NO341963B1 - Polymorf form av 4-[3-(4-syklopropankarbonyl-piperazin-1-karbonyl)-4-fluorbenzyl]- 2H-ftalazin-1-on - Google Patents

Abstract

4-[3-(4-syklopropankarbonyl-piperazin-1 -karbonyl)-4-fluor-benzyl]-2H-ftalazin-1 -on som krystallinsk form A.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en krystallinsk form av et bestemt ftalazinonderivat, og farmasøytiske sammensetninger og anvendelser av den krystallinske formen.

Pattedyrenzymet PARP (et 113-kDa multidomeneprotein) har blitt implisert i signalisering av DNA-skade gjennom dets evne til å gjenkjenne og raskt binde til DNA enkel- eller dobbelstrengbrytere (D’Amours, et al., Biochem. J., 342, 249-268 (1999)).

Flere observasjoner har ført til konklusjonen at PARP deltar i et antall DNA-relaterte funksjoner som inkluderer genamplifisering, celledeling, differensiering, apoptose, DNA-basert eksisjonsreparering og også effekter på telomerlengde og kromosomstabilitet (d’Adda di Fagagna, et al., Nature Gen., 23(1), 76-80 (1999)).

Studier på mekanismen hvorved PARP modulerer DNA-reparering og andre prosesser har identifisert dets viktighet ved dannelsen av poly (ADP-ribose) kjeder i den cellulære kjernen (Althaus, F.R. and Richter, C., ”ADP-Ribosylation of Proteins: Enzymology and Biological Significance”, Springer-Verlag, Berlin (1987)). Det DNA-bundede, aktiverte PARP anvender NAD for å syntetisere poly (ADP-ribose) på et antall nukleære målproteiner, som inkluderer topoisomerase, histoner og PARP i seg selv (Rhun, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 245, 1-10 (1998)).

Poly (ADP-ribosyl)ering har også blitt assosiert med malignant transformasjon. For eksempel er PARP aktivitet høyere i de isolerte kjernene til SV40-transformerte fibroblaster, mens både leukemiceller og kolonkreftceller viser høyere enzymaktivitet enn de ekvivalente, normale leukocyttene og kolonmucosa (Miwa, et al., Arch.

Biochem. Biophys., 181, 313-321 (1977); Burzio, et al., Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 149, 933-938 (1975); og Hirai, et al., Cancer Res., 43, 3441-3446 (1983)).

Et antall lav-molekylvekt inhibitorer av PARP har blitt anvendt for å avdekke den funksjonelle rollen til poly (ADP-ribosyl)ering i DNA-reparering. I celler behandlet med alkyleringsmidler fører inhibering av PARP til en markert økning i DNA-strengbrudd og celleavlivning (Durkacz, et al., Nature, 283, 593-596 (1980); Berger, N.A., Radiation Research, 101, 4-14 (1985)).

Senere har slike inhibitorer blitt vist å øke effektene av bestrålingsrespons ved å undertrykke reparering av potensiell letal skade (Ben-Hur, et al., British Journal of Cancer, 49 (Suppl. VI), 34-42 (1984); Schlicker, et al., Int. J. Radiat. Bioi., 75, 91-100 (1999)). PARP inhibitorer har blitt rapportert å være effektive i radiosensitiserende, hypoksiske tumorceller (US 5,032,617; US 5,215,738 og US 5,041,653).

Videre fremviser PARP utslags (PARP -/-) dyr genomisk instabilitet som respons på alkyleringsmidler og γ-stråling (Wang, et al., Genes Dev., 9, 509-520 (1995); Menissier de Murcia, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7303-7307 (1997)).

En rolle for PARP har også blitt demonstrert i visse vaskulære sykdommer, septisk sjokk, ischemisk skade og neurotoksisitet (Cantoni, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1014, 1-7 (1989); Szabo, et al., J. Clin. Invest., 100, 723-735 (1997)). Oksygenradikal DNA-skade som fører til strengbrudd i DNA, som etterfølgende gjenkjennes av PARP, er en hovedbidragsytende faktor til slike sykdomstilstander som vist ved PARP inhibitorstudier (Cosi, et al., J. Neurosci. Res., 39, 38-46 (1994); Said, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 4688-4692 (1996)). Mer nylig har PARP vist seg å spille en rolle i patogenesen til blødningssjokk (Liaudet, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(3), 10203-10208 (2000)).

Det har også blitt demonstrert at effektiv retroviral infeksjon til pattedyrceller blokkeres ved inhibering av PARP aktivitet. Slik inhibering av rekombinante retrovirale vektorinfeksjoner har vist seg å forekomme i flere forskjellige celletyper (Gaken, et al., J. Virology, 70(6), 3992-4000 (1996)). Inhibitorer av PARP har således blitt utviklet for anvendelse i antivirale behandlinger og i kreftbehandling (WO 91/18591).

Videre har det blitt spekulert i om PARP inhibering forsinker utbruddet av aldringskarakteristikker i humane fibroblaster (Rattan and Clark, Biochem. Biophys. Res. Comm., 201(2), 665-672 (1994)). Dette kan være relatert til rollen som PARP spiller når det gjelder å kontrollere telomerfunksjon (d'Adda di Fagagna, et al., Nature Gen., 23(1), 76-80 (1999)).

WO 2004/080976 beskriver et antall ftalazinonderivater, deres aktivitet når det gjelder å inhibere PARP, og som en konsekvens, deres anvendelse ved behandling av kreft, om det er ledsagende til strålebehandling eller kjemoterapi, eller som et middel stående alene.

WO 2005/053662 beskriver anvendelsen av PARP inhibitorer, særlig ftalazinonderivater, som base eksisjonsreparerings (BER) inhibitorer. Anvendelsen av disse inhibitorene ved fremstilling av medikamenter for behandling av kreft som er defisient i “Homologous Recombination” (HR) avhengig DNA DSB repareringsaktivitet, særlig for kreftformer som har en BRCA1- og/eller en BRCA2 defisient fenotype, er beskrevet.

Caira, M. R., Topics in Current Chemistry, vol.198, side 164-165, Springer Verlag Berlin Heidelberg 1998, beskriver krystallisk polymorfisme i organiske forbindelser.

4-[3-(4-syklopropankarbonyl-piperazin-1-karbonyl)-4-fluor-benzyl]-2H-ftalazin-1-on (forbindelse A) beskrevet i WO 2004/080976:

er av særlig interesse.

I WO 2004/080976 ble forbindelse A syntetisert som én av et antall bibliotekforbindelser fra 4-[4-fluor-3-(piperazin-1-karbonyl)-benzyl]-2H-ftalazin-1-on (forbindelse B):

ved tilsetting av syklopropankarbonylklorid:

til en løsning av (B) i diklormetan, fulgt av Hünig’s base (N,N-diisopropyletylamin). Denne reaksjonen utføres med røring ved romtemperatur i 16 timer, og den resulterende forbindelsen renses med preparativ HPLC.

