NO335959B1 - Anvendelse av poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) inhibitorer for fremstilling av et medikament for anvendelse i behandling av cancer og fremgangsmåte for å fastslå aktiviteten av den HR-avhengig DNA DSB reparasjonsveien i en cancertilstand og fremgangsmåte for å fastslå responsen av en cancertilstand i et individ. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelsen vedrører induksjonen av cellulær dødelighet i cancerceller, spesielt cancerc eller som mangler homolog rekombinasjon (HR) avhengig DNA dobbeltråd brudd (DSB) reparasjon.

Den effektive reparasjonen av DNA-skade i celler baserer seg på mekanismer for å føle skade etterfulgt av transduksjonen av skadesignaler til nedstrøms effektorer som arresterer ved cellesyklus sjekkpunkter og reparerer DNA skadepunkter. Celler inneholder en rekke distinkte reaksjonsveier med signaler og effekter som styrer reparasjonen av forskjellige typer DNA-skade. Disse reaksjonsveier inkluderer base-bortskjæringsreparasjon (BER), homolog rekombinasjon (HR) avhengig DNA dobbeltråd brudd (DSB) reparasjon, ikke-homolog endesammenføyning (NHEJ), nukleotid bortskjæringsreparasjon (NER), base bortskjæringsreparasjon (BER) og feiltreff reparasjon (MMR). Interaksjonen og interavhengighet mellom de forskjellige DNA-reparasjonsreaksjonsveiene er fremdeles dårlig forstått.

De foreliggende oppfinnerne har oppdaget at hemmingen av BER reaksjonsveien, for eksempel ved å hemme poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), så er dette selektivt letalt for de cancerceller som mangler HR avhengig DNA DSB reparasjonsreaksjonsvei. Dette har viktige implikasjoner i behandlingen av cancertilstander.

Et aspekt i oppfinnelsen tilveiebringer anvendelsen av en hemmer av en base bortskjærings-reparasjonsreaksjonsvei i produksjonen av et medikament for anvendelse i behandlingen av cancer hos et individ, hvor nevnte cancer mangler en HR-avhengig DNA DSB reparasjonsaktivitet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse av poly (ADP-ribose)polymerase (PARP) inhibitor for fremstilling av et medikament for anvendelse i behandlingen av cancer i et individ, hvor nevnte cancer har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjonsreaksjonsvei, hvori PARP inhibitoren er valgt fra gruppen bestående av: nikotinamider, benzamider, forskjellige fra 3-aminobenzamid, isokinolinoner, dihydroisokinolinoner, benzimidazoler, forskjellige fra benzimidazol-karboksamider, indoler, forskjellige fra tricykliske laktamindoler, ftalazinoner, kinazolinoner, forskjellige fra kinazolin-4-[3H]-oner, isoindolinoner, fenantridiner, fenantridinoner, forskjellige fra 6 (5H) fenantridinon, benzopyroner, umettede hydroksimsyrederivater, pyridiziner, caffein, teofyllin og tymidin, og hvor nevnte cancer i individet tidligere er identifisert som at den har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjonsvei.

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anvendelse av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor ved fremstillingen av et medikament for anvendelse i behandling av cancer som har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjonsvei i et individ, hvor PARP inhibitoren er valgt fra gruppen bestående av: nikotinamider; benzamider valgt fra gruppen bestående av 3-hydroksybenzamid, 3-nitrosobenzamid, 3-metoksybenzamid og 3-klorprokainamid, 4-aminobenzamid og 1,5-di[(3-karbamoylfenyl)aminokarbonyloksy]pentan og analoger og derivater derav; isokinolinoner; dihydroisokinolinoner; benzimidazoler og indoler valgt fra gruppen bestående av benzoksazol-4-karboksamider, 2-cykloalkylbenzimidazol-4-karboksamider, kinoksalinkarboksamider, imidazopyridinkarboksamider, 2-fenylindoler, 2-substituerte benzoksazoler, l,3,4,5-tetrahydro-azepino[5,4,3-cd]indol-6-on, azepinoindoler, azepinoindoloner, 3-substituerte dihydrodiazapinoindolinoner, tetrahydrodiazapinoindolinon, 5,6-dihydroimidazo[4,5,1 -jk] [ 1,4]benzodiazepin-7(4H)-on, 2-fenyl-5,6-dihydroimidazo[4,5,l-jk][l,4]benzodiazepin-7(4H)-on og 2,3-dihydro-isoindol-l-on og analoger og derivater derav; ftalazinoner; kinazolinoner valgt fra gruppen bestående av 4-hydroksykinazolin og analoger og derivater derav; isoindolinoner; fenantridiner; fenantridinoner valgt fra gruppen bestående av substituerte 5[H]fenantridin-6-oner, tieno[2,3-c]isokinoloner, N-(6-okso-5,6-dihydrofenantridin-2-yl]-2-(N,N-dimetylamino)acetamid, substituerte 4,9-dihydrocyklopenta[lmn]fenantridin-5-oner; benzopyroner; umettede hydroksimsyrederivater; pyridaziner; kaffein, teofyllin og tymidin, hvor nevnte cancer i individet tidligere er identifisert som at den har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjonsvei.

Ytterligere tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anvendelse av en poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor ved fremstillingen av et medikament for anvendelse i behandling av cancer som har mangel på HR-avhengig DNA DSB reparasjonsvei i et individ, hvor nevnte cancer i individet på forhånd er identifisert som at den har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjonsvei og hvor PERP inhibitoren er formulert i en kapsel, pulverkapsel eller tablett for oral administrering.

I en utførelsesform omfatter anvendelsen følge oppfinnelsen trinnet med identifisering av en cancertilstand i et individ som mangelfull i HR-avhengig DNA DSB reparasjon.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for å fastslå aktiviteten av den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien i en cancertilstand i et individ, omfattende;

å la en PARP-inhibitor in vitro komme i kontakt med en prøve av cancerceller skaffet til veie fra individet som har tilstanden, og;

å bestemme mengden av celledød i nevnte prøve.

Ytterligere tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å forutsi responsen av en cancertilstand i et individ på en behandling som målretter cancerens mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjon, som kan omfatte;

å la en PARP-inhibitor komme i kontakt in vitro med en prøve med cancerceller skaffet til veie fra individet som har cancertilstanden, og;

å bestemme mengden av celledød i nevnte prøve.

Canceren kan omfatte en eller flere cancerceller som har en redusert eller opphevet evne til å reparere DNA ved nevnte andre reparasjonsreaksjonsvei i forhold til normale celler.

Miknyoczki S.J. et al., "Chemopotentiation of temozolomide, irinotecan, and cisplatin activity by CEP-6800, a poly(ADP-ribose)polymerase inhibitor", Molecular Cancer Therapeutics, vol. 2, april 2003, s. 371 - 382, beskriver anvendelse av PARP-1 inhibitoren CEP-6800 for å potensiere effekten av temozolomid og irinotecan til å forårsake akkumulering av poly(ADP-ribose) (PAR) i blant annet LoVo carcinomcellexenografter.

WO 2004/080976 (NO 20054625) beskriver PARP-inbibitorer avledet fra ftalazinon og deres anvendelse som supplerende midler i cancerterapi eller for å potensiere tumorceller for radioterapi eller kjemoterapi.

WO 02/090334 beskriver PARP-inhibtorer avledet fra isokinoloner og deres anvendelse som supplerende midler i cancerterapi eller for å potensiere tumorceller for radioterapi eller kjemoterapi.

WO 02/36576 beskriver PARP-inhibtorer avledet fra ftalazinon og deres anvendelse som supplerende midler i cancerterapi eller for å potensiere tumorceller for radioterapi eller kjemoterapi.

WO 03/093261 beskriver PARP-inhibtorer avledet fra l(2H)-ftalazinon og deres anvendelse som supplerende midler i cancerterapi eller for å potensiere tumorceller for radioterapi eller kjemoterapi.

Giannini G. et al., "Human MRE11 is inactivated in mismatch repair-deficient cancers", EMBO reports, vol. 3, nr. 3,2002, s. 248-254 viser at LoVo kolon cancerceller har delesjoner i en eller to baser som involverer begge MRE11 alleler.

Jackson S.P., "DNA damage signalling and apoptosis ", Biochemical Society Transactions, vol. 29, part 6, 2001, s. 655-661 viser at redusert ekspresjon av MRE11 og RAD50 proteinene resulterer i skader på HR-reparasjonsveien.

Den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien reparerer dobbeltrådige brudd (DSB'er) i DNA via homologe mekanismer for å redanne en kontinuerlig DNA he liks (K. K. Khanna og S. P. Jackson, Nat. Genet. 27(3): 247-254 (2001)). Komponentene i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien inkluderer ATM (NM_000051), RAD51 (NM_002875), RAD51L1 (NM_002877), RAD51C (NM_002876), RAD51L3 (NM_002878), DMC1 (NM_007068), XRCC2 (NM_005431), XRCC3 (NM_005432), RAD52 (NM_002879), RAD54L (NM_003579), RAD54B (NM_012415), BRCA1 (NM_007295), BRCA2 (NM_000059), RAD50 (NM_005732), MRE1 IA (NM_005590) og NBS1 (NM_002485). Andre proteiner som er involvert i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien inkluderer regulatoriske faktorer slik som EMSY (Hughes-Davies et al., Cell, vol. 115, s. 523-535).

Base bortskjærings-reparasjons (BER) -reaksjonsveien reparerer DNA enkeltrådbrudd og gap og fjerner spesifikt ødelagte baser. Gap i DNA-heliksen fylles ved den etterfølgende virkningen av en poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) og en ligase. (K. K. Khanna og S. P. Jackson, Nat. Genet., 27(3): 247-254 (2001); F. Dantzer et al, Biochemistry 39, 7559-69, (2000); J. H. Hoeijmakers, Nature 411 366-74 (2001)). En hemmer av base bortskjæringsreparasjon kan hemme enhver av komponentene i base bortskjæringsreparasjons-reaksjonsveien. Komponenter i BER reaksjonsveien inkluderer: UNG (NM_003362), SMUG1 (NM_014311), MBD4 (NM_003925), TDG (NM_003211), OGG1 (NM_002542), MYH (NM_012222), NTHL1 (NM_002528), MPG (NM_002434), NEIL1 (NM_24608), NEIL2 (NM_145043), NEIL3 (NM_018248), APE1 (NM_001641), APE2 (NM_014481), LIG3 (NM_013975), XRCC1 (NM_006297), ADPRT (PARP1) (NM_0016718) og ADPRTL2 (PARP2)

(NP_005475).

BER-hemmere kan anvendes i behandlingen av HR-avhengige DNA DSB reparasjons-defisiente cancere i kombinasjon med et DNA-ødeleggende middel. Helst så blir DNA- ødeleggende midler anvendt i en dose eller formulering som, i fraværet av BER-hemmeren, ikke er letal for cellene. Passende DNA-ødeleggende kjemoterapeutiske midler er beskrevet under.

I noen fortrukne utførelsesformer så kan en hemmer av pattedyrenzymet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (D'Amours et al, (1999) Biochem. J. 342: 249-268) benyttes. En PARP-hemmer kan dermed anvendes for behandlingen av en cancer som er defisient i HR-avhengig DNA DSB reparasjon.

En fremgangsmåte for behandling av en cancer defisient i HR-avhengig DNA DSB reparasjon i et individ kan omfatte: å administrere en PARP-hemmer til nevnte individ.

En PARP-hemmer kan anvendes i produksjonen av et medikament for anvendelse i behandlingen av cancer i et individ, hvor nevnte cancer mangler HR-avhengig DNA DSB reparasjon.

PARP-hemmere er beskrevet i mer detalj under.

En cancer som er defisient i HR-avhengig DNA DSB reparasjon kan omfatte eller bestå av en eller flere cancerceller som har en redusert eller opphevet evne til å reparere DNA DSB'er gjennom den reaksjonsveien, i forhold til normale celler, dvs. aktiviteten av den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien kan være redusert eller ødelagt i

en eller flere cancerceller.

Aktiviteten av en eller flere komponenter i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien kan være ødelagt i en eller flere cancerceller i et individ som har en cancer som mangler HR-avhengig DNA DSB reparasjon. Komponenter i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien er godtkarakteriserti fagfeltet (se for eksempel Wood et al, (2001) Science 291 1284-1289) og inkluderer komponentene som er opplistet over.

