Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych inhibitorów dipeptydazy.Ostatnio opisano nowa grupe antybiotykówy3-laktamowyeh o skondensowanych pierscie¬ niach obejmujaca tienamycyne i jej pochodne pól syntetyczne, a mianowicie epitienamycyny i kwasy eliwanowe* Zwiazki tef omówione bardziej wyczerpujaco w ponizszej czesci opisu, okreslane sa ponizej terminem "grupa zwiazków tienamycynowych"• Zwiazki te wykazuja wyso¬ ki poziom aktywnosci antybakteryjnej, ale w organizmie ssaków ulegaja ekstensywnemu me¬ tabolizmowi* Ustalono, ze w pierwszym rzedzie nerka stanowi teren metabolizmu i z ekstraktów nerkowych wyodrebniono enzym katalizujacy proces inaktywacji tienamycyny przez hydrolize /3-laktamu* Biorac pod uwage takie kryteria jak lokalizacja cytologiczna, swoistosc sub¬ stratowa i wrazliwosc na inhibitory enzymów, enzym ten okazal sie bardzo podobny, jesli nie identyczny, do szeroko badanej dipeptydazy nerkowe /Enz. 3*4i13i1l/, nazywanej w pi¬ smiennictwie takze "dehydropeptydazal"» Jednakze, aktywnosc^-laktamazy przejawia sie tyl¬ ko wobec grupy zwiazków tienamycynowych* Rzeczywiscie, nie istnieje jak dotad zaden przy¬ klad metabolizmu u ssaków poprzez rozszczepienie ^-laktamu, jakiegokolwiek przedstawicie¬ la klasycznych antybiotyków /J-laktamowych, penicylin i cefalosporyn* Stwierdzono, ze do substancji chemicznych selektywnie hamujacych dzialanie dipepty¬ dazy (Kat* Ensi 3*4«13«11), zwanych takze "inhibitorami dipeptydazy" naleza nowe zwiazki chemiczne stanowiace kwasy Z-1-acyloamino-2-jednopodstawione etenokarboksylowe i ich po¬ chodne o wzorze ogólnym 1*.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie zwiazki o wzorze ogólnym 1, ewentualnie w po- staci soli lub estru, w którym to wzorze R oznacza grupe cyklopropylowa, mono- albo dime- tylocyklopropylowa lub 2,2-dichlorocyklopropylowa, R5 oznacza prosta lub rozgaleziona gru-2 131 618 pe alkilowa o 3-7, zwlaszcza 3-4 atomach wegla a R oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1-6 atomach wegla, dialkiloaminoalkilowa lub farmaceutycznie dozwolony kation* Konfiguracje Z £j.EóBlack-Wood i in. J.Am. Chem. Soc. 90, 509 (1968)J powyzszych zwiaz¬ ków o wzorze 1 ustalono na zasadzie ich widm NMR przez analogie do pracy A* Srinevasana i wspi /Tetrahedron Lett., 891 (1976)/.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze poddaje sie reakcji chlorek kwasowy o wzorze 8, w którym R ma wyzej podane znaczenie, z estrera III-rzed. butylowym o wzorze 9, w którym Rf ma wyzej podane znaczenie, w obecnosci zasady, a nastepnie prowadzi sie utleniajaca addycje metanolanu sodowego, poczym otrzymany zwiazek posredni poddaje sie reakcji z bezwodnym chlo¬ rowe dorenu Sposób wedlug wynalazku polega na wykorzystaniu estru III-rzed. butylowego oC-aminokwa- su o wzorze 9 w reakcji z chlorkiem kwasowym o wzorze 8 wedlug zalaczonego schematu. Reakcja ta zachodzi w obecnosci zasady, takiej jak trójetyloamina, w srodowisku rozpuszczalnika, ta¬ kiego jak chlorek metylenu. Nastepnie utworzony zwiazek N-acylowy o wzorze 10 poddaje sie utlenianiu dzialajac podchlorynem III-rzedi butylu, po czym nastepuje addycja metanolanu so¬ dowego, w wyniku tego otrzymuje sie 2-metoksypochodna o wzorze 11 i/lub produkt eliminacji z tej pochodnej, a mianowicie 06, /3 -nienasycony ester o wzorze 12* W rezultacie dalszego od¬ dzialywania bezwodnym chlorowodorem przeksztalca sie albo zwiazek o wzorze 11 lub 12, albo mieszanine obu tych zwiazków, w zadany 06, (i -nienasycony wolny kwas o wzorze 1, po czym otrzy¬ many kwas przeksztalca sie ewentualnie w sól lub ester.Korzystnie, jako chlorek kwasowy o wzorze 8 