Særlige former av forbindelse A kan ha fordelaktige egenskaper, feks. med hensyn til deres løselighet og/eller deres stabilitet og/eller deres biotilgjengelighet og/eller deres urenhetsprofil og/eller deres filtreringskarakteristikker og/eller deres tørkekarakteristikker og/eller deres mangel på hygroskopisitet og/eller de kan være enklere å håndtere og/eller mikronisere og/eller bli dannet til tabletter. Det er også ønskelig å ha en forbedret fremgangsmåte for syntese som er egnet for syntese av forbindelse A på en multi-gramsskala.

Følgelig tilveiebringer et første aspekt ifølge oppfinnelsen 4-[3-(4-syklopropankarbonyl-piperazin-1-karbonyl)-4-fluor-benzyl]-2H-ftalazin-1-on (forbindelse A) som krystallinsk form A, der forbindelsen har de følgende karakteristiske topper i et pulver røntgendiffraksjonsmønter (λ=1,5418Å):

Forbindelse A som krystallinsk form A kan også ha følgende ytterligere topper med røntgendiffraksjonsmønster (λ=1,5418Å):

Forbindelse A som krystallinsk form A kan også karakteriseres ved en hvilken som helst kombinasjon av tre eller flere topper valgt fra listen av 10 topper ovenfor.

Et representativt pulver XRD-mønster av forbindelse A som form A er vist i figur 3.

Uten ønske om å være bundet av noen teori, er forbindelse A i stand til lett å danne en struktur hvori løsemiddelmolekyler kan okkupere posisjoner i krystallgitteret. Slike solvater, ikke nødvendigvis støkiometriske av type, kan bestå av et rent solvat (feks. forbindelse A metanolat og forbindelse A tetrahydrofuranat) eller kan potensielt bestå av mer enn én løsemiddelkomponent (feks. metanol og dietyleter).

Løsemiddelmolekylene ligger typisk i lommer dannet av forbindelse A molekylene. I visse tilfeller er volumet til disse lommene tilstrekkelig fleksibelt til å inkorporere et antall løsemidler, som resulterer i liten forandring i den totale strukturen av materialet, og således kun små skift i XRPD refleksjonene.

Solvater, som inkluderer de som deler den samme totale strukturen, oppstår fra løsningsmodnings- og krystalliseringseksperimenter fra diklormetan, etylacetat, metanol, etanol, isopropanol, 2-butanon, t-butylmetyleter, toluen, tetrahydrofuran, vann, sykloheksan, syklopropylmetylketon, 1,2 dikloretan, etyltrifluoracetat, fluorbenzenheksafluor-iso-propanol, metylnonafluorbutyleter, 2-metyl-1-propanol, nitrometan, propionitril, trikloretylen, α α α-trifluortoluen, heptan, dioksan, acetonitril, enten som rene løsemidler eller kombinert med et annet løsemiddel.

Røntgendiffraksjonsmønsteret til den mest vanlige solvatstrukturen er vist i figur 4 og inneholder typisk de mest intense toppene ved posisjoner listet nedenfor:

Det vil være å forstå at de relative intensitetene til toppene vist i figurene kan variere i henhold til orienteringen av prøven som testes og typen og innstillingen av instrumentet som anvendes, slik at intensitetene i XRD-diagrammene inkludert heri er illustrative og er ikke tiltenkt å bli anvendt for absolutt sammenligning.

Form A av forbindelse A er i det vesentlige uten løsemiddel. Begrepet ”i det vesentlige uten løsemiddel” slik det anvendes heri, refererer til formen som kun har ikkesignifikante mengder av et hvilket som helst løsemiddel, feks. en form med totalt 0,5 vekt-% eller mindre av et hvilket som helst løsemiddel. Totalmengden av hvilket som helst løsemiddel, som inkluderer vann, kan være 0,25%, 0,1%, 0,05% eller 0,025% i forhold til vekt eller mindre.

Form A av forbindelse A kan også karakteriseres ved anvendelse av DSC. Form A av forbindelse A når den varmes opp fra 25°C til 325°C ved 10°C pr. minutt, vil begynne smelting ved 210,1°C ±1°C. Et representativt DSC-diagram for forbindelse A som form A er vist i figur 5.

Det andre aspektet ifølge oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å oppnå 4-[3-(4-syklopropankarbonyl-piperazin-1-karbonyl)-4-fluor-benzyl]-2H-ftalazin-1-on (forbindelse A) som krystallinsk form A, som innbefatter krystallisering av forbindelse A i et løsemiddel og deretter å erstatte løsemiddelet fra den krystallinske formen med et erstatningsmiddel. Erstatningsmiddelet kan være vann eller en blanding av en C1-2alkohol og vann.

I en første utførelsesform innbefatter denne fremgangsmåten trinnene med å:

(i) krystallisere 4-[3-(4-syklopropankarbonyl-piperazin-1-karbonyl)-4-fluor-benzyl]-2H-ftalazin-1-on (forbindelse A) fra et løsemiddel;

(ii) hvis det opprinnelige løsemiddelet ikke er etanol, behandle den krystallinske forbindelsen A med etanol;

(iii) behandle den krystallinske forbindelsen A med vann for å fjerne fanget etanol; (iv) tørke det resulterende produktet.

Løsemiddelet som anvendes i den opprinnelige krystalliseringen kan feks. være diklormetan eller acetonitril.

Fremgangsmåtene for å oppnå form A kan generelt involvere løsemiddelerstatning. Det har blitt funnet at forbindelse A krystalliserer på en slik måte at kanaler i krystallgitteret dannes som kan fange løsemidler, som således gjør dem vanskelig å fjerne.

Fremgangsmåten i den første utførelsesformen kan anvendes særlig hvis løsemiddelet anvendt i krystalliseringen av forbindelse A er diklormetan. Trinnet med å bytte ut diklormetan som et løsemiddel med etanol som et løsemiddel, kan utføres ved å destillere løsningen av forbindelse A ved atmosfæretrykk under nærvær av etanol. Utbyttingen er fullstendig når hodetemperaturen nærmer seg kokepunktet til etanol, feks. minst 73°C. Særlig kan utbyttingen utføres ved å destillere ut hovedandelen DCM og deretter tilsette et volum etanol. Destillasjonen fortsetter deretter med å erstatte destillatbatcher med like volumer etanol.

Krystallisering av forbindelse A fra etanol løsemiddelet kan utføres ved avkjøling av løsningen til under 15°C, foretrukket mindre enn 10°C og mer foretrukket ca.8°C. Krystallene av forbindelse A kan deretter fjernes fra løsningen ved filtrering.

Den krystallinske forbindelsen A kan behandles med vann for å fjerne fanget etanol ved å suspendere det krystallinske materialet i vann og varme opp ved refluks i en tilstrekkelig tidsperiode, feks. minst tre timer, og foretrukket ca.4 timer. Den krystallinske forbindelsen A kan fjernes fra suspensjonen i vann ved filtrering.

Tørking av det resulterende produktet i trinnet ovenfor blir lett oppnådd. For eksempel ved å varme opp produktet i en ovn ved en temperatur på minst 60°C, foretrukket ved ca. 70°C.

I en annen slik utførelsesform innbefatter fremgangsmåten trinnene med å:

(i) krystallisere forbindelse A fra et løsemiddel;

(ii) hvis det opprinnelige løsemiddelet som anvendes i syntesen av forbindelse A i den krystallinske formen ikke er en blanding av vann og en C1-2alkohol (dvs. metanol, etanol), behandle forbindelse A i den krystallinske formen med en blanding av vann og en C1-2alkohol;

(iii) destillere blandingen ved omgivelsestrykk; og

(iv) tørke det resulterende produktet.