I noen foretrukne utførelsesformer så kan cancercellene ha en BRCA1- og/eller en BRCA2-manglende fenotype, dvs. BRCA1- og/eller BRCA2-aktivitet er redusert eller ødelagt i cancercellene. Cancerceller med denne fenotype kan mangle BRCA1 og/eller BRCA2, dvs. uttrykk og/eller aktivitet av BRCA1 og/eller BRCA2 kan være redusert eller ødelagt i cancercellene, for eksempel på grunn av mutasjon eller polymorfisme i den kodende nukleinsyren, eller på grunn av mutasjon eller polymorfisme i et gen som koder for en regulatorisk faktor, for eksempel EMSY-genet som koder for en BRCA2-regulerende faktor (Hughes-Davies et al., vol. 115, s. 523-535).

BRCA1 og BRCA2 er kjente tumorsuppressorer hvis villtype alleler ofte er mistet i tumorer med heterozygote bærere (Jasin M, Oncogene. 2002,16. desember; 21(58): 8981-93; Tutt et al, Trends Mol. Med. (2002) 8(12): 571-6). Assosiasjonen mellom BRCA1 og/eller BRCA2 mutasjoner med brystcancer er godtkarakteriserti fagfeltet (Radice P. J., Exp. Clin. Cancer Res., 2002, september; 21(3 Suppl): 9-12). Oppformering av EMSY-genet, som koder for en BRCA2-bindende faktor, er også kjent for å være assosiert med bryst- og ovariecancer.

Bærere av mutasjoner i BRCA1 og/eller BRCA2 har også en forhøyet risiko for cancer i ovarier, prostata og pancreas.

I noen utførelsesformer så kan en cancertilstand i et individ tidligere ha blitt identifisert som en cancer som mangler HR-avhengig DNA DSB-reparasjon.

I andre utførelsesformer så kan en fremgangsmåte som beskrevet her omfatte trinnet med å identifisere en cancertilstand i et individ som mangler HR-avhengig DNA DSB-reparasjon.

En cancer kan identifiseres som en HR-avhengig DNA DSB-reparasjonsdefisient cancer, for eksempel ved å bestemme aktiviteten av den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien i en eller flere cancerceller fra en prøve skaffet til veie fra individet eller ved å bestemme aktiviteten av en eller flere komponenter i reaksjonsveien. Aktivitet kan bestemmes i forhold til normale (dvs. ikke-cancer) celler, helst fra det samme vevet.

Aktiviteten av den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien kan bestemmes ved å måle dannelsen av foci som inneholder Rad51 i kjernen som respons på DNA-ødeleggende midler eller PARP-hemmere. Celler som mangler den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien mangler evnen til å produsere slike foci. Tilstedeværelsen av Rad51 foci kan bestemmes ved å anvende standard immunofluorescens-teknikker. Andre fremgangsmåter for å bestemme aktiviteten til den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien kan inkludere sensitivitet for IR, kjemoterapeutika slik som inter-tråd krysskoblingsreagenser, DSB-induserende midler (Topoisomerase I & II hemmere) så vel som anvendelsen av western blot analyse, immunohistologi, kromosomale abnormaliteter, enzymatiske eller DNA bindingsanalyser og plasmidbaserte analyser.

I noen utførelsesformer så kan en cancer identifiseres som å mangle en HR-avhengig DNA DSB reparasjonsreaksjonsvei ved å bestemme tilstedeværelsen i cancerceller fra individet av en eller flere varianter, for eksempel polymorfismer eller mutasjoner, i en nukleinsyre som koder for et polypeptid som er en komponent i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien.

Sekvensvariasjoner slik som mutasjoner og polymorfismer kan inkludere en sletting, innsetting eller substitusjon av en eller flere nukleotider, i forhold til villtype nukleotidsekvensen. I noen utførelsesformer så kan variasjonen være en genoppformering, for eksempel en oppformering av EMSY-genet (CAD22881; gensymbol Cl 1ORF30). Den ene eller flere variasjoner kan være i en kodende eller ikke-kodende region av nukleinsyresekvensen og kan redusere eller ødelegge uttrykket eller funksjonen av det HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsvei-komponent polypeptidet. Med andre ord så kan variantnukleinsyren kode for et variantpolypeptid som har redusert eller ødelagt aktivitet eller så kan den kode for et villtype polypeptid som har lite eller intet uttrykk innen cellen, for eksempel gjennom den forandrede aktiviteten av et regulatorisk element. En variant nukleinsyre kan ha en, to, tre, fire eller flere mutasjoner eller polymorfismer i forhold til villtypesekvensen.

Tilstedeværelsen av en eller flere variasjoner i en nukleinsyre som koder for en komponent i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien kan bestemmes ved å detektere, i en eller flere celler av en testprøve, tilstedeværelsen av en kodende nukleinsyresekvens som omfatter den ene eller flere mutasjoner eller polymorfismer, eller ved å detektere tilstedeværelsen av variantkomponentpolypeptidet som kodes for av nukleinsyresekvensen.

Forskjellige fremgangsmåter er tilgjengelige for å bestemme tilstedeværelsen eller fraværet i en prøve skaffet til veie fra et individ av en bestemt nukleinsyresekvens, for eksempel en nukleinsyresekvens som har en mutasjon eller polymorfisme som reduserer eller opphever uttrykket eller aktiviteten av en HR-avhengig DNA DSB reparasjonsreaksjonsvei-komponent. Ved å ha sekvensert nukleinsyre til et individ eller prøve så kan videre sekvensinformasjonen holdes tilbake og deretter søkes uten forbehold til den originale nukleinsyren i seg selv. Å scanne en database med sekvensinformasjon ved å anvende sekvensanalyse-software kan dermed for eksempel identifisere en sekvensforandring eller mutasjon.

Fremgangsmåter i henhold til noen aspekter i den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte å bestemme bindingen av en oligonukleotidprobe til nukleinsyre skaffet til veie fra prøven, for eksempel genomisk DNA, RNA eller cDNA. Proben kan omfatte en nukleinsyresekvens som binder seg spesifikt til en nukleinsyresekvens som inneholder en eller flere mutasjoner eller polymorfismer og som ikke binder spesifikt til nukleinsyresekvensen som ikke inneholder den ene eller flere mutasjoner eller polymorfismer, eller vice versa.

Oligonukleotidproben kan omfatte en merking, og binding av proben kan bestemmes ved å detektere tilstedeværelsen av merkingen.

En fremgangsmåte kan inkludere hybridisering av en eller flere (f. eks. to) oligonukleotidprober eller primere til målnukleinsyren. Hvor nukleinsyren er dobbeltrådet DNA, så vil hybridisering vanligvis skje etter denaturering for å produsere enkeltrådet DNA. Hybridiseringen kan være som del av en PCR-prosedyre, eller som del av en probeprosedyre som ikke involverer PCR. En eksempelprosedyre ville være en kombinasjon av PCR og lav stringens hybridisering.

Binding av en probe til målnukleinsyre (f. eks. DNA) kan måles ved å anvende en rekke teknikker som er tilgjengelig for fagfolk. For eksempel så kan prober være radioaktivt, fluorescent eller enzymatisk merket. Andre fremgangsmåter benytter ikke merking av probe inkludert undersøkelse av restriksjonsfragmentlengde polymorfismer, oppformering ved å anvende PCR, RN'ase kløyving og allelspesifikk oligonukleotidprobing. Probing kan benytte standard Southern blotteteknikken. For eksempel så kan DNA ekstraheres fra celler og kuttes med forskjellige restriksjonsenzymer. Restriksjonsfragmenter kan så separeres ved elektroforese på en agarosegel, før denaturering og overføring til et nitrocellulosefilter. Merket probe kan hybridiseres til DNA-fragmentene på filteret og binding bestemmes.

Fagfolk er i stand til å benytte passende betingelser for den ønskede stringensen for selektiv hybridisering, etter å ha tatt i betraktning faktorer slik som oligonukleotid lengde og basesammensetning, temperatur, osv.

Passende selektive hybridiseringsbetingelser for oligonukleotider på 17 til 30 baser inkluderer hybridisering over natt ved 42°C i 6 ganger SSC og vasking i 6 ganger SSC i en serie med økende temperatur fra 42°C til 65°C.

Andre passende betingelser og protokoller er beskrevet i Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 3. utgave, Sambrook & Russell (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press NY, og Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley& Sons (1992).

Nukleinsyre, som kan være genomisk DNA, RNA eller cDNA, eller en oppformert region av dem, kan sekvenseres for å identifisere eller bestemme tilstedeværelsen av polymorfisme eller mutasjon i dem. En polymorfisme eller mutasjon kan identifiseres ved å sammenligne sekvensen skaffet til veie med databasesekvensen av komponenten, som satt fram over. Spesielt så kan tilstedeværelsen av en eller flere polymorfismer eller mutasjoner som forårsaker opphør eller tap av funksjon av polypeptidkomponenten, og dermed den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien som et hele, bestemmes.

Sekvensering kan utføres ved å anvende enhver av en rekke standard teknikker. Sekvensering av et oppformert produkt kan for eksempel involvere presipitering med isopropanol, resuspensjon og sekvensering ved å anvende et TaqFS+ fargeterminerings-sekvenseirngskit. Ekstensjonsprodukter kan kjøres på elektroforese på en ABI 377 DNA sekvensmaskin og data analyseres ved å anvende Sequence Navigator software.

En spesifikk oppformeringsreaksjon slik som PCR ved å anvende en eller flere primer-par kan lett utføres for å oppformere regionen av interesse innen nukleinsyresekvensen, for eksempel delen av sekvensen som er mistenkt for å inneholde mutasjoner eller polymorfismer. Den oppformerte nukleinsyren kan så sekvenseres som over og/eller testes på annen måte for å bestemme tilstedeværelsen eller fraværet av en mutasjon eller polymorfisme som reduserer eller opphører uttrykket eller aktiviteten av den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveis-komponenten. Passende oppformeringsreaksjoner inkluderer polymerase kjedereaksjonen (PCR) (oversikt for eksempel i "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", eds. Innis et al., 1990, Academic Press, New York, Mullis et al., Cold Spring Harbor, Symp. Quant. Biol, 51: 263 (1987), Ehrlich (ed), PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989, og Ehrlich et al., Science, 252: 1643-1650 (1991).

I noen utførelsesformer så kan en cancer identifiseres som å mangle en HR-avhengig DNA DSB reparasjon ved å undersøke nivået av uttrykk eller aktivitet av en positiv eller negativ regulator av en komponent i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien, slik som EMSY. Uttrykksnivåer kan bestemmes, for eksempel ved Western blot, ELISA, RT-PCR, nukleinsyrehybridisering eller karyotypisk analyse.

I noen foretrukne utførelsesformer så er individet heterozygot for en eller flere variasjoner, slik som mutasjoner og polymorfismer, i BRCA1 og/eller BRCA2 eller en regulator av dem. Deteksjonen av variasjon i BRCA1 og BRCA2 er velkjent i fagfeltet og er beskrevet for eksempel i EP 699754, EP 705903, Neuhausen S. L. og Ostrander E. A., Genet. Test (1992) 1, 75-83; Chappnis, P. O. og Foulkes, W. D., Cancer Treat Res

(2002) 107, 29-59; Janatova M. et al, Neoplasma. 2003: 50(4): 246-50; Jancarkova N., Ceska Gynekol. 2003 68(1); 11-6). Bestemmelse av oppformering av BRCA2-bindingsfaktoren EMSY er beskrevet i Hughes-Davies et al, Cell, 115, 523-535).

Mutasjoner og polymorfismer assosiert med cancer kan også detekteres på proteinnivået og detekterer tilstedeværelsen av et variant (dvs. et mutant eller allelisk variant) polypeptid.

En fremgangsmåte for å identifisere en cancercelle i en prøve fra et individ som mangler HR-avhengig DNA DSB reparasjon kan inkludere å la en prøve komme i kontakt med et spesifikt bindingsmedlem rettet mot en variant (f. eks. en mutant) polypeptidkomponent i reaksjonsveien, og å bestemme binding av det spesifikke bindingsmedlemmet til prøven. Binding av det spesifikke bindingsmedlemmet til prøven kan være en indikasjon på tilstedeværelsen av variant polypeptidkomponenten i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien i en celle innen prøven.

Foretrukne spesifikke bindingsmolekyler for anvendelse i aspektene i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer antistoffer og fragmenter eller derivater av dem ("antistoffmolekyler").

Reaktivitetene til et bindingsmedlem slik som et antistoff på normale prøver og testprøver kan bestemmes ved hjelp av enhver passende måte. Tagging med individuelle reportermolekyler er en mulighet. Reportermolekylene kan direkte eller indirekte generere detekterbare og helst målbare signaler. Koblingen av reportermolekyler kan være direkte eller indirekte, kovalent, f. eks. via en peptidbinding, eller ikke-kovalent. Kobling via en peptidbinding kan være som et resultat av rekombinant uttrykk av en genfusjon som koder for bindingsmolekyl (f. eks. antistoff) og reportermolekyl.

Måten for å bestemme binding er ikke et trekk i den foreliggende oppfinnelsen, og fagfolk er i stand til å velge en passende måte i henhold til deres preferanse og generelle kunnskap.

Cancerceller generelt erkarakterisert vedunormal proliferering i forhold til normale celler og danner vanligvis klynger eller tumorer i et individ som har en cancertilstand.

En cancertilstand som mangler den HR-avhengige DNA DSB

reparasjonsreaksjonsveien som beskrevet her kan inkludere enhver type solid cancer eller ondartet lymphoma og spesielt leukemi, sarcoma, hudcancer, blærecancer, brystcancer, livmorcancer, ovariecancer, prostatacancer, lungecancer, colorectal cancer, cervical cancer, levercancer, hode- og nakkecancer, øsofageal cancer, pancreascancer, renal cancer, magecancer og cerebral cancer. I noen utførelsesformer så kan cancertilstanden være bryst-, ovarie-, pancreas- eller prostatacancer. Cancere kan være familiære eller sporadiske.

En prøve skaffet til veie fra et individ kan være en vevsprøve som omfatter en eller flere celler, for eksempel en biopsi fra et cancervev som beskrevet over, eller et ikke-cancervev, for eksempel for anvendelse som en kontroll.

Fremgangsmåter kan være nyttige i å undersøke et individ som har en cancertilstand, for eksempel for å bestemme en terapeutisk kurs for virkning.

En fremgangsmåte for å undersøke et individ som har en cancertilstand kan omfatte;

å identifisere en cancercelle skaffet til veie fra individet som mangler HR-avhengig DNA DSB reparasjon i forhold til normale celler, og;

å tilveiebringe en hemmer av BER reaksjonsveien som er passende for å administrere til nevnte individ.

I noen foretrukne utførelsesformer så er BER-reaksjonsveishemmeren en PARP-hemmer. PARP-hemmere er beskrevet i mer detalj under. En fremgangsmåte for å undersøke en cancertilstand kan omfatte;

å identifisere en cancercelle skaffet til veie fra individet som mangler HR-avhengig DNA DSB reparasjon i forhold til normale celler, og:

å tilveiebringe en PARP-hemmer passende for å gi til nevnte individ.

I noen foretrukne utførelsesformer så kan cancercellen som er identifisert som å mangle HR-avhengig DNA DSB reparasjon ha en BRCA1- eller BRCA2-manglende fenotype.

Et individ kan ha en predisposisjon for en cancer som mangler HR-avhengig DNA DSB reparasjon. Fremgangsmåter og måter i oppfinnelsen er spesielt nyttig for slike individer.

Et individ kan for eksempel være heterozygot for en mutasjon eller polymorfisme i en nukleinsyre som koder for en komponent i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien, for eksempel en nukleinsyre som koder for en komponent beskrevet over.

En fremgangsmåte for å behandle cancer i et individ kan omfatte;

å administrere en BER-reaksjonsveishemmer til nevnte individ, og nevnte individ er heterozygot for en mutasjon eller polymorfisme i et gen som koder for en komponent i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien.

En BER-hemmer kan anvendes i produksjonen av et medikament for anvendelse i behandlingen av en cancer i et individ som er heterozygot for en mutasjon i et gen i en HR-avhengig DNA DSB reparasjonsreaksjonsvei og en base bortskjæringsreparasjons-hemmer kan anvendes i behandlingen av en cancer i et individ som er heterozygot for en mutasjon i et gen som koder for en komponent i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien.

I noen foretrukne utførelsesformer så kan et individ som er heterozygot for en mutasjon eller polymorfisme i et gen som koder for en komponent i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien være heterozygot for en mutasjon eller polymorfisme i BRCA1 og/eller BRCA2.

En BER-hemmer som er passende for anvendelse i en fremgangsmåte beskrevet her kan være enhver forbindelse eller helhet, slik som et lite organisk molekyl, peptid eller nukleinsyre, som hemmer, reduserer eller ødelegger aktiviteten av en eller flere komponenter i BER-reaksjonsveien.

I noen foretrukne utførelsesformer så kan BER-hemmeren redusere eller ødelegge aktiviteten av enzymet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP).

Uttrykket PARP som anvendt her refererer til PARP1 (EC 2.4.2.30, Genbank No: M32721) og/eller PARP2 (Ame et al., J. Biol. Chem. (1999), 274 15504-15511; Genbank No: AJ236912) med mindre sammenhengen dikterer noe annet.

Eksempler på forbindelser som er kjente PARP-hemmere og som kan anvendes i overensstemmelse med oppfinnelsen inkluderer: 1. Nikotinamider, slik som 5-metyl-nikotinamid og 0-(2-hydroksy-3-piperidino-propyl)-3-karboksylsyre-amidoksim, og analoger og derivater av dem. 2. Benzamider, inkludert 3-substituerte benzamider slik som 3-aminobenzamid, 3-hydroksybenzamid, 3-nitrosobenzamid, 3-metoksybenzamid og 3-klorprokainamid, og 4-aminobenzamid, l,5-di[(3-karbamoylfenyl)aminokarbonyloksy]pentan, og analoger og derivater av dem. 3. Isoquinolinoner og dihydroisoquinolinoner, inkludert 2H-isoquinolin-l-oner, 3H-quinozolin-4-oner, 5-substituerte dihydroisoquinolinoner slik som 5-hydroksy dihydroisoquinolinon, 5-metyl dihydroisoquinolinon, og 5-hydroksy isoquinolinon, 5-amino isoquinolin-l-on, 5-dihydroksyisoquinolinon, 3,4 dihydroisoquinolin-l(2H)-oner slik som 3, 4 dihydro-5-metoksy-isoquinolin-l(2H)-on og 3, 4 dihydro-5-metyl-1 (2H)isoquinolinon, isoquinolin-1 (2H)-oner, 4,5-dihydro-imidazo[4,5,1 -ij]quinolin-6-oner, l,6-naftyridin-5(6H)-oner, 1,8-naftalimider slik4-amino-l,8-naftalimid, isoquinolinon, 3,4-dihydro-5-[4-l(1 -piperidinyl)butoksy]-1 (2H)-isoquinolinon, 2,3-dihydrobenzo[de]isoquinolin-l-on, l-llb-dihydro-[2H]benzopyrano[4,3,2-de]isoquinolin-3-on, og tetracykliske laktamer, inkludert benzpyranoisoquinolinoner slik som benzopyrano[4,3,2-de]isoquinolinon, og analoger og derivater av dem. 4. Benzimidazoler og indoler, inkludert benzoksazol-4-karboksamider, benzimidazol-4-karboksamider, slik som 2-substituerte benzoksazol-4-karboksamider og 2-substituerte benzimidazol-4-karboksamider slik som 2-aryl-benzimidazol-4-karboksamider og 2-cykloalkylbenzimidazol-4-karboksamider inkludert 2 -(4-hydroksyfenyl) -benzimidazol-4- karboksamid, quinoksalinkarboksamider, imidazopyridinkarboksamider, 2-fenylindoler, 2-substituerte benzoksazoler, slik som 2-fenyl-benzoksazol og 2-(3-metoksyfenyl)-benzoksazol, 2-substituerte benzimidazoler, slik som 2-fenyl--benzimidazol og 2-(3-metoksyfenyl)-benzimidazol, l,2,3,4,5-tetrahydro-azepino[5,4,3-cd]-indol-6-on, azepinoindoler og azepinoindoloner slik som l,5-dihydro-azepino[4,5,6-cd]-indolin-6-on og dihydrodiazapinoindolinon, 3-substituerte dihydrodiazapinoindolinoner, slik som 3-(4-trifluormetylfenyi)-dihydrodiazapinoindolinon, tetrahydrodiazapinoindolinon og 5,6-dihydroimidazo[4,5,l-j, k] [l,4]-benzodiazopin-7(4H)-on, 2-fenyl-5,6-dihydro-imidazo[4,5,l-jk] [1,4]-benzodiazepin-7(4H)-on og 2,3-dihydro-isoindol-l-on, og analoger og derivater av dem. 5. Ftalazin-l(2H)-oner og quinazolinoner, slik som 4-hydroksyquinazolin, ftalazinon, 5- metoksy-4-metyl-l(2)-ftalazinoner, 4-substituerte ftalazinoner, 4-(l-piperazinyl)-l(2H)-ftalazinon, tetracykliske benzopyrano[4,3,2-de]-ftalazinoner og tetracykliske indeno [l,2,3-de]-ftalazinoner og 2-substituerte quinazoliner, slik som 8-hydroksy-2-metylquinazolin-4-(3H)-on, tricykliske ftalazinoner og 2-aminoftalhydrazid, og analoger derivater av dem.

6. Isoindolinoner og analoger og derivater av dem.

7. Fenantridiner og fenantridinoner, slik som 5[H]fenantridin-6-on, substituerte 5[H] fenantridin-6-oner, spesielt 2-, 3-substituerte 5[H] fenantridin-6-oner og sulfonamid/karbamidderivater av 6(5H)-fenantridinoner, tieno[2,3-c]-isoquinoloner slik som 9-amino-tieno[2,3-c]-isoquinolon og 9-hydroksytieno[2,3-c]-isoquinolon, 9-metoksytieno[2,3-c]-isoquinolon, ogN-(6-okso-5,6-dihydrofenantridin-2-yl]-2-(N,N-dimetylamino)-acetamid, substituerte 4,9-dihydrocyklopenta[lmn]-fenantridin-5-oner, og analoger og derivater av dem. 8. Benzopyroner slik som 1,2-benzopyron, 6-nitrosobenzopyron, 6-nitroso 1,2-benzopyron, og 5-jod-6-aminobenzopyron, og analoger og derivater av dem. 9. Umettede hydroksyminsyrederivater slik som 0-(3-piperidino-2-hydroksy-l-propyl)-nikotinisk amidoksim, og analoger og derivater av dem.

10. Pyridaziner, inkludert fuserte pyridaziner, og analoger og derivater av dem.

11. Andre forbindelser slik som koffein, teofyllin og tymidin, og analoger og derivater av dem.

Tilleggs PARP-hemmere er beskrevet for eksempel i US 6.635.642, US 5.587.384, WO 2003080581, WO 2003070707, WO 2003055865, WO 2003057145,WO 2003051879, US 6.514.983, WO 2003007959, US 6.426.415, WO 2003007959, WO 2002094790, WO 2002068407, US 6.476.048, WO 2001090077, WO 2001085687, WO 2001085686, WO 2001079184, WO 2001057038, WO 2001023390, WO 2001021615, WO 2001016136, WO 2001012199, WO 9524379, Banasik et al, J. Biol. Chem., 267:3, 1569-75 (1992), Banasik et al., Molec. Cell. Biochem. 138:185-97 (1994), Cosi

(2002) Expert Opin. Ther. Patents 12 (7), og Southan & Szabo (2003), Curr. Med. Chem. 10 321-340, og referanser deri.

En foretrukket klasse med passende PARP-hemmere inkluderer ftalazinoner slik som l(2H)-ftalazinon og derivater av den, som beskrevet i WO 02/36576. Spesielt forbindelser med formelen

og isomerer, salter, oppløsninger, kjemisk beskyttede former og promedikamenter av dem, kan anvendes for å hemme PARP, hvor: A og B sammen representerer en valgfritt substituert, fusert aromatisk ring;

Rcer representert ved -L-RL, hvor L er av formel: -(CH2)ni-Qn2-(CH2)n3-

hvor ni, n2og n3er hver valgt fra 0,1, 2 og 3, summen av ni, n2og n3er 1,2 eller 3 og Q er valgt fra O, S, NH, C(=0) eller -CR1R2-, hvor Ri og R2er uavhengig valgt fra hydrogen, halogen eller valgfritt substituert Ci.7alkyl, eller kan sammen med karbonatomet som de er festet til danne en C3.7cyklisk alkylgruppe, som kan være

mettet (en C3.7cykloalkylgruppe) eller umettet (en C3.7cykloalkenylgruppe), eller en av Ri og R2kan være festet til et atom i RLtil å danne en umettet C3.7cykloalkenylgruppe som omfatter karbonatomene som Ri og R2er festet til i Q, -(CH2)n3- (hvis til stede) og del av Rl;

og Rler valgfritt substituert Cs-2o aryl; og

Rner valgt fra hydrogen, valgfritt substituert Ci-7alkyl, C3.20heterocyklyl, og C5-20aryl, hydroksy, eter, nitro, amino, amido, tiol, tioeter, sulfoksid og sulfon.

Helst en forbindelse med formel

eller en isomer, salt, oppløsning, kjemisk beskyttet form eller promedikament av den kan anvendes for å hemme PARP, hvor: A og B sammen representerer en valgfritt substituert, fusert aromatisk ring;

Rcer -CH2-RL;

Rler valgfritt substituert fenyl; og

Rn er hydrogen.

I noen foretrukne utførelsesformer så kan en forbindelse som har strukturen til KU-0058684 eller KU-0058948 som satt fram i Figur 2, eller en isomer, salt, oppløsning, kjemisk beskyttet form eller promedikament av dem, anvendes for å hemme PARP.

Passende PARP-hemmere er enten kommersielt tilgjengelige eller så kan de syntetiseres ved hjelp av kjente fremgangsmåter fra startmaterialer som er kjente (se for eksempel Suto et al, Anticancer Drug Des. 6:107-17 (1991)).

En annen klasse base bortskjæringsreparasjonshemmere inkluderer peptidfragmenter av komponenter i BER-reaksjonsveien. For eksempel så peptidfragmenter fra PARP-sekvensen anvendes for å hemme PARP og dermed redusere eller ødelegge aktivitet til BER-reaksjonsveien. Peptidfragmenter kan genereres helt eller delvis ved hjelp av kjemisk syntese ved å anvende de publiserte sekvensene til komponentene, for eksempel den publiserte PARP-sekvensen (tilgangsnr.: NM_001618). Peptidfragmenter kan lett lages i henhold til vel etablerte, standard flytende eller helst fast fase peptid-syntesefremgangsmåter, generelle beskrivelser av disse er vidt tilgjengelig (se for eksempel i J. M. Stewart og J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. utgave, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), i M. Bodanzsky og A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984); og Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California), eller så kan de lages i løsning, ved flytende fase fremgangsmåten eller ved enhver kombinasjon av fast fase, flytende fase og løsningskjemi, f. eks. ved først å gjøre ferdig den respektive peptiddelen og deretter, hvis det er ønskelig og passende, etter å ha fjernet enhver beskyttende gruppe som er til stede, ved introduksjon av residiet X ved reaksjon av den respektive karbon- eller sulfonsyren, eller et reaktivt derivat av dem.

Andre kandidatforbindelser for å hemme en komponent i BER-reaksjonsveien, slik som PARP, kan være basert på å modulere den tredimensjonale strukturen til komponenten og anvende rasjonell medikamentdesign for å tilveiebringe kandidatforbindelser med bestemt molekylform, størrelse og ladningskarakteristikker. En kandidathemmer kan for eksempel være en "funksjonell analog" av et peptidfragment eller annen forbindelse som hemmer komponenten. En funksjonell analog har den samme funksjonelle aktiviteten som peptidet eller annen forbindelse det er spørsmål om, dvs. den kan interferere med interaksjoner eller aktivitet til DNA reparasjonsreaksjonsveis-komponenten. Eksempler på slike analoger inkluderer kjemiske forbindelser som er modulert for å ligne den tredimensjonale strukturen til komponenten i et område som er i kontakt med en annen komponent, og spesielt arrangementet til nøkkelaminosyre-residiene som de forekommer.

En annen klasse passende BER-reaksjonsveishemmere inkluderer nukleinsyre kodende del av eller hele aminosyresekvensen til en komponent i BER-reaksjonsveien, slik som PARP (tilgangsnr.: NM_001618), eller komplementet til den, som hemmer aktivitet eller funksjon ved nedregulering av produksjon av aktivt polypeptid.

For eksempel så kan hemmingen av PARP-aktivitet bestemmes ved å anvende konvensjonelle fremgangsmåter, inkludert for eksempel dot blot (Affar EB et al., Anal. Biochem. 1998; 259(2): 280-3), og BER-analyser som måler den direkte aktiviteten av PARP til å danne poly ADP-ribose kjeder for eksempel ved å anvende radioaktive analyser med tritiert substrat NAD eller spesifikke antistoffer mot polymerkjedene dannet av PARP-aktivitet (K. J. Dillon et al., Journal of Biomolecular Screening, 8(3): 347-352 (2003)).

For eksempel så kan uttrykk av en BER-reaksjonsveiskomponent hemmes ved å anvende antisens eller RNAi teknologi. Anvendelsen av disse tilnærmingsmåtene for å nedregulere genuttrykk er nå vel etablert i fagfeltet.

Antisens oligonukleotider kan designes til å hybridisere til den komplementære sekvensen ved nukleinsyre, pre-mRNA eller modent mRNA, og interferere med produksjonen av base bortskjæringsreparasjons-reaksjonsveiskomponenten slik at dets uttrykk reduseres eller hindres fullstendig eller vesentlig fullstendig. I tillegg til å målrette kodende sekvens, så kan antisens-teknikker anvendes for å målrette kontrollsekvenser til et gen, f. eks. i den 5' flankerende sekvensen, hvor antisens-oligonukleotider kan interferere med uttrykks-kontrollsekvenser. Konstruksjonen av antisens-sekvenser og deres anvendelse er beskrevet for eksempel i Peyman og Ulman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990), og Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 329-376 (1992).

Oligonukleotider kan genereres in vitro eller ex vivo for administrering eller antisens RNA kan genereres in vivo innen cellene hvor nedregulering er ønsket. Dobbeltrådet DNA kan dermed plasseres under kontrollen av en promoter i en "revers orientering" slik at transkripsjon av antisens-tråden til DNA'et gir RNA som er komplementært til normalt mRNA transkribert fra sens-tråden til målgenet. Den komplementære antisens RNA sekvensen antas å binde mRNA slik at det dannes en dupleks, og hemme translasjon av det endogene mRNA fra målgenet til protein. Om dette er den aktuelle virkningsmåten eller ikke, er fremdeles usikkert. Imidlertid er det et etablert faktum at teknikken virker.

Den fullstendige sekvensen som korresponderer til den kodende sekvensen i revers orientering trenger ikke anvendes. For eksempel så kan fragmenter med tilstrekkelig lengde anvendes. Det er rutinesak for fagfolk å screene fragmenter av forskjellige størrelser og fra forskjellige deler av den kodende eller flankerende sekvensen til et gen for å optimalisere nivået av antisens hemming. Det kan være fordelaktig å inkludere det initierende metionin ATG-kodonet, og kanskje et eller flere nukleotider oppstrøms for det initierende kodonet. Et passende fragment kan ha ca. 14-23 nukleotider, f. eks. ca. 15,16 eller 17.

Et alternativ til antisens er å anvende en kopi av hele eller del av målgenet satt inn i sens, dvs. i den samme, orienteringen som målgenet for å oppnå reduksjon i uttrykk av målgenet ved ko-suppresjon; Angell & Baulcombe (1997) The EMBO Journal 16,12: 3675-3684; og Voinnet & Baulcombe (1997) Nature 389: s. 553. Dobbeltrådet RNA (dsRNA) har blitt funnet å være enda mer effektiv i gendemping enn både sens og antisens tråder alene (Fire A. et al., Nature 391, (1998)). dsRNA-styrt demping er genspesifikk og kalles ofte RNA interferens (RNAi).

RNA interferens er en totrinns prosess. Først så kløyves dsRNA innen cellen slik at det gir korte interfererende RNA'er (siRNA) på ca. 21-23nt i lengde med 5' terminalt fosfat og 3' korte overheng (~2nt). siRNA'ene målretter den korresponderende mRNA-sekvensen spesifikt for destruksjon (Zamore P. D., Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750, (2001)).

RNAi kan også effektivt induseres ved å anvende kjemisk syntetiserte siRNA duplekser med den samme strukturen med 3'-overhengende ender (Zamore P. D. et al, Cell, 101, 25-33, (2000)). Syntetiske siRNA duplekser har vært vist å spesifikt undertrykke uttrykk av endogene og heterologe gener i en rekke pattedyr cellelinjer (Ellbashir S. M. et al, Nature, 411, 494-498, (2001)).

En annen mulighet er at nukleinsyre anvendes og ved transkripsjon produserer et ribozym, som er i stand til å kutte nukleinsyre ved et spesifikt sete - og er dermed også nyttig i å influere genuttrykk. Bakgrunnsreferanser for ribozymer inkluderer Kashani-Sabet og Scanlon, 1995, Cancer Gene Therapy, 2(3): 213-223, og Mercola og Cohen, 1995, Cancer Gene Therapy, 2(1), 47-59.

Fremgangsmåter kan omfatte å administrere en BER-hemmer, slik som en PARP-hemmer, til et individ. Dette kan finne sted etter å ha identifisert individet som å ha en cancertilstand defisient for HR-avhengig DNA DSB reparasjon.

Mens det er mulig for den aktive forbindelsen å administreres alene, er det ønskelig å presentere den som en farmasøytisk sammensetning (f. eks. formulering) som omfatter minst en aktiv forbindelse, som definert over, sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere, adjuvanter, hjelpestoffer, fortynnere, fyllere, buffere, stabilisatorer, konserveringsmidler, smøremidler eller andre materialer som er kjent for fagfolk og valgfritt andre terapeutiske eller profylaktiske midler.

Farmasøytiske sammensetninger som omfatter base utskjæringsreparasjonshemmere som definert over, for eksempel en hemmer blandet sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere, hjelpestoffer, buffere, adjuvanter, stabilisatorer eller andre materialer, som beskrevet her, kan anvendes i fremgangsmåtene som er beskrevet her.

Uttrykket "farmasøytisk akseptabel" som anvendt her angår forbindelser, materialer, sammensetninger og/eller doseringsformer som er, innen omfanget av sunn medisinsk bedømmelse, passende for anvendelse i kontakt med vevene til et individ (f. eks. menneske) uten overdreven toksisitet, irritasjon, allergisk respons eller andre problemer eller komplikasjoner, som er i samsvar med et fornuftig fordel/risikoforhold. Hver bærer, hjelpestoff, osv. må også være "akseptabel" i betydningen av å være kompatibel med de andre ingrediensene i formuleringen.

Passende bærere, hjelpestoffer, osv. kan finnes i standard farmasøytiske tekster, for eksempel Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990.

Formuleringene kan på en lett måte presenteres i enhets doseringsform og kan lages ved hjelp av enhver fremgangsmåte som er velkjent i fagfeltet innen farmasi. Slike fremgangsmåter inkluderer trinnet med å bringe den aktive forbindelsen i assosiasjon med en bærer som kan utgjøre en eller flere tilleggsingredienser. Generelt så lages formuleringene ved uniformt og intimt å bringe den aktive forbindelsen sammen med flytende bærere eller fint oppdelte faste bærere eller begge, og deretter hvis det er nødvendig forme produktet.

Formuleringer kan være i form av væsker, løsninger, suspensjoner, emulsjoner, eliksirer, siruper, tabletter, drops, granulater, pulvere, kapsler, "cacheter", piller, ampuller, stikkpiller, pessarer, salver, geléer, pastaer, kremer, sprayer, støv, skum, lotioner, oljer, store piller, avføringsmidler eller aerosoler.

BER-hemmeren eller den farmasøytiske sammensetningen som omfatter hemmeren kan administreres til et individ ved hjelp av enhver passende administreringsrute, enten systemisk/perifert eller ved stedet hvor det er ønsket virkning, inkludert, men ikke begrenset til, oralt (f. eks. ved inntak); topikalt (inkludert f. eks. transdermalt, intranasalt, okulart, bukkalt og sublingualt); via lungen (f. eks. ved inhalerings- eller insuffleringsterapi ved å anvende f. eks. en aerosol, f. eks. gjennom munn eller nese); rektalt; vaginalt; parenteralt, for eksempel ved injeksjon, inkludert subkutant, intradermalt, intramuskulært, intravenøst, intraarterielt, intrahjerte, intratekalt, intraspinalt, intrakapsulært, subkapsulært, intraorbitalt, intraperitonealt, intratrakealt, subkutikulært, intraartikulært, subaraknoid og intrasternalt; ved implantat av et depot, for eksempel subkutant eller intramuskulært.

Formuleringer som er passende for oral administrering (f. eks. ved inntak) kan presenteres som adskilte enheter slik som kapsler, cacheter eller tabletter, som hver inneholder en på forhånd bestemt mengde av den aktive forbindelsen; som et pulver eller som granulater; som en løsning eller suspensjon i en vandig eller ikke-vandig væske; eller som en olje-i-vann flytende emulsjon eller vann-i-olje flytende emulsjon; som et avføringsmiddel; eller som en pasta.

En tablett kan lages ved hjelp av konvensjonelle måter, f. eks. kompresjon eller støping, valgfritt med en eller flere tilleggsingredienser. Kompresserte tabletter kan lages ved å presse i en passende maskin den aktive forbindelsen i en frittflytende form slik som et pulver eller som granulater, valgfritt blandet med en eller flere bindere (f. eks. povidon, gelatin, akasie, sorbitol, tragakant, hydroksypropylmetylcellulose); fyllere eller fortynnere (f. eks. laktose, mikrokrystallinsk cellulose, kalsiumhydrogenfosfat); smøremidler (f. eks. magnesiumstearat, talkum, silika); disintegranter (f. eks. natriumstivelseglykolat, krysskoblet povidon, krysskoblet natriumkarboksymetyl-cellulose); overflateaktive eller fordelings- eller bløtgjøringsmidler (f. eks. natriumlaurylsulfat); og konserveirngsmidler (f. eks. metyl p-hydroksybenzoat, propyl p-hydroksybenzoat, sorbinsyre). Støpte tabletter kan lages ved å støpe i en passende maskin en blanding av pulverforbindelsen bløtgjort med en uvirksom flytende fortynner. Tablettene kan valgfritt overtrekkes eller merkes og kan formuleres for å tilveiebringe langsom eller kontrollert frigjøring av den aktive forbindelsen i den, ved for eksempel å anvende hydroksypropylmetylcellulose i varierende deler for å tilveiebringe den ønskede frigjøringsprofilen. Tabletter kan valgfritt tilveiebringes med en enterisk overtrekking, for å tilveiebringe frigjøring i deler av tarmen annet enn magen.

Formuleringer som er passende for parenteral administrering (f. eks. ved injeksjon, inkludert kutan, subkutan, intramuskulær, intravenøs og intradermal) inkluderer vandige og ikke-vandige, isotone, pyrogenfrie, sterile injeksjonsløsninger som kan inneholde antioksidanter, buffere, konserveringsmidler, stabilisatorer, bakteriostater og oppløste stoffer som gjør formuleringen isoton med blodet til den mente mottakeren; og vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner som kan inkludere suspenderingsmidler og fortykningsmidler, og liposomer eller andre mikropartikulære systemer som er designet for å målrette forbindelsen til blodkomponenter eller en eller flere organer. Eksempler på passende isotone verktøy for anvendelse i slike formuleringer inkluderer natriumkloridinjeksjon, Ringers løsning eller Ringers injeksjon med melk. Vanligvis så er konsentrasjonen av den aktive forbindelsen i løsningen fra ca. 1 ng/ml til ca. 10 ug/ml, for eksempel fra ca. 10 ng/ml til ca. 1 ug/ml. Formuleringene kan presenteres i enhetsdose eller multidose forseglede beholdere, for eksempel ampuller og rør, og kan være oppbevart i en frysetørket (lyofilisert) tilstand som kun krever tilsetningen av den sterile flytende bæreren, for eksempel vann for injeksjoner, rett før anvendelse. Improviserte injeksjonsløsninger og suspensjoner kan lages fra sterile pulvere, granulater og tabletter. Formuleringer kan være i formen av liposomer eller andre mikropartikulære systemer som er designet for å målrette den aktive forbindelsen til blodkomponenter eller et eller flere organer.

Det vil forstås at passende doseringer av de aktive forbindelsene, og sammensetninger som omfatter de aktive forbindelsene, kan variere fra pasient til pasient. Å bestemme den optimale dosen vil vanligvis involvere å balansere nivået av terapeutisk fordel mot enhver risiko eller alvorlige bieffekter av behandlingene i den foreliggende oppfinnelsen. Det valgte doseringsnivået vil være avhengig av en rekke faktorer, inkludert, men ikke begrenset til, aktiviteten av den bestemte forbindelsen, administreirngsruten, tiden for administrering, hastigheten for utskillelse av forbindelsen, varigheten av behandlingen, andre medikamenter, forbindelser og/eller materialer anvendt i kombinasjon, og alder, kjønn, vekt, tilstand, generell helse og tidligere medisinsk historie for pasienten. Mengden av forbindelse og administreringsrute vil til slutt bli utøvd etter skjønn fra legen, selv om generelt så vil dosen være for å oppnå lokale konsentrasjoner ved virkningsstedet som oppnår den ønskede effekten uten å forårsake vesentlig skadelig eller ødeleggende bieffekter.

Sammensetninger som omfatter BER-reaksjonsveishemmere kan anvendes i fremgangsmåtene beskrevet her i kombinasjon med standard kjemoterapeutiske regimer som ødelegger cancercelle DNA. Passende midler kan inkludere nemmere av topoisomerase I og II aktivitet, slik som camptothecin, medikamenter slik som irinotecan, topotecan og rubitecan, alkylerende midler slik som temozolomid og DTIC (dacarbazin), og platinamidler som cisplatin, cisplatin-doxorubicin-cyklofosfamid, karboplatin og karboplatin-paclitaxel.

Andre passende kjemoterapeutiske midler inkluderer doxorubicin-cyklofosfamid, capecitabin, cyklofosfamid-methotrexat-5-fluorouracil, docetaxel, 5-fluoracil-epirubicin-cyklofosfamid, paclitaxel, vinorelbin, etoposid, pegylert liposomalt doxorubicin og topotecan.

Behandlingen av individer ved å anvende slike midler er velkjente i fagfeltet.

Administrering irt vivo kan utføres i en dose, kontinuerlig eller med avbrudd (f. eks. i oppdelte doser ved passende intervaller) gjennom behandlingsforløpet. Fremgangsmåter for å bestemme de mest effektive måtene og dosering for administrering er velkjent for fagfolk og vil variere med formuleringen anvendt for terapi, hensikten med terapien, målcellen som blir behandlet og individet som blir behandlet. Enkel eller flere administreringer kan utføres med dosenivået og mønsteret som blir valgt av den behandlende legen.

Generelt så er en passende dose av den aktive forbindelsen i området ca. 100 ug til ca. 250 mg per kilo kroppsvekt av individet per dag. Der hvor den aktive forbindelsen er et salt, en ester, et promedikament eller lignende, så blir mengden som blir administrert beregnet på basis av moderforbindelsen og så blir den aktuelle vekten som skal anvendes øket proporsjonalt.

Fremgangsmåter kan også være nyttige i å undersøke og fastsette en cancertilstand i et individ.

En fremgangsmåte for å fastsette aktiviteten av den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien i en cancertilstand kan omfatte;

å la en base utskjæringsreparasjonshemmer komme i kontakt med en prøve med cancerceller skaffet til veie fra individet som har tilstanden, og;

å bestemme mengden av celledød i nevnte prøve i forhold til en kontrollprøve.

En økning i celledød i prøven i forhold til kontrollceller som har normale nivåer av HR-avhengig DNA DSB reparasjonsaktivitet er en indikasjon på at canceren mangler HR-avhengig DNA DSB reparasjon.

Individet kan ha en cancertilstand og prøven kan være en prøve av cancerceller, for eksempel fra en tumorbiopsi.

I foretrukne utførelsesformer så er base utskjæringsreparasjonshemmeren en PARP-hemmer. En fremgangsmåte for å fastsette HR-avhengig DNA DSB reparasjon i en cancertilstand kan dermed omfatte;

å la en PARP-hemmer komme i kontakt med en prøve med cancerceller skaffet til veie fra individet som har cancertilstanden, og;

å bestemme mengden av celledød i nevnte prøve i forhold til en kontrollprøve.

En øket sensitivitet av PARP-hemmeren i celler fra prøven i forhold til kontrollceller er en indikasjon på at canceren mangler HR-avhengig DNA DSB reparasjonsaktiviteten.

Øket sensitivitet for PARP-hemmere kan være en indikasjon på at cancercellene har en BRCA1- eller BRCA2-manglende fenotype, for eksempel en reduksjon eller opphevelse av BRCA1 eller BRCA2 uttrykk eller aktivitet.

En cancertilstand identifisert som å være mangelfull i HR-avhengig DNA DSB reparasjonsaktivitet, for eksempel en tilstand som har en BRCA1- eller BRCA2-manglende fenotype, kan utsettes for terapier som er spesifikt rettet mot slike tilstander. Passende terapier kan inkludere anvendelsen av DNA krysskoblingsmidler slik som Mitomycin C, cisplatin eller karboplatin.

Fremgangsmåter kan anvendes for å forutsi responsen i en cancertilstand i et individ på en behandling som målretter HR, for eksempel en behandling som er spesifikk for cancere som har en BRCA1- eller BRCA2-manglende fenotype.

En fremgangsmåte for å forutsi responsen i en cancertilstand i et individ på en behandling som målretter cancere som har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjon kan omfatte;

å la en BER-hemmer, for eksempel en PARP-hemmer, komme i kontakt med en prøve av cancerceller skaffet til veie fra individet som har cancertilstanden, og;

å bestemme mengden av celledød i nevnte prøve i forhold til en kontrollprøve.

En økning i celledød i prøven i forhold til kontrollceller som har normale nivåer av HR-avhengig DNA DSB reparasjonsaktivitet (dvs. en øket sensitivitet for PARP-hemmere) er en indikasjon på at canceren kan være responsiv for nevnte behandling. Behandlinger med målcancere som har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjon, for eksempel BRCA1- eller BRCA2-mangel cancer, kan for eksempel inkludere DNA krysskoblingsmidler slik som mitomycin C, cisplatin eller karboplatin.

Andre aspekter av oppfinnelsen vedrører anvendelsen av en hemmer av HR-avhengig DNA DSB reparasjon i behandlingen av en cancer som er mangelfull i base bortskjæringsreparasjon.

En fremgangsmåte for behandling av en cancer som er mangelfull i base bortskjæringsreparasjon i et individ kan omfatte;

å administrere en HR-avhengig DNA DSB reparasjonsreaksjonsveihemmer til nevnte individ.

En HR-avhengig DNA DSB reparasjonshemmer kan anvendes i produksjonen av et medikament for anvendelse i behandlingen av cancer i et individ, hvor nevnte cancer er mangelfull i base utskjæringsreparasjon.

En hemmer av HR-avhengig DNA DSB reparasjon kan inkludere en hemmer med en eller flere av reaksjonsveiskomponentene som er satt fram over. Passende nemmere inkluderer ATM-hemmere.

En ATM-hemmer kan for eksempel være en forbindelse med formel I:

eller en isomer, et salt, en oppløsning, en kjemisk beskyttet form eller et promedikament av den, hvor: Y er enten O eller S;

R1 og R2 er uavhengig hydrogen, en valgfritt substituert C1.7alkylgruppe, C3.20heterocyklylgruppe eller C5.20arylgruppe, eller kan sammen danne, sammen med nitrogenatomet som de er festet til, en valgfritt substituert heterocyklisk ring som har fra 4 til 8 ringatomer; og

R ■3 er en fenylgruppe festet til en valgfritt substituert C5-20karboarylgruppe med en eter-eller tioeterbro, fenylgruppen og valgfritt substituert C5.20karboarylgruppe er valgfritt koblet med enda en brogruppe, som er bundet tilstøtende til eter- eller tioeterbroen på begge grupper slik at den danner en valgfritt substituert C5.7oksygen- eller svovel-inneholdende heterocykel fusert til både fenylgruppen og C5-20karboarylgruppen, fenylgruppen er videre valgfritt substituert.

Slike nemmere er beskrevet i mer detalj i WO 03/070726.

Andre nemmere inkluderer peptidylfragmenter av komponenter av HR-avhengig DNA DSB reparasjon og kodende nukleinsyrer som beskrevet over.

En cancertilstand kan identifiseres som mangelfull i BER-aktivitet ved å anvende en fremgangsmåte som er beskrevet over.

Aspekter i den foreliggende oppfinnelsen vil nå bli illustrert med referanse til de vedlagte figurene som er beskrevet under og eksperimentell eksemplifisering, ved hjelp av eksempel og ikke begrensende. Videre aspekter og utførelsesformer vil være tydelig for fagfolk.

Forskjellige parametere og trekk av oppfinnelsen er satt fram over. For å unngå enhver tvil, så er det fastslått at alle kombinasjoner og underkombinasjoner av disse parametere og trekk er omfattet av den foreliggende oppfinnelsen.

Alle dokumenter som er nevnt i denne spesifikasjonen er her inkorporert ved referanse. Figur 1 viser at en reduksjon i nivået av Parpl reduserer viabiliteten til BRCA1 og BRCA2 mutante celler i forhold til villtypeceller. Figur 2 viser PARP-hemmerne KU0058684, KU0058948 og KU0051529 og deres IC5o'er mot PARP-1 enzymaktivitet. Figurene 3 og 4 viser klonogene overlevelseskurver av celler eksponert for PARP-hemmere. Figur 3 viser Brcal villtype (11CO: ■), heterozygot (Cre6: A) og mangel (CrelO: •) ES celler under kontinuerlig eksponering for PARP-hemmere (KU0058684, øverst;

KU0058948, i midten; KU0051529, nederst). Feilbar representerer standard feil av gjennomsnittet. Figur 4 viser Brca2 villtype (D3: ■), heterozygot (Cre6: A) og mangel (Cre24: •) ES celler under kontinuerlig eksponering for PARP-hemmere (KU0058684, øverst; KU0058948, i midten; KU0051529, nederst). Feilbar representerer standard feil av gjennomsnittet. Figurene 5 og 6 viser klonogene overlevelseskurver etter 1,4 og 24 timers eksponering forKU0058684. Figur 5 viser Brcal villtype (1 ICO: ■), heterozygot (Cre6: A) og mangel (CrelO: •) ES celler etter 1 (øverst), 4 (i midten) og 24 timer (høyre) eksponering for KU0058684. Feilbar representerer standard feil av gjennomsnittet. Figur 6 viser Brca2 villtype (D3: ■), heterozygot (Cre6: A) og mangel (Cre24: •) ES celler etter 1 (øverst), 4 (i midten) og 24 timer (høyre) eksponering for KU0058684. Feilbar representerer standard feil av gjennomsnittet. Figurene 7 og 8 viser at PARP-hemming i BRCA-1 og BRCA-2 mutante celler behandlet med PARP-hemmer resulterte i øket G2/M arrest. Figur 7 viser Brcal villtype (1 ICO: øverst) og mutante (CrelO: nederst) celler behandlet med KU0058684 i 24 timer ved 0 nM (venstre), 10 nM (i midten) eller 1 uM (høyre) og analysert ved hjelp av FACS. Figur 8 viser Brca2 villtype (D3) og mutante (Cre24) celler behandlet med KU0058684 i 24 timer ved 0 nM (venstre), 10 nM (i midten) eller 1 uM (høyre) og analysert ved hjelp av FACS. Figur 9 viser en kvantitativ analyse av Rad51 foci dannelse indusert ved PARP-hemming i villtype celler, men ikke i Brcal eller Brca2 defekte celler. Figur 10 viser en nøytral kometanalyse av BRCA2-/- VC8 og BRCA2 komplementerte VC8-BAC. KU0058684 (1 uM) behandling i 30 timer induserte en signifikant økning i DNA DSB'er bedømt ved en økning i endemoment i BRCA2-/- celler, mens ingen signifikant økning i endemoment er observert i den BRCA2 komplementerte linje.

Gjennomsnittlige data fra 3 uavhengige eksperimenter er vist +/- SEM, med 50 kometer som score for endemoment i hvert eksperiment. Figur 11 viser en mulig modell for de selektive effektene av PARP-hemming på BRCA1 og BRCA2 mutante celler.

Figurene 12 og 13 viser fosfo-histon H3 FACS data for ES celler.

Figur 12 viser fosfo-histon H3 FACS data for Brcal villtype (1 ICO: øverst) og mutante (CrelO:) ES celler og Brca2 villtype (D3) og mutante (Cre24) celler behandlet med KU0058684 i 24 timer ved 0 nM (venstre), 10 nM (i midten) eller 1 uM (høyre) og analysert ved FACS. Figur 13 viser fosfo-histon H3 FACS for VC8 og VC8BAC celler behandlet med 0 uM, 100 uM, 1 nM og 10 nM (henholdsvis venstre mot høyre) KU0058684 i 24 timer. Figurene 14 og 15 viser en analyse av effektene av PARP-hemming i andre celler som mangler BRCA1 og BRCA2 funksjon. Figur 14 viser klonogene overlevelseskurver av Brca2 mangel (V-C8: ■) og komplementerte (V-C8 BAC+: A) celler under kontinuerlig eksponering for PARP-hemmere (KU0058684: øverst, KU0058948: i midten og KU0051529: nederst). Figur 15 viser klonogene overlevelseskurver av Brca2 mangel (V-C8: ■) og komplementerte (V-C8 BAC+: A) celler etter 1 time (øverst), 4 timer (i midten) og 24 timer (nederst) eksponering for KU0058684. Feilbar representerer standard feil av gjennomsnittet. Figur 16 viser tumordannelse i ES xenografer og effekten av behandling med KU0058684; prikket linje - villtype med verktøy, uthevet hel linje - villtype med medikament KU0058684, hel linje - Brca2 mangel med verktøy, oppstreket linje - Brca2 mangel med KU0058684. Figur 17 viser klonale overlevelseskurver av BRCA1 villtype (MCF7-blandet) og BRCA1 dempet (MCF7-3.23) celler under kontinuerlig eksponering for et konsentrasjonsområde av PARP-hemmeren KU0058684 i 12-14 dager. Log

konsentrasjon av hemmer er plottet mot log overlevelsesfraksjon av celler. Feilbar representerer standard feil av gjennomsnittet.

Figur 18 viser klonale overlevelseskurver av BRCA1 villtype (MCF7-blandet) og BRCA1 dempet (MCF7-3.23) celler under kontinuerlig eksponering for et konsentrasjonsområde av PARP-hemmer KU0051529 i 12-14 dager. Log konsentrasjon av hemmer er plottet mot log overlevelsesfraksjon av celler. Feilbar representerer standard feil av gjennomsnittet.

Eksempler

Materialer og fremgangsmåter

RNA interferens

Genspesifikk pSUPER (T. R. Brummelkamp et al., Science 296, 550-3 (2002)) konstruksjoner ble laget som uttrykker de følgende RNAi målsekvenser: (i) muse Parpl

Et 1,6 kb fragment som inneholdt CMVIE promoteren og eCFP (forsterket cyan fluorescerende protein) ble subklonet fra pECFP-Mito (Invitrogen) inn i Sapl setet til de resulterende pSUPER konstruksjonene, og dannet pSUPER- eCFP- Parpl og pSUPER-eCFP- kontroll. D3 ES celler ble transfektert med disse plasmider ved å anvende Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. 48 timer etter transfeksjon, ble totale cellelysater generert ved å anvende en buffer sammensatt av 20 mM Tris pH 8,200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% (v/v) NP40, 10% (v/v) glycerol og proteasehemmere. 30 fig av hvert lysat ble kjørt på elektroforese på Bis-Tris acetat-akrylamid forhåndsstøpte geler (Novex) og blottet over på Trans-Blot nitrocellulose (Biorad). Blot ble probet med enten kanin polyklonalt anti-PARPl antistoff (Cell Signalling, Cat. No. 9542) eller kanin anti-GFP/CFP antiserum (Invitrogen, Cat. No. R970-01), etterfulgt av en sekundær hybridisering med anti-kanin IgG-HRP med etterfølgende kjemiluminescens deteksjon ved å anvende ECL™ (Amersham, UK).

Små molekylhemmere av PARP:

PARP-hemmere ble syntetisert som beskrevet i WO 02/36576. Kjemiske hemmere ble løst i DMSO ved 10 mM og oppbevart ved -20°C i mørke.

Cellelinjer

VC8 celler og muse Brca2 BAC komplementerte derivater var som beskrevet i M. Kraakman-van der Zwet et al, Mol. Cell. Biol. 22,669-79 (2002). ES celler defekte i Brca2 funksjon er blitt beskrevet tidligere (Tutt et al., (2002) EMBO Rep. 3, 255-60). Konstruksjonen av ES celler defekte i Brcal vil bli beskrevet annet sted, men er tidligere blitt validert (Foray et al, (2003) Embo J. 22 2860-71). HBL100 celler ble transfektert med et pSUPER BRCA1 RNAi plasmid og selektert med geneticin i 3 uker. Kloner ble selektert på basis av deres BRCA1 uttrykk, som analysert ved Northern blot.

Klonogene analyser

For måling av sensitivitet for Parpl RNA knockdown, så ble ES celler opprettholdt på vevskulturskåler overtrukket med 0,1% gelatin transfektert som over, med enten pSUPER- eCFP- Parpl eller pSUPER- eCFP- kontroll sammen med en vektor som uttrykker resistens mot antibiotika, blasticidin ( pEF- Bsd, Invitrogen). 24 timer etter transfeksjon ble cellene trypsinert og utsådd i 6-brønners plater. 48 timer etter transfeksjon ble behandling med blasticidin startet og celler ble skiftet på hver tredje dag. Etter 10-14 dager ble celler vasket med PBS, fiksert i metanol og farget med krystallfiolett. Kolonier som inneholder mer enn ca. 50 celler ble talt.

For måling av sensitivitet for kjemiske nemmere, ble cellekulturer i eksponensiell vekst trypsinert og sådd ut ved forskjellig tetthet i 6-brønners plater på Mitomycin C inaktiverte muse embryoniske fibroblaster og ble passende behandlet med hemmere etter 18 timer. For kontinuerlig eksponering, så ble celler skiftet på hver 4 dag med friskt medium og hemmer. For tidseksponering, så ble hemmer tilsatt for den spesifiserte perioden, deretter ble cellene vasket og skiftet på med friskt medium. Etter 10-14 dager ble cellene vasket med PBS, fiksert i metanol og farget med krystallfiolett. Kolonier som inneholder mer enn ca. 50 celler ble talt. Eksperimenter ble utført minst tre ganger i triplikat.

FACS analyse

For måling av DNA-innhold, ble celler fiksert i 70% etanol, inkubert med Rnase A og propidiumjodid (PI) og analysert med en FACS Calibur (Becton Dickinson). For fosfo-histon H3 analyse, så ble celler fiksert i 70% etanol, permeabilisert med 0,25% triton X- 100, inkubert med anti-fosfo-histon H3 antistoff (Upstate Biotechnology) i 3 timer, og deretter med FITC-antikanin IgG (Serotec) i 30 minutter. Prosessering for FACS analyse var som over.

Apoptotisk analyse

Celler ble trypsinert, både kultursupernatant og vaskemedium ble bevart. Disse ble slått sammen og cellene ble vasket i kald PB S-A før resuspensjon ved lxlO<6>celler/ml i bindingsbuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2(pH 7,4)). 100 ul suspensjon ble inkubert i mørke med 5 (il Annexin V-FITC (BD Biosciences) / 0,1 ug propidiumjodid i 15 minutter ved romtemperatur, 400 ul bindingsbuffer ble tilsatt og analysert øyeblikkelig på en FACS Calibur (BD Biosciences).

Rad 51 focus dannelse

ES celler ble dyrket i 48 timer i varierende konsentrasjoner av PARP-hemmer fiksert i 4% paraformaldehyd i PBS og permeabilisert med 0,2% Triton XI00 i PBS. Celler ble farget med 1:100 fortynning av kanin anti-Rad51 polyklonalt antistoff (Ab 551922, BD-Pharmingen, Oxford, UK). Etter vasking ble det primære antistoffet visualisert med Alexa Fluor-555 geit antikanin IgG (Alexa) og kjerner med TO-PRO-3 jodid (Molecular Probes). Rad51 foci ble visualisert med og kvantifisert ved å anvende et Leica TCS-SP2 konfokalt mikroskop.

Kometanalyse

VC8 og VC8-BAC celler ble platet ut 24 timer før behandling med 1 uM KU0058684 i 30 timer. Alt videre arbeid ble utført i mørke. Celler ble vasket med og skrapet i PBS før kometanalysen som beskrevet (Lemay og Wood, 1999). Celler suspendert i LMP agarose (0,5% i PBS) ble spredd på komet objektglass (Trevigen, Gaithersburg) og plassert ved 4°C inntil de hadde satt seg, før lyses i 45 minutter i 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-base, 1% natriumlaurylsarkosinat, 0,01% Triton X-100. Objektglassene ble overført til TBE i 5 minutter før elektroforese ved 18 volt i 15 minutter. Objektglassene ble så fiksert i 100% etanol i 5 minutter og lufttørket før tilsettingen av SYBR grønn farge og visualisering ved epifluorescens ved å anvende fluoresceinfiltere (Nikon). Kometer ble analysert ved å anvende Comet software modulen til Lucia G billedpakken levert av Nikon. 50 kometer per datapunkt ble undersøkt for hver av de tre uavhengige eksperimentene og det gjennomsnittlige endemomentet beregnet.

Mitotisk kromosomanalyse

ES-celler ble sådd ut på gelatin, behandlet i 24 timer med kjemiske hemmere, etterfulgt av kolcemidbehandling i 1 time. Celler ble høstet, fiksert, droppet på objektglass, tørket og farget med DAPI før kromosomanalyse under et mikroskop.

ES- celle xenografter og behandling med KU0058684

ES-celleutledede tumorer (teratomas) ble produsert ved subkutan injeksjon av 2 x IO<8>ES-celler inn i 6-8 uker gamle atymiske BALB/c nakne (nu/nu) mus. 20 mus ble injisert med Brca2-manglende ES-celler og en identisk kohort med isogen villtype celler. To dager etter celleinjeksjon, så ble behandling med KU0058684 eller verktøy initiert. I tre etterfølgende dager så ble to intraperitoneale doser av KU0058684 (eller verktøy) administrert, 6 timer mellom hver dose, hver ved en dosering på 15 mg/kg dyr. Denne behandling ble så stoppet i 5 dager og deretter reinitiert (som før) for enda 3 etterfølgende dager. Vekst av tumor ble målt fra et minimumvolum på 0,3 cm<3>. Dataene i Figur 16 representerer to separate eksperimenter som involverer totalt 40 dyr.

Produksjon av BRCAl- celle- defisient linje

MCF7 sammenrørte og MCF7-3.23 cellelinjer ble generert ved stabil transfeksjon av MCF7 bryst adenokarcinomaceller med genspesifikke pSUPER konstruksjoner. Genspesifikke pSUPER konstruksjoner ble generert til å uttrykke de følgende RNAi målsekvensene: (i) human BRCA1 5'-GGAACCTGTCTCCACAAAG-3' (ii) sammen-rørt kontroll 5'-CATGCCTGATCCGCTAGTC-3'. Et 1,8 kb fragment inneholdende den humane EF la promoteren og blasticidinresistensgenet (bsd) ble subklonet fra pEFBsd (Invitrogen) inn i Sapl setet til de resulterende pSUPER-konstruksjonene, og genererte pSUPER-Bsd-BRCAl og pSUPER-Bsd-sammenblandet. MCF7-celler ble transfektert med disse plasmider ved å anvende FuGene6 (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter seleksjon i blasticidin, så ble resistente kloner fastslått ved real time PCR for demping av BRCA1 mRNA (Egawa et al., Oncology, 2001; 61(4): 293-8; Egawa et al, Int. J. Cancer, 2001, 20. juli; 95(4): 255-9). Kloner med reduserte nivåer av BRCA1 mRNA ble dyrket (under blasticidinseleksjon) i løpet av 8 passasjer og real-time analysen repetert. Cellelinje MCF7-3.23 viste seg å ha bare 30% uttrykk av BRCA1 sammenlignet med MCF7 kloner som hadde konstruksjonen pSUPER-Bsd-sammenrørt.

Resultater

Reduksjon i Parpl proteinnivåer ved hjelp av siRNA

Et plasmid ( pSUPER- eCFP- Parpl) som uttrykker et Parpl spesifikt siRNA under kontrollen av Hl promoteren (T. R. Brummelkamp et al., Science 296,550-3 (2002)) og forsterket cyan fluorescerende protein (eCFP) under kontrollen av CMV IE promoteren ble transfektert inn i D3 museembryone stamceller. Som en kontroll, så ble et plasmid som uttrykker et ikke-relatert sammenrørt siRNA, pSUPER- eCFP- kontroll separat transfektert. 48 timer etter transfeksjon, ble cellelysater laget og analysert ved western blotting. Blottene ble probet med enten et polyklonalt anti-PARP-1 antistoff eller et anti-GFP/CFP antiserum.

Nivåer av PARPl i de Parpl spesifikke siRNA uttrykkende cellene ble observert å være mye lavere enn PARPl-nivåene i kontrollcellene. Nivåer av eCFP var lignende i både Parpl siRNA uttrykkende celler og kontrollceller.

Reduksjon i viabiliteten avBRCAl- og BRCA2- manglende celler etter Parpl- spesifikk siRNA knockdown

Villtype, Brcal"<7>" og Brca2_</>" museembryone stam (ES)-celler ble transfektert med enten pSUPER- eCFP- Parpl eller pSU?ER- eCFP- kontroll sammen med et blasticidinresistens-kodende plasmid pEF-Bsd i et 10:1 forhold. Blasticidinresistens-kloner ble selektert og kvantitert. Resultatene er vist i Figur 1 plottet som antall kolonier etter transfeksjon av pSUPER- eCFP- Parpl i forhold til antall etter transfeksjon av pSUPER- eCFP- kontroll. Feilbar er lik et standard avvik rundt gjennomsnittet.

Etter korreksjon for transfeksjonseffektivitet ved å anvende kontroll siRNA, var det tydelig at overlevelsen av både Brcal- og Brca2-manglende celler var betraktelig redusert når uttrykket av Parpl var hemmet.

Reduksjon i viabiliteten av BRCA1- og BRCA2- manglende celler etter kjemiske PARP-hemmere

Kjemiske nemmere av Parp-aktivitet ble benyttet for å bekrefte den selektive hemmingen av Brcal - og Brca2-manglende celler observert over. To forskjellige PARP-hemmere, KU0058684, KU0058948 og en svakt aktiv, men kjemisk relatert forbindelse KU0051529 ble anvendt (Fig. 2). Disse nye PARP-hemmerne er basert rundt en ftalazin-l-on kjerne og er kompetitive hemmere med hensyn til PARP substratet NAD<+>. KU0058684 og KU0058948 er potente og spesifikke hemmere av poly(ADP-ribose) polymeraseaktiviteten til proteinene PARP-1 og PARP-2 og hemmer ikke "vault" PARP, tankyrase eller PARP-3 ved konsentrasjoner opp til 1 uM. Omvendt så er KU0051529~250 ganger mindre effektiv i hemmingen av disse enzymer til tross for at den er kjemisk relatert.

KU0058684, KU0058948 og KU0051529 ble anvendt for å probe sensitiviteten av celler som mangler Brcal eller Brca2 for hemmingen av PARP-aktivitet. Klonogene analyser viser at både Brcal - og Brca2-manglende cellelinjer var ekstremt sensitive for KU0058684 og KU0058948 sammenlignet med andre isogene celler (Figurene 3, 4). SF50 (dosen hvor 50% av cellene overlevde) for KU0058684 var 3,5 x 10"<8>M for Brcal og 1,5 x 10"<8>M for Brca2; for villtype celler så var dette rundt 3,5 x 10"<8>M. Dette representerer faktorer på 57 ganger og 133 ganger øket sensitivitet for henholdsvis Brcal og Brca2 mutante celler sammenlignet med villtype. Lignende resultater ble skaffet til veie med kinesisk hamster ovarieceller som mangler Brca2, som viste mer enn 1000 ganger øket sensitivitet sammenlignet med et Brca2-komplementert derivat (Figur 14 og 15). Sensitiviteten av Brcal og Brca2 mutante celler for KU0058948 var til og med større enn den til KU0058684.1 motsetning til dette, så hadde KU0051529 ingen selektiv effekt på cellene som manglet villtype Brcal eller Brca2 sammenlignet med villtype celler. I sammenheng med siRNA-dataene, så demonstrerer dette at mekanismen for sensitivitet er spesifikk gjennom hemming av PARP. Det er verdt å legge merke til at ingen av hemmerne hadde noen selektiv effekt på celler som var heterozygote for Brcal eller Brca2 mutasjon.

Tidsavhengighet for effektene på KU0058684 på klonogen overlevelse av Brcal- og Brca2- manglende celler

Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av KU0058684 i definerte tidsperioder. Hemmeren ble så fjernet og effektene målt ved å anvende en klonogen analyse. De hemmende effektene til KU0058684 på klonal vekst var tydelige etter en relativt kort eksponeringstid, 4 timer, og var essensielt fullstendige etter 24 timers eksponering (Figur 5 og 6). Effektene av PARP-hemming ble funnet å være irreversible etter som en kort eksponering etter 10-14 dager i fravær av hemmeren hindret vekst.

Effekt av PARP- hemming på cellesyklusarrest

FACS-analyse ble anvendt for å bestemme om PARP-hemming resulterte i cellesyklusarrest. Celler ble eksponert med KU0058684 i forskjellige perioder og deretter merket med BrdU og delen av celler i hver fase i cellesyklusen. Resultatene er vist i Figur 7 og 8. KU0058684 ble observert å fremkalle en inngående arrest av celler med et tetraploid DNA-innhold som indikerer arrest i G2eller M fase i cellesyklusen. For videre å karakterisere denne arrest, så ble celler analysert for både DNA-innhold og for fosforylert Histone H3, en M fase markør. For videre å karakterisere denne arrest, så ble celler analysert for både DNA-innhold og for fosforylert Histone H3, en M fase markør (Figur 12 og 13). Hovedmengden av arresterte celler ble ikke merket med anti-fosfo Histone H3 antistoffer, noe som indikerer at hovedparten av cellene var arrestert i G2.

Rad51 foci dannelse

Et kjennetegn på Brca-avhengig dobbeltrådbruddreparasjon er dannelsen av foci i kjerner som inneholder Rad51. Evnen til KU0058684 til å fremkalle Rad51 foci i villtype og i Brcal - og Brca2-manglende celler ble undersøkt.

Villtype og Brcal- og Brca2-defekte ES-celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av KU0058684 i 48 timer. Celler ble så fiksert og farget for RAD51 foci som beskrevet av Tarsounas (Tarsounas M. et al., Oncogene. 2003, 22(8): 1115-23).

I villtype ES-celler så forårsaket KU0058684 Rad51 foci dannelse på en doseavhengig måte (Figur 9). I motsetning til dette, ble ingen foci indusert i Brcal- eller Brca2-manglende celler. Dette siste funnet er i overensstemmelse med tidligere observasjoner at DNA-ødeleggende midler ikke forårsaker Rad51 focus dannelse i Brcal- eller Brca2-manglende celler.

KU0058684 er derfor vist å indusere lesjoner, slik som dobbeltråd DNA-brudd eller lesjoner som degenererer til dobbeltråd DNA-brudd, som repareres av et kompleks som involverer Rad51 og som krever Brcal og Brca2. Det er viktig å legge merke til at KU0051529 ikke induserte Rad51 focus dannelse ved sammenlignbare doser, noe som understreker spesifisiteten av sensitiseringsmekanisme.

Kometanalyse

For å bestemme om hemming av PARP-aktivitet fører til produksjonen av DNA dobbeltrådbrudd, så ble nøytrale kometanalyser utført på Brca2 mutante celler og deres isogene motparter. Resultatene er vist i Figur 10. Etter en 30 timers eksponering for 1 uM KU0058684, så var det en 4,7 gangers økning i endemomentet til Brca2-manglende VC8-celler og ingen signifikant økning i endemoment for den komplementerte VC8-BAC linje. Dette resultatet viser at DNA dobbeltrådbrudd indusert av PARPi blir etterlatt ureparert i den Brca2-manglende linjen.

Mitotisk kromosomanalyse

Undersøkelse av mitotiske kromosomer av Brcal - og Brca2-manglende celler viste at KU0058684-behandling resulterte i hyppige store avvik. Disse inkluderte kromatidbrudd og tri-radiale og kvadri-radiale kromosomer. Disse fenotyper tilveiebringer indikasjon på en feil til å reparere dobbeltrådbrudd av søster-kromatidgenomdannelse og den forhøyede anvendelse av alternative feil-"prone" reaksjonsveier.

ES- celle xenografter og behandling med KU0058684

Isogene og Brca2-manglende ES-celleutledede tumorer (teratomas) ble produsert i atymiske BALB/c nakne (nu/nu) mus som beskrevet over.

Effekten av KU0058684 på veksten av villtype og Brca2-manglende xenograft tumorer ble målt og resultatene vist i Figur 16.

KU0058684 ble observert å dramatisk redusere veksten av Brca2-manglende tumorer i forhold til villtype tumorer.

Effekt av PARP- hemming i BRCAl- cellemanglende linjer

MCF7-sammenrørte og MCF7-3.23 cellelinjer ble produsert som beskrevet over. MCF7-3.23 ble funnet å ha 30% uttrykk av BRCA1 sammenlignet med MCF7-sammenrørt.

Både MCF7-sammenrørte og MCF7-3.23 celler ble behandlet med KU0058684 og KU0051529 og overlevelse av cellene ble bestemt (Figur 17 og 18). KU0058684 er en potent PARP-hemmer, mens KU0051529 er mindre effektiv.

Verken MCF7-sammenrørte eller MCF7-3.23 celler viste signifikant sensitivitet for KU0051529 (Figur 18). Begge cellelinjer var imidlertid sensitive for KU0058684.

MCF7-3.23 celler viste seg å være signifikant mer sensitive for KU0058684 enn MCF7-sammenrørte celler.

Interaksjon mellom PARP og den HR- avhengige DNA DSB reaksjonsveien

Uten å begrense omfanget av oppfinnelsen på noen måte, så er en mulig modell for interaksjon mellom PARP og den HR-avhengige DNA DSB reaksjonsveien vist i Figur 11.

DNA enkeltrådbrudd (SSB) dannes på grunn av oksidativ skade og dets reparasjon. Hemming av Parp-1 PAR polymeraseaktivitet hindrer sammenstillingen av XRCC1 skaffoldproteinet og etterfølgende SSB gap innfylling av DNA polymeraser (Figur 11A).

Store antall SSB'er vedblir og møtes av DNA replikasjonsgafler. Fraværet av en templattråd ved SSB fører til en DSB og kan, avhengig av posisjonen, forårsake at replikasjonsgaffelen kollapser (Figur 1 IB).

Nærheten av et uskadet søster-kromatidtemplat tillater invasjon av søster-kromatidet ved RAD51 overtrukket enkeltrådet DNA filament og initiering av søsterkromatid-rekombinasjonsreparasjon. Denne prosess er avhengig av BRCA1 og BRCA2 og er assosiert med dannelsen av multiple nukleære foci av RAD51. Kollapsede replikasjonsgafler kan startes igjen ved en lignende mekanisme (Figur 11C).

Når Holliday-koblinger ved rekombinasjonsintermediater er oppløst, så kan en søsterkromatidutbytting (SCE) finne sted. Overskuddsantallet av SSB'er som møtes av replikasjonsgaflene i løpet av Parp-1 hemming fører til en økning i SCE'er (Figur 1 ID).

I fraværet av funksjonell BRCA1 eller BRCA2 så bli RAD51 focusdannelse og søster-kromatidrekombinasjon alvorlig skadet. Overskudd ureparerte SSB'er danner DNA DSB'er i løpet av DNA-replikasjon, men søsterkromatidrekombinasjon finner ikke sted. De forblir ureparerte som kromatidbrudd eller de blir reparert ved feil-prone RAD51 uavhengige mekanismer som forårsaker komplekse kromosom-rearrangementer. Disse celler arresterer når de møter G2/M DNA skadesjekkpunktet og blir permanent arrestert eller går i apoptose (Figur 11E).

RNAi data tilveiebrakt her, sammen med observasjonen at KU0051529 var ineffektiv, viser at PARP-hemming er ansvarlig for sensitiseringseffektene som er observert.

PARP-hemming induserer lesjoner som normalt repareres av søsterkromatidutbytting (SCE) (Wang Z. Q. et al, (1997) Genes Dev. Vol. 11(18): 2347-58, og "From DNA damage and stress signalling to cell death", G. de Murcia og S. Shall eds., Oxford University Press (2000)). PARP-hemming er kjent å øke SCE, uten samtidig økning i genomdannelse av DSB'er og derfor ingen global økning i den Rad51-avhengige rekombinasjonsreaksjonsveien (Schultz N. et al, 2003, Nucleic Acids Research; vol. 31 (17): 4959-4964).

Den syntetiske letalitetstilnærmingsmåten beskrevet her kan være nyttig både i behandlingen av a) tumorer i BRCA-bærere, b) tumorer hvor andre komponenter av HR-avhengige DNA DSB reparasjon er defekte.

Selv om forskjeller er blitt beskrevet i alder på start og patologi for tumorer i bærere av BRCA-mutasjoner, så er behandling den samme på det nåværende tidspunkt for pasienter med sporadisk sykdom. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny tilnærmingsmåte for disse tumorer som beskrevet her.

Signifikant så ble ingen heterozygot effekt observert. Dette er viktig for den terpeutiske anvendelsen av de beskrevne fremgangsmåtene i heterozygote bærere av mutasjoner i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien, inkludert for eksempel BRCA1/2 mutasjoner.

Claims (25)

1. Anvendelse av poly (ADP-ribose)polymerase (PARP) inhibitor for fremstilling av et medikament for anvendelse i behandlingen av cancer i et individ, hvor nevnte cancer har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjonsreaksjonsvei, hvori PARP inhibitoren er valgt fra gruppen bestående av: nikotinamider, benzamider, forskjellige fra 3-aminobenzamid, isokinolinoner, dihydroisokinolinoner, benzimidazoler, forskjellige fra benzimidazol-karboksamider, indoler, forskjellige fra tricykliske laktamindoler, ftalazinoner, kinazolinoner, forskjellige fra kinazolin-4-[3H]-oner, isoindolinoner, fenantridiner, fenantridinoner, forskjellige fra 6 (5H) fenantridinon, benzopyroner, umettede hydroksimsyrederivater, pyridiziner, caffein, teofyllin og tymidin, og hvor nevnte cancer i individet tidligere er identifisert som at den har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjonsvei.

2. Anvendelse av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor ved fremstillingen av et medikament for anvendelse i behandling av cancer som har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjonsvei i et individ, hvor PARP inhibitoren er valgt fra gruppen bestående av: nikotinamider; benzamider valgt fra gruppen bestående av 3-hydroksybenzamid, 3-nitrosobenzamid, 3-metoksybenzamid og 3-klorprokainamid, 4-aminobenzamid og 1,5-di [(3-karbamoylfenyl)aminokarbonyloksy]pentan og analoger og derivater derav; isokinolinoner; dihydroisokinolinoner; benzimidazoler og indoler valgt fra gruppen bestående av benzoksazol-4-karboksamider, 2-cykloalkylbenzimidazol-4-karboksamider, kinoksalinkarboksamider, imidazopyridinkarboksamider, 2-fenylindoler, 2-substituerte benzoksazoler, 1,3,4,5-tetrahydro-azepino[5,4,3-cd]indol-6-on, azepinoindoler, azepinoindoloner, 3-substituerte dihydrodiazapinoindolinoner, tetrahydrodiazapinoindolinon, 5,6-dihydroimidazo[4,5,l-jk][l,4]benzodiazepin-7(4H)-on, 2-fenyl-5,6-dihydroimidazo[4,5,l-jk][l,4]benzodiazepin-7(4H)-on og 2,3-dihydro-isoindol-l-on og analoger og derivater derav; ftalazinoner; kinazolinoner valgt fra gruppen bestående av 4-hydroksykinazolin og analoger og derivater derav; isoindolinoner; fenantridiner; fenantridinoner valgt fra gruppen bestående av substituerte 5[H]fenantridin-6-oner, tieno[2,3-c]isokinoloner, N-(6-okso-5,6-dihydrofenantridin-2-yl]-2-(N,N-dimetylamino)acetamid, substituerte 4,9-dihydrocyklopenta[lmn]fenantridin-5-oner; benzopyroner; umettede hydroksimsyrederivater; pyridaziner; kaffein, teofyllin og tymidin, hvor nevnte cancer i individet tidligere er identifisert som at den har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjonsvei.

3. Anvendelse av en poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor ved fremstillingen av et medikament for anvendelse i behandling av cancer som har mangel på HR-avhengig DNA DSB reparasjonsvei i et individ, hvor nevnte cancer i individet på forhånd er identifisert som at den har mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjonsvei og hvor PERP inhibitoren er formulert i en kapsel, pulverkapsel eller tablett for oral administrering.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor PARP inhibitoren er valgt fra gruppen bestående av nikotinamider, benzamider, isokinolinoner, dihydroisokinolinoner, benzimidazoler, indoler, ftalazin-l(2H)-oner, kinazolinoner, isoindolinoner, fenantridiner, benzopyroner, umettede hydroksimsyrederivater, kaffein, teofyllin og tymidin og analoger og derivater derav.

5. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 4, hvor nevnte cancer omfatter en eller flere cancerceller som har en redusert eller opphevet evne til å reparere DNA DSB ved hjelp av HR i forhold til normale celler.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 5, omfattende trinnet med identifisering av en cancertilstand i et individ som mangelfull i HR-avhengig DNA DSB reparasjon.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor nevnte cancer identifiseres som en cancer som har mangler ved HR-avhengig DNA DSB reparasjon ved å bestemme den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsaktiviteten av cancerceller fra individet relativt til normale celler.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvor aktiviteten av den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsveien bestemmes i cancercellene ved å måle dannelsen av foki inneholdende Rad51 i kjernen som respons på DNA ødeleggende midler eller PARP inhibitorer.

9. Anvendelse ifølge krav 6, hvor nevnte cancer identifiseres som mangelfull i HR-avhengig DNA DSB reparasjon ved å bestemme aktiviteten av en eller flere komponenter av den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsveien i cancerceller fra individet relativt til normale celler.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor nevnte cancer identifiseres som mangelfull i HR-avhengig DNA DSB reparasjon ved å bestemme nærværet i cancerceller fra individet av en eller flere mutasjoner eller polymorfier i en nukleinsyresekvens som koder en komponent av den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsveien, hvor nevnte ene eller flere mutasjoner eller polymorfier reduserer eller opphever funksjonen eller ekspresjonen av komponenten av den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsveien.

11. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 10, hvor nevnte cancerceller har en BRCA1- eller BRCA2-mangel fenotype.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor nevnte cancerceller har mangler i BRCA1 eller BRCA2.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor nevnte cancerceller er homozygote for en mutasjon i BRCA1 eller BRCA2.

14. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13, hvor nevnte individ er heterozygot for en mutasjon i et gen som koder for en komponent i den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor nevnte individ er heterozygot for en mutasjon i BRCA1 og/eller BRCA2.

16. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående kravene, hvor nevnte cancer er bryst-, ovarie-, pancreas- eller prostatacancer.

17. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor nevnte PARP-inhibitor er en ftalazin-l(2H)-on eller en analog eller et derivat av den.

18. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 17, hvor nevnte medikament videre omfatter et DNA-ødeleggende kjemoterapeutisk middel.

19. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 17, hvor nevnte behandling videre omfatter å administrere et DNA-ødeleggende kjemoterapeutisk middel.

20. Fremgangsmåte for å fastslå aktiviteten av den HR-avhengige DNA DSB reparasjonsreaksjonsveien i en cancertilstand i et individ, omfattende; å la en PARP-inhibitor in vitro komme i kontakt med en prøve av cancerceller skaffet til veie fra individet som har tilstanden, og; å bestemme mengden av celledød i nevnte prøve.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, hvor nevnte PARP-inhibitor er valgt fra gruppen som består av nikotinamider, benzamider, isokinolinoner, dihydroisokinolinoner, benzimidazoler, indoler, ftalazin-l(2H)-oner, kinazolinoner, isoindolinoner, fenantridiner, benzopyroner, umettede hydroksimsyrederivater, koffein, theofyllin og thymidin, og analoger og derivater derav.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor nevnte PARP-inhibitor er en ftalazin-l(2H)-on eller en analog eller et derivat av den.

23. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 22, hvor canceren er identifisert som å ha mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjon.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, hvor canceren er identifisert som å ha en BRCA1- eller BRCA2-mangel fenotype.

25. Fremgangsmåte for å forutsi responsen av en cancertilstand i et individ på en behandling som målretter cancerens mangel i HR-avhengig DNA DSB reparasjon, som kan omfatte; å la en PARP-inhibitor komme i kontakt in vitro med en prøve med cancerceller skaffet til veie fra individet som har cancertilstanden, og; å bestemme mengden av celledød i nevnte prøve.