NO334650B1

NO334650B1 - Preparat for behandling eller profylakse av en patologi relatert til betennelse, neurodegenerasjon, dereguleringer av lipid og/eller glukosemetabolisme, celleproliferasjon og/eller differensiering og/eller hud- eller sentral-nervesystemaldring, omfattende, i en farmasøytisk akseptabel bærer, minst ett substituert 1,3-difenylprop-2-en-1-on-derivat

Info

Publication number: NO334650B1
Application number: NO20045082A
Authority: NO
Inventors: Karine Caumont-Bertrand; Jamila Najib
Original assignee: Genfit
Priority date: 2002-07-08
Filing date: 2004-11-22
Publication date: 2014-05-05
Also published as: NZ538052A; FR2841784A1; WO2004005243A2; BRPI0312399B1; CY1108051T1; US20050171149A1; CN1688532A; DE60314420T2; BRPI0312399B8; PL207707B1; MXPA05000425A; PL373465A1; EP1519908B1; SI1519908T1; BR0312399A; US7632870B2; AU2003264699A1; JP2005532386A; US8461212B2; AU2003264699B2

Abstract

Oppfinnelsen vedrører preparater som inneholder substituerte 1,3-difenylprop-2-en-1-on-derivater for terapeutisk anvendelse. Preparatene ifølge oppfinnelsen er særlig anvendelige til å forebygge eller behandle kardiovaskulære sykdommer, syndrom X, restenose, diabetes, fettsyke, hypertensjon, betennelsessykdommer, kreft eller neoplasma (godartede eller ondartede tumorer), neurodegenerative, dermatologiske sykdommer og forstyrrelser relatert til oksidativt stress og f.eks. hudaldring, særlig på kosmetikkområdet (opptreden av rynker og lignende).

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et preparat for behandling eller profylakse av en patologi relatert til betennelse, neurodegenerasjon, dereguleringer av lipid og/eller glukosemetabolisme, celleproliferasjon og/eller differensiering og/eller hud- eller sentralnervesystemaldring, omfattende, i en farmasøytisk akseptabel bærer, minst ett substituert 1,3-difenylprop-2-en-1-on-derivat.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen har farmakologiske antioksidantegenskaper og PPARct- og PPARy-aktivatoregenskaper som er fordelaktige. Heri beskrives forskjellige anvendelser av disse forbindelser samt farmasøytiske og kosmetiske preparater som inneholder dem. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er anvendelig spesielt for å forebygge eller behandle kardiovaskulære sykdommer, syndrom X, restenose, diabetes, fettsyke, hypertensjon, betennelsessykdommer, kreft eller neoplasma (godartede eller ondartede tumorer), neurodegenerative, dermatologiske sykdommer og forstyrrelser relatert til oksidativt stress, for å forebygge eller behandle virkningene av aldring generelt og f.eks. hudaldring, særlig på det kosmetiske området (utvikling av rynker o.l.).

Derivatene og/eller preparatene ifølge oppfinnelsen kan særlig anvendes til behandling av sykdommer som impliserer vev som uttrykker PPARct og PPARy. Nærmere bestemt gjør de det på fordelaktig måte mulig å behandle inflammatoriske, proliferative, degenerative sykdommer eller patologier som påvirker forskjellige organer og vev, særlig sykdommer som involverer patologisk angio-genese eller neovaskularisering samt enhver patologi eller forstyrrelse (f.eks. relatert til alder) som medfører et oksidativt stress. På en fordelaktig måte kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes i behandlingen av sykdommer eller forstyrrelser som påvirker ved og/eller organer uavhengig av den etiologiske komponent.

PPAR'ene eller «peroksisomproliferatoraktiverte reseptorer» er nukleære reseptorer fra superfamilien av transkripsjonsfaktorer aktivert av følgende ligander: steroider/tyroidhormoner/retinoider. Til dags dato er 3 PPAR-isotyper blitt klonet i mus og mennesker: PPARa, PPARp75 og PPARy. Selv om PPARp78-ekspresjon i mennesker synes å være ubikvitær, oppviser PPARa og y en differensiell vevfordeling (Braissant og Wahli, 1998). PPARa uttrykkes i celler med høy fettsyrekatabolisk aktivitet og i celler med høy peroksisomal aktivitet (hepatocytter, kardiomyocytter, renale proksimale tubuli, tarmslimhinne). PPARp/6 uttrykkes ubikvitært og rikelig i de fleste vev. Hva PPARy angår er den begrenset hovedsakelig til fettvev, visse immunsystemceller og netthinnen og foreligger bare i spormengder i andre organer (Braissant og Wahli, 1998).

PPAR'ene inneholder atskillige domener som har forskjellige egenskaper. Et DNA-bindende domene (DBD) gjenkjenner spesifikke sekvenser, også kalt responselementer, som er lokalisert i reguleringsregioner av deres målgener. Som andre nukleære reseptorer inneholder også PPAR'ene et ligandbindende domene, hvorved aktivering av PPAR'ene med deres ligand modulerer ekspresjonen av gener som inneholder spesifikke PPAR-responselementer (PPRE) i promotorregionen. For å aktivere transkripsjon av deres målgener må de aktiverte PPAR'er heterodimerisere med en annen nukleær reseptor, RXR (reginoid-X-reseptor). Tar man PPARa som eksempel formidles dens virkning av en klasse forbindelser, så som fibratene som har en lipidsenkende effekt. Det er også blitt identifisert naturlige ligander, f. eks. fettsyrer, eikosanoider (leukotrien B4) og 8(S)-hydroksyeikosatetraensyre (Kliewer, Sundseth et al., 1997) .

PPAR'ene er primært blitt knyttet til lipid- og glukosemetabolisme. PPAR-aktivatorer, så som fibrater muliggjør en regulering av plasmakolesterol- og triglyseridkonsentrasjoner via aktivering av PPARa (Hourton, Delerive et al., 2001). Fibratterapi fører til en økning i fettsyreoksidasjon i lever. Fibrater ned-setter også syntesen og ekspresjonen av triglyserider (Staels og Auwerx, 1998) . PPARa-aktivatorer er også i stand til å korrigere hyperglykemi og insulinnivå. Fibrater senker også adiposevevmasse via en mekanisme som er uavhengig av matinntak og leptingenekspresjon. (Guerre-Millo, Gervois et al., 2000).

Den terapeutiske interesse for PPARy-agonister er mye undersøkt i behandlingen av Diabetes Type 2 (Spigelman, 1998). Det er blitt vist at PPARy-agonister gjenoppretter insulinfølsomhet i målvev og senker glukose-lipid- og insulinnivåer både i dyremodeller med Diabetes Type 2 og hos mennesker (V.J. Ram, 2003).

PPAR-aktivering ved hjelp av ligander spiller også en rolle ved regulering av ekspresjonen av gener som deltar i slike prosesser som betennelser, angio-genese, celleproliferasjon og -differensiering, av apoptose og aktivitetene av iNORS, MMPase og TIMP'er. Aktivering av PPARa i keratinocytter resulterer i et opphør av deres proliferasjon og ekspresjon av gener som er involvert i differensiering (Komuves, Hanley et al., 2000). PPAR'ene har antiinflammatoriske egenskaper pga. at de interfererer negative med transkripsjonsmeka-nismene som involverer andre transkripsjonsfaktorer, så som NF-kB, eller transkripsjonene aktivatorer som (STAT) og AP-1 (Desvergne og Wahli, 1999). Disse antiinflammatoriske og antiproliferative egenskaper gjør PPAR'ene (og særlig PPARa) til interessante terapeutiske mål for behandlingen av slike sykdommer som vaskulære okklusive sykdommer (aterosklerose, etc), hypertensjon, sykdommer relatert til neovaskularisering (diabetisk retinopati, etc), inflammatoriske sykdommer (inflammatorisk tarmsykdom, psoriasis, etc.) samt neoplastiske sykdommer (karsinogenese, etc).

Frie radikaler spiller en rolle i en meget lang rekke patologier som inkluderer allergi, tumorinitiering og -fremming, kardiovaskulære sykdommer (aterosklerose, iskemi), genetiske- og metabolske forstyrrelser (diabetes), infektiøse og degenerative sykdommer (Alzheimers Sykdom, Parkinson's Sykdom, Prion, etc.) og oftalmiske forstyrrelser (Mates, Perez-Gomez et al., 1999).

Reaktive oksygenarter (ROS) dannes under normal cellefunksjon. Reaktive oksygenarter inneholder hydroksylradikalene (OH), superoksidanionet (OV), hydrogenpersoksid (H2O2) og nitrogenoksid (NO). Disse arter er meget labile og utgjør som følge av sin høye kjemiske reaktivitet en fare for cellenes biologiske funksjoner. De forårsaker lipidperoksidasjon, oksidasjon av visse enzymer og meget utstrakt oksidasjon av proteiner som fører til dekomponering av disse. Beskyttelse mot lipidperoksidasjon er en essensiell prosess i aerobiske organismer pga. at peroksidasjonsprodukter kan forårsake DNA-skade. En deregulering eller modifisering av likevekten av mellom dannelse, bearbeidelse og eliminering av radikalarter ved hjelp av naturlig antioksidantforsvar fører derfor til opprettelse av prosesser som er skadelige for cellen eller organismen.

