PL169165B1

PL169165B1 - Sposób otrzymywania roslin wykazujacych ceche cytoplazmicznej sterylnosci meskiej PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL169165B1
Application number: PL91309866A
Authority: PL
Inventors: Sandrine Bonhomme; Francoise Budar; Dominique Lancelin; Georges Pelletier
Original assignee: Agronomique Inst Nat Rech
Priority date: 1990-09-21
Filing date: 1991-09-20
Publication date: 1996-06-28
Also published as: EP0549726B1; EP0909815B1; ES2307308T3; DK0549726T3; ATE396257T1; FR2667078B1; WO1992005251A1; FR2667078A1; PL169149B1; US5789566A; EP0549726A1; CZ291186B6; RU2117704C1; PL168666B1; ATE211170T1; IE20020681A1; DE69133597D1; CZ45493A3; PT99024B; CA2393476A1

Abstract

Sposób otrzymywania roslin wykazujacych ceche cytoplazmicznej sterylnosci meskiej, znamienny tym, ze do mitochondriów wprowadza sie sekwencje DNA sterylnosci Ogury, która zawiera a) sekwencje ograniczona nukleotydami o numerach 928 i 1569 z fig. 1 lub b) sekwencje wykazujaca co najmniej 50% homologii z sekwencja wymieniona w punkcie a), i gdy jest obecna w cytoplazmie rosliny, nadaje wymienionej roslinie cytoplazmiczna Sterylnosc meska z wyjat- kiem calego genomu mitochondrialnego Ogury. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania roślin wykazujących cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej. Materiał biologiczny, posiadający cechę sterylności męskiej przydatny jest do opracowywania odmian hybrydowych gatunków mających znaczenie w agronomii.

W szczególności sposób według wynalazku dotyczy otrzymywania roślin należących do rodziny krzyżowych, których cytoplazma w komórkach zawiera organella mające sekwencje nukleotydowe, powodujące sterylność męską i korzystne cechy agronomiczne.

Układ cytoplazmicznej sterylności męskiej pozwala na opracowanie nowych odmian hybrydowych, posiadających korzystne cechy agronomiczne.

Hybrydy otrzymuje się przez krzyżowe zapłodnienie pomiędzy dwiema populacjami form rodzicielskich, z których jedna odgrywa rolę męską, zaś druga - żeńską. Jednym z wymogów spotykanych przy otrzymywaniu odmian hybrydowych o jednolitej jakości przez krzyżowanie płciowe wykonywane na gatunkach autogamicznych jest zdolność rośliny do samozapylania się. Układy sterylności męskiej pozwalają na otrzymanie roślin żeńskich niezdolnych do samozapładniania, z których po zapyleniu można - bez uciekania się do żmudnych technik, takich jak kastrowanie kwiatów - bezpośrednio zbierać nasiona, które wszystkie są hybrydami.

Pośród genetycznych determinant sterylności męskiej są takie, których nośnikiem jest cytoplazma. W każdym pokoleniu płciowym są one przekazywane wyłącznie przez formę żeńską. Otrzymuje się zatem 100% form męskosterylnych w każdym pokoleniu wraz z układem cytoplazmicznej sterylności męskiej (CMS). Te determinanty genetyczne przenosi genom mitochondrialny.

System cytoplazmicznej sterylności męskiej właściwy dla rodziny krzyżowych jest określony przez poniższe cechy:

1) sterylność męska winna być całkowita . tzn . jakiekolwiek są wamnki hodowii i jakakolwiek jest linia, którą chcemy wykorzystać jako formę rodzicielską żeńską, nie powinna występować tam produkcja pyłku. W przeciwnym razie nasiona zebrane z tych roślin żeńskich pochodziłyby częściowo z samozapłodnienia, a zatem nie byłyby typem hybrydy FI.

2) Wytwarzame tych roślin wykonać przy wykorzystaniu naturalnych wektorów pyłka.

tzn. w przypadku tych gatunków: błonoskrzydłych, dwuskrzydłych oraz wiatru. Pyłek powinien być przeniesiony z roślin zapylających na rośliny męskosterylne (żeńskie). W praktyce, jedynie owady mogą zapewnić przeniesienie pyłku na odległość.

Rośliny żeńskie winny zatem być wystarczająco przyciągające dla owadów przylatujących w poszukiwaniu nektaru. Morfologia kwiatów powinna zmusić owada do tego poszukiwania poprzez wierzchołek kwiatu, który umożliwia zasadniczo kontakt z przetchlinką. W praktyce następuje to w ten sposób, że podstawa kielicha powinna utworzyć rodzaj rurki wokół podstawy słupka.

3) Morfologia organów żeńskich (słupek) powinna być identyczna jak w przypadku rośliny płodnej. W szczególności powinien występować pojedynczy słupek w kwiecie i mieć on postać prostoliniową. W istocie zdarza się często, że sterylne formy męskie wyrażają się także poprzez feminizację pylników, które zmieniają się w pseudosłupki, a nawet przez przekształcenie nektarów

169 165 w pełnych kwiatach. Zdarza się także, że tam, gdzie zdeformowane są słupki, dotyczy to także produktów. Wszystkie te odchylenia nie pozwalają na prawidłową produkcję nasion i w tym przypadku można mówić o pewnej sterylności żeńskiej.

4) Do wytwarzania odmian hybrhyowych FI h gatu nków, gdzie zbiera się n asiona, t^iaiclj jak rzepa lub gorczyce, warunkiem niezbędnym jest, aby forma rodzicielska męska hybrydy całkowicie zlikwidowała efekt sterylnej kytoplnzmr męskiej tak, by rośliny hybrydowe mogły być łatwo zapylone.

W przypadku rodziny krzyżowych pierwszy przypadek męskiej cytoplazmy sterylnej, gdzie CMS został opisany przez Ogurę (1968), dotyczył rzodkwi, Raphanus sativus. Bannerot (1974, 1977) przeniósł cytoplazmę Ogury na rodzaj Brossicoe, otrzymując w ten sposób rośliny wykazujące cytoplazmiczną sterylność męską. Rośliny te nie miały zadawalających cech agronomicznych (chloroza w czasie obniżenia temperatury, zła płodność żeńska) i ich zła wydajność czyniła je nieodpowiednimi do wykorzystania handlowego.

Dla uniknięcia chlorozy u roślin z rodziny krzyżowych użyteczne jest połączenie w tej samej komórce genomów jądrowych oraz chloroplastowych tego samego rodzaju. Stąd też rośliny rodzaju Brassicae posiadające jeden z genomów chloroplostrcanych nie wykazują już chlorozy. W przypadku, gdy posiadają całość genomu mitochondrialnego Ogury, charakteryzują się pełną cy^^zm^ną sterylnością męską, lecz równocześnie morfologia kwiatów będzie wykazywać odchylenia, co sprawi, że ich zapylenie przez wektory naturalne będzie niemożliwe.

Poza tym w przypadku gatunków, których nasiona mają znaczenie, użyteczne jest przywrócenie płodności męskiej odmian hybrydowych za pomocą genów jądrowych, zwanych restauratorami.

Przywrócenie płodności męskiej w przypadku roślin posiadających całość genomu mitochondrialnego Ogury jest rzeczą trudną, ponieważ należałoby równocześnie wprowadzić do działania szereg genów-restauratorów.

Celem wynalazku było opracowanie sposobu otrzymywania roślin wykazujących cechę cytop^micznej sterylności męskiej przez zastosowanie odpowiedniego układu sterylności męskiej przez eliminację genów odpowiedzialnych za cechy niepożądane w cytoplazmie Ogury, utrzymując efektywną i łatwą do przywrócenia sterylność męską.

Sposób otrzymywania roślin wykazujących cechę kytoplazmicanej sterylności męskiej według wynalazku polega na tym, że do mitochondrium wprowadza się sekwencję DNA sterylności Ogury, która zawiera a) sekwencję ograniczoną nukleonami o numerach 928 i 1569 z fig. 1 lub b) sekwencję wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją wymienioną w punkcie a), i gdy jest obecna w cytoplazmie rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmicaną sterylność męską z wyjątkiem całego genomu mitochondralnego Ogury.

Sekwencja DNA, którą nazywa się „sterylnością Ogury“ ma następujące wyróżniające ją cechy:

a) nośnikiem jej jest sekwencja DNA ograniczona przez nukleotydy 928 i 2273 z fig. 1 lub

b) wykazuje ona co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie o) i w przypadku obecności w genomie mitochondrialnym bądź jądrowym rośliny zapewnia u wspomnianej rośliny cytoplaamicaną sterylność męską.

W szczególności sekwencja DNA „sterylności Ogury“ stosowano w sposobie według wynalazku wykazuje ponadto dwie następujące cechy:

c) nośnikiem jej jest sekwencjo ograniczono przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1 lub

d) wykazuje ona co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie

c), o także charakteryzuje się tym, że jest tronskrybowono na RNA w mitochondriach roślin męskosterylnych.