stosuje sie chlorek 2,2-dimetylocyklopro- panokarbonylu, a jako ester o wzorze 9 ester III-rzed. butylowy D,L-norleucyny. Otrzymuje sie w tym przypadku kwas 1-(2,2-dimetylocyklopropanokarboksyamldo)-penteno-1--karboksylowy-»1.Aczkolwiek zwiazki o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, sa opisane jako wolne kwasy i tak nazwane, jest oczywiste, ze jako zwiazki im równowazne moga byc stosowane ich róz¬ ne farmaceutycznie dozwolone pochodne, takie jak sole metali alkalicznych i ziem alkalicznych, amoniowe lub z aminami, lub temu podobne* Korzystne sa sole takie jak sól sodowa, potasowa, wapniowa i czterometyloamoniowa.Wolne kwasy o wzorze 1 moga byc równiez ewentualnie przeksztalcone w estry dowolnych farmaceutycznie dopuszczalnych kwasów karboksyIowyclu Estryfikacje prowadzi sie w dowolny kon¬ wencjonalny sposób^ np. opisany w publikacji Id. Finer, Organie Chemistry (1959) str. 175 lub w inny znany sposób* Zwiazki o wzorze 1 wytworzone sposobem wedlug wynalazku stanowia inhibitory dipepty- dazy, jak wspomniano powyzej.Stosowac je mozna lacznie ze zwiazkami antybakteryjnymi, ulegajacymi degradacji w nerce.Jako przyklad zwiazków nadajacych sie do stosowania lacznie ze zwiazkami o wzorze 1, otrzy¬ mywanymi sposobem wedlug wynalazku, mozna wymienic grupe antybiotyków o pierwszorzednym obec¬ nie znaczeniu, okreslanych terminem "grupa zwiazków tienamycynowyeh".Termin powyzszy stosuje sie do okreslenia szeregu pochodnych naturalnych, pólsyntetycz- nych lub syntetycznych, albo analogowych zwiazków ^-laktamowych o skondensowanych pierscie¬ niach. Zwiazki te ogólnie mozna sklasyfikowac jako kwasy 6*- i (ewentualnie) 2-podstawione-pen- -2-emokarboksylowe-3 i 1-karbadetiopen-2-emokarboksylowe-3 lub kwasy 1-azabicyklo/3»2.^hept- -2-en-7-enokarboksylowe-2.Jako korzystny przyklad zwiazku tienamycynowego do stosowania lacznie ze zwiazkiem o wzorze 1 mozna podac zwiazki o wzorze 2, w którym X oznacza CI-U lub S, R oznacza aton wodo- ru, grupe -S-CI^CR^NHR , gdzie R^ oznacza atom wodoru, grupe acetylowa, formimidoilowa lub acetanidoilowa, S(0)-CH=CHNHCOCH, lub -S-CH^CHNKCOCH* a R oznacza grupe o wzorze -(CHR7)CH-z, w którym R' oznacza atom wodoru, grupe hydroksylowa lub sulfenoksylowa, albo R oznacza atom wodoru. Powyzszy wzór strukturalny obejmuje wszystkie mozliwe postacie stereoizomerycznei131 618 3 Wszystkie te zwiazki objete wzorem 2 sa opisane w pismiennictwie. W przypadku £Cy X 2 6 oznacza Cr^, R oznacza SC^C^NHg, a R oznacza CH(CH)CH,, zwiazek znany jest pod nazwa tienamycyny, antybiotyku wytworzonego metoda fermentacyjna ze Scattleya, opisanego w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 3 950 357. Stanowiaca produkt fermentacji N-acetylotie- namycyne (R oznacza /CH/Oh/Ch' a R oznacza grupe acetylowa), zwana takze 924 Af zastrze¬ zono w belgijskim opisie patentowym nr 848 346. Pochodne N-imidoilowe obejmuje belgijski opis patentowy nr 848 545* Produktem fermentacji jest zwiazek zawierajacy nienasycony lan¬ cuch boczny, zwany N-acetylodehydrotienamycyna lub 924 Ac, zastrzezony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4 162 323 a takze w belgijskim opisie patentowym nr 866 035i Spime- ryczne postacie N-acetylotienamycyny, zwane takze 890 A i 890 A,, jak równiez dezacetylo 890 A i dezacetylo-890 A^ opisane, odpowiednio, w opublikowanym francuskim zgloszeniu nr 763 887, zlozonym 19 listopada 1976 i w bejgijskim opisie patentowym nr 248 349. £pimerycz- ne postacie nienasyconej tienamycyny, zwane takze 890 A2 i 890 A,-, zastrzezono w opubliko¬ wanym francuskim zgloszeniu patentowym z dnia 28 kwietnia 1976, nr 15 839* - *cetylo-zwiaz- ki zawierajace grupe 6-sulfenyloksylowa, zwane takze 890 Ag i 890 A10, zastrzezone, odpo¬ wiednio, w opublikowanym francuskim zgloszeniu patentowym nr 7 734 456, zlozonym 16 listo¬ pada 1977 oraz w opublikowanym francuskim zgloszeniu patentowym nr 7 734 457, zlozonym 16 li¬ stopada 1977« Niektóre z dezacetyloanalogów zwiazków w szeregu 890 Ag i 890 A1Q znane sa takze jako pochodne kwasu eliwanowego (patrz Cerbett i wsp. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 2 1977t nr 24, str. 953-954)• Zwiazki a powyzszym wzorze 2, w którym R oznacza atom wodoru, zwane takze dezcysteaminylotienamycynami, zastrzezone sa w belgijskim opisie patentowym nr 867 227i Zwiazki o wzorze 2, w których '.?,?rze R oznacza atom wodoru, a X oznacza CHg, opisano w opisie patentowym RFN nr 2 751 624* 2 6 Antybiotyk typu tienamycyny, w którego wzorze 2 R oznacza -SCl^CF^NHAc, a R oznacza C2Hc, nazwany zostal PS-5 i zostal opisany przez K.- Choimure i wsp. w J, Antibiotics0 31, 480 (1978), patrz takze belgijski opis patentowy nr 865 578.Zwiazki o wzorze 2, w których X oznacza S, zwane takze "penemami", sa opisane przez T.Z. Wooduarda w "Recent Advances in the Chemistry of /?-lactam Antibiotics", wyd. J* Elks.The Chemical Society, Londyn, 1977, str. 167, a takze przez K.B. Uoodserda w "Abstracts od Uppsala Uhiversity 500 Years Symposium ca Current Topica in Drug Research, Uppsala, Szwecja, pazdziernik, 1921, 1977, Acta Fharra. Succica, tom 14, Supplement, str. 23, oraz w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 070 477* Szczególnie korzystnymi zwiazkami nalezacymi do grupy zwiazków tienamycynowych sa N-ferminidoilowe i N-acetamidoilowe pochodne tienamycyny* Krystaliczna N-forminidoilotiena- mycyna, opisana ostatnio, jest takze przydatna przy stosowaniu w praktyce zwiazków o wzorze 1 otrzymywanych sposobem wedlug wynalazkui Lek zlozony skladajacy sie z nowego chemicznego inhibitora wytworzonego sposobem wedlug wynalazku i zwiazku typu tienamycyny moze miec postac srodka farmaceutycznego zawierajacego dwa te zwiazki w farmaceutycznie dozwolonym nosniku. Oba zwiazki mozna stosowac w takich ilosciach, aby stosunek wagowy zwiazku z grupy tienamycyny do inhibitorów wynosil od 1:3 do 30;1, korzystnie 1f1 do 5:1» Skladniki te mozna takze podawac oddzielnie. Np* zwiazek typu tienamycyny mozna poda¬ wac domiesniowo lub dozylnie w ilosci 1-100 mg/kg/dzien, korzystnie 1-20 mg/kg/dzien lub 1-5 mg/kg/dzien, w dawkach podzielonych, np* 3 lub 4 razy dziennie. Inhibitor mozna podawac oddzielnie, doustnie, domiesniowo lub dozylnie, w ilosci 1-100 mg/kg/dzien lub, korzystnie, 1-30 mg/kg/dzien lub 1-5 mg/kg/dzien. Hosci tych dwóch zwiazków podawane w ciagu jednego dnia doskonale mieszcza sie w wyzej wspomnianym zakresie stosunków ilosciowych.4 131 618 Najkorzystniejszy znany obecnie zglaszajaceinu sposób dawkowania polega na podawaniu pojedynczej dawki dwóch krystalicznych zwiazków, z których jeden stanowi N-formimidoilotie- naraycyne, a drugi kwas ^ + ;-z-i-/^^-*aiaietyiocyklopropanokarboksyamido/hepteno-l-karboksy- lowy-1 jako Jalowy roztwór wodny dozylnej postaci, do wstrzykiwania (sól sodowa) w ilosci 150 mg tienamycyny i 75 albo 150 mg kwasu heptenokarboksylowego. Dawke te podaje sie ludziom 0 zalozonej wadze okolo 80 kg, od 1 do 4 razy dziennie, lub 2-8 mg/kg/dzien zwiazku z grupy tienamycyny i 1-8 mg/kg/dzien inhibitora.Skladniki zarówno podawane oddzielnie jak i lacznie, stosuje sie w farmaceutycznie dozwolonych nosnikach, takich jak zwykle zarobki, przy czym srodki moga miec postac przysto¬ sowana do podawania doustnego, taka jak kapsulki, tabletki, wzglednie ciekle