rozpustí v methanolu a přidá se stechiometrický přebytek hydroxidu amonného. Reakční teplota se udržuje mezi 0 °C až 50 °C, výhodně při teplotě místnosti. Po dokončení reakce (které může být určeno TLC), se může přidat další rozpouštědlo k usnadnění izolace deprotektovaného produktu, jako je ethylester, což vede kvysrážení deacylovaného produktu, který může být odfiltrován a izolován pomocí konvenčních separačních postupů.

Krok III: při tomto kroku se aktivovaný derivát amino-chráněného L-valinu vzorce III esterifikuje chráněným ganciklovirovým derivátem získaným při kroku II. Vhodné

- 19CZ 290511 B6 amino-chránicí skupiny pro L-valin jsou: N-benzyloxykarbonylová skupina, ftalylová skupina, terciární butyloxykarbonylová skupina a N-(9-fluorenylmethoxykarbonyl)ová skupina nebo „FMOC“ skupina.

Alespoň jeden ekvivalent chráněné aminokyseliny a jeden ekvivalent vhodného spojovacího prostředku nebo dehydratačniho prostředku, například 1,3-dicyklohexylkarbodiimidu nebo solí takových diimidů se zásaditými skupinami by se měl použít na začátku. Mohou být také použity jiné karbodiimidy, jako je N,N’-karbonyldiimidazol.

Dalšími užitečnými dehydratačními prostředky jsou: anhydrid kyseliny trifluoroctové, směsné anhydridy, chloridy kyselin, l-benzotriazolyíoxytris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát, PIBOP, 1-hydroxybenzotriazol, 1-hydroxy—4-azabenzotriazol, l-hydroxy-7-azabenzotriazol, N-ethyl-N’-(3-(dimethylamino)propyl)karbodiimidhydrochlorid, 3-hydroxy-3,4-dihydro-4oxo-l,2,3-benzotriazin, O-(benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát, O-(7-azabenzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát, O-(7-azabenzotriazol1 —y l>— 1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborát, O-( 1 H-benzotriazol-l-yl)-l, 1,3,3-bis(tetramethylen)uroniumhexafluorfosfát nebo O-(7-azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-bis(tetramethylen)uroniumhexafluorfosfát.

Popis těchto spojovacích prostředků může být nalezen vJ. Am. Chem. Soc. 115, 4397-4398 (1993). Také jsou užitečné pro tento účel urethan-chráněné N-karboxyanhydridy aminokyselin (UNCA), které jsou popsány Fullerem a kol. v J. Am. Chem. Soc. 112, 7414-7416 (1990), na což se zde tímto odkazuje. V souhrnu jakýkoli jiný reagent, který produkuje anhydrid nebo další aktivovaný derivát chráněné aminokyseliny za mírných podmínek může být použit jako spojovací prostředek.

Amino-chráněná aminokyselina se rozpustí v inertním rozpouštědle, jako je halogenovaný nižší alkan, výhodně dichlormethan pod inertní atmosférou například dusíkem a přidá se spojovací prostředek, výhodně 1,3-dicyklohexylkarbodiimid. Reakční směs se míchá při teplotách mezi 0 °C až 50 °C, výhodně při asi teplotě místnosti. Reakční směs se zfiltruje a reakční produkt (anhydrid chráněné aminokyseliny) se izoluje.

Výsledný produkt se rozpustí v suchém inertním rozpouštědle, jako je suchý dimethylformamid (DMP) a uloží pod dusík. Přidá se roztok ekvivalentního množství produktu z kroku II v inertním rozpouštědle do výše uvedeného roztoku anhydridu. Reakce se provádí mezi 0 °C až 50 °C, výhodně při teplotě místnosti po dobu 5 až 90 hodin.

Reakční produkt může být izolován a vyčištěn pomocí konvenčních postupů jako je chromatografie. Produkt obvykle obsahuje nezreagovanou N-chráněnou aminokyselinu, která může být odstraněna zpracováním s vodnou zásadou jako je hydrogenuhličitan sodný, uhličitan sodný, solanka a jejich směsi. Z organické fáze L-valinester gancikloviru s chráněnou alifatickou hydroxyskupinou a N-chráněnou aminokyselinou může být izolován a vyčištěn pomocí konvenčních izolačních a čisticích postupů.

Krok IV: (finální deprotekce k získání produktu vzorce I): Dvě chránící skupiny produktu z kroku III se odstraní deprotekčními reakcemi, výhodně v kyselém prostředí nebo rozpouštědle, výhodněji hydrogenací. Dává se přednost deprotekci za kyselých podmínek, protože to zajišťuje, aby aminoskupina uvolněná při deprotekční reakci byla protonována, to znamená, že báze vzorce I, jak je vytvořena při deprotekční reakci byla zachycena alespoň stechiometrickým množstvím přítomné kyseliny. Izolace sloučeniny vzorce I ve formě adiční soli s kyselinou chrání požadované stereouspořádání sloučeniny vzorce I. Tudíž dále uvedené příklady, které ukazují deprotekční krok (a) také ukazují průvodní krok (b) tvorby soli.

Deprotekční reakce se provádí rozpouštěním produktu z esterifikačního kroku v inertním rozpouštědle, výhodně v kyselém rozpouštědle za použití hydrogenačního katalyzátoru jako je

-20CZ 290511 B6 palladium na uhlí, platina, za použití zvýšeného tlaku vodíku mezi 6,86 kPa až 13,72 MPa, výhodně 137,2 kPa až 1,372 MPa.

Dokončení reakce může být monitorováno pomocí konvenční tenkovrstvé chromatografické analýzx· (TLC). Hydrogenace se provádí až do úplné konverze, když je třeba s přídavkem dalšího hydrogenačního katalyzátoru. Katalyzátor se odstraní a promyje. Sloučené filtráty z filtrace apromývání se koncentrují a lyofilizují, čímž se izoluje L-valinester gancikloviru. Čištění produktu a izolace krystalického esteru se provádí rekrystalizací nebo jinými čisticími postupy, jako jsou kapalinové chromatografické postupy.

Když se má použít terciární butyloxykarbonylová skupina jako amino-chránicí skupina, její odstranění se provádí kyselinou jako je HC1 a isopropanolem jako rozpouštědlem, nebo nezředěnou trifluoroctovou kyselinou.