Wynalazek zilustrowano na rysunkach, no których fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA mitochondrialnego z rzodkwi Ogury, noszącą cechę CMS, fig. 2 przedstawia mapę restrykcyjną fragmentu DNA mitochondralnego opisanego w fig. 1, fig. 3 przedstawia elektroforezę DNA mitochondrialnego po trawieniu przez BgtI (3o) i Nrul (3b). Wykryte pasmo odpowiadają hybrydyzacji z sondą CoxI. (Hiesel et ol, 11987), fig. 4 przedstawia elektroforezę DNA mitochondrialnego po trawieniu przez SA II. Wykryte pasmo odpowiadają hybrydyzacji z sondą

169 165 ograniczoną przez nukleotydy 389 i 1199 sekwencji opisanej przez fig. 1, fig. 5 przedstawia owoce wytworzone przez kapusty noszące różne genomy cytoplazmiczne, fig. 6 przedstawia elektroforezę RNA mitochondrialnego. Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą, fragment EcoRIBAM HI, włączającej część sekwencji nazywanej ORFB.

Sekwencja DNA „sterylności Ogury“ jest określona przez odniesienie do sekwencji ograniczonej numerami 1 i 2428 na fig. 1. Nośnikiem jej jest transkrybowana sekwencja, której skrajne punkty 3' i 5' są na fig. 2 połączone linią kropkowaną i którą obserwuje się wyłącznie u roślin męskosterylnych. ORFB odpowiada obszarowi rozpoczętego odczytu. Określenie to nadano wskutek zaobserwowanej homologii z sekwencją opisaną przez Brennicka. Na fig. 2 przedstawiono obszarem zakreskowanym sekwencję odpowiadającą jednemu z dwóch genów RNA, przenoszącego formylometioninę.

Sekwencja DNA ograniczona przez nukleotydy oznaczone numerami 928 oraz 2273 na fig. 1 odpowiada transkryptowi, który może być uwidoczniony przez hybrydyzację molekularną (1,4), jak przedstawiono na fig. 6. Na fig. 6 każda „studnia** odpowiada roślinie płodnej (F) bądź męskosterylnej (S). Jedynie rośliny męskosterylne syntetyzują transkrypt około 1400 zasad. Ten transkrypt rozpoczyna się w pozycji 928 (10 zasad) z fig. 1i kończy się w pozycji 2273 (5) (rozpoczęcie oraz zatrzymanie transkrypcji może się dokonać w różnych położeniach w mitochondriach roślinnych).

Jak wykazały badania, cytoplazma zawierająca sekwencję DNA wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną przez nukleotydy 928 oraz 2273 z fig. 1, zapewniającą cechę CMS lub cytoplazma zawierająca sekwencję DNA wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną przez nukleotydy 928 oraz 1569 z fig. 1 i transkrybowaną na RNA, nadającą cechę CMS, ma szereg charakterystycznych cech:

— obejmuje ona chloroplasty tego samego rodzaju co genom jądrowy bądź innego rodzaju lecz zgodne z tym genomem jądrowym, — nie obejmuje całości ani też części jednego bądź drugiego (bądź obydwu) fragmentu genomu mitochondrialnego Ogury, który:

— jest nośnikiem jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę, służącego do zapoczątkowania translacji, — jest nośnikiem genu CoxI, kodującego podjednostkę nr 1 oksydazy cytochromowej.

Nieobecność tych fragmentów zwanych „sekwencjami niepożądanymi* jest niezbędna do otrzymania genomów mitochondrialnych o dobrej jakościowo sterylności męskiej, zgodnej z 4 cechami wymienionymi poprzednio.

Odpowiednio do wyżej przedstawionych cech cytoplazmy, zrekombinowany genom roślinny jądrowy bądź mitochondrialny obejmuje sekwencje DNA „sterylności Ogury“, które posiadają następującą charakterystykę tej sekwencji:

a) jest przenoszona przez sekwencję DNA zawartą pomiędzy nukleotydami 928 oraz 2273 sekwencji przedstawionej na fig. 1 bądź

b) wykazuje co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie a), i - w przypadku jej obecności w cytoplazmie rośliny - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską.

W szczególnym przypadku zrekombinowany genom roślinny jądrowy lub mitochondrialny stosowany w sposobie według wynalazku obejmuje sekwencję DNA „sterylności Ogury“,

c) która jest przenoszona przez sekwencję ograniczoną nukleotydymi o numerach 928 oraz 1569 na fig. 1 lub

d) która wykazuje co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie c) i która - w przypadku obecności w cytoplazmie rośliny i transkrypcji na RNA - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską. Genom jądrowy lub mitochondrialny stosowany w sposobie według wynalazku można scharakteryzować przez to, że wspomniany genom zrekombinowany pozbawiony jest całości lub części fragmentów genomu Ogury:

— będącego nośnikiem jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę, służącego do zapoczątkowania translacji, — będącego nośnikiem genu CoxI, kodującego podjednostkę nr 1 oksydazy cytochromowej, bądź w którym wspomniane fragmenty są nieaktywne.

169 165 5

Dokładniej, zrekombinowany genom jądrowy lub mitochondrialny stosowany w sposobie według wynalazku charakteryzuje się tym, że:

1) jest pozbawiony całości lub części fragmentu około 10,7kb po trawieniu przez BglI lub fragmentu około 11 kb po trawieniu przez NruI, nośników genu Coxl.

Jest do uwidocznione w szczególności na fig. 3 przez hybrydyzację molekularną z sodą, która jest nośnikiem sekwencji Coxl.

2) jest pozbawiony całości lub części fragmentu 5,1 kb po trawieniu przez Sali lub fragmentu o około 15 kb po trawieniu przez NruI lub fragmentu o około 18,5 kp po trawieniu przez BglI, nośników jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę.

Uwidoczniono to w szczególności na fig. 4, przez hybrydyzację molekularną z sondą ograniczoną przez nukleotydy o numerach 389 oraz 1199 sekwencji opisanej przez fig. 1. Na fig. 3 oraz 4 genotypy oznaczone cyframi odpowiadają roślinom, w których występuje odpowiedni układ cytoplazmatycznej sterylności męskiej.

GENOTYPY	CHLOROPLASTY	MITOCHONDRIA
B.n.	B. napus	B. napus
27	B. napus	B. napus/Ogura
OGU	R. sativus (OGU)	R. sativus (OGU)
9,17,21,24,27c	B. oleracea	B. oleracea/Ogura
B.o.	B. oleracea	B. oleracea

Ponadto istnienie dobrej jakościowo cechy CMS wymaga obecności sekwencji DNA, którą można oznaczać przez hybrydyzację DNA/DNA na produktach trawienia. Taka właśnie sekwencja DNA, która może być łatwo określona powinna zawierać sekwencję, która po trawieniu przez NcoI daje fragment o 2,5 kb, po trawieniu przez NruI daje fragment o 6,8 kb, zaś po trawieniu przez Sali daje fragment o 4,4kb. Tę sekwencję można również oznaczyć przez hybrydyzację całkowitego RNA roślin meskosterylnych. Udowodniono istnienie transkryptu o około 1400 parach zasad. Jest on nieobecny u roślin powracających do płodności.

Określenie „niepożądanych oraz „niezbędnych z punktu widzenia „sterylności Ogury sekwencji nukleotydowych pozwala na wyselekcjonowanie - za pomocą technik hybrydyzacji DNA znanych specjalistom - materiału roślinnego o dobrej jakości, która jest nośnikiem chloroplastów zgodnych z genomem jądrowym oraz nośnikiem mitochondriów, bez konieczności oczekiwania na roślinę dojrzałą i pojawienie się kwiatów i owoców. Jest to zatem narzędzie bardzo skuteczne dla wyselekcjonowania roślin posiadających męskosterylną cytoplazmę, o korzystnych cechach agronomicznych.

Mitochondrium stosowane w sposobie według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową odpowiadającą DNA i wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną zasadami o numerach 928 i 2273 na fig. 1 oraz kodującą cytoplazmiczną męską „sterylność Ogury - bądź też mitochondrium zawierającego sekwencję DNA, której nośnikiem jest sekwencja ograniczona przez nukleotydy 928 i 1569 z fig.1, bądź wykazująca 50% homologii z tą sekwencją i która jest transkrybowa na RNA w mitochondriach roślin męskosterylnych. Wspomniane DNA może poza tym wykazywać cechy określone powyżej, w szczególności nieobecność sekwencji niepożądanych.

Analogiczne cechy posiada również cytoplazma rodziny roślin krzyżowych, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję DNA „sterylności Ogury obecną w genomie mitochondrialnym; cytoplazma ta zawiera poza tym chloroplasty tego samego rodzaju lub też innego rodzaju, lecz zgodnie z genomem jądrowym.

169 165

Sekwencja „sterylności Ogury“ charakteryzuje się tym, że:

a) jest przenoszona przez sekwencję DNA złożoną z 2428 par zasad, przedstawioną na fig. 1,

b) jest ograniczona przez nukleotydy 928 i 2273 z fig. 1 i odpowiada transkryptowi wskazanemu przez linie kropkowane na fig. 2 i uwiodcznionemu przez hybrydyzację molekularną (1,4) na fig. 6,

c) wykazuje co najmniej 50% homologii z wymienioną sekwencją wspomnianą w punkcie b) i -w przypadku obecności w genomie mitochondrialnym rośliny - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską, lub

d) jest przenoszona przez sekwencję ograniczoną przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1 i transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin sterylnych, lub

e) wykazuje co najmniej 50% homologii z sekwencją opisaną w punkcie d) i jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin sterylnych.

Sposób według wynalazku umożliwia również otrzymanie roślin z rodziny krzyżowych, które zawierają chloroplasty i jądro tego samego rodzaju lub zgodne oraz mitochondria będące nośnikiem genomu nadającego cechę CMS, taką jak określona powyżej.