roztwory lub zawiesiny. Skladniki, zarówno oddzielnie jak i lacznie, moga byc równiez rozpuszczone w nos¬ niku przystosowanym do iniekcji, srodki odpowiednie do podawania doustnego moga zawierac roz¬ cienczalniki, czynniki uzywane przy granulowaniu, czynniki konserwujace, lepiszcza, czynniki zapachowo-smakowe i czynniki powlekajace. Przykladem postaci do podawania doustnego jest lek zlozony ze skladników cynnych, lub tez sam skladnik kwasowy, zmieszany, jako suchy proszek, z zelatyna, skrobia, stearynianem magnezowym i kwasem alginowym i sprasowany w tabletke.Jak zaznaczono w powyzszej czesci opisu, znana obecnie korzystna metoda jest pozajeli-- to we podawanie zwiazku typu tienamycyny oraz laczne pozajelitowe, albo doustne podawanie zwiazku-inhibitora.Jak wspomniano, badania nad zachowaniem sie tienamycyny, jej naturalnych analogów i pochodnych pólsyntetycznych ujawnily, glówny metaboliczny szlak degradacji i wydalenia tych zwiazków u róznych badanych gatunków zwierzat, takich jak myszy, szczury, psy, szympansy i malpy Rhezus, Nasilenie metabolizmu znajduje swoje odbicie w niskim poziomie odzyskiwania w moczu i krótkim okresie polowicznego zaniku w surowicy* Wykazano, ze mechanizm tej degra¬ dacji polega na rozszczepieniu laktamu przez dipeptydaze nerkowa (Kat, Enz, 3»4,13i11)# co zostalo opisane po raz pierwszy przez M, Bergmanna i N, Schleicha w Z, Physiol* Chenu 205» 65 (.1932), Patrz takze J,P, Greenatein w Advances in Enzymology, tom VIII, Wiley-Interscien- ce (1948), Mew York, oraz E,J, Camphell, Y-Ci Lin* RiV. Dawis i E, Rallew: "The Parafication and Properties of Particulate Renul Dipeptase", Biochem, Biophys* ActaM118, 371 (1966)* W celu wykazania zdolnosci zwiazków o wzorze ogólnym 1 do hamowania dzialania enzyma¬ tycznego dipeptazy nerkowej, przeprowdzono badanie screningowe in vitro* Polega ono na zdol¬ nosci zwiazków do hamowania hydrolizy glicylodehydrofenyloalaniny (GDP) przez solubilizowa- ny preparat dipeptazy wyodrebniony z nerki swini. Sposób postepowania jest nastepujacy: do 1 al 500 niH buforu "MOPS" (kwas 3-/N-morfolino/propanosulfonowy/ o pH 7,1 dodaje sie 5/iS liofilizowanego enzymu i badany zwiazek do stezenia koncowego 0,1 mH, Po 5 minutach inkubacji w teinperaturze 37°C dodaje sie GDP do koncowego stezenia 0,05 mM, Inkubacje prowadzi sie w dalszym ciagu przez 10 minut w temperaturze 37°C, po czym oznacza sie stopien hydrolizy GDP za pomoca pomiaru zmiany, zaistnialej w trakcie inkubacji, w gestosci optycznej przy dlu¬ gosci fali 275 nm. Stopien zahamowania aktywnosci enzymu okresla sie przez porównanie z wy¬ nikami tak samo przeprowadzonych prób w nieobecnosci inhibitora i wyraza sie jako stala in- hibitowana K^ Jest to takie stezenie inhibitora, które wywoluje 50% zahamowania.GDP nadaje sie do zastosowania w tym badaniu bardziej od tienamycyny, a to z powodu wyzszej maksymalnej szybkosci hydrolizy przez dipeptadyze nerkowa, co zmniejsza zuzycie potrzebnej ilosci enzymu, GDP i tienamycyny maja podobne powinowactwo do dipeptadyzy ner¬ kowej, ponadto stale inhibitorowe K* okazaly sie po okresleniu identyczne dla tych dwóch substratowa W uzupelnieniu badania screeningowego in vitro przeprowdzono badanie screeningowe in vivo w celu zmierzenia zdolnosci badanego zwiazku do hamowania dzialania enzymu, przejawia-131 618 5 jacego sie wzrostem odzyskania tienamycyny w moczu myszy. W badaniu tym stosuje sie laczne podawanie zwiazku badanego droga dozylna lub podskórna w dawce 10-100 mg/kg z tienamycyna w dawce 10 mg/kg. Poziom odzyskania tienamycyny w moczu po 4-godzinnym okresie czasu porów¬ nuje sie z poziomem odzyskania w