ROS bearbeides via et antioksidantsystem som omfatter en enzymatiske komponent og en ikke-enzymatisk komponent. Det enzymatiske system er sammensatt av atskillige enzymer som har følgende karakteristika: Superoksid-dismutase (SOD) ødelegger superoksidradikalet ved å omdanne det til peroksid. Peroksidet påvirkes i sin tur av et annet enzymsystem. Lave nivåer av SOD dannes kontinuerlig ved aerobisk respirasjon. 3 klasser SOD er blitt identifisert i mennesker, som hver inneholder Cu, Zn, Fe, Mn, eller Ni som kofaktor. De 3 humane SOD klassifiseres som følger: en cytosolisk

Cu-Zn SOD, en mitokondrial Mn-SO og en ekstracellulær SOD.

Katalase er meget effektiv ved omdanning av hydrogenperoksid (H2O2) til vann og O2. Hydrogenperoksid kataboliseres enzymatiske i aerobiske organismer. Katalase katalyserer også reduksjonen av forskjellige hydroperoksider (ROOH).

Glutationperoksidase anvender selen som kofaktor og katalyserer reduksjonen av hydropersoksider (ROOH og H2O2) ved å anvende glutation og beskytter derved celler mot oksidativ skade.

Ikke-enzymatiske forsvar omfatter molekyler som dannes eller tilføres i kosten.

Antioksidantmolekyler foreligger i forskjellige cellekammere. F.eks. eliminerer detoksifikasjonsenzymer frie radikaler og er essensielle for celleliv. De 3 viktigste typer antioksidantforbindelser er karotenoidene, vitamin C og vitamin E (Gilgun-Sherki, Melamed et al., 2001).

Det har overraskende vist seg at forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse har PPARa-agonistaktivitet og antioksidantegenskaper. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er derfor i stand til å forstyrre minst 2 signalbaner som aktiveres spesielt ved betennelse, cytokindannelse og dannelse av frie radikaler. Ved å virke synergistisk utgjør forbindelsene ifølge oppfinnelsen et fordelaktig terapeutisk middel for behandling av patologier relatert til inflammasjon (aterosklerose, allergi, astma, eksem, pruritus, etc), neurodegenerering (Alzheimers Sykdom, Parkinson's Sykdom, etc), dereguleringer av lipid- og/eller glukosemetabolisme (diabetes, aterosklerose, fettsyke etc), celleproliferasjon/differensiering (karsinogenese, etc.) og forstyrrelser relatert til aldring (hud eller sentralnervesystem, etc).

Det har vist seg at forbindelsene ifølge oppfinnelsen side om side har PPAR-aktivator-, antioksidant- og antiinflammatoriske egenskaper.

Oppfinnelsen vedrører således farmasøytiske preparater som inneholder minst ett substituert 1,3-difenylprop-2-en-1-on-derivat for behandling av patologier relatert til inflammasjon, neurodegenerering, dereguleringer av lipid- og/eller glukosemetabolisme, celleproliferasjon og/eller -differensiering og/eller hud-eller sentralnervesystemaldring.

Preparatet i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen er således kjennetegnet ved at det inneholder minst ett substituert 1,3-difenylprop-2-en-1-on-derivat med formelen (I) nedenfor:

hvor

Xi er et halogen eller en -R1-gruppe eller en gruppe med formelen -G1-R1, hvor G1 er et oksygen- eller svovelatom, og R1 er et hydrogenatom eller et usubstituert alkylgruppe med 1-7 karbonatomer,

X2er et hydrogenatom eller en hydroksygruppe eller en usubstituert alkyloksygruppe hvor alkylenheten til alkoksygruppen har 1-7 karbonatomer,

X3er en usubstituert alkylgruppe med 1-7 karbonatomer,

X4er en gruppe med formelen: -G4-R4, hvor G4 er et oksygenatom, og R4 er en alkylgruppe med 1-7 karbonatomer, og substituert med en substituent som er del av gruppe (1),

X5er en usubstituert alkylgruppe med 1-7 karbonatomer,

X6er et oksygenatom,

substituentene fra gruppe 1 er valgt blant karboksygrupper med formelen:

-COOR6 og karbamoylgrupper med formelen: -CONR6R7,

hvor R6og R7, som er like eller forskjellige, er et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-7 karbonatomer,

samt de optiske og geometriske isomerene, racematene, tautomerene, saltene, hydratene og blandingene derav.

Preparatet kan spesielt anvendes for behandling eller forebygging av en patologi relatert til inflammasjon, neurodegenerering, dereguleringer av lipid-og/eller glukosemetabolisme, celleproliferasjon og/eller differensiering og/eller hud- eller sentralnervesystemaldring.

Innenfor rammen av oppfinnelsen kan de ovenfor definerte derivater med formelen (I) innta en cis- eller transstruktur. Et preparat ifølge oppfinnelsen kan derved omfatte derivater som har cis- eller transstruktur eller en blanding derav.

Med fordel er X2 et hydrogenatom.

Mer foretrukket vedrører oppfinnelsen derivater med den ovenfor beskrevne formel (XI) hvor X1 er en -G1-R1-gruppe.

Enda mer foretrukket vedrører oppfinnelsen derivater med den ovenfor beskrevne formel (XV) hvor X4 er en -G4-R4-gruppe, G4 er et oksygenatom og X3 eller X5 er hhv. R3 og, hvor R3 eller R5 er en metylgruppe.

Oppfinnelsen vedrører også derivater med formelen (I) hvor, X4 er OC(CH3)2COOR6med R6 er slik som definert ovenfor.

Andre foretrukne utførelser av den foreliggende oppfinnelsen er fremlagt i krav 2-10.

Termen halogen representerer et kloratom eller et bromatom eller et jodatom eller et fluoratom.

Ifølge en særlig utførelsesform av oppfinnelsen er foretrukne forbindelser angitt nedenfor med deres tilhørende formler: 1-[2-hydroksy-4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyl-oksyfenyl]prop-2-en-1-on, og 1-[2-hydroksy-4-klorfenyl-3-3,5-dimetyl-4-/'sopropyloksykarbonyldimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on:

og 1-[2-hydroksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on og 1-[2-hydroksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-/sopropyloksykarbonyldimetylmetyl-oksyfenyl]prop-2-en-1-on:

1-[4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-fertbutyloksykarbonyldimetyl-metyloksyfenyl]prop-2-en-1 -on,

1-[4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-/sopropyloksykarbonyldimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[2-hydroksy-4-bromfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyl-oksyfenyl]prop-2-en-1-on,

1-[4-metyltiofenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyloksykarbonyldimetylmetyl-oksyfenyl]]prop-2-en-1-on,

1-[4-metyltiofeny]l-3-[3,5-dimetyl-4-isopropyloksykarbonyldimetylmetyl-oksyfenyl]prop-2-en-1 -on,

1-[4-metyltiofenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on,

1-[2-metoksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyloksykarbonyldimetyl-metyloksyfenyl]prop2-en-1 -on,

1-[2-metoksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop 1-on,

1-[4-heksyloksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-fetrbutyloksykarbonyldimetyl-metyloksybenzyl]prop-2-en-1 -on,

1-[4-heksyloksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on,

1-[2-metyloksy-4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyloksykarbonyldimetylmetyl-oksyfenyl]prop-2-en-1-on,

1-[2-metyloksy-4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksy-fenyl]prop-2-en-1 -on,

1-[4-heptylfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-fertbutyloksykarbonyldimetylmetyl-oksyfenyl]prop-2-en-1-on,

1-[4-heptylfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on,

1-[4-bromfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyloksykarbonyldimetyl-metyloksyfenyl]prop-2-en-1 -on,

1-[4-bromfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on.

Oppfinnelsen vedrører således anvendelse av minst én forbindelse med den ovenfor definerte formen (I), og spesielt én av de fordelaktige eller foretrukne forbindelser til fremstilling av et farmasøytisk preparat for forebyggende eller fortrinnsvis helbredende behandling av en patologi relatert til dereguleringer av lipid- og/eller glukosemetabolisme, celleproliferasjon og/eller differensiering og/eller hud- eller sentralnervesystemaldring, så som psoriasis, diabetes, aterosklerose, fettsyke, karsinogenese, etc.

Beskrivelsen vedrører også en fremgangsmåte til fremstilling av forbindelser eller derivater med formelen (I).

Fremgangsmåten kjennetegnes ved at minst én forbindelse med formelen (A) i et basisk medium eller i et surt medium bringes i kontakt med minst én forbindelse med formelen (B), hvor formlene (A) og (B) er:

hvor X1, X2, X3, X4 og X5 er slik som definert ovenfor.

Betingelsene for utførelse av denne reaksjon i surt eller basisk medium er innenfor rekkevidde for fagfolk på området og kan variere mye.

De 2 forbindelser bringes med fordel i kontakt med hverandre i støkiometriske forhold. Kontakt utføres fortrinnsvis ved rt (mellom ca. 18°C og 25°C) og ved atmosfærisk trykk.

I basisk medium utføres reaksjonen fortrinnsvis i nærvær av en sterk base, så som et jordalkalimetallhydroksid, så som natriumhydroksid, eller et alkali-metallalkoholat, så som natriumetylat.

I surt medium utføres reaksjonen fortrinnsvis i nærvær av en sterk syre, så som saltsyre.

Reaksjonsskjemaet kan angis som følger:

Fremgangsmåten i basisk medium kan utføres på følgende måte:

1 molarekvivalent keton (forbindelse (A)) og 1 ekvivalent aldehyd (forbindelse

(B)) løses i en vann-alkoholløsning av 20 molar ekvivalenter natriumhydroksid. Blandingen omrøres i ca 18 t ved rt (mellom 18°C og 25°C). Deretter surgjøres

mediet (spesielt til en pH på ca 2), særlig med saltsyre. Det forventede, sub-

stituerte 1,3-difenylprop-2-en-1-on kan oppnås ved utfelling eller fast/væske-ekstraksjon etter avdampning av reaksjonsmediet.

