NO341841B1

NO341841B1 - Anvendelse av en immunogen blanding omfattende VZV gE antigen, immunogen blanding og vaksine

Info

Publication number: NO341841B1
Application number: NO20074392A
Authority: NO
Inventors: Jean Stephenne; Emmanuel Jules Hanon
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2007-08-29
Publication date: 2018-02-05
Also published as: LT2281831T; SI1858917T1; CY1118629T1; KR20070110413A; TR201809393T4; PT2281830T; CY2018025I2; AU2006222225A1; GB0504436D0; EP2281830A2; PT1858917E; KR20140006115A; CY1116108T1; SI2281830T1; EA200701632A1; CY1121211T1; DK2281830T3; EP2281830A3; CN101189254A; PE20061287A1

Abstract

Anvendelse av en immunogen blanding omfattende VZV gE, eller immunogent fragment derav, og en TH-1 adjuvans ved fremstilling av et medikament for forebygging eller forbedring av helvetesild og/eller post-herpetisk neuralgi. Blandinger omfattende et trunkert VZV gE-antigen og en adjuvans inneholdende QS21, kolesterol og 3D MPL omfattes også.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av en immunogen blanding omfattende VZV gE antigen, immunogen blanding og vaksine. Disse er i stand til å indusere en immunrespons mot varicella-zoster virus.

Varicella-zoster virus (VZV) er et humant herpesvirus som er det etiologiske agens for vannkopper (varicella) og helvetesild (zoster). Varicella er forårsaket av en initiell, eller primær infeksjon, som en vanligvis pådrar seg i løpet av barndommen hvilken er relativt godartet. Imidlertid kan VZV, for voksne som ikke ble eksponert for varicella i løpet av barndommen, og innimellom for individer som er immunkompromitterte, være livstruende. På lignende måte kan en VZV-infeksjon være livstruende for nyfødte barn, for viruset er i stand til å krysse placenta. Med direkte kontakt er varicella kjent som en svært smittsom infeksjonssykdom.

Som de fleste herpesvirus har VZV en tendens til å infisere noen celler i hvilke dens utvikling blir stanset. Etter en variabel latensperiode kan varicella-zoster (VZ)-viruset frigjøres for å initiere infeksjon i andre celler. Denne reaktiveringen av VZ-viruset forårsaker anslagsvis 5 millioner tilfeller av zoster årlig (Plotkin et al., Postgrad Med J 61: 155-63 (1985)). Zoster er karakterisert ved inflammasjon i cerebral ganglia og perifere nerver, og den er forbundet med akutt smerte.

Vafai A. (Vaccine 199513(14):1336-1338) beskriver anvendelse av gE i kombinasjon med MPL i mennesker, og indikerer at en humoral respons ble produsert. Ingen celle-mediert immunrespons ble demonstrert.

Jacquet A. et al (Vaccine 200220(11-12):1593-1602) og WO 0043527 A1 beskriver et chimerisk (fusjons) protein som kombinerer VZV gE og IE63, og evaluering av denne fusjonskonstruksjonen sammenlignet med trunkert VZV gE og IE63 (separat eller i kombinasjon) ved immunisering av mus og marsvin.

Det har blitt vist at mennesker vaksinert med attenuerte stammer av VZV har fått beskyttende immunitet mot VZV-infeksjoner (Arbeter et al., J. Pediatr 100886- 93 (1982) og Brunell et al., Lancet ii: 1069- 72 (1982)). Spesielt har OKA-stammen av VZV blitt anvendt i forsøk for forebygging av helvetesild (”herpes zoster”) og postherpetisk neuralgi. OKA-stammen har også blitt anvendt ved fremstilling av vaksiner for varicella i mange år og er godt karakterisert – se for eksempel EP651789 og referanser deri.

Et stort klinisk forsøk som anvender OKA-stammen for indikasjon av zoster er publisert i The New England Journal of Medicine 2005, nummer 22, Volum 352:2271-2284 (M.N. Oxman et al).

Det eksisterer fortsatt et behov for forbedrede vaksiner mot herpes zoster og beslektede lidelser slik som post-herpetisk neuralgi (PHN).

Redegjørelse for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse beskriver anvendelse av en immunogen blanding omfattende VZV gE antigen bestående av aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR:1, hvor gE antigenet ikke er i form av et fusjonsprotein, og en TH-1 adjuvans omfattende 3D-MPL, QS21 og liposomer omfattende kolesterol, for fremstilling av et medikament for forebygging eller forbedring av helvetesild og/eller postherpetisk neuralgi (i) i en populasjon av individer over 50 år eller eldre eller (ii) i en populasjon av immunkompromitterte individer.

Foreliggende oppfinnelse beskriver videre immunogen blanding eller vaksine, omfattende VZV gE antigen bestående av aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR:1, hvor gE antigenet ikke er i form av et fusjonsprotein, og et TH-1 adjuvans omfattende 3D-MPL, QS21 og liposomer omfattende kolesterol for anvendelse for forebygging eller forbedring av helvetesild og/eller post-herpetisk neuralgi (i) i en populasjon av individer over 50 år eller eldre eller (ii) i en populasjon av immunkompromitterte individer.

Foreliggende oppfinnelse beskriver videre anvendelse ifølge krav 1 eller blanding for anvendelser ifølge krav 2, hvor 3D-MPL er omfattet inne i et liposom.

Foreliggende oppfinnelse beskriver videre immunogen blanding eller vaksine ifølge krav 2, bestående vesentlig av (a) et VZV antigen bestående av aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR:1, hvor gE antigenet ikke er i form av et fusjonsprotein og (b) en adjuvans omfattende QS21, 3D MPL og liposomer omfattende kolesterol.

Det er mulig å forebygge og/eller redusere alvorlighetsgraden av herpes zoster og/eller post-herpetisk neuralgi (PHN) omfattende å levere til et individ en immunogen blanding omfattende et VZV-antigen eller immunogent derivat derav i kombinasjon med en levende attenuert VZV eller hel inaktivert VZV.

Det er mulig å frembringe et kit omfattende en levende attenuert VZV eller hel inaktivert VZV og, separat, et VZV-antigen eller immunogent derivat derav, hvor komponentene er egnet for ledsagende eller sekvensiell levering, eller for blanding som en enkelt sammensetning før levering.

Det er videre mulig å fremstille en immunogen blanding, hvor fremgangsmåten omfatter å kombinere en levende attenuert VZV eller hel inaktivert VZV med et VZV-antigen eller immunogent derivat derav.

Figurer

Figur 1 viser sekvensen av et trunkert VZV gE.

Figurene 2 - 4 viser humorale responser oppnådd i humane kliniske forsøk ved anvendelse av blandinger ifølge oppfinnelsen.

Figurene 5 og 6 viser cellemediert immunitet oppnådd i humane kliniske forsøk ved anvendelse av blandinger ifølge oppfinnelsen.

Detaljert beskrivelse

Det er følgelig beskrevet blandinger og regimer som kan fremkalle en immunrespons mot VZV. I ett aspekt er immunresponsen frembrakt ved eksponering for slike blandinger passende reproduserbart høyere og statistisk signifikant sammenlignet med den oppnådd i individer som ikke har fått noen eksponering for blandingene ifølge oppfinnelsen. Immunresponsen kan bedømmes ved analyse av hvilket som helst eller flere aspekter av CMI-respons og/eller antistoffresponser ved anvendelse av teknikkene skissert nedenfor.

Det er mulig å forebygge og/eller redusere alvorlighetsgraden av herpes zoster og/eller post-herpetisk neuralgi (PHN). Når zoster oppstår så blir alvorlighetsgraden av reaktiveringen av zoster passende redusert sammenlignet med en uvaksinert kontroll (forbedring av zoster). Når zoster forekommer, er det følgelig mulig å forebygge forekomsten av PHN. I et ytterligere aspekt når PHN forekommer, så blir alvorlighetsgraden av PHN passende redusert sammenlignet med en ikke vaksinert kontroll (forbedring av PHN). Reduksjon i alvorlighetsgraden kan hensiktsmessig bedømmes ved en reduksjon i smerten forårsaket av zoster eller PHN, for eksempel, ved anvendelse av kjente mål for smertebelastning (f.eks. Coplan et al J Pain 2004; 5 (6) 344 -56). Reduksjon av alvorlighetsgraden kan også bedømmes ved andre kriterier slik som varighet av helvetesild eller PHN, andel av kroppsoverflate angrepet av helvetesild eller PHN; eller sete for helvetesild /PHN.

De ovennevnte redegjørelsene angår alle aspekter av oppfinnelsen.

Når en levende attenuert stamme anvendes i det første aspektet av oppfinnelsen, er den levende attenuerte stammen i ett aspekt den levende attenuerte VZV-stammen OKA-stammen, en stamme velkjent på området, for eksempel som angitt i Arbeter et al. (Journal of Pediatrics, vol 100, Nr 6, s886 ff), WO9402596, og referanser deri, slik som US 3985615. Enhver annen passende levende attenuert stamme kan også anvendes i oppfinnelsen. For eksempel er Varilrix<TM>og Varivax<TM>-stammene begge passende og kommersielt tilgjengelige og kunne anvendes i oppfinnelsen.

Hele inaktiverte VZV-stammer, slik som inaktivert VZV OKA er også egnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse.

VZV-antigenet for anvendelse i oppfinnelsen kan være hvilket som helst egnet VZV-antigen eller immunogent derivat derav, hensiktsmessig er det et renset VZV-antigen.

I ett aspekt er antigenet eller derivatet ett som er i stand til å fremkalle, når levert i kombinasjon, ledsagende eller sekvensielt med en levende attenuert VZV-stamme eller hel inaktivert VZV, en immunrespons som er forbedret fremfor den fremkalt ved den levende attenuerte stammen/hel inaktivert stamme alene eller ved VZV-antigenet alene. En slik respons kan være, for eksempel, forbedret når det gjelder én eller flere av størrelsen av immunrespons, varighet av immunrespons, antall eller % eller respondere, eller bredden av respons (f.eks. spekteret av antistoff eller T-celleresponser detektert), eller kan gi en forbedring på det kliniske nivået når det gjelder forekomst, reduksjon av smerte eller symptomer. Forbedringer av immunresponsen kan vurderes ved, for eksempel, antistoffnivåer eller cellemediert immunitet (CMI) aktivitet ved anvendelse av standardteknikker på området; forbedringer på det kliniske nivået kan også bedømmes ved anvendelse av kjente kliniske kriterier.

Spesielt oppviser immunresponsen fremkalt ved blandingen eller vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse, i ett aspekt, én eller flere av:

● en statistisk signifikant økning i CMI og/eller antistoffresponsen, sammenlignet med pre-vaksinasjonsnivå, ved sammenligning med VZV-antigen eller levende attenuert stamme/hel inaktivert stamme alene;

● En forbedret multivalent CMI respons, sammenlignet med prevaksinasjons-nivåer, sammenlignet med VZV-antigen eller levende attenuert stamme/hel inaktivert stamme alene. En multivalent CMI-respons tar hensyn til et spekter av markører for CMI slik som (men ikke begrenset til) IFN gamma, IL2, TNF alfa og CD40L og en forbedret multivalent respons induserer en CMI respons gjennom et bredere spekter av slike markører eller en høyere respons i én eller flere av markørene sammenlignet med et VZV-antigen eller levende attenuert stamme/hel inaktivert stamme alene; ● Forbedret persistent CMI eller antistoffrespons, sammenlignet med prevaksinasjons nivåer, sammenlignet med VZV-antigen eller levende attenuert stamme/hel inaktivert stamme alene. I ett aspekt blir persistens målt over etter 1 måned, 2 måneder, 3 måneder, 4 måneder, 5 måneder, 6 måneder, 12 måneder, 24 måneder, 36 måneder eller 48 måneder.

I ett aspekt blir forbedringer av immunresponsen bedømt i den eldre populasjonen, passende populasjonene med en alder på over 50 år, for hvilke risikoen for zoster eller PHN er økt med hensyn til populasjonen med en alder på under 50 år.

Forbedrede immunresponser kan også undersøkes hos immunkompromitterte populasjoner. I ett aspekt er slike populasjoner mål-populasjoner for hvilken som helst utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse.

I ett aspekt er populasjonen over 50 år, passende over 60 år, over 70 år, eller til og med over 80 år og over. I ett aspekt er populasjonen 50-70 år gammel.

Følgelig er det beskrevet anvendelse av blandingene og metodene for forebygging og/eller reduksjon av alvorlighetsgraden av zoster eller PHN hos mennesker med en alder på over 50 år.

Det er videre beskrevet anvendelse av blandingene og metodene for å forebygge og/eller redusere alvorlighetsgraden av zoster eller PHN hos immunkompromitterte individer, slik som transplantasjonspasienter eller slike som er HIV-positive.

Betegnelsen ”immunogent derivat” omfatter hvilket som helst molekyl som bibeholder evnen til å indusere en immunrespons mot VZV etter administrering til mennesker. Immunogene forbindelser heri er passende i stand til å reagere detekterbart innenfor en immunanalyse (slik som en ELISA eller T-celle stimulering analyse) med antisera og/eller T-celler fra en pasient med VZV.

Screening for immunogen aktivitet kan utføres ved anvendelse av teknikker velkjent for fagfolk. For eksempel kan slike screeninger utføres ved anvendelse av metoder slik som de beskrevet i Harlow og Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Passende metoder for fremstilling av derivater er velkjent på området og omfatter standard molekylærbiologiske teknikker som beskrevet, for eksempel, i Sambrook et al [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press], slik som teknikker for addisjon, delesjon, substitusjon eller rearrangering av aminosyrer eller kjemiske modifikasjoner derav. I ett aspekt omfatter derivater, for eksempel, trunkeringer eller andre fragmenter.

I ett aspekt er derivater i konteksten heri aminosyresekvenser omfattende epitoper, dvs., antigene determinanter i det vesentlige ansvarlig for de immunogene egenskapene av et polypeptid og er i stand til å fremkalle en immunrespons, hvor de i ett aspekt er T-celle epitoper.

I ett aspekt er nivået av immunogen aktivitet av det immunogene derivatet minst ca. 50%, i ett aspekt minst ca.70% og i ett aspekt i det minste eller mer enn ca. 90% av immunogenisiteten for polypeptidet fra hvilket det er avledet, passende som bedømt ved immunanalyse teknikker beskrevet ovenfor. I noen aspekter heri kan det identifiseres immunogene deler som har et nivå av immunogen aktivitet høyere enn den for det korresponderende fulllengde polypeptidet, f.eks., har høyere enn ca.100% eller 150% eller mer immunogen aktivitet.

I ett aspekt er VZV-antigenet et glykoprotein, i ett aspekt gE-antigenet (også kjent som gp1), eller immunogent derivat derav.

gE-antigenet, anker frie derivater derav (som også er immunogene derivater) og fremstilling derav er beskrevet i EP0405867 og referanser deri [se også Vafai A. Antibody binding sites on truncated forms of varicalla-zoster virus gpI(gE) glykoprotein Vaccine 199412:1265-9]. EP192902 beskriver også gE og fremstilling derav.

I ett aspekt er gE et trunkert gE som har sekvensen ifølge figur 1 heri, og som beskrevet i Virus research, vol 40, 1996 s 199 ff. Henvisning til gE inkluderer heretter henvisning til trunkert gE, dersom ikke annet er innlysende fra konteksten.

Andre passende antigener omfatter, for eksempel, gB, gH, gC, gl, IE63 (for eksempel se, Huang et al. J. Virol.1992, 66: 2664, Sharp et al. J. Inf. Dis.1992, 165:852, Debrus, J Virol.1995 Mai; 69(5):3240-5 og referanser deri), IE62 (for eksempel se Arvin et al. J. Immunol.1991146:257, Sabella J Virol.1993 Des; 67(12):7673-6 og referanser deri) ORF4 eller ORF 10 (Arvin et al. Viral Immunol.

2002 15: 507.)

Antigen-kombinasjoner kan anvendes med den levende attenuerte eller drepte VZV, og i ett aspekt kan gE inkluderes i hvilken som helst slik kombinasjon. I ett aspekt angår kombinasjoner av gE med IE63 og gE med IE62, for eksempel.

VZV antigener og derivater av VZV-antigener kan undersøkes for passende immunogen aktivitet ved anvendelse i modellsystemet som beskrevet i eksemplene ifølge foreliggende søknad, eller ved kliniske forsøk i mennesker. En eller flere av de følgende indikatorene for aktivitet er egnet for overveielse ved bedømmelse av immunogen aktivitet:

● Økte CD4 eller CD8 T-celle-responser mot VZV eller antigenderivater.

● Økning av VZV eller antigenderivat-spesifikke antistoffer.

● Økt produksjon av cytokiner slik som interferon γ eller IL-2 eller TNF α ● Økt ekspresjon av CD40L i CD4 og CD8 T-celler.

● Reduksjon av forekomsten av zoster under forekomsten funnet i den generelle populasjonen av på samme måte riskoindivider, og likeså redusert alvorlighetsgrad av sykdom og/eller assosiert smerte levere enn forekomsten funnet i den generelle populasjonen av på samme måte riskoindivider.

Økninger eller reduksjoner, som beskrevet ovenfor, er passende statistisk signifikante med hensyn til egnede kontroller, slik som alders tilpasset ikkevaksinert gruppe. I ett aspekt interfererer ikke den levende attenuerte VZV eller drept VZV og VZV-antigenet eller antigenderivater i betydelig grad med hverandre, slik at når de blir anvendt i kombinasjon er de to komponentene fortsatt i stand til å gi en immunogen respons mot VZV. I ett aspekt er responsen en beskyttende immunogen respons, hva enten de to komponentene blir anvendt som en blanding eller anvendt for sekvensiell administrering eller ko-administrering. Det vil forstås at noe interferens tolereres, gitt imidlertid at den totale beskyttende immunresponsen blir forbedret på en eller annen måte (økt i størrelse, økt % respondere eller bredere antigene responser, for eksempel) fremfor den for den ene eller begge de opprinnelige komponentene anvendt individuelt.

Det er beskrevet kombinasjonen av gE-antigenet og OKA-stammen, anvendt for ledsagende eller sekvensiell administrering, i den ene eller andre rekkefølge. Når levering finner sted samtidig så blir de to komponentene levert inn i ulike injeksjonsseter men i løpet av samme dag, for eksempel. I ett aspekt anvendes ulike ruter for levering for de to komponentene, spesielt subkutan levering for virusstammen slik som OKA og intramuskulær levering for antigenet slik som gE.

Det er følgelig beskrevet anvendelse av kombinasjoner av VZV-antigener eller derivater med en levende attenuert VZV-stamme eller drept VZV. Passende kombinasjoner av antigener omfatter i ett aspekt gE eller immunogent derivat derav.

Den kombinerte blandingen, eller den ene av eller begge de individuelle komponentene kan i tillegg omfatte en adjuvans eller immunstimulerende middel slik som men ikke begrenset til avgiftet lipid A fra hvilken som helst kilde og ikketoksiske derivater av lipid A, saponiner og andre reagenser, passende i stand til å stimulere en TH1 type-respons.

I ett aspekt omfatter blandingen en adjuvans i stand til å stimulere en TH1-type respons.

Høye nivåer av Th1-type cytokiner er tilbøyelige til å støtte induksjon av cellemedierte immunresponser mot et gitt antigen, mens høye nivåer av Th2-type cytokiner er tilbøyelige til å støtte induksjon av humorale immunresponser mot antigenet.

Forskjellen på Th1 og Th2-type immunrespons er ikke absolutt. I realiteten vil et individ støtte en immunrespons som er beskrevet som hovedsakelig Th1 eller hovedsakelig Th2. Imidlertid er det ofte hensiktsmessig å betrakte familiene av cytokiner i form av det beskrevet for murine CD4 ve T celle-kloner ved Mosmann og Coffman (Mosmann, T.R. og Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, s145-173). Tradisjonelt er Th1-type responser forbundet med produksjon av INF-γ og IL-2 cytokinene ved T-lymfocytter. Andre cytokiner ofte direkte forbundet med induksjon av Th1- type immunresponser blir ikke produsert av T-celler, slik som IL-12. I motsetning er Th2-type responser forbundet med sekresjon av Il-4, IL-5, IL-6, IL-10.

Passende adjuvans-systemer som fremmer en hovedsakelig Th1-respons omfatter, monofosforyl lipid A eller et derivat derav, spesielt 3-de-O-acylert monofosforyl lipid A. Det har lenge vært kjent at enterobakterie lipopolysakkarid (LPS) er en potent stimulator av immunsystemet, selv om dens anvendelse i adjuvanser har vært innskrenket av den toksiske effekter. Et ikke-toksisk derivat av LPS, monofosforyl lipid A (MPL), fremstilt ved fjerning av kjerne karbohydratgruppen og fosfatet fra glukosaminet ved den reduserende enden, har blitt beskrevet av Ribi et al (1986, Immunology and immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, s407-419) og har følgende struktur:

En ytterligere avgiftet versjon av MPL kommer som et resultat av fjerning av acylkjeden fra 3-stillingen av disakkarid ryggraden, og blir kalt 3-O-Deacylert monofosoryl lipid A (3D-MPL). Den kan renses og fremstilles ved metodene beskrevet i GB 2122204B, hvilken referanse også beskriver fremstilling av difosforyl lipid A, og 3-O-deacylerte varianter derav.

I ett aspekt er 3D-MPL i form av en emulsjon med en liten partikkelstørrelse mindre enn 0,2 μm i diameter, og metode for fremstilling av denne er beskrevet i WO 94/21292. Vandige formuleringer omfattende monofosforyl lipid A og en surfaktant har blitt beskrevet i WO9843670A2.

De bakterie lipopolysakkarid-avledede adjuvansene som skal formuleres i blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse kan renses og bearbeides fra bakterielle kilder, eller alternativt kan de være syntetiske. For eksempel er renset monofosforyl lipid A beskrevet i Ribi et al 1986 (supra), og 3-O-Deacylert monofosforyl eller difosforyl lipid A avledet fra Salmonella sp. beskrevet i GB 2220211 og US 4912094. Andre rensede og syntetiske lipopolysakkarider har blitt beskrevet (Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141-6; og EP 0549 074 B1). I ett aspekt er den bakterielle lipopolysakkarid adjuvansen 3D-MPL.

Følgelig er de LPS-derivatene som kan anvendes heri de immunstimulerende midlene som har lignende struktur som den av LPS eller MPL eller 3D-MPL. I en annen utførelsesform kan LPS-derivatene være et acylert monosakkarid, som er en undergruppe av den ovennevnte strukturen av MPL.

Saponiner er beskrevet i: Lacaille-Dubois, M og Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 s.363-386). Saponiner er steroide eller triterpene glykosider vidt utbredt i planteriket og det marine dyreriket. Saponiner er konstatert å danne kolloidale løsninger i vann som skummer ved risting, og for å utskille kolesterol. Når saponiner er nær cellemembraner danner de porelignende strukturer i membranen som fører til at membranen revner. Hemolyse av erytrocytter er et eksempel på dette fenomenet, som er en egenskap for visse, men ikke alle, saponiner.

Saponiner er kjent som adjuvanser i vaksiner for systemisk administrering.

Adjuvans- og hemolytisk aktivitet av individuelle saponiner har blitt omfattende studert på området (Lacaille-Dubois og Wagner, supra). For eksempel er Quil A (avledet av barken fra det søramerikanske treet Quillaja Saponaria Molina), og fraksjoner derav, beskrevet i US 5,057,540 og "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; og EP 0362 279 B1. Partikulære strukturer, betegnet Immun Stimulerende COMplekser (ISCOMS), omfattende fraksjoner av Quil A er hemolytiske og har blitt anvendt ved fremstilling av vaksiner (Morein, B., EP 0 109942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739). De hemolytiske saponinene QS21 og QS17 (HPLC rensede fraksjoner av Quil A) har blitt beskrevet som potente systemiske adjuvanser, og metoden for fremstilling av dem er beskrevet i US Patent nr.5,057,540 og EP 0362 279 B1. Andre saponiner som har blitt anvendt i systemiske vaksinasjonsstudier omfatter de avledet av andre plantearter slik som Gypsophila og Saponaria (Bomford et al, Vaccine, 10(9):572-577, 1992).

Et forsterket system omfatter kombinasjonen av et ikke-toksisk lipid A-derivat og et saponin-derivat spesielt kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL som beskrevet i WO 94/00153, eller en mindre reaktogen blanding hvor QS21 blir quenchet med kolesterol som beskrevet i WO 96/33739. I ett aspekt kan kombinasjonen av QS21 med 3D MPL bli anvendt.

I ett aspekt omfatter adjuvansen for anvendelse heri QS21 og en liposomformulering omfattende kolesterol og 3D MPL.

En spesielt potent adjuvansformulering omfattende QS21 og 3D-MPL i en olje-ivann emulsjon er beskrevet in WO 95/17210 og er også passende for anvendelse heri.

I ett aspekt omfatter blandingen ytterligere et saponin, som i ett aspekt er QS21, og i et annet aspekt er QS21 quenchet med kolesterol som beskrevet i WO 96/33739.

Den immunogene blandingen heri omfatter eventuelt en olje-i-vann emulsjon, som kan anvendes i kombinasjon med andre adjuvanser slik som QS21 og/ eller 3D MPL som beskrevet ovenfor. Adjuvansformuleringer omfattende en olje-i-vann emulsjon er beskrevet i WO9911241 og WO9912565.

Et alternativ valg av adjuvans er et umetylert CpG dinukleotider ("CpG"). CpG er en forkortelse for cytosin-guanosin dinukleotid-motiver til stede i nukleinsyrer. CpG oligonukleotider er beskrevet i WO 96/02555 og EP 468520.

I ett aspekt blir en kombinasjon av hvilke som helst av adjuvansene beskrevet heri (QS21 eller QS21 quenchet med kolesterol 3DMPL, eventuelt med en olje-ivann emulsjon) anvendt med gE, eller immunogent derivat derav, anvendt i ledsagende eller sekvensiell administrering med en levende attenuert VZV eller inaktivert hel VZV.

Mengden av VZV-antigen blir valgt som en mengde som induserer en immunbeskyttende respons uten signifikante, ugunstige bivrikninger i typiske vaksiner. Slike mengder vil variere avhengig av hvilket spesifikt immunogen som anvendes og hvordan det blir presentert. Generelt er det forventet at hver dose vil omfatte 1-1000 μg protein, for eksempel 2-100 μg, eller 5-60 μg. Når gE blir anvendt så kan i ett aspekt 25 – 100 μg gE anvendes for mennesker, for eksempel 40-100 μg gE for bruk i mennesker, i ett aspekt ca.25 μg, ca.50 μg eller ca.100 μg gE, passende 25 μg, 50 μg eller 100 μg gE. For OKA-stammen er, for eksempel, en passende dose 500 - 50000 pfu/0,5 ml, for eksempel 2000 - 6000 pfu/0,5 ml, mens en passende dose av GSK Varilrix Oka-stammen for eksempel er 6000-25,000 per dose, for eksempel 10,000 pfu/ dose. Høyere doser slik som 30,000 pfu, 40000 pfu, 50,000 pfu 60,000 pfu, 70000 pfu, 80000 pfu, 90000 pfu eller til og med 100000 pfu kan anvendes.

En optimal mengde for en bestemt vaksine kan fastslås ved standard studier omfattende observasjon av hensiktsmessige immunresponser i subjekter. Etter en initiell vaksinasjon, kan subjekter motta én eller flere booster immuniseringer med passende intervaller.

Blandingen(e) ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres for hvilken som helst egnet metode for administrering, inkludert for eksempel, topisk, oral, nasal, mukosal, intravenøs, intradermal, intraperitoneal, subkutan og intramuskulær administrering. Levering av OKA-stammen finner sted, i ett aspekt, ved subkutan levering.

Den immunogene blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i en vaksineblanding, eventuelt i kombinasjon med en adjuvans og/eller (annen) passende bærer.

VZV-antigenet og attenuert VZV heri kan anvedes sammen i en blanding for å fremkalle en immunrespons mot VZV, eller separat – enten ledsagende eller sekvensielt i et prime boost-regime. For ledsagende eller sekvensiell levering kan komponentene i vaksinen anvendes i hvilken som helst rekkefølge. I én utførelsesform blir levering av en levende attenuert VZV eller hel inaktivert VZV etterfulgt av et VZV-antigen eller immunogent derivat derav. I en annen utførelsesform blir levering av et VZV-antigen eller immunogent derivat derav fulgt av levering av levende attenuert VZV eller hel inaktivert VZV.

Det er mulig å forebygge og/eller redusere alvorlighetsgraden av herpes zoster og/eller post-herpetisk neuralgi omfattende å levere til et individ med risiko for zoster en immunogen blanding omfattende en levende attenuert VZV og et VZV-antigen.

Det er videre mulig å forebygge og/eller redusere alvorlighetsgraden av herpes zoster og/eller post-herpetisk neuralgi omfattende sekvensiell eller ledsagende levering til et individ med risiko for zoster av en levende attenuert VZV og et VZV-antigen.

Et prime boost-regime er mulig hvori et VZV-antigen, i ett aspekt et antigen tilsatt adjuvans, blir levert først, hvoretter immunsystemet blir boostet med levering av en attenuert VZV.

Et prime boost-regime i mennesker omfatter, i ett aspekt, å prime med 25 - 100 μg gE, i ett aspekt 40 - 100 μg gE , slik som 50 eller ca.50 μg gE, eller et immunogent derivat derav, tilsatt QS21 som adjuvans (for eksempel QS21 quenchet med kolesterol som beskrevet ovenfor) og 3D-MPL, og booste med OKA-stammen av VZV.

Når prime boost-regimer blir anvendt, eller når multiple vaksinasjonsregimer blir anvendt, så kan 2, 3, 4 eller flere immuniseringer anvendes. Passende regimer for prime boost omfatter 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 måneder mellom individuelle immuniseringer.

Et prime boost-plan omfatter, i ett aspekt, levering av et VZV-antigen eller immunogent derivat derav, passende et VZV-antigen eller derivat tilsatt adjuvans, ved 0 måneder og boosting med en levende attenuert VZV ved 2M.

I en alternativ leverings-plan finner det sted en ledsagende levering av begge de to individuelle komponentene (VZV-antigen eller derivat og levende attenuert VZV) ved både 0 og 2 måneder.

I et andre aspekter kan et gE-antigen, eller immunogent derivat eller immunogent fragment derav, anvendes med en adjuvans for å gi en immunogen blanding eller vaksine. Det vil si at gE-antigenet eller immunogent derivat eller immunogent fragment derav kan anvendes i en vaksinasjonsplan i fravær av en levende attenuert stamme eller hel inaktivert stamme.

En blanding omfattende gE eller et immunogent derivat eller immunogent fragment derav i kombinasjon med en TH-1-adjuvans, kan anvendes ved fremstilling av et medikament for forebygging eller forbedring av herpes zoster reaktivering og/eller post-herpetisk neuralgi.

Betegnelsen "immunogent derivat" hva angår gE er som beskrevet ovenfor, sammen med metoder for å oppnå slike derivater slik som fragmenter av gE.

Immunogene fragmenter som beskrevet heri er immunogene derivater som bibeolder evnen til å indusere en immunrespons mot VZV etter administrering til mennesker.

I ett aspekt blir det anvendt et gE trunkat i hvilket gE har en C-terminal trunkering.

I ett aspekt fjerner trunkeringen fra 4 til 20 prosent av de totale aminosyrerestene ved den karboksyterminale enden.

I ett aspekt mangler gE den karboksyterminale forankrings-regionen (passende ca. aminosyrene 547- 623 av villtypesekvensen).

I ett aspekt er gE et trunkert gE som har sekvensen ifølge figur 1 heri, og som beskrevet i Virus research, (Haumont et al VoI 40, 1996 s 199 - 204).

Referanse til gE omfatter heretter referanse til trunkert gE, eller andre fragmenter eller derivat av gE, dersom ikke annet er innlysende fra konteksten.

I et annet aspekt omfatter blandingen fullengde gE.

I et annet aspekt er gE eller derivat eller fragment derav lyofilisert. I et annet aspekt er gE eller derivat eller fragment derav rekonstituert i en løsning omfattende en adjuvans (slik som en adjuvans omfattende QS21, kolesterol og 3D MPL) før levering.

I én utførelsesform omfatter blandingen eller vaksinen gE og en TH-1 adjuvans og omfatter ikke et IE63-antigen eller andel derav. I én utførelsesform omfatter blandingen eller vaksinen gE og en TH-1 adjuvans og omfatter ikke noe annet VZV-antigen. I én utførelsesform omfatter blandingen eller vaksinen gE og en TH-1 adjuvans og omfatter ikke noe annet viralt antigen.

I ett aspekt er gE eller immunogent fragment derav ikke i form av et fusjonsprotein.

I ett aspekt består blandingen eller vaksinen hovedsakelig av QS21, et trunkert VZV gE-antigen og liposomer omfattende kolesterol og 3D-MPL.

I ett aspekt består blandingen eller vaksinen av 3D-MPL, QS21, et trunkert VZV gE-antigen, liposomer omfattende kolesterol og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Blandingen kan anvendes ved fremstilling av et medikament for forebygging eller forbedring av herpes zoster reaktivering og/eller post-herpetisk neuralgi.

Blandingen eller vaksinen blir passende anvendt i populasjonen av mennesker på 50 år eller eldre enn 50 år. Populasjonen er passende populasjonen av de som er eldre enn 55, 60, 65, 70, 75, 80, eller eldre enn 80. Passende er populasjonen 50-70 år.

I ett aspekt er populasjonen av individer de som har hatt varicella eller som har fått en levende varicella-vaksine.

I ett aspekt blir blandingen ifølge de første og andre aspektene heri anvendt for de individene i hvilke varicella zoster-viruset ikke er reaktivert.

Blandingen kan anvendes ved doser og leveringsruter som skissert ovenfor.

Spesielt blir mengden av gE-antigen valgt som en mengde som induserer en immunbeskyttende respons uten betydelige uønskede bivirkninger i typiske vaksiner. Slike mengder vil variere avhengig av hvilket spesifikt immunogen som anvendes og hvordan det blir presentert. Generelt er det forventet at hver dose vil omfatte 1-1000 μg protein, slik som 2-100 μg, eller 5-60 μg. Når gE blir anvendt så blir passende 25 – 100 μg gE anvendt, i ett aspekt 40- 100 μg gE, slik som ca.25 μg, 50 μg eller ca.100 μg gE, passende 25 μg, 50 μg eller 100 μg gE. En optimal mengde for en bestemt vaksine kan fastslås ved standard studier omfattende observasjon av hensiktsmessige immunresponser i subjekter. Etter en initiell vaksinasjon, kan subjekter motta én eller flere booster immuniseringer med passende mellomrom.

I ett aspekt blir gE og adjuvansblandingen eller vaksinen anvendt i et doseleverings-regime. I ett aspekt blir gE og adjuvansblandingen eller vaksinen anvendt i et to dose-leverings-regimene.

I ett aspekt blir blandingen eller vaksinen herisssss anvendt i et 2-doseregime med et 2 måneders mellomrom mellom doser.

I ett aspekt er TH-1 adjuvansen hvilken som helst adjuvans identifisert ovenfor. Spesielt kan en kombinasjon av 3D MPL og QS21 anvendes, for eksempel som beskrevet i WO94/00153, eller en mindre reaktogen blanding hvor QS21 blir quenchet med kolesterol som beskrevet i WO 96/33739 og US6846489. En alternativ adjuvans omfatter QS21 og 3D-MPL i en olje-i-vann emulsjon som beskrevet i WO 95/17210.

I ett aspekt omfatter en formulering en C-terminal trunkering av VZV gE-antigenet, for eksempel den gitt i Figur 1, i kombinasjon med 3D MPL og QS21.

Det er mulig å danne et kit omfattende, som separate komponenter, en TH-1 adjuvans og et gE-antigen eller immunogent fragment derav, som beskrevet ovenfor, passende for ekstemporert fremstilling av en vaksineblanding. I ett aspekt er begge komponentene flytende. I ett aspekt er én komponent lyofilisert og er egnet for rekonstituering med den andre komponenten. I ett aspekt omfatter kitet et gE-antigen som har sekvensen ifølge figur 1 og en adjuvans omfattende QS21 og liposomer omfattende kolesterol og 3D MPL.

Vaksine fremstilling er generelt beskrevet i New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. (eds), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978.

Aspekter heri omfatter:

A En immunogen blanding omfattende et VZV-antigen eller immunogent derivat derav i kombinasjon med en levende attenuert VZV eller hel inaktivert VZV.

B Det er følgelig mulig å forebygge og/eller redusere alvorlighetsgraden av herpes zoster og/eller post-herpetisk neuralgi (PHN) omfattende å levere til et individ en immunogen blanding omfattende et VZV-antigen eller immunogent derivat derav i kombinasjon med en levende attenuert VZV eller hel inaktivert VZV.

C Det er videre mulig å forebygge og/eller redusere alvorlighetsgraden av herpes zoster og/eller post-herpetisk neuralgi, hvor fremgangsmåten omfatter sekvensiell eller ledsagende levering til et individ av et VZV-antigen eller immunogent derivat derav og en levende attenuert VZV eller hel inaktivert VZV.

D Det er mulig med en fremgangsmåte ifølge avsnitt C hvori et VZV-antigen blir levert før levende attenuert VZV.

E Det er videre mulig med en fremgangsmåte ifølge avsnitt C hvori et VZV-antigen blir levert etter levende attenuert VZV.

F Det er videre mulig med en fremgangsmåte ifølge avsnitt C hvori et VZV-antigen blir levert ledsagende med levende attenuert VZV, foretrukket med hver komponent i en ulik arm hos en pasient.

G Det er videre mulig å danne et kit omfattende en levende attenuert VZV eller hel inaktivert VZV og, separat, et VZV-antigen eller immunogent derivat derav, hvor komponentene er passende for ledsagende eller sekvensiell levering, eller for blanding i en enkelt sammensetning før levering.

H Det er videre mulig med en fremgangsmåte for fremstilling av en immunogen blanding, hvor fremgangsmåten omfatter å kombinere en levende attenuert VZV eller hel inaktivert VZV med et VZV-antigen eller immunogent derivat derav.

I Det er videre mulig å anvende en levende attenuert VZV-stamme ved fremstilling av en immunogen blanding for å forebygge og/eller redusere alvorlighetsgraden av herpes zoster og/eller post-herpetisk neuralgi, hvori den levende attenuerte VZV-stammen blir anvendt i kombinasjon med et VZV-antigen eller immunogent derivat derav

J Det er videre mulig å anvende en hel inaktivert VZV-stamme ved fremstilling av en immunogen blanding for å forebygge og/eller redusere alvorlighetsgraden av herpes zoster og/eller post-herpetisk neuralgi, hvori den hele inaktiverte VZV-stammen blir anvendt i kombinasjon med et VZV-antigen eller immunogent derivat derav

K Det er videre mulig å anvende et VZV-antigen eller immunogent derivat derav ved fremstilling av en immunogen blanding for å forebygge og/eller redusere alvorlighetsgraden av herpes zoster og/eller post-herpetisk neuralgi, hvori VZV antigenet blir anvendt i kombinasjon med en levende attenuert VZV-stamme eller hel inaktivert VZV stamme

L Det er videre mulig å anvende ifølge hvilke som helst foregående avsnitt I-K hvori antigenet eller derivatet derav blir levert i en forsterkningsdose (”prime boost”)-metode før VZV-stammen.

M Anvendelse ifølge hvilke som helst foregående avsnitt I-K er mulig hvori antigenet eller derivatet derav blir levert i en forsterkningsdose (”prime boost”)-metode etter VZV-stammen.

N Anvendelse ifølge hvilke som helst av avsnittene I-K er videre mulig hvori antigenet eller derivatet derav blir levert ledsagende med VZV-stammen.

O Anvendelse ifølge hvilket som helst foregående avsnitt I-K er videre mulig hvori antigenet eller derivatet derav blir levert i blanding med VZV-stammen.

P En anvendelse, fremgangsmåte, kit eller blanding ifølge hvilket som helst foregående avsnitt er videre mulig hvori den levende attenuerte VZV-stammen er OKA-stammen

Q En anvendelse, fremgangsmåte, kit, blanding eller vaksine ifølge hvilket som helst av det foregående er videre mulig hvor VZV-antigenet blir levert med en adjuvans i stand til å stimulere en TH1 type-respons.

Foreliggende oppfinnelse blir illustrert ved de følgende eksemplene.

Eksempel 1

Tre eksperimentelle grupper kan settes opp for å studere begge aspektene ifølge oppfinnelsen:

Regime 1 50 μg gE adjuvans AS1 (MPL<®>/ QS21) 0, 2 måneder 2 OKA stamme (Varilrix<TM>) ~10,000 pfu/dose 0,2 måneder 3 Ledsagende administrering av 50 μg gE AS1 gruppe 0, 2 måneder (som i 1) med Varilrix<TM>(som i 2)

MPL<®>= 3D-MPL

Den anvendte gE kan være trunkert gE, som beskrevet i Figur 1. Varilrix<TM>er en kommersielt tilgjengelig OKA-stamme.

Humane frivillige (for eksempel, 50 pr. gruppe - friske, i alderen 50- 70 år) kan velges for vaksinering i henhold til ovennevnte protokoll, og resultater kan bedømmes ved å måle både cellemediert immunitet og antistoffresponser, for eksempel ved intracellulær farging (ICS, Roederer et al.2004 Clin. Immunol.110: 199) eller ELISA-teknikker henholdsvis, idet disse er velkjent på området.

Spesifikk cellemediert immunitet kan evalueres ved, for eksempel, in vitro inkubering av pasient PBMC med varicella-zoster virus-ekstrakter så vel som spesifikke VZV-antigener eller peptider gE, IE63 og IE62. Analyse kan utføres ved nivået av, for eksempel:

a Lymfoproliferasjon (data uttrykt som Stimuleringsindeks [SI]): GM, GM ganger økning og % av respondere

b Analyse av IFNγ eller IL2 eller TNFα, eller CD 40L ekspresjon ved CD4 og CD8-celler ved ICS (intracellular cytokin farging): GM, GM ganger økning og % av respondere

Effektivitet kan bedømmes ved å søke etter en signifikant økning i CMI og /eller antistoffrespons sammenlignet med pre vaksinasjonsnivåer.

Effektivitet av andre antigener eller metoder kan bedømmes ved anvendelse av disse eller lignende teknikker, og sammenligne pre vaksinasjonsnivåer med post vaksinasjonsnivåer.

Eksempel 2

Forsøket ifølge Eksempel 1 ble utført i humane frivillige med ulik alder, som følger:

Gruppe A gE AS1 i voksne 18 - 30 år

Gruppe B gE levert ledsagende med Varilrix OKA-stammen 18 -30 år Gruppe C Varilrix OKA-stammen alene i voksne 50-70 år

Gruppe D gE AS1 i voksne 50-70 år

Gruppe E gE levert ledsagende med Varilrix OKA-stammen 50-70 år

Vaksinasjonsplanen var som følger:

Gruppe Alder (År) N Vaksinasjon 1 (måned 0) Vaksinasjon 2 (måned 2) A 18-30 10 gE-AS1 gE-AS1

B 18-30 10 gE-AS1 Varilrix<TM>gE-AS1 Varilrix<TM>

C 50-70 45 Varilrix<TM>Varilrix<TM>

D 50-70 45 gE-AS1 gE-AS1

E 50-70 45 gE-AS1 Varilrix<TM>gE-AS1 Varilrix<TM>

Adjuvansen AS1 omfatter 3D MPL og QS21 i en quenchet form med kolesterol, og ble fremstilt som beskrevet i WO9633739, omfattet heri ved referanse. Spesielt ble AS1 adjuvansen fremstilt hovedsakelig som Eksempel 1.1 ifølge WO9633739. Adjuvansen omfater: liposomer, som igjen omfatter dioleoyl fosfatidylcholin (DOPC), kolesterol og 3D MPL [i en mengde på 1000 μg DOPC, 250 μg kolesterol og 50 μg 3D MPL, hvor hver verdi er gitt pr. vaksinedose], QS21 [50 μg/dose], PBS og vann til et volum på 0,5ml.

Ved prosessen for fremstilling av liposomer inneholdende MPL blir DOPC (Dioleyl fosfatidylcholin), kolesterol og MPL oppløst i etanol. En lipidfilm blir dannet ved fordampning av løsningsmiddel under vakum. Fosfat Buffer Saltoppløsning eller PBS (9 mM Na2HPO4, 41 mM KH2PO4, 100 mM NaCl) ved pH 6,1 blir tilsatt og blandingen blir underlagt prehomogenisering etterfulgt av mikro fluidisering ved 15,000 psi (20 sykluser). Dette fører til fremstilling av liposomer som blir sterilfiltrert gjennom en 0,22 μm membran i et aseptisk (klasse 100) område. Det sterile produktet blir deretter fordelt i sterile glassbeholdere og lagret i et kaldt rom (+2 til 8°C). På denne måten inneholder de fremstilte liposomene MPL i membranen ("MPL i" utførelsesform of WO9633739).

Den trunkerte gE ifølge Figur 1 ble uttrykt i CHO K1-celler ved anvendelse av standardteknikker og renset ved anvendelse av, i rekkefølge, anionbytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi, ionebytterkromatografi, diafiltrering og nanofiltrering fulgt av sterilisering gjennom et 0,22 μm filter.

Spesielt ble de følgende trinnene anvendt ved rensing av gE

Første trinn: anionbytterkromatografi

Kultursupernatanten inneholdende gE (ca.30 mg/l) blir renset, enten direkte etter klargjøring av cellesuspensjonen eller etter tining ved 4°C. Etter overføring til en 20 liters syreballong, blir pH av supernatanten justert til 6.

Bindingstrinnet foregår ved omgivelsestemperatur på en kromatografikolonne inneholdende en Q Sepharose XL resin.

Etter rensing med natriumhydroksid, blir kolonnen kondisjonert i bindingsbufferen (piperazin 20 mM pH 6). Supernatanten blir deretter fylt på kolonnen og kolonnen blir vasket med ekvilibreringsbuffer og en løsning av piperazin 20 mM NaCl 150 mM pH 6.

Fraksjonen inneholdende gE blir deretter eluert med en løsning av piperazin 20 mM NaCl 250 mM ved pH 6.

Andre trinn: hydrofob interaksjonskromatografi

Dette kromatografitrinnet foregår ved omgivelsestemperatur i en Toyopearl butyl-650 M resin (Tosoh Biosep).

Fraksjonen eluert med 20 mM piperazin 250 mM NaCl i Q Sepharose XL-trinnet blir tilberedt til 1M i ammoniumsulfat og justert til pH 7,5.

Etter rensing med natriumhydroksid og før påfylling av denne fraksjonen, ble kolonnen kondisjonert i bindingsbufferen (50 mM KH 2PO4 1M ammoniumsulfat pH 7,5). Etter fylling ble kolonnen vasket med buffer 50 mM KH2PO4 100 mM (NH4)2SO4 pH 7,5. gE blir eluert med buffer 50 mM KH2PO4 25 mM (NH4)2SO4 pH 7,5.

Tredje trinn: affinitets kromatografi på immobilisert metallion

Dette kromatografitrinnet foregår ved omgivelsestemperatur på en Chelating Sepharose Fast Flow-resin. Denne resinen blir mettet med metallion (Ni) ved anvendelse av en nikkelsulfatløsning (1%) og overskytende ubundne ioner (Ni), fjernet ved vasking. gE-fraksjonen eluert med 50 mM KH2PO4 25 mM (NH4)2SO4 pH 7,5 i den hydrofobe fasen blir tilberedt til 0,5 M NaCl og justert til pH 7,5. Etter rensing blir kolonnen ekvilibrert i bindingbufferen (50 mM KH2PO4 0,5 M NaCl pH 7,5). gE-løsningen blir fylt på kolonnen, som deretter blir vasket med en løsning av 50 mM KH2PO4 0,5 M NaCl pH 5,6. gE blir deretter eluert med en buffer av 50 mM natriumacetat 0,5 M NaCl pH 5, og nøytralisert med en Tris 1M løsning pH 9,5.

Fjerde trinn: diafiltrering

Buffer utveksling og utskillelse av salter fra gE-fraksjonen eluert ved pH 5 i det foregående trinnet blir utført ved tangential ultrafiltrering. Dette trinnet blir utført i sin helhet ved 4°C.

Ultrafiltreringen blir kjørt ved Millipore Proflux M12-systemet, tilpasset med en 10 kDa Pellicon2 Mini membran av regenerert cellulose (kat: P2C010C01) av grense nominell molekylvekt og et overflateareal på 0,1 m<2>plassert i en Pellicon2 minikassett beholder (kat.XX42PMINI).

Etter rensing med vann og renhold med natriumhydroksid, blir hele systemet med membran renset med 2 liter av modifisert PBS-buffer (= 8,1 mM Na2HPO42H2O, 1,47 mM KH 2PO4, 137 mM NaCl, 2,68 mM KCL pH 7,2) og deretter ekvilibrert med 2 liter av samme buffer inntil en pH-verdi på 7,2 blir nådd i permeatet.

Målingen av permeabiliteten av membranen blir verifisert. Integritetstesten for membranen blir utført ved å plassere systemet under trykk opptil 1 bar før og ved slutten av diafiltreringstrinnet. Dersom denne membranen blir anvendt to ganger med et intervall på én uke, vil integriteten bli testet tre ganger (en gang før hver ultrafiltrering og en gang etter den andre filtreringen). Membranen blir ansett å være intakt dersom tap av trykk registrert over 5 minutter er mindre enn 0,1 bar. Konsentrasjonen av gE-fraksjonen eluert ved pH 5 i affinitetstrinnet bli evaluert ved å måle den optiske tettheten ved 280 nm. Korrelasjonen mellom absorbansen ved 280 nm og proteinkonsentrasjonen av gE ved mikroBCA blir fastsatt ved 1 OD280 = 1,75 mg/ml.

Løsningen inneholdende gE blir diafiltrert mot 10 volumer av modifisert PBS-buffer (= 8,1 mM Na2HPO42H2O, 1,47 mM KH 2PO4, 137 mM NaCl, 2,68 mM KCL pH 7,2). Trykkbetingelsene blir innstilt slik at diafiltreringstiden er ca.11/2 - 2 timer (permeat strømning ca.60 ml/min). Diafiltrerings residuet blir deretter gjenvunnet og på grunnlag av baselinje OD280 blir membranen renset med modifisert PBS for å gi en tilnærmet endelig konsentrasjon på 0,4 mg/ml.

Femte trinn: nanofiltrering

Dette neste trinnet gjør det mulig å fjerne virus med en diameter på mer enn 15 nm ved bibeholdelse. Dette trinnet blir utført i sin helhet ved 4°C.

Nanofiltreringen blir utført på et PLANOVA 15N filter (gjennomsnittlig porestørrelse 15 nm; filtrerings overflateareal 0,12 m<2>(ASAHI kat: 15NZ-120)). Under et konstant trykk på 0,45 bar, blir gE-løsningen filtrert på membranen og gjenvunnet på den andre siden med virus fjernet.

Rørene og beholderen (kolonne XK50) blir renset i to timer med en løsning av NaOH 0,5M. Det hele blir deretter renset og nøytralisert med den modifiserte PBS-bufferen (samme buffer som for diafiltreringen) inntil en pH-verdi på 7,2 er oppnådd.

Etter festing av nanofilter PLANOVA 15N (tilførsel siden) under rammen, blir filteret renset og ekvilibrert med en modifisert PBS-løsning.

Diafiltrerings-residuet inneholdende gE-løsningen blir først pre-filtrert gjennom 0,22 μm (mini kleenpak OU Acropak20, avhengig av volumet som skal filtreres) før det blir nano-filtrert ved et konstant trykk på 0,45 bar på PLANOVA 15N.

Ved slutten av nanofiltreringen blir filteret renset med et tilstrekkelig volum av modifiert PBS til å gi en endelig konsentrasjon av bulken på ca.0,3 mg/ml.

Til slutt blir membranen vasket med 50 ml modifisert PBS. Løsningen blir gjenvunnet gjennom rest utløpet.

Integritetstesten på PLANOVA 15N membranen blir deretter utført som følger: - den første testen består av å sette membranen under trykk (1,0 kg/cm<2>) og observere dannelsen av luftbobler. Denne testen detekterer enhver stor sprekk. - den andre testen: fjerning av partikler av gull (PARTICORPLANOVA-QCVAL4) verifiserer strukturen av membranen (god fordeling av store porer og kapillærer).

Vaksineblanding

gE-komponenten av vaksinen omfatter 50 μg gE og eksipientene natriumklorid, kaliumklorid, monokaliumfosfat, dinatriumfosfat og vann for injeksjon så vel som AS1-adjuvansen. Funksjonen av de uorganiske saltene er å sørge for isotonisitet og fysiologisk pH.

I en steril glassbeholder ble vann for injeksjon, konsentrert fosfatbufret saltoppløsning og gE-antigen blandet for å nå konsentrasjonen av ingredienser som nedenfor:

Løsningen blir blandet i 30 til 40 minutter. pH blir undersøkt og justert til 7,2 ± 0,1 med HCl eller NaCl eller passende og omrørt i ytterligere 10 minutter. Den endelige bulken ble lagret i polypropylenflasker ved -20°C og overført til GSK Bio for fylling. Vaksinen blir fylt inn i 3 ml, sterile, silikoniserte glassampuller (0,25 ml/ampulle) som blir lukket med grå klorbutyl gummipropper og forseglet med sentral aluminiumhetter som kan rives av. De kontrollerte, godkjente ampullene blir deretter lagret ved - 20°C.

Levering av vaksiner

gE-AS1-vaksinen for administrering ble oppnådd ved å blande det flytende antigenpreparatet med den flytende AS1-adjuvansen umiddelbart før injeksjon (maksimalt én time før injeksjon). OKA (Varilrix<TM>) var en kommersielt tilgjengelig lot fremstilt i henhold til fabrikantens instruksjoner.

Vaksineformuleringer var som følger:

Vaksine gE

Formulering 50 μg VZV (gE) antigen i 0,2 ml volum

AS1 i 0,5 ml volum

Presentasjon Glassampulle inneholdende flytende gE

Totalt Dose Volum* 0,7ml (etter rekonstituering) ;;Vaksine Varilrix med fortynningsmiddel ;Formulering Omtrent 10<4.0>pfu/dose ;0/5ml volum ;Presentasjon Glassampulle inneholdende lyofilisert ;vaksine for rekonstituering ;Totalt Dose Volum* 0,5 ml

gE AS1-komponenten ble administrert ved intramuskulær injeksjon.

Varilrix-komponenten ble administrert ved subkutan injeksjon.

Analyse av resultater

Protokollen for det kliniske forsøket, inngitt ved forberedelse for det kliniske forsøket, skisserte typene av studier som skulle utføres i forsøket, som følger:

a lymfoproliferasjon (data uttrykt som Stimuleringsindeks [SI]): GM, ganger økning i GM og % av respondere etter stimulering ved VZV lysat.

b IFN gamma og/eller IL2, TNF alfa, CD40L, CD4 og CD8-respons ved ICS (intracellulær farging): GM, - ganger økning i GM og % av respondere etter stimulering ved VZV-lysat og gE, IE62 og IE63-peptider.

Lymfoproliferasjon

Perifert blod antigen-spesifikke lymfocytter kan restimuleres in vitro til å proliferere dersom inkubert med deres korresponderende antigen. Følgelig kan mengden av antigenspesifikke lymfocytter anslås ved opptelling tritiert tymidin inkorporeringsanalyse. I foreliggende studie vil VZV-antigen eller peptid avledet fra VZV-proteiner bli anvendt som antigen for å restimulere VZV-spesifikke lymfocytter. Resultater vil bli uttrykt som en stimuleringsindeks (SI) som korresponderer med forholdet mellom antigen-spesifikk og bakgrunnslymfoproliferasjon.

Cytokin strømningscytometri (CFC)

Perifert blod antigen-spesifikke CD4 og CD8 T-celler kan restimuleres vitro til å uttrykke CD40L, IL-2, TNF alfa og IFN gamma dersom inkubert med deres korresponderende antigen. Følgelig kan antigenspesifikke CD4 og CD8 T-celler telles opp ved strømningscytometri etter konvensjonell immunfluorescensmerking av cellulær fenotype så vel som intracellulær cytokin-produksjon. I foreliggende studie vil VZV-antigen eller peptid avledet av VZV-proteiner bli anvendt som antigen for å restimulere VZV-spesifikke T-celler. Resultater vil bli uttrykt som en frekvens av cytokin(er)-positive CD4 eller CD8 T-celler innenfor CD4 eller CD8 T-celle subpopulasjonen.

Spesifikt antistoff (anti-VZV og anti-gE)

Antistoffnivåer mot VZV og gE vil bli målt ved anvendelse av klassiske ELISA-analyser.

Resultater av forsøket er vist i tabellform. Figurene 2-6 presenterer resultater i en grafisk form for antistoff (Figurene 2-4, se tabellene 1.1 a - c) og CMI-responser (Figurene 5 og 6 – se tabell C1 / "CD4 all doubles" test med gE antigen eller Varilirix, median verdier).

HUMORAL IMMUNRESPONS

Tabell I.1a Seropositivitets rater og GMT’er for VZV IGG antistoffer (ATP kohort for immunogenisitet)………………………..

Tabell I.1b Seropositivitets rater og GMT’er for VZV. GE-antistoffer (ATP kohort for immunogenisitet)……………………….

Tabell I.1c Seropositivitets rater og GMT’er for IFA-antistoffer

(ATP kohort for immunogenisitet)……..

Tabell I.2b Serokonversjon rates for gE antistoff-titer ved hvert post vaksinasjonstidspunkt (ATP kohort for immunogenisitet)……..

Tabell I.3a Vaksinerespons for VZV antistoff-titer ved hvert post vaksinasjonstidspunkt (ATP kohort for immunogenisitet)….

Tabell I.3b Vaksinerespons for gE antistoff-titer ved hvert post vaksinasjonstidspunkt (ATP kohort for immunogenisitet)….

Tabell I.3c Vaksinerespons for IFA antistoff-titer ved hvert post vaksinasjonstidspunkt (ATP kohort for immunogenisitet)…… Tabell I.1a Seropositivitets rater og GMT’er for VZV IGG-antistoffer (ATP kohort for immunogenisitet)

gE/Y = gE-AS1/18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1+Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1 Varilrix/50-70 år

GMC = geometrisk gjennomsnittlig antistoffkonsentrasjon beregnet for alle subjekter

N = antall subjekter med tilgjengelige resultater

n/% = antall/prosentandel av subjekter med konsentrasjon innenfor det angitte området

95% Cl = 95% konfidensintervall; LL = Nedre grense, UL = Øvre grense

MIN/MAX = Minimum/Maksimum

PRE = Pre vaksinasjonsdose 1

PI(M1) = Post vaksinasjonsdose 1 (Måned 1)

PI(M2) = Post vaksinasjonsdose 1 (Måned 2)

PII(M3) = Post vaksinasjonsdose 2 (Måned 3)

Tabell I.1b Seropositivitets rater og GMT’er for VZV.GE antistoffer (ATP kohort for immunogenisitet)

gE/Y = gE-AS1/18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1 Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1 /50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1 Varilrix/50-70 år

N = antall subjekter med tilgjengelige resultater

95% Cl = 95% konfidensintervall; LL = Nedre grense, UL = Øvre grense

MIN/MAX = Minimum/Maksimum

PRE = Pre vaksinasjonsdose 1

PI(M1) = Post vaksinasjonsdose 1 (Måned 1)

PI(M2) = Post vaksinasjonsdose 1 (Måned 2)

PII(M3) = Post vaksinasjonsdose 2 (Måned 3)

Tabell I.1c Seropositivitets rater og GMT’er for IFA antistoffer (ATP kohort for immunogenisitet)

gE/Y = gE-AS1 /18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1+Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1 Varilrix/50-70 år

GMT = geometrisk gjennomsnittlig antistofftiter beregnet for alle subjekter

N = antall subjekter med tilgjengelige resultater

n/% = antall/prosentandel av subjekter med titer innenfor det angitte området

95% Cl = 95% konfidensintervall; LL = Nedre grense, UL = Øvre grense

MIN/MAX = Minimum/Maksimum

PRE = Pre vaksinasjonsdose 1

PI(M1) = Post vaksinasjonsdose 1 (Måned 1)

PI(M2) = Post vaksinasjonsdose 1 (Måned 2)

PII(M3) = Post vaksinasjonsdose 2 (Måned 3)

Tabell I.2b Serokonversjons-rater for gE antistoff-titer ved hvert post vaksinasjons tidspunkt (ATP kohort for immunogenisitet)

gE/Y = gE-AS1/18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1+Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1+Varilrix/50-70 år

N = antall av seronegative subjekter ved dag 0

n/% = antall/prosentandel av initielt seronegative subjekter som ble seropositive ved det angitte post vaksinasjonstidspunktet

95% Cl = 95% konfidensintervall; LL = Nedre grense, UL = Øvre grense

Tabell I.3a Vaksinerespons for VZV antistoff-titer ved hvert post vaksinasjonstidspunkt (ATP kohort for immunogenisitet)

gE/Y = gE-AS1/18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1+Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1+Varilrix/50-70 år

N = antall seropositive subjekter ved dag 0

n/% = antall/prosentandel av initielt seropositive subjekter med en fire ganger økning ved det angitte post vaksinasjonstidspunktet

95% Cl = 95% konfidensintervall; LL = Nedre grense, UL = Øvre grense

Tabell I.3b Vaksinerespons for gE antistoff-titer ved hvert post vaksinasjonstidspunkt (ATP kohort for immunogenisitet)

gE/Y = gE-AS1/18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1 Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1 Varilrix/50-70 år

N = antall seropositive subjekter ved dag 0

95% Cl = 95% konfidensintervall; LL = Nedre grense, UL = Øvre grense

Tabell I.3c Vaksinerespons for IFA antistoff-titer ved hvert post vaksinasjonstidspunkt (ATP kohort for immunogenisitet)

gE/Y = gE-AS1/18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1 Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1 Varilrix/50-70 år

N = antall seropositive subjekter ved dag 0

95% Cl = 95% konfidensintervall; LL = Nedre grense, UL = Øvre grense

Analyse av CMI-responser er gitt nedenfor

LISTE OVER TABELLER

Tabell C.1 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Deskriptiv statistikk for CD4 T-celler ved hvert tidspunkt (Total vaksinert Kohort)………………

Supplerende Tabell C.1 Intracellulær Cytokin farging (ICS): Deskriptiv statistikk for CD8 T-celler ved hvert tidspunkt (Total vaksinert Kohort)…….

Tabell C.2 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Hypoteseprøvende: P-verdier fra Kruskal-Wallis Tester for CD4 T-celler ved hvert tidspunkt (Total vaksinert Kohort)………………………………………………………………………….

Supplerende Tabell C.2 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Hypoteseprøvende:

P- verdier fra Kruskal-Wallis Tester for CD8 T-celler ved hvert tidspunkt (Total vaksinert Kohort)……………………………………………………..

Tabell C.3 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Deskriptiv statistikk for CD4 T-celler ved POST-PRE (Total vaksinert Kohort)……………………

Supplerende Tabell C.3 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Deskriptiv statistikk for CD8 T-celler ved POST-PRE (Total vaksinert Kohort)……….

Tabell C.4 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Hypoteseprøvende: P-verdier fra Kruskal-Wallis Tester for CD4 T-celler ved POST-PRE (Total vaksinert Kohort)………………………………………………… Supplerende Tabell C.4 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Hypoteseprøvende:

P- verdier fra Kruskal-Wallis Tester for CD8 T-celler ved POST-PRE (Total vaksinert Kohort)…………………

Tabell C.1 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Deskriptiv statistikk for CD4 T-celler ved hvert tidspunkt (Total vaksinert Kohort)

gE/Y = gE-AS1/18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1+Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1 Varilrix/50-70 år

N = antall subjekter med tilgjengelige resultater N miss.= antall subjekter med manglende resultater SD = Standardavvik

Min, Maks = Minimum, Maksimum

Q1,Q3 = Første, tredje kvadratur Supplerende Tabell C.1 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Deskriptiv statistikk for CD8 T-celler ved hvert tidspunkt (Total vaksinert kohort)

gE/Y = gE-AS1/18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1+Varilrix/18-30 år VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1 Varilrix/50-70 år N = antall subjekter med tilgjengelige resultater N miss.= antall subjekter med manglende resultater SD = Standardavvik

Min, Maks = Minimum, Maksimum

Q1,Q3 = Første, tredje kvadratur

Tabell C.2 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Hypoteseprøvende: P-verdier fra Kruskal-Wallis Tester for CD4 T-celler ved hvert tidspunkt (Total vaksinert kohort)

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1+Varilrix/50-70 år

Supplerende Tabell C.2 Intracellulær Cytokin Farging (ICS):

Hypoteseprøvende: P-verdier fra Kruskal-Wallis Tester for CD8 T-celler ved hvert tidspunkt (Total vaksinert Kohort)

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1 /50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1+Varilrix/50-70 år

Tabell C.3 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Deskriptiv statistikk for CD4T-celler ved POST-PRE (Total vaksinert kohort)

gE/Y = gE-AS1/18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1+Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1 /50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1 /Varilrix/50-70 år

Min, Maks = Minimum, Maksimum

Q1,Q3 = Første, tredje kvadratur Supplerende Tabell C.3 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Deskriptiv statistikk for CD8 T-celler ved POST-PRE (Total vaksinert Kohort)

insufficientOCRQuality for page 56

gE/Y = gE-AS1/18-30 år; gEVAR/Y = gE-AS1+Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år;

gE/E = gE-AS1/50-70 år;

gEVAR/E = gE-AS1 Varilrix/50-70 år

N = antall subjekter med tilgjengelige resultater; N miss.= antall subjekter med manglende resultater

SD = Standardavvik

Min, Maks = Minimum, Maksimum

Q1,Q3 = Første, tredje kvadratur

Tabell C.4 Intracellulær Cytokin Farging (ICS): Hypoteseprøvende: P- verdier fra Kruskal-Wallis Tester for CD4 T-celler ved POST-PRE (Total vaksinert Kohort)

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1+Varilrix/50-70 år

Supplerende Tabell C.4 Intracellulær Cytokin Farging (ICS):

Hypoteseprøvende: P-verdier fra Kruskal-Wallis Tester for CD8 T-celler ved POST-PRE (Total vaksinert Kohort)

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1 /50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1 Varilrix/50-70 år

Lymfoproliferasjon tabeller

LISTE OVER TABELLER SIDE

Tabell L.1 Deskriptiv statistikk for Stimuleringsindeks for lymfoproliferasjon (ATP kohort for immunogenisitet)………………………………….

Tabell L.2 Lymfoproliferasjon: Geometrisk gjennomsnitt (ATP kohort for immunogenisitet)…………………………………………………

Tabell L.3 Lymfoproliferasjon: Hypoteseprøvende for stimuleringsindeks (ATP kohort for immunogenisitet)………………………………….

Tabell L.4 Lymfoproliferasjon: Ganger økning i geometrisk gjennomsnitt (GMR)

(ATP kohort for immunogenisitet)……………………………

Tabell L.1 Deskriptiv statistikk for stimuleringsindeks for lymfoproliferasjon (ATP kohort for immunogenisitet)

gE/Y = gE-AS1/18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1+Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1 Varilrix/50-70 år

Min, Maks = Minimum, Maksimum

Q1,Q3 = Første, tredje kvadratur

Tabell L.2 Lymfoproliferasjon: Geometrisk gjennomsnitt for stimulerin sindeks ATP kohort for mmuno enisitet

gE/Y = gE-AS1 /18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1+Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1+Varilrix/50-70 år

N = antall subjekter med tilgjengelige resultater

N miss.= antall subjekter med manglende resultater GMT= geometrisk gjennomsnittlig titer

LL, UL= Nedre, øvre grense for 95% konfidensintervall Min, Maks = Minimum, Maksimum

Tabell L.3 Lymfoproliferasjon: Hypoteseprøvende for stimuleringsindeks ATP kohort for immuno enisitet

gE/Y = gE-AS1 /18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1 Varilrix/18-30 år VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1 Varilrix/50-70 år Tabell L.4 Lymfoproliferasjon: Ganger økning i geometrisk gjennomsnitt (GMR) (ATP kohort for immunogenisitet)

gE/Y = gE-AS1/18-30 år

gEVAR/Y = gE-AS1 Varilrix/18-30 år

VAR/E = Varilrix/50-70 år

gE/E = gE-AS1/50-70 år

gEVAR/E = gE-AS1+Varilrix/50-70 år

N = antall subjekter med tilgjengelige resultater

N miss.= antall subjekter med manglende resultater

GMR= Geometrisk gjennomsnittlig ratio

LL, UL= Nedre, øvre grense for 95% konfidensintervall for GMR

Min, Maks = Minimum, Maksimum

Konklusjoner

gE AS1-vaksinen og den ledsagende leveringen av gE AS1 med OKA-stammen fremkaller begge en god immunrespons sammenlignet med responsen oppnådd ved OKA-stammen alene.