kontrolnej grupie zwierzat, którym nie podano inhibitora lacznie z tienamycyna.Odzyskanie tienamycyny w moczu okresla sie we wszystkich przypadkach za pomoca cylin- derkowego lub krazkowego testu dyfuzyjnego w sposób opisany w oposie patentowym Stanów Zje¬ dnoczonych nr 3 950 357 • To badanie biologiczne z uzyciem Staphylococcus aureus ATCC 6538 jako organizmu testowego, daje uzyteczna odpowiedz w zakresie od 0,04/ug/r/1 rio Z,0 //g/ml• Ponizej podano opis testów prowadzonych w celu oznaczenia aktywnosci wytwarzanych produktów.Test 1» Dane dotyczace badan in vitro Uzywa sie 1 ml 500 mil buforu "MOPS" o pH 7,1• Dodaje sie do niego 5 A*S enzymu z ner¬ ki swinskiej i zwiazek badany do stezenia koncowego 0,1 mll« Po 5 minutach inkubacji w tem¬ peraturze 37°C dodaje sie GDF do stezenia koncowego 0,05 nii-u Uklad w dalszym iagu inkubu- je sie przez 10 minut w temperaturze 37°C,. po czym dokonuje sie oznaczenia stopnia hydroli¬ zy GDP za pomoca zmierzenia zmiany, zaistnialej w trakcie inkubacji,w gestosci optycznej przy dlugosci fali 275 nn. Stopien zahamowania aktywnosci enzymu okresla sie przez porówna¬ nie z wynikami tak samo przeprowadzonych prób w nieobecnosci inhibitora i wyraza sie jako % zahamowania. K^ jest to stala wskazujaca stezenie inhibitora wywolujace 505* zahamowania* Jest to wartosc wyliczona z wyników otrzymanych przez prowadzenie wiekszej ilosci badan in vitro, takich jak wyzej opisano, przy stezeniach wywolujacych zahamowanie ponizej i powyzej 50$ó-wej wartosci zahamowania* Uzyskane wyniki zamieszczono w ponizszej tablicy I.Zwiazek nr 7 stanowi zwiazek porównawczy (kwas 1-izowaleroamidopropeno-1-karboksy- lowy-1).3^ Tablica I Zwiazki o wzorze 6 I Inhibitor I dipeptydazy 1 1 2x 2ax 2bx 3 6 7 (zw# porównawczy) 10 | 41 45 47 48 l ^ 2 CHgCK^ CK, j ch5 CH, CH3 CH, CH3 I CH3 (CH3)2CK CH5CH2 I Cn-rCripCHp (CH3)2CHCI^ I I R2 t I wzór 3 wzór 3 wzór 3 wzór 3 wzór 4 wzór 5 -CH2-CH(CH5)2 wzór 7 wzór 3 | wzór 3 wzór 3 wzór 3 % zahamowania przy stezeniu * 98 98 j 100 92 83 91 97 98 98 98 97 r~ ki ~~ i (/ug) 5 0,1S I I °'39 I I 0,12 19,8 1»7 4,6 6 9 0,54 0,18 0,11 0,23 cd. tabl. i na str. 6131 618 cd tabl. I 1 49 50 56 57 58 "2" ; ch3(ch2)3 CH3(CH2)4 CH3(CH2)5 CH3(CH2)6 CH3(CK2)g 3 wzór 3 wzór 3 wzór 3 wzór 3 wzór 3 r~—zr~~~—- 100 100 ; 98 99 96 pZ^ETTIi ! o,ii 0,17 0,149 0f092 I 0,14 I W powyzszej tablicy I uzyto nastepujacych oznaczen: "Zwiazki 2, 2a i 2b sa to, odpowiednio: racemat, odmiana prawo skretna i lewoskretnai Test 2» - Dane dotyczace badan in vivo Badania in vivo na myszach prowadzi sie w nastepujacy sposób* Myszom Charles River CD plci zenskiej o wadze 20 g, wstrzykuje sie podskórnie dobrane dawki inhibitora chemicznego* Nastepnie, po uplywie 2 minut podaje sie dozylnie dawke tienamycyny, wykonuje sie równiez próby kontrolne z uzyciem tienamycyny* Poziom tienamycyny w moczu okresla sie, jako % odzys¬ kania, w badaniu biologicznym. Uzyskane wyniki zamieszczono w ponizszej tablicy II* Numery dwóch zwiazków badanych odpowiadaja numerom z tablicy !• Zwiazek 7 stanowi kwas 7-izowalera- midopropeno-1-karboksylowy-1 f a zwiazek 10 stanowi kwas Z-1-cyklopropylokarboksyamidopro- peno-1-karboksylowy-1 * Tablica II Zwiazek I 7 I 7 I 10 kontrola Dawka zwiazku mg/kg 50 10 50 mm Dawka tienamy¬ cyny mg/kg 10 10 10 10 % odzyskania tienamycyny w moczu 53 | 53 I 56 | 25-30 m | Test 3» Nastepujace zwiazki: kwas 1-izowaleromidopropeno-1-karboksylowy-1, zwiazek 7 i kwas Z-1-(2,2-dimetylocyklopropanokarboksyamido)propeno-1-karboksylov/y-1 bada sie bardziej szczególowo in vivo na myszach, lacznie z tienamycyna (THM)* Ogólny sposób prowadzenia ba¬ dan podobny jest