Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych kwasów 7p-[D-2-a'mino-2^/R'-iS1ulfonylo- aminofenylo/-acetyloamino]-3-R-3^cefemo-4-karbo- ksylowych o wzorze 1, w którym R oznacza nizsza grupe alkoksylowa o 1—4 atomach wegla lub chlo¬ rowiec o liczbie atomowej co najwyzej 35, a R' oznacza rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, oraz ich soli, majacych wlasciwosci antybiotyczne.Nizszy rodnik alkilowy w grupie R'-sulfonylo- aminowej zawiera 1—4 atomów wegla i oznacza na przyklad rodnik etylowy, n-propylowy, izopro¬ pylowy, n-butylowy lub izobutylowy a przede wszystkim metylowy. Grupa R^sulfonyloaminowa moze znajdowac sie w jakiejkolwiek pozycji rodni¬ ka fenylowego jednakze przede wszystkim zajmuje pozycje -3.Nizsza grupa alkoksylowa R zawiera 1—4 ato¬ mów wegla i oznacza na przyklad grupe etoksylo- wa, n-propoksylowa, izopropoksylowa, n-butoksy- lowa lub izobutoksyIowa a przede wszystkim me- toksylowa, natomiast chlorowiec oznacza fluor lub brom a przede wszystkim chlor.Solami sa w szczególnosci nietoksyczne sole da¬ jace sie stosowac farmaceutycznie, takie jak sole metali albo amonowe, zwlaszcza sole metali alka¬ licznych i metali ziem alkalicznych, na przyklad sole sodowe, potasowe, magnezowe, lub wapniowe, jak tez sole amonowe z amoniakiem lub odpo¬ wiednimi aminami organicznymi, przy czym dla utworzenia soli wchodza w rachube przede wszyst- 2 kim alifatyczne, cykloalifatyczne, cykloalifatyczno- alifatyczne i aryloalifatyczne pierwszorzedowe, dru- gorzedowe lub trzeciorzedowe jedno-, dwu lub wie- loaminy, jak tez zasady heterocykliczne, takie jak 5 lizsze alkiloaminy, np. trójetyloamina, hydroksy- niskoalkiloaminy, np. 2-hydroksyetyloamiina, bis-/2- -hydroksyetylo/-amina lub trójV2-hydroksyetylo/- -amina, zasadowe alifatyczne estry kwasów karbo- ksylowych, np. 4-aminobenzoesan 2-dwuetyloamino- io etylu, nizsze alkilenoaiminy, np. 1-etylopiperydyna, cykloalkiloaminy, np. dwucykloheksyloamina lub benzyloaminy, np. NjN^dwubenzyloetylenodwuami- na a nastepnie zasady typu pirydynowego, takie jak pirydyna, kolidyna lub chinolina. Nowe zwiaz- 15 ki moga takze tworzyc sole addycyjne z kwasami, np. z kwasami nieorganicznymi takimi jak kwas solny, siarkowy, lob fosforowy albo z odpowiedni¬ mi organicznymi kwasami karboksyIowymi lub sulfonowymi jak np. z kwasem trójfluorooctowym 20 lub 4-metylofenylosulfonowyim. Nowe zwiazki ko¬ rzystnie wystepuja w postaci swych soli wewnetrz¬ nych to znaczy w postaci amfoterycznej.Nowe zwiazki otrzymane sposobem wedlug wy¬ nalazku wykazuja cenne wlasciwosci farmakolo- 25 giczne. Sa one skuteczne w wolnej postaci lub w postaci swych soli in vitro przeciwko gronkow- com, jak Stephylococcus aureus, Streptococcus pyo- gencs, Streptococcus haemylyticus, Streptococcus fascalis, Diplococcus pneumoniae, Neisseria gonor- 30 rhosae i Neisseria meningitidis w zakresie dawek 110 876110 876 od 0,05 do 100 mcg/ml, przeciwko bakteriom jeli¬ towym jak Escherichia coli, Salmonella species, Shigalla flexneri, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Proteus rettgeri, Proteus mirabilis w za¬ kresie dawek od 0,8 do 50 mcg/ml jak równiez 5 przeciwko innym zarazkom patogennym jak Hae- mophilus influenzae i Pasteurella multocida w za¬ kresie dawek od 0,4 do 12,5 mcg/ml.W przypadku podawania pozajelitowego lub zwlaszcza doustnego sa one przy niewielkiej tok- *• sycznosci skuteczne przeciwko mikroorganizmom, takim jak bakterie gram-dodatnie, np. Staphylo- coccus aureus, Streptococous pyogenes i Diplococ- cus pneumoniae (np. w przypadku myszy w daw¬ kach od okolo 0,5 do okolo 100 mg/kg s.c. lub p.o.) 15 i bakterie gram-ujemme, np. Escherichia coli, Sal¬ monella typhimuriuim, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Proteus rettgeri i Proteus mirabilis (np. w przypadku myszy w dawkach od okolo 3,0 do okolo 200 mg/kg s.c. lub 20 p.o.) a zwlaszcza takze przeciw bakteriom odpor¬ nym na penicyline.W porównaniu ze znanymi z niemieckich opisów ogloszeniowych 2 331133 i 2 408 698 3-chlorowoo-, 3-alkoksy- lub 3-acylopodstawionymi kwasami 25 7P-fenyloglicyloamino-3-cefemo-4^karboksylowymi, które nie zawieraja w rdzeniu fenylowym zadnej grupy niskoalkilosulfonyloaiminowej, zwiazki beda¬ ce przedmiotem wynalazku wyrózniaja sie wiek¬ sza aktywnoscia in vitro przeciwko wielu szczepom *• bakterii jelitowych. Na myszy in vivo wyraznie przewyzszaja one te znane preparaty i sa skutecz¬ niejsze przeciwko wielu zakazeniom wywolanym przez gronkowce i bakterie jelitowe.W porównaniu ze znanymi z niemieckich opisów w ogloszeniowych 2 422 385 i 2 432190 3-metylo-, 3- Hniskoalkanoiloksy-, 3-alkoksy- lub 3-heterocyklo- tiopodstawionymi kwasami 7iP-[2-/niskoalkilosulfo- nyloaminofenylo/-glicyloamino]-3-ceifemo-4-kairbo- ksylowymi nowe zwiazki wyrózniaja sie zwiek^zo- *o na aktywnoscia in vitro (myszy) zwlaszcza prze¬ ciwko szczepom bakterii jelitowych. Oprócz tego maja one duza rozpuszczalnosc w wodzie i moczu, która stwarza jedynie niewielka mozliwosc krysta- lurgii. Nowe zwiazki moga miec zastosowanie do 45 leczenia wyzej podanych zakazen na przyklad w postaci antybiotycznie dzialajacych preparatów.