Dokładniej, sposobem według wynalazku można otrzymać rośliny należące do rodzaju Brassica, zawierające chloroplasty i jądro Brassica oraz mitochondria będące nośnikiem genomu nadającego cechę CMS, taką jak określono powyżej. Ten genom mitochondrialny winien również być nośnikiem pewnej liczby genów rozpatrywanego gatunku Brassica. Uzyskuje się to przez rekombinację między genomem Ogury i genomem Brassica.

Podobnie, sposobem według wynalazku otrzymuje się rośliny należące do gatunku Brassica napus, zawierające jądro Brassica i cytoplazmę, która mieści w sobie chloroplasty Brassica oraz mitochondria męskosterylne stosowane w sposobie według wynalazku, będące nośnikiem DNA. Mitochondria te mogą również być nośnikiem większości genów mitochondrialnych Brassica napus (186, Atp9, Atp6, CoxII, ndh1, cob). Brassica napus odpowiada rzepakowi, bądź roślinom Canola i Rutabaga.

Analogicznie, sposobem według wynalazku otrzymuje się rośliny gatunku Brassica oleracea, zawierające jądro Brassica oraz cytoplazmę, która mieści w sobie chloroplasty Brassica i mitochondria zawierające sekwencję DNA, kodującą cechę CMS, taką jak określono poprzednio. Brassica oleracea obejmuje różne typy kapusty: kapusty głowiaste, kapustę brukselską, kalarepy, brokuły, kapusty pastewne i kalafiory. Rośliny gatunku Brassica campestris charakteryzują się tym, że zawierają jądro Brassica i cytoplazmę, która mieści w sobie chloroplasty Brassica zgodnie z genomem jądrowym oraz mitochondriami zawierającymi sekwencję DNA kodującą cechę CMS, taką jak określono. Brassica campestris odpowiada rzepakowi, brukwi, kapuście chińskiej, pekińskiej i japońskiej.

Analogicznie, sposobem według wynalazku można otrzymać rośliny z grupy obejmującej:

B. juncea, B. nigra, B. hirta, B. carinata, zawierające jądro Brassica i cytoplazmę, która mieści w sobie chloroplasty Brassica zgodne z genomem jądrowym oraz mitochondria zawierające sekwencję DNA kodującą cechę CMS, taką jak określono.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się również rośliny należące do rodzaju Brassica, zawierające genom jądrowy o sekwencji „sterylności Ogury“, taką jak określono powyżej, jak również elementy zapewniające jego ekspresję oraz transport produktu translacji do mitochondrium. Rośliny te mogą w szczególności należeć do jednego z następujących gatunków: B. napus, B. oleracea, B. campestris, B. nigra, B. juncea, B. hirta i B. carinata.

Obecność „sekwencji sterylności Ogury“ jest konieczna i wystarczająca dla indukowania całkowitej nieobecności pyłku przy nieobecności genów-restauratorów. Zapylenie tych roślin jest zapewnione normalnie dzięki prawidłowej produkcji nektaru.

Morfologia organów żeńskich jest normalna i dojrzałe owoce (łuszczyny) zawierają prawidłową liczbę nasion. Fig. 5 ilustruje morfologię zaobserwowaną u rośliny normalnej - świadka (z), rośliny z morfologii odchylającej się od normy, posiadającej cały genom Ogury [z (6)] i chloroplasty Brassica oleracea, kapusty, będącej nośnikiem chloroplastów Brassica napus i mitochondriów męskosterylnych, posiadających geny Brassica napus [z (A)] oraz roślin będących nośnikami chloroplastów Brassica oleracea i zrekombinowanych mitochondriów, nie zawierających już niepożądanych sekwencji [z (9) i z (17)]. Rośliny te mają następujące cechy:

169 165

GENOTYPY	CHLOROPLASTY	MITOCHONDRIA
z	B. oleracea	B. oleracea
z ( A)	B. napus	B. napus/Ogura
z(6)	B. oleracea	Ogura
z(9)	B. oleracea	B. oleracea/Ogura
z (17)	B. oleracea	B. oleracea/Ogura

Genotypy z(A) i z(6) nie wykazują odpowiedniego układu cytoplazmicznej sterylności męskiej.

Takie rośliny otrzymuje się przy użyciu technik, które zapewniają prawidłową rekombinację między genomem mitochondrialnym rozpatrywanego gatunku a genomem mitochondrialnym Ogury. U takich roślin płodność jest restaurowana przez pojedynczy gen-restaurator, zwany Rf1, pochodzący z rzodkwi, co nie zachodzi w przypadku roślin, które są nośnikiem całości nieodpowiedniego genomu mitochondrialnego.

Rośliny otrzymywane sposobem według wynalazku mają genom mitochondrialny - otrzymany przez transfer genu do mitochondrium.

Rośliny te posiadają właściwy układ CMS, a mianowicie:

— całkowitą sterylność męską, — morfologię pozwalającą na prawidłowe zapylenie i prawidłową produkcję nasion, jak to zilustrowano w tabeli 1 oraz tabeli 2.

Uogólniając, najlepsze cechy agronomiczne otrzymuje się dla roślin męskosterylnych posiadających chloroplasty tego samego gatunku co jądro i mitochondria wykazujące odpowiedni układ sterylności męskiej.

Tabela 1 przedstawia wydajność linii kapusty na różnych cytoplazmach, (odpowiednie są genotypy z9 lub z 17). Tabela 2 przedstawia wydajność linii rzepaku na różnych cytoplazmach (odpowiednie są genotypy Fu 27, Fu 58 i Fu 85).

Sporządzono także sondę obejmującą sekwencję co najmniej 10 zasad, korzystnie zaś 15 zasad, z sekwencji zawartej między nukleotydami o numerach 928 i 1569 na fig. 1; wspomnianą sondę można oznaczyć na przykład w środowisku radioaktywnej zasady oraz każdym innym środkiem (na przykład przez fluorescencję). Sondę tę można wykorzystać dla wykrycia sterylności męskiej, a także w szczególności przy selekcji klonów.

Cechy i korzyści wynikające ze sposobu według wynalazku zilustrowano w następujących przykładach.

Tabela 1

Wydajność linii Z (kapusta do kwaszenia) przy różnych cytoplazmach

Cytoplazma	Genotypy	Zbiór nasion
Chioropla s ty	Mitochondria		gram/roślina
B. oleracea	B. Oleracea	(z)	53,1
B. napus	Ogura	(zC)	0
B. napus	Ogura/napus	(zA)	22,7
B oleracea	Ogura	(z6)	9.3
Ogura	Ogura	(z0)	20,1
B. oleracea	Ogura/oleracea	(z9 lub z17)	91,8

169 165

Tabela 2

Wydajność linii DARMOR (rzepak zimowy) przy różnych cytoplazmach Wydajność Rzepak zimowy DARMOR męski płodny i męskosterylny

	Wydajność (% DARMOR)	Chloroplasty	Mitochondria
DARMOR	100 (35 g)	B. napus	B. napus
Fu 27	118	B. napus	B. napus/ogura
Fu 58	120	B. napus	B. napus/ogura
Fu 77	96	B. campestris	Ogura
Fu 85	114	B. napus	B. napus/ogura
FU 118	103	B. napus	B napus/ogura
BIENVENU	108
JET NEUF	89

Składniki wydajności (Clermont-Ferrand)

	NS	PIS	NGPS	NG	PIG	MST	HI	RDT	BT
DARMOR	7183	81,9	9,9	70028	4,31	1077	0,256	31,6	120
BIENVENU	7334	80,7	11,2	81841	3,88	1064	0,269	30,7	109
JET NEUF	7977	87,7	8,6	67291	4,98	1176	0,262	33,3	115
Fu 27 DARMOR	9292	82,8	11,6	106188	4,09	1337	0,293	42,2	122
Fu 58 DARMOR	8617	76,5	11,7	99947	3,65	1228	0,270	36,0	131
Fu 118 DARMOR *	8339	84,6	11,0	92428	4,11	1243	0,276	38,1	132

NS: liczba łuszczvn/m* - PIS ciężar łuszczyny (mg) - NGPS: liczba nasion na łuszczynę NG· liczba nasio'n/m^s - PIG ciężar nasiona (mg) - MST. substancja sucha ogółem (g/cm) HI· wskaźnik zbiorów (%) - RDT wydajność (q/ha) - HT wysokość (cm) “Rośliny te wykazują często zdeformowane owoce (łuszczyny)

Przykład I. Wykrycie sekwencji DNA odpowiedzialnej za cytoplazmiczną sterylność męską Ogury.

1. Roślina

Przez „cybrydę określa się formy otrzymane przez fuzję izolowanych protoplastów, po której następuje regeneracja całej rośliny. Taki sposób otrzymywania pozwala na połączenie w komórce informacji cytoplazmicznych pochodzących od obydwu form rodzicielskich. Cybrydę nr 13 otrzymano pośród 820 roślin regenerowanych przez fuzję protoplastów między cybrydą B. napus odporną na triazynę, cms Ogury (potomstwo cybrydy 77 opisanej w Pelletier et al., 1983 oraz Chetrit et al., 1985) oraz odmianą pochodzącą od Brutor, wrażliwą na triazynę oraz płodną. Próba odporności na triazynę (Ducruet i Gasquez, 1978) wykonana na próbce liścia każdego regeneranta pozwoliła na ustalenie typu chloroplastu (chloroplasty odporne na triazynę pochodzące od formy rodzicielskiej 77 lub chloroplasty wrażliwe na triazynę pochodzące z linii Brutor). Wyhodowano rośliny i obserwowano stadium kwitnienia. Rośliny będące kombinacjami nierodzicielskimi (bądź czułe/męskosterylne bądź odporne/męskie płodne) wyselekcjonowano jako cybrydy. Cybryda nr 13 była typu wrażliwa/męskosterylna. Cybryda nr 1 była typu odporna/męska płodna.