Det resulterende produktet kan ytterligere behandles med en blanding av vann og en C1-

2alkohol, og tørkes for ytterligere å isolere forbindelse A i en krystallinsk form A.

Blandingen av vann og C1-2alkohol er foretrukket i området 2:1 til 1:2 i forhold til volum, og mer foretrukket 1,5:1 til 1:1,5 i forhold til volum. En særlig foretrukket blanding er 1 del vann til 1,2 deler C1-2alkohol. En annen særlig foretrukket blanding er 2 deler vann til 1 del C1-2alkohol. C1-2alkoholen er foretrukket etanol.

Løsemiddelbehandlingen i trinn (ii) kan utføres ved å suspendere forbindelse A i blandingen av vann og C1-2alkohol og varme opp til refluks med røring. Dette kan følges av avkjøling til mellom 55 og 65°C og filtrering, feks. gjennom en celittpute. Filterputen kan vaskes med en blanding av vann og C1-2alkohol før trinn (iii) med destillasjon ved omgivelsestrykk (vanligvis 1 atm). Destillasjonen kan stoppes for å gi en suspensjon som blir værende ved romtemperatur før etterfølgende filtrering. Den resulterende filterkaken kan vaskes med vann.

Tørking av det resulterende produktet i trinnet ovenfor blir lett oppnådd. For eksempel ved oppvarming av produktet i en ovn ved en temperatur på minst 50°C, foretrukket ved ca. 60°C.

Den ytterligere behandlingen kan skje på tilsvarende måte som beskrevet ovenfor.

I en tredje utførelsesform innbefatter fremgangsmåten:

(i) suspendere forbindelse A i en blanding av vann og en C1-2alkohol som løsemiddelet; (ii) varme opp suspensjonen til refluks;

(iii) avkjøle løsningen og så med forbindelse A som form A;

(iv) tørke det resulterende produktet.

Det resulterende produktet kan ytterligere behandles med en blanding av vann og en C1-

2alkohol og tørkes, for ytterligere å isolere forbindelse A i en krystallinsk form A.

Blandingen av vann og C1-2alkohol er foretrukket i området 2:1 til 1:5 i forhold til volum, og mer foretrukket 1:2 til 1:4 i forhold til volum. En særlig foretrukket blanding er 1 del vann til 3 deler C1-2alkohol. C1-2alkoholen er foretrukket etanol.

Trinn (iii) kan innbefatte avkjøling av løsningen til mellom 65 og 75°C (feks. 70°C) og filtrering, feks. gjennom en celittpute. Filterputen kan vaskes med en blanding av vann og C1-2alkohol før destillasjon (feks. ved omgivelsestrykk eller høyere). Såing kan forekomme etter at det resulterende filtratet har blitt avkjølt til mellom 40 og 50°C (feks. 45°C). Den resulterende suspensjonen kan avkjøles til omgivelsestemperatur (feks. 20°C) i løpet av mellom 2 og 3 timer (feks. 2,5 timer) og opprettholde nevnte temperatur lenge nok til å etablere krystallisering. Dette kan være mellom 12 og 24 timer og kan være ca.16 timer. Ved slutten av denne perioden kan ytterligere vann tilsettes. Mengden kan være ca. lik volumet av totalt løsemiddel (vann og C1-2alkohol) tilstede og kan tilsettes sakte, feks. i løpet av en periode på 4 til 6 (feks.5) timer.

Suspensjonen kan holdes ved omgivelsestemperatur etter vanntilsettingen, feks. i 2 timer.

Suspensjonen kan deretter filtreres, og den resulterende filterkaken kan vaskes med en blanding av C1-2alkohol og vann (i et forhold på mellom 1:3 og 1:2, feks.1:2,3).

Tørking av det resulterende produktet fra trinnet ovenfor blir lett oppnådd. For eksempel ved oppvarming av produktet i en ovn under vakuum ved en temperatur på mellom 40 og 60°C.

Et tredje aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer en farmasøytisk sammensetning som innbefatter en forbindelse ifølge det første aspektet og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

Et fjerde aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer en forbindelse ifølge det første aspektet for anvendelse i en fremgangsmåte for behandling av menneske- eller dyrekroppen.

Ytterligere aspekter ifølge oppfinnelsen tilveiebringer anvendelsen av en forbindelse slik det er definert i det første aspektet ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av: vaskulær sykdom; septisk sjokk, ischemisk skade; neurotoksisitet; blødningssjokk, viral infeksjon eller sykdommer som lindres ved inhibering av aktiviteten til PARP.

Et annet ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer anvendelsen av en forbindelse slik det er definert i det første aspektet ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for anvendelse som et ledsagende middel ved kreftbehandling eller for å potensiere tumorceller for behandling med ioniserende stråling eller kjemoterapeutiske midler.

I ytterligere aspekter av foreliggende oppfinnelse kan forbindelsen anvendes for fremstilling av et medikament for behandling av kreft som er defisient i “Homologous Recombination” (HR)-avhengig DNA DSB repareringsaktivitet, som innbefatter administrering til nevnte pasient av en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen.

Den HR-avhengige DNA DSB repareringsreaksjonsveien reparerer dobbelstrengede brudd (DSBer) i DNA via homologe mekanismer for å omdanne en kontinuerlig DNA-helix (K.K. Khanna and S.P. Jackson, Nat. Genet. 27(3): 247-254 (2001)).

Komponentene i den HR-avhengige DNA DSB repareringsreaksjonsveien inkluderer, men er ikke begrenset til, ATM (NM_000051), RAD51 (NM_002875), RAD51L1 (NM_002877), RAD51C (NM_002876), RAD51L3 (NM_002878), DMC1 (NM_007068), XRCC2 (NM_005431), XRCC3 (NM_005432), RAD52 (NM_002879), RAD54L (NM_003579), RAD54B (NM_012415), BRCA1 (NM_007295), BRCA2 (NM_000059), RAD50 (NM_005732), MRE11A (NM_005590) og NBS1 (NM_002485). Andre proteiner involvert i den HR-avhengige DNA DSB repareringsreaksjonsveien inkluderer reguleringsfaktorer, slik som EMSY (Hughes-Davies, et al., Cell, 115, s.523-535). HR-komponenter er også beskrevet i Wood, et al., Science, 291, 1284-1289 (2001).

En kreftform som er defisient i HR-avhengig DNA DSB reparering kan innbefatte eller bestå av én eller flere kreftceller som har en redusert eller abrogert evne til å reparere DNA DSBer gjennom den reaksjonsveien, relativ til normale celler, dvs. aktiviteten til den HR-avhengige DNA DSB repareringsreaksjonsveien kan være redusert eller opphevet i kreftcellene.

Aktiviteten til én eller flere komponenter av den HR-avhengige DNA DSB repareringsreaksjonsveien kan oppheves i én eller flere kreftceller hos et individ med en kreftform som er defisient i HR-avhengig DNA DSB reparering. Komponenter av den HR-avhengige DNA DSB repareringsreaksjonsveien er godt karakterisert i litteraturen (se feks. Wood, et al., Science, 291, 1284-1289 (2001)) og inkluderer de komponentene som er listet ovenfor.