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie prze¬ de wszystkim kwasy 7i|HD-2-amino-2H/3-metyilosul- fonyloaminofenyla/-acetyloamino] -3-R'-3-cefemo-4- 50 -karboksylowe, w których R' oznacza grupe meto- ksylowa lub chlor, oraz ich sole, zwlaszcza nie¬ toksyczne, dajace sie stosowac farmaceutycznie, a w szczególnosci ich sole wewnetrzne.Nowe zwiazki wytwarza sie analogicznie do zna- 55 nych metod, sposobem polegajacym wedlug wyna¬ lazku na tym, ze w kwasie 7i|3-amino-3-R-3^cefemo- -4-karboksylowym o wzorze 2, w którym grupa karboksylowa wystepuje w postaci ewentualnie za¬ bezpieczonej a grupa 7ip-aminowa wystepuje w po- 60 staci ewentualnie reaktywnej, to znaczy w zabez¬ pieczonej postaci umozliwiajacej acylowanie, gru¬ pe 7p-aminowa acyluje sie rodnikiem D-2-amino-2- ^R'^sulfonyloaminofeinylo/-acetylowym, i w otrzy¬ manym zwiazku zabezpieczona grupe 2-aminowa 65 i/lub N-acylowana grupe R'-sulfonyloaminowa prze¬ ksztalca sie w wolna grupe aminowa wzglednie w grupe R'sulfonyloaminowa i/lub zabezpieczona grupe karboksylowa przeksztalca sie w wolna gru¬ pe karboksylowa, i otrzymana sól ewentualnie przeksztalca sie w wolny zwiazek lub w inna sól i/lub wolny zwiazek ewentualnie przeksztalca sie w sól.W powyzszej substancji wyjsciowej o wzorze 2 grupa karboksylowa i w acylujacej substancji wyj¬ sciowej grupa 2-aminowa moze wystepowac w po¬ staci zabezpieczonej, przy czym jako grupy zabez¬ pieczajace wchodza w rachube grupy stosowane zwlaszcza w chemii penicyliny i cefalosporyny oraz w chemii peptydów.Grupa karboksylowa jest zazwyczaj zabezpieczo¬ na w postaci estrowej, przy czym takie ugrupowa¬ nie estrowe daje sie latwo rozszczepiac w lagod¬ nych warunkach. Jako odpowiednie zabezpieczone grupy karboksylowe wchodza w rachube zwlaszcza grupa niskoalkoksykarbonylowa, w szczególnosci Ill-rzed.niskoalkoksykarbonylowa, np. III-rzed.bu- toksykarbonylowa, grupa wielocykloalkoksykarbo- nylowa, np. adamantyloksykarbonylowa, grupa ary- lometoksykarbonylowa, w której czesc arylowa sta¬ nowia korzystnie jeden lub dwa, ewentualnie niz¬ szym rodnikiem alkilowym, zwlaszcza trzeciorzedo¬ wym nizszym rodnikiem alkilowym, np. Ill-rzed, butylowym, nizsza grupa alkoksylowa jak np. me- toksylowa, grupa hydroksylowa, chlorowcem, np. chlorem i/lub grupa nitrowa jedno- lub wielopod- stawione rodniki fenylowe, jak ewentualnie np. wyzej wspomniana grupa benzyloksykarbonylowa, np. 4-niitrobenzyloksykarhonylowa, albo jak wyzej podano podstawiona grupa dwufenylometoksykar- bonylowa, np. benzhydryloksykarbonylowa lub dwu-/4^metoksyfenylo/-metoksykarbonylowa, albo 2-chlorowconiskoalkoksykarbonylowa, np. 2,2,2-trój- chloroetoksykarbonylowa lub 2-bromo- albo 2-jodo- etoksykarbonylowa lub acylometoksykarbonylowa, zwlaszcza aroilometoksykaribonylowa, w której gru¬ pe aroilowa korzystnie stanowi ewentualnie, np. chlorowcem np. bromem podstawiona grupa benzo- ilowa np. fenacylokarbonylowa.Zestryfikowanymi grupami karboksylowymi sa równiez odpowiednie grupy sililoksykarbonylowe, a zwlaszcza organiczne grupy sililoksykarbonylowe.W grupach tych atom krzemu zawiera jako pod¬ stawniki korzystnie nizszy rodnik alkilowy, zwlasz¬ cza metylowy, ponadto nizsza grupe alkoksylowa, np. metoksylowa, i/lub chlorowiec, np. chlor. Odpo¬ wiednimi zabezpieczajacymi grupami sililowymi sa przede wszystkim grupa trójniskoalkilosilalowa, zwlaszcza trójmetylosililowa, ponadto dwumetylo- -Ill^rzed.butylosililowa, grupa niiskoalkoksyniskoal- kilochlorowcosililowa, np. metoksymetylochlorosili- lowa, albo grupa dwuniskoalkilochlorowcosililowa, np. dwumetylochlorosililowa, zabezpieczajace gru¬ py sililowe, zwlaszcza zawierajace jeden atom chlo¬ rowca jako podstawnik, moga przy tym równo¬ czesnie zabezpieczac grupy karboksylowe w dwóch róznych czasteczkach substancji wyjsciowej, to zna¬ czy w tego rodzaju grupach taki atom chlorowca jest wymieniony przez grupe karbonylowa dalszej czasteczki substancji wyjsciowej. :~ V'.110 876 6 Zabezpieczana grupa karboksylowa korzystnie jest, np. jak wspomniano, ewentualnie podstawiona grupa benzyloksykarbonylowa, np. 4-nitrobenzylo- ksykarbonylowa lub dwufenylometoksykarbonylo- wa, np. benzhydryloksykarbonyIowa.Zabezpieczona grupa 2-aminowa moze np. wyste¬ powac w postaci latwo rozszczepialnej grupy acy- loaminowej, trójarylometyloaminowej, zeterowanej grupy merkaptoaminowej, l^acylo-2-niskoalkilide- noaminowej lub sililoarnikiowej albo grupy azydko- wej.W odpowiedniej grupie