2. Wyodrębnienie kwasów nukleinowych

Całkowity DNA wyodrębniono przy użyciu liści pochodzących z czterotygodniowych roślin według metody opisanej przez Dellaporta (1983). DNA mitochondrialny wyekstrahowano z liści ośmiotygodniowych roślin, tak jak opisali to Vedel i Mathieu, 1982, z następującymi wariantami:

169 165 mitochondria nie zostały oczyszczone w gradiencie sacharozy po lizie i lizę wykonano w sarcosylu 4% z proteinazą K 0,5 mg/ml (Boehringer Manheim GmbH), w Tris pH 8, 50 mM, EDTA 20 mM. Po wytrąceniu, DNA mitochondrialny oczyszczono przez odwirowanie w gradiencie bromku etydyny - chlorku cezu (metoda 1 - Vedel i Mathieu 1982) w probówkach do odwirowania w polialomerze.

Całkowite RNA wyodrębniono przy użyciu liści lub pączków kwiatowych według pracy Logemanna et al., 1987.

RNA mitochondrialne wyekstrahowano z ośmiotygodniowych kalafiorów według techniki Sterna i Newtona, 1986.

3. Analizy przez restrykcję DNA mitochondrialnego oraz elektroforezę w żelu agarozowym

Analizy wykonano tak, jak opisali Pelletier et al., 1983. Całkowite lub mitochondrialne RNA umieszczono na żelach elektroforetycznych, zawierających formaldehyd, tak jak opisali Sambrook et al., 1989.

4. Hybrydyzacja

Przeniesienie DNA bądź RNA na filtry nylonowe (Hybond -N, Amersham) wykonano przez absorpcję kapilarną przy użyciu, odpowiednio, 6 X SSC bądź 10 X SSPE według instrukcji producenta. Prehybrydyzację i hybrydyzację przeprowadzono według Amershama, wykorzystując sondy znaczone przez wieloinicjujący układ znaczenia DNA (Amersham) po oczyszczeniu na kolumnach Sephadex G50 (Sambrook et al., 1989).

5. Klonowanie DNA mitochondrialnego

Dwa banki genomowe linii cybrydy męskosterylnej (13-7) oraz rewertanta (13-6) utworzono w wektorze faga lambda EMBL3 i hodowano na szczepie restrykcyjnym E. coli Nm539 (Frischauf et al., 1983). Otrzymano około 2,5 X 104 klonów na mg DNA mitochondrialnego.

Banki DNA mitochondrialnego mianowano i rozwinięto w celu wyodrębnienia warstewek, które przeniesiono na filtry nylonowe, tak jak opisali Sambrook et al., 1989. Sondę hybrydyzacyjną wykorzystywaną do skriningowania dwóch banków DNA mitochondrialnego przygotowano następująco: fragment DNA mitochondrialnego, specyficzny dla CMS, wymyto, wykorzystując procedurę Gene cleanTM (BIO 101 INC.), przy użyciu produktu trawienia DNA mitochondrialnego, umieszczonego na preparatywnym żelu agarozowym. Wymyty DNA następnie znaczono tak jak opisano wyżej.

Ekstrakcja DNA Lambda, podklonowanie fragmentu NcoI 2,5 w miejscu NcoI pTrc99A (Amann et al., 1988) oraz ekstrakcje DNA plazmidowego wykonano według protokołów Sambrooka et al., 1988. Plazmidy rekombinujące wprowadzono na szczep E. coli NM522 (Gough i Murray, 1983).

6. Badanie genetyczne cybrydy 13 i jej potomstwa

W pierwszym pokoleniu potomstwa otrzymanego przez zapylenie cybrydy 13 przez Brutor, złozonym z 13 roślin, pięć jest całkowicie męskosterylnych (włączając w to rośliny 13-2 i 13-7), jedna męska płodna (numer 13-6) i siedem praktycznie całkowicie sterylnych z kilkoma kwiatami męskimi płodnymi.

Roślina płodna 13-6 została samozapylona oraz skrzyżowana z Brutorem. W dwóch przypadkach otrzymuje się wyłącznie rośliny płodne (odpowiednio 43 i 42).

W przypadku krzyżowania rośliny męskosterylnej numer 13-7 oraz Brutora 24 potomków jest całkowicie sterylnych, zaś 6 ma kilka kwiatów płodnych; jest to wynik podobny do otrzymanego przy użyciu samej cybrydy. Roślinę 13-2 skrzyżowano z linią restauracyjną RF, która jest heterozygotą dla specyficznych genów-restauratorów męskiej „sterylności Ogury“ (Chetrit et al., 1985). Potomstwo tej krzyżówki składa się z 53 roślin męskosterylnych, 37 roślin męskich płodnych oraz 9 roślin praktycznie całkowicie sterylnych, jednakże zawierających kilka kwiatów płodnych. Wyniki te sugerują, że rośliny męskosterylne z rodziny cybrydy 13 zawierają determinantę CMS Ogury, podobnie jak inne cybrydy badane poprzednio o prostszym profilu restauracji (Chetrit et al., 1985).

169 165

W tym stadium badań można było wziąć pod uwagę dwie możliwości: albo cybryda 13 zawiera mieszaninę genomów mitochondrialnych męskich płodnych oraz męskosterylnych i można je bardziej wyselekcjonować w celu oczyszczenia dwóch fenotypów lub tez cybryda 13 zawiera zrekombinowany genom mitochondrialny o niestabilnej strukturze, który wraca do bardziej stabilnej konfiguracji „płodnej i będzie niemożliwe utrzymanie jednorodnego fenotypu męskosterylnego w następnych pokoleniach.

Sterylne rośliny męskie, otrzymane przy użyciu potomstwa sterylnej rośliny męskiej numer 13-7 uzyskano równocześnie przez rozsadę i przez krzyżowanie płciowe z Brutorem. Po zmiennej liczbie pokoleń (1 - 5), za pomocą obydwu metod, wszystkie rodziny dały rośliny płodne. Inaczej jest w przypadku otrzymanych w ten sposób roślin całkowicie płodnych, które nie dają nigdy ponownie roślin sterylnych.

W świetle tych wyników można wziąć pod uwagę, że drugie wyjaśnienie zaproponowane powyżej, czyli że cybryda 13 zawiera niestabilny genom mitochondrialny, który traci determinantę CMS Ogury podczas procesu prowadzącego do konfiguracji „płodnej, bez możliwości powrotu do fenotypu sterylnego jest wyjaśnieniem poprawnym.

7. Porównanie miio choodΓialdego DNA w przypadltu roślin męskosterolnych oraz płodnych rewertantów. Wyodrębnienie spocyficzsogo fragmentu roślin męskosterylnych.

DNA mitochpndrialny wyekstrahowano z liści mslkosnorylnogo potomstwa 13-7 oraz płodnych reyertastów (potomstwo 13-6 lub 13-7) i trawiono licznymi enzymami restrykcyjnymi, w celu porównania jego profilu restrykcyjnego. Genomy mitpchpndrialne dwóch typów są bardzo podobne, gdyż nie można zaobserwować żadnej różnicy między profilami restrykcyjnymi mitochondriów msskostełylsych i płodnych rewertantów, uzyskanymi przy użyciu rozmaitych enzymów. Jednak fragment restrykcyjny o 6,8 kb wykryto w profilu restrykcyjnym DNA mitpchpnhdalnego roślin męskosterylnych trawionych przy użyciu NruI, zoś nigdy nie zaobserwowano w profilach odpowiednich płodnych rewe^antów.

Fragment (zwany N 6,8) wymyto z żelu agałodpwego, znaczono i wykorzystano jako sondę na profilach restrykcyjnych DNA mitρchoshrialsego otrzymanych przy użyciu NruI: wOżny sygnał przy 6,8 kb zaobserwowano u całego męskosterylnego potomstwa cybrydy 13, podczas gdy żaden fragment tej wielkości nie uległ hybrydyzacji z sondą w genomach mitpchpndrialnych płodnych łewertostóy. Poza tym, sonda N 6,8 hybrydyzuje z fragmentem o 6,8 kb w mitpchoshrialsym DNA Ogury, trawionym przy użyciu NruI; sonda nie hybrydyzuje natomiast z fragmentem pochodzącym od B. napus cv Brutor wskazując, że fragment ten jest pochodzenia Ogury.

Bank lambda, zawierający ekstrakty DNA mitpchpsdrialsegp pochodzącego od roślin męskpltołylsych (13-7) sprawdzono ze znaczonym wymytym fragmentem i spośród 8 klonów hybrydyzujących, wyodrębniono 2 fagi ^kombinujące, zawierające cały fragment N 6,8 oraz sokyoscjo sąsiadujące. Otrzymano szczegółową mapę restrykcyjną tego obszaru. Hybrydyzacja profilu restrykcyjnego DNA mitochosdłialsegp, pochodzącego od potomków płodnych i sterylnych cybrydy 13 z N 6,8 w charakterze sondy, pozwoliła ograniczyć obszar specyficzny genotypu męlkpltołylsogp do fragmentu NcoI o 2,5 kb.

