MXPA06000953A - Uso de arni que inhibe la actividad de parp para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cancer - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con el uso de un agente de inhibe la actividad de una enzima que media la reparación de una ruptura de una hebra de ADN en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades causadas por un defecto en un gen que media la recombinación homóloga.

Description

USO DE ARNI QUE INHIBE LA ACTIVIDAD DE PARP PARA LA MANUFACTURA DE UN MEDICAMENTO PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con el uso de un agente que inhibe la actividad de una enzima que media la reparación de las rupturas de la hebra de ADN en el tratamiento de algunas formas de cáncer en particular cáncer de mama. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La recombinación homologa (HR, por sus siglas en inglés) se ha mostrado que juega un papel importante en la reparación del daño que se presenta en las horquillas de replicación de ADN en las células de mamífero (2) . De esta manera, las células deficientes en HR muestran un crecimiento retardado y exhiben mayor nivel de inestabilidad genética. Se cree que la inestabilidad genética debida a la pérdida de la reparación de HR en los cánceres humanos contribuye significativamente al desarrollo de cáncer en estas células (1) . La modificación post-transcripcional de las proteínas nucleares por poli (ADP-ribosil) ación (PARP) en respuesta a las rupturas de la hebra de ADN juega un papel importante en la reparación del ADN, regulación de la apoptosis y mantenimiento de la estabilidad genómica. La poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP-1) es una proteína nuclear abundante en las células de mamíferos que cataliza la REF.: 169644 formación de polímeros de poli (ADP-ribosa) (PAR) usando NAD+ como sustrato. En el daño del ADN, PARP-1 se enlaza rápidamente a una ruptura de la hebra de ADN (hebra simple o hebra doble) y cataliza la adición de las cadenas de PAR cargadas negativamente a estas mismas (automodificación) y otras proteínas (ver [3, 4] para revisiones) . La unión de PARP-1 a rupturas de la hebra de ADN se cree que protege las lesiones del ADN del procesamiento adicional hasta PARP-1 se disocia de la ruptura por la carga negativa acumulada que resulta de los polímeros de PAR (5, 6) . Aunque PARP-1 ha sido implicada en varios procesos nucleares, tales como modulación de la estructura de cromatina, replicación de ADN, reparación y transcripción de ADN, PARP-1 se desarrolla normalmente en ratones agénicos (ratones sin funcionalidad del gen resultante) (7) . Las células aisladas de estos ratones exhiben un fenotipo de hiper recombinación e inestabilidad genética en la forma de niveles aumentados de SCE, micronúcleo y tetraploidia (8-10) . La inestabilidad genética también se puede presentar en estos ratones agénicos de PARP-1 a través del acortamiento del telómero,- aumento de la frecuencia de la fusión de cromosomas y aneuploidia (11) , aunque todos estos resultados no puede repetirse en otro grupo de ratones agénicos de PARP-1 (12) . En los ratones agénicos anteriores, el rescate de la mutación nula de PARP-1 dañó la recombinación de V(D)J en ratones SCID Estos resultados apoyan el punto de vista sugerido por Lindahl y colaboradores de que PARP-1 tiene un papel protector contra la recombinación (5) . Propusieron que la unión de PARP-1 a las rupturas' de la hebra de ADN evita la maquinaría de recombinación del reconocimiento y procesamiento de las lesiones de ADN o, de manera alternativa, que las cargas negativas acumuladas después de la poli ADP-ribosilación repelen las secuencias de 7ADN recombinogénicas adyacentes. Únicamente el último modelo es consistente con la inhibición de PARP-1 misma y la expresión de una PARP-1 mutante negativa dominante, que induce SCE, la amplificación del gen y la recombinación hom loga (HR [14-18]), Los estudios basados en el tratamiento de células con inhibidores de PARP o células derivadas de PARP-1 o PARP-2 en ratones agénicos indican que la supresión de la actividad de PARP-1 aumenta la susceptibilidad celular a los agentes que dañan el ADN e inhibe la re-unión de la ruptura de la hebra (3, 4, 8-11, 19, 20, 47) . Los inhibidores de la actividad de PARP-1 se han usado en combinación con los agentes anticáncer tradicionales, tales como radioterapia y quimioterapia (21) . Los inhibidores se usan en combinación con agentes de metilación, venenos de topoisomerasa y radiaciones ionizantes y se encontraron que mejoran la efectividad de estas formas de tratamiento. Estos tratamientos, sin embargo, se conoce que causan daño y muerte a las células no cancerosas o "saludables" y se asocian con efectos secundarios no placenteros. Por lo tanto, hay una necesidad para un tratamiento para el cáncer que es tanto efectivo como selectivo para matar las células del cáncer y que no necesita determinarse en combinación con los tratamientos de radio y quimioterapia. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que las células deficientes en la recombinación homologa (HR) son hipersensibles a los inhibidores PT?RP comparado con las células de tipo silvestre . Esto es sorprendente dado que los ratones agénicos de P7ARP-1 viven normalmente, lo que indica que PARP-1 no es esencial para la vida. De esta manera, podría esperarse que las células fueran sensibles a la inhibición de PARP. De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente que inhibe la actividad de una enzima que media la reparación de las rupturas de la hebra de ADN en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que son causadas por un defecto genético en un gen que media la recombinacióri homologa. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad o condición en un mamífero, incluyendo el humano, que es causada por un defecto genético en un gen que media la recombinación homologa, el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que inhibe la actividad de una enzima que media la reparación de las rupturas de la hebra de ADN u otras lesiones presentes en las horquillas de replicación. En un aspecto preferido la enzima es PARP . En un aspecto preferido adicional el agente es un inhibidor de PARP o una molécula de ARNi específica para el gen de P7?RP . En un aspecto preferido adicional, el uso está en el tratamiento de cáncer. De preferencia, el medicamento es una composición farmacéutica que consiste del inhibidor de PARP en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La sensibilidad específica de los tumores deficientes en HR para la inhibición de PARP-1 significa que las células que se dividen normalmente en el paciente no serán afectadas por el tratamiento. El tratamiento de las células cancerígenas deficientes en HR usando un inhibidor de PARP también tiene la ventaja de que no necesita administrarse como una terapia de combinación junto con los tratamientos de radio y quimioterapia convencionales, por lo que se evitan los efectos secundarios asociados con estas formas de tratamiento convencionales . Un defecto genético en un gen que media la recombinación homologa puede ser debido a una mutación en ausencia de, o expresión deficiente de, un gen que codifica una proteína involucrada en la HR. En un aspecto adicional, la invención proporciona además el uso de un inhibidor de PARP en la manufactura de un medicamento para inducir la apoptosis en las células deficientes en la HR. En otro aspecto, la invención proporciona un método para inducir la apoptosis en las células deficientes en HR en un mamífero, el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de PARP. Provocando la apoptosis en las células deficientes en la HR, debería ser posible reducir o interrumpir el crecimiento de un tumor en el mamífero. De preferencia, las células deficientes en HR son células cancerígenas . Las células cancerígenas en la HR pueden ser parcial o totalmente deficientes en la HR. De preferencia, las células cancerígenas son totalmente deficientes en la HR. El término "cáncer" o "tumor" incluye cáncer de pulmón, colon, pancreático, gástrico, ovario, cervical, mama o próstata. El cáncer también puede incluir cáncer de piel, renal, hígado, vejiga o cerebral. En un aspecto preferido, el cáncer es en un mamífero, de preferencia el humano. El cáncer que se tratará puede ser una forma heredada de cáncer en donde el paciente que se tratará tiene una predisposición familiar al cáncer. De preferencia, el cáncer que se tratará en el cáncer hereditario enlazado con los genes. En una modalidad preferida de la invención el cáncer es cáncer de mama hereditario enlazado con los genes . En un aspecto preferido, el inhibidor de PARP es útil en el tratamiento de células cancerígenas deficientes en la expresión de un gen involucrado en la HR. Los genes con una función sugerida en la HR incluyen XRCC1, ADPRT (PARP-1) , ADPRTL2 (PARP-2), CTPS, RPA, RPA1 , RPA2 , RPA3 , XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2 , XRCC3, BRCA1, BRCA2 , RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NBS1, WRN, BLM, Ku70, Ku80, ATM, ATR, chkl , chk2 , FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, RAD9 , FEN-1, Musdl, Emel, DDS1, BARD (ver (2, 3, 5, 22-28) para revisiones) . Un gen involucrado en la HR puede ser un gen supresor de tumores. De esta manera la invención proporciona el tratamiento de células cancerígenas deficientes en la expresión de un gen supresor de tumores. De preferencia, el gen supresor de tumores es BRCA1 o BRCA2. En la actualidad, el cáncer de mama es la enfermedad de cáncer más común entre las mujeres en el mundo Occidental.