Alternativně, když se esterifikační krok provádí s trityl nebo substituovaný trityl-chráněným ganciklovirovým derivátem, tato chránící skupina se může odstranit zpracováním s vodnou alkanovou kyselinou nebo trifluoroctovou nebo chlorovodíkovou kyselinou při teplotách mezi -20 °C až 100 °C, například vodnou kyselinou octovou.

Allylové skupiny se odstraní izomerizací na vinylethery pomocí rhodiových nebo palladiových katalyzátorů, načež následuje kyselá vodná hydrolýza.

Jiné způsoby přípravy /kroky (b), (d) a (e)/

Běžný odborník v oboru také ví, že se sloučenina vzorce I může připravit jako adiční sůl s kyselinou nebo odpovídající volná báze. Když se připravuje jako adiční sůl s kyselinou, sloučenina může být převedena na volnou bázi zpracováním s vhodnou zásadou jako je roztok hydroxidu amonného, hydroxidu draselného, hydroxidu sodného a podobně. Je však důležité poukázat, že volná báze vzorce I se obtížněji charakterizuje než její soli s kyselinou.

Když se převádí volná báze na adiční sůl s kyselinou, nechá se sloučenina reagovat s vhodnou organickou nebo anorganickou kyselinou (dříve popsanou). Tyto reakce se provádějí zpracováním s alespoň stechiometrickým množstvím příslušné kyseliny (v případě adiční soli s kyselinou) nebo zásady (v případě uvolnění volné sloučeniny vzorce I).

Při solnotvomém kroku tohoto vynálezu se typicky volná báze rozpustí v polárním rozpouštědle jako je voda nebo nižší alkanol (výhodně isopropanol) a jejich směsích a přidá se požadované množství kyseliny ve vodě nebo v nižším alkanolu. Reakční teplota se obvykle udržuje při asi 0 °C až 50 °C, výhodně při asi teplotě místnosti. Odpovídající sůl se sráží spontánně nebo může být získána z roztoku přídavkem méně polárního rozpouštědla, odstraněním rozpouštědla odpařením nebo ve vakuu nebo ochlazením roztoku.

Reakční podmínky kondenzačního kroku (d) jsou popsány v evropské přihlášce vynálezu, zveřejňovací číslo 187 297. Tento kondenzační krok je jedním z výhodných postupů pro přípravu diastereomeru tohoto monoesteru. Při tomto kondenzačním kroku guanin, výhodně s chráněnou 2-aminoskupinou, se nechá reagovat s guaninem nebo substituovaným derivátem guaninu v aprotickém rozpouštědle (jako je benzen nebo toluen nebo xyleny) nebo DMF s hexanižšímalkylsilazanem, například hexamethylsilazanem, hexaethylsilazanem nebo podobně a katalyzátorem při teplotách mezi 30 °C a refluxní teplotou. Katalyzátorem je sůl Lewisovy kyseliny, jako je trialkylsilylová sůl, jako je sulfát nebo trifluoralkylsulfonát, chlorsilan nebo síran amonný a pyridin.

Pro detailnější osvětlení reakčních podmínek pro kondenzační krok (d) viz vysvětlení v evropské přihlášce vynálezu zveřejňovací číslo 187 297, na kterou se tímto odkazuje. Obvykle Y¹ a Y²

-21 CZ 290511 B6 potřebuje být zvolen tak, aby se umožnilo získání mono-L-valinesteru vzorce I. Y¹ může být amino-chráněná L-valinylová skupina nebo skupina přeměnitelná na L-valinylovou skupinu.

Sloučenina tohoto vynálezu může být také připravena z 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin9-yl)methoxy-l,3-propandiyl-bis(L-valinátu), což je popsáno v evropské přihlášce vynálezu zveřejňovací číslo 375 329.

Konverze na 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-1 -propany 1-Lvalinátu se provádí parciální hydrolýzou /krok (e)/ jedné L-valinesterové skupiny za řízených podmínek, což má za následek přednostní štěpení jen jednoho acylového zbytku aminokyseliny. Sůl 2-(2-amino-l ,6-dihydro-6-oxo-9H-purin-9-yl)methoxy-l ,3-propandiyl-bis-L-valinátu výhodně jako bisacetátová sůl, se rozpustí v deionizované vodě a částečně se neutralizuje slabou zásadou, jako je zředěný roztok hydroxidu amonného. Směs se udržuje při teplotě místnosti po dobu jednoho až několika dnů, výhodně po dobu 48 až 72 hodin.

Alternativně se může také použít enzymatická hydrolýza s esterasou jako je prasečí esterasa nebo peptidasou jako je karboxypeptidasa k provedení parciální hydrolýzy.

Monoester může být oddělen od bisesteru preparativní chromatografií za slabě kyselých podmínek (pH 3 až 5, výhodně pH 4). Rozpouštědlo použité pro chromatografické dělení se odstraní a 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxo-9H-purin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-L-valinátová sůl se izoluje jako směs dvou diastereomerů.

Izolace stereoizomerů

Ze vzorce I je zjevné, že sloučenina tohoto vynálezu má jeden asymetrický atom uhlíku (chirální centrum) v propanylovém řetězci, navíc k asymetrickému atomu uhlíku v L-valinu. Tudíž existují dvě diastereomemí formy (R)- a (S)-formy, jak je určeno podle pravidel Cahna a kol.

Mohou být použity početné způsoby vhodné pro separaci diastereomerů, ale výhodné způsoby užívají postupy, které využívají výhod rozdílných fyzikálních vlastností dvou diastereoizomerů. obvykle se diastereomery oddělí chromatografií, ale výhodné jsou separační/štěpicí postupy v závislosti na rozdílech v rozpustnosti, jako je frakční krystalizace.

Specifika separačních postupů aplikovatelných na přípravu diastereomerů vzorce I jsou popsána v Jean Jacques, André Collet, Samuel H. Wilen, Enantiomers, Racemates and Resolutions, John Wiley and Sons, lne. (1981), na což se zde tímto odkazuje.

Alternativně sloučenina tohoto vynálezu může být připravena pomocí opticky aktivních reaktantů. Když se připravují čisté diastereomery mono-L-valingancikloviru, kondenzační krok (d) je výhodnou syntézní metodou. Avšak, když se mají použít opticky aktivní reagenty, je důležité vyvarovat se rozmezí pH nad 6, protože při vyšším pH rozmezí dochází k interkonverzi volné sloučeniny vzorce I. Například při pH 7 a teplotě 40 °C mají diastereomemí směsi vzorce I poločas kratší než 1 hodinu.