Fragment NcoI o 2,5 kb znaczono i wykorzystano jako sondę w stosunku do DNA mitochpshłialnegc, pochodzącego od potomków 13-7 i 13-6 trawionego przy pomocy NcoI. Oprócz sygnału, przy 2,5 kb specyficznego dla profilu męlkρsterylnego, liczne fragmenty NcoI hybrydyzują równocześnie w profilach płodnych rewertantów oraz profilach męskosterylnych; fragmenty te są przy 2,2,10 i 14 kb. Fragment NcoI o 2,7 kb silnie hybrydyzuje w genomie mitochondrialnym płodnych potomków, natomiast nie hybrydyzuje w przypadku potomków sterylnych. Analiza tego profilu hybrydyzacji prowadzi do wniosku, że fragment NcoI o 2,5 kb, chociaż specyficzny dla męlkclterylnogp DNA mitpchondrialnegp, zawiera sekwencje, które powtarzają się gdzie indziej w genomie mitochonhłialnym (we fragmentach o 2,2,10 i 14 kb po wytrawieniu przy użyciu NcoI) i te powtarzające się sekwencje są również obecne w DNA mίtochpndrialnym płodnych łewertantów poza specyficznym fragmentem o 2,7 kb.

Całkowite RN A yyesktrahowanp z liści lub z zalążków potomków cybrydy 13 lub z męskosterylnych lub płodnych cybryd (pochodzących z innych doświadczeń polegających na fuzji) i linii Brutor. Nota blots (przemieszczenia typu Nor^ern) wykonano i hybłydyzpwaso z sondą odpowiadającą wstawce (insertowi) klonu lambda zawierającego N 6,8 opisanego w przykładzie 3.

169 165

Wykryto główny transkrypt o 1,4 kb u wszystkich cybryd męskosterylnych, także w przypadku cybrydy 13-7, podczas gdy nie zaobserwowano żadnego transkryptu tej wielkości w linii Brutor ani też w przypadku dwóch cybryd płodnych (różnych od cybrydy 13). Ponadto rośliny płodne wykazują transkrypt o 1,1 kb hybrydyzujący z sondą, nieobecny lub obecny na bardzo niskim poziomie, we wszystkich badanych cybrydach męskosterylnych. Liczne transkrypty wspólne dla wszystkich próbek hybrydyzują słabo z sondą, z powodu znacznej wielkości znaczonej wstawki (insertu). Sprawdzono, że transkrypty mitochondrialne w próbkach całkowitego RNA można wykryć przez hybrydyzację samego Northen blot (przemieszczenia typu Northern) z fragmentem DNA zawierającym sekwencję genu atpa.

Ten sam specyficzny transkrypt o 1,4 kb znaleziono w mitochondrialnych RNA Ogury wyekstrahowanych z kalafiorów, przy użyciu jako sondy fragmentu NcoI 2,5. Dokładne granice tego transkryptu wyznaczono przy wykorzystaniu w charakterze sondy podklonów fragmentu NcoI 2,5.

8. cybrydy 1 i jej potomstwa

Cybryda 1 była płodną formą męską. Spośród jej potomstwa roślina 1.12 była płodna, zaś roślina 1.18 - sterylna. Roślina 1.12 dała jako potomstwo rośliny sterylne (S3) i rośliny płodne (RF3). Roślina 1.18 dała rośliny sterylne (S2)oraz gałąź płodną (RF2). Rośliny S2 i S3 restauruje się tym samym jądrowym genem restaurującym płodność pyłkową co w przypadku cybrydy 13.

DNA mitochondrialny roślin S2 i S3, znaczony przez hybrydyzację z fragmentem NcoI o

2,5 kb , nie daje sygnahj przy 2,5 kb po traweeniu przez Ncol, arn też sygnahj przy 6,8 kb po trawieniu przez NruI.

Podobnie, hybrydyzacja całkowitego RNA (Northern) z sondą odpowiadającą sekwencji ORFB nie daje sygnału przy 1,4 kb, jak w przypadku sterylnej cybrydy 13. Natomiast sonda odpowiadająca sekwencji między nukleotydami 928 i 1569 z fig. 1 daje sygnał z Northern przy około 1,3 kb. Sygnał ten jest nieobecny w przypadku RNA roślin RF1, RF2, RF3 lub Brutor. Podobnie możliwe jest wykorzystanie tej samej sekwencji (928-1569) jako sondy, przy przesunięciu punktowym (dot blot) całkowitych RNA i w tym przypadku wszystkie rośliny męskosterylne dają sygnał.

Powyższe wyniki wskazują, że rośliny S2 i S3, mimo że męskosterylne, niezachowały sekwencji nukleotydowej, opisanej na fig. 1, w swojej oryginalnej konformacji i pokazują, że część tej sekwencji zawarta między nukleotydami 928 i 1569 jest nośnikiem specyficznej determinanty „sterylności Ogury“; czyni ona rośliny męskosterylnymi, gdy ta sekwencja ulegnie transkrypcji.

Sekwencja ta nie ma znaczącej homologii z sekwencjami obecnymi w bankach danych.

Przykład II. Wykrycie sekwencji niepożądanych w genomie mitochondrialnym Ogury

Zbiór cybryd otrzymano w ramach gatunku B. napus przez fuzję protoplastów rzepaku, będącego nośnikiem cytoplazmy Ogury i rzepaku normalnego. Pierwszy z nich jest męskosterylny i ma deficyt chlorofilu w niskiej temperaturze, drugi zaś jest normalnie zielony i płodny. Cybrydy wyselekcjonowano spośród roślin regenerowanych i zachowano te, które były męskosterylne i normalnie zielone.

Cybrydy te skrzyżowano z różnymi odmianami - odpowiednio - rzepaku bądź kapusty. Krzyżówki te powtarzano w każdym pokoleniu z tymi samymi odmianami tak, by otrzymać określony genotyp bliski genotypu takiego, jak w przypadku odmiany wstecznej.

Wspomniane wyżej różne odmiany przekształcone w ten sposób na cytoplazmach różnych cybryd poddano próbom agronomicznym, w celu zmierzenia produkcji nasion; zależy ona od szeregu czynników: produkcji nektaru wystarczającej dla zapewnienia zapylania przez owady, prawidłowej morfologii kwiatowej, tak by zapylenie było skuteczne i by owoce się prawidłowo rozwijały.

Zbiór cybryd mógł być zatem podzielony na dwie partie:

— partię cybryd wykazującą sterylność męską odpowiednią dla handlowej produkcji nasion — partię cybryd nie wykazującą wszystkich cech korzystnych dla prawidłowej produkcji handlowej nasion.

Do pierwszej partii przynależą np. cybrydy rzepaku nr 27,58,85 oraz cybrydy kapusty nr 9,17, 21,24, 27c.

Do drugiej partii przynależą np. cybrydy rzepaku nr 23s, 77,118 oraz cybrydy kapusty nr 16 i 14.

169 165

Całkowite DNA tych cybryd poddano trawieniu przez enzymy: SaII, NcoI, NruI, BglI, PstI, KpnI. Otrzymane Southern blots (przeniesienia typu Southern) hybyrydyzowano z różnymi sondami mitochondrialnymi Atpa, Cob, CoxI, Atp6,26S, 18S i dwoma fragmentami genomu Ogury: o

2,5 kb otrzymanym po tr^wie^rim przez Ncol i o 19,4kb otrzymanym po trawieniu przez Nurl.

Dwie partie cybryd różnią się następująco:

a) nr. nr. 23S, 77,11S - w przypadku rzepaku - oraz 1,6,11 - w przypadku kapusty-posiadają obszar genomu Ogury, który otacza gen coxI rozpoznawalny przez fragmenty BgII o 10,7 kb lub NruI o 11 kb oraz obszar genomu Ogury, który otacza jeden z genów RNA, przenoszącego formylometioninę, rozpoznawalny przez fragmenty SaII o 5,1 kb i Nrui o 15 kb.

b) nr. nr. 27,58,85 - w przypadku rzepaku - oraz 9,17,21,24 i 27c-w przypadku kapusty-nie posiadają obszarów odpowiadających, które zostały zmienione - na skutek rekombinacji między genomami dwóch form rodzicielskich, które uległy fuzji - przez analogiczne obszary genomu mitochondrialnego rzepaku w przypadku nr. nr. 27, 58, 85 oraz kapusty w przypadku nr. nr. 9,17, 21, 24 i 27c.

Na tej podstawie wnioskuje się, że dwa rozpatrywane obszary genomu Ogury są niepożądane, jeśli chce się uzyskać układ sterylności męskiej odpowiedni dla handlowej produkcji nasion.

Przykład III. Przykład ten ilustruje znaczenie znajomości sekwencji męskiej „sterylności Ogury“ oraz sekwencji niepożądanych dla wykonania bezpośredniego wyselekcjonowania otrzymania cybryd bez konieczności wieloletniego krzyżowania wstecznego oraz testów agronomicznych.

Łączy się protoplasty rośliny z rodzaju Brassica, będące nośnikiem cytoplazmy Ogury z protoplastami rozpatrywanego rodzaju Brassica. Uzyskane w wyniku fuzji kolonie hoduje się in vitro i powoduje regenerację w środowisku, które sprzyja tworzeniu pączków (zob. Pelletier et al., 1983).