do opisanego powyzej w tescie 2* Uzyskane wyniki podano w ponizszych ta¬ blicach III i IVi T a b 1 i c a III yplyw podawanego wspólnie z tienamycyna kwasu 1-izowaleramidopropeno-1-karboksylowego-1 (zwiazek 7) na odzyskanie tienamycyny w moczu myszy a' [ Sposó Zwiazek 7 - SC SC b podawania**' THM IV lub sc SC I IV Dawka Zwiazek 7 «¦ i °f3 2 ' l mg/kg THM 10 10 10 Odzyskanie tienamycyny w moczu % 30 ± 5 33 42 cd, tabLIIIna str. 7131618 7 ccUtabl. Iii _^—_ SC SC SC SC SC SC r~ t~~~~— SC IV SC IV SC SC -1—— 2 10 50 50 80 100 ~—zr—— 10 10 10 10 10 10 5— , '-«-ra~"»u»'»'"¦'¦-¦ ¦ ¦¦ 1 47 53 54 53 59 81 l W powyzszej tablicy III uzyto nastepujacych oznaczen: a) myszy Charles Siver CD«|, plci zenskiej o wadze 20 g b) podawanie laczne IV oznacza podawanie dozylne sc oznacza podawanie podskórne Tablica IV Wplyw podawanego lacznie z tienamycyna kwasu Z-W2,2-dimetylocyklopropanokarboksyamido/ propeno-1-karboksylowego-1 (zwiazek 2) na odzyskanie tienamycyny w moczu myszy a' Sposób pod Zwiazek 2 - SC SC SC SC SC awania ' THK SC SC SC SC SC SC Dawka Zwiazek 2 I - 0,1 0,3 1 10 30 l mg/kg THM 10 10 10 10 10 10 Odzyskanie tienamycyny w moczu Só 38 i 5 I 35 I uo ue 60 73 W powyzszej tablicy IV uzyto nastepujacych oznaczen: a) myszy Charles River CD1# plci zenskiej, o wadze 20 g b) podawanie laczne IV oznacza podawanie dozylne sc oznacza podawania podskórne Test 4* V innym badaniu na myszach, ogólnoustrojowa aktywnosc przeciwbakteryjna tiena- nycyny wzmaga sie trzykrotnie przy lacznym podawaniu jej z kwasem 1-izowaleramidopropano- -1~karboksylowym-1, patrz ponizsza tablica Vi Tablica V Wplyw lacznie z tienamycyna podawanego kwasu 1-izowaleramidopropeno-1-karboksylowego-1 na ogólnoustrojowa skutecznosc przeciwbakteryjna tienamycyny w leczeniu zakazenia Staphylococcus aureus TOM sama + inhibitor 100 mg/kg r~ EE^TmgTKiF 1 0,2 0,066 131 618 Test 5. Do badan nad inhibitorami dipeptadyzy, jesli chodzi o ich wplyw na odzyskanie w moczu N-formirridoilotienamycyny, uzywa sie psów gonczych plci.meskiej* W badaniach kon¬ trolnych psom podaje sie dozylnie 5 m^/kg M-formimidoilotienamycyny bez inhibitora. Drugi eksperyment wykonuje sie z ta sama dawka N-formimidoilotienamycyny, ale podajac równiez kwas Z-1-izowaleramidopropeno-1-karboksylowy-1, w 3 dawkach po 20 mg/kg zwiazku kazda. Pier¬ wsza dawke podaje sie bezposrednio po wstrzyknieciu ^formimidoilotienamycyny, druga po uplywie 40 minut, a trzecia po uplywie 60 minut. W trzecim eksperymencie pojedyncza dawke (2 mg/kg) kwasu Z-1-/2f2-dimetylocyklopropenokarboksyamido/propeno-1-karboksylowego-1 poda¬ je sie bezposrednio przed wstrzykniecieni N-formimidoilotienanycyny* Uzyskane wyniki za¬ mieszczono w ponizszej tablicy VI« Tablica VI Odzyskanie 2-formimidoilotienamycyny w moczu psów gonczych plci meskiej po uplywie 3 godzin od dozylnego jej podania w dawce 5 mg/kg J ¦ ¦ I II ¦ I —— 1 1 ¦¦ II Zwiazek badany N-formimidoilotienamycyna + kwas Z-1-izowaleramido*- propeno-1-karboksylowy-1 f+ kwas Z-1-/2,2-dimetylocy- klopropanokarboksyamido/- propeno-1-karboksylowy-i % odzyskania w moczu 7,8 46 53 Ponizsze przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku nie ograniczajac jego zakresu.Przyklad I* Otrzymywanie kwasu 1-/2f2-dimetylocyklopropanokarboksyamido/- ^ penteno-1-karboksylowego-1 Stadium A. Otrzymywanie estru III-rzed.butylowego. DJnorleucyny Ogc^lna metoda wedlug R.Rocaka, J* Org* Chem. 28, 1251 (1963)* Do zawiesiny 9f82 g (75 milimoli) DL-norleucyny w 80 ml dioksanu, mieszczacej sie w 500 ml butelce cisnieniowej oziebionej na lazni z lodem, dodaje sie powoli, przy miesza¬ niu, 8 ml stezonego kwasu siarkowego* Otrzymana