I noen foretrukne utførelsesformer kan kreftcellene ha en BRCA1- og/eller en BRCA2 defisient fenotype, dvs. BRCA1- og/eller BRCA2 aktivitet er redusert eller opphevet i kreftcellene. Kreftceller med denne fenotypen kan være defisiente i BRCA1 og/eller BRCA2, dvs. ekspresjon og/eller aktivitet av BRCA1 og/eller BRCA2 kan være redusert eller opphevet i kreftcellene, feks. ved hjelp av mutasjon eller polymorfisme i den kodende nukleinsyren, eller ved hjelp av amplifisering, mutasjon eller polymorfisme i et gen som koder en reguleringsfaktor, feks. EMSY-genet, som koder en BRCA2 reguleringsfaktor (Hughes-Davies, et al., Cell, 115, 523-535).

BRCA1 og BRCA2 er kjente tumorsuppressorer, hvis villtype alleler ofte er tapt i tumorer til heterozygote bærere (Jasin M., Oncogene, 21(58), 8981-93 (2002); Tutt, et al., Trends Mol Med., 8(12), 571-6, (2002)). Assosiasjonen mellom BRCA1 og/eller BRCA2 mutasjoner og brystkreft er godt karakterisert i litteraturen (Radice, P.J., Exp Clin Cancer Res., 21(3 Suppl), 9-12 (2002)). Amplifisering av EMSY-genet, som koder en BRCA2 bindingsfaktor, er også kjent for å være assosiert med bryst- og eggstokkreft.

Bærere av mutasjoner i BRCA1 og/eller BRCA2 utgjør også hevet risiko for kreft i eggstokk, prostata og bukspyttkjertel.

I noen foretrukne utførelsesformer er individet heterozygot for én eller flere varianter, slik som mutasjoner og polymorfismer, i BRCA1 og/eller BRCA2 eller en regulator derav. Deteksjon av variasjon i BRCA1 og BRCA2 er godt kjent i litteraturen og er feks. beskrevet i EP 699754, EP 705903, Neuhausen, S.L. and Ostrander, E.A., Genet. Test, 1, 75-83 (1992); Chappnis, P.O. and Foulkes, W.D., Cancer Treat Res, 107, 29-59 (2002); Janatova M., et al., Neoplasma, 50(4), 246-50 (2003); Jancarkova, N., Ceska Gynekol., 68(1), 11-6 (2003). Bestemmelse av amplifisering av BRCA2 bindingsfaktoren EMSY er beskrevet i Hughes-Davies, et al., Cell, 115, 523-535.

Mutasjoner og polymorfismer assosiert med kreft kan detekteres ved nukleinsyrenivået ved å detektere tilstedeværelsen av en variant nukleinsyresekvens eller ved proteinnivået ved å detektere tilstedeværelsen av en variant (dvs. en mutant eller allelisk variant) polypeptid.

Figur 1 viser NMR av forbindelse A etter vannbehandling (eksempel 1);

Figur 2 viser pulver XRD-mønster av forbindelse A som form A etter vannbehandling (eksempel 1);

Figur 3 viser et representativt pulver XRD-mønster av forbindelse A som form A;

Figur 4 viser et representativt pulver XRD-mønster av forbindelse A som solvatisert form;

Figur 5 viser et representativt DSC-diagram av forbindelse A som form A oppnådd ved oppvarming fra 25°C til 325°C ved 10°C pr. minutt.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbindelse A som form A som en aktiv forbindelse, spesifikt aktiv i å inhibere aktiviteten til PARP.

Begrepet ”aktiv” slik det anvendes heri angir forbindelsen som er i stand til å inhibere PARP aktivitet. En undersøkelse som hensiktsmessig kan anvendes for å bestemme PARP inhiberingen som utøves av forbindelsen er beskrevet i eksemplene nedenfor.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å inhibere aktiviteten til PARP i en celle, som innbefatter å bringe nevnte celle i kontakt med en effektiv mengde av den aktive forbindelsen, foretrukket i form av en farmasøytisk akseptabel sammensetning. En slik fremgangsmåte kan praktiseres in vitro.

For eksempel kan en celleprøve dyrkes in vitro og den aktive forbindelsen bringes i kontakt med nevnte celler, og effekten av forbindelsen på disse cellene observeres. Som eksempler på “effekt” kan mengden av DNA reparering oppnådd i en bestemt tidsperiode bestemmes. Der den aktive forbindelsen er funnet å fremvise en innflytelse på cellene, kan dette anvendes som en prognostisk eller diagnostisk markør for effektiviteten til forbindelsen i fremgangsmåter for behandling av en pasient som bærer celler av den samme cellulære typen.

Begrepet “behandling” slik det anvendes heri i sammenheng med behandling av en tilstand, omfatter generelt behandling og terapi, om det er et menneske eller et dyr (dvs. i veterinære applikasjoner), hvori en ønsket terapeutisk effekt oppnås, feks. inhiberingen av fremskritt av tilstanden, og inkluderer en reduksjon i progresjonshastigheten, en stopp i progresjonshastigheten, lindring av tilstanden og helbreding av tilstanden.

Behandling som et profylaktisk tiltak (dvs. profylakse) er også inkludert.

Begrepet “ledsagende” slik det anvendes heri angår anvendelsen av den aktive forbindelsen i forbindelse med kjente, terapeutiske metoder. Slike metoder inkluderer cytotoksiske regimer av legemidler og/eller ioniserende stråling slik det anvendes ved behandling av forskjellige krefttyper. Særlig er de aktive forbindelsene kjent for å potensiere virkningene til et antall kreft-kjemoterapibehandlinger, som inkluderer topoisomeraseklassen av gift (feks. topotecan, irinotecan, rubitecan), de fleste av de kjente alkyleringsmidlene (feks. DTIC, temozolamid) og platinabaserte legemidler (feks. karboplatin, cisplatin) anvendt ved kreftbehandling.

Den aktive forbindelsen kan også anvendes som cellekulturadditiver for å inhibere PARP, for eksempel for å sensitisere celler overfor kjente kjemoterapeutiske midler eller ioniserende strålingsbehandlinger in vitro.

Den aktive forbindelsen kan også anvendes som del av en in vitro undersøkelse, for eksempel for å bestemme om en kandidatvert trolig ville ha fordel av behandling med forbindelsen det gjelder.

Den aktive forbindelsen eller den farmasøytiske sammensetningen som innbefatter den aktive forbindelsen kan administreres til et subjekt ved en hvilken som helst passende administrasjonsrute, om den er systemisk/perifer eller ved setet for ønsket virkning, som inkluderer, men er ikke begrenset til, oral (feks. ved inntak gjennom munnen); topisk (som inkluderer feks. transdermal, intranasal, okulær, bukkal og sublingual); pulmonær (feks. ved inhalasjon eller insufflasjonsbehandling ved anvendelse feks. av en aerosol, feks. gjennom munn eller nese); rektal; vaginal; parenteral, feks. ved injeksjon, som inkluderer subkutan, intradermal, intramuskulær, intravenøs, intraarteriell, intrakardisk, intratekal, intraspinal, intrakapsulær, subkapsulær, intraorbital, intraperitoneal, intratrakeal, subkutikulær, intraartikulær, subaraknoid og intrasternal; ved implantering av et depot, feks. subkutant eller intramuskulært.

Subjektet kan være en eukaryot, et dyr, et vertebratdyr, et pattedyr, en gnager (feks. et marsvin, en hamster, en rotte, en mus), et musedyr (feks. en mus), et hundedyr (feks. en hund), et kattedyr (feks. en katt), et hestedyr (feks. en hest), et primat, et apedyr (feks. en ape), en ape (feks. marmoset, bavian), en ape (feks. gorilla, sjimpanse, orangutang, gibbon) eller et menneske.

Mens det er mulig for den aktive forbindelsen å bli administrert alene, er det foretrukket å presentere den som en farmasøytiske sammensetning (feks. formulering), som innbefatter den aktive forbindelsen som definert ovenfor, sammen med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere, adjuvanser, eksipienter, fortynningsmidler, fyllstoffer, buffere, stabilisatorer, konserveringsmidler, smøremidler eller andre materialer godt kjente for fagmannen, og eventuelt andre terapeutiske eller profylaktiske midler.

Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse ytterligere farmasøytiske sammensetninger, som definert ovenfor, og fremgangsmåter for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, som innbefatter sammenblanding av den aktive forbindelsen, som definert ovenfor, med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere, eksipienter, buffere, adjuvanser, stabilisatorer eller andre materialer, slik det er beskrevet heri, slik at den aktive forbindelsen holdes som krystallinsk form A.

Begrepet “farmasøytisk akseptabel” slik det anvendes heri omfatter forbindelser, materialer, sammensetninger og/eller doseringsformer som er, innenfor rimelig medisinsk vurdering, egnet for anvendelse i kontakt med vev til et subjekt (feks. menneske) uten urimelig toksisitet, irritasjon, allergisk respons eller annet problem eller komplikasjon, med hensyn til et rimelig fordel/risikoforhold. Hver bærer, eksipient etc. må også være “akseptabel” i betydningen å være kompatibel med de andre ingrediensene i formuleringen.

Egnede bærere, fortynningsmidler, eksipienter etc. kan finnes i standard farmasøytiske lærebøker. Se feks. “Handbook of Pharmaceutical Additives”, 2. utgave (red. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA), “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 20. utgave, pub. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; og “Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 2. utgave, 1994.

Formuleringene kan hensiktsmessig fremstilles i enhetsdoseringsform og kan fremstilles ved en hvilken som helst fremgangsmåte kjent i litteraturen for farmasi. Slike fremgangsmåter inkluderer trinnet med å bringe i assosiasjon den aktive forbindelsen med bæreren som utgjør én eller flere hjelpeingredienser. Generelt blir formuleringene fremstilt ved enhetlig og inngående å bringe i assosiasjon den aktive forbindelsen med flytende bærere eller fint oppdelte, faste bærere eller begge, og deretter hvis nødvendig, forme produktet.

Formuleringer kan være i form av suspensjoner, tabletter, granuler, pulver, kapsler, cacheter, piller eller pastaer.

Formuleringer egnet for oral administrasjon (feks. ved inntak gjennom munnen) kan presenteres som atskilte enheter, slik som kapsler, cacheter eller tabletter, som hver inneholder en forhåndsbestemt mengde av den aktive forbindelse; som et pulver eller granuler; som en suspensjon i en vandig eller ikke-vandig væske, eller som en pasta.

En tablett kan fremstilles ved vanlige fremgangsmåter, feks. sammenpressing eller støping, eventuelt med én eller flere hjelpeingredienser. Sammenpressede tabletter kan fremstilles ved å sammenpresse i en passende maskin den aktive forbindelsen i en frittflytende form, slik som et pulver eller granuler, eventuelt blandet med ett eller flere bindemidler (feks. povidon, gelatin, cacia, sorbitol, tragakant, hydroksypropylmetylcellulose); fyllstoffer eller fortynningsmidler (feks. laktose, mikrokrystallinsk cellulose, kalsiumhydrogenfosfat); smøremidler (feks.

magnesiumstearat, talkum, silika); desintegreringsmidler (feks. natriumstivelseglykolat, tverrbundet povidon, tverrbundet natriumkarboksymetylcellulose); overflateaktive- eller dispergerings- eller fuktemidler (feks. natriumlaurylsulfat) og konserveringsmidler (feks. metyl p-hydroksybenzoat, propyl p-hydroksybenzoat, sorbinsyre). Støpte tabletter kan fremstilles ved å støpe i en passende maskin en blanding av den pulveriserte forbindelsen fuktighetstilsatt med et inert flytende fortynningsmiddel. Tablettene kan eventuelt være belagt eller utstyrt med delestrek og kan formuleres for å tilveiebringe sakte eller kontrollert frigivelse av den aktive forbindelsen deri, feks. ved anvendelse av hydroksypropylmetylcellulose i forskjellige andeler for å tilveiebringe den ønskede frigivelsesprofilen. Tabletter kan eventuelt bli tilveiebrakt med et enterisk belegg for å tilveiebringe frigivelse i en del av tarmen utenfor maven.

En kapsel kan inkludere den aktive forbindelsen i suspensjon.

Formuleringer egnet for topisk administrasjon (feks. transdermal, intranasal, okulær, bukkal og sublingual) kan formuleres som en pasta.

Formuleringer egnet for topisk administrasjon til øyet inkluderer også øyedråper hvori den aktive forbindelsen er suspendert i en passende bærer, særlig et vandig løsemiddel for den aktive forbindelsen.

Formuleringer egnet for nasal administrasjon, hvori bæreren er et fast stoff, inkluderer et grovt pulver som har en partikkelstørrelse feks. i området ca.20 til ca.500 mikron, som administreres på en måte hvori et sniff tas, dvs. ved rask inhalering gjennom den nasale passasjen fra en beholder av pulveret holdt nært opp til nesen.

Formuleringer egnet for administrasjon ved inhalasjon inkluderer de som er tilstede som en aerosolspray fra en trykksatt beholder, med anvendelse av et passende drivemiddel, slik som diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan, karbondioksid eller andre egnede gasser.

Det vil være å forstå at passende doseringer av den aktive forbindelsen og sammensetningene som innbefatter den aktive forbindelsen, kan variere fra pasient til pasient. Bestemmelse av optimal dosering vil generelt involvere balansering av nivået av terapeutisk effekt mot eventuell risiko eller uheldige bivirkninger ved behandlingene ifølge oppfinnelsen. Det valgte doseringsnivået vil avhenge av et antall faktorer som inkluderer, men er ikke begrenset til, aktiviteten til den bestemte forbindelsen, administrasjonsruten, administrasjonstiden, ekskresjonshastigheten av forbindelsen, varigheten av behandlingen, andre legemidler, forbindelser og/eller materialer anvendt i kombinasjon, alderen, kjønnet, vekten, tilstanden, den generelle helsen og den tidligere medisinske historien til pasienten. Mengden forbindelse og administrasjonsrute vil til slutt bestemmes av ansvarlig lege, selv om doseringen generelt vil gi lokale konsentrasjoner ved virkningssetet som gir den ønskede effekten uten å forårsake vesentlig skadelige eller uheldige bivirkninger.

Administrasjon in vivo kan utføres i én dose, kontinuerlig eller periodevis (feks. i oppdelte doser ved passende intervaller) i løpet av behandlingsforløpet.

Fremgangsmåter for å bestemme den mest effektive doseringsmåten og doseringen er godt kjent for fagmannen og vil variere med formuleringen som anvendes for behandling, formålet med behandlingen, målcellen som behandles og subjektet som behandles. Enkle og multiple administrasjoner kan utføres med doseringsnivået og forløpet valgt av ansvarlig lege.

Generelt er en passende dose av den aktive forbindelsen i området fra ca.10 mg til ca.

600 mg pr. m<2>kroppsarealvekt til subjektet pr. dag.

EKSEMPLER

Eksempel 1: Syntese av forbindelse A

Utgangsmaterialet (D) ble syntetisert ved fremgangsmåten beskrevet i WO 2004/080976.

Fremgangsmåter

Preparativ HPLC

Prøver ble renset med et Waters masse-rettet rensesystem ved anvendelse av en Water 600 LC pumpe, Waters Xterra C18 kolonne (5 µm 19 mm x 50 mm) og Micromass ZQ massespektrometer, som ble operert i positiv ioneelektrospray ionisasjonsmodus.

Mobilfaser A (0,1% maursyre i vann) og B (0,1% maursyre i acetonitril) ble anvendt i en gradient; 5% B til 100% i løpet av 7 minutter, oppholdt i 3 minutter, ved en strømningshastighet på 20 ml/min.

Analytisk HPLC-MS

Analytisk HPLC ble utført med en Spectra System P4000 pumpe og Jones Genesis C18 kolonne (4 µm, 50 mm x 4,6 mm). Mobilfaser A (0,1% maursyre i vann) og B (acetonitril) ble anvendt i en gradient av 5% B i 1 minutt, som ble hevet til 98% B etter 5 minutter, oppholdt i 3 minutter ved en strømningshastighet på 2 ml/min. Deteksjon var med en TSP UV 6000LP detektor ved 254 nm UV og område 210-600 nm PDA. Massespektrometeret var en Finnigan LCQ, som ble operert i positiv ioneelektrospray modus.

NMR

<1>H NMR spektra ble avlest ved anvendelse av et Bruker DPX 300 spektrometer ved 300 MHz. Kjemiske skift ble rapportert i deler pr. million (ppm) på δ skalaen relativ til tetrametylsilan indre standard. Med mindre annet var angitt, ble alle prøvene løst i DMSO-d6.

(a) 4-[2-fluor-5-(4-okso-3,4-dihydro-ftalazin-1-ylmetyl)-benzoyl]-piperazin-1-karboksylsyre tert-butylester (C)

Til en rørt løsning av utgangsmaterialet D (850 g) i dimetylacetamid (DMA) (3.561 ml) ble det ved romtemperatur under nitrogen tilsatt HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluroniumheksafluorfosfat) (1.402 g) i én porsjon. Hünig's base (iPr2NEt, 1.096 ml) ble tilsatt, og temperaturen ble holdt mellom 15 og 25°C, fulgt av en løsning av 1-Boc-piperazin (637 g) i DMA (1.428 ml), mens temperaturen ble holdt mellom 15 og 25°C.

Løsningen ble rørt ved romtemperatur i 2 timer, og prøver ble tatt for fullstendig reaksjon (HPLC). Etter fullstendig reaksjon ble løsningen tilsatt til et kraftig rørt vann (17.085 ml), mens temperaturen ble holdt mellom 15 og 25°C og det faste stoffet filtrert fra, vasket med vann (2 x 7.131 ml), heksan (2 x 7.131 ml) og metyl tertbutyleter (MTBE) (2 x 3.561 ml). Det faste stoffet ble deretter tørket over natten og deretter tatt prøver av for vanninnhold og kjemisk renhet.

Denne reaksjonen ble gjentatt, se tabell:

a. Større enn 100% utbytte som skyldes ikke-representativ prøvetaking.

(b) 4-[4-fluor-3-(piperazin-1-karbonyl)-benzyl]-2H-ftalazin-1-on (B)

Til en rørt løsning av industrielt metylert sprit (IMS) (2.200 ml) og konsentrert HCl (4.400 ml) ble det tilsatt forbindelse C (2.780,2 g) i porsjoner ved romtemperatur under nitrogen, og skummingen ble kontrollert ved tilsettingshastigheten. Løsningen ble deretter rørt ved 15 til 25°C i 30 minutter og tatt prøver av for fullstendig reaksjon (HPLC).

Etter fullstendig reaksjon ble løsningen fordampet for å fjerne eventuell IMS og vannfasen ekstrahert med CH2Cl2(2 x 3.500 ml) før pH ble justert til >8 ved anvendelse av konsentrert ammoniakk. Den resulterende slurry ble deretter fortynnet med vann (10.000 ml) og ekstrahert med CH2Cl2(4 x 3.500 ml), vasket med vann (2 x 2.000 ml), tørket over MgSO4(250 g) og fordampet. Det urene produktet ble deretter oppslemmet i CH2Cl2(3.500 ml) og tilsatt til MTBE (5.000 ml). Den resulterende suspensjonen ble filtrert og tørket ved 50°C over natten, som ga 611,0 g (58,5% utbytte) av materiale med en renhet på 94,12%.

(c) 4-[3-(4-syklopropankarbonyl-piperazin-1-karbonyl)-4-fluor-benzyl]-2H-ftalazin-1-on (A)

Til en rørt suspensjon av forbindelse B (1.290 g) i CH2Cl2(15.480 ml) ble det under nitrogen tilsatt en forhåndsblandet løsning av trietylamin (470 ml) og syklopropankarbonylklorid (306 ml) i CH2Cl2(1.290 ml) dråpevis, mens temperaturen ble holdt under 20°C. Løsningen ble deretter rørt ved 10-15°C i 15 minutter, og det ble tatt prøver for å sjekke fullstendig reaksjon. Reaksjonsblandingen ble funnet kun å inneholde 1,18% utgangsmateriale B, og således ble reaksjonen ansett for å være fullstendig, og blandingen ble deretter opparbeidet.

Reaksjonsblandingen ble vasket med vann (7.595 ml), 5% sitronsyreløsning (7.595 ml), 5% natriumkarbonatløsning (7.595 ml) og vann (7.595 ml). Det organiske sjiktet ble deretter tørket over magnesiumsulfat (500g).

Det CH2Cl2-inneholdende produktsjiktet ble deretter isolert, filtrert gjennom celitt og tilsatt til en 25 liters beholder. CH2Cl2(8.445 ml) ble deretter destillert av ved atmosfæretrykk, og etanol (10.000 ml) ble tilsatt. Destillasjon fortsatte med at hver 4.000 ml destillat som ble fjernet ble erstattet med etanol (4.000 ml) til hodetemperaturen nådde 73,7°C. Reaksjonsvolumet ble deretter redusert (til 7.730 ml), hvorved hodetemperaturen hadde nådd 78,9°C, og løsningen ble avkjølt til 8°C over natten. Det faste stoffet ble deretter filtrert fra, vasket med etanol (1.290 ml) og tørket ved 70°C over natten.

Utbytte = 1.377,3 g (90%). HPLC renhet (99,34% [areal-%]). Inneholder 4,93% etanol og 0,45% CH2Cl2med GC.

(d) Vannbehandling av forbindelse A

En suspensjon av forbindelse A (1.377,0 g), fremstilt i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1, i vann (13.770 ml) ble varmet opp til refluks i 4 timer, avkjølt i romtemperatur og filtrert. Det faste stoffet ble vasket med vann (2.754 ml) og tørket ved 70°C over natten.

Utbytte = 1.274,8 g (92,6%). HPLC renhet (99,49% [area-%]). Innholder 0,01% etanol og 0,01% CH2Cl2med GC.

<1>H NMR spektrum av forbindelse A (DMSO-d6) etterfølgende vannbehandlingen er vist i figur 1.

Pulver XRD-mønsteret av forbindelse A etterfølgende vannbehandlingen er vist i figur 2, som viser at forbindelsen er som form A.

Eksempel 2: Alternativ syntese av forbindelse A ved anvendelse av 1-(syklopropylkarbonyl) piperazin HCl salt

(a) 1-(syklopropylkarbonyl)piperazin HCl salt (I’)

Eddiksyre (700 ml) ble behandlet med piperazin (50,00 g, 0,581 mol) porsjonsvis i løpet av 15 minutter med røring under nitrogen. Reaksjonsblandingen ble varmet opp til 40°C og holdt ved denne temperaturen til en fullstendig løsning ble oppnådd.

Syklopropankarbonylklorid (59,2 ml, 0,638 mol) ble tilsatt i løpet av 15 minutter.

Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur over natten. Reaksjonsblandingen ble filtret, og filtratet destillert under redusert trykk til ~430 ml destillater var blitt samlet opp. Toluen (550 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen, og redusert trykkdestillering fortsatte til ytterligere 400 ml destillater var samlet opp. En ytterligere tilsetting av toluen (550 ml) ble gjort, og redusert trykkdestillasjon fortsatte til 350 ml destillater var samlet opp. Den resulterende slurry ble fortynnet med toluen (200 ml) og rørt over natten. Ytterligere toluen (500 ml) ble tilsatt for å mobilisere slurryen. Slurryen ble filtrert, vasket med toluen (100 ml) og tørket i vakuum ved 40°C, som ga tittelforbindelsen som et off-white fast stoff (86,78 g).

Massespektrum: MH+ 155

1H NMR (400 MHz, D2O) δ: 0,92 (m, 4H), 1,98 (m, 1H), 3,29 (m, 2H), 3,38 (m, 2H), 3,84 (m, 2H), 4,08 (m, 2H).

(b) Forbindelse A

2-fluor-5-[(4-okso-3,4-dihydroftalazin-1-yl)metyl]benzosyre (D)(0,95 g, 3,19 mmol) ble suspendert med røring under nitrogen i acetonitril (4 ml).2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyluroniumheksafluorfosfat (HBTU) (1,45 g, 3,83 mmol) ble tilsatt, fulgt av 1-syklopropylkarbonylpiperazin HCl salt (0,73 g, 3,83 mmol).

Diisopropyletylamin (1,39 ml, 7,98 mmol) ble tilsatt i løpet av 3 minutter, og reaksjonsblandingen ble rørt over natten ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 5°C og holdt ved denne temperaturen i 1 time før filtrering. Filterkaken ble vasket med kald (3°C) acetonitril (2 ml) før tørking i vakuum ved opp til 40°C, som ga tittelforbindelsen som et mattgult fast stoff (0,93g).

(c) Rekrystallisering av forbindelse A fra vandig metanol

Forbindelse A (9,40 g, 21,64 mmol) fra trinn (b) ble suspendert i en blanding av vann (100 ml) og metanol (120 ml). Suspensjonen ble varmet opp til refluks med røring. En blakket løsning ble fremstilt, som deretter ble avkjølt til 60°C og filtrert gjennom en harborlittpute. Filterputen ble vasket med en blanding av vann (5 ml) og metanol (5 ml). Filtratet ble destillert ved atmosfæretrykk til 115 ml av destillat var blitt samlet opp. Destillasjonen ble deretter stoppet, og suspensjonen som ble produsert ble avkjølt til romtemperatur. Den resulterende suspensjonen ble rørt i ~18 timer før filtrering.

Filterkaken ble vasket med vann (20 ml) før tørking i vakuum ved opp til 60°C, som ga tittelforbindelsen i form A som et hvitt fast stoff (8,67 g).

Massespektrum: MH+ 435

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,70 (m, 4H), 1,88 (br s, 1H), 3,20 (br s, 2H), 3,56 (m, 6H), 4,31 (s, 2H), 7,17 (t, 1H), 7,34 (dd, 1H), 7,41 (m, 1H), 7,77 (dt, 1H), 7,83 (dt, 1H), 7,92 (d, 1H), 8,25 (dd, 1H), 12,53 (s, 1H).

(d) Rekrystallisering av forbindelse A fra vandig etanol

Forbindelse A (9,40 g, 21,64 mmol) fra trinn (b) ble suspendert i en blanding av vann (100 ml) og etanol (50 ml). Suspensjonen ble varmet opp til refluks med røring. Den blakkede løsningen som ble fremstilt ble deretter avkjølt til 60°C og filtrert gjennom en harborlittpute. Filterputen ble vasket med en blanding av vann (5 ml) og etanol (5 ml). Filtratet ble destillert ved atmosfæretrykk til 53 ml av destillat var blitt samlet opp. Destillasjonen ble deretter stoppet, og suspensjonen som ble fremstilt ble avkjølt til romtemperatur. Den resulterende suspensjonen ble rørt i ~18 timer før filtrering.

Filterkaken ble vasket med vann (20 ml) før tørking i vakuum ved 60°C, som ga tittelforbindelsen i form A som et hvitt fast stoff (8,74 g).

Massespektrum: MH+ 435

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,70 (m, 4H), 1,88 (br s, 1H), 3,20 (br s, 2H), 3,56 (m, 6H), 4,31 (s, 2H), 7,17 (t, 1H), 7,34 (dd, 1H), 7,41 (m, 1H), 7,77 (dt, 1H), 7,83 (dt, 1H), 7,92 (d, 1H), 8,25 (dd, 1H), 12,53 (s, 1H).

Eksempel 3: Rekrystallisering av forbindelse A fra vandig etanol

4-(3-{[4-(syklopropylkarbonyl)piperazin-1-yl]karbonyl}-4-fluorbenzyl)ftalazin-1(2H)-on (forbindelse A) (20,00 g, 44,66 mmol) ble suspendert i en blanding av vann (50 ml) og etanol (150 ml). Suspensjonen ble varmet opp til refluks med røring. Løsningen som ble fremstilt ble deretter avkjølt til 70°C og filtrert. Filterputen ble vasket med en blanding av vann (8 ml) og etanol (22 ml).