Przy użyciu 1 g świeżego materiału, co dotyczyłoby zasklepki lub fragmentu regenerowanego zarodka roślinnego, możliwe jest, przy użyciu technik opisanych poprzednio, wyodrębnienie całkowitego DNA. Po trawieniu przez Saii, hybrydyzacja typu Southern z sondą zawartą między nukleotydami nr 389 i 1199 (zob. fig. 1) powinna dać sygnał jedynie dla 4,4 kb (nie powinna dać sygnału przy 5,1 kb). Podobnie po trawieniu przez Nrui i hybrydyzacji z sondą zawierającą gen CoxI powinno się otrzymać sygnał dla wielkości różnej od 11 kb.

Wspomniane hybyrydyzacje pozwalają przewidzieć, że dysponuje się rośliną, która będzie męskosterylna i która będzie się nadawać do handlowej produkcji nasion.

Przykład VI. Niniejszy przykład jest wariantem przykładu III, z tym że w miejsce wykonania fuzji protoplastów wykonuje się krzyżowanie płciowe między dwiema formami rodzicielskimi w warunkach szczególnych lub ze szczególnymi genotypami takiego rodzaju, który - w przeciwieństwie do procesów znanych z zapładniania u roślin - jest połączeniem (wynikiem skrzyżowania) cytoplazm oosfery i łagiewki pyłkowej lub gamety męskiej. Jeśli te sposoby byłyby opisane, można by w ten sam sposób wykonać wczesną selekcję młodych roślin uzyskanych z tych sztucznych zapłodnień, przy wykorzystaniu tych samych sond i tych samych kryteriów jak w przykładzie III.

PrzykładV. Niniejszy przykład ilustruje korzyść wynikającą ze znajomości sekwencji „sterylności Ogury“, przy manipulacji genetycznej typu już opisanego dla przypadku drożdży (Johnston et al., 1988).

Przy użyciu normalnej rośliny Brassica bombarduje się merystemy bądź też komórki in vitro mikrocząsteczkami pokrytymi DNA, które jest nośnikiem sekwencji „sterylności Ogury“. Rośliny otrzymane przez potomstwo merystem poddanych obróbce lub regenerowanych zarodników roślinnych będą cytoplazmicznie męskosterylne, jeśli DNA mógł przeniknąć do mitochondriów i zintegrować się z genomem tych organelli. Uniknie się zatem problemów wywołanych przez sekwencje niepożądane, co dotyczyłoby chloroplastów rzodkwi Ogury lub sekwencji określonych w ten sposób w genomie mitochondrialnym Ogury.

Przykład VI. Niniejszy przykład ilustruje korzyść wynikającą ze znajomości sekwencji „sterylności Ogury“, przy konstruowaniu metodami inżynierii genetycznej jądrowej sterylności męskiej w dziedziczeniu mendlowskim, a nie cytoplazmicznym.

169 165

Przy użyciu sekwencji DNA mitochondrialnego ograniczonego przez nukleotydy 928 i 1569 można skonstruować gen chimeryczny, który po transformacji genetycznej komórek Brassica lub innego rodzaju, będzie transkrybowany do jądra komórek otrzymanych transformowanych roślin. Jeśli gen chimeryczny zawiera presekwencję, która umożliwia wprowadzenie do mitochondrium swojego produktu translacji w białko, transformanty te będą męskosterylne i cecha ta będzie funkcjonować jako dominująca cecha mendlowska.

LITERATURA

Amman E, Ochs B, Abel K-J (1988) Gene 69:301-315

Bannerot H, Boulidard L, Cauderon Y, Tempe J (1974) Proc

Eucarpia Meeting Cruciferae 25:52-54

Bannerot H, Boulidard L, Chupeau Y (1977) Eucarpia

Cruciferae Newsl: 2-16

Chetrit P, Mathieu C. Vedel F, Pelletier G, Primard C (1985)

Theor Appl Genet 69:361-366

Dellaporta SL, Wodd J, Hicks JB (1983) Plant Mol Biol Rep 1:19-21

Ducruet JM i Gasquez J (1978) Chemosphere 8:691-696

Frishauf AM, Lehrach H, Poutska A, Murray N (1983) J Mol Biol 170:827-842

Gough J i Murray N (1983) J Mol Biol 166:1-19

Hiesel R, Shobel W, Schuster W, Brennicke A (1987) EMBO J 6:29-34

Johnston SA, Anziano PQ, Shark K, Sanford JC, Butów RA (1988) Science 240:1538-1541 Logemann J, Schell J, Wilmitzer L, (1987) Analytical Biochem 163:16-20 Ogyra H (1968) Mem Fac Agric Kagoshima Univ 6:39-78

Pelletier G, Primard C, Vedel F, Chetrit P. Remy R, Roussele P, Renard M (1983) Mol Gen Genet 191:244-250

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning,

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York

Stern DB i Newton KJ (1986) Methods Enzymol 118:488-496

Vedel F i Mathieu C (1982) Anal Biochem 127:1-8

Τ

Ν «

8 1	H	T	c	ς
aONSa	D	i	3PM	Av	I
asccl	d	n	pil	Ii	I
Jaoyl	β	f	Eey	u J	-
111XI	X	I	III	II	2
///				/

CCATGGACAATAATCYTAGTCGGAGTCAAATTCCTTACCTTTCCACCCAAAGCTGAACAT 1 -----------------♦ 60

GGTACCTGTTATTAGAATCAGCCTCAGTTTAAGGAATGGAAAGGTGGGTTTCGACTTGTA

	s	ε	B P	N 1
BB Na	Β
S	M	A	asOlu	λ	sT	c	u	a
P	n	1	mc pa 3	1	ca	0	1	I
i	1	w	ΗΥηΧλ	w	b<?	B	0	I
X	X	X	XXXVX	X	IX	I	I	X
			/ //		/

ATCCGCACAGATATTCCATTTTTTTTATTGAGGATCCATTrrCGAACTGAACTACTCATG gl ........,-♦—-— ---♦---------♦---------♦---------*---------♦ 120

TAGGCGTGTCTATAAGGTAAAAAAAATAACTCCTAGGTAAAAGCTTGACTTGATGAGTAC

T c

h F

	B	1	c c	n	N
0	3	M	Ml	BAvMNAvS	M	u	1
d	P	w	31	bliahlif	n	4	&
e	c	o	«X	vuJ««uJ·	1	H	I
I	I	X	XX	ΧΧΧΧΧΧΧΧ III u	X	I	V

CTTAGGCAAAACAAGCAAGGGAGTTGTTKATAAGGAGCTAGCTACAGTGCTGCGGAGGGT

GAATCCGTTTTGTTCGTTCCCTCAACAATTATTCCTCGATCGATGTCACGACGCCYCCCA

S F

c	NC S	n	c
y	M	lvMNc	U	Av	B
s	3	aiscr	4	li	b
j	•	IJpiF	H	uJ	V
X	X	νχχχχ	X	IX	Z
/		/		/

TCCGTGCTTATTAAGGAGCCGGGCAGCTACGCAACACTTCCTTGCAACTCATACCTACTA

181 -----♦— ----— -----♦-------—*---------- 240

AGGCACGAATAATTCCTCGGCCCGTCGATGCGTTGTGAAGCAACGTTGAGTATGGATGAT

FIG 1

169 165 f

FIG.1	Cn	ε	MBS
e	M	AvuSF	M	c	RasnRS
	fe	3	114 sa	n	0	saaasp
	V	e	u JRmu	1	N	alABal
	X	1	ΙΙΙΙΧ	I	I	ΙΧΙΙΙΧ
			II			/ /

ACAAACTGTTTACTCT17TTTAAGAGTTAGCTGCATTCCTGCGGGAGGTACGTACGCAAT

24, ...................................................._. 3oo

TGTTTGACAAATGAGAAAAAATTCTCAATCGACGTAAGGACGCCCTCCATGCATGCGTTA

M w

O

I ε

c o

?

I a

P

IM

2aB

Sab

6Iv

ΙΧΧ /

M w

o

I a

P

M

X

N

I a

I

X

I

CAAAGCAGCAGGGCACGTTCGCAACACCTGCTTCAACTTCATGCACAITAGCAACAAGAT

301 — ------♦—-------------------------—♦ 360

GTTTCGTCGTCCCGTGCAAGCGTTGTGGACGAAGTTGAAGTACGTGTAATCGTiGTTCTA

		r r Cnln C			ε CBS
M	a	AvusufAvS	B	s	ose
n	b	Ix4p4allf	b	£	Aar
1	V	uJHCMtuJ·	V	•	IJT
I	I	ΧΧΧΧΧΧΧΧΣ II //	X	X	XXX

TGGGlAGTTCArrGTTGGGAGGATAGCTGCAGCTCCCTACOGGAGTGAACTACAGTTCCA

361---------*--------------------------------------*---------♦ <20

ACCCATCAACTAACAACCCTCCTATCGACGTCGAGGGATGCCCTCACTTGATGTCAAGGT

B

P	s	M	c
IM	Ba	Ca	f	c				M
2«	su	V·	rMM		r	MT	£	b
11	Ρ»	IX	lns	i	a	hh	a	0
(A	CC	JX	Olp	J	u	aa	r	I
XX	XX	XX	XXX	X	X	XX	X	X
/		/	/			/

GGOOGAGCACAOCAAOGOCCAATACCGGCrGTGAGGCGCGTAGCGGGAAGAGATGTATGG 421--------------.......---460

S

c	Ba	a
Av	M	A	su	D	srs	M
li	s	1	a3	P	aot	n
uj	•	w	BA	n	Jky	1
II	X	I	XX	X	III	X
/					//