mieszanine oziebia sie na lazni z suchym lodem, dodajac w tym czasie 80 ml cieklego izobutylenu* Nastepnie pozwala sie mieszaninie ogrzac sie do temperatury pokojowej, po czym wytrzasa sie ja pod cisnieniem autogenicznym w ciagu 23 godzin. Po wypuszczeniu wiekszosci izobutylenu, lekko metny roztwór oziebia sie na lazni z lodem, po czym dodaje sie zimnej mieszaniny 400 ml 1N wodorotlenku sodowego i 500 ml eteru etylowego* Po wytrzasnieciu w rozdzielaczu, warstwy rozdziel* sie i frakcje wodna dodatkowo przemywa 100 ml eteru etylowego* Nastepnie roztwór eterowy wytrzasa sie ze 150 ml 0,5 N kwasu solnego* Kwasna frakcje wodna zadaje sie 2,5 N wodorotlenkiem sodowym, az do uzyskania odczynu silnie zasadowego, a nastepnie wytrzasa sie z 250 ml eteru etylo¬ wego* Nastepnie roztwór eterowy suszy sie (MgSO^), saczy i zateza w wyparce obrotowej* Na¬ stepnie przez dluzszy czas prowadzi sie destylacje z zastosowaniem wysokiej prózni, z laz¬ ni parowej, otrzymujac 5,04 g (6550 przezroczystej, bezbarwnej pozostalosci w postaci oleju* Badanie metoda NMR wykazalo jedynie slady dioksanu* Badanie metoda chromatografii cienko¬ warstwowej (mieszanina 9:1 chloroformu i metanolu) wykazalo pojedyncza plame* Stadium B* Otrzymywanie estru Ill-rzed* butylowego N-/2,2-dimetylocyklopropanokar- bonylo/-DL-norleucyny Do roztworu 8,98 g (48 milimoli) estru IH-rzed* butylowego DL-norleucyny i 5,05 g (50 milimoli) trietyloaminy w 100 ml CH2Cl2 wkrapla sie przy mieszaniu na lazni z lodem, z uzyciem rurki osuszajacej, w ciagu 75 minut, roztwór 6,39 g (48 milimoli) chlorku 2,2- dimetylocyklopropanokarbonylu (M* Elliot i N*R* James, brytyjski opis patentowy nr 1 260 847 /1972/ w 50 ml Gh^CO^i v trakcie dodawania, a zwlaszcza pod koniec, zachodzi wytracenie131 618 9 sie chlorowodorku trietyloaminy; Lód stopniowo topi sie i mieszaninie pozwala sie ogrzac do temperatury pokojowej* Po uplywie 16 godzin mieszanine wytrzasa sie z 20C ml 0,5 N kwasu solnegoi "arstv7 tepnie 2 razy po 200 ml, 0,5 N wodorotlenku sodowego i na koniec 200 ml wody; Nastepnie war¬ stwe te suszy sie siarczanem magnezowym i po dodaniu we^la drzewnego saczy przez Celite* Otrzymany przesacz zateza sie w wyparce obrotowej (stosujac w ostatniej fazie wysoka próznie), otrzymujac 11f93 (08%) pozostalosci o konsystencji oleju i o barwie jasnopomaranczowej; Ba¬ danie metoda chromatografii cienkowarstwowej (mieszanina 2:1 heksanu i octanu etylu) wykaza¬ lo pojedyncza plame* Badanie metoda NMR i IR wykazalo zgodnosc z przewidywana struktura; Po kilkudniowym przetrzymaniu produktu, wykrystalizowala z niego czesc zwiazku; Temperatura topnienia 52 do 65°C; Stadium C« Otrzymywanie estru III-rzed; butylowego kwasu 1-/2,2-dimetylocyklopropanokar- bek syamido/-1«metoksypentanokarboksylowego-1 Sposób oparty o metode H* Polsela i V; Schmidta, Chem; Ber; 108, 2547 (1975) Do roztworu 6,37 g (22,5 milimola) estru III-rzed;-butylowego N-/2,2-diEaetylocyklo- propanokarbonylo/-DL-norleucyny w 35 ml eteru etylowego dodaje sie przy mieszaniu, w tempe¬ raturze pokojowej, w atmosferze azotu i bez dostepu swiatla, 2,69 ml (2,45 g, 22,5 milimola) podchlorynu III-rzed-butylu; Po uplywie 15 minut dodaje sie roztwór metanolami sodowego, wy¬ tworzony za pomoca rozpuszczenia 0,52 g (22,6 milimola) sodu w 35 ml metanolu. Mieszanie kontynuuje sie w temperaturze otoczenia, w atmosferze azotu, bez dostepu swiatla; Bo uplywie 16 1/2 godziny odsacza sie wytracony chlorek sodowy, a przesacz rozciencza sie eterem etylo¬ wym i przemywa kolejno 3 razy po 50 ml 0,5 N HC1, 50 ml nasyconego weglanu sodowego i 2 razy po 50 ml wody; Faze eterowa suszy sie siarczanem