acyloaiminowej jak rów¬ niez w grupie N-acylo-R'-«ulfonyloaminowej rodnik acylowy jest korzystnie rodniteiem acylowyim pól¬ estru kwasu weglowego, np. grupa niskoalkoksy- karbonylowa, zwlaszcza Ill-rzed.niskoalkoksykarbo- nylowa, np. III-rzed.butoksykarbonylowa, wielocy- fcloalkoksykairbonylowa, np. adamantyloksykarbo- nylowa, arylometoksykarbonylowa, w której rodnik arylowy stanowi korzystnie jeden lub dwa rodniki fenyilowe, jedno- lub wielopodstawiione ewentualnie np. nizszym rodnikiem alkilowym, zwlaszcza III- -rzedowym nizszym rodnikiem alkilowym, np. III- Hrzed-butylowym, nizsza grupa alkoksylowa jak me- toksylowa, grupa hydroksylowa, chlorowcem, np. chlorem i/lub grupa nitrowa. Rodnikiem tym moze byc ewentualnie np. jak wyzej podano, podstawio¬ na grupa benzyloksykarbonylowa, np. 4-nifcroben- zy^oksykarbonylowa, albo np. jak wyzej wspomnia¬ no, podstawiona grupa dwufenylometoksykarbony- lowa, np. banzhydryloksykarbonylowa lub dwu-/4- -metoksyfenylo/Hmetoksykarbonylowa albo 2-chlo- rowconiskoalkoksykairbonylowa, np. 2,2,2-trójchlo- roetoksykarbonylowa, 2-bromoetoksykarbonylowa lub 2-jodoetoksykarbonylowa lub acylornetoksykar- bonylowa, zwlaszcza aroilometoksykarbonylowa, w której rodnik aroilowy stanowi * korzystnie ewen¬ tualnie np. chlorowcem takim jak brom, podsta¬ wiony rodnik benzoilowy jak np. grupa fenacylo- ksykarbonylowa. Rodnik acylowy w grupie acylo- aminowej lub N-acyloniskoalkilosulfonyloaiminowej moze stanowic takze odpowiedni rodnik organicz¬ nego kwasu sulfonowego. Tego rodzaju rodnikiem jest zwlaszcza grupa arylosulfonylowa, w której rodnik arylowy oznacza ewentualnie np. nizszym rodnikiem alkilowym jak metylowym, chlorowcem jak brom lub grupa nitrowa podstawiony rodnik fenylowy np. grupa 4-metylofenylosulfonylowa.W grupie trójarylometyloaminowej rodniki arylo- we sa zwlaszcza ewentualnie podstawionymi rod¬ nikami fenylowyimi. Odpowiadajaca grupa jest w pierwszym rzedzie grupa tritylowa.Zeterowana grupa merkaptanowa w zabezpieczo¬ nej tego rodzaju rodnikiem grupie aminowej jest przede wszystkim grupa arylotio lub aryloniskoal- kilotio, w której rodnik arylowy jest zwlaszcza rodnikiem fenylowym podstawionym ewentualnie np. nizszym rodnikiem alkilowym jak metylowym lub IH-rzedJbutylowym, nizsza grupa alkoksylowa jak np. metoksylowa, chlorowcem jak np. chlorem i/lub grupa nitrowa. Odpowiednia ochronna grupa aminowa jest np. grupa 4-nitrofenylotio.W dajacym sie stosowac jako zabezpieczajacy grupe aminowa rodniku l-acylo-2-niskoalkilideno- wym jest rodnik acylowy korzystnie odpowiednim rodnikiem kwasu niskóalkanokarboksylowego, kwa¬ su benzoesowego podstawionego ewentualnie np. nizszym rodnikiem alkilowym jak metylowym lub III-rzed.butylowym, nizsza grupa alkoksylowa jak B metoksylowa, chlorowcem jak np. chlorem i/lub grupa nitrowa, albo pólestru kwasu weglowego jak np. niskoalkilowego pólestru kwasu weglowego.Odpowiednimi grupami zabezpieczajacymi sa prze¬ de wszystkim grupa l-niskoalkanoilo-2-propylide- i* nowa, np. l-acetylo-2-propylidenowa, albo 1-nisko- alkoksykarbonylo-2Hpropylidenowa, np. 1-etoksy- karbonylo-2npropylidenowa.Grupa sililoaminowa jest w pierwszym rzedzie organiczna grupa sililoaminowa, w której atom u krzemu jako podstawniki zawiera korzystnie niz¬ szy rodnik alkilowy, zwlaszcza metylowy, nastep¬ nie nizsza grupe alkoksylowa, np. metoksylowa i/lub chlorowiec, np. chlor. Odpowiednimi grupami sililowymi sa przede wszystkim grupa trdjnisko- * alkilosililowa, zwlaszcza trójmetylosililowa, nastep¬ nie dwumetylo-III-rzedjbutylosililowa, niskoalko- ksyniskoalkilochlorowcosililowa, np. metoksymety- •lochlorasililowa lub dwuniskoalkilochlorowcosililo- wa, np. dwumetylochlorosililowa. Sililowe grupy ** zabezpieczajace a zwlaszcza zawierajace jako pod¬ stawnik jeden atom chlorowca moga przy tym rów¬ noczesnie zabezpieczac grupe aminowa w dwóch róznych czasteczkach substancji .wyjsciowej, to zna¬ czy w tego rodzaju grupach atom chlorowca wy* 30 mieniany jest przez grupe aminowa drugiej cza¬ steczki substancji wyjsciowej.Grupa 2-aminowa w substancji wyjsciowej moze byc takze zabezpieczona w postaci protonowej; ja¬ ko aniony wchodza w rachube przede wszystkim 35 aniony mocnych kwasów nieorganicznych jak np. kwasów chlorowcowodorowych, np. anion chloru albo bromu. Jako grupy zabezpieczajace amine ko¬ rzystne sa rodniki acylowe pólestrów kwasu weglo¬ wego, zwlaszcza grupa III^rzed.niskoalkoksykarbo- 40 nylowa, ewentualnie np. jak podano, podstawiona grupa benzyloksykarbonylowa lub dwufenylometo- ksykarbonylowa albo 2-chlorowconiskoalkoksykar- bonylowa.W substancji wyjsciowej o wzorze 2 grupa kar- *5 boksyIowa moze byc zabezpieczona korzystnie w postaci zestryfikowanej, np. jak wyzej opisano, przede wszystkim w postaci estru sililowego jak np. estru trójmetylosililowego, (który