Det kan deretter renses ved silikagelkromatografi eller ved krystallisasjon.

Fremgangsmåten i surt medium kan utføres på følgende måte:

Ett molarekvivalenketon (forbindelse (A)) og én molarekvivalent aldehyd (forbindelse (B)) løses i en etanolløsning mettet med gassformig saltsyre. Blandingen omrøres ved rt i ca. 6 t, løsemidlet fjernes, spesielt ved vakuumfordampning. Det substituerte 1,3-difenyl-2-en-1-on renses, særlig ved kromatografi-på-silikagel.

Oppfinnelsen vedrører således anvendelse av en forbindelse eller et derivat som definert ovenfor til fremstilling av et farmasøytisk preparat for utførelse av en fremgangsmåte til behandling eller profylakse av menneske- eller dyre-kroppen.

De farmasøytiske preparater eller forbindelser med formelen (I) ifølge oppfinnelsen anvendes med fordel til behandling eller profylakse eller patologier relatert til deregulering av lipid- og/eller glukosemetabolisme, celleproliferasjon og/eller differensiering, mer spesielt psoriasis, diabetes, aterosklerose, fettsyke, karsinogenese etc. Faktisk viste det seg overraskende at forbindelser med formelen (I) har fordelaktige farmakologiske egenskaper som antioksidanter og aktivatorer av PPARa og PPARy.

Beskrivelsen omtaler også en fremgangsmåte til behandling av patologiene dereguleringer av lipid- og/eller glukosemetabolisme, celleproliferasjon og/eller -differensiering og mer spesielt psoriasis, diabetes, aterosklerose, fettsyke, karsinogenese, hvorved det til et individ, særlig et menneske, administreres en effektiv dose av en forbindelse med den generelle formel (I) eller av et farmasøytisk preparat slik som beskrevet ovenfor.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen inneholder med fordel én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter eller vehikler. Eksempler omfatter saltløsning, fysiologiske, isotoniske, bufrede løsninger o.l., som er forenlige med farmasøytisk anvendelse og kjente for fagfolk på området. Preparatene kan inneholde ett eller flere midler eller vehikler valgt blant dispergeringsmidler, løselighetsgjørere, stabilisatorer, konserveringsmidler o.l. Midler eller vehikler som kan anvendes i formuleringene (væskeformede og/eller -injiserbare og/eller faste) er spesielt metylcellulose, hydroksymetylcellulose, karboksymetylcellulose, polysorbat 80, mannitol, gelatin, laktose, planteoljer akasie o.l. Preparatene kan formuleres som suspensjoner for injeksjon, geler, oljer, tabletter, stikkpiller, pulvere, kapsler, geler o.l, evn. ved hjelp av farmasøytiske former eller anordninger som sikrer forlenget og/eller forsinket frigjøring. Til denne type formulering anvendes det med fordel et slikt middel som cellulose, karbonater eller stivelse.

Forbindelsene eller preparatene ifølge oppfinnelsen kan administreres på forskjellige måter og i forskjellige former. F.eks. kan de administreres ved den orale eller systemiske rute, så som f.eks. ved den intravenøse, intramuskulære, Subkutane, transdermale, intraarterielle rute, etc. For injeksjoner formuleres forbindelsene generelt som flytende suspensjoner som kan injiseres f.eks. gjennom sprøyter eller ved infusjon. Det forstås at injeksjonshastigheten og/eller den injiserte dose kan tilpasses av fagfolk på området eller pasienten, patologien, administreringsmåten etc. Typisk administreres forbindelsene i doser på fra 1 u.g-2 g pr. administrering, fortrinnsvis fra 0,1 mg til 1 g pr. administrering. Administreringen kan gis daglig eller gjentatt atskillige ganger pr. dag, alt etter omstendighetene. Videre kan preparatene ifølge oppfinnelsen i tillegg inneholde andre aktive ingredienser eller midler.

Andre aspekter og fordeler med oppfinnelsen vil fremgå av de etterfølgende eksempler som er gitt av belysningsformål og ikke som begrensning.

Forklaringer av figurer

Fig. 1- 1, 1- 2, 1- 3: Evaluering av antioksidantegenskapene til forbindelse 2, forbindelse 3, forbindelse 12, forbindelse 14 og forbindelse 17 på LDL-oksidasjon med kobber (Cu). Fig. 1-1 viser resultatene av et forsøk med måling av dannelse av konjugerte

diener over tid. Det kan ses at inkubasjon av LDL med prøveforbindelsene i en konsentrasjon på 10"\l forsinket dannelse av konjugerte diener. Forsinkelsesfasen var 111 min. for kobber alene sammenlignet med en forsinkelsesfase på hhv. 132, 145, 134 og 203 min., når LDL ble inkubert med forbindelse 3, forbindelse 12, forbindelse 14 og forbindelse 17. Forsinkelsesfasen var mer enn

480 min. når LDL ble inkubert med forbindelse 2. Denne forsinkelse i dannelsen av konjugerte diener er karakteristisk for antioksidanter. Fig. 1-2 viser hastigheten ved diendannelse etter forskjellige behandlinger. Inkubasjon av forbindelsene med LDL i nærværet av kobber senket hastigheten ved dannelse av konjugerte diener. Denne hastigheten var 2nmol/min./mg LDL med kobber alene, 1,7 nmol/min./mg LDL når LDL ble inkubert i nærvær av lO^M forbindelse 17 og ikke bestemt for forbindelse 2 ved lO^M (ikke målbart pga. for lav). Fig. 1-3 representerer den største mengde konjugerte diener som ble dannet over tid. Inkubasjon av LDL med kobber førte til dannelse av 348 nmol konjugerte diener pr. mg LDL; inkubasjon med forbindelse 2 i lO^M førte til en 84% senkning i dannelse av konjugerte diener (54,4 nmol pr. mg LDL). I nærværet av forbindelsene 3 og 17 var dannelse av konjugerte diener hhv. 303 og 327 nmol pr. mg LDL. Fig. 1- 4, 1- 5, 1- 6: Evaluering av antioksidantegenskaper av forbindelse 18, forbindelse 19, forbindelse 21 og forbindelse 22 på LDL-oksidasjon med kobber (Cu). Fig. 1-4 viser at inkubasjon av LDL med prøveforbindelsene i en konsentrasjon på 10^M forsinket dannelse av konjugerte diener. Forsinkelsesfasen var 178 min. for kobber alene sammenlignet med en forsinkelsesfase på hhv. 240, 182 og 241 min. (fra forsøksbestemmelsen) når LDL ble inkubert med forbindelse 18, forbindelse 19 eller forbindelse 22. Forsinkelsesfasen var mer enn 480 min. når LDL ble inkubert med forbindelse 21. Denne forsinkelse i dannelsen av konjugerte diener er karakteristisk for antioksidanter. Fig. 1-5 viser hastigheten ved diendannelse eller forskjellige behandlinger. Hastigheten ved dannelsen av konjugerte diener var 1,6 mol/min./mg LDL med kobber alene, 1,4 nmol/min./mg LDL når LDL ble inkubert i nærvær av forbindelse 18 i lO^M, 1,3 nmol/min./mg LDL når LDL ble inkubert i nærværet av forbindelse 22 og ikke bestemt for forbindelse 21 i lO^M (ikke målbar pga. for lav). Fig. 1-6 representerer den største mengden konjugerte diener som ble dannet over tid. Inkubasjon av LDL med kobber førte til dannelse av 353 nmol konju gerte diener pr. mg LDL. Inkubasjon med forbindelse 21 i lO^M inhiberte dannelse av konjugerte diener. Dannelse av konjugerte diener var hhv. 305, 345 og 345 nmol pr. mg LDL i nærværet av forbindelsene 18,19 og 22. Fig. 1- 7, 1- 8: Evaluering av antioksidantegenskaper av forbindelse 25 og forbindelse 28 på LDL-oksidasjon med kobber (Cu). Fig. 1-7 viser resultatene av forsøket med måling av dannelse av konjugerte diener over tid. Det kan ses at inkubasjon av LDL med prøveforbindelsene i en konsentrasjon på lO^M forsinket dannelse av konjugerte diener. Forsinkelsesfasen var 82 min. for kobber alene sammenlignet med en forsinkelsesfase på hhv. 120 og 135 min. (fra forsøksbestemmelsen) når LDL ble inkubert med forbindelse 25 og forbindelse 29. Fig. 1-8 representerer den største mengde konjugerte diener som ble dannet over tid. Inkubasjon av LDL med kobber førte til dannelse av 393 nmol konjugerte diener pr. mg LDL. I nærværet av forbindelse 25 var denne verdi 378 nmol pr. mg LDL. Fig. 1- 9, 1- 10, 1- 11: Evaluering av antioksidantegenskapene til forbindelse 31, forbindelse 33 og forbindelse 35 på LDL-oksidasjon med kobber (Cu). Fig. 1-9 viser resultatene av forsøket som målte dannelse av konjugerte diener over tid. Det kan ses at inkubasjon av LDL med prøveforbindelsene ved en konsentrasjon på lO^M forsinket dannelse av konjugerte diener. Forsinkelsesfasen var 80 min. for kobber alene sammenlignet med en forsinkelsesfase på hhv. 139, 247 og 149 min. (fra forsøksbestemmelsen) når LDL ble inkubert med forbindelse 31, forbindelse 33 og forbindelse 35. Denne forsinkelse i dannelse av konjugerte diener er karakteristisk for antioksidanter.