Algunas ' familias tienen una fuerte predisposición para el cáncer de mama, el cual es a menudo debido a una mutación hereditaria en' un alelo de BRCAl o BRCA2. Sin embargo, estos pacientes aún mantienen un alelo funcional. De esta manera, estos pacientes se desarrollan normalmente y no tienen consecuencia fenotípica de esta mutación. Sin embargo, en una célula, el alelo funcional puede perderse, haciendo a estas células cancerosas y al mismo tiempo deficientes en la recombinación homologa (HR) . Esta etapa es critica para el inicio de un tumor (1) . Los presentes inventores han encontrado sorpresivamente que las células deficientes en BRCA2 son 100 veces más sensibles a la citotoxicidad del inhibidor de PARP, NU1025, que las células de tipo silvestre . De esta manera, en un aspecto preferido, la invención proporciona el uso de un inhibidor de PARP en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de células cancerígenas deficientes en la HR, por ejemplo, debido a la pérdida de la expresión de BRCAl y/o BRCA2. Las células cancerígenas que se tratarán pueden ser parcial o totalmente deficientes en la expresión de BRCAl o BRCA2. Las mutaciones de BRCAl y BRCA2 pueden identificarse usando las técnicas de PCR múltiples, las técnicas de arreglo (29, 30) o usando otras técnicas de selección conocidas por los experimentados en la técnica.

Los inhibidores de PARP usados en la presente invención pueden seleccionarse de los inhibidores de PARP-1, PARP-2, PARP-3, PARP-4, tanquirasa 1 o tanquirasa 2 (ver 31 para una revisión) . En una modalidad preferida, el inhibidor de PAPR útil en la presente invención es un inhibidor de la actividad de PARP-1. Los inhibidores de PARP útiles en la presente invención incluyen benzimidazol-carboxamidas, quinazolin-4- [3H] -onas y derivados de isoquinolina (por ejemplo, 2- (4-hidroxifenil) benzimidazol-4-carboxamida (NU1085) , 8-hidroxi-2-metilquinazolin-4- [3H] ona ' (NU1025) ; 6 (5H) fenantridinona; 3 aminobenzamida; benzimidazol-4-catboxamidas (BZ1-6) e índoles de lactama tricíclicos (Tll-5) [32] . Los inhibidores adicionales de PARP pueden identificarse ya sea por diseño [33] o la nueva prueba FlashPlate [34] . El inhibidor de PARP formulado como una composición farmacéutica puede administrarse de cualquier manera efectiva, conveniente para dirigir las células cancerígenas incluyendo, por ejemplo, administración por las rutas oral, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intranasal, entre otras. Los vehículos o diluyentes útiles en la composición farmacéutica pueden incluir, pero no se limitan a solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. En terapia o como un profiláctico, el agente activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril. El inhibidor puede administrarse directamente a un tumor o puede dirigirse al tumor por medio de la administración sistémica. Una cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor es típicamente uno que es suficiente para alcanzar el efecto deseado y puede variar de acuerdo con la naturaleza y gravedad de la condición de enfermedad, y la potencia del inhibidor. Se apreciará que las diferentes concentraciones pueden emplearse para la profilaxis que para el tratamiento de una enfermedad activa. Para la administración a mamíferos, y particularmente humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del agente activo será de hasta 100 mg/kg, por ejemplo de 0.01 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, por lo regular hasta 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10, 15, 20 ó 30 mg/kg de peso corporal. Sin embargo, finalmente la cantidad del inhibidor administrado y la frecuencia de la administración serán de la discreción de un médico. Una ventaja de usar los inhibidores de PARP para tratar las células cancerígenas es que únicamente se necesitan dosis muy bajas para tener un efecto terapéutico en el tratamiento de cáncer, por lo que se reduce la acumulación sistémica de los inhibidores y cualquiera de los erectos tóxicos asociados . Un aspecto preferido de la invención proporciona un agente que es un inhibidor de la molécula de ARN (ARNi) . Una técnica para extirpar específicamente la función del gen es por medio de la introducción de ARN de doble hebra, también referido como ARN inhibidor (ARNi) , en una célula que resulta en la destrucción del ARNm complementario a la secuencia incluida en la molécula de ARNi. La molécula de ARNi comprende dos hebras complementarias de ARN (una hebra sentido y una hebra antisentido) hibridadas entre sí para formar una molécula de ARN de doble hebra. La molécula de ARNi se deriva por lo regular de la secuencia exónica o codificante del gen que se extirpará. De preferencia, la molécula de ARNi se deriva de la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de ácido nucleico como se representa por la secuencia en la Figura 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 o un fragmento de la misma; b) una secuencia de ácido nucleico que híbrida a las secuencias de ácido nucleico de la Figura 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 y codifica un gen para PARP; c) una secuencia de ácido nucleico que comprende las secuencias que son degeneradas como resultado del código genético a las secuencias de ácido .nucleico definidas en (a) y (b) . Los últimos estudios sugieren que las moléculas de ARNi que oscilan de 100-1000 pb derivadas de la secuencia de codificación son inhibidores efectivos de la expresión génica. De manera sorpresiva, únicamente unas cuantas moléculas del ARNi se requieren para bloquear la expresión génica lo que implica que el mecanismo es catalítico. El sitio de acción parece que es muy poco nuclear si el ARNi se detecta en el citoplasma de las células, lo que indica que el ARNi ejerce su efecto durante la síntesis o procesamiento del ARNm. Más preferentemente, esta la molécula de ARNi tiene una longitud de entre 10 bases de nucleótidos (bn) - 1000 bn. Aún más preferentemente, esta molécula de ARNi tiene una longitud de 10 bn; 20 bn; 30 bn; 40 bn; 50 bn; 60 bn; 70 bn; 80 bn; 90 bn ó 100 pb. Aún más preferentemente, esta molécula de ARNi es de una longitud de 21 bn. Aún más preferentemente, esta molécula de ARNi comprende la secuencia de ácido nucleico aaa age cau ggu gga gua uga (PARP-1) . Aún más preferentemente, esta molécula de ARNi cosiste de la secuencia de ácido nucleico aag acc aau cuc ucc agu uca ac (PARP-2) . Todavía más preferentemente, esta molécula de ARNi consiste de la secuencia de ácido nucleico aag acc aac auc gag aac aac (PARP-3) . La molécula de ARNi puede comprender las bases nucleotídicas modificadas. Las características preferidas de cada aspecto de la invención son como se establecen para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se describirá ahora únicamente a manera de ejemplo con referencia a las figuras anexas, en donde : Las Figuras la-lc son gráficas que demuestra que las células deficientes en HR son hipersensiblés al efecto tóxico causado por la inhibición de PARP-1. El crecimiento externo de la colonia de las líneas celulares de hámster Chino AA8 (tipo silvestre), irslSF (defectuosas en HR[4]), CXR3 (irslSF complementado con XRCC3 [2] ) , V79 (tipo silvestre) , irsl (defectuosas en HR[5]) o irslX2.2 (irsl complementado con XRCC2 [1] ) debido a la exposición a 3-AB (a) , ISQ (b) o NU1025 (c) . Se muestran las medias (símbolos) y la desviación estándar (barras) de por lo menos tres experimentos. Se usó la prueba de crecimiento externo de la colonia; La Figura 2 es una gráfica que muestra la supervivencia celular en presencia del inhibidor de PARP NU1025 en células wt V79, células VC-8 deficientes en BRCA-2 y células VC-8 complementadas con el gen BRCA2 funcional (VC-8#13, VC-8+B2) .