Stereokonfigurace v druhém centru chirality sloučeniny vzorce I může být stanovena cirkulámím dichroizmem, výhodně monokrystalovou rentgenovou analýzou derivátu s těžkým kovem, nebo korelací s materiálem připraveným celkovou syntézou z jednotlivého enantiomeru glycerolu známé konfigurace.

Výroba krystalického 2-(2-amino-l ,6-dihydro-6-oxo-purin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-lpropanyl-L-valinátu

Sloučenina tohoto vynálezu může být a je produkována v krystalické formě. To je rozhodující výhodou oproti sloučeninám zveřejněným v známém stavu techniky, které byly popsány jako

-22CZ 290511 B6 nekrystalícké materiály. Tato výhoda spočívá ve skutečnosti, že farmaceutické formulace mohou být snadněji vytvářeny s krystalickým materiálem. Krystalický materiál může být účinně zpracován a je reprodukovatelně charakterizovatelný oproti nekrystalickému materiálu a kvalita krystalických materiálů tohoto vynálezu může být snadněji určena než kvalita nekrystalických materiálů.

Aby se vytvořil krystalický materiál, je výhodné použít sůl 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-L-valinátu. Výhodné krystalické soli jsou acetátová a hydrochloridová sůl. Je výhodné iniciovat krystalizaci soli rozpuštěním hydrochloridové nebo acetátové soli ve vodě a přidáním organického rozpouštědla mísitelného s vodou, jako je methanol, ethanol, isopropanol, tetrahydrofuran nebo acetonitril. Alternativně chlorovodíková sůl může být vykrystalizována z bezvodého roztoku nižšího alkanolu jako je methanol, ethanol, přídavkem jiných organických rozpouštědel jako je ethylacetát, isopropanol, tetrahydrofuran nebo toluen.

Příklady provedení vynálezu

Následující přípravy a příklady jsou uvedeny, aby umožnily odborníkům v oboru snadněji porozumět a provádět předložený vynález. Neměly by být považovány za omezení rozsahu vynálezu, ale pouze jako jeho ilustrace a představa.

Příklad 1

Příprava (S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-benzyloxypropan-l-olu

A. (R)-( l-chlor-2-acetoxymethoxy-3-benzyloxy)propan

Plynný HC1 (vysušený průchodem koncentrovanou H2SO4) byl probubláván do míchané směsi (S)-(+)-benzyloxymethyloxiranu (500 mg, 3,06 mmol) a paraformaldehydu (201 mg, 6,71 mmol) v dichlormethanu (8 ml) při 0 °C, až se všechny tuhé látky rozpustily (asi 45 minut). Výsledný roztok byl uskladněn při 0 °C po dobu 16 hodin. Po vysušení síranem hořečnatým bylo odpařeno rozpouštědlo, čímž se získal (R)-(l-chlor-2-chlormethoxy-3-benzyloxy)propan.

Tento chlormethyletherový meziprodukt byl rozpuštěn v acetonu (3 ml) a po kapkách přidán do směsi octanu draselného (2,1 g, 21,4 mmol) v acetonu (7 ml). Směs byla míchána při teplotě okolí po dobu 16 hodin. Tuhá látka byla odfiltrována a filtrát zkoncentrován. Zbytek byl vyzvednut ve 20 ml toluenu a promyt nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (10 ml) a vodou (2 x 20 ml). Organická vrstva byla vysušena nad síranem sodným, po filtraci byl filtrát zkoncentrován a zbytek vyčištěn mžikovou chromatografií přes silikagel (hexany/ethylacetát = 7/1), čímž se získal (R)-(l-chlor-2-acetoxymethoxy-3-benzyloxy)propan (810 mg, 2,97 mmol) jako bezbarvý olej s 97% výtěžkem (izomerní poměr byl 12:1).

B. (R)-2-(2-Amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l-chlor-3-benzyloxypropan

Roztok persilylovaného guaninu (1,09 g, 2,95 mmol) v DMF (3,2 ml) byl přidán od 810 mg (R)-(l-chlor-2-acetoxymethoxy-3-benzyloxy)propanu. Roztok byl míchán při teplotě 130 °C po dobu 1 hodiny předtím, než byl zaveden trimethylsilyltrifluormethansulfonát. Míchání pokračovalo při stejné teplotě po dobu 4 hodin. Směs byla ochlazena na teplotu místnosti a rozdělena mezi vodu a ethylacetát. Vodná vrstva byla extrahována odsáváním s ethylacetátem. Sloučená organická vrstva byla vysušena nad síranem hořečnatým, zfiltrována a zkoncentrována. Zbytek byl vyčištěn chromatografií přes silikagel, čímž se získal (R)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6oxopurin-9-yl)methoxy-l-chlor-3-benzyloxypropan spolu s N-7 izomerem. Podíl N-9 : N-7 izomeru byl asi 2,3 : 1.

-23CZ 290511 B6

C. (R)-2-(2-Amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l-acetoxy-3-benz\loxypropan

Směs produktu z předešlého kroku, octan draselný (velký' přebytek) a DMF byla zahřívána k refluxu po dobu 5 hodin. Výsledná hnědá směs byla ochlazena na teplotu místnosti a zfiltrována přes vrstvu celitu. Filtrová vrstva byla propláchnuta methanolem. Filtrát byl odpařen a zbytkový DMF odstraněn za vakua. Surový produkt byl vyčištěn mžikovou chromatografií přes silikagel (CHjCU : methanol = 10 : 1), čímž se získal (R)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin9-yl)methoxy-l-acetoxy-3-benzyloxypropan jako bleděžlutá tuhá látka.

D. (S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l-benzyloxypropan-3-ol

Směs (R)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l-acetoxy-3-benzyloxypropanu ve směsi 30% amoniaku/methanolu (1:2) byla míchána při okolní teplotě po dobu 18 hodin. Rozpouštědlo bylo odpařeno a zbytek byl triturován malým množstvím methanolu. Bleděžlutá tuhá látka byla shromážděna, čímž se získal (S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9yl)methoxy-l-benzyloxypropan-3-ol. Matečný louh byl koncentrován a zbytek byl rekrystalizován z horkého methanolu, čímž se získal druhý výnos produktu.

Příklad 2

Příprava 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l-benzyloxypropan-3-olu

A. N2-acetyl-2-(2-amino-l ,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l ,3-bis(benzyloxy)propan, 54,2 g (114 mmol) byl rozpuštěn v refluxujícím ethanolu (815 ml) a byl přidán cyklohexen (610 ml) pod atmosférou dusíku. Suspenze hydroxidu palladia (16 g) v ethanolu (50 ml) byla přidána do reakční směsi a směs byla refluxována pod dusíkem po dobu 1,5 hodin. Horká směs byla zfiltrována přes celit a filtrát byl koncentrován na rotační odparce. Výsledná surová reakční směs byla chromatografována na silikagelu. Eluce 8% methanolem/92% dichlormethanem následovaná 10% methanolem/90% dichlormethanem dala N2-acetyl-2-(2-amino-l,6-dihydro6-oxopurin-9-yl)methoxy-l,3-bis(benzyloxy)propan (výchozí materiál) (18,6 g, 16%) a N2acetyl-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l-benzyloxypropan-3-ol (17,6 g, 40 %).

B. N2-acetyl-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l-benzyloxypropan-3-ol, 21,9 g (56,5 mmol) byl rozpuštěn v methanolu (200 ml) a byl přidán hydroxid amonný (101 ml). Směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Do bílé suspenze byl přidán ethylether (400 ml) a směs byla zfiltrována. Sraženina byla promyta postupně ethyletherem (100 ml), vodou (100 ml) a ethyletherem (100 ml) a vysušena za vysokého vakua přes noc, čímž se získalo 15,9 g (46,13 mmol), 82 %) 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l-benzyloxypropan-

3-olu. Odpaření filtrátu a suspendace výsledné sraženiny v ethyletheru (200 ml), následovaná filtrací a vysušením za vysokého vakua poskytly další 2,3 g (6,7 mmol, 12 %) produktu.

Analýza vypočtená pro C₁₆H₁₉N₅O4 (345,36): C 55,65, H 5,55, N 20,28

Nalezeno: C 55,25, H 5,60, N 20,12.

-24CZ 290511 B6

Příklad 3

Příprava 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-Lvalinátu

A. 2-[(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy]-3-benzyloxy-l-propanyl-N(benzyloxykarbony l)-L-val inát

N-Benzyloxykarbonyl-L-valin 43,66 g (0,174 mol, 3 ekvivalenty), byl suspendován v dichlormethanu, 72 ml a byl přidán 1,3-dicyklohexylkarbodiimid, 14,34 g (69,5 mmol), 1,2 ekvivalenty). Směs byla míchána pod dusíkem po dobu 48 hodin. Směs byla zfiltrována přes skleněnou fritu a bílý tuhý zbytek byl promyt dichlormethanem, 75 ml. Sloučený filtrát byl míchán pod dusíkem a byla přidána suspenze 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-benzyloxypropan-l-olu, 20 g (57,91 mmol), 1 ekvivalent) v dimethylformamidu, 90 ml a pak byl přidán 4-dimethylaminopyridin, 1,77 g (14,4 mmol, 0,25 ekvivalentu).

Směs byla míchána pod dusíkem po dobu 18 hodin, nalita do vody, 1200 ml, a extrahována směsí ethylacetátu (350 ml) a toluenu (350 ml). Vodná vrstva byla separována a organická vrstva byla promyta zpola nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, 600 ml a pak vodou (200 ml). Organická vrstva byla vysušena nad síranem hořečnatým a koncentrována za sníženého tlaku. Zbytek byl vysrážen ze směsi ethylacetátu a cyklohexanu, čímž se získal 2-[(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy]-3-benzyloxy-l-propanyl-N-(benzyloxykarbonyl)-L-valinát jako amorfní tuhá látka.

B. 2-(2-Amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy]-3-hydroxy-l-propanyl-L-valináthydrochlorid

2-[(2-Amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy]-3-benzyloxy-l-propanyl-N-(benzyloxykarbonyl)-L-valinát, 224,8 g (0,39 mol), byl rozpuštěn v methanolu (1,2 1) a byla přidána po kapkách koncentrovaná chlorovodíková kyselina, 32,4 (0,39 mol). Směs byla uložena pod dusíkem a bylo přidáno palladium na uhlí, 67,4 g. Směs byla hydrogenována v Parrově bombě pod vodíkem (274,4 kPa až 686 kPa, průměrně 548,8 kPa tlaku) po dobu 48 hodin. Bylo přidáno dalších 5 g palladia na uhlíku a směs byla hydrogenována při 686 kPa po dobu 24 hodin.

Směs byla zfiltrována přes vrstvu celitu a zbytek byl promyt 1 1 methanolu. Filtrát byl odpařen do sucha za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn ve vodě, 150 ml a zahřát na 60 °C. Po kapkách byl pomalu přidán za míchání isopropanol (830 ml), přičemž se udržovala teplota 60 °C až 70 °C. Roztok byl pomalu ochlazen na teplotu okolí během 16 hodin. Výsledný krystalický roztok byl zahřát na 30 °C a byl přidán další isopropanol, 220 ml. Směs byla ponechána pomalu chladnout na konečnou teplotu -11 °C po dobu 4 hodin.

Filtrací byly izolovány krystaly a byly promyty 200 ml chladné 2% směsi voda/isopropanol, čímž se získal 2-(2-amino-l ,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-Lvalináthydrochlorid (120,5 g, 79% výtěžek). Sloučenina prochází fázovou přeměnou při 142 °C a rozkládá se při 175 °C.

Příklad 4

Příprava krystalické soli 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-lpropanyl-L-valinátu

2-(2-Amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-L-valináthydrochlorid, 150 g, byl rozpuštěn ve vodě, 150 ml a zahřát na 50 až 60 °C.

-25CZ 290511 B6

Pomalu po kapkách byl přidán isopropanol (830 ml) za míchání, zatímco se mírně zvýšila teplota na 60 °C až 70 °C. Roztok byl pomalu ochlazen na 25 °C po 20 hodinách. Výsledný krystalický roztok byl zahřát na 30 °C a byl přidán další isopropanol, 220 ml. Směs byla ponechána pomalu chladnout na konečnou teplotu -11 °C po 6 hodinách. Byly izolovány krystaly filtrací a promyty 200 ml chladné 2% směsi voda/isopropanol, čímž se získal 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-L-valináthydrochlorid ve formě krystalů (135 g, 90% výtěžek). Sloučenina podléhá fázové přeměně při 142 °C a rozkládá se nad 175 °C.

Podobným způsobem může být připraven 2-(2-amino-l ,6-dihydro-6-oxopurin~9-yl)methoxy3-hydroxy-l-propanyl-L-valinátacetát v krystalické formě.

Příklad 5

Příprava (S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-Lvalináthydrochlorid

A. (S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-benzyloxy-l-propanyl-N(benzyloxykarbonyl)-L-valinát

N-Benzyloxykarbonyl-L-valin, 437 mg (1,74 mmol, 3 ekvivalenty) se suspenduje v dichlormethanu, 1 ml a přidá se 1,3-dicyklohexylkarbodiimid, 143 mg (0,7 mmol, 1,2 ekvivalenty). Směs se míchá pod dusíkem po dobu 48 hodin. Směs se zfiltruje přes skleněnou fritu a bílý tuhý zbytek se promyje dichlormethanem, 1 ml.

Sloučený filtrát se míchá pod dusíkem a přidá se suspenze (R)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6oxopurin-9-yl)methoxy-3-benzyloxypropan-l-olu, 200 ml (0,58 mmol, 1 ekvivalent) v dimethylformamidu, 1,5 ml a pak 4-dimethylaminopyridin, 18 mg (14,4 mmol, 0,25 ekvivalentu). Směs se míchá pod dusíkem po dobu 18 hodin, nalije se do vody, 12 ml a extrahuje směsí ethylacetátu (3,5 ml) a toluenu (3,5 ml). Vodná vrstva se oddělí a organická vrstva se promyje zpoloviny nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, 6 ml a pak vodou (2 ml). Organická vrstva se vysuší nad síranem hořečnatým a koncentruje za sníženého tlaku.

Zbytek se vysráží ze směsi ethylacetátu a cyklohexanu, čímž se získá (S)-2-(2-amino-l,6dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-benzyloxy-l-propanyl-N-(benzyloxykarbonyl)-Lvalinát jako tuhá látka.

B. (S)-2-(2-Amino-l,6-dihydro--6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-Lvalináthydrochlorid (S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-benzyloxy-l-propanyl-N-(benzyloxykarbonyl)-L-valinát, 225 mg (3,9 mol), se rozpustí v methanolu, 12 ml a přidá se koncentrovaná kyselina chlorovodíková, 0,3 ml (3,9 mmol). Směs se uloží pod dusíkem a přidá se palladium na uhlí, 674 mg. Směs se hydrogenuje v Parrově bombě pod vodíkem (274,4 kPa až 686 kPa, průměrně 548,8 kPa tlaku) po dobu 48 hodin. Přidá se dalších 50 mg palladia na uhlí a směs se hydrogenuje při 686 kPa po dobu 24 hodin. Směs se zfiltruje přes vrstvu celitu a zbytek se promyje methanolem, 10 ml. Filtrát se odpaří do sucha za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí ve vodě, 1,5 ml a zahřeje na 60 °C. Pomalu se přidá isopropanol (8 ml) za míchání, přičemž se udržuje teplota 60 °C až 70 °C. Roztok se pomalu ochladí na teplotu okolí pod dobu 16 hodin. Výsledný roztok se zahřeje na teplotu 30 °C a přidá se další isopropanol, 2 ml. Směs se ponechá pomalu chladnout na konečnou teplotu -11 °C po dobu 4 hodin.

Krystaly se izolují filtrací a promyjí 2 ml chladné směsi 2 % vody/isopropanol, čímž se získá (S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-L-valináthydrochlorid.

-26CZ 290511 B6

Příklad 6

Příprava 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-Lvalinát acetátu z 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-l,3-propandiylbis (L-valinát)bisacetátu

2-[(2-Amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy]-l,3-propandiylbis-L-valinátbisacetát, 100 mg (lyofilizovaný vzorek obsahoval 0,6 ekvivalentů přebytečné kyseliny octové, 0,164 mmol (= celkem 0,426 mmol kyseliny octové)) byl rozpuštěn v deionizované vodě, 0,4 ml a zčásti neutralizován přídavkem 24 ml 0,015 M roztoku hydroxidu amonného (= 0,36 mmol). Směs byla ponechána při teplotě místnosti po dobu 67 hodin. Vzorek byl vstříknut ve dvou stejných dávkách na preparativní reverzní fázi HPLC sloupce (YMC-Pack, ODS-AM DM-33-5, 2x250 mm, YMC lne.). Separace bylo dosaženo rozpouštědlovým systémem 10% methanolu/90 % 0,1 M octanu amonného pufrovaného na pH 4 kyselinou octovou, průtoková rychlost 9,5 ml/min a detektor byl nastaven na 256 nm. Byly zachyceny 2 píky představující 2 diastereomery monoesterového produktu.

Rozpouštědlo bylo odstraněno za vysokého vakua na asi 2 ml a zbytek byl lyofilizován 2xzvody obsahující kyselinu octovou (0,1%) kodstranění pufru. Bylo izolováno 45 mg (0,112 mmol = 68%) soli kyseliny octové a 2-[(2-amino-l,6-dihydro-6-oxo-9H-purin-9yl)ethoxy]-3-hydroxy-l-propanyl-L-valinátu jako směs dvou diastereomerů s následujícími charakteristickými píky NMR spektra:

'HNMR (300 MHz) DMSO-d₆ roztok: δ 7,78 (1H, s, H C-8), 6,48 a 6,45 (2 br.s., 2H, NH₂), 5,44 (mAB, J = 11 Hz) a 5,43 (s) souhrn 2H, CH₂, 1,91 (s, 3H, CH₃COO), 0,83 + 0,82 (2d, J = 7 Hz, 3H, CH₃.

Příklad 7

Separace (R,S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanylL-valinátu

Roztok (R,S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-Lvalinátu (1,66 g) v 90 % 0,1 M octanu amonného okyseleného na pH 4 kyselinou octovou, 10 % methanolu (9,60 ml) byl použit do YMC-Pack ODS-AM HPLC sloupce (kat. č. DM-33-5, rozměr 250x200 mm ID, částice S-5 mm, 120 A) ve 48 injekcích 200 mikrolitrů s elucí 9,5 ml/min za použití mobilní fáze 90 % 0,lM octanu amonného okyseleného na pH 4 kyselinou octovou a 10% methanolu. Píky byly zjišťovány pomocí Knauerova variabilního monitoru vlnových délek nastaveného na 256 nm a frakce byly jímány manuálně. Byly jímány 3 sady frakcí, pík 1 (retenční doba 24,4 min), překryvná oblast mezi dvěma píky a pík 2 (retenční doba 27,8 min). Frakce každé sady byly sloučeny, odpařeny za sníženého tlaku k odstranění methanolu, pak lyofilizovány k odstranění zbývajících těkavých složek. Zbytek byl rozpuštěn ve vodě, okyselen na pH 4 kyselinou octovou a znovu lyofilizován, načež se získal pík 1 (1,57 g) a pík 2 (0,91 g).

HPLC analýza produktů za použití YMC-Pack ODS-AM sloupce (kat. č. RM-33-5, velikost 250x4,6 mm ID, částice S-5 mm, 120 A) s elucí při 0,5 ml/min za použití mobilní fáze 90% 0,lM octanu amonného okyseleného na pH 4 kyselinou octovou, a 10 % methanolu indikovala, že pík 1 (retenční doba 24,4 min na preparativním sloupci) obsahoval směs 70,8 %, pík 1 (retenční doba 21,1 min), 26,4 %, pík 2 (retenční doba 24,6 min) a 2,8 % plně hydrolyzovaného produktu )retenční doba 12,4 min) a pík 2 (retenční doba 27,8 min na preparativním sloupci) obsahoval směs 68,5 %, pík 2 (retenční doba 22,0 min), 27,5 % pík 1 (retenční doba 20,2 min)

-27CZ 290511 B6 a 4 % plně hydrolyzovaného produktu (retenční doba 11,6 min). Pík 2 (0,91 g) a pík 1 (1,57 g) byly každý rozpuštěn v 90 % 0,lM octanu amonného okyseleného na pH 4 kyselinou octovou a 10 % methanolu (3,60 ml) a vyčištěny znovu za použití výše uvedeného systému v 18 injekcích 200 ml. Byly jímány 2 sady frakcí odpovídajících pikům 1 a 2, sloučeniny, částečně odpařeny za sníženého tlaku k odstranění methanolu a zbytek lyofilizován pro odstranění zbylých těkavých složek. Zbytek z každé sady frakcí byl rozpuštěn ve vodě, pečlivě okyselen na pH 4 kyselinou octovou a ještě jednou lyofilizován.

Frakce odpovídající píku 1 poskytly bílou chmýřovitou tuhou látku (0,70 g), která byla hygroskopická při vystavení vzduchu, přičemž HPLC analýza (prováděná jak je popsáno výše) určila, že to je směs obsahující 94,9 % píku 1 (retenční doba 21,1 min), 4,6 % píku 2 (retenční doba 26,7 min a 0,5 % plně hydrolyzovaného produktu (retenční doba 11,8 min).

'Η NMR analýza (^d6DMSO, delta hodnoty uvedeny ve vztahu k tetramethylsilanu jako vnitřnímu standardu) ukázala charakteristické píky delta 5,43 (m_AB, 2H, Jab = 11,1 Hz, d_A 5,44, d_B 5,43), 3,02 (d, 1H, J = 6,8 Hz).

Frakce odpovídající píku 2 poskytly chmýřovitou tuhou látku (0,81 g), která byla hygroskopická při vystavení působení vzduchu, přičemž HPLC analýza (provedena jak bylo uvedeno výše) indikovala, že to je směs obsahující 91 % píku 2 (retenční doba 29,8 min), 8,4 % píku 1 (retenční doba 28,4 min) a 0,6% plně hydrolyzovaného produktu )retenční doba 14,4 min). 'HNMR analýza (^d6DMSO, delta hodnoty uvedeny ve vztahu k tetramethylsilanu jako vnitřnímu standardu) ukázala charakteristické píky d 5,43 (s, 2H), 2,99 (d, 1H, J = 5,2 Hz) 0,83 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,76 (d, 3H, J = 6,8 Hz).

Příklad 8

A. Příprava (R)-2-(2-amino-l ,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-benzyloxy-lpropanyl-(N-benzyloxykarbonyl)-L-valinátu

Do roztoku N-benzyloxykarbonyl-L-valinu (327 mg, 1,30 mmol, 3 ekvivalenty) v dichlormethanu (25 ml) pod dusíkem byl přidán 1,3-dicyklohexylkarbodiimid (134 mg, 0,65 mmol, 1,5 ekvivalentu) a reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 13,5 hodin. Výsledná směs byla zfdtrována k odstranění nerozpustného materiálu a rozpouštědlo odpařeno za sníženého tlaku pomocí rotační odparky.

Výsledná bílá pěna byla rozpuštěna v suchém DMF (10 ml) a byla přidána přímo do roztoku (S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-benzyloxy-l-propan-l-olu (150 mg, 0,43 mmol, 1 ekvivalent), také v suchém DMF (10 ml). Do DMF roztoku byl přidán 4,4-dimethylaminopyridin (13 mg, 0,11 mmol), 0,25 ekvivalentu) a reakční směs ponechána míchat při teplotě místnosti po dobu 27 hodin až ukázala TLC analýza spotřebu výchozího materiálu. Reakční směs byla odpařena za sníženého tlaku a surový produkt vyčištěn mžikovou chromatografií za použití mobilní fáze 95 % methylenchloridu a 5 % methanolu, čímž se získala titulní sloučenina jako amorfní tuhá látka (158 mg, 63 %).

B. Příprava (R)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy]-3-hydroxy-l-propanyl-L-valináthydrochloridu (R.)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy]-3-benzyloxy-l-propanyl-(Nbenzyloxykarbonyl)-L-valinát (158 mg, 0,27 mmol) byl rozpuštěn v methanolu (15 ml) a byla přidána koncentrovaná kyselina chlorovodíková (24 ml, 0,27 mmol). Směs byla uložena pod dusíkem a bylo přidáno 10% palladia na uhlí (48 mg). Směs byla hydrogenována v Parrově třepačce pod dusíkem (343 kPa tlaku) po dobu 5 hodin. Směs byla zfdtrována přes vrstvu celitu a zbytek promyt methanolem (25 ml).

-28CZ 290511 B6

Odpaření sloučeného filtrátu a výplachů za sníženého tlaku poskytlo titulní sloučeninu (107 mg, 95 %).

HPLC analýza produktu za použití AMC-Pack ODS-AM sloupce (kat. číslo RM-33-5, rozměr 250 x 4,6 mm ID, částice S-5 mm, 120 A) s elucí při 0,5 ml/min, za použití mobilní fáze 90 % 0,lM octanu amonného okyseleného na pH 4 kyselinou octovou a 10 % methanolu indikovala, že to je 85 : 15 směs (R) a (S) diastereomerů.

Příklad 9

Určení orální absorpce (biodostupnosti) u krys

Následující zkouška byla použita k určení orální absorpce (orální biodostupnosti) sloučeniny vzorce I (L-monovalinesteru gancikloviru) a jiných aminokyselinových esterů gancikloviru, jiných esterů gancikloviru a etherů zkoušených pro srovnávací účely.

Pro měření orální biodostupnosti sloučeniny byla nejdříve určena úroveň sloučeniny v plazmě u samců krys po jednotlivé orální (p.o.) dávce této sloučeniny. K měření orální biodostupnosti prekurzoru sloučeniny byla nejdříve určena úroveň aktivní sloučeniny v plazmě, v tomto případě gancikloviru u samců po jedné p.o. dávce prekurzoru sloučeniny. Pak se určí úroveň aktivní sloučeniny v plazmě (tedy gancikloviru) u samců krys po jednotlivé intravenózní (i.v.) dávce sloučeniny. Pro ganciklovir je jednotlivá dávka v každém případě p.o. a i.v. lOmg/kg, pro prekurzorový ester (včetně L-monovalinesteru gancikloviru) je jednotlivá dávka v každém případě, orálním a i.v. taková, že je ekvimolámí 10 mg/kg gancikloviru. Ze dvou měření následujících po p.o. a i.v. podání byla vypočtena orální biodostupnost sloučeniny dělením celé plochy koncentrace proti časové křivce následující p.o. podání, celkovou plochou pod koncentrací proti časové křivce následující p.o. podání, celkovou plochou pod koncentrací proti časové křivce následující i.v. podání, příslušně opraveným pro dávku, podle rovnice

F(p._o.) (%) = [AUQp o./AUCo.v.)] x [dávkuj _vydávka(p o j] x 100

AUC celková plocha pod křivkou) hodnoty byly vypočteny v celém časovém rozmezí, které bylo analyzováno od 0 do 24 hodin.

Základ dávky pro orální a intravenózní podání obsahoval normální fyziologický roztok obsahující 2 % kyseliny octové. V obou případech byla koncentrace sloučeniny ekvivalentní 4,0 mg/ml ganciklovir s mírou dávky ekvivalentní 10 mg/kg (2,5 ml/kg) gancikloviru. 200 g krysy obdržely 0,5 ml orálního roztoku léčiva žaludeční sondou nebo pomocí injekce do ocasní žíly.

Krysy byly aklimatizovány na laboratorní prostředí po dobu 3 dnů a hladověly přes noc před začátkem experimentu až do 4 hodin po dávkování. Krev byla jímána ze 4 krys od každé v následujících časech: 0 minut (před dávkou), 5 minut (i.v.), 15 minut, 30 minut, 1 hodina, 2 hodiny, 3 hodiny, 5 hodin, 7 hodin, 10 hodin a 24 hodin.

Krev byla bezprostředně odstředěna, čímž se získala plazma a tato plazma byla zmrazená při -20 °C až do analýzy.

Stanovení gancikloviru v plazmě

Alikvotní díl plazmy (0,50 ml) byl smíchán s 0,020 ml vnitřního standardu (aciklovir, 15 mikrogramů/ml v 10% methanolu ve vodě) a 3,0 ml acetonitrilu. Směs byla vířena a výsledná sraženina byla odstraněna odstředěním (4000 g, 10 min). Kapalina nad sedlinou byla odpařena do sucha pod dusíkem a rekonstituována v 200 mikrolitrech HPLC mobilní fáze. Alikvoty (0,05 ml)

-29CZ 290511 B6 byly analyzovány HPLC pomocí Keystone Hypersil BDS, 250 x4,6 mm C 18 sloupce. Mobilní fáze obsahovala 2 % acetonitrilu v 30 mM sodnofosforečnanového pufru obsahujícího 5 mM heptansulfonové kyseliny, pH 2,0 a byla čerpána rychlostí l,0ml/min. Ganciklovir a interní standard byly zjišťovány a měřeny UV absorbancí při 254 nm.

Orální dostupnost

Sloučenina	orální biodostupnost (F%)	odkaz
Ganciklovir (G)	7,9	USP 3 355 032
[2-(2-Amino-1,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)-
methoxy-l,3-propandiol] G-ester bis(kyseliny		J.Pharm.Sci. 76,
propionové	17,7	180-184(1987)
G-bis(L-valin)ester	52,0	EP 375 329
G-L-valinesterbenzylether	nezjistitelný	-
G-bis(fenylglycin)ester diacetát	8,18	-
G-dibenzylether	nezjistitelný	-
Aminokyselinový ester tohoto vynálezu
G-L-valinacetát	84,0
G-L-valináthydrochlorid	98,1

Příklad 10

Určení orální absorpce (biodostupnosti) u opic Cynomolgus

Zvířata, dávkování a jímání vzorků

Samci opic cynomolgus vážící 5 až 7 kg byli použiti pro tento test, zvířata byla krmena krmením pro opice, ovocem a vodou a udržována při 12hodinovém světelném cyklu, testované sloučeniny byly formulovány v koncentraci ekvimolámí lOmg/ml roztoku gancikloviru ve fyziologickém roztoku. Orální formulace byla podávána žaludeční sondou v množství 1,0 ml/kg pro konečnou dávku ekvimolámí 10 mg/kg dávky gancikloviru. I.v. formulace gancikloviru byla formulována ve fyziologickém roztoku obsahujícím 0,2% HC1 a v koncentraci 20 mg/ml a podávána v množství 0,5 ml/kg.

Zvířata hladověla od večera před dávkováním a až do 4 hodin po dávkování. Vzorky krve byly odebírány od každé opice v čase 0 (před dávkováním), 5 minut (i.v.), 15 minut, 30 minut, 1 hodina, 3 hodiny, 5 hodin, 7 hodin, 10 hodin a 24 hodin po dávkování. Vzorky krve byly jímány v heparinizovaných injekčních stříkačkách a plazma byla ihned izolována odstředěním a zmrazená při -20 °C až do analýzy.

Stanovení gancikloviru v plazmě

Alikvoty plazmy (0,5 ml) byly smíchány s 0,020 ml vnitřního standardu (aciklovir), 15 mikrogramů/ml v 10% methanolu ve vodě) a 3,0 ml acetonitrilu. Směs byla vířena a výsledná sraženina byla oddělena odstředěním (4000 g, 10 minut, kapalina nad sedlinou byla odpařena do sucha pod dusíkem a rekonstituována ve 200 mikrolitrech HPLC mobilní fáze. Alikvoty (0,05 ml) byly analyzovány HPLC za použití Keystone Hypersil BDS, 250 x 4,6 mm C 18 sloupce.

Mobilní fáze obsahovala 2 % acetonitrilu v 30 mM sodnofosforečnanovém pufru obsahujícím 5 mM heptansulfonové kyseliny, pH 2,0 a byla čerpána průtokovou rychlostí l,0ml/min. Ganciklovir a vnitřní standard byly určeny a měřeny UV absorbancí při 254 nm.

-30CZ 290511 B6

Biodostupnost (F) se vypočte podle rovnice uvedené v příkladu 9.

Prekurzor 2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-Lvalinát měl orální biodostupnost 35,7 %. 2-(2-Amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy1,3-propandiylbis-L-valinát měl orální biodostupnost 23,5%. Ganciklovir měl biodostupnost 9,9 %. Když se dával tentýž prekurzor orálně a ganciklovir intravenózně stejným opicím, byla střední orální biodostupnost pro prekurzor 41,6 %.

Příklad 11

Následující příklady navrhovaných tobolek obsahujících ganciklovir-L-valinmonoester, obsahují jako základ povidon, pojivo, kukuřičný škrob jako rozřeďovač a kyselinu stearovou jako lubrikant a kluzný prostředek, které se naplní do dvou dílů tobolkového pouzdra z tvrdé želatiny. Voda je granulační kapalinou a v podstatě se odstraní během zpracování.

Kvantitativní složení tobolek s ganciklovir-L-valinmonoesterem (1 tobolka 3 x denně)

Složky	hmotnost na tobolku (mg)	% hmotn./hmotn.
Ganciklovir-L-valinmonoesterhydrochlorid	390,00	92,75
povidon	12,61	3,00
kukuřičný škrob	16,81	4,00
kyselina stearová1	1,05	0,25
Celková hmotnost plnění (teoretická)3	420,47	100,00

Prášková směs se naplní do dvoudílného tobolkového pouzdra z tvrdé želatiny.

¹ množství kyseliny stearové může kolísat od 0,1 % do 5,0 % hmotnosti ² množství vody může kolísat podle potřeby k vytvoření potřebné granulace, a tato množství

se vysuší 3 celková hmotnost plnění (teoretická; v konečném produktu.	1 nezahrnuje zbytkovou vlhkost, která je přítomna
Kvantitativní složení tobolek L-valinmonoesteru gancikloviru (2 tobolky 3	x denně)
Složky	hmotnost na tobolku	%
	(mg)	hmotn./hmotn.
Ganciklovir-L-valin-
monoesterhydrochlorid	312,00	92,75
povidon	10,09	3,00
kukuřičný škrob	13,45	4,00
kyselina stearová1	0,84	0,25
voda2
Celková hmotnost plnění (teoretická)3	336,80	100,00

-31 CZ 290511 B6

Prášková směs se naplní do dvoudílného tobolkového pouzdra z tvrdé želatiny.

¹ množství kyseliny stearové může kolísat od 0,1 % do 5,0 % hmotnosti ² množství vody může kolísat pro vytvoření potřebné granulace a tato voda se vysuší ³ celková hmotnost plnění (teoretická) nezahrnuje zbytkovou vlhkost, která je přítomna v konečném produktu.

Příklad výrobního postupu pro ganciklovir-L-valinmonoesterové tobolky

1. Smíchá se ganciklovir-L-valin-monoester a část kukuřičného škrobu ve vhodném mísiči.

2. Rozpustí se povidon ve vodě za míchání.

3. Přidá se (2) k (1), přičemž pokračuje míchání do vytvoření granulátu.

4. Když je třeba,vlhký granulát se rozmělní.

5. Vlhký granulát se vysuší v sušárně.

6. Suchý granulát, zbývající kukuřičný škrob a kyselina stearová se nechají projít mlýnem.

7. Smíchá se (6) ve vhodném mísiči.

8. Naplní se příslušné množství (7) do dvoudílných tobolkových pouzder z tvrdé želatiny.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. 2-(2-Amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyl-L-valinát nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, ve formě (R)— nebo (S)-diastereomeru nebo ve formě směsi těchto dvou diastereomerů.
2. 2. L-valinát podle nároku 1 zahrnující uvedenou směs obsahující stejná množství (R)a (S)-diastereomerů.
3. 3. L-valinát podle nároku 1, kde farmaceuticky akceptovatelnou solí je hydrochlorid nebo acetát.
4. 4. L-valinát podle nároku 1 v krystalické formě.
5. 5. L-valinát podle nároku 1, kterým je (R)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-1-propany 1-L-valinát a jeho farmaceuticky akceptovatelné soli.
6. 6. L-valinát podle nároku 1, kterým je (S)-2-(2-amino-l,6-dihydro-6-oxopurin-9-yl)methoxy-3-hydroxy-l-propanyI-L-valinát a jeho farmaceuticky akceptovatelné soli.
7. 7. L-valinát podle nároku 5 nebo 6, kde uvedenou solí je hydrochlorid.
8. 8. L-valinát podle nároku 5 nebo 6, kde uvedenou solí je acetát.

   -32CZ 290511 B6
9. 9. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tí m, že obsahuje L-valinát podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, a popřípadě také farmaceuticky akceptovatelný základ nebo nosný materiál.
10. 10. Farmaceutická kompozice podle nároku 9 ve formě pro intravenózní podávání.
11. 11. Sloučenina obecného vzorce II (II) , kde

    P¹ je vodík, nebo hydroxy-chránicí skupina a

    P² je amino-chránicí skupina.
12. 12. L-valinát podle nároků 1 až 8 pro použití jako léčivo.
13. 13. L-valinát podle nároků 1 až 8 pro použití jako léčivo pro léčení virových a příbuzných nemocí.
14. 14. Použití L-valinátu podle nároků 1 až 8 pro přípravu farmaceutických kompozic.
15. 15. Použití L-valinátu podle nároků 1 až 8 pro přípravu farmaceutických kompozic pro léčení virových a příbuzných nemocí.