Flg. 1-10 viser hastigheten ved diendannelse etter forskjellige behandlinger. Inkubasjon av forbindelsene med LDL i nærværet av kobber senket hastigheten ved dannelsen av konjugerte diener. Denne hastighet var 1,9 nmol/min./mg LDL med kobber alene, 1,6 nmol/min./5 g LDL når LDL ble inkubert i nærværet av forbindelse 31 i lO^M, 0,8 nmol/min./mg LDL når LDL ble inkubert i nærværet av forbindelse 33 og 1,5 nmol/min./mg LDL, når LDL ble inkubert i nærværet av forbindelse 35.

Fig. 1-11 representerer den største mengde konjugerte diener som ble dannet over tid. Inkubasjon av LDL med kobber førte til dannelse av 298 nmol konjugerte diener pr. mg LDL sammenlignet med 257 nmol pr. mg LDL i nærværet av forbindelse 33. Fig. 1-12, 1-13, 1-14: Evaluering av antioksidantegenskaper av forbindelse 37, forbindelse 38 og forbindelse 41 på LDL-oksidasjon med kobber (Cu). Fig. 1-12 viser resultatene av forsøket som målte dannelse av konjugerte diener over tid. Det kan ses at inkubasjon av LDL med prøveforbindelser i en konsentrasjon på lO^M forsinket dannelse av konjugerte diener. Forsinkelsesfasen var 120 min. for kobber alene sammenlignet med en forsinkelsesfase på hhv. 196, 284 og 411 min. (fra forsøksbestemmelsen) når LDL ble inkubert med forbindelse 37, forbindelse 38 og forbindelse 41. Fig. 1-13 viser hastigheten ved diendannelse etter forskjellige behandlinger. Inkubasjon av forbindelsene med LDL i nærværet av kobber senket hastigheten ved dannelsen av konjugerte diener. Denne hastighet var 1,8 nmol/min./mg LDL med kobber alene, 1,49 nmol/min./mg LDL når LDL ble inkubert i nærværet av forbindelse 37 i lO^M, 0,71 nmol/min./mg LDL når LDL ble inkubert i nærværet av forbindelse 38 og 0,54 nmol/min./mg LDL når LDL ble inkubert i nærværet av forbindelse 41. Fig. 1-14 representerte den største mengde diener som ble dannet over tid. Inkubasjon av LDL med kobber førte til dannelse av 372 nmol konjugerte diener pr. mg LDL sammenlignet med 338 nmol pr. mg LDL, 244 nmol pr. mg LDL, og 71 nmol pr. mg LDL i nærværet av hhv. forbindelse 37, 38 og 41.

Forsinkelsesfasen ved dannelsen av konjugerte diener, senkningen av hastigheten av diendannelse og minskningen av den totale mengde diener som ble dannet er karakteristiske for antioksidanter.

Fig. 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6: Evaluering av PPARct-agonistegenskaper av forbindelsene i PPARa/Ga14-transaktiveringssystemet.

RK13-celler ble inkubert med forskjellige forbindelser i konsentrasjoner på 10, 30 og 100 u.M eller 1, 10 og 100 u.M i 24 t. Resultatene uttrykkes som induksjonsfaktor (luminiscenssignal i forhold til ubehandlede celler) etter de for skjellige behandlinger. Jo høyere induksjonsfaktor, desto sterkere PPARct-agonistaktivitet.

Fig. 2-1:

Resultatene viser induksjonsfaktorene for forbindelse 3, forbindelse 4, forbindelse 7, forbindelse 8 og forbindelse 9. Verdiene av disse induksjonsfaktorer er angitt i Tabell 2-1.

Resultatene viste at forbindelse 3 frembrakte en største 27-foldig induksjon i en konsentrasjon på 30 u.M, forbindelse 4 hadde en høyeste induksjonsfaktor på 60 i 100 uM, 22 i 30 uM og 4 i 10 uM. Forbindelse 7 hadde en høyeste induksjonsfaktor på 50 i 100 u.M. Forbindelse 8 aktiverte systemet med en høyeste induksjonsfaktor på 10 i 100 u.M. Forbindelse 9 hadde en induksjonsfaktor på 28 i 100 u.M, den høyeste konsentrasjon.

Fig. 2-2:

Resultatene viser induksjonsfaktorer for forbindelse 11, forbindelse 12, forbindelse 13, forbindelse 14 og forbindelse 17. Verdiene av disse induksjonsfaktorer er angitt i Tabell 2-2.

Resultatene viser at forbindelse 11 frembrakte en største 10-foldig induksjon i en konsentrasjon på 100 u.M, forbindelse 12 hadde en høyeste induksjonsfaktor på 22 i 100 uM, 8 i 30 uM, og 1 i 10 uM. Forbindelser 13 og 14 hadde induksjonsfaktorer på mellom 1,1 og 1,5 i de forskjellige konsentrasjoner som ble testet. Forbindelse 17 aktiverte systemet med en høyeste induksjonsfaktor på 85 i 10 uM og en laveste induksjonsfaktor på 13,8 i 100 uM-konsentrasjonen.

Fig. 2-3:

Resultatene viser induksjonsfaktorene for forbindelse 19, forbindelse 20, forbindelse 21 og forbindelse 22. Verdiene av disse induksjonsfaktorer er angitt i Tabell 2-3.

Resultatene viser at forbindelse 19 frembrakte en største 15,6-foldig induksjon i 10 u.M, forbindelse 20 hadde en høyeste induksjonsfaktor på 53 i 10 u.M. Forbindelse 21 hadde induksjonsfaktorer på mellom 0,8 og 22 i de forskjellige konsentrasjoner som ble testet. Forbindelse 22 aktiverte systemet med en høyeste induksjonsfaktor på 50 i 10 uM-konsentrasjonen.

Fig. 2-4:

Resultatene viser induksjonsfaktorene for forbindelser 23, 24, 25, 26 og 29. Verdiene av disse induksjonsfaktorer er angitt i Tabell 2-4.

Forbindelse 23 hadde en høyeste induksjonsfaktor på 3,6 i 10 u.M, forbindelse 24 hadde en høyeste induksjonsfaktor på 11 i 10 100 jaM. Forbindelse 25 aktiverte systemet med induksjonsfaktorer på mellom 7 og 21 ifølge konsentrasjonene som ble testet. Forbindelse 26 hadde en høyeste induksjonsfaktor på 7,8 i 10 uM-konsentrasjonen, og forbindelse 29 hadde induksjonsfaktorer på 28 og 25 i konsentrasjoner på hhv. 1 og 10 u.M.

Fig. 2-5:

Resultatene viser induksjonsfaktorene for forbindelse 31 og forbindelse 33. Verdiene av disse induksjonsfaktorer er angitt i Tabell 2-5.

Forbindelse 31 aktiverte systemet med en induksjonsfaktor på 15,5 i konsentrasjonen 10 u.M. Induksjonsfaktorene for forbindelse 33 var 22, 44 og 77 for hhv. konsentrasjonene 1, 10 og 100 u.M.

Fig. 2-6:

Resultatene viser induksjonsfaktorene for forbindelser 37, 38 og 41. Verdiene av disse induksjonsfaktorer er angitt i Tabell 2-6.

De høyeste induksjonsfaktorer for forbindelser 37, 38, 41 var hhv. 27, 22 og 31

i konsentrasjonen 10 u.M.

Disse resultater viser at de forbindelser ifølge oppfinnelsen som ble testet oppviste PPARa-ligandaktivitet og muliggjør derved transkripsjonen aktivering derav.

Fig. 2-7: Evaluering av PPARy-agonistegenskaper for forbindelsene ifølge oppfinnelsen i PPARy/Ga14-transaktiveringssystemet.

RK13-celler ble inkubert med de forskjellige forbindelser i konsentrasjoner på 1, 10 og 100 u.M i 241. Resultatene er uttrykt som induksjonsfaktoren (luminiscenssignal i forhold til ubehandlede celler) etter de forskjellige behandlinger. Jo høyere induksjonsfaktor, desto sterkere PPARy-agonistaktivitet. Resultatene i figuren viser induksjonsfaktorene for forbindelse 17, forbindelse 33 og forbindelse 29. Verdiene av disse induksjonsfaktorer er angitt i Tabell 2-7.

Resultatene viser at forbindelse 17 hadde en høyeste induksjonsfaktor på 25 i 10 u.M. Forbindelse 33 hadde en høyeste induksjonsfaktor på 45,6 i 100 u.M og forbindelse 29 på 33,9 i 10 uM.

Disse resultater viser at de forbindelser ifølge oppfinnelsen som ble testet oppviser PPARy-ligandaktivitet, og derved muliggjør transkripsjonen aktivering derav. Fig. 3- 1, 3- 2, 3- 3, 3- 4: Evaluering av virkninger av forbindelse 7 og forbindelse 17 på metabolisme av triglyserider og kolesterol. Fig. 3-1, 3-2, 3-3 og 3-4 viser virkningen av behandling med forbindelser 7 og 17 på triglyserid- og kolesterolmetabolisme i Apo E2/E2-transgene mus. Dyr ble behandlet ved gavage med hver forbindelse i en dose på 200 mg/kg i 7 dager. Fig. 3-1 og 3-2 viser minskningen i plasmakonsentrasjoner av triglyserider og kolesterol forårsaket av forbindelser 7 og 17. Fig. 3-3 og 3-4 viser triglyserid- og kolesterolfordeling i lipopartikler evaluert ved eksklusjonskromatografi. En typisk fordeling av triglyserider og kolesterol iakttas hovedsakelig i lipopartikler av stor størrelse. Det kan også ses at behandling med forbindelser 7 og 17 minsket triglyseridene og kolesterol i denne lipopartikkelsubfraksjon. Fig. 3- 5, 3- 6, 3- 7, 3- 8: Fig. 3-5, 3-6, 3-7 og 3-8 viser virkningene av behandling med forbindelse 29 ifølge oppfinnelsen på triglyserid- og kolesterolmetabolisme i Apo E2/E2-trans-gene mus. Dyr ble behandlet med forbindelse 29 i følgende doser: 200, 50, 12,5 og 3,15 mg/kg/dag i 8 dager. Fig. 3-5 og 3-6 viser den doseavhengige minskning i plasmatriglyserid- og kolesterolnivåer med en større minskning med økende doser av forbindelse 29. Fig. 3-7 og 3-8 viser triglyserid- og kolesterolfordeling i lipopartikler evaluert ved eksklusjonskromatografi. En typisk fordeling av triglyserider og kolesterol iakttas hovedsakelig i lipopartikler med stor størrelse. En minskning i triglyserid og kolesterol i denne lipopartikkelsubfraksjon kan også ses. Fig. 3- 9. 3- 10, 3- 11, 3- 12: Fig. 3-9 og 3-10 viser virkningen av forbindelser 31 og 41 ifølge oppfinnelsen på triglyserid- og kolesterolmetabolisme i Apo E2/E2-transgene mus. Dyrene ble behandlet med de forskjellige forbindelser i en dose på 50 mg/kg/dag i 8 dager. Fig. 5-1 og 5-2 viser minskningen i plasmatriglyserider og kolesterol forårsaket av forbindelser 33 og 41. Fig. 3-11 og 3-12 viser triglyserid- og kolesterolfordeling i lipopartikler evaluert ved eksklusjonskromatografi. En typisk fordeling av triglyserider og kolesterol iakttas hovedsakelig i lipopartikler av stor størrelse og en minskning i triglyserider og kolesterol i denne lipopartikkelsubfraksjon under virkningen av forbindelser 33 og 41.

Andre aspekter og fordeler med oppfinnelsen vil bli åpenbare i de etterfølgende eksempler som er gitt for belysningsformål og ikke som begrensning.

EKSEMPLER

Forbindelsene ble fremstilt ifølge de generelle fremgangsmåter som er angitt nedenfor.

Beskrivelse av generelle fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen:

Fremstilling av 1, 3- difenvlprop- 2- en- 1- oner:

X1=PH, Cl, Br-SCH3, -OC6Hi3, -C7Hi5, OC(CH3)2COOR6,

SC(CH3)2COOR6,

X2=H, 0(2-fenyl-4-H-1-benzypyran-4-on), =CH3, OH

X4=OH, Cl, Br, -SCH3, OC(CH3)2COOR6, SC(CH3)2COOR6

X3 og X5= CH3, C(CH3)3, OCH3,

OH, OC(CH3)2COOR6

R6=CH2CH3, H

Generell fremgangsmåte 1:

Fremstilling av 1,3-difenylprop-2-en-1-oner i surt medium:

1 ekvivalent av ketonet og 1 ekvivalent av aldehydet ble løst i etanolløsning mettet med gassformig saltsyre. Reaksjonen ble omrørt ved rt i 6 t, og løsemidlet ble deretter fjernet ved vakuumfordampning. 1,3-difenylprop-2-en-1-on ble renset ved kromatografi-på-silikagel.

Generell fremgangsmåte 2:

Fremstilling av 1,3-difenylprop-2-en-1-oner i basisk medium:

1 ekvivalent av ketonet og 1 ekvivalent av aldehydet ble løst i 20 ekvivalenter av en vann/alkoholløsning av natriumhydroksid. Blandingen ble omrørt ved rt i

18 t. Mediet ble surgjort til pH=2 med saltsyre.

1,3-difenylprop-2-en-1-on ble oppnådd ved utfelling eller fast/væskeekstraksjon etter fordampning av reaksjonsmediet. Det ble renset ved silikagelkromatografi eller ved rekrystallisering.

Generell fremgangsmåte 3:

Fremstilling av substituerte 1,3-difenylprop-2-en-1-oner i nærværet av natriumetylat: 1 ekvivalent natrium ble løst i absolutt etanol. 1 ekvivalent av ketonet av 1 ekvivalent av aldehydet ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved rt i 121, og 5 ekvivalenter 2 N natriumhydroksid ble deretter tilsatt. Blandingen ble holdt ved 100°C i 12 t. Reaksjonsmediet ble surgjort ved tilsetning av 6 N vandig salt-syreløsning. Løsemidlet ble fjernet ved vakuumfordampning. Resten ble renset ved kromatografi-på-silikagel eller ved rekrystallisering.

O-alkylering og S-alkylering av tiofenoler

Generell fremgangsmåte 4:

X1=CI, Br-SCH3, -OC6Hi3, -C7H15

X2=H, 0(2-fenyl-4-H-1-benzopyran-4-on), OCH3

X3 og X5=CH3

R6=CH2CH3, H

1 ekvivalent av fenolen ble løst i acetonitril. 1-10 ekvivalenter av det halo-generte derivat og 5 ekvivalenter kaliumkarbonat ble deretter tilsatt. Reaksjonsmediet ble omrørt kraftig under tilbakeløp i ca. 10 t. Saltene ble fjernet ved filtrering, løsemidlet og overskytende reaktant ble fjernet ved vakuumfordampning, og det forventede produkt ble renset ved silikagelkromatografi.

Syrehvdrolvse av tert- butylestere:

Generell fremgangsmåte 5:

X3 og X5=CH3

X2=H, 0(2-fenyl-4-H-benzopyran-4-on), OCH3

X1=CI, Br, -SCH3, OC6Hi3, -C7H15

1 ekvivalent av tert-butylesteren ble løst i diklormetan, 10 ekvivalenter trifluor-eddiksyre ble tilsatt, og blandingen ble omrørt ved rt i 12 t. Det resulterende produkt ble renset ved kromatografi-på-silikagel eller ved rekrystallisering.

Fremstilling av utgangsmaterialer anvendt ved fremstilling av forbindelsene ifølge oppfinnelsene: Utgangsmateriale 1: 2'- hvdroksv- 4'-( etoksvkarbonvldimetylmetoksv) acetofenon:

Forbindelsen ble fremstilt fra 2', 4'-dihydroksyacetofenon og etylbromisobutyrat (1 ekvivalent) ifølge den generelle fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor. Den ble renset ved kromatografi-på-silikagel (eluering: cykloheksan/etylacetat 9:1).

<1>H NMR CDCI35ppm: 1,25 (T, J=7,17Hz, 3H), 1,67 (s, 6H), 2,56 (s, 3H), 4,24 (q, J=7,17 Hz, 2H9, 6,27 (d, J=2,55 Hz, 1H), 6,37 (dd, J=2,55 Hz, J=8,72 Hz, 1H), 7,62 (d, J=8,72 Hz, 1H), 12,6 (signal, 1H).

Referanse: US-Patent Nr 3.629.290 (1970) Fisons Pharmaceutical

Utgangsmateriale 2:

3- klorfenvlacetat

3-klorfenol ble løst i diklormetan. 1 ekvivalent trietylamin og 2 ekvivalenter eddiksyreanhydrid ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved rt i 5 t. Løsemiddel ble fjernet ved vakuumfordampning. Fordampningsresten ble opptatt i diklormetan, tørket på magnesiumsulfa, og løsemidlet ble fjernet ved vakuumfordampning.

Rensing ble utført ved kromatografi-på-silikagel (eluering: cykloheksan/etylacetat=95:5).

<1>H NMR CDCbppm: 2,29 (s, 3H), 6,99-7,33 (m, 4H).

Utgangsmateriale 3:

4'- klor- 2-' hvdroksyacetofenon

3-klorfenylacetat (utgangsmateriale 2) ble blandet med 3 ekvivalenter aluminiumklorid. Blandingen ble oppvarmet ved 200°C i 1 t. Reaksjonsmediet ble avkjølt til rt og deretter helt på is. Den vandige fase ble ekstrahert med metylenklorid, som ble tørket på magnesiumsulfat og deretter vakuum-fordampet. Rensning var ved silikagelkromatografi (eluering: cykloheksan/etylacetat=95:5).

<1>H NMR CDCI36ppm: 3,41 (s, 3H), 6,81 (dd, J=8,82 Hz, J=1,47 Hz, 1H), 6,91 (d, J=1,47 Hz, 1H), 7,60 (d, 8,82 Hz, 1H), 12,33 (s, 1H).

Referanse: Chen et al., J. Chem. Soc, 1958, p 146-148.

Utgangsmateriale 4:

4- etvloksvkarbonvldimetvlmetvloksvbenzaldehvd

Denne forbindelse ble fremstilt fra 4-hydroksybenzaldehyd og etylbromisobutyrat ifølge den generelle fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning ble utført ved silikagelkromatografi (eluering: cykloheksan/etylacetat= 9:1).

<1>NMR CDCI36ppm: 1,20 (t, J=6,96 Hz, 3H9, 1,67 (s, 6H), 4,21 (q, J=6,96 Hz, 2H), 6,89 (d, J=8,91 Hz, 2H), 7,79 (d, J=8,94 Hz, 2H), 9,87 (S, 1H).

Utgangsmateriale 5:

3, 5- dimetvloksv- 4- etvloksvkarbonvldimetvlmetyloksvbenzaldehvd

Denne forbindelse ble fremstilt fra 3,5-dimetyloksy-4-hydroksybenzaldehyd og etylbromisobutyrat ifølge den generelle fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved silikagelkromatografi (eluering:cykloheksan/etylacetat=8:2).

<1>H NMR CDCI35 ppm: 1,33 (t, J=7,29 Hz, 3H), 1,50 (s, 6H), 3,84 (s, 6H), 4,27 (q, J=7,29Hz, 2H), 7,08 (s, 2H), 9,86 (s, 1H).

Utgangsmateriale 6:

3, 5- dimetvl- 4- etvoksvkarbonvldimetvlmetyloksvbenzaldehvd

Denne forbindelse ble fremstilt fra 3,5-dimetyl-4-hydroksybenzaldehyd og etylbromisobutyrat ifølge den generelle fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved silikagelkromatografi (eluering:cykloheksan/etylacetat=95:5).

<1>H NMR CDCI36 ppm: 1,37 (t, J=7,14Hz, 3H), 1,50 (s, 6H), 2,29 (s, 6H), 4,30 (q, J=7,14 Hz, 2H), 7,54 (s, 2H), 9,88 (s, 1H).

Utgangsmateriale 7:

3- etyloksvkarbonvldimetvlmetyloksvbenzaldehvd

Denne forbindelse ble fremstilt fra 3-hydroksybenzaldehyd og etylbromisobutyrat ifølge den generelle fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved silikagelkromatografi (eluering:cykloheksan/etylacetat=9:1).

<1>H NMR CDCI35 ppm: 1,24 (t, J=7,27 Hz, 3H), 1,62 (s, 6H), 4,25 (q, J=7,27 Hz, 2H), 7,11 (m, 1H), 7,31 (m, 1H), 7,40 (t, J=8,19 Hz, 1H), 7,49 (m, 1H), 9,93 (s, 1H).

Utgangsmateriale 8:

4- etvloksvkarbonvldimetvlmetyltiobenzaldehvd

1 ekvivalent 4-metyltiobenzaldehyd ble løst i metylenklorid og løsningen avkjølt til 0°C. 1,5 ekvivalenter metaklorperbenzosyre ble tilsatt i små fraksjoner. Reaksjonen ble fulgt av tynnsjiktskromatografi. Ytterligere metaklorbenzasyre ble evnt. tilsatt for å oppnå total forsvinning av utgangsproduktet. Bunnfallet ble fjernet ved filtrering. 1,5 ekvivalenter kalsiumhydroksid ble tilsatt, og blanding ble omrørt i 15 min. til. Faststoffet ble fjernet ved filtrering, filtratet tørket på magnesiumsulfat, og metylenkloridet ble deretter fjernet ved vakuumfordampning.

Fordampningsresten ble opptatt i eddiksyreanhydrid og deretter oppvarmet under tilbakeløp i 30 min. og inndampet til tørr tilstand. Resten ble opptatt i metanol/trietylaminløsning, omrørt ved rt i 15 min. hvoretter løsemidlene ble fjernet ved vakuumfordampning. Den oljeaktige rest ble opptatt i en mettet, vandig ammoniumkloridløsning og deretter ekstrahert med metylenklorid. Den organiske fase ble tørket på magnesiumsulfat og vakuuminndampet.

Det resulterende 4-merkaptobenzaldehydmellomprodukt ble anvendt uten ytterligere rensning. Det ble alkylert ifølge generell fremgangsmåte 4, hvorved det ble oppnådd 4-etyloksykarbonyldimetylmetyltiobenzaldehyd.

Rensning var ved silikagelkromatografi (eluering:cykloheksan/etylacetat=9:1).

<1>H NMR CDCI35 ppm: 1,22 (t, J=7,46Hz, 3H), 2,60 (s, 6H), 4,15 (q, J=7,46 Hz, 2H), 7,53 (D, J=8,38 Hz, 2H), 7,88 (d, J=8,39 Hz, 2H), 9,99 (s, 1H).

Referanse: N.R. Young, J.Y. Gauthier, W. Coombs (1984). Tetrahedron Letters, Vol 25(17), p 1753-1756.

Utgangsmateriale 9:

4'- etvloksykarbonvldimetvlmetyloksyacetofenon:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 4'-hydroksyacetofenon og etylbromisobutyrat ifølge generell fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved silikagelkromatografi (eluering:cykloheksan/etylacetat=9:1).

1H NMRCDCI36ppm: 1,17 (t, J=5,64Hz, 3H), 1,61 (s, 6H), 2,50 (s, 3H), 4,18 (q, J=5,64 Hz, 2H), 6,78 (d, J=8,82 Hz, 2H), 7,83 (d, J=8,81 Hz, 2H).

Utgangsmateriale 10:

3- bromfenvlacetat

3-bromfenol ble løst i diklormetan. 1 ekvivalent trietylamin og 2 ekvivalenter eddiksyreanhydrid ble tilsatt, og blandingen ble omrørt ved rt i 51. Løsemidlet ble fjernet ved vakuumfordampning. Fordampningsresten ble opptatt i diklormetan og deretter tørket på magnesiumsulfat. Løsemidlet ble fjernet ved vakuumfordampning.

Rensning var ved silikagelkromatografi (eluering:cykloheksan/etylacetat=95:5).

<1>H NMR CDCI36 ppm: 2,30 (s, 3H), 7,0-7,4 (m, 4H).

Utgangsmateriale 11:

2'- hvdroksy- 4'- bromacetofenon

3-bromfenylacetat (utgangsmateriale 10) ble blandet med 3 ekvivalenter aluminiumklorid, og blandingen ble oppvarmet ved 200°C i 1 t. Reaksjonsmediet ble avkjølt til rt og deretter helt i is. Den vandige fase ble ekstrahert med metylenklorid, som ble tørket på magnesiumsulfat.

Rensning var ved silikagelkromatografi (eluering:cykloheksan/etylacetat=95:5).

<1>H NMR CDCI36 ppm: 2,59 (s, 3H), 7,01 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,13 (s, 1H), 7,55 (d, J=8,5 Hz, 1H), 12,33 (s, 1H).

Utgangsmateriale 12:

4'- etvloksykarbonvldimetvlmetvltiacetofenon

4-metyltioacetofenon ble løst i metylenklorid og løsningen avkjølt til 0°C. 1,5 ekvivalenter metaklorperbenzosyre ble tilsatt i små fraksjoner. Reaksjonen ble fulgt ved tynnsjiktskromatografi. Ytterligere metaklorperbenzosyre ble evnt. tilsatt for å oppnå total fjerning av utgangsproduktet. Bunnfallet ble fjernet ved filtrering. 1,5 ekvivalenter kalsiumhydroksid ble tilsatt, og blandingen ble omrørt i 15 min. til. Faststoffet ble fjernet ved filtrering, filtratet tørket på magnesiumsulfat, hvoretter metylenkloridet ble fjernet ved vakuumfordampning. Fordampningsresten ble opptatt i eddiksyreanhydrid og deretter oppvarmet under ti I— bakeløp i 30 min. og inndampet til tørr tilstand. Resten ble opptatt i metanol/ trietylaminløsning, omrørt ved rt i 15 min., hvoretter løsemidlene ble fjernet ved vakuumfordampning. Den oljeaktige rest ble opptatt i en mettet, vandig ammoniumkloridløsning og deretter ekstrahert med metylenklorid. Den organiske fase ble tørket på magnesiumsulfat og deretter vakuuminndampet.

Det resulterende 4-merkaptoacetofenonmellomprodukt ble anvendt uten ytterligere rensning. Det ble alkylert ved generell fremgangsmåte 4, hvorved det ble oppnådd 4-etyloksykarbonyldimetylmetyltioacetofenon.

Rensning var ved silikagelkromatografi (eluering:cykloheksan/etylacetat=9:1).

Referanse: N.R. Young, J.Y. Gauthier, W. Coombs (1984). Tetrahedrom Letters, Vol 25(17): p 1753-1756.

<1>H NMR CDCI36 ppm: 1,21 (t, J=7,32 Hz, 3H), 1,51 (s, 6H), 2,59 (s, 3H), 4,12 (q, J=7,32 Hz, 2H), 7,51 (d, J=8,40 Hz, 2H), 7,79 (d, J=8,40 Hz, 2H).

Fremstilling av mellomforbindelser anvendt til fremstilling av forbindelsen ifølge oppfinnelsen: Mellomforbindelse 1:

1-[ 4- klorfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- hvdroksvfenyllprop- 2- en- 1- on

Denne forbindelse ble fremstilt fra 4-kloracetofenon og 3,5-dimetyl-4-hydroksybenzaldehyd ifølge generell fremgangsmåte 1 som beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (elueringxykloheksan/ etylacetat=95:5).

<1>H NMR CDCI35 ppm: 2,30 (s, 6H), 7,32 (s, 2H), 7,34 (d, J=15,25 Hz, 1H), 7,47 (d, J=8,86 Hz, 2H), 7,75 (d, J=15,26 Hz, 1H), 7,97 (d, J=8,86 Hz, 2H).

Mellomforbindelse 2:

1-[ 4- metvltiofenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- hvdroksvfenvllprop- 2- en- 1- on

Denne forbindelse ble fremstilt fra 4'-metyltioacetofenon og 3,5-dimetyl-4-hydroksybenzaldehyd ved generell fremgangsmåte 1 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (elueringxykloheksan/ etylacetat=8:2).

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 2,22 (s, 6H), 2,54 (s, 3H), 7,36 (d, J=8,20 Hz, 2H), 7,48 (s, 2H), 7,62 (d, J=15,7 Hz, 1H), 7,74 (d, J=15,7 Hz, 1H), 8,10 (d, J=8,20 Hz, 2H), 8,92 (s, 1H).

Mellomforbindelse 3:

1- r2- metoksvfenvll- 3- r3, 5- dimetvl- 4- hvdroksvfenvllprop- 2- en- 1- on

Denne forbindelse ble fremstilt fra 2'-metoksyacetofenon og 3,5-dimetyl-4-hydroksybenzaldehyd ved generell fremgangsmåte 1 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (elueringxykloheksan/etylacetat =8:2).

<1>H NMR DMSO 5 ppm: 2,39 (s, 6H), 2,22 (s, 6H), 7,58 (s, 2H), 7,67-7,62 (m, 3H), 7,82 (d, J=15,5 Hz, 1H), 8,17 (d, 1H), 12,96 (s, 1H).

Mellomforbindelse 4:

1-[ 4- heksvloksvfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- hvdroksvfenvllprop- 2- en- 1- on

Denne forbindelse ble fremstilt fra 4-heksyloksyacetofenon og 3,5-dimetyl-4-hydroksybenzaldehyd ved generell fremgangsmåte 1 som er beskrevet ovenfor.

Den forventede forbindelse falt ut i reaksjonsmediet:; den ble tørket og anvendt uten ytterligere rensning i den etterfølgende reaksjon.

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 0,88 (m, 3H), 1,28-1,43 (m, 6H), 1,72 (m, 2H), 2,21 (s, 6H), 4,05 (t, J=6,42 Hz, 2H), 7,40 (d, J=8,43 Hz, 2H), 7,48 (s, 2H), 7,57 (d, J=15,24Hz, 1H), 7,72 (d, J=15,24Hz, 1H), 8,12 (d, J=8,43 Hz, 2H), 8,89 (s, 1H).

Mellomforbindelse 5:

1- r2- hvdroksv- 4- klorfenvn- 3-[ 3, 5- dimetyl- 4- hvdroksvfenvnprop- 2- en- 1- on

Forbindelsen ble fremstilt fra 4'-klor-2'-hydroksyacetofenon (utgangsmateriale 3) og 3,5-dimetyl-4-hydroksybenzaldehyd ved generell fremgangsmåte 1 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (toluen:10).

<1>H NMR DMSO 5 ppm: 2,21 (s, 6H), 7,1 (m, 2H), 7,55 (s, 2H), 7,72 (d, J=15,4 Hz, 1H), 7,80 (d, J=15,4 Hz, 1H), 8,25 (d, J=9,0 Hz, 1H), 9,09 (s, 1H), 13,04 (s, 1H).

Mellomforbindelse 6:

2-( 3, 5- dimetvl- 4- hvdroksvfenvl)- 7- klor- 4H- 1- benzopyran- 4- on

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[2-hydroksy-4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-hydroksyfenyl]prop-2-en-1-on (mellomforbindelse 5) ved følgende fremgangsmåte: 1 -[2-hydroksy-4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-hydroksyfenyl]prop-2-en-1 -on ble løst i dimetylsulfoksid, et jodkrystall ble tilsatt, og blandingen ble holdt under tilbakeløp i 10 min.

Reaksjonsmediet ble brakt til romtemperatur, hydrolysert. Bunnfallet ble tørket, skylt med natriumtiosulfatløsning og deretter med vann.

Rensning var ved oppløsning i metylenklorid og utfelling ved tilsetning av heptan.

<1>H NMR DMSO 5 ppm: 2,25 (s, 6H), 6,87 (s, 1H), 7,51 (d, J=8,55 Hz, 1H), 7,73 (s, 2HH), 7,98 (m, 2H).

Referanse: A.G. Doshi, S.P., B.J. Ghiya (1986), Indian J. Chem. Sect. B, Vol 25, p 759.

Mellomforbindelse 7: 1- r2- metvloksv- 4- klorfenvll- 3- r3, 5- dimetvl- 4- hvdroksvdimetvlmetvloksvfenvll prop- 2- en- 1- on

Denne forbindelse ble fremstilt fra 4'-klor-2'-metoksyacetofenon og 3,5-dimetyl-4-hydroksybenzaldehyd ved den generelle fremgangsmåte 1 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (elueringxykloheksan/etylacetat =85:15).

<1>H NMR DMSO 5 ppm: 2,21 (s, 6H), 3,90 (s, 3H), 7,12 (m, 1H), 7,23 (d, J=15,5 Hz, 1H), 7,29 (s, J=1,80 Hz, 1H), 7,38 (d, J=15,5 Hz, 1H), 7,41 (s, 2H), 7,48 (d, J=7,98 Hz, 1H).

Mellomforbindelse 8:

1 -[ 4- bromfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- hvdroksvfenyllprop- 2- en- 1 - on

Denne forbindelse ble fremstilt fra 4'-bromacetofenon og 3,5-dimetyl-4-hydroksybenzaldehyd ved generell fremgangsmåte 1 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (elueringxykloheksan/ etylacetat=85:15).

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 2,30 (s, 6H), 7,32 (s, 2H), 7,56-7,66 (m, 3H), 7,75 (d, J=15,27 Hz, 1H), 7,90 (d, J=8,70 Hz, 2H), 9,82 (s, 1H).

Mellomforbindelse 9:

1- r4- heptvlfenvn- 3-[ 3, 5- dimetyl- 4- hvdroksvfenvnprop- 2- en- 1- on

Denne forbindelse ble fremstilt fra 4'-heptylacetofenon og 3,5-dimetyl-4-hydroksybenzaldehyd ved generell fremgangsmåte 1 som er beskrevet ovenfor. Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (eluering:cykloheksan/etylacetat= 85:15).

<1>H NMR DMSO 5 ppm: 0,84 (m, 3H), 1,25 (m, 8H), 1,60 (m, 2H), 2,21 (s, 6H), 2,65 (t, J=7,50 Hz, 2H), 7,35 (d, J=8,02 Hz, 2H), 7,48 (s, 2H), 7,60 (d, J=15,48 Hz, 1H), 7,71 (d, J=15,48 Hz, 1H), 8,05 (d, J=8,02 Hz, 2H), 8,92 (s, 1H).

Fremstilling av forbindelser ifølge oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter forbindelsene 7, 11, 15-17, 25, 27-33, og 36-42.

Forbindelsene 1-6, 8-10,12-14, 18-24, 34 og 35 er ikke omfattet av foreliggende oppfinnelse, men angis med forbindelsesnummer og navn siden de omtales i beskrivelsen og figurene.

Forbindelse 1: 1- r2- hvdroksv- 4- etoksvkarbonvldimetvlmetvloksvfenvll- 3- r3, 5- ditertbutvl- 4-hvdroksvfenvllprop- 2- en- 1- on

Forbindelse 2: 1-[ 2- hvdroksv- 4- karboksvdimetvlmetvloksvfenvll- 3-[ 3, 5- ditertbutyl- 4- hvdroksvfenvllprop- 2- en- 1 - on

Forbindelse 3: 1- r2- hvdroksv- 4- klofrenvll- 3- r4- karboksvdimetvlmetvloksvfenvllprop- 2- en- 1- on

Forbindelse 4: 1-[ 2- hvdroksvfenvll- 3-[ 4- karboksvdimetvlmetvloksvfenyllprop- 2- en- 1- on

Forbindelse 5: 1-[ 2- hvdroksyfenvll- 3-[ 3, 5- dimetoksy- 4- karboksydimetvlmetvloksyfenyllprop- 2-en- 1- on: Forbindelse 6: 1-[ 2- hvdroksy- 4- klorfenvll- 3- r3, 5- dimetoksy- 4- karboksydimetvlmetyl-oksyfenvllprop- 2- en- 1- on: Forbindelse 7: 1-[ 2- hvdroksy- 4- klorfenvll- 3- r3, 5- dimetvl- 4- karboksydimetvlmetyloksy-fenyllprop- 2- en- 1 - on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 2'-hydroksy-4'-kloracetofenon (utgangsmateriale 3) og 3,5-dimetyl-4-etyloksykarbonyldimetylmetyloksybenzaldehyd (utgangsmateriale 6) ved generell fremgangsmåte 2 som er beskrevet ovenfor.

Rensning ble utført ved kromatografi-på-silikagel (eluering:cykloheksan/etylacetat=9:1).

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 1,39 (s, 6H), 2,22 (s, 6H), 7,07 (m, 1H), 7,12 (d, J=2,07 Hz, 1H), 7,61 (s, 2H), 7,74 (d, J=15,5 Hz, 1H), 7,87 (d, J=15,5 Hz, 1H), 8,26 (d, 1H), 12,76 (s, 1H).

MS[ES-MS]:387,1[M-1].

Forbindelse 8: 1-[ 2- hvdroksv- 4- karboksvdimetvlmetvloksvfenvll- 3-[ 3, 5- dibrom- 4- hydroksv-fenyllprop- 2- en- 1 - on: Forbindelse 9: 1-[ 2- hvdroksyfenvll- 3-[ 3- karboksydimetvlmetvloksyfenvnprop- 2- en- 1- on

Forbindelse 10: 1-[ 2- hvdroksy- 4- karboksydimetvlmetvloksyfenvll- 3-[ 3- hvdroksyfenvllprop- 2- en-1- on: Forbindelse 11: 1-[ 2- hvdroksyfenvll- 3- r3, 5- dimetvl- 4- karboksydimetvlmetvloksyfenyllprop- 2- en-1- on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 2'-hydroksyacetofenon og 3,5-dimetyl-4-etyloksykarbonyldimetylmetyloksybenzaldehyd (utgangsmateriale 6) ved generell fremgangsmåte 2 som er beskrevet ovenfor.