najczesciej wytwarza sie bezposrednio przed reakcja acylowa- 50 nia przez dzialanie odpowiednim srodkiem sililuja- cym, np. trójmetylochlorosilanem lub bis-/trójmety- losililo/-acetamidem). Bedacy substancja wyjsciowa kwas karboksylowy o wzorze 2 mozna takze stoso¬ wac w postaci soli, jak np. w postaci soli amonio- 55 wej, takiej jak sól trójetyloamoniowa albo w po¬ staci chronionej, która mozna otrzymac w wyniku reakcji wyjsciowego kwasu karboksylowego o wzo¬ rze 2 z odpowiednim organicznym halogenkiem fosforu, np. z dwuhalogenkiem niskoalkilo- lub nis- oo koalkoksyfosforowym, takim jak dwuchlorek me- tylofosforowy, dwuhromek etyloiosforowy lub dwu¬ chlorek metoksyfosforowy. Grupa 7i0^a postaci zabezpieczonej i reaktywnej jest np. grupa 7p-aminowa zabezpieczona rodnikiem sililowym, np.W jednym z wyzej podanych rodników.110 876 7 8 Dalszymi grupami, mogacymi zabezpieczac grupe 7|3-aminowa w postaci reaktywnej, sa grupa kar- bonylowa (0=C-) jak równiez ewentualnie 1-pod¬ stawione grupy 1-chloroweo- lub 1-alkoksymetyle¬ nowe. W takich grupach metylenowych chlorowcem jest brom lub zwlaszcza chlor a grupa alkoksylowa jest w szczególnosci ewentualnie podstawiona niz¬ sza grupa alkoksylowa jak np. etoksylowa, propo- ksylowa, but oksyIowa lub korzystnie metoksy Io¬ wa.Innym podstawnikiem w pozycji 1 takiej grupy metylenowej jest wodór lub jakikolwiek rodnik organiczny o malej zawadzie sterycznej, np. ewen¬ tualnie podstawiony nizszy rodnik alkilowy jak metylowy, 4-amino-4-karboksybutylowy, w którym grupa aminowa i karboksylowa moze byc chronio¬ na, rodnik benzylowy, fenyloksymetylowy, tienylo- metylowy lub tez furylometylowy jak np. 2-tienylo- albo 2-furylornetyIowy.Acylowanie wolnej lub reaktywnej, zabezpieczo¬ nej grupy 7p-aminowej w substancji wyjsciowej o wzorze 2 przeprowadza sie znanym sposobem.Jako srodki acylujace wchodza w rachube kwas' D-2-amino-2-/R/-sulfonyloamiinofenylo/-octowy o wzorze 3 lub jego reaktywna pochodna przy czym grupa 2-aminowa znajduje sie zazwyczaj w posta¬ ci zabezpieczonej, miedzy innymi takze w postaci protonowanej lub zamaskowanej, np. tez jako gru¬ pa azydkowa a grupa niskoalkilosulfonyloamino- wa przy azocie moze byc ewentualnie podstawiona grupa acylowa.W przypadku uzycia do acylowania wolnego kwa¬ su o wzorze 3 z zabezpieczona grupa 2-aminowa i ewentualnie N-acylowana grupa niskoalkilosulfo- nyloaminowa, stosuje sie zazwyczaj odpowiednio srodki kondensujace takie jak karbodwuimidy, np.N,N'-dwuetylo-, N,N'-dwupropylo-, N,N'-dwuizo- propylo-, N,N'-dwucykloheksylo- albo N-etylo-N'- -3-dwumetyloaminopropylokarbodwuimid, odpo¬ wiednie zwiazki karbonylowe, np. karbonylodwu- imidazol albo sole izoksazoliniowe, np. 3'-sulfonian N-etylo-5-fenyloizoksazoliniowy i nadchloran N- -III-rzed.-butylo-5-fenyloizoksazoliniowy albo odpo¬ wiedni zwiazek acyloaminowy jak np. 2-etoksy-l- -etoksykarbonylo-l,2-dwuwodorochinoline. Reakcje kondensacji przeprowadza sie korzystnie w bez¬ wodnym srodowisku, np. w chlorku metylenu, dwu- metyloformamidzie lub acetonitrylu.Dalszymi odpowiednimi srodkami kondensujacy- mi do acylowania grupy 7(3-aminowej kwasem D-2- -amino-2-/R'-sulfonyloaminofenylo/- octowym, przy czym moga byc stosowane takze jego estry, np. estry niskoalkilowe, jak ester metylowy lub etylo¬ wy, i w którym grupa 2-aminowa moze byc w po¬ staci zabezpieczonej a grupa R'-sulfonyloaminowa w postaci zabezpieczonej a grupa R'-sulfonyloami- nowa w postaci N-acylowanej, sa katalizujace acy¬ lowanie enzymy odpowiednich mikroorganizmów np. Pseudomonas melanogenum ATCC, 17808 lub licznych innych, znanych szczepów acylujacych jak np. Xanthomonas, Acetobacter, Achromobacter, Be- neckea hyperoptica, Micrococous urea, Mycobacte- rium smegmatis lub Noeordia globerula. Acylowa¬ nie enzymatyczne nastepuje w znany sposób w obecnosci wymienionych mikroorganizmów albo w pozywce wodnej zawierajacej niezbedne dla wzro¬ stu uzytego szczepu znane substancje odzywcze albo tez w roztworze buforowym, np. w buforze octanowym zawierajacym chlorek sodowy, w wa¬ runkach aerobowych w temperaturze pomiedzy 20 i 50°C jak równiez przy wartosci nie 6,5—7.Reaktywna pochodna wspomnianego kwasu o wzorze 3, zazwyczaj z zabezpieczona grupa amino¬ wa i ewentualnie N-acylowana grupa nisko-R'- sulfonyloaminowa, jest przede wszystkim jego bez¬ wodnik a korzystnie bezwodnik mieszany. Miesza¬ nymi bezwodnikami sa np. bezwodniki z kwasami nieorganicznymi zwlaszcza kwasami chlorowcowo¬ dórowymi, to znaczy odpowiednie halogenki kwa¬ sowe, np. chlorek lub bromek kwasowy, nastepnie bezwodnik z kwasem azotówodórowym to znaczy odpowiedni azydek kwasowy, z kwasem zawiera¬ jacym fosfor, np. kwasem fosforowym lub fosfora¬ wym, z kwasem zawierajacym siarke, np. kwasem siarkowym albo z halogenkiem, np. chlorkiem, pól- estru dwumetyloimmoniometyiowego kwasu siarko¬ wego lub z kwasem cyjanowodorowym.Dalszymi bezwodnikami mieszanymi sa bezwod¬ niki z kwasami organicznymi, np. organicznymi kwasami karboksylowymi, jak np. chlorowcem, ta¬ kim jak fluor lub chlor, ewentualnie podstawiony¬ mi nizszymi kwasami alkanokarboksylowymi, np. z kwasem piwalinowym lub trójchloroweooctowym, albo z pólestrami, zwlaszcza niskoalkilowymi pól- estrami kwasu weglowego np. z pólestrem etylo¬ wym lub izobutyIowym lub z halogenkiem, np. chlorkiem, pólestru N,N-dwumetyloimmoniometylo- wego kwasu weglowego albo z organicznymi, zwla¬ szcza alifatycznymi lub aromatycznymi kwasami sulfonowymi, np. z kwasem p-toluenosulfonowym.Dalszymi pochodnymi kwasowymi, nadajacymi sie do reakcji z grupa aminowa substancji wyjscio¬ wej o wzorze 2 sa zaktywowane estry wspomnia¬ nego kwasu o wzorze 3, zazwyczaj z zabezpieczona grupa aminowa, jak' estry z alkoholami szeregu winylowego (to znaczy enolami), np. z nizszymi alkenolami szeregu winylowego, albo estry arylo- we, jak np. grupa nitrowa lub chlorowcem takim jak chlor, korzystnie podstawione estry fenylowe, np. ester pieciochlorofenylowy, 4-nitrofenylowy lub 2,4-dwunitrofenylowy, estry heteroaroniatyczne, jak ester benzotriazolowy, lub estry dwuacyloaminowe, jak ester .sukcynyloiminowy lub ftaliloiminowy.Acylowanie za pomoca pochodnej kwasowej, np. bezwodnika a zwlaszcza halogenku kwasowego mozna przeprowadzic w obecnosci srodka wiazace¬ go kwas jak na przyklad zasady organicznej, np. aminy organicznej, np. aminy trzeciorzedowej jak np. trójniskoalkiloaminy, np. trójetyloaminy, N,N- -dwuniskoalkiloaniliny, np. N,N-dwumetyloaniliny albo zasady typu pirydynowego jak np. pirydyny, zasady nieorganicznej, np. wodorotlenku, weglanu lub wodoroweglanu metalu alkalicznego lub meta¬ lu ziem alkalicznych, np. wodorotlenku, weglanu lub wodoroweglanu sodowego, potasowego lub wa¬ pniowego albo oksiranu, np. nizszego tlenku 1,2- -alkilenowego jak tlenek etylenu lub tlenek 1,2- propylenu.Powyzsza reakcje acylowania mozna prowadzic 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 609 10 w wodnym lub korzystnie niewodnym rozpuszczal¬ niku lub mieszaninie rozpuszczalników, np. w ami¬ dzie kwasu karboksylowego, jak w N,N-dwunisko- alkiloamidzie, np. w dwumetyloforrciamidzie, w chlorowcowanym weglowodorze, np. w chlorku me¬ tylenu, czterochlorku wegla lub chlorobenzenie, w ketonie, np. acetonie, estrze, np. octanie etylu, albo w nitrylu, np. acetonitrylu, lub w ich mieszaninach, oraz ewentualnie w temperaturze obnizonej lub podwyzszonej, np. w temperaturze od 20° do H-IOO^C ii/lub w atmosferze gazu obojetnego, np. w atmosferze azotu.Jesli w substancji wyjsciowej o wzorze 2 grupa 7p-aminowa zabezpieczona jest rodnikiem pozwala¬ jacym na acylowanie, to rodnik ten zostaje od- szczepiony przy acylowaniu lub przy przeróbce pro¬ duktu reakcji, na przyklad hydrolitycznie i ewen¬ tualnie w obecnosci zasady, jak np. trójetyloaminy.Substancje wyjsciowe o wzorze 2 sa znane i moz¬ na je Wytworzyc np. przez rozszczepienie znanym sposobem ugrupowania acyloaminowego w zwiaz¬ kach kwasu 7!p-acyloamino-3-R^3-cefemo-4-karbo- ksylowego, w których rodnik acylowy oznacza rod¬ nik inny niz D~2-amino-2-/R'-sulfonyloaminofeny- lo/-acetylowy, np. fenylaacetylowy lub fenoksyace- tylowy; np. przez traktowanie pieciochlorkiem fos¬ foru w obecnosci pirydyny a nastepnie metanolem i ewentualnie woda.Substancje wyjsciowe o wzorze 2, w którym gru¬ pa 7[(5-aiminowa jest zabezpieczona w postaci reak¬ tywnej, pozwalajacej na acylowanie, sa równiez znane lub moga byc wytworzone znanymi metoda¬ mi, ewentualnie in situ. Orupe sililowa wprowadza sie przez traktowanie wolnej grupy 7p-aminowej odpowiednim srodkiem sililujacym, np. trójmetylo- chlorosilanem lub tez bis-/tr6jmetylosililo/-aceta'mi- dem. Grupe karbonyIowa mozna Wprowadzic przez traktowanie wolnej grupy 7|3-aminowej fosgeneim w obecnosci zasady jak np. aminy trzeciorzedowej takiej jak trójetyloamina. Substancje wyjsciowe o wzorze 2, w którym grupa aminowa zabezpieczona jest ewentualnie 1^podstawiona grupa 1-chlorowco- metylenowa, otrzymuje sie przez traktowanie kwa¬ su 7#-acyloamino-3-R-3-cefemo-4-karboksylowego, w którym rodnik acylowy jest rodnikiem innym niz rodnik D-2-amino-2-/R'-sulfonyloaminofenylo/- -acetylowy (ewentualnie z zabezpieczona grupa aminowa) np. ewentualnie podstawionym nizszym rodnikiem alkanoilowym, np. forniylowym, acetylo- wym, 5-amino-5-karboksywalery.lowym w którym grupa aminowa i karboksylowa moze byc chronio¬ na, fenyloacetylowym, fenoksyacetylowym, -tienjNo^ acetylowym lub tez furyloacetylowym a grupa kar¬ boksylowa i/lub istniejace w rodniku acylowym grupy funkcyjne ewentualnie sa w postaci chro¬ nionej, za pomoca pieciohalogenku fosforu, zwlasz,- cza pieciochlorku fosforu w obecnosci zasady jak np. pirydyny. Otrzymany zwiazek 1-chlorowcome^ tylenoiminowy mozna albo acylowac bezposrednio, albo przez traktowanie alkoholem, np. metanolem, przeksztalcic w odpowiedni ewentualnie 1-podsta¬ wiony zwiazek 1-alkoksymetylenowy, który zaziwy- czaj poddaje sie acylowaniu równiez bez jego wy¬ odrebniania.- W zwiazkach otrzymywanych sposobem wedlug wynalazku zabezpieczone grupy karboksylowe i/lub- aminowe i/lufo N-acylowane grupy R'^sulfonylo- aminowe uwalnia sie, ewentualnie jednoczesnie, w znany sposób, np. za pomoca solwolizy, wlacznie z hydroliza, alkoholiza lub acydoliza, albo za po¬ moca redukcji, wlacznie z hydrogenoliza, lub re¬ dukcji chemicznej.Mozna wiec np. grupe Ill-rzed.niskoalkoksykar- bonylowa, wielocykloalkoksykarbonylowa lub dwu- fenylometoksykarbonylowa przeksztalcic w wolna grupe karboksylowa przez traktowanie stosownym srodkiem kwasnym, np. kwasem mrówkowym lub trójfluorooctowym, ewentualnie dodajac zwiazku nukleofilowego, zwlaszcza fenolu lub anizolu. Ewen¬ tualnie podstawiona grupe benzyloksykarbonylowa mozna uwolnic np. za pomoca hydrogenolizy przez traktowanie wodorem w obecnosci katalizatora sto¬ sowanego przy uwadarnianiu jak np. katalizatora palladowego. Nastepnie mozna pewne podstawione grupy benzyloksykarbonylowe, np. 4-nitrobenzylo- ksykarbonylowa, przeksztalcic w wolna grupe kar¬ boksylowa takze za pomoca redukcji chemicznej, np. przez traktowanie podsiarczynem metalu alka¬ licznego, np. podsiarczynem sodu, albo redukuja¬ cym metalem, np. cynkiem, albo sola metalu, np. sola chromowa, zwlaszcza chlorkiem chromawym, zazwyczaj w obecnosci oddajacego wodór srodka, który wraz z metalem moze wytwarzac wodór in statu nascendi, np. kwasu, przede wszystkim kwa¬ su octowego, oraz mrówkowego, albo alkoholu, przy czym korzystnie dodaje sie wode.Przez traktowanie redukujacym metalem lub so¬ la metalu, jak wyzej opisano, mozna takze grupe 2-ohloTowconiskoalkoksykarbonylowa (ewentualnie po przeksztalceniu grupy 2-bromoniskoalkoksykar- bonylowej w grupe 2-jodoniskoalkoksykarbonylowa) lub grupe acylometoksykarbonylowa przeprowadzic w wolna grupe karboksylowa, przy czym grupe aroilometoksykarbonylowa mozna rozszczepic takze przez traktowanie odczynnikiem nukleofilowym, ko¬ rzystnie tworzacym sól, np. tiofenolanem sodu lub jodkiem sodu. Grupe karboksylowa, zabezpieczona np. za pomoca sililowania mozna uwolnic w zwykly sposób, np. przez traktowanie woda lub alkoholem.Analogicznie mozna za pomoca hydrolizy lub alko¬ holizy uwolnic grupe karboksylowa zabezpieczona przez reakcje z organicznym halogenkiem fosforu.Zabezpieczona grupe aminowa uwalnia sie znana i rózna w zaleznosci od rodzaju grupy ochronnej metoda, np. za pomoca solwolizy lub redukcji.Grupe 2-chlorowconiskoalkoksykarbonyloiaminowa (ewentualnie po przeksztalceniu grupy 2-bromoni- skoalkoksykarbonylowej w grupe 2-jodoniskoalko- ksykarbonylowa), grupe acylornetoksykarbonylo- aminowa lub np. grupe 4-nitrobenzyloksykarbony- loaminowa mozna uwolnic np. przez traktowanie stosownym chemicznym srodkiem redukujacym, np. cynkiem w obecnosci wodnego roztworu kwasu octowego, zas grupe aroilometoksykarbonyloamino- wa takze przez traktowanie odczynnikiem nukleo- filowym, korzystnie tworzacym sole, np. tiofenola¬ nem sodowym, a grupe 4-nitrobenzyloksykarbony- loaminowa równiez przez traktowanie podsiarczy¬ nem metalu alkalicznego, np. podsiarczynem sodo¬ wym; 'Grupe dwufenylometoksykarbonyloaininowa, 10 15 20 29 30 39 40 43 90 59 80110? 11 Ill-rzedjniskoalkoksykarbonyloaminowa lub wielo- cykloalkoksykarbonyloamina mozna uwolnic przez traktowanie np. kwasem mrówkowym lub trójfluo- rooctowyim, ewentualnie podstawiona grupa benzy- loksykarbonyloaminowa mozna uwolnic np. za po- 5 moca hydrogenolizy przez traktowanie wodorem w obecnosci katalizatora stosowanego przy uwodornia¬ niu, np, katalizatora palladowego, zas grupe arylo- lub aryloniskoalkilotioaminowa np. przez trakto¬ wanie odczynnikiem nukleofilowym, np. kwasem 10 siarkowym, natomiast grupe arylosulfonyloamino- wa np. za pomoca redukcji elektrolitycznej, grupe l-acylo-2-niskoalkilidenoaminowa lub trójarylome- tylowa np. przez traktowanie wodnym roztworem kwasu nieorganicznego a aminowa grupe zabezpie- 15 czóna przez organiczna grupe sililowa mozna uwol¬ nic np. za pomoca hydrolizy lub alkoholizy.Grupe aminowa, zabezpieczona w postaci grupy azydkowej przeprowadza sie w znany sposób przez redukcje w wolna grupe aminowa, np. poprzez ka- 2° talityczne uwodornienie za pomoca wodoru i kata¬ lizatora stosowanego przy uwodornianiu, np. tlenku platyny, palladu lub niklu Raneya, albo tez za po¬ moca cynku i kwasu, np. octowego. Katalityczne uwodornienie przeprowadza sie korzystnie w obo- 25 jetnym rozpuszczalniku, np. w chlorowcowanym weglowodorze, zwlaszcza w chlorku metylenu, oraz w wodzie, albo w mieszaninie wody i rozpuszczal¬ nika organicznego, np. alkoholu lub dioksanu, w temperaturze 20—25°C albo w temperaturze obni- 30 zonej lub podwyzszonej.N-acylowana grupe niskoalkilosu'lfonyloaminowa przeprowadza sie w grupe R'^sul£onyloaminowa takze znanym sposobem, np. za pomoca solwolizy lub redukcji. W celu odszczepienia tych grup N- » -acylowych mozna stosowac te same metody, które zostaly podane dla odszczepienia grup acylowych, na przyklad 2-chlorowconiskoalkoksykarbpnylowej, acylometoksykarbonylowej, 4-nitrobenzyloksykarbo- nylowej, aTóilometoksykarbonylowej, dwufenylome- *o toksykarbonylowej, Ill-rzed.niskoalkoksykarbonylo- wej, wielocykloalkoksykarbonylowej lub tez arylo- sulfonylowej, z odpowiednich grup acylpaminowych.Sole nowych zwiazków o wzorze 1 mozna wy¬ twarzac znanym sposobem. Mozna wiec tworzyc *' sole np. przez traktowanie zwiazkami metali, np. solami metali alkalicznych z odpowiednimi kwasa¬ mi, np. sola sodowa kwasu a-etylokapronowego, albo przez traktowanie amoniakiem lub odpowied¬ nia amina organiczna, przy czym korzystnie sto- w suje sie ^stechiometryczne ilosci lub jedynie nie¬ wielki nadmiar srodka solotwórczego. Sole addy¬ cyjne z kwasami otrzymuje sie znanym sposobem, np. przez traktowanie kwasem lub odpowiednim odczynnikiem do wymiany anionów. Sole wewnetrz- 55 ne mozna wytworzyc np. przez neutralizacje np. soli addycyjnych z kwasami do punktu izoelek- trycznego np. za pomoca slabych zasad lub przez traktowanie cieklymi wymieniaczami jonowymi.Otrzymane sole mozna w zwykly sposób prze- 60 ksztalcic w wolne zwiazki a wiec sole metali i amo¬ nowe np. przez traktowanie odpowiednimi kwasami a sole addycyjne z kwasami np. przez traktowanie srodkiem zasadowym.W dalszej postaci wykonania sposobu wedlug w 12 wynalazku mozna substancje wyjsciowe stosowac w postaci pochodnych lub wytworzyc je w warun¬ kach reakcji.Korzystnie stosuje sie takie substancje wyjscio¬ we i warunki reakcji dobiera tak, zeby uzyskac zwiazki omówione we wstepie opisu jako szczegól¬ nie korzystne.Nowe zwiazki wytworzone sposobem wedlug wy¬ nalazku, mozna np. uzywac do wytwarzania pre¬ paratów farmaceutycznych zawierajacych skutecz¬ na ilosc substancji czynnej razem lub w mieszani¬ nie z nieorganicznymi lub organicznymi, stalymi lub cieklymi, farmaceutycznie stosowanymi nosni¬ kami i przydatnymi do podawania jelitowego lub pozajelitowego. Tak wiec stosuje sie tabletki lub kapsulki zelatynowe zawierajace substancje czynna wraz z rozcienczalnikami np. laktoza, dekstroza, sa¬ charoza, mannitem, sorbitem, celuloza i/lub glicyna oraz srodkami poslizgowymi np. krzemionka, tal¬ kiem, kwasem stearynowym lub jego solami jak stearynianem magnezu lub stearynianem wapnia i/lub z glikolem polietylenowym.Tabletki zawieraja równiez srodki wiazace np. krzemian glinowomagnezowy, skrobie jak np. skro¬ bie kukurydziana, pszeniczna, ryzowa lub ze strzal¬ ki wodnej, zelatyne, tragant, metyloceluloze, karbo- ksymetyloceluloze sodowa i/lub poliwinylopirolidon i ewentualnie srodki rozsadzajace, np. skrobie, agar, kwas alginowy lub jego sól, jak np. alginian sodo¬ wy, i/lub mieszanki gazujace lub srodki adsorpcyj- ne, barwniki, substancje smakowe i srodki slodzace.Nowe, farmakologicznie czynne zwiazki mozna po¬ nadto stosowac w postaci preparatów dajacych sie wstrzykiwac np. podawanych dozylnie, lub roztwo¬ rów infuzyjnych. Tego rodzaju roztworami sa ko¬ rzystnie izotoniczne roztwory wodne lub zawiesiny pirzy czym te ostatnie mozna wytworzyc przed uzy¬ ciem np. z liofilizowanych preparatów zawieraja¬ cych substancje czynna sama lub wraz z nosnikiem jak np. mannitem.Preparaty farmaceutyczne moga byc wyjalowione i/lub zawierac substancje .pomocnicze jak np. srod¬ ki konserwujace, stabilizujace, zwilzajace i/lub emulgujace, rozpuszczalniki posrednie, sole do re¬ gulowania cisnienia osmotycznego i/lub substancje buforowe. Powyzsze preparaty farmaceutyczne, któ¬ re ewentualnie moga zawierac inne farmakologicz¬ nie cenne substancje wytwarza sie w znany spo¬ sób, np. za pomoca konwencjonalnych metod mie¬ szania, granulowania, drazetkowania, rozpuszcza¬ nia lub liofilizowania. Zawieraja one od 0,lP/# do 100P/t, zwlaszcza od Wt do 50V» substancji czynnej a liofilizaty az do lOP/t substancji czynnej. Dawka jednostkowa dla organizmu stalocieplnego o wadze okolo 70 kg wynosi od 0,1 do 0,7<5 g a dawka dzienna od 0,2 do 1,0 g.W niniejszym opisie, o ile nie zostalo to wyraz¬ nie zaznaczone inaczej, rodniki organiczne okreslo¬ ne jako „nizsze" zawieraja az do 7, korzystnie az do 4 atomów wegla.Podane nizej przyklady objasniaja blizej sposób wedlug wynalazku. W przykladach tych tempera¬ tura podana jest w stopniach Celsjusza.Przyklad I. a) Zawiesine 0,764 g drobno sproszkowanego chlo-13 110 876 14 