Se usó la prueba de crecimiento externo de la colonia; La Figura 3 es un histograma que muestra el porcentaje de las células en la apoptosis después de una incubación de 72 horas con NU1025; Figura 4a. análisis Western blot de los lisados de la proteína de MCF-7 (p53t) o MDA-MB-231 (p53mut) de las células de cáncer de mama después de la transfección de 48 horas con ARNis . Figura 4b. Crecimiento externo de la colonia de células MCF-7 tratadas con ARNis o Figura 4c células MDA-MB-231 después de la exposición a NU1025 del inhibidor de PARP. Se muestran las medias (símbolos) y la desviación estándar (barras) de por lo menos tres experimentos. Figuras 5a-5e. Las células deficientes en BRCA2 no reparan una lesión de recombinación, formada en las horquillas de replicación por los inhibidores de PARP. Figura 5a, visualización de las rupturas de doble hebra (DSBs) en células proficientes o deficientes en BRCA2 después de un tratamiento de 24 horas con NU1025 (0.1 mM) por electroforesis en gel de campo pulsado. Se usó hidroxiurea 2 mM como un control positivo. Figura 5b, visualización de los focos ?H2Ax en las células de V-C8+B2 y V-C8 no tratadas. El número de células que contienen los focos ?H2Ax Figura 5c, o los focos RAD51 Figura 5d, se visualizaron en células V-C8+B2 y V-C8 después de un tratamiento de 24 horas con NU1025 (10 µM).- Se muestran las medias (símbolos) y los errores estándares (barras) de tres a nueve experimentos. Figura 5e, Un modelo sugerido para la muerte celular inducida en células deficientes en BRCA2. Figuras 6a-6c. PARP-1 y no PARP-2 es importante en la prevención de la formación de una lesión recombinogénica, causando la muerte en ausencia de BRCA2. Figura 6a RT-PCR en ARN aislado de las células SW480SN.3 tratadas con ARNis de BRCA2, PARP-1 y PARP-2 en combinaciones se muestran durante 48 horas. Figuras 6b supervivencia clonogénica después de la depleción de BRCA2 , PARP-1 y PARP-2. Se muestran las medias (símbolos) y la desviación estándar (barras) de por lo menos tres experimentos. Dos y tres estrellas designan la significación estadística en la prueba t p<0.01 y p<0.001, respectivamente . Figuras 6c Inmunoelectrotransferencia para PARP-1 en células SW480SN.3 tratadas con ARNis diferentes. Figura 7a. Visualización de polímeros PAR en células V79 no tratadas y Figura 7b tratadas con timidina (5 mM durante 24 horas) . Figura 7c, porcentaje de células que contienen >10 sitios de actividad de PARP después del tratamiento con hidroxiurea (0.2 mM) y timidina (5 mM) . Por lo menos se contaron 300 núcleos para cada tratamiento y experimento.

Figura 7d, Supervivencia de células V-C8+B2 después del CQ-tratamiento con hidroxiurea o Figura 7e, timidina y NU1025 (10 µM) . Figura 7f , la actividad de PARP se determinó por el nivel de NAD(P)H1:L libre, después del tratamiento con MMS, hidroxiurea (0.5 mM) o timidina (10 mM) . Se muestran las medias (símbolos) y la desviación estándar (barras de error) de por lo menos tres experimentos . Figura 8a Visualización del polímero PAR en células V-C8 no tratadas y Figura 8b, V-C8+B2. Figura 8c, cuantificación del porcentaje de células que contienen >10 sitios de actividad PARP en células V-C8 y V-C8+B2 no tratadas. Figura 8d, nivel de NAD(P)H medido en las células V-C8 y V-C8+B2 no tratadas. Tres estrellas designan p<0.001 en la prueba t. Figura 8e, visualización de RAD51 y los sitios de actividad de PARP en células V79 después de un tratamiento de 24 horas (5 mM) . Figura 8f , un modelo para el papel de PARP y HR en las horquillas de replicación de paro. La Figura 9 es la secuencia de ADNc.de humano de PARP-1 La Figura 10 es la secuencia de ADNc de human de PARP-2 La Figura 11 es la secuencia de ADNc de human de PARP-3 La Figura 12 es la secuencia de ADNg de humano de Tanquirasa 1; La Figura 13 es la secuencia de ARNm de humano de Tanquirasa 2 ; La Figura 14 es la secuencia de ARNm de humano de VPARP.- DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Materiales y Métodos Citotoxicidad de los inhibidores de PARP a las células deficientes en HR: XRCC2 , XRCC3 o BRCA2 Cultivo celular Las líneas celulares irsl, irsX2.1 y V79-4 fueron una donación de John Thacker [40] y las líneas celulares AA8 , irslSF y CXR3 se proporcionaron por Larry Thompson [41] . La VC-8, VC-8+B2, VC-8#13 fueron un regalo de Malgorzata Zdzienicka [42] . Todas las líneas celulares en este estudio se crecieron en un Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) con 10% de bovino fetal y penicilina (100 U/ml) y sulfato de estreptomicina (100 µg/mL) a 37°C bajo una atmósfera que contiene 5% de C02.

Prueba de toxicidad - prueba de crecimiento externo de la colonia 500 células suspendidas en un medio se colocaron en placas en una caja de Petri 4 horas antes de la adición de 3- 'AB, ISQ o NU1025. ISQ y NU1025 se disolvieron en DMSO hasta una concentración final de 0.2% en el medio de tratamiento. 7-12 días después, cuando pudieron observarse las colonias, estas colonias se fijaron y se tiñeron con azul de metileno en metanol (4 g/1) . Las colonias que consisten de más de 50 células se contaron subsecuentemente .

Experimentos de apoptosis 0.25xl06 células se colocaron en placas en cajas de Petri y se crecieron durante 4 horas antes del tratamiento con NU1025. Después de 72 horas, las células se tripsinizaron y se resuspendieron con un medio que contiene cualquiera de las células de flotación de tal muestra. Las células se granularon por centrifugación y se resuspendieron para el análisis de apoptosis con anexina V conjugada con FITC y yoduro de propidio (Pl) (ApoTarget, Biosource International) de acuerdo con el protocolo del fabricante . Las muestras se analizaron por citometría de flujo (Becton Dickenson FACSort, láser de 488 nm) y el porcentaje de células apoptóticas se determinó por la fracción de células vivas (Pl negativo) enlazada con anexina V conjugada con FITC.

Inmunofluorescencia Las células se colocaron en placas sobre cubre objetos 4 h antes de los tratamientos de 24 h como se indica. Después de los tratamientos, el medio se removió y los cubre objetos 1 se enjuagaron una vez en PBS a 37°C y se fijaron como se describe en otra parte [2] . Los anticuerpos primarios y las diluciones usados en este estudio fueron: antí PAR policlonal de conejo (Trevigen; 1:500), anti Rad51 policlonal de cabra (C20", Santa Cruz; 1:200) y anti Rad51 policlonal de conejo (H-92, Santa Cruz; 1:1000). Los anticuerpos fueron anticuerpo IgG de anti-conejo de cabra Cy-3 conjugado (Zymed; 1:500), anticuerpo IgG de F(ab')2 anti-conejo de Alexa 555 (Molecular Probes; 1:500), anticuerpo IgG de anti-co?ejo de asno Alexa 546 (Molecular Probes; 1:500) y anticuerpo IgG de anti-conejo de asno Alexa 488 (Molecular Probes; 1:500). Los anticuerpos se diluyeron' en PBS que contiene 3% de albúmina de suero de bovino. El ADN se tiñó con 1 µg/ml de To Pro (Molecular Probes) . Las imágenes se obtuvieron con un microscopio confocal invertido Zeiss LSM 510 usando un objetivo de inmersión en aceite 1.4 63X/NA planapocromático y longitudes de onda de excitación 488, 546 y 630 nm. Las imágenes de proyección máxima del foco minuciosas se adquirieron de las secciones ópticas de 0.50 µm separadas y con un espesor de sección de 1.0 µm. Las imágenes se procesaron usando Adobe Photoshop (Abacus Inc) . Se contaron por lo- menos 300 núcleos en cada portaobjetos y se clasificaron los que contenían más de 10 focos RAD51 o sitios de actividad de PARP como positivos.

Pruebas de actividad de PARP Se usó una sal de tetrazolio soluble en agua (WST-8 5 mM) para monitorear la cantidad de NAD(P)H por medio de su reducción hasta colorante de formazan de color amarillo [43] . Se colocaron en placas 5000 células por lo menos triplicados en pozos de una placa de 96 pozos cultivada en medio de crecimiento normal de 100 µl durante 4 h a 37°C. El amortiguador CK8 (Dojindo Molecular Technology, Gaithersburg, USA), que contiene WST-8, después se adicionó ya sea con o sin tratamiento con agentes que dañan el ADN a las concentraciones indicadas. La reducción de WST-8 en presencia de. NAD(P)H se determinó midiendo la absorbancia visible (OD450) cada 30 min. También se preparó un blanco medio que contiene sólo el medio y el amortiguador CK8. Se calcularon los cambios en los niveles de N7AD(P)H comparando la absorbancia de los pozos que contienen las células tratadas con los agentes que dañan el ADN y los tratados únicamente con DMSO. De manera alternativa, los niveles relativos de NAD(P)H en diferentes líneas celulares se calcularon después de 4 h de incubación en amortiguador CK8. La capacidad de NU1025 de inhibir la actividad de PARP-1 también se probó en células' permeabilizadas usando una modificación del método de Halldorsson et al [44] y descrito en detalle en otra parte [45] . De forma breve: se incubaron 300 µl ' de células permeabilizadas tratadas con NU1025 (15 min) a 26°C con oligonucleótido (concentración final 2.5 µg/ml) , NAD 75 µM + NAD [32P] (Amersham Pharmacia, Amersham, UK) en un volumen total de 400 µl . La reacción se terminó después de 5 ' minutos mediante la adición de 10% de TCA, 10% de NaPpi enfriado con hielo durante 60 minutos antes de la filtración a través de un filtro GF/C de Whatman (LabSales, Maidstone, UK) , se enjuagaron 6x con 1% de TCA, 1% de NáPPi, se dejaron secar y se midió la radioactividad incorporada para determinar la actividad PARP-1. Los datos se expresan como NAD pmol incorporado/106 células con referencia a los estándares [32P] NAD. Electroforesis en gel de campo pulsado 1.5xl06 células se colocaron en placas en discos de 100 mm y se dejaron 4 h para la unión. La exposición al fármaco fue durante 18 h, después de lo cual las células se tripsinizaron y se fundieron 106 células en cada inserción de 1% de agarosa. Estos insertos se incubaron como se describe en otra parte (8) y se separaron mediante electroforesis en gel de campo pulsado durante 24 h (BioRad; ángulo de 120°, tiempo del interruptor 60 a 240 s, 4 V/cm) . El gel se tiñó subsecuentemente con bromuro de etidio para el análisis.

Tratamiento de ARNis Se adquirieron BRCA2 SMARTpool y ARNis mezclados prediseñados (Dharmacon, Lafayette, CO) . Se sembraron 10000 células en placas de 6 pozos y se dejaron durante la noche antes de transfectarse con ARNis 100 nM usando un reactivo de oligofectamina (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células después se cultivaron en un medio de crecimiento normal durante 48 h antes de la tripsinización y se volvieron a colocar en placas para las pruebas de toxicidad. La supresión de BRCA2 se confirmó por inmunoelectrotransferencia (Western blot) (como se describe anteriormente [46] ) de los extractos de proteína tratados con ARNis con un anticuerpo contra BRCA2 (Oncogene, Nottingham, UK) . EJEMPLOS Las células ' deficientes ' de recombinación homologa son hipersensibles a la inhibición de PARP-1 Para investigar la participación de HR en las respuestas 'celulares para la inhibición de PARP-1, se estudiaron los efectos de los inhibidores de PARP-1 sobre la supervivencia de las líneas celulares deficientes. Se encontró que las células deficientes en HR (es decir, irslSF que es deficiente en XRCC3 o irsl que es deficiente en XRCC2 [ er la Tabla 1] fueron muy sensibles al efecto tóxico de la 3-aminobenzamida (3-AB) y con dos inhibidores más potentes de PARP-1: 1,5-dihidroxiisoquinolina (ISQ; [37] ) o 8-hidroxi-2-metilquinazolinona (NU1025 [38, 39]) (Figura 1). La sensibilidad de las células irslSF a 3-AB, ISQ o NU1025 se corrigió por la introducción de un cósmido que contiene un gen XRCC3 funcional CXR3) . De manera similar, la sensibilidad en las células irsl a 3-AB, ISQ o NU1025 se corrigió mediante la introducción de un - cósmido que contiene un gen XRCC2 funcional (irsl X2.2) .

Las células deficientes en BRCA2 son hipersensibles a la inhibición de PARP-1 Se investigó la supervivencia de las células deficientes en. BRCA2 (VC8) y las células de tipo silvestre (V79Z) en presencia de los inhibidores de PARP-1. Se encontró que las células VC8 son muy sensibles al efecto tóxico de NU1025 (Figura 2) . La sensibilidad en las células VC8 se corrigió mediante la introducción de un gen BRCA2 funcional ya sea en el cromosoma 13 (VC8#13) o un vector de sobre-expresión (VC8+B2) . Este resultado demuestra que la sensibilidad a los inhibidores de PARP-1 es una .consecuencia directa de la pérdida de la función de BRCA2. Para investigar si la inhibición de PARP-1 activa la apoptosis en las células deficientes en BRCA2 , se investigó el nivel de apoptosis 72 horas después de la exposición a NU1025. Se encontró que la .apoptosis se desencadenó por NU1025 únicamente en las células VC8, lo que muestra que la pérdida de la actividad de PARP-1 en las células deficientes en BRCA2 desencadena este medio de muerte (Figura 3) .

Las células de cáncer de mama deficientes en BRCA2 son hipersensibles a la inhibición de PARP-1 Se examinó si las líneas celulares de cáncer de mama MCF7 (p53 de tipo, silvestre) y MDA-MB-231 (p53 mutadas) exhibieron una sensibilidad similar a NU1025 en la depleción de BRCA2. Se encontró que los inhibidores de PARP redujeron profundamente la supervivencia de las células MCF7 y MDA-MB-231 únicamente cuando BRCA2 se agotó con una mezcla de ARNis de BRCA2 (Figuras 4a-4c) . Esto muestra que las células de cáncer de mama agotadas con BRCA2 son sensibles a los inhibidores de PARP sin considerar el estado p53.

Las células deficientes en BRCA2 mueren de la inhibición de PARP-1 en ausencia de rupturas de ADN de doble hebra (DSBs) pero en presencia de ?H2Ax La HR se conoce que está involucrada en la reparación de DSBs y otras lesiones que se presentan durante la replicación del ADN [2] . Para determinar si la sensibilidad de las células deficientes en BRCA2 es el resultado de una incapacidad para reparar DSBs en las células V79 y V-C8 se midió después de los tratamientos con niveles altamente tóxicos de'NU1025. Se encontró que no fueron detectables DSBs por el análisis electroforético en gel de campo pulsado del ADN obtenido de las células tratadas (Figura 5a) lo que sugiere que bajos niveles de DSBs u otros sustratos recombinogénicos se acumularon después de la inhibición' de PARP en las células deficientes en HR, lo que desencadena ?H2Ax (Figura 5b) . La razón por la que las células deficientes en BRCA2 mueren después de la inducción de estas lesiones recombinogénicas es probablemente debido a una incapacidad de reparación de estas lesiones . Para probar esto, se determinó la capacidad de las células V-C8 deficientes en BRCA2 y las células complementarias BRCA2 para formar los focos RAD51 en respuesta a NU1025. Se encontró que los focos RAD51 se indujeron de hecho en las células V-C8+B2 después del tratamiento con NU1025 (estadísticamente significativo en la prueba t p<0.05; Figura 5d) . Esto indica que las lesiones recombinogénicas desencadenan la reparación de HR en estas células lo que les permite la supervivencia. Por el contrario, las células V-C8 deficientes en BRCA2 fueron incapaces de formar focos RAD51 en respuesta al tratamiento con NU1025 (Figura 5d) lo que indica sin HR, lo que dejaría las lesiones recombinogénicas sin reparación y de esta manera, causan la muerte celular.

PARP-1 y no PARP-2 es importante en la prevención de la formación de una lesión recombinogénica Hay dos PARPs principales presentes en el núcleo en las células del mamífero, PARP-1 y PARP-2 y todos los inhibidores de PARP reportados inhiben ambos. Para distinguir cual PARP fue responsable del efecto, se probó si la ausencia de PARP-1 y/o PARP-2 resulta en la acumulación de lesiones tóxicas, mediante la depleción de éstas y BRCA2 con ARNis en las células de humano (Figura 6a) . Se encontró que la supervivencia clonogénica se redujo significativamente cuando las proteínas PARP-1 y BRCA2 se co-agotaron de las células del humano (Figura 6b) . La depleción de PARP-2 con BRCA2 no tuvo efecto sobre la supervivencia clonogénica y la depleción de PARP-2 en las células agotadas PARP-1 y BRCA2 no resultó en la toxicidad adicional . Estos resultados sugieren que PARP-1 y no PARP-2 es el responsable de la reducción de las lesiones recombinogénicas tóxicas en las células del humano. La eficiencia de la clonación únicamente se redujo a 60% del control en las células co-agotadas PARP-1 y BRCA2 , mientras que no sobrevivieron las células deficientes en HR a los tratamientos con los inhibidores de PARP. Esto es probable de hacer con la depleción incompleta de la proteína PARP-1 abundante por ARNis (Figura 6c) , lo que podría ser suficiente para mantener la función de PARP-1 en algunas de las células.

PARP-1 se activa por los inhibidores de replicación HR también está involucrada en la reparación de las lesiones que se presentan en las horquillas de replicación de paro, lo que no puede involucrar DSBs detectables [2] . Para probar si PARP tiene un papel en las horquillas de replicación, se examinó la activación de PARP en las células tratadas con células con agentes (timidina o hidroxiurea) que retardan o detienen la progresión de las horquillas de replicación de ADN. La timidina agota las células de dCTP y disminuye las horquillas de replicación sin causar DSBs. La hidroxiurea agota varios dNTP y bloquea la horquilla de replicación, ' lo cual se asocia con la formación de DSBs en las horquillas de replicación [2] . Ambos de estos agentes inducen potentemente la HR [2] . Las células de hámster V79 tratadas durante 24 horas con timidina o hidroxiurea se tiñeron para los polímeros de PAR. Esto reveló un aumento sustancial en el número de células que contienen los sitios de actividad de PARP (Figura 7c) . Este resultado sugiere una función para PARP en las horquillas de replicación de paro. También se ha mostrado que la inhibición de PARP con NU1025 mejora la sensibilidad a la timidina o hidroxiurea en las células V-C8+B2 (Figura 7d, 7e) . Este resultado sugiere que la actividad de PARP es importante en la reparación de las horquillas de replicación de paro o alternativamente, previene la inducción de la muerte en las células con horquillas de replicación de paro. PARP se activa rápidamente en las rupturas de ADN de hebra simple (SSB) y atrae las enzimas de reparación de ADN [3, 6]. El sulfonato de metilmetano (MMS) causa la alquilación de ADN, que se repara por la reparación de excisión de base. PARP se activa rápidamente por el intermediario de SSB formado durante esta reparación, lo cual agota los niveles de NAD(P)H (Figura 7f) . Se encontró que la activación de los niveles de PARP y la reducción de NAD(P)H es mucho más lenta después de los tratamientos con timidina o hidroxiurea. Esto lenta activación de PARP puede explicarse por la acción indirecta de la timidina e hidroxiurea y el tiempo requerido para acumular las horquillas de replicación de paro acumuladas conforme las células entran en la fase S del ciclo celular. PARP-1 y HR tienen papeles separados en las horquillas de replicación de paro Se determinó el número de sitios de la actividad de PARP en las células V-C8 deficientes en BRCA2 no tratadas. Se encontró que más células V-C8 contienen sitios de actividad de PARP comparado con las células V-C8+B2 (Figura 8a, b, c) . También, las células V-C8 tienen menores niveles de NAD(P)H libres que las células corregidas (Figura 8d) , como un resultado probable del aumento en la actividad de PARP. De manera importante, estos sitios de la actividad de PARP no traslapan con el foco RAD51 (Figura 8e) . Los resultados en la presente sugieren que PARP y HR tienen papeles separados en la producción o rescate de las horquillas de replicación de paro (Figura 8f) . Una pérdida de la actividad de PARP puede compensarse por el aumento de HR/ mientras que una pérdida de HR puede compensarse por el aumento en la actividad de PARP. Sin embargo, la pérdida de ambas rutas conduce a la acumulación de las horquillas de replicación de paro y a la muerte, como en el caso de las células deficientes en BRCA2 inhibidas por PARP. Como se muestra en el modelo representado en la Figura 8F, PARP y HR tienen papeles complementarios en las horquillas de replicación de paro. (i) Las horquillas de replicación pueden pararse cuando se ' encuentran con un bloque en el camino sobre el molde de ADN. Además, también pueden detenerse temporalmente, debido a la carencia de dNTPs u otros co-factores de replicación. (ii) PARP se une a las horquillas de replicación de paro u otro daño asociado con la replicación, desencadenando polimerización de PAR. Los polímeros de PAR cargados negativamente resultantes pueden proteger a las horquillas de replicación de paro, repeliendo las proteínas que procesarían normalmente las horquillas de replicaclón (por ejemplo, resolvasas) , hasta que la horquillas de replicación pueda restituirse espontáneamente cuando dNTPs u otros co-factores llegan a ser disponibles. De manera alternativa, los' polímeros de PAR o PARP pueden atraer proteínas para resolver el bloqueo de replicación por otros medios. (iii) En ausencia de la actividad de PARP, la HR puede usarse como una ruta alternativa para la reparación de las horquillas de replicación de paro. Este modelo compensatorio explica el aumento en el nivel de los focos de HR y RAD51 encontrados en las células deficientes en PARP3"5 y la mayor actividad de PARP encontrada en las células deficientes en HR (es decir, V-C8) . Los bloqueos/lesiones de la replicación espontánea son sólo letales en ausencia tanto de PARP como de HR.

Tabla 1. Genotipo y origen de las líneas celulares usadas en este estudio.

REFERENCIAS [1] A.R. Venkitaraman Cáncer susceptibility and the functions of BRCAl and BRCA2 , Cell 108 (2002) 171-182. [2] C. Lundin, K. Erixon, C. Arnaudeau, N. Schultz, D. Jenssen, M. Meuth and T. Helleday Different roles for nonhomologous end joining and homologous recombination following replication arrest in mammalian cells, Mol Cell Biol 22 (2002) 5869-5878. [3] D. D'Amours, S. Desnoyers, 1. D' Silva and G.G. Poirier Poly (_DP-ribosyl) ation reactions in the regulation of nuclear functions, Biochem J 342 (1999) 249-268. [4] Z. Herceg and Z.Q. Wang Functions of poly(ADP~ ribose) polymerase (PARP) in DNA repair, genomic integrity and cell death, Mutat Res 477 (2001) 97-110. [5] T. Lindahl, M.S. Satoh, G.G. Poirier and A. Klungland Post-translational modification of poly (ADP-ribose) polymerase induced by DNA strand breaks, Trends. Biochem Sci 20 (1995) 405-411. [6] M.S. Satoh and T. Lindahl Role of poly (ADP-ribose) formation in DNA repair, Nature 356 (1992) 356-358. [7] S. Shall and G. de Murcia Poly (ADP-ribose) polymerase-1 : what have we learned from the deficient mouse model?, Mutat Res 460 (2000) 1-15. [8] Z.Q. Wang, L. Stingl, C. Morrison, M. Jantsch, M. Los, K. Schulze-Osthoff and E.F. Wagner PARP is important for genomic stability but dispensable in apoptosis, Genes Dev 11 (1997) 2347-2358. [9] C.M. Simbulan-Rosenthal, B.R. Haddad, D.S. Rosenthal, Z. Weaver, A. Coleman, R. Luo, H.M. Young, Z.Q. Wang, T. Ried and M.E. Smulson Chromosomal aberrations in PARP(-/-) mice: genome stabilization in immortalized cells by reintroduction of poly (ADP-ribose) polymerase cDNA, Proc Nati Acad Sci USA 96 (1999) 13191-13196. [10] J.M. de Murcia, C. Niedergang, C. Trueco, M. Ricoul, B. Dutrillaux, M. Mark, F.J. Oliver, M. Masson, A. Dierich, M. LeMeur, C. Walztinger, P. Chambón and G. de Murcia Requirement of poly (7ADP-ribose) polymerase in recovery from DNA damage in mice and in cells, Proc Nati Acad Sci USA 94 (1997) 7303-7307. [11] F. d'Adda di Fagagna, M.P. Hande, W.M. Tong, P.M. Lansdorp, Z.Q. Wang and S.P. Jackson Functions of poly (ADP-ribose) polymerase in controlling telomere length and chromosomal stability, Nat Genet 23 (1999) 76-80. [12] E. Samper, F.A. Goytisolo, J. Menissier-de Murcia, E. Gonzalez-Suarez, J.C. Cigudosa, G. de Murcia and M.A.

Blasco Normal telomere length and chromosomal end capping in poly (ADP-ribose) polymerase-deficient mice and primary cells despite increased chromosomal instability, J Cell Biol 154 (2001) 49-60. [13] C. Morrison, G.C. Smith, L. Stingl, S.P. Jackson, E.F. Wagner and Z.Q. Wang Genetic interaction between PARP and DNA-PK in V(D)J recombination and tumorigenesis, Nat Genet 17 (1997) 479-482. [14] V. Schreiber, D. Hunting, C. Trueco, B. Gowans, D. Grunwald, G. De Murcia and J.M. De Murcia A dominant-negative mutant of human pol (ADP-ribose) polymerase affeets cell recovery, apoptosis, and sister chromatid exchange following DNA damage, Proc Nati Acad Sci USA 92 (1995) 4753-4757. [15] J.H. Kupper, M. Muíler and A. Burkle Trans-dominant inhibition of poly (ADP-ribosyl) ation potentiates carcinogen induced gene amplification in SV40-transformed Chínese hámster cells, Cáncer Res 56 (1996) 2715-2717. [16] J. Magnusson and C. Ramel Inhibitor of poly (ADP-ribose) transferase potentiates the recombinogenic but not the mutagenic action of alkylating agents in somatic cells in vivo in Drosophila melanogaster, Mutagenesis 5 (1990) 511-514. [17] A.S. Waldman and B.C. Waldman Stimulation of intrachromosomal homologous recombination in mammalian cells by an inhibitor of poly (ADP-ribosylation) , Nucleic Acids Res 19 (1991) 5943-5947. [18] A. Semionov, D. Cournoyer and T.Y. Chow Inhibition of pol (ADP-ribose) polymerase stimulates extrachromoso al homologous recombination in mouse Ltk-fibroblasts, Nucleic Acids Res 27 (1999) 4526-4531.

[19] F. Dantzer, V. Schreiber, C. Niedergang, C. Trueco, E. Flatter, G. De La Rubia, J. Oliver, V. Rolli, J. Menissier-de Murcia and G. de Murcia Involvement of poly (ADP-ribose) polymerase in base excisión repair, Biochimíe 81 (1999) 69-75. [20] F. Dantzer, G. de La Rubia, J. Menissier-De Murcia, Z. Hostomsky, G. de Murcia and V. Schreiber Base excisión repair is impaired in mammalian cells lacking Poly (ADP-ribose) polymerase-1, Biochemistry 39 (2000) 7559-7569. [21] L. Tentori, I. Portarena and G. Graziani Potential clinical applications of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors, Pharmacol Res 45 (2002) 73-85. [22] T. Lindahl and R.D. Wood Quality control by DNA repair, Science 286 (1999) 1897-1905. [22] K. W'. Caldecott DNA single-strand break repair and spinocerebellar ataxia, Cell 112 (2003) 7-10. [24] D. D'Amours and S.P. Jackson The Mrell complex: at the crossroads of dna repair and checkpoint signalling, Nat Rev Mol Cell Biol 3 (2002) 317-327. [25] A.D. D'Andrea and M. Grompe The Fanconi anaemia/BRCA pathway, Nat Rev Cáncer 3 (2003) 23-34. [26] S.P. Jackson Sensing and repairing DNA double-strand breaks, Carcinogenesis 23 (2002) 687-696. [27] R. Kanaar, J.H. Hoeijmakers and D.C. van Gent Molecular mechanisms of DNA double strand break repair, Trends Cell Biol 8 (1998) 483-489. [28] D.C. van Gent, J.H. Hoeij akers and R. Kanaar Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection, Nat Rev Genet 2 (2001) 196-206. [29] S.L. Neuhausen and E.A. Ostrander Mutation testing of early-onset breast cáncer genes BRCAl and BRCA2 , Genet Test 1 (1997) 75-83. [30] G. Kuperstein, W.D. Foulkes, P. Ghadirian, J.

Hakimi and S.A. Narod A rapid fluorescent multiplexed-PCR analysis (FMPA) for founder mutations in the BRCAl and BRCA2 genes, Clin Genet 57 (2000) 213-220. [31] A. Chiarugi Poly (ADP-ribose)_ polymerase: killer or conspirator? The 'suicide hypothesis' revisited, Trends Pharmacol Sci 23 (2002) 122-129. [32] C.R. Calabrese, M.A. Batey, H.D. Thomas, B.W.

Durkacz, L.Z. Wang, S. Kyle, D. Skalitzky, J. Li, C. Zhang, T. Boritzki, K. Maegley, A.H. Calvert, Z. Hostomsky, D.R.

Newell and N.J. Curtin Identification of Potent Nontoxic Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 Inhibitors: Chemopotentiation and Pharmacological Studies, Clin Cáncer Res 9 (2003) 2711- 2718. [33] D. Ferraris, Y.S. Ko, T. Pahutski, R.P. Ficco, L.

Serdyuk, C. Alemu, C. Bradford, T. Chiou, R. Hoover, S.

Huang, S. Lautar, S. Liang, Q. Lin, M.X. Lu, M. Mooney, L. Morgan, Y. Qian, S. Tran, L.R. Williams, Q.Y. Wu, J. Zhang, Y. Zou and V. Kalish Design and synthesis of poly ADP-ribose polymerase-1 inhibitors. 2. Biological evaluation of aza-5 [H] -phenanthridin-6-ones as potent, aqueous.-soluble compounds for the treatment of ischemic injuries, J Med Chem 46 (2003) 3138-3151. [34] K.J. Dillon, G.C. Smith and N.M. Martin A FlashPlate assay for the identification of PARP-1 inhibitors, J Bio ol Screen 8 (2003) 347-352. [35] A.J. Pierce, R.D. Johnson, L.H. Thompson and M. Jasin XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells, Genes Dev 13 (1999) 2633-2638. [36] R.D. Johnson, N. Liu and M. Jasin Mammalian XRCC2 promotes the repair f DNA double-strand breaks by homologous recombination, Nature 401 (1999) 397-399. [37] G.M. Shah, D. Poirier, S. Desnoyers, S. Saint-Martín, J.C. Hoflack, P. Rong, M. ApSimon, J.B. Kirkland and G.G. Poirier Complete inhibition of poly (ADP-ribose) 'polymerase activity prevents the recovery of C3H10T1/2 cells from oxidative stress, Biochim Biophys Acta 1312, (1996) 1-7. [38]- R.J. Griffin, S. Srinivasan, K. Bowman, A.H. Calvert, N.J. Curtin, D.R. Newell, L.C. Pemberton and B.T. Golding Resistance-modifying agents. 5. Synthesis and biological properties of quinazolinone inhibitors of the DNA repair enzyme pol (ADP-ribose) polymerase (PARP) , J Med Chem 41 (1998) 5247-5256.

[39] S. Boulton, L.C. Pemberton, J.K. Porteous, N.J.

Curtin, R.J. Griffin, B.T. Golding and B.W. Durkacz Potentiation of temozolomide-induced cytotoxicity: a comparative study of the biological effects of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors, Br J Cáncer 72 (1995) 849-856. [40] C.S. Griffin, P.J. Simpson, C.R. Wilson and J.

Thacker Mammalian recombination-repair genes XRCC2 and XRCC3 promote correct chromosome segregation, Nat Cell Biol 2 (2000) 757-761. [41] R.S. Tebbs, Y. Zhao, J.D. Tucker, J.B. Seheerer, M.J. Siciliano, M. Hwang, N. Liu, R.J. Legerski and L.R. Thompson Correction of chromosomal instability and sensitivity to diverse mutagens by a cloned cDNA of the XRCC3 DNA repair gene, Proc Nati Acad Sci USA 92 (1995) 6354-6358. [42] M. Kraakman-van der Zwet, W.J. Overkamp, R.E. van Lange, J. Essers, A. van Duijn-Goedhart, I. Wiggers, S.

Swaminathan, P.P. van Buul, A. Errami, R.T. Tan, N.G.

Jaspers, S.K. Sharan, R. Kanaar and M.Z. Zdzienicka Brca2 (XRCC11) deficieney results in radioresistant DNA synthesis and a higher frequency of spontaneous deletions, Mol Cell Biol ,22 (2002) 669-679. [43] J. Nakamura, S. Asakura, S.D. Hester, G. de Murcia, K.W. Caldecott and J.A. Swenberg Quantitation of intracellular NAD(P)H can monitor an imbalance of DNA single strand break repair in base excisión repair deficient cells in real time, Nucleic Acids Res 31 (2003) el04. [44] H. Halldorsson, D.A. Gray and S. Shall Poly (ADP-ribose) polymerase activity in nucleotide permeable cells, FEBS Lett 85 (1978) 349-352. [45] K. Grube, J.H. Kupper and A. Burkle Direct stimulation of poly (ADP ribose) polymerase in permeabilized cells by double-stranded DNA oligomers, Anal Biochem 193 (1991) 236-239. [46] C. Lundin, N. Schultz, C. Amaudeau, A. Mohindra, L.T. Hansen and T. Helleday RAD51 is Involved in Repair of Damage Associated with DNA Replication in Mammalian Cells, J Mol Biol 328 (2003) 521-535. [47] Schreider et al., Journal of Biological Chemistry 277: 23028-23036 (2002). Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la- solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Uso de un agente que inhibe la actividad de una enzima que media la reparación de una ruptura de la hebra de ADN en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades causadas por un defecto en un gen que media la recombinación homologa. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la enzima es poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) .
3. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde el agente es un inhibidor de- PARP .
4. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el inhibidor de PARP se selecciona del grupo que consiste de PARP-1, PARP-2, PARP-3, PARP-4, tanquirasa 1 y tanquirasa 2.
5. 5. El uso de conformidad con la reivindicación 4 , en donde la PARP es PARP-1.
6. 6. El uso de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el agente es una molécula de ARNi específica para un gen PARP.
7. 7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde la molécula de ARNi se deriva de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de : a) una secuencia de ácido nucleico como se representa por la secuencia en las Figuras 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 , o un fragmento de la misma; b) una secuencia de ácido nucleico que híbrida a las secuencias de ácido nucleico de las Figuras 9, 10, 11, 12, 13 ó 14, y codifica un gen para PARP; o c) una secuencia de ácido nucleico que comprende las secuencias que son degeneradas como resultado del código genético a las secuencias de ácido nucleico definidas en (a) y (b) .
8. 8. El uso de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, en donde la molécula de ARNi comprende la secuencia de ácido nucleico aaa age cau ggu gga gua uga.
9. 9. El uso de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, en donde la molécula de ARNi consiste de la secuencia de ácido nucleico aag acc aau cuc ucc agu uca ac .
10. 10. El uso de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, en donde la molécula de ARNi consiste de la secuencia de ácido nucleico aag acc aac aus gag aac aac.
11. 11. El uso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde el defecto es una mutación en un gen que codifica una proteína involucrada en HR.
12. 12. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde- el defecto es la ausencia de un gen que codifica una proteína involucrada en HR.
13. 13. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el defecto está en la expresión de un gen que codifica una proteína involucrada en HR.
14. 14. El uso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde el gen que media la HR se selecciona del grupo que consiste de XRCC1, ADPRT (PARP-1) , ADPRTL2 (PARP-2), CTPS, RPA, RPA1, RPA2 , RPA3 , XPD, ERCC1 , XPF, MMS19, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2 , XRCC3 , BRCAl, BRCA2, RAD52, RAD54, RAD50, MRE11, NBS1, WRN, BLM, Ku70, Ku80, ATM, ATR, chkl, chk2 , FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1, RAD9, FEN-1, Musdl, Emel, DDS1 y BARD.
15. 15. El - uso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en el tratamiento de cáncer.
16. 16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de pulmón, colon, pancreático, gástrico, ovario, cervical, mama y próstata.
17. 17. El uso de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, en donde el cáncer es en un humano.
18. 18. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde el cáncer es cáncer hereditario enlazado con los genes.
19. 19. El uso de conformidad con la reivindicación 18, en donde el cáncer es cáncer de mama.
20. 20. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde las células cancerígenas que se tratarán son deficientes en la expresión de BRCAl.
21. 21. El uso de. conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde las células cancerígenas que se tratarán son deficientes en la expresión de BRCA2.
22. 22. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, en donde las células cancerígenas son parcialmente deficientes en la expresión de BRCAl y/o BRCA2.
23. 23. El uso de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, en donde las células cancerígenas son totalmente deficientes en la expresión de BRCAl y/o BRCA2.
24. 24. El uso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde el gen que media la HR es un gen supresor de . tumores .
25. 25. El uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde el gen supresor de tumores es BRCAl .
26. 26. El uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde el gen supresor de tumores es BRCA2.
27. 27. Uso de un inhibidor de PARP en la manufactura de un medicamento para inducir la apoptosis en las células defectuosas en HR.
28. 28. El uso de conformidad con la reivindicación 27, en donde las células" defectuosas en HR son células cancerígenas.
29. 29. El uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde las células cancerígenas defectuosas en HR son parcialmente deficientes en HR.
30. 30. El uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde las células cancerígenas defectuosas en HR son totalmente deficientes en HR.
31. 31. Un método de tratamiento de una enfermedad o condición en un mamífero, incluyendo el humano, caracterizado porque es causado por' un defecto genético en un gen que media ' la recombinación homologa, el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que inhibe la actividad de una enzima que media la reparación de las rupturas de la hebra de ADN.
32. 32. Un método para inducir la apoptosis en las células deficientes en HR en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de PARP.