magnezowym i saczy* Przesacz zateza sie w wyparce obrotowej, otrzymujac 6,45 g pozostalosci w postaci bladego zloto-zóltego oleju, który poddaje sie preparatywnej cieczowej chromatografii cisnieniowej; Po rozdzieleniu i wy¬ odrebnieniu otrzymuje sie 273 mg i 496 mg dwóch diastereomerów estru III-rzed;-butylowego kwasu 1-/2,2-dimetylocyklopropanokarboksyamido/-1-metoks3rpentanokarboksylowego-1f o tempe¬ raturze topnienia, odpowiednio 114-118°C i 124-125*5°* oraz 1,97 g pojedynczego izomeru (naj¬ wyrazniej Z) estru III-rzed; butylowego kwasu 1-/2,2-dimetylocyklopropanokarboksyamido/pen- tano-1-karboksylowego-1 w postaci bezbarwnego oleju* Stadium D; Otrzymywanie kwasu 1-/2,2-dimetyloc^klopropanokarboksyamido/penteno«1-kar- boksylowego-1 Roztwór 0,84 g (3,0 mola) estru III-rzed;butylowego kwasu 1-/2,2-dimetylocyklopropa- nokarboksyamido/penteno-1-karboksylowego-1 w 10 ml eteru etylowego wysyconego bezwodnym chlorowodorem pozostawia sie w temperaturze pokojowej pod rurka osuszajaca na okres 17 godzin; Nastepnie otrzymany roztwór odparowuje sie i gumowata pozostalosc rozpuszcza sie w 10 ml nasyconego roztworu wodoroweglanu sodowego; Roztwór ten przemywa sie dodatkowo 15 ml 0,5 N kwasu solnego, suszy siarczanem magnezowym, saczy i zateza, otrzymujac lepki olej, który pod¬ daje sie krystalizacji z toluenem; Otrzymuje sie 0,32 g (47#) krysztalów o barwie bialej, o temperaturze topnienia 119-122°C; Badanie metoda chromatografii cienkowarstwowej mieszani¬ na 4:1 toluenu i kwasu octowego/ wykazalo pojedyncza plame; Badanie metoda HMR wykazalo obecnosc zasadniczo czystego izomeru Z; (Uwaga: poddajac metanolowy addukt estru III-rzed; butylowego kwasu 1 -/2,2-dimetylocyklopropanokarboksyamido/-2-metoksypenteno-1-karboksylo- wego-1 reakcji z bezwodnym chlorowodoVem w srodowisku eteru etylowego i zachowujac podobne warunki reakcji, otrzymuje sie ten sam zwiazek;10 131 618 Zastrzezenia patentowe 2 1. Sposób wytwarzania nowych inhibitorów dipeptydazy o wzorze 1, w którym R oznacza grupe cyklopropylowa, mono- albo -dimetylocyklopropylowa lub 2,2-dichlorocyklopropylowa, R oznacza prosta lub rozgaleziona grupe alkilowa o 3-7, a zwlaszcza 3-4 atomach wegla, a R oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1-6 atomach wegla, dialkiloaminoalki.lowa lub farmaceutycznie dopuszczalny kation, ewentualnie w postaci soli, korzystnie sodowej lub potasowej, znamienny tym, ze chlorek kwasowy o wzorze 8, w którym R ma wy¬ zej podane znaczenie, poddaje sie reakcji z estrem Ill-rzedi butylowym ct-aminokwasu o wzorze 9, w którym R^ ma wyzej podane znaczenie, w obecnosci zasady, a nastepnie prowadzi sie utleniajaca addycje metanolami sodowego, po czym otrzymany zwiazek posredni poddaje sie reakcji z bezwodnym chlorowodorem, a nastepnie otrzymany produkt w postaci kwasu ewentual¬ nie przeprowadza sie w sól lub ester w znany sposób. 2i Sposób wedlug zastrzi 1, znamienny tym, ze w przypadku otrzymania kwasu 1-/2,2-dimetylocyklopropanokarboksyamido/-penteno-1-karboksylowego-1 poddaje sie reakcji ester Ill-rzedi butylowy DL-norleucyny i chlorek 2,2-dimetylocyklopropanokarbonylu* R3 H c 2 /¦ \ i R CONH COOR1 WZÓR 1 rWr2 0-^-N—L-COOH WZ(3R 2131 618 A( .CH3 •CH3 WZÓR 3 A/CH3 J^W»*£STIifJ^fc» CH3 CH3 WZÓR 4 WZÓR 5 H COOH 1 I I 2 R - C = C-NHCOR OChL 3 I 3 R CH2CC02C(CH3)3 NHCR2 II O WZÓR 6 WZÓR 11 A WZÓR 7 RJCH = CC02C(CH3)3 NHCR2 O WZÓR 12131 618 CC) o 8 0 = O —Z z: o o o er •o NI cr ^_co X O o I o o o I u X —O — I rsj X o X po en o KI LU X u (f) C£ o i 'o: 00 CK O KI Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz.Cena 100 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL