CN102107008B - 用于治疗癌症的dna损伤修复抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及认同在HR依赖的DNA DSB修复缺陷细胞中碱基切除修复途径的抑制是选择性致死的。在此提供涉及使用靶向碱基切除修复组分(如PARP)的抑制剂来治疗HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症的方法和手段。

Description

用于治疗癌症的DNA损伤修复抑制剂
本申请是申请日为2004年11月30日的、发明名称为“用于治疗癌症的DNA损伤修复抑制剂”的中国专利申请200480040831.6(PCT/GB2004/005025)的分案申请。 
技术领域
本发明涉及在癌细胞、特别是同源重组(HR)依赖的DNA双链断裂(DSB)修复缺陷的癌细胞中诱导细胞致死现象。 
背景技术
细胞中DNA损伤的有效修复依赖于感应损伤然后向下游效应子传导损伤信号的机制，该机制在细胞周期关卡停滞并修复DNA损伤。细胞含有许多不同的信号和效应子途径，介导不同类型的DNA损伤修复。这些途径包括碱基切除修复(BER)、同源重组(HR)依赖的DNA双链断裂(DSB)修复、非同源末端连接(NHEJ)、核苷酸切除修复(NER)、碱基切除修复(BER)和错配修复(MMR)。关于多种DNA修复途径之间的相互作用和相互依赖仍然知之甚少。 
发明概述 
本发明人发现，例如通过抑制聚ADP核糖聚合酶(PARP)的BER途径的抑制对HR依赖的DNA DSB修复途径缺陷的那些癌细胞是选择性致死的。这在癌症疾病治疗中具有重要意义。 
本发明的一方面提供碱基切除修复途径抑制剂在制造用于治疗个体癌症的药物中的用途，其中所述癌症是HR依赖的DNA DSB修复活性缺陷的。 
治疗个体中癌症的方法可以包括：给所述个体施用碱基切除修复途径抑制剂，其中所述癌症是HR依赖的DNA DSB修复途径缺陷的。 
癌症可以包含一种或多种癌细胞，相对于正常细胞，所述癌细胞由所 述第二个修复途径修复DNA的能力降低或丧失。 
HR依赖的DNA DSB修复途径通过同源机制重新形成连续的DNA螺旋而修复DNA中的双链断裂(DSB)(K.K.Khanna和S.P.Jackson，Nat.Genet.27(3)：247-254(2001))。HR依赖的DNA DSB修复途径组分包括ATM(NM_000051)、RAD51(NM_002875)、RAD51L1(NM_002877)、RAD51C(NM_002876)、RAD51L3(NM_002878)、DMC1(NM_007068)、XRCC2(NM_005431)、XRCC3(NM_005432)、RAD52(NM_002879)、RAD54L(NM_003579)、RAD54B(NM_012415)、BRCA1(NM_007295)、BRCA2(NM_000059)、RAD50(NM_005732)、MRE 11A(NM_005590)和NBS1(NM_002485)。涉及HR依赖的DNA DSB修复途径的其它蛋白质包括调节因子，例如EMSY(Hughes-Davies等，Cell，第115卷，第523-535页)。 
碱基切除修复(BER)途径修复DNA单链断裂和缺口，并去除特定的损伤碱基。聚ADP核糖聚合酶(PARP)和连接酶的相继作用填充DNA螺旋中的缺口。(K.K.Khanna和S.P.Jackson，Nat.Genet.，27(3)：247-254(2001)；F.Dantzer等，Biochemistry 39，7559-692000；J.H.Hoeijmakers，Nature 411 366-74(2001))。碱基切除修复抑制剂可以抑制碱基切除修复途径的任一个组分。BER途径组分包括：UNG(NM_003362)、SMUG1(NM_014311)、MBD4(NM_003925)、TDG(NM_003211)、OGG1(NM_002542)、MYH(NM_012222)、NTHL1(NM_002528)、MPG(NM_002434)、NEIL1(NM_024608)、NEIL2(NM_145043)、NEIL3(NM_018248)、APEl  (NM_001641)、APE2(NM_014481)、LIG3(NM_013975)、XRCC1(NM_006297)、ADPRT(PARP1)(NM_0016718)和ADPRTL2(PARP2)(NP_005475)。 
BER抑制剂与DNA损伤剂组合可以用于治疗HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症。优选以不存在BER抑制剂时对细胞不致死的剂量或制剂使用DNA损伤剂。下文描述了合适的损伤DNA的化学治疗剂。 
在一些优选的实施方案中，可以采用哺乳动物酶聚ADP核糖聚合酶 (PARP)抑制剂(D′Amours等，(1999)Biochem.J.342：249-268)。PARP抑制剂因此可用于治疗HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症。 
治疗个体中HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症的方法可以包括：给所述个体施用PARP抑制剂。 
PARP抑制剂可用于制造治疗个体中癌症的药物，其中所述癌症是HR依赖的DNA DSB修复缺陷的。 
PARP抑制剂在下文有更加详细的说明。 
HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症可以包括一种或多种癌细胞或由一种或多种癌细胞组成，相对于正常细胞，所述癌细胞通过该途径修复DNA DSB的能力降低或丧失，即所述一种或多种癌细胞中HR依赖的DNADSB修复途径的活性可能降低或丧失。 
HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症个体的一种或多种癌细胞中，HR依赖的DNA DSB修复途径中一个或多个组分的活性可能丧失。HR依赖的DNA DSB修复途径组分在本领域已充分表征(见例如Wood等，(2001)Science 291 1284-1289)，并包括上文所列组分。 
在一些优选的实施方案中，癌细胞可能具有BRCA1和/或BRCA2缺陷表型，即癌细胞中BRCA1和/或BRCA2活性降低或丧失。具有该表型的癌细胞可能是BRCA1和/或BRCA2缺陷的，即通过例如编码核酸中的突变或多态性，或通过编码调节因子的基因(例如编码BRCA2调节因子的EMSY基因)的突变或多态性，可以降低或丧失癌细胞中BRCA1和/或BRCA2的表达和/或活性(Hughes-Davies等，Cell，第115卷，第523-535页)。 
BRCA1和BRCA2是已知的肿瘤抑制因子，其野生型等位基因在杂合体携带者中常常丢失(Jasin M.Oncogene.2002Dec 16；21(58)：8981-93；Tutt等，Trends Mol Med.(2002)8(12)：571-6)。本领域充分表征了BRCA1和/或BRCA2突变与乳腺癌的关系(Radice P J Exp Clin Cancer Res.2002Sep；21(3Suppl)：9-12)。也已知编码BRCA2结合因子的EMSY基因的扩增与乳腺癌和卵巢癌有关。 
BRCA1和/或BRCA2突变携带者也具有升高的卵巢、前列腺和乙酰癌症危险。 
在一些实施方案中，个体中的癌症疾病可能先前已经被鉴定为HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症。 
在另一些实施方案中，在此所述的方法可以包括鉴定个体中的癌症疾病为HR依赖的DNA DSB修复缺陷的步骤。 
例如，可以通过在从个体获得的样品中的一种或多种癌细胞中测定HR依赖的DNA DSB修复途径活性、或通过测定该途径中一个或多个组分的活性，将癌症鉴定为HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症。可以相对于正常(例如非癌症)细胞(优选来自相同组织)测定活性。 
可以通过测量应答DNA损伤剂或PARP抑制剂而形成核中含有Rad51的聚集点/灶(foci)而测定HR依赖的DNA DSB修复途径的活性。HR依赖的DNA DSB修复途径缺陷的细胞缺乏产生这种聚集点的能力。可以使用标准免疫荧光技术测定Rad51聚集点的存在。测定HR依赖的DNA DSB修复途径活性的其它方法可以包括对IR、化疗药物例如链内交联剂、DSB诱导剂(拓扑异构酶I和II)的敏感性，以及使用蛋白质印迹分析、免疫组织学、染色体异常、酶或DNA结合测定法和基于质粒的测定法。 
在一些实施方案中，可以通过在来自个体的癌细胞中确定核酸中存在一个或多个变异(例如多态性或突变)，将癌症鉴定为HR依赖的DNA DSB修复途径缺陷，所述核酸编码的多肽是HR依赖的DNA DSB修复途径组分。 
序列变异(例如突变和多态性)可以包括相对于野生型核苷酸序列的一个或多个核苷酸的缺失、插入或替代。在一些实施方案中，变异可以是基因扩增，例如EMSY基因(CAD22881；基因符号C11ORF30)的扩增。一个或多个变异可以存在于核酸序列的编码或非编码区内，并可能降低或废除HR依赖的DNA DSB修复途径组分多肽的表达或功能。换言之，变异核酸可以编码活性降低或丧失的变异多肽，或可以通过例如调节元件活性改变而编码在细胞内表达很少或不表达的野生型多肽。相对于野生型序 列，变异核酸可以具有一个、两个、三个、四个或更多突变或多态性。 
可以在测试样品的一种或多种细胞中通过检测包含一个或多个突变或多态性的编码核酸序列的存在、或通过检测由该核酸序列编码的变异组分多肽的存在，确定编码HR依赖的DNA DSB修复途径组分的核酸中存在一个或多个变异。 
可以使用多种方法检测从个体获得的样品中是否存在特定的核酸序列，例如具有突变或多态性的核酸序列，所述突变或多态性降低或消除了HR依赖的DNA DSB修复途径组分的表达或活性。另外，对个体或样品的核酸测序后，可以保留序列信息并随后检索，而无需借助于原始的核酸本身。因此，例如使用序列分析软件扫描序列信息数据库可以鉴定序列改变或突变。 
根据本发明某些方面的方法可以包括测定寡核苷酸探针与从样品获得的核酸(例如基因组DNA、RNA或cDNA)的结合。探针可以包含与含有一个或多个突变或多态性的核酸序列特异性结合并且不与不含有一个或多个突变或多态性的核酸序列特异性结合的核酸序列，或反之。 
寡核苷酸探针可以包含标记，且可以通过检测标记的存在确定探针的结合。 
方法可以包括一个或多个(例如两个)寡核苷酸探针或引物与靶核苷酸的杂交。当核酸是双链DNA时，杂交之前一般将通过变性以产生单链DNA。杂交可以作为PCR程序的一部分，或作为不涉及PCR的探查程序的一部分。示范程序可以是PCR与低严格性杂交的组合。 
可以随本领域技术人员之便使用许多技术中的任一技术测量探针与靶核酸(例如DNA)的结合。例如，探针可以是放射性、荧光或酶标记的。其它不采用探针标记的方法包括检查限制性片段长度多态性、使用PCR扩增、RNA酶切割和等位基因特异的寡核苷酸探查。探查可以采用标准DNA印迹技术。例如，可以从细胞提取DNA，并以不同的限制酶消化。然后可以在变性并向硝化纤维素滤膜转移之前，通过琼脂糖凝胶电泳分离限制性片段。可以使标记的探针与滤膜上的DNA片段杂交并测定结合。 
本领域技术人员也能为选择性杂交很好地采用适于所需严格性的条件，考虑例如寡核苷酸长度和碱基组成、温度等因素。 
对于17至30个碱基的寡核苷酸，合适的选择性杂交条件包括在6×SSC中于42℃杂交过夜，并在6×SSC中于42℃至65℃一系列逐渐增加的温度中洗涤。 
在《Molecular Cloning：a Laboratory Manual》，第3版，Sambrook和Russell(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press NY和《CurrentProtocols in Molecular Biology》，Ausubel等编，John Wiley & Sons(1992)中描述了其它合适的条件和方案。 
可以对核酸(可以是基因组DNA、RNA或cDNA)或其扩增区域测序以鉴定或确定多态性或突变的存在。如上所述，可以通过将获得的序列与该组分的数据库序列比较而鉴定多态性或突变。具体而言，可以确定一个或多个多态性或突变的存在，所述多态性或突变引起多肽组分功能并因此使HR依赖的DNA DSB修复途径总体上废除或丧失功能。 
可以使用一系列标准技术中的任一种进行测序。扩增产物的测序可以包括例如以异丙醇沉淀、重悬并使用TaqFS+染料终止子测序试剂盒(TaqFS+Dye terminator sequencing kit)测序。可以将延伸产物在ABI 377DNA测序仪上电泳，并使用Sequence Navigator软件分析数据。 
可以方便地采用特定的扩增反应(例如使用一对或多对引物的PCR)扩增核酸序列内的目的区域，例如怀疑含有突变或多态性的序列部分。然后可以如上对扩增的核酸测序，和/或以任何其它方法测试以确定是否存在降低或消除HR依赖的DNA DSB修复途径组分表达或活性的突变或多态性。 
合适的扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)(综述见例如《PCRprotocols：A Guide to Methods and Applications》，Innis等编，1990，Academic Press，New York，Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51：263，(1987)，Ehrlich编，《PCR technology》，Stockton Press，NY，1989，以及Ehrlich等，Science，252：1643-1650，(1991))。 
在一些实施方案中，可以通过评估HR依赖的DNA DSB修复途径组分的正或负调节因子(例如EMSY)的表达水平或活性，将癌症鉴定为HR依赖的DNA DSB修复途径缺陷。可以通过例如蛋白质印迹分析、ELISA、RT-PCR、核酸杂交或染色体组型分析测定表达水平。 
在一些优选的实施方案中，个体杂合了BRCA1和/或BRCA2或其调节因子中的一个或多个变异，例如突变和多态性。检测BRCA1和BRCA2中的变异在本领域广为人知，并且在例如EP699754、EP705903、NeuhausenS.L.和Ostrander E.A.Genet.Test(1992)1，75-83；Chappnis，P.O.和Foulkes，W.D.(Cancer Treat Res(2002)107，29-59)；Janatova M等(Neoplasma.2003：50(4)：246-50；Jancarkova N Ceska Gynekol.200368(1)：11-6)中有所描述。在Hughes-Davies等(Cell，115523-535)中描述了BRCA2结合因子EMSY扩增的测定。 
通过检测变异(例如突变或等位基因变体)多肽的存在，也在蛋白质水平检测了与癌症有关的突变和多态性。 
鉴定个体样品中的癌细胞为HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌细胞的方法可以包括：将样品与针对该途径的变异(例如突变)多肽组分的特异性结合成分接触，并测定特异性结合成分与样品的结合。该特异性结合成分与样品的结合可能指示样品中细胞内存在HR依赖的DNA DSB修复途径的变异多肽组分。 
用于本发明此方面的优选特异性结合分子包括抗体及其片段或衍生物(“抗体分子”)。 
可以通过任何适当的方法测定结合成分(例如抗体)对正常和测试样品的反应性。用加单独的报告分子作为标签是一种可能。报告分子可以直接或间接产生可检测(并优选可测量的)信号。报告分子的连接可以是直接的或间接的、共价的(例如通过肽键)或非共价的。通过肽键连接可以是编码结合分子(例如抗体)与报告分子基因融合的重组表达的结果。 
测定结合的方式不是本发明的特征，本领域技术人员能够根据其偏好和一般知识选择合适的方式。 
癌细胞一般以相对于正常细胞的异常增殖以及在患有癌症疾病的个体中形成簇或肿瘤为特性。 
在此所述HR依赖的DNA DSB修复途径缺陷的癌症疾病可以包括任何类型的实体癌或恶性淋巴瘤，尤其是白血病、肉瘤、皮肤癌、胆囊癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、肝癌、头颈癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、胃癌和脑癌。在一些优选实施方案中，癌症疾病可以是乳腺、卵巢、胰腺或前列腺癌。癌症可以是家族性的或散发性的。 
从个体获得的样品可以是包含一种或多种细胞的组织样品，例如上述癌组织、或例如用作对照的非癌组织活检样品。 
本发明的方法可用于评估患有癌症疾病的个体，从而例如确定作用的治疗时程。评估患有癌症疾病的个体的方法可以包括：鉴定从个体获得的癌细胞相对于正常细胞为HR依赖的DNA DSB修复缺陷的，并且提供适于施用于该个体的BER途径抑制剂。 
在一些优选实施方案中，BER途径抑制剂是PARP抑制剂。PARP抑制剂在下文有更详细的描述。评估癌症疾病的方法可以包括：鉴定从个体获得的癌细胞相对于正常细胞为HR依赖的DNA DSB修复缺陷的，并且提供适于施用于该个体的PARP抑制剂。 
在一些优选实施方案中，鉴定为HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌细胞可以具有BRCA1或BRCA2缺陷表型。 
个体可能具有HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症易感体质。本发明的方法和手段尤其可用于这类个体。 
个体可以是例如编码HR依赖的DNA DSB修复途径组分的核酸(例如编码上述组分的核酸)中突变或多态性的杂合体。 
治疗个体中癌症的方法可以包括：给个体施用BER途径抑制剂，其中，所述个体是编码HR依赖的DNA DSB修复途径组分的基因中突变或多态性的杂合体。 
BER抑制剂可用于制造治疗个体中癌症的药物，其中所述个体是HR依赖的DNA DSB修复途径的基因中突变的杂合体，而且，在个体癌症治疗中可以使用碱基切除修复抑制剂，所述个体是编码HR依赖的DNA DSB修复途径组分的基因中突变的杂合体。
在一些优选实施方案中，编码HR依赖的DNA DSB修复途径组分的基因中突变或多态性的杂合体个体可以是BRCA1和/或BRCA2中突变或多态性的杂合体。 
适用于在此所述方法的BER抑制剂可以是抑制、降低或消除BER途径一个或多个组分活性的任何化合物或实体，例如小的有机分子、肽或核酸。 
在一些优选的实施方案中，BER抑制剂可以降低或消除酶聚ADP核糖聚合酶(PARP)的活性。 
除非文中另外指出，此处所用的术语PARP指PARP1(EC 2.4.2.30,Genbank No:M32721)和/或PARP2（Ame等，J.Biol.Chem.(1999)27415504-15511;Genbank No:AJ236912）。 
已知为PARP抑制剂并可根据本发明使用的化合物的实例包括： 
1.尼克酰胺类（例如5-甲基尼克酰胺和邻-(2-羟基-3-哌啶基-丙基)-3-羧酸偕胺肟(amidoxime)）及其类似物和衍生物。 
2.苯甲酰胺类，包括3-取代的苯甲酰胺类（例如3-氨基苯甲酰胺、3-羟基苯甲酰胺、3-亚硝基苯甲酰胺、3-甲氧基苯甲酰胺和3-氯普鲁卡因胺）和4-氨基苯甲酰胺、1,5-二[(3-氨甲酰基苯基)氨基羰基氧基]戊烷，及其类似物和衍生物。 
3.异喹啉酮类和二氢异喹啉酮类，包括2H-异喹啉-1-酮类、3H-喹唑啉-4-酮类、5-取代的二氢异喹啉酮类，例如5-羟基二氢异喹啉酮、5-甲基二氢异喹啉酮、及5-羟基异喹啉酮、5-氨基异喹啉-1-酮、5-二羟基异喹啉酮、3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮类（例如3,4-二氢-5-甲氧基异喹啉-1(2H)-酮和3,4-二氢-5-甲基-1(2H)异喹啉酮）、异喹啉-1(2H)-酮类、4,5-二氢-咪唑并[4,5,1-ij]喹啉-6-酮、1,6-萘啶-5(6H)-酮类、1,8-萘二甲酰亚胺类(1,8-naphthalimides)（例如4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺）、异喹啉酮、3,4- 二氢-5-[4-1(1-哌啶基)丁氧基]-1(2H)-异喹啉酮、2,3-二氢苯并[de]异喹啉-1-酮、1-11b-二氢-[2H]苯并吡喃并[4,3,2-de]异喹啉-3-酮、和四环内酰胺类，包括苯并吡喃并异喹啉酮类，例如苯并吡喃并[4,3,2-de]异喹啉酮，及其类似物和衍生物。 
4.苯并咪唑类和吲哚类，包括苯并 
Figure DEST_PATH_GDA00001618645700021
唑-4-甲酰胺类、苯并咪唑-4-甲酰胺类，例如2-取代的苯并 
Figure DEST_PATH_GDA00001618645700022
唑4-甲酰胺类和2-取代的苯并咪唑4-甲酰胺类，例如2-芳基苯并咪唑4-甲酰胺类和2-环烷基苯并咪唑-4-甲酰胺类，包括2-(4-羟苯基)苯并咪唑4-甲酰胺、喹喔啉甲酰胺类、咪唑并吡啶甲酰胺类、2-苯基吲哚类、2-取代的苯并 
Figure DEST_PATH_GDA00001618645700023
唑类，例如2-苯基苯并 唑和2-(3-甲氧基苯基)苯并 
Figure DEST_PATH_GDA00001618645700025
唑、2-取代的苯并咪唑类，例如2-苯基苯并咪唑和2-(3-甲氧基苯基)苯并咪唑、1,3,4,5-四氢-氮杂 并[5,4,3-cd]吲哚-6-酮、氮杂 
Figure DEST_PATH_GDA00001618645700027
并吲哚类和氮杂 并吲哚酮类，例如1,5-二氢-氮杂 
Figure DEST_PATH_GDA00001618645700029
并[4,5,6-cd]吲哚啉-6-酮和二氢二氮杂 
Figure DEST_PATH_GDA000016186457000210
并吲哚满酮、3-取代的二氢二氮杂 
Figure DEST_PATH_GDA000016186457000211
并吲哚满酮类，例如3-(4-三氟甲基苯基)-二氢二氮杂 
Figure DEST_PATH_GDA000016186457000212
并吲哚满酮、四氢二氮杂 
Figure DEST_PATH_GDA000016186457000213
并吲哚满酮和5,6-二氢咪唑并[4,5,1-j,k][1,4]]苯并二氮杂 
Figure DEST_PATH_GDA000016186457000214
-7(4H)–酮、2-苯基-5,6-二氢-咪唑并[4,5,1-j k][1,4]苯并二氮杂 -7(4H)–酮和2,3-二氢-异吲哚-1-酮，及其类似物和衍生物。 
5.2,3-二氮杂萘-1(2H)-酮类和喹唑啉酮类，例如4-羟基喹唑啉、2,3-二氮杂萘酮、5-甲氧基-4-甲基-1(2)-2,3-二氮杂萘酮类、4-取代的2,3-二氮杂萘酮类、4-(1-哌嗪基)-1(2H)-2,3-二氮杂萘酮、四环苯并吡喃并[4,3,2-de]2,3-二氮杂萘酮类和四环茚并[1,2,3-de]2,3-二氮杂萘酮类和2-取代的喹唑啉类，例如8-羟基-2-甲基喹唑啉-4-(3H)酮、三环2,3-二氮杂萘酮类和2-氨基邻苯二甲酰肼，及其类似物和衍生物。 
6.异吲哚啉酮类及其类似物和衍生物。 
菲啶类和菲啶酮类，例如5[H]菲啶-6-酮、取代的5[H]菲啶-6-酮类、特别是2-,3-取代的5[H]菲啶-6-酮类和6(5H)菲啶-6-酮类的磺酰胺/脲衍生物、噻吩并[2,3-c]异喹诺酮类，例如9-氨基噻吩并[2,3-c]异喹诺酮和9-羟基噻吩并[2,3-c]异喹诺酮、9-甲氧基噻吩并[2,3-c]异喹诺酮、及N-[6- 氧代-5，6-二氢菲啶-2-基]-2-[N，N-二甲基氨基]乙酰胺、取代的4，9-二氢环戊烷[lmn]菲啶-5-酮类，及其类似物和衍生物。 
8.苯并吡喃酮类，例如1，2-苯并吡喃酮、6-亚硝基基苯并吡喃酮、6-亚硝基1，2-苯并吡喃酮、及5-碘代-6-氨基苯并吡喃酮，及其类似物和衍生物。 
9.不饱和羟肟酸衍生物，例如邻-(3-哌啶基-2-羟基-1-丙基)烟碱偕胺肟(nicotinic amidoxime)，及其类似物和衍生物。 
10.哒嗪类，包括稠合的哒嗪类、及其类似物和衍生物。 
11.其它化合物，例如咖啡因、茶碱和胸苷、及其类似物和衍生物。 
在例如US6,635,642、US5,587,384、WO2003080581、WO2003070707、WO2003055865、WO2003057145、WO2003051879、US6514983、WO2003007959、US6426415、WO2003007959、WO2002094790、WO2002068407、US6476048、WO2001090077、WO2001085687、WO2001085686、WO2001079184、WO2001057038、WO2001023390、WO2001021615、WO2001016136、WO2001012199、WO9524379，Banasik等，J.Biol.Chem.，267：3，1569-75(1992)、Banasik等，Molec.Cell.Biochem.138：185-97(1994)、Cosi(2002)Expert Opin.Ther.Patents 12(7)、及Southan和Szabo(2003)Curr Med Chem 10321-340及其中参考文献中描述了其它PARP抑制剂。 
一类优选的适合的PARP抑制剂包括2，3-二氮杂萘酮(例如1(2H)-2，3-二氮杂萘酮)及其衍生物，如WO02/36576中所述。具体而言，可使用具有通式 
Figure BDA0000046137430000111
的化合物及其异构体、盐、溶剂化物、化学保护形式及前药来抑制PARP，其中：A和B共同表示任意取代的稠合芳香环； 
RC代表-L-RL，其中L为通式：-(CH2)n1-Qn2-(CH2)n3- 
其中n1、n2和n3各选自0、1、2和3，n1、n2和n3的和为1、2或3，且Q选自O、S、NH、C(＝O)或-CR1R2-，其中R1和R2独立地选自氢、卤素或任意取代的C1-7烷基，或可以与其连接的碳原子一起形成C3-7环烷基，所述环烷基可以是饱和的(C3-7环烷基)或不饱和的(C3-7环烯基)，或R1和R2之一可以与RL中的原子连接形成不饱和的C3-7环烯基团，其包含Q中R1和R2连接的碳原子、-(CH2)n3-(如果存在)和部分RL； 
且RL是任意取代的C5-20芳基； 
且RN选自氢、任意取代的C1-7烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基、羟基、醚、硝基、氨基、胺、硫醇、硫醚、亚砜和砜。 
可以优选使用通式为 
的化合物或其异构体、盐、溶剂化物、化学保护形式及前药来抑制PARP，其中：A和B共同表示任意取代的稠合芳香环； 
RC是-CH2-RL； 
RL是任意取代的苯基；且 
RN是氢。 
在一些优选的实施方案中，可以使用具有如图2所示KU-0058684或KU-0058948结构的化合物或其异构体、盐、溶剂化物、化学保护形式及前药来抑制PARP。 
合适的PARP抑制剂既可以通过商业途径获得，也可以通过已知方法从已知的起始材料合成(见例如Suto等，Anticancer Drug Des.6：107-17(1991))。 
另一类碱基切除修复抑制剂包括BER途径组分的肽片段。例如，可以使用PARP序列的肽片段来抑制PARP从而降低或消除BER途径的活 性。可以使用公布的组分序列(例如，公布的PARP序列(登录号NM-001618))通过化学合成完全或部分产生肽片段。可以根据完善建立的标准液相或优选的固相肽合成方法容易地制备肽片段，所述肽合成方法的一般性说明可随处获得(见例如J.M.Stewart和J.D.Young，《SolidPhase Peptide Synthesis》，第二版，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois(1984)、M.Bodanzsky和A.Bodanzsky，《The Practice of PeptideSynthesis》，Springer Verlag，New York(1984)；和Applied Biosystems430A Users Manual，ABI Inc.，Foster City，California)，或者可以通过液相方法或固相、液相和溶液化学的任何组合，例如，首先完成各个肽部分，然后(如果需要并且恰当)在去除存在的任何保护基团之后，通过各自的碳酸或磺酸或其反应性衍生物的反应引入残基X，在溶液中制备肽片段。 
抑制BER途径组分(例如PARP)的其它候选化合物可以基于模拟该组分的三维结构并使用合理的药物设计以提供具有特定分子形状、大小和电荷特征的候选化合物。候选抑制剂可以是例如肽片段的“功能类似物”或抑制该组分的其它化合物。功能类似物具有与该肽或在相关的其它化合物相同的功能活性，即其可以干扰DNA修复途径组分的相互作用或活性。这类类似物的实例包括经过模拟同该组分与另一个组分接触区域的三维结构(特别是所表现的关键氨基酸残基排列)相似的化合物。 
另一类合适的BER途径抑制剂包括编码BER途径组分(例如PARP，登录号NM001618)的部分或全部氨基酸序列的核酸或该核酸的互补物，所述核酸通过下调活性多肽的产生而抑制活性或功能。 
例如，可以使用常规方法测定PARP活性的抑制，包括例如点渍法(Affar EB等，Anal Biochem.1998；259(2)：280-3)和BER测定法，该方法通过例如使用放射性测定法，以含氚底物NAD或对由PARP活性形成的多聚体链特异的抗体测量PARP形成聚ADP-核糖链的直接活性(K.J.Dillon等，Journal of Biomolecular Screening，8(3)：347-352(2003))。 
例如，可以使用反义或RNAi技术抑制BER途径组分的表达。使用这些方法下调基因表达现在已经在本领域完善建立。 
可以设计反义寡核苷酸与核酸、前体mRNA或成熟RNA的互补序列杂交，干扰碱基切除修复途径组分的产生，从而降低、或完全或基本完全阻止其表达。除了靶向编码序列，也可以使用反义技术靶向基因的控制序列，例如5’侧翼序列，由此反义寡核苷酸可以干扰表达控制序列。在例如Peyman和Ulman，Chemical Reviews，90：543-584，(1990)及Crooke，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：329-376，(1992)中描述了反义序列的构建及其用途。 
可以体外或离体产生施用的寡核苷酸，或者可以在需要下调的细胞中体内产生反义RNA。因此，可以将双链DNA以“反方向”置于启动子控制下，从而DNA反义链转录产生与靶基因有义链转录的正常mRNA互补的RNA。于是认为互补的反义RNA序列结合mRNA形成双链，抑制来自靶基因的内源性mRNA翻译为蛋白质。尚不肯定这是否是实际的作用模式。然而该技术有效是确定的事实。 
不需要使用与反向编码序列对应的完整序列。例如，可以使用足够长度的片段。从基因的编码或侧翼序列的不同部分筛选多种长度的片段以优化反义抑制水平，对于本领域技术人员是常规事项。包含起始甲硫氨酸ATG密码子以及或许起始密码子上游一个或多个核苷酸是有利的。合适的片段可以具有14-23个核苷酸，例如约15、16或17个核苷酸。 
反义的备选是使用靶基因的全部或部分拷贝，该拷贝按照靶基因的有义(即相同的)方向插入，通过共抑制实现靶基因表达的降低；Angell和Baulcombe(1997)The EMBO Journal 16，12：3675-3684；及Voinnet和Baulcombe(1997)Nature 389：第553页)。发现双链RNA(dsRNA)在基因沉默中甚至比单独的有义或反义链更有效(Fire A等，Nature 391，(1998))。dsRNA介导的沉默是基因特异性的，并且常被称为RNA干涉(RNAi)。 
RNA干涉是两步过程。首先，在细胞内切割dsRNA，产生约21-23个核苷酸长、具有5’末端磷酸酯和3’短的突出(约2个核苷酸)的短干涉RNA(siRNAs)。siRNAs特异性靶向破坏相应的mRNA序列(Zamore P.D. Nature Structural Biology，8，9，746-750，(2001))。 
使用具有3’突出末端的相同结构的化学合成siRNA双链也可以有效诱导RNAi(Zamore PD等，Cell，101，25-33，(2000))。已显示合成的siRNA双链在广泛的哺乳动物细胞系中特异性抑制内源和异源基因的表达(Elbashir SM.等，Nature，411，494-498，(2001))。 
另一种可能是使用在转录中产生核酶的核酸，所述核酶能够在特异性位点切割核酸，从而可用于影响基因表达。核酶的背景参考文献包括Kashani-Sabet和Scanlon，1995，Cancer Gene Therapy，2(3)：213-223，及Mercola和Cohen，1995，Cancer Gene Therapy，2(1)，47-59。 
本发明的方法可以包括给个体施用BER抑制剂，例如PARP抑制剂。这可以发生在将该个体鉴定为患有HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症疾病之后。 
尽管可以单独施用活性化合物，优选将其与一种或多种可药用载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲液、稳定剂、防腐剂、润滑剂或其它本领域技术人员熟知的材料及任选的其它治疗或预防剂一起，作为包含至少一种如上定义的活性化合物的药物组合物提供。 
在此描述的方法中，可使用包含如上定义的碱基切除修复抑制剂的药物组合物(例如与一种或多种在此所述的可药用载体、赋形剂、缓冲液、佐剂、稳定剂或其它材料混合的抑制剂)。 
在此所用的术语“可药用的”指在合理的医学判断范围内适用于接触受试者(例如人类)组织，而没有过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，具有相当的利益/危险比的化合物、材料、组合物和/或剂型。各载体、赋形剂等在与制剂的其它成分相容方面也必须是可接受的。 
合适的载体、赋形剂等可见于标准制药学教科书中，例如《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第18版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，1990。 
可以以单位剂型方便地提供该制剂，并优选通过制药领域熟知的任何方法制备该制剂。这类方法包括将活性化合物与组成一种或多种辅助成分 的载体联合的步骤。通常，将活性化合物与液体载体或精细分割的固体载体或二者均一并密切联合，从而制备制剂，然后如果需要的话使产品成形。 
制剂可以是液体、溶液、悬液、乳剂、酏剂、糖浆、片剂、锭剂、颗粒、粉末、胶囊、扁囊剂、丸剂、安瓿剂、栓剂、阴道栓剂、软膏剂、凝胶、糊剂、霜剂、喷雾、合剂、泡沫、洗液、油、大丸剂、药糖剂或气雾剂形式。 
无论全身/外周或在所需作用位点，可以通过任何方便的施用途径给受试者施用BER抑制剂或包含该抑制剂的药物组合物，包括但是不限于经口(例如通过摄取)；局部(包括例如经皮肤、鼻内、眼、口腔和舌下腺)；肺(例如通过使用例如气雾剂经口或鼻吸入或喷洒)；直肠；阴道；胃肠外(例如注射，包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内、动脉内、心内、鞘内、脊柱内、囊内、囊下、眼内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下、和胸内)；例如皮下或肌肉内置入贮库制剂。 
可以以不连续单位(例如胶囊、扁囊剂或片剂，每个含有预定量的活性化合物)；以粉末或颗粒；以水性或非水性液体中的溶液或悬液；或以水包油液体乳剂或油包水液体乳剂；以丸药；以药糖剂；或以糊剂提供适用于经口施用(例如通过摄取)的制剂。 
可以通过常规方法制备片剂，例如任选地以一种或多种辅助成分压缩或塑型。可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式的活性化合物(例如粉末或颗粒)而制备压缩片剂，所述活性化合物任选地与一种或多种粘合剂(例如聚乙烯吡咯酮、明胶、阿拉伯树胶、山梨糖醇、黄芪胶、羟基丙基甲基纤维素)；填充剂或稀释剂(例如乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、云母、硅石)；分解质(例如羟乙酸淀粉钠、交联聚乙烯吡咯酮、交联羧甲基纤维素钠)；表面活性或分散或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)；及防腐剂(例如甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、山梨酸)混合。可以通过在合适的机器中将以惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物混合物塑型而制备为成型片剂。可以任选地将片剂包被或刻痕，并可以经过配制而提供其中所采用的活性化合物的缓慢或受控释 放，例如不同比例的羟基丙基甲基纤维素提供所需的释放特征。可以任选地提供具有肠衣的片剂，以供在除胃之外的部分肠内释放。 
适于胃肠外(例如注射，包括表皮、皮下、肌肉内、静脉内和皮内)投药的制剂包括水性或非水性的等张、无热原、无菌注射溶液，可以含有抗氧化剂、缓冲液、防腐剂、稳定剂、抑菌剂和使该制剂与目标受试者血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬液，可以包含悬浮剂和增稠剂、以及经过设计将化合物靶向血液成分或一个或多个器官的脂质体或其它微颗粒体系。适用于这类制剂的等张载体的实例包括氯化钠注射剂、林格溶液或乳酸岩林格注射剂。一般而言，溶液中活性化合物的浓度约1ng/ml至约10μg/ml，例如约10ng/ml至约1μg/ml。可以以单位剂量或多剂密封容器(例如安瓿和小瓶)提供制剂，并可以在冰冻干燥(冻干)的条件下保存，仅需在临用前加入无菌的液体载体(例如注射用水)。可以从无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液。制剂可以是经过设计将化合物靶向血液成分或一个或多个器官的脂质体或其它微颗粒体系。 
应当理解，活性化合物及包含该活性化合物的组合物的合适剂量在患者与患者之间可以不同。确定最佳剂量一般涉及将本发明的治疗受益水平与治疗的任何危险或毒副作用平衡。所选的剂量水平将依赖于许多因素，包括但是不限于特定化合物的活性、施用途径、施用时间、化合物的排泄速率、治疗持续时间、组合使用的其它药物、化合物、和/或材料、以及患者的年龄、性别、体重、病症、综合健康状况及既往病史。尽管通常用量将在作用位点达到事先所需效果而不引起实质性的有害或毒副作用的局部浓度，化合物的量和给药途径最终将由医师决定。 
包含BER途径抑制剂的组合物可以与损伤癌细胞DNA的标准化学治疗方案组合用于在此所述的方法中。合适的制剂可以包含拓扑异构酶I和II活性的抑制剂(例如喜树碱)、药物(例如伊立替康、拓扑替康和卢比替康)、烷化剂(例如替莫唑胺和DTIC(氮烯唑胺)和铂剂(例如顺铂、顺铂-阿霉素-环磷酰胺、卡铂、及卡铂-紫杉醇)。 
其它合适的化学治疗剂包括阿霉素-环磷酰胺、卡培他滨、环磷酰胺- 氨基蝶呤-5-氟尿嘧啶、多西他奇、5-氟尿嘧啶-表柔比星-环磷酰胺、紫杉醇、长春瑞滨、鬼臼乙叉甙、二乙醇化脂质体(pegylated liposomal)阿霉素和拓扑替康。 
使用这类试剂治疗个体在本领域广为人知。 
在治疗过程中可以连续或间断(例如以适当间隔分开的剂量)地以一剂实现体内施用。确定最有效的施用手段和剂量的方法为本领域技术人员所熟知，并且将随着用于治疗的制剂、治疗目的、治疗的靶细胞和治疗的受试者而变化。可以采用治疗医师所选的剂量水平和模式进行单次或多次施用。 
一般而言，活性化合物的合适剂量在每日每公斤受试者体重约100μg至约250mg的范围内。当活性化合物为盐、酯、前药等时，以母体化合物为基础计算施用量，因此使用的实际重量相应增加。 
本发明的方法也可用于在个体中调查和评估癌症疾病。 
评估癌症疾病中HR依赖的DNA DSB修复途径活性的方法可以包括：将碱基切除修复抑制剂与从患有该疾病的个体获得的癌细胞样品接触，并测定该样品中相对于对照样品的细胞死亡数量。 
相对于具有正常水平的HR依赖的DNA DSB修复活性的对照细胞，样品中细胞死亡增加，表示癌症是HR依赖的DNA DSB修复依赖的。 
个体可能患有癌症疾病，且样品可以是来自例如肿瘤活检组织的癌细胞样品。 
在优选的实施方案中，碱基切除修复抑制剂是PARP抑制剂。评估癌症疾病中HR依赖的DNA DSB修复的方法因此可以包括：将PARP抑制剂与从患有癌症疾病的个体获得的癌细胞样品接触，并测定该样品中相对于对照样品的细胞死亡数量。 
相对于对照细胞，样品细胞中PARP抑制剂的敏感性增加，表示该癌症是HR依赖的DNA DSB修复活性缺陷的。 
对PARP抑制剂敏感性的增加可能表示癌细胞具有BRCA1或BRCA2缺陷表型，例如BRCA1或BRCA2表达或活性的降低或废除。 
鉴定为HR依赖的DNA DSB修复活性缺陷的癌症疾病(例如具有BRCA1或BRCA2缺陷表型的疾病)可以经特异性针对这类疾病的治疗。合适的治疗可以包括使用DNA交联剂，例如丝裂霉素C、顺铂或卡铂。 
可以使用一些方法预测个体中癌症疾病对靶向HR的治疗(例如对具有BRCA1或BRCA2缺陷表型的癌症的特异性治疗)的反应。 
预测个体中癌症疾病对靶向HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症治疗的反应的方法可以包括：将BER抑制剂(例如PARP抑制剂)与从患有癌症疾病的个体获得的癌细胞样品接触，并测定该样品中相对于对照样品的细胞死亡数量。 
相对于具有正常水平的HR依赖的DNA DSB修复活性的对照细胞，样品中细胞死亡增加(即对PARP抑制剂的敏感性增加)，表示癌症可能对该治疗反应。 
靶向HR依赖的DNA DSB修复依赖的癌症(例如BRCA1或BRCA2缺陷的癌症)治疗剂可以包括DNA交联剂，例如环磷酰胺、顺铂或卡铂。 
本发明的其它方面涉及HR依赖的DNA DSB修复抑制剂在碱基切除修复缺陷的癌症治疗中的用途。 
治疗个体碱基切除修复缺陷的癌症的方法可以包括：给该个体施用HR依赖的DNA DSB修复途径抑制剂。 
HR依赖的DNA DSB修复抑制剂可以用于制造治疗个体中癌症的药物，其中所述癌症是碱基切除修复缺陷的。 
HR依赖的DNA DSB修复抑制剂可以包括一种或多种上述途径组分的抑制剂。合适的抑制剂包括ATM抑制剂。 
ATM抑制剂可以是例如具有通式I： 
Figure BDA0000046137430000191
的化合物或其异构体、盐、溶液、化学保护形式或前药，其中： 
Y是O或S； 
R1和R2独立地是氢、任意取代的C1-7烷基、C3-20杂环基、或C5-20芳基，或可以与其连接的氮原子一起，形成任意取代的、具有4至8个环原子的杂环；且 
R3是通过醚或硫醚桥与任意取代的C5-20芳基羰基(carboaryl)连接的苯基，该苯基通过另一个桥基与任意取代的C5-20芳基羰基任意连接，该连接在两个基团上都毗邻醚或硫醚桥，从而形成与苯基和C5-20芳基羰基稠合的任意取代的含氧或硫C5-7杂环，其中苯基另外被任意取代。 
在WO03/070726中更为详细地描述了这类抑制剂。 
其它抑制剂包括HR依赖的DNA DSB修复组分的肽基片段和上述编码核酸。 
可以使用上述方法将癌症疾病鉴定为BER活性缺陷的。 
参考下述附图和实验范例作为实例且不为限制，现在对本发明的诸方面进行说明。其它方面和实施方案对本领域技术人员显而易见。 
上文陈述了本发明的多个参数和特征。为了避免疑问，声明本发明包括这些参数和特征的所有组合和次级组合(sub-combinations)。 
在本说明书中提及的所有文件在此引用作为参考。 
图1显示降低Parp1水平减少了BRCA1和BRCA2突变体细胞相对于野生型细胞的生存力。 
图2显示PARP抑制剂KU0058684、KU0058948和KU0051529及其针对PARP-1酶活性的IC50。 
图3和4显示暴露于PARP抑制剂的细胞的克隆存活曲线(clonogenicsurvival curves)。 
图3显示持续暴露于PARP抑制剂(KU0058684，上；KU0058948，中；KU0051529，下)的Brca1野生型(11CO：■)、杂合体(Cre6：▲)和缺陷型(Cre10：●)ES细胞。误差棒代表平均标准差。 
图4显示持续暴露于PARP抑制剂(KU0058684，上；KU0058948， 中；KU0051529，下)的Brca2野生型(D3：■)、杂合体(Cre6：▲)和缺陷型(Cre24：●)ES细胞。误差棒代表平均标准差。 
图5和6显示计时暴露于KU0058684下1、4和24小时后的克隆存活曲线。 
图5显示计时暴露于KU0058684下1(上)、4(中)和24小时(右)后的Brca1野生型(11CO：■)、杂合体(Cre6：▲)和缺陷型(Cre10：●)ES细胞。误差棒代表平均标准差。 
图6显示计时暴露于KU0058684下1(上)、4(中)和24小时(右)后的Brca2野生型野生型(D3：■)、杂合体(Cre6：▲)和缺陷型(Cre24：●)ES细胞。误差棒代表平均标准差。 
图7和8显示经PARP抑制剂处理的BRCA-1和BRCA-2突变体细胞中PARP抑制导致增强的G2/M停滞。 
图7显示以0nM(左)、10nM(中)或1μM(右)KU0058684处理24小时、并经FACS分析的Brca1野生型(11CO：上)和突变(Cre10：下)细胞。 
图8显示以0nM(左)、10nM(中)或1μM(右)KU0058684处理24小时、并经FACS分析的Brca2野生型(D3)和突变(Cre24)细胞。 
图9显示在野生型细胞内但非Brca1或Brca2缺陷细胞内由PARP抑制诱导Rad51聚集点形成的定量分析。 
图10显示BRCA2-/-VC8和BRCA2互补的VC8-BAC的中性彗星分析(neutral comet analysis)。通过BRCA2-/-细胞中的尾素增加、而BRCA2互补细胞系中没有观察到尾素显著增加，而判断KU0058684(1μM)处理30小时诱导DNA DSB的显著增加。以+/-SEM表示3个独立实验的平均数据，在各实验中对50个彗星进行尾素评分。 
图11显示PARP对BRCA1和BRCA2突变体细胞的选择性抑制作用的可能模式。 
图12和13显示ES细胞的磷酸化组蛋白H3FACS数据。 
图12显示Brca1野生型(11CO：上)和突变体(Cre10：)ES细 胞及Brca2野生型(D3)和突变体(Cre24)细胞的磷酸化组蛋白H3FACS数据，所述细胞以0nM(左)、10nM(中)或1μM(右)KU0058684处理24小时并经FACS分析。 
图13显示以0μM、100μM、1nM和10nM(分别从左至右)KU0058684处理24小时的VC8和VC8BAC细胞的磷酸化组蛋白H3FACS。 
图14和15显示PARP在其它缺乏BRCA1和BRCA2功能的细胞中的抑制作用分析。 
图14显示持续暴露于PARP抑制剂(KU0058684，上；KU0058948，中；KU0051529，下)的Brca2缺陷型(V-C8：■)和互补型(V-C8BAC+：▲)细胞的克隆存活曲线。 
图15显示计时暴露于KU00586841小时(上)、4小时(中)和24小时(下)后的Brca2缺陷型V-C8：■)和互补型(V-C8BAC+：▲)细胞的克隆存活曲线。误差棒代表平均标准差。 
图16显示ES异种移植物中的肿瘤形成以及KU0058684的治疗效果；点线-含有载体的野生型；加粗实线-含有药物KU0058684的野生型；实线-含有载体的Brca2缺陷型，虚线-含有KU0058684的Brca2缺陷型。 
图17显示持续暴露于一定浓度范围PARP抑制剂KU0058684下12-14天的BRCA1野生型(MCF7-混杂的(scrambled))和BRCA1沉默(MCF7-3.23)细胞的克隆存活曲线。将抑制剂的对数浓度对细胞的对数存活级分作图。误差棒代表平均标准差。 
图18显示持续暴露于一定浓度范围PARP抑制剂KU0051529下12-14天的BRCA1野生型(MCF7-混杂的)和BRCA1沉默(MCF7-3.23)细胞的克隆存活曲线。将抑制剂的对数浓度对细胞的对数存活级分作图。误差棒代表平均标准差。 
实施例
材料和方法
RNA干涉 
产生表达下列RNAi靶序列的基因特异性pSUPER(T.R.Brummelkamp等，Science 296，550-3(2002))构建体：(i)小鼠Parp15’-GCGGAGUACGCCAAGUCCA-3’，(ii)混杂的对照5’-CAUGCCUGAUCCGCUAGUC-3’。 
从pECFP-Mito(Invitrogen)将含有CMV IE启动子和eCFP(强化青色荧光蛋白)的1.6kb片段克隆到得到的pSUPER构建体SapI位点，产生pSUPER-eCFP-Parp1和pSUPER-eCFP-对照。根据厂商指示使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用这些质粒转染D3ES细胞。转染后四十八小时，使用缓冲液产生全细胞裂解物，所述缓冲液由20mM Tris(pH 8)、200mM NaCl、1mM EDTA、0.5％NP40、10％甘油和蛋白酶抑制剂组成。在Bis-Tris Acetate Acrylamide Pre Cast Gels(Novex)上电泳30μg各裂解物，并印迹到Trans-Blot Nitrocellulose(Biorad)上。以兔多克隆抗PARP-1抗体(Cell Signalling，目录号9542)或兔抗GFP/CFP抗血清(Invitrogen，目录号R970-01)探测斑点，继之使用抗兔IgG-HRP进行第二抗体杂交，随后使用ECLTM(Amersham，UK)化学发光检测。 
PARP的小分子抑制剂： 
如WO02/36576所述合成PARP抑制剂。将化学抑制剂以10mM溶解于DMSO中，并于-20℃避光保存。 
细胞系 
在M.Kraakman-van der Zwet等，Mol Cell Biol 22，669-79(2002)中描述了VC8细胞和小鼠Brca2 BAC互补衍生物(complementedderivatives)。Brca2功能缺陷的ES细胞以前已有描述(Tutt等，(2002)EMBO Rep 3，255-60)。Brca1缺陷的ES细胞的构建将在别处描述，但以前已得到确认(Foray等，(2003)EMBO J 222860-71)。以pSUPERBRCA1 RNAi质粒转染HBL100细胞，并以遗传霉素选择3周。根据RNA印迹分析，基于克隆的BRCA1表达选择克隆。 
克隆形成测定(Clonogenic Assays) 
为了测量对Parp1 RNA敲除的敏感性，使用pSUPER-eCFP-Parp1 或pSUPER-eCFP-对照，与表达杀稻瘟菌素抗生素抗性的载体(pEF-Bsd，Invitrogen)一起如上转染ES细胞，所述ES细胞保持在以0.1％明胶包被的组织培养皿上。转染后24小时，以胰蛋白酶作用于细胞并接种在6孔板中。转染后48小时，开始以杀稻瘟菌素处理，并且每三天重复饲养细胞。10-14天后，将细胞以PBS清洗、固定于甲醇中、并且以结晶紫染色。计数含有约50个细胞以上的克隆。 
为了测量对化学抑制剂的敏感性，以胰蛋白酶作用于指数生长中的细胞培养物，并以不同密度接种于6孔板中经丝裂霉素C失活的小鼠胚胎成纤维细胞上，18小时后以抑制剂适当处理。对于持续暴露，每四天以新鲜培养基和抑制剂重复饲养细胞。对于计时暴露，加入抑制剂持续特定时期后，清洗细胞并以新鲜培养基重复饲养。10-14天后，将细胞以PBS清洗、固定于甲醇中、并且以结晶紫染色。计数含有约50个细胞以上的克隆。实验至少以一式三份进行三次。 
FACS分析 
对于DNA含量测量，将细胞固定于70％乙醇中，与RNA酶A和碘化丙啶(PI)孵育，并以FACS Calibur(Becton Dickinson)分析。对于磷酸化组蛋白H3分析，将细胞固定于70％乙醇中，以0.25％triton X-100透化，与抗磷酸化组蛋白H3抗体(Upstate Biotechnology)孵育3小时，然后以FITC-抗兔IgG(Serotec)孵育30分钟。FACS分析方法如上。 
凋亡分析 
以胰蛋白酶作用于细胞，保留培养物上清液和清洗培养基。合并培养物上清液和清洗培养，并且在将细胞以1×106细胞/ml悬浮于结合缓冲液(10mM HEPES、140mM NaCl、2.5mM CaCl2(pH7.4))之前以冰冷的PBS清洗。将100μl悬液与5μl Annexin V-FITC(BD Biosciences)/0.1μg碘化丙啶于室温避光孵育15分钟，加入400μl结合缓冲液并立即在FACSCalibur(BD Biosciences)上分析。 
Rad 51聚集点形成 
在不同浓度的PARP抑制剂中将ES细胞培养48小时，固定于4％多 聚甲醛的PBS溶液中，并以0.2％Triton X-100的PBS溶液透化。将细胞以1∶100稀释的兔抗Rad 51多克隆抗体(Ab 551922，BD-Pharmingen，Oxford，UK)染色。清洗后，以Alexa Fluor-555山羊抗兔IgG(Alexa)对第一抗体显像，并以TO-PRO-3碘化物(Molecular Probes)对核显像。使用Leica TCS-SP2共聚焦显微镜显示Rad51聚集点并定量。 
彗星测定法 
以1μM KU0058684处理30小时之前24小时接种VC8和VC8-BAC细胞。其它所有工作均避光进行。按照说明(Lemay和Wood，1999)进行彗星分析之前，将细胞以PBS清洗并刮到PBS中。把悬浮于LMP琼脂糖(0.5％的PBS溶液)的细胞涂布于彗星载玻片(Trevigen，Gaithersburg)上，并在2.5M NaCl、100mM EDTA、10mM Tris碱、1％十二烷基肌氨酸钠、0.01％Triton X-100中裂解45分钟之前置于4℃直至处理。于18V电泳15分钟之前将载玻片转移到TBE中持续5分钟。然后将载玻片于100％乙醇中固定5分钟，并在添加SYBR绿色染料并使用荧光滤波片(Nikon)以表面荧光显像之前空气干燥。使用Nikon提供的Lucia G成像包的Comet软件模件分析彗星。对三个独立实验各检查每个数据点50个彗星，并计算平均尾素。 
有丝分裂染色体分析 
将ES细胞接种到明胶上，以化学抑制剂处理24小时，继之以秋水仙酰胺处理1小时。在显微镜下进行染色体分析之前，将细胞收获、固定并滴在载玻片上，干燥细胞并以DAPI染色。 
ES细胞异种移植物以及KU0058684治疗 
将2×108个ES细胞皮下注射到6-8周无胸腺BALB/c裸鼠(nu/nu)中产生ES细胞衍生的肿瘤(畸胎瘤)。以Brca2缺陷的ES细胞注射20只小鼠，并以等基因野生型细胞注射相同的一组。细胞注射后2天，开始以KU0058684或载体治疗。连续三天间隔六小时腹膜内施用两剂KU0058684(或载体)，每剂剂量为15mg/kg动物。停止治疗五天，然后重新开始(如前)另外三个连续工作日。从0.3cm3最小体积开始监控肿瘤生长。图16 中的数据代表总共包括40只动物的两个独立实验。 
产生BRCA1缺陷的细胞系 
通过以基因特异性pSUPER构建体稳定转染MCF7哺乳动物腺癌细胞，产生混杂的MCF7和MCF7-3.23细胞系。产生表达下列RNAi靶序列的基因特异性pSUPER构建体：(i)人BRCA15’-GGAACCTGTCTCCACAAAG-3’，(ii)混杂的对照5’-CATGCCTGATCCGCTAGTC-3’。从pEFBsd(Invitrogen)将含有人EFla启动子和杀稻瘟菌素抗性基因(bsd)的1.8kb片段克隆到产生的pSUPER构建体SapI位点，产生pSUPER-Bsd-BRCA1和pSUPER-Bsd-混杂。根据厂商指示使用FuGene6(Roche)以这些质粒转染MCF7细胞。在杀稻瘟菌素中选择之后，通过实时PCR对抗性克隆评估BRCA1mRNA的沉默(Egawa等，Oncology.2001；61(4)：293-8；Egawa等，Int J Cancer.2001 Jul 20；95(4)：255-9)。(在杀稻瘟菌素选择下)将BRCA1mRNA水平降低的克隆培养8代以上，并重复实时测定。经显示，与含有构建体pSUPER-Bsd-混杂的MCF7克隆相比，细胞系MCF7-3.23仅有30％的BRCA1表达。 
结果
由siRNA引起的Parp1蛋白质水平降低 
将在H1启动子下表达Parp1特异性siRNA(T.R.Brummel kamp等，Science 296，550-3(2002))并在CMV IE启动子下表达强化青色荧光蛋白(eCFP)的质粒(pSUPER-eCFP-Parp1)转染到D3小鼠胚胎干细胞中。作为对照，单独转染表达无关混杂的siRNA的质粒pSUPER-eCFP-对照。转染后四十八小时，制备细胞裂解物并以蛋白质印迹分析。以多克隆抗PARP-1抗体或抗GFP/CFP抗血清探查斑点。 
观察到Parp1特异性siRNA表达细胞中的PARP1水平大大低于对照细胞中的PARP1水平。Parp1siRNA表达细胞征中的eCFP水平与对照细胞中的相似。 
Parp1特异性siRNA敲除后BRCA1和BRCA2缺陷细胞生存力降低 
将pSUPER-eCFP-Parp1或pSUPER-eCFP-对照与杀稻瘟菌素抗性编码质粒pEF-Bsd一起，以10∶1的比例转染野生型、Brca1-/-和Brca2-/-小鼠胚胎干细胞(ES)。选择杀稻瘟菌素抗性克隆并定量。结果显示于图1中，以pSUPER-eCFP-Parp1转染后的集落数相对于pSUPER-eCFP-对照转染后的数量作图。误差棒等于一个平均标准差。 
使用对照siRNA校准转染效率后，显而易见，parp1表达受抑制时，Brca1和Brca2缺陷ES细胞的存活都大大降低。 
使用化学PARP抑制剂后BRCA1和BRCA2缺陷细胞生存力降低 
采用Parp活性的化学抑制剂证实上面观察到的Brca1和Brca2缺陷细胞的选择性抑制。使用两种不同的PARP抑制剂KU0058684、KU0058948和化学相关的弱活性化合物KU0051529(图2)。这些新的PARP抑制剂基于2，3-二氮杂萘-1-酮核心，并且是PARP底物NAD+的竞争性抑制剂。KU0058684和KU0058948是蛋白质PARP-1和PARP-2聚ADP核糖聚合酶活性的有效且特异的抑制剂，并且在上至1μtM的浓度不抑制vaultPARP、端锚聚合酶或PARP-3。相反，尽管化学相关，KU0051529对这些酶的抑制效率约低250倍。 
使用KU0058684、KU0058948和KU0051529探查Brca1或Brca2缺陷细胞对PARP活性抑制的敏感性。克隆形成测定显示，与其它等基因细胞相比，Brca1和Brca2缺陷细胞系均对KU0058684和KU0058948极度敏感(图3、4)。KU0058684的SF50(50％的细胞存活的剂量)对于Brca1为3.5×10-8M，对于Brca2为1.5×10-8M；对于野生型细胞，SF50约为3.5×10-8M。这代表与野生型相比，对Brca1和Brca2突变体细胞分别为57倍和133倍增强的敏感性因子。以Brca2缺陷的中国仓鼠卵巢细胞获得类似结果，该结果显示与Brca2互补的衍生细胞相比增强大于1000倍的敏感性(图14和15)。Brca1和Brca2突变体细胞对KU0058948的敏感性甚至高于KU0058684。相反，与野生型细胞相比，KU0051529对缺乏野生型Brca1或Brca2的细胞没有选择作用。结合siRNA数据，这证实敏感性的机制特异性经由PARP抑制。值得一提的是，该抑制剂中无一对Brca1 或Brca2突变杂合体细胞具有任何选择作用。 
KU0058684对Brca1和Brca2缺陷细胞克隆生存影响的时程依赖性 
将细胞于不同浓度的KU0058684下暴露确定时期。然后去除抑制剂，并使用克隆形成测定法测量影响。相对较短的暴露时间(4小时)后，KU0058684对克隆生长的抑制作用明显，并且在24小时暴露下基本完全(图5和6)。由于短期暴露之后10-14天不存在该抑制剂仍然阻止生长，因此PARP的抑制作用是不可逆的。 
PARP抑制对细胞周期停滞的影响 
使用FACS分析确定PARP抑制是否导致细胞周期停滞。将细胞以KU0058684暴露不同时期，然后以BrdU标记细胞周期各期中的细胞比例。结果显示于图7和8。观察到KU0058684引起具有四倍体DNA含量的细胞的完全停滞，说明停滞于细胞周期的G2或M期。为了进一步表征所述停滞，分析细胞DNA含量和磷酸化组蛋白H3(M期标志)(图12和13)。大多数停滞的细胞没有被抗磷酸化组蛋白H3抗体标记，说明大多数细胞被停滞于G2。 
Rad51聚集点形成 
Brca依赖的双链断裂修复的一个特征是在含有Rad51的核中形成聚集点。研究KU0058684在野生型及Brca1和Brca2缺陷细胞中引起Rad51聚集点的能力。 
将野生型及Brca1和Brca2缺陷的ES细胞在不同浓度的KU0058684中暴露48小时。然后如Tarsounas所述固定细胞并对RAD51染色(Tarsounas M等，Oncogene.200322(8)：1115-23)。 
在野生型ES细胞中，KU0058684以剂量依赖的方式引起Rad51聚集点形成(图9)。相反，在Brca1或Brca2缺陷细胞中没有诱导聚集点。后一发现与之前观察到DNA损伤剂不能在Brca1或Brca2缺陷细胞中引起聚集点的形成一致。 
因此显示KU0058684诱导损伤(例如双链DNA断裂)或退化为双链DNA断裂的损伤，所述损伤由包含Rad51的复合物修复并需要Brca1和 Brca2。重要的是，KU0051529在相当的剂量并不诱导Rad51聚集点形成，强调了致敏机制的特异性。 
彗星测定法 
为了确定PARP活性的抑制是否导致DNA双链断裂的产生，对Brca2突变体细胞及其等基因对应物进行中性彗星测定。结果显示于图10中。于1μM KU0058684中暴露30分钟后，Brca2缺陷的VC8细胞的尾素增加4.7倍，而互补的VC8-BAC细胞系中尾素没有显著增加。该结果显示由PARPi诱导的DNA双链断裂在Brca2缺陷细胞中不可修复。 
有丝分离染色体分析 
Brca1和Brca2缺陷细胞的有丝分离染色体检查显示，KU0058684处理导致频繁的重大畸变。这些畸变包括染色单体断裂及三辐和四辐染色体。这些表型表示通过姐妹染色单体基因转换来修复双链断裂的失败以及交互(alternative)易错途径使用的增加。 
ES细胞异种移植及KU0058684治疗 
如上所述，在无胸腺BALB/c裸鼠(nu/nu)中产生等基因和Brca2缺陷ES细胞衍生的肿瘤(畸胎瘤)。 
测量KU0058684对野生型和Brca2缺陷异种移植肿瘤生长的作用，结果显示于图16。 
相对于野生型肿瘤，观察到KU0058684显著地降低Brca2缺陷肿瘤的生长。 
PARP抑制剂对BRCA1细胞缺陷系的作用 
如上所述产生混杂的MCF7和MCF7-3.23细胞系。发现MCF7-3.23的BRCA1表达为混杂的MCF7的30％。 
以KU0058684和KU0051529处理混杂的MCF7和MCF7-3.23细胞，并测定细胞存活(图17和18)。KU0058684是有力的PARP抑制剂而KU0051529却是低效的。 
混杂的MCF7或MCF7-3.23均未对KU0051529展示显著的敏感性(图18)。然而，两个细胞系对KU0058684均敏感。 
显示MCF7-3.23细胞比混杂的MCF7细胞对KU0058684更为灵敏。PARP与HR依赖的DNA DSB途径的相互作用 
不对本发明范围进行任何限制，图11中显示了PARP与HR依赖的DNA DSB途径之间相互作用的一种可能模式。 
由于氧化损伤及DNA修复，形成DNA单链断裂(SSB)。Parp-1PAR聚合酶活性的抑制阻止了XRCC1支架蛋白的招募及随后由DNA聚合酶添补SSB缺口(图11A)。 
大量SSB持续存在并遭遇DNA复制叉。SSB处模板链的缺失导致DSB，并依赖于位置可能引起复制叉的瓦解(图11B)。 
未损伤姐妹染色单体模板的接近使得由RAD51覆盖的单链DNA丝侵入该姐妹染色单体并开始姐妹染色单体重组修复。该过程依赖于BRCA1和BRCA2，并且与形成多个RAD51核聚集点有关。可以通过类似的机制重新开始瓦解的复制叉(图11C)。 
当重组介质的Holliday连接体溶解时，可以发生姐妹染色单体交换(SCE)。Parp-1抑制期间复制叉遭遇的过量SSB导致SCE增加(图11D)。 
不存在功能性BRCA1或BRCA2时，RAD51聚集点形成及姐妹染色单体重组严重受损。DNA复制期间过量的未修复SSB形成DNA DSB，但是不出现姐妹染色单体重组。它们由于染色单体断裂而保持未修复，或通过独立的易错RAD51机制得到修复，所述机制引起复杂的染色体重排。当这些细胞遭遇G2/M DNA损伤关卡时，它们停滞并永远停滞或凋亡(图11E)。 
在此提供的RNAi数据以及KU0051529低效的观察，证实PARP抑制是形成观察到的致敏作用的原因。 
PARP抑制诱导通常由姐妹染色单体交换(SCE)修复的损伤(WangZQ等，(1997)Genes Dev.卷11(18)：2347-58，以及《From DNA damageand stress signalling to cell death》，G.de Murcia和S.Shall编，OxfordUniversity Press(2000))。已知PARP抑制增加SCE，而不伴随DSB基因转换的增加，因此没有Rad51依赖的重组途径的全面增加(Schultz N 等，2003，Nucleic Acids Research；31(17)：4959-4964)。 
在此描述的人工致死途径可用于治疗a)BRCA携带者的肿瘤，b)HR依赖的DNA DSB修复的其它组分缺陷的肿瘤。 
尽管关于BRCA突变携带者发作年龄和肿瘤病理学的描述有差异，目前的治疗与散发疾病患者相同。本发明为在此描述的这些肿瘤提供了新的治疗方法。 
值得注意的是，没有观察到杂合的作用。对于所述方法在HR依赖的DNA DSB修复途径突变(包括例如BRCA1/2突变)杂合携带者中的治疗用途，这一点非常重要。 
Figure IDA0000046137480000011
Figure IDA0000046137480000021

Claims (18)

1.聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂在制备在治疗个体癌症的方法中使用的药物中的用途，其中所述癌症是HR依赖的DNA DSB修复途径缺陷的，
其中所述PARP抑制剂选自：
尼克酰胺类；
苯甲酰胺类，选自：3-羟基苯甲酰胺、3-亚硝基苯甲酰胺、3-甲氧基苯甲酰胺和3-氯普鲁卡因胺、4-氨基苯甲酰胺、1,5-二[(3-氨甲酰基苯基)氨基羰基氧基]戊烷；
异喹啉酮类；
二氢异喹啉酮类；
苯并咪唑类或吲哚类，选自：苯并
Figure FDA00002581363400011
唑-4-甲酰胺类、2-环烷基苯并咪唑-4-甲酰胺类、喹喔啉甲酰胺类、咪唑并吡啶甲酰胺类、2-苯基吲哚类、2-取代的苯并
Figure FDA00002581363400012
唑类、2-取代的苯并咪唑类、1,3,4,5-四氢-氮杂
Figure FDA00002581363400013
并[5,4,3-cd]吲哚-6-酮、氮杂
Figure FDA00002581363400014
并吲哚类、氮杂
Figure FDA00002581363400015
并吲哚酮类、3-取代的二氢二氮杂
Figure FDA00002581363400016
并吲哚满酮类、四氢二氮杂
Figure FDA00002581363400017
并吲哚满酮、5,6-二氢咪唑并[4,5,1-j,k][1,4]]苯并二氮杂
Figure FDA00002581363400018
-7(4H)–酮、2-苯基-5,6-二氢咪唑并[4,5,1-jk][1,4]苯并二氮杂
Figure FDA00002581363400019
-7(4H)–酮和2,3-二氢异吲哚-1-酮；
2,3-二氮杂萘酮类；
喹唑啉酮类，选自：4-羟基喹唑啉和2-取代的喹唑啉类；
异吲哚啉酮类；
菲啶类；
菲啶酮类，选自：取代的5[H]菲啶-6-酮类、噻吩并[2,3-c]异喹诺酮类、N-[6-氧代-5,6-二氢菲啶-2-基]-2-[N,N-二甲基氨基]乙酰胺、取代的4,9-二氢环戊烷并[lmn]菲啶-5-酮类；
苯并吡喃酮类；
不饱和羟肟酸衍生物；
哒嗪类；
咖啡因；茶碱和胸苷。
2.根据权利要求1的用途，其中所述癌症包含一种或多种癌细胞，所述癌细胞通过HR修复DNA DSB的能力相对于正常细胞降低或丧失。
3.权利要求1的用途，其中所述方法包括步骤：将个体的癌症疾病鉴定为HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症。
4.权利要求3的用途，其中，通过相对于正常细胞而确定来自个体的癌细胞的HR依赖的DNA DSB修复活性，将所述癌症鉴定为HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症。
5.根据权利要求4的用途，其中通过测量应答DNA损伤剂或PARP抑制剂在细胞核中含Rad51灶的形成，确定癌细胞中HR依赖的DNA DSB修复途径的活性。
6.根据权利要求3的用途，其中通过相对于正常细胞而确定来自个体的癌细胞中HR依赖的DNA DSB修复途径的一种或多种组分的活性，将所述癌症鉴定为HR依赖的DNA DSB修复缺陷的癌症。
7.根据权利要求3的用途，其中通过确定在来自个体的癌细胞中编码HR依赖的DNA DSB修复途径组分的核酸序列中一个或多个突变或多态性的存在，将所述癌症鉴定为HR依赖的DSB修复缺陷的癌症。
8.根据权利要求7的用途，其中所述一个或多个突变或多态性导致该HR依赖的DNA DSB修复途径的组分的功能降低或丧失。
9.根据权利要求7的用途，其中所述一个或多个突变或多态性导致该HR依赖的DNA DSB修复途径的组分的表达降低或丧失。
10.根据权利要求1-9之任一项的用途，其中所述癌细胞具有BRCA1或BRCA2缺陷表型。
11.根据权利要求10的用途，其中所述癌细胞是BRCA1或BRCA2缺陷的。
12.根据权利要求11的用途，其中所述癌细胞是BRCA1或BRCA2突变纯合的。
13.根据权利要求1至9中任一项的用途，其中所述个体是编码HR依赖的DNA DSB修复途径组分的基因的突变杂合体。
14.根据权利要求13的用途，其中所述个体是BRCA1和/或BRCA2中的突变的杂合体。
15.根据前述权利要求1至9之任一项的用途，其中所述癌症是乳腺、卵巢、胰腺或前列腺癌。
16.根据前述权利要求1至9之任一项的用途，其中所述PARP抑制剂是2,3-二氮杂萘-l(2H)-酮。
17.根据权利要求1-9之任一项的用途，其中所述药物还包含损伤DNA的化学治疗剂。
18.根据权利要求1-9之任一项的用途，其中所述治疗还包括施用损伤DNA的化学治疗剂。
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