Filtratet ble avkjølt til 45°C med røring. 4-(3-{[4-(syklopropylkarbonyl)piperazin-1-yl]karbonyl}-4-fluorbenzyl)ftalazin-1(2H)-on (forbindelse A) i form A (0,08 g) ble tilsatt for å så blandingen. Den resulterende suspensjonen ble avkjølt til 20°C i løpet av 2,5 timer og ble deretter rørt ved denne temperaturen i ytterligere 16 timer for å etablere krystallisering. Vann (200 ml) ble tilsatt i løpet av 5 timer mens temperaturen ble holdt ved 20°C. Ved slutten av tilsettingen ble suspensjonen holdt ved 20°C i 2 timer.

Suspensjonen ble filtrert og filterkaken vasket med en blanding av etanol (24 ml) og vann (56 ml). Det isolerte faste stoffet ble tatt ut og tørket under vakuum ved 40-60°C, som ga tittelforbindelsen (form A) som et off-white fast stoff (18,1 g).

Fremgangsmåter for å oppnå figurene 3 og 5

Pulver XRD – figur 3 (forbindelse A som form A)

Pulverrøntgendiffraksjon ble avlest med et Bruker D5000 diffraktometer (bølgelengde for røntgen 1,5418 Å Cu-kilde, spenning 40 kV, filamentemisjon 40 mA). Prøver ble skannet fra 2-40 º 2 θ ved anvendelse av en 0,02 º trinnbredde og en 4 sekunders tidtelling.

Pulver XRD – figur 4 (forbindelse A som solvatisert form) Pulverrøntgendiffraksjon av solvatfamilien ble avlest med et Inel XRG-3000 diffraktometer (bølgelengde for røntgen 1,5418 Å Cu-kilde, spenning 40 kV, filamentemisjon 30 mA), utstyrt med en kurvet posisjonssensitiv detektor (område 120 º 2 θ) . Prøver ble skannet fra 2,5-40 º 2 θ ved anvendelse av en 0,03 º trinnbredde, typisk med en total oppsamlingstid på 300 s.

Differensiell skanningkalorimetri (DSC) – figur 5

DSC ble avlest ved anvendelse av en Mettler DSC820E med TSO801RO robotsystem. Typisk ble mindre enn 5 mg materiale, tilsatt til en 40 μl aluminiumpanne utstyrt med et lokk med hull i, varmet opp over et temperaturområde fra 25°C til 325°C ved en konstant oppvarmingshastighet på 10°C pr. minutt. En nitrogenoverstrømningsgass ble anvendt med en strømningshastighet på 100 ml pr. minutt.

Eksempel 4: Inhiberingsvirkning

For å bestemme inhiberingsvirkningen til den aktive forbindelsen, ble følgende undersøkelse anvendt for å bestemme en IC50verdi.

Pattedyr PARP, isolert fra Hela-celle nukleært ekstrakt, ble inkubert med Z-buffer (25 mM Hepes (Sigma); 12,5 mM MgCl2(Sigma); 50 mM KCl (Sigma); 1 mM DTT (Sigma); 10% glyserol (Sigma); 0,001% NP-40 (Sigma); pH 7,4) i 96 brønns FlashPlater (TRADE MARK) (NEN, UK), og forskjellige konsentrasjoner av nevnte inhibitorer ble tilsatt. Alle forbindelser ble fortynnet i DMSO og ga sluttundersøkelseskonsentrasjoner på mellom 10 og 0,01 μM, med DMSO værende ved en sluttkonsentrasjon på 1% pr. brønn. Det totale undersøkelsesvolumet pr. brønn var 40

μl.

Etter 10 minutters inkubering ved 30ºC ble reaksjonene initiert ved tilsetting av en 10 μl reaksjonsblanding, som inneholder NAD (5 μM),<3>H-NAD og 30 mer dobbelstrengede DNA-oligoer. Designerte positive og negative reaksjonsbrønner ble utført i kombinasjon med forbindelsebrønner (ukjente) for å beregne % enzymaktiviteter.

Platene ble deretter ristet i 2 minutter og inkubert ved 30ºC i 45 minutter.

Etterfølgende inkuberingen ble reaksjonene stoppet ved tilsetting av 50 μl 30% eddiksyre til hver brønn. Platene ble deretter ristet i 1 time ved romtemperatur.

Platene ble overført til en TopCount NXT (TRADE MARK) (Packard, UK) for scintillasjonstelling. Verdiene som avleses er tellinger pr. minutt (cpm), etterfølgende en 30 sekunders telling av hver brønn.

% enzymaktiviteten for forbindelsen ble deretter beregnet ved anvendelse av følgende ligning:

IC50verdier (konsentrasjonen hvor 50% av enzymaktiviteten er inhibert) ble beregnet, som ble bestemt over et område med forskjellige konsentrasjoner, normalt fra 10 μM ned til 0,001 μM. Slike IC50verdier ble anvendt som sammenligningsverdier for å identifisere økende forbindelsepotensialer.

Forbindelse A har en IC50på ca.5 nM.

Potensieringsfaktor

Potensieringsfaktoren (PF50) for den aktive forbindelsen ble beregnet som forholdet mellom IC50til kontrollcellevekst og IC50til cellevekst PARP inhibitor.

Vekstinhiberingskurver for både kontroll- og forbindelsebehandlede celler er under nærvær av alkyleringsmiddelet metylmetansulfonat (MMS). Testforbindelsen ble anvendt ved en fiksert konsentrasjon på 0,2 mikromolar. Konsentrasjonene av MMS var i området fra 0 til 10 μg/ml.

Cellevekst ble bestemt ved anvendelse av sulforhodamin B (SRB) undersøkelsen (Skehan, P., et al., (1990) ”New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening”. J. Natl. Cancer Inst.82, 1107-1112.). 2.000 HeLa-celler ble sådd i hver brønn til en flatbunnet 96-brønns mikrotiterplate i et volum på 100 μl og inkubert i 6 timer ved 37°C. Celler ble enten erstattet med media alene eller med media som inneholder PARP-inhibitor ved en sluttkonsentrasjon på 0,5, 1 eller 5 μM. Celler ble dyrket i ytterligere 1 time før tilsetting av MMS ved et antall konsentrasjoner (typisk 0, 1, 2, 3, 5, 7 og 10 μg/ml) til enten ikke-behandlede celler eller PARP- inhibitorbehandlede celler. Celler behandlet med PARP-inhibitor alene ble anvendt for å bestemme vekstinhiberingen med PARP-inhibitoren.

Celler ble værende i ytterligere 16 timer før erstatning av media, og cellene ble dyrket i ytterligere 72 timer ved 37°C. Media ble deretter fjernet og cellene fiksert med 100 μl iskald, 10% (vekt/volum) trikloreddiksyre. Platene ble inkubert ved 4°C i 20 minutter og ble deretter vasket fire ganger med vann. Hver brønn av celler ble deretter farget med 100 μl 0,4% (vekt/volum) SRB i 1% eddiksyre i 20 minutter før vasking fire ganger med 1% eddiksyre. Plater ble deretter tørket i 2 timer ved romtemperatur. Fargestoffet fra de fargede cellene ble solubilisert ved tilsetting av 100 μl 10 mM Tris Base til hver brønn. Plater ble ristet forsiktig og ble stående ved romtemperatur i 30 minutter før måling av den optiske tettheten ved 564 nM på en Microquant mikrotiterplateavleser.

Forbindelse A har en PF50ved 200 nM på minst 20.