rowodorku kwasu 7|3^mino-3-metoksy-3^cefemo-4- -karboksylowego (zawierajacego jeden mol dwu- oksanu) w 10 ml absolutnego chlorku metylenu traktuje sie w atmosferze argonu i w temperaturze pokojowej 1,04 ml bis-Ztrójmetylosililo/acetaniidu, dodajac ten ostatni w ciagu 10 minut i nastepnie miesza w ciagu 45 minut.Ochlodzony do temperatury —15°C roztwór 0,806 g kwasu D-2-III-rzed.butoksykarbonyloamino-2-/3-me- tylosulfonyloaminofenylo/-octowego i 0,29 ml 4-me- tylomortfoliny w 10 ml absolutnego chlorku mety¬ lenu traktuje sie w atmosferze argonu 0,34 ml chlo- romr6wczanu izobutylu i pozostawia do przereago- wania w ciagu dodatkowych 15 minut. Do tak otrzymanego bezwodnika mieszanego wkrapla sie w temperaturze —10° wyzej opisana sililowana substancje wyjsciowa i mieszanine reakcyjna mie¬ sza sie kolejno w ciagu 15 minut w temperaturze —10°, 0° i w temperaturze pokojowej. Potem roz¬ ciencza sie za pomoca 100 -ml octanu etylu i prze¬ mywa trzykrotnie nasyconym, wodnym roztworem chlorku sodowego. Fazy wodne ekstrahuje sie po¬ nownie octanem etylu i polaczone roztwory orga¬ niczne suszy nad siarczanem magnezu oraz uwal¬ nia od rozpuszczalnika pod zmniejszonym cisnie¬ niem.Pozostalosc oczyszcza sie na zelu krzemionkowym stosujac jako srodek eluujacy mieszanine 1:1 chlorku metylenu i octanu etylu. Otrzymuje sie jednolity pod wzgledem chromatografii cienkowar¬ stwowej kwas 7P-[D-2-III-rzed.butoksykarbonylo- amino-2-/3-metylo-sulfonyloaminofenylo/-acetylo- amino]-3^metoksy-3^cefemo-4-karboksylowy w for¬ mie bezpostaciowego produktu. Chromatogram cien¬ kowarstwowy (zel krzemionkowy; identyfikacja ninhydryna): Rf~0,63 (uklad: II-rzed.buitanol) kwas octowy (woda 67 :10: 23). WMimo absorpcji w nad¬ fiolecie (w 95% wodnym roztworze etanolu): A.max— 273 nm (£=7100). Widmo absorpcji w podczerwieni (w chlorku metylenu): charakterystyczne pasma w 3380, 2930, 1765, 1685, 1603, 1485 i 1160.Ten sam zwiazek mozna takze otrzymac naste¬ pujaco: b) Zawiesine 6,22 g (27 mmoli) drobno sproszko¬ wanego kwasu 7|3-amino-3-metoksy-3-ce(femo-4- -karboksylowego w 120 ml absolutnego chlorku metylenu traktuje sie w atmosferze argonu i w temperaturze pokojowej 7,52 ml bis-/trójmetylosili- lo/-acetamidu, dodajac go w ciagu okolo 10 minut i nastepnie miesza w ciagu 45 minut. Ochlodzony do temperatury —15° roztwór 10,33 g (30 mmoli) kwasu D-2-III^zed.butoksykarbonyloamino-2-/3- -metylosulfonyloaminofenylo/-octowego i 3*33 ml 4- ^metylomorfoliny w 180 ml absolutnego acetonitry- lu traktuje sie w atmosferze argonu 3,93 ml chloro- mrówczanu izobutylu i pozostawia do przereago- wania w ciagu dodatkowych 25 minut. Do tak otrzymanego bezwodnika mieszanego wkrapla sie w temperaturze —15° wyzej opisana sililowana substancje wyjsciowa i mieszanine reakcyjna mie¬ sza sie w ciagu 2 godzin w temperaturze 0° oraz 30 minut w temperaturze pokojowej.Nastepnie usuwa sie rozpuszczalnik w wyparce rotacyjnej, pozostalosc, traktuje 400 ml octanu ety¬ lu i przemywa trzykrotnie nasyconym wodnym roztworem chlorku sodowego. Fazy wodne ekstra¬ huje sie ponownie octanem etylu. Polaczone roz¬ twory organiczne suszy sie nad siarczanem magne¬ zu i pod zmniejszonym cisnieniem uwalnia od roz- 5 puszczalnika. Pozostalosc oczyszcza sie na zelu krzemionkowym stosujac jako srodek eluujacy mie¬ szanine 1:1 chlorku metylenu i octanu etylu.Otrzymuje sie jednolity pod wzgledem chromato¬ grafii cienkowarstwowej kwas 7ij3-[D-2-III-rzed.-bu- W toksykarbonyloamino-2^/3-metyl'Osulfonyloaminofe- nylo-/acetyloamino]-3-metoksy-3-cefemo-4^karbo- ksylowy w formie bezpostaciowego produktu, któ¬ ry wykrystalizowany z mieszaniny 1:3 chlorku metylenu i eteru etylowego ma temperature top- 15 nienia 140° (rozklad). Dane fizykochemiczne sa identyczne z podanymi w przykladzie la). c) Zawiesine 891 mg kwasu 7-amino-3Hmetoksy- -3-cefemo-4-karboksylowego w 10 ml absolutnego chlorku metylenu traktuje sie 1,23 ml N,0-bis-/trój- 20 metylosililo/-acetamidu i miesza w ciagu 1 godziny w temperaturze 23° (roztwór A).Roztwór 1,58 g kwasu D-2-III^rzed.butoksykar- bonyloamino-2V3-metylosulfonyloaminofenylo/-octo- wego i 0,52 ml N-metylomorfoliny w 20 ml aceto- 25 nitrylu traktuje sie 0,58 ml chloromrówczanu izo¬ butylu w temperaturze od —10 do —15° i miesza w tej temperaturze w ciagu 1/2 godziny (roztwór B).Do ochlodzonego do temperatury —25° roztworu 30 B dodaje sie szybko w atmosferze azotu roztwór A i mieszanine miesza nastepnie w ciagu 1 1/2 go¬ dziny w temperaturze 0°. Wsad miesza sie z 100 ml 1/3-molowego buforu fosforanowego o pH 7 i pod zmniejszonym cisnieniem uwalnia od rozpuszczalni- 35 ka. Pozostaly wodny roztwór przemywa sie octa¬ nem etylu, celem usuniecia czesci obojetnej. Faze wodna pokrywa sie warstwa dalszej ilosci octanu etylu, zakwasza do pH za pomoca 85 PL PL PL PL PL PL PL PL PL