TAAOGGAlAGCTGTrrAACCATrrCTAATGGAATGGGATGrrCATCCTCCTTCGAATAAT

461---------♦---------------------------*---------♦---------♦ 540

ATTCCCTATCGACAAATTGGTAAACATTACCTTACCCTACAACTAGGAGGAACCT7AT1A

169 1 65

FIG.1 _F

MBS	M	n
asn	M	X	bB	T	uS
• aa	m	rn	03	a	<P
ΣΑΒ	•	n	Ir		Hi
ΙΧΧ	I	I	II	I	II

/

ACGTATATAAGAAGATTTTCATTCCAGTTCGAAAGCAATCGAGAAAACGCCGCCCAAATA

541-------------------*-------------------*---------*---------- 600

TGCATATATTCTTCTAAAAGTAAGGTCAACCTTTCGTTAGCTCTTTTGCGGCGGGTTTAT

A

fBM	c	HB	B
laa?	V	P	X3	NT	M	MBsM
Ia aa	i	1	np	rh	1	ssmc
ΙΑΧ1	J	•	fM	ua	y	paAr
ΧΧΧΧ	I	I	IX	IX	I	ΙΧΧΙ
//				/		//

CGCTTCGCCACGTGTAGCCCTGTATGGACTCGCGAAGCAGGTCTCCGGTCGGTGTCCAAG

601---------♦---------*-------------------♦---------4------*—4 gg₀

GCGAAGCGGTGCACATCGGGACATACCTGAGCGCTTCGTCCAGAGGCCAGCCACAGGTTC

S * MBS u O M aanB p n «aab

A η 1 IABv

XX X XXIX /

ATTTGATCTAACTATTGAGTGAGGAC7ACT7ACCGATTGATAGAATAATACCTATATAAG

661

-------------------♦ —4 720

TAAAC7AGATTGATAACTCACTCCTGATGAATGGCT AACTATCTTATTATGCATATAITC r $

Cn	M	a		T	H	K
Avu	b	u 0	T	3M	Ha	i
1x4	0	3 P	a	Ρ»	h·	n
uJH	X	A n	<ł	£·	al
XXX	X	X X	I	IX	XX	I
//

AAGJUOCTOCrrrGTOGAGTGATCTrrCTCGAAATGAATTAAGTAAGGCGCTArGTTCAG

721----—«♦»---------------------------♦------------------- 7 80

TTCTTCGACGJUUbCACCTCACTAGAAACAOCTTTACTTAATTCATTCCOCGATACAAGTC c

A	0		C		c	B
T 1	r	HSM	»	N	0	sA
f w	d	npa	X	w	5	ar
1 N	X	iw	J	O	7	Ja
X X	X	XXX	X	X	X	IX

ATTCTGAACCAAAOCAC7AGTTGAOOTCTGAAOCCTTATGAOCAGAAGTAATAAATACC7

TAACACTTGGTTTCGTGATCAACTCCACACTTCGGAATACTCGTCTTCATTATTTATGGA

840

169 1 65

FIG.1

F a

u

I

M n

I

M b

o

I

I τ

p £

I

H i

n c

I

I c

v

J

I

N a

I

CGGGGAAGAAGCGGGGTAGAGGAATTGGTCAACTCATCAGGCTCATGACC7GAAGATTAC

841 -------------------------------------- 900

GCCCCTTCTTCGCCCCATCTCCTTAACCAGTTGAGTAG7CCGAGTACTGGACTTCTAATG

M b

o

I £

c o

I

F i

n

I s

P x

X

F a

u

X s

f a

N

X

AGGTTCAAATCCTG7CCCCGCACCGTAGT7TCATTCTGCATCAC7C7CCCTG7CGTTA7C

901 —------------— ---------♦—-------— ----- ♦ 950

TCCAAGTTTAGGACAGGGGCGTGGCATCAAAGTAAGACGTAGTGAGAGGGACAGCAATAG

	Η X	M TE
G	GCa m	aBae	M
d	Edv«Ha	•cpo	b	s
X	aiilcl	I«4S	0	P
I	•XJXrX	1257	X	i
I	ΙΙΙΙΧΧ / III	ΙΙΙΧ	I	X

GACA7CGCAAGG77T7TGAAACGGCCGAAACGGGAAGTGACAATACCGC7T7TC7TCAGC 951-----— ♦-------------------♦ —---- — ♦---------♦---------- 1020

CTGTAGCGTTCCAAAAACTTTGCCGGCTTTGCCCTTCACTGTTATGGCGAAAAGAAGTCG

Β T

3T 3 ta p

Bq £

XX X /

ATATAAATGCAATCATTACCTTTTTCGAAAAATTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCACTC

1021-------------------------------------------------*---------* 1080

7ATATTTACGTTACTAATGGAAAAAGCTTT7TAACAGG7GAAAAACAGTA77AGAGTGAG

c	5 H aCa
Av	uv«
11	9xX
uJ	6JI
IX	ΙΧΧ
/	/

C7ACTGAATGTAAAGTTAGTGTAATAAGTT7CT7TCTT77AGC7T7TT7ACTAATGGCCG

1081

40

GATCACT7ACAT7TCAATCACAT7A77CAAAGAAAGAAAATCGAAAAAAXGATTACCGGG

	N	s
c	c	80	1	a	E
vOE	Av	a r	a	u	DaMX
Ida	li	md	I	3	ppao
Jep	u J	Al	I	A	n3«a
III	II	II	I	I	1111
/	/				/ /

ATATTTGGCTAAGCTGGTTTTCTAACAACCAACATTGTTTACGAACCATGAGACGATCTA

1141-----------------------------*---------*---------*---------» 1200

TATAAACCGATTCGACCAAAAGATTGTTGGTTGTAACAAATGCTTGGTACTCTGCTAGAT

T a

7		C	T
M	3	N	la	vM	3
a	P	d	lp	ia	P
e	E	e	-E	J·	£
I	I	I	21	II	I

GAGAAGTTAAAAATTCCATATGAATTTCAGTATGGGTGGCTAGG7GTCAAAATTACAA7A

1201---------*---------*---------*---------*-------------------* 1260

CTCTTCAATTTTTAAGGTATACTIAAAGTCATACCCACCGATCCACAGTTTTAATGTTAT

Μ T aa B

R	e	P	H	a	M	M
a	I	4	P	m	3	n
a	I	5	n	A	•	1
I	I	I	I	I	I	I

AAATCAAATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGGGGAA

1261-------------------*---------*---------*---------*---------* 1320

7T7AGTTTACATGGAT7GCTACTTCACTGC7TTTTTCAGAGTGGATAGTAATTTCCCCTT

M	H	M	M	M
n	n	n	n	n
X	X	X	X	X
X	I	X	X	I

A7AGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAA7AGAGGGGAAAGAGGAAAAA

1321---------*---------*---------*---------*-------------------* L3B0

TATcrccccrrrCTCCTTrrrr-TTCTCCccTTTCcccTTłATCTCcccTTrcTccTTTTT

			T
M	M	M	a
n	n	n	P
X	X	X	E
X	X	X	X
AAAGAGGGGAAAGGGGAAA7AGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGG7GGAAAAT*7GACCG

777C7CCCC777CCCC777A7C7CCCC777C7CC77777777C7CCACC7777AAC7GGC

FIG 1

FIG1

I MS r fp

- eE

II /

AGAAAATAATCCTTTGTGAACCCAATTGCTTTGACAAAAATAAAGAAAGAAGCAAAATCT

L441 -------------------*-----------------------------*---------* 1500

TCTTTTATTACGAAACACTTGGGTTAACGAAACTGTTTTTATTTCTTTCTTCGTTTTAGA

S N

T 3B a Μ 1 s ε gsDu b * χ p a Πρ3 o I c

Ε c ΣΥηΑ I I m

I I IIII I I I / /

CATTCA-ATTTGAAATAGAAGAGATCTCTATGCCCCCTGTTCTTGGTTTTCTCCCATGCTT

GTAAGTTAAACTTTATCTTCTCTAGAGATACGGGGGACAAGAACCAAAAGAGGGTACGAA

H n

c

I

M bS of

1«

II

M rt

X

M a

•

I c

v i

J

I

TTGTTGGTCAACAACCAACCACAACTTTCTATAGTTCTTCACTACTCCTAGAGGCTTGAC

1561---------*---------*---------*---------*-------------------* 1620

AACAACCAGTTGTTGGTTGGTGTTGAAAGATATCAAGAAGTGATGAGGATCTCCGAACTG

N

c	H	T	1
AvM	xT	G	SAM	a
lin	rtf	a	pas	I
uJl	fi	u	E··	T
III	II	I	III	I
u			/

GGAGTGAAGCTGICTGGAGGGAATCATTTTGTTGAAATCAATTAATCTAATCATGCCTCA

CCTCACTTCGACAGACCTCCCTTAGTAAAACAACTTTAGT7AATTAGATTAGTACGGAGT

	T		T	M
BM	s	b	s	b
sn	P	0	P	0
rl	£	I	E	I
II	I	I	I	I
! ACTGGATAAATTCACTTATTTTTCACAATTCTTCTGGTTATGCCTTTTCTTCTTTACTT?

TGACCTAT77AAGTGAATAAAAAGTGTTAAGAAGACCAATACGGAAAAGAAGAAATGAAA

FIG.1

S c

	a	0	£	T
N	AS	u	O	P	Ac	s
d	SC	3	P	1	lo	P
•	aa	A	n	5	wA	£
Σ	II	Σ	I	Σ	II	Σ

/

CTATATTTTCATATGCAATGATGGAGATGGAGTACTTGGGATCAGCAGAATTCTAAAACT

1741---------♦—-------*-----------------------------♦---------- 1800

GATATAAAAGTATACGTTACTACCTCTACCTCATGAACCCTAGTCGTCTTAAGATTTTGA

S o S

ND	B S	£	B	CM	AONPa	B
lr	F 3MNC	c	b	yb	vllpu	3
ad	o ascr	0	V	Lo	a0au9	C
ΙΣ	k jpir	P	Σ	TI	Σ9ΣΜ6	X
VI	Σ ΙΣΣΧ	Σ	I	II	IIVII	I
	!U				/ U

ACGGAACCAACTGCTTTCACACCGGGGGAAGACCATCCAGAGCAAGGACCCCAAGAGTTT

1801---—-------------*---------♦---------------------------♦ 1860

TGCCTTGGTTGACGAAAGTGTGGCCCCCTTCTGGTAGGTCTCGTTCCTGGGGTTGTCAAA

1861

S

BB a Μ B gsOu b Β m s ltp3 o 3 a t

ΣΥηλ Σ r · B

ΣΣΣΣ X I II / /

GGAAGATCTCTTGAGAAAAGGTTTTAGCACTGGTGTATCCTATATGTATGCTAGTTTATT

CCTTCTAGAGAACTCrrTTCCAAAATCGTGACCACATAGGATATACATACGATCAAATAA

1920

1981

	B	H Ca	H i	S a
T	C	v«	SAn?	N	u
a	•	ii	acca	n	3
q	£	JI	lc Iq	1	A
Σ	I	ΣΣ	ΣΣΣΣ	Σ	I
/		/	/

CGAAGTATCCCAATGGTGTAAGGCCGTCGACTTATTGGGAAAAAGGAGGAAAATCACirr

1921------*--------*---------*---------*---------♦---------* 1980

GCTTCATAOGGTTACCACATTCCGGCAGCTGAATAACCCTTrrrCCTCC-rTTTAGTGAAA

O

P n

Σ

C vB is

Ji

II

GATCTCTTGTTTCGGAGAAATAAGTGGCTCACGAGGAATGGAAAGAAACATATTATATAA

2040

CTAGAGAACAAAGCCTCTTTATTCACCGAGTGCTCCTTACCTTTCTTTGTATAATATATT

FIG.1		169165	5
			a		7
7	M	a	u 0	A	3
a	n	3	3 P	1	P
q	1	r	A n	W	ε
T	I	I	i :	I	r

7A7A7CGAAG7CC7C7CC7TCAAATACTGGAAGGTGGATCAC77G7AGGAA77G7AGGAA

A7A7AGC77CAGGAGAGGAAG7T7A7GACCTTCCACCTAGTGAACA7CC7TAACA7CCTT
N		Ν H
1		1 8C a	H
a	XR	Ea33vH«SM	iT	s
*	C3	aiaaialtw	nf	f
I	ma	eliJJalyo	fi	•
X	IX	ΙΙΧΧΙΣΧΧΧ	IX	I

////

TGACATAATGCTAATCCATGTTGTACATGGCCAAGGAAGCATAAAATGATTCTTTCATTC

2101---------*---------*---------*---------*---------*---------♦ 2160

ACTGTATTACGATTAGGTACAACATGTACCGGTTCCTTCGTATTTTACTAAGAAAGTAAG £· c

o

R

ε		2	a
c	M	4Γ	MT 3
o	n	/a	nh p
N	1	3u	la C
X	I	XX	IX I
		/	/

TATAGATACCTCTGGTAGGTAAAGCACTCTACTGTGCTTTATTGAAAGTTCCCATCGCGG

2161 ------—------- 222 0

ATATCTATGGAGACCATCCATTTCGTGAGATGACACGAAATAACrrTCAAGGGTKGCGCC

B	c	H	ε
3	T	T	P	V	i	M	CM
P	h	a	1	1	n	1	03
c	a	q	•	J	f	Z	DP
X	X	X	X	X	X	X	XX

GGGCGAGGATACTTOCCTTCGCGGTTCGACTTTCTTTrCAGGCTTGACTCATTATTTTCC

2221 --------------------------*------------------------------ 2280

CCCGCTCCTATGAACGGAAGCGCCAAGCTGAAAGAAAAGTCCGAACTGAG7AA7AAAAOG a

s P

Aa	s cbih	H	c
vu	M	fAva2gS	0	iT	V
a»	n	allnlia	d	nf	i
16	1	NuJIlAt	•	fi
II	X	ΧΧΧΧΧΧΣ	X	XX	X
/		/ ///

GGTCCTCTCACACCCCrTTAGAGCTCTTTATGATGCCCACTGAGTAAGATTCOGGGGCTT 22 81 2340

CCAGGAGAGTGTGGGGAAATCTCGAGAAATACTACGGGTGACTCATTCTAAGCCCCCGAA

169 165

FIG.1

s		3	c		B 35	ENM	3		M
MNc	H	3	Av	F	30paS?	3 Ib	37	E	a	EM
9CC	h	P	li	a	asBcph	pao	ma	a	•	an
pir	a	c	u J	u	Jallia	3X1	*q	r	X	rl
XXX	▼	X	XI	• X	IIIIII	XVI	IX	I	I	II
U			/		/ u	/				/

CCCGGCGCAGAAGCTCATTCTGAACCGCGGGAACCTTCGTCTCTTCGACACAAACGTTTT

2341 ---------*---------*---------*---------*---------*---------♦ 2400

GGGCCGC3TC77CGAGTAAGACTTGGCGCCC7TGGAAGCAGAGAAGCTGTGTTTGCAAAA

S

c	M	388 N a
V	M	b	A	sasDlHu
i	n	o	1	amtpap3
J	1	X	w	BHYnlhA
X	I	X	X	ΙΣΧΧνΧΙ

/ / /

A7GAAGAGGCTGATGGTGA7GAGGATCC

2401 ------------------------—- 2428

TACTTCTCCGACTACCACTACTCCTAGC

Enzymy	przecinaj ące
AecX	Α21ΣΧΧ	Alul	AlwI	AlwNI	As»X	AvaX	AvaXI
Bali	BamHI	BanXX	Bbvl	BbvII	Bcef X	Bglll	BpulOI
53*1	BsiAI	BsaBI	BsaJZ	BsiX	Bsal	BsaAl	Bspl286X
BspCZ	BspHI	BspMI	Bsrl	BstBI	BstXX	BstYI	CfrlOI
CviJX	Ddal	DpnI	DrdXX	Dsal	Eael	Earl	EcoSH
EcoBI	EcoDZ	EcoNI	EcoO109X	EcoPI	EcoP15X	EcoRI	EcoRII
EcoR124/3X	Espl	Esp3X Faul	FinX	Fnu4HX	Foki Gdi
Gsul	Ka«X	Ha«XX	Ha«IXI	HgiAI	Hhal	HincII	Hmil
HphI	Ma·!	Ma· IX	Maelll	MboII	Mcrl	Miel	Mlyl
Kmal	Mn 11	K3«X	Mspl	Mwol	NciI	NcoI	Ndal
Nh·!	Nlali:	NlaXV	Nrui	NspBi:	Piał	Pmll	PpuMl
P3tX	Rsal	Sacll	Sali	Sau9«I	Sau3AX	Scal	Scrn
SfaKI	Sfal	SnaBI	Sp«X	Spił	Spił	Sstl	Styl
StyLTI	StySJI	TaqX	TaqXX-l	TaqXX-2	Tfil	ThaX	Tsp45X
TspEI TthUlII	XbaX	XcaX	XaaIIX	XanX

Enzymy nie przecinające

AatXX	Afixx	Agel	Aha XX	Apal	ApaLI	ΑνεΙΙ	Bani
Bcgl	Bell	BglI	BspGI	BspMIX	Β33ΗΧΧ	BstEII	B3u36X
CfrAI	Ciał	Dral	Dralll	Drdl	EciI	ECO47III	EcoAI
EcoDXXX	EcoEI	ECOKX	ECOR124I	EcoRV	Fs«X	Fspl	Hga X
Hgi£XX	HindIII	HinfXXX	Hpal	Rpnl	Mlul	Na·:	Nad
Not:	Nsil	NapX	Pf 1MI	PshAI	Pwl	PvuII	RleAI
Rsrll	Sfil	SgrAI	Smal	Snął	SphI	Sspl	Stul
StySBI	StySPI	StySQI	Tthllll	UballO5I	UballOSI	XhoX

20

FIG. 2

B.h

Μ

CM β

u

3/, rft,

$.σ

Γ' l—ί

Z?

o

LL c·^». v ·, ··.:* '·

J*w

¢¢0

ro

HH

On ć£>

Γ*7

O

CQ O?

OJ o

t+“

O co

yv' ¢-5.1 ¢-4-.4Sal I FIG. 4

FIG. 5

.Ą‘ v.· · ·'·

Cena 4,00 zł

Nakład 90 egz.

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób otrzymywania roślin wykazujących cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej, znamienny tym, że do mitochondriów wprowadza się sekwencję DNA sterylności Ogury, która zawiera

a) sekwencję ograniczoną nukleotydami o numerach 928 i 1569 z fig. 1 lub b) sekwencję wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją wymienioną w punkcie a), i gdy jest obecna w cytoplazmie rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską z wyjątkiem całego genomu mitochondrialnego Ogury.