Rensning ble utført ved kromatografi-på-silikagel (eluering:cykloheksan/etylacetat=9:1) etterfulgt av preparativ HPLC (revers fase RP18, Licrospher 12 um, eluering : vann/metanol/trifluoreddiksyre=22:78:0,1).

1H NMR DMSO 6 ppm: 1,57 (s, 6H), 2,31 (s, 6H), 6,96 (t, J=8,17Hz, 1H), 7,04 (d, J=8,72 Hz, 1H), 7,35 (s, 2H), 7,49 (t, J=8,2 Hz, 1H), 7,58 (d, J=15,8 Hz, 1H), 7,84 (d, J=15,8 Hz, 1H), 7,94 (d, J=8,7 Hz, 1H), 12,87 (s, 1H).

MS[ES-MS]:351,1[M-1].

Forbindelse 12: 1- 2- hvdroksv- 4- karboksvdimetvlmetvloksvfenvl- 3- 4- metvltiofenvlprop- 2- en- 1- on: Forbindelse 13: 1- r2, 4- dihvdroksvfenvll- 3- r4- karboksvdimetvlmetvloksvfenvllprop- 2- en- 1- on: Forbindelse 14: 1-[ 2- hvdroksvfenvll- 3- r4- karboksvdimetvlmetyloksvfenvnprop- 2- en- 1- on: Forbindelse 15: 1-[ 4- klofrenvll- 3- r3, 5- dimetvl- 4- isopropvloksykarbonvldimetvlmetyloksy-fenyllprop- 2- en- 1 - on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-hydroksy-fenyl]prop-2-en-1-on (mellomforbindelse 1) og isopropylbromisobutyrat ved generell fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 1,25 (d, J=6,06 hz, 6H), 1,39 (s, 6H), 5,00 (sept, J=6,06 Hz, 1H), 7,57 (s, 2H), 7,62 (d, J=8,40 Hz, 2H), 7,64 (d, J=15,8 Hz, 1H), 7,81 (d, J=15,8 Hz, 1H), 8,16 (d, J=8,40 Hz, 2H).

MS [Maldi-Tof]:415[M+1].

Forbindelse 16:

1-[ 4- klorfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- tertbutvloksvkarbonvldimetvlmetvloksvfenyll prop- 2- en- 1- on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-hydroksy-fenyl]prop-2-en-1-on (mellomforbindelse 1) og tertbutylbromisobutyrat ved generell fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (elueringxykloheksan/ etylacetat=9:1).

Forbindelse 17:

1-[ 4- klorfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- karboksvdimetvlmetvloksvfenyllprop- 2- en- 1- on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyloksy-karbonyldimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on (forbindelse 16) ved generell fremgangsmåte 5 som er beskrevet ovenfor.

Rensning ble utført ved kromatografi-på-silikagel (eluering:diklormetan/ metanol=98:2).

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 1,39 (s, 6H), 2,22 (s, 6H), 7,58 (s, 2H), 7,67-7,62 (m, 3H), 7,82 (d, J=15,5 Hz, 1H), 8,17 (d, 1H), 12,96 (s, 1H).

MS [Maldi-Tof]:373,7[M+1].

Forbindelse 18: 1-[ 2- hvdroksv4- karboksvdimetvlmetvloksvfenvl1- 3-[ 4- klorfenyllprop- 2- en- 1- on: Forbindelse 19: 1-[ 2- hvdroksyfenvll- 3-[ 4- karboksydimetvlmetvltiofenyllprop- 2- en- 1- on: Forbindelse 20: 1-[ 4- klor- 2- hvdroksyfenvll- 3- r4- karboksydimetvlmetvltiofenyllprop- 2- en- 1- on: Forbindelse 21: 1-[ 4- karboksydimetvlmetvloksyfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- hvdroksyfenvllprop- 2- en-1- on: Forbindelse 22: 1-[ 4- metvltiofenvll- 3- r4- karboksydimetvlmetvloksyfenyllprop- 2- en- 1- on: Forbindelse 23: 1-[ 4- karboksydimetvlmetvloksvfenvll- 3-[ 4- klorfenyllprop- 2- en- 1- on: Forbindelse 24: 1-[ 4- karboksydimetvlmetvltiofenvll- 3-[ 4- metvltiofenyllprop- 2- en- 1- on: Forbindelse 25: 1-[ 2- hvdroksv- 4- bromfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- karboksvdimetvlmetyl-oksyfenyllprop- 2- en- 1- on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 4'-brom-2'-hydroksyacetofenon (utgangsmateriale 11) og 3,5-dimetyl-4-etyloksykarbonyldimetyloksybenzaldehyd (utgangsmateriale 6) ved generell fremgangsmåte 2 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (eluering:diklormetan/metanol=95:5) etterfulgt av preparativ HPLC (omvendt fase RP18, Licrospher 12 um, eluering: vann/metanol/trifluoreddiksyre=22:78:0,1).

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 1,39 (s, 6H), 2,22 (s, 6H), 7,20 (dd, J=2,16, J=8,55 Hz, 1H), 7,25 (d, J=1,59 Hz, 1H), 7,60 (s, 2H), 7,73 (d, J=15,51 Hz, 1H), 7,86 (d, J=15,51 Hz, 1H), 8,16 (d, J=8,58 Hz, 1H), 12,70 (s, 1H), 13,30 (s, 1H).

MS [ES-MS]:432,9[M-1].

Forbindelse 26: 1-[ 4- karboksvdimetvlmetvloksvfenvll- 3-[ 4- metvltiofenyllprop- 2- en- 1- on: Forbindelse 27: 1-[ 4- metvltiofenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- tertbutvloksykarbonvldimetvlmetyl-oksyfenvllprop- 2- en- 1- on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-metyltiofenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-hydroksyfenyl]prop-2-en-1-on (mellomforbindelse 2) og tertbutylbromisobutyrat ved generell fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (eluering:cykloheksan/etylacetat= 80:2).

Forbindelse 28:

1- r4- metvltiofenvll- 3- r3, 5- dimetvl- 4- isopropvloksvkarbonvldimetyl-metvloksvfenvnprop- 2- en- 1 - on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-metyltiofenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-hydroksy-fenyl]prop-2-en-1-on (mellomforbindelse 2) og isopropylbromisobutyrat ved generell fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (eluering/cykloheksan/ etylacetat=9:1).

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 1,25 (d, J=6,18 Hz, 6H), 1,39 (s, 6H), 2,18 (s, 6H), 2,57 (s, 3H), 4,99 (sept, J=6,18 Hz, 1H), 7,40 (d, J=8,28 Hz, 2H), 7,58 (s, 2H), 7,62 (d, J=15,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J=15,5 Hz, 1H), 8,10 (d, J=8,28 Hz, 2H), 12,97 (s, 1H).

MS [Maldi-Tof]427,1[M+1].

Forbindelse 29:

1-[ 4- metvltiofenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- karboksvdimetvlmetvloksvfenyllprop- 2- en- 1-on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-metyltiofenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyl-oksykarbonyldimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on (forbindelse 28) ved generell fremgangsmåte 5 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (eluering:diklormetan/ metanol=98:2).

<1>H NMR DMSO 5 ppm: 1,39 (s, 6H), 2,57 (s, 3H), 7,40 (d, J=8,55 Hz, 2H), 7,57 (s, 2H), 7,62 (d, J=15,5 Hz, 1H), 7,83 (d, J=15,5 Hz, 1H), 8,10 (d, J=8,55 Hz, 2H), 12,97 (s, 1H).

MS [ES-MS]:383,3[M-1].

Forbindelse 30:

1-[ 2- metoksvfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- tertbutvloksvkarbonvldimetvlmetyl-oksyfenyllprop- 2- en- 1- on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[2-metoksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-hydroksyfenyl]prop-2-en-1-on (mellomforbindelse 3) og tertbutylbromisobutyrat ved generell fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (eluering:cykloheksan/etylacetat= 9:1).

Forbindelse 31:

1-[ 2- metoksvfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- karboksvdimetvlmetvloksvfenyllprop- 2- en-1- on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[2-metoksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tert-butyloksykarbonyldymetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on (forbindelse 30) ved generell fremgangsmåte 5 som er beskrevet ovenfor.

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 1,38 (s, 6H), 2,19 (s, 6H), 3,93 (s, 3H), 7,05 (m, 1H), 7,20 (d, J=8,31 Hz, 1H), 7,25 (d, J=15,5 Hz, 1H), 7,37 (d, J=15,5 Hz, 1H), 7,39 (s, 2H), 7,46 (d, J=7,2 Hz, 1H), 7,53 (m, 1H), 12,93 (s, 1H).

MS [ES-MS]:367,1[M-1].

Forbindelse 32:

1-[ 4- heksvloksvfenvll- 3- r3, 5- dimetvl- 4- tertbutvloksvkarbonvldimetyl-metyloksyfenvnprop- 2- en- 1 - on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-heksyloksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-hydroksyfenyl]prop-2-en-1-on (mellomforbindelse 4) og tertbutylbromisobutyrat ved generell fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (eluering:cykloheksan/etylacetat= 95:5).

Forbindelse 33:

1-[ 4- heksyloksyfenvll- 3- r3, 5- dimetvl- 4- karboksydimetvlmetyloksyfenvnprop- 2-en- 1- on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-heksyloksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tert-butyloksykarbonyldimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on (forbindelse 32) ved generell fremgangsmåte 5 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved rekrystallisering i metanol.

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 0,88 (t, J=6,33Hz, 3H), 1,30 (m, 4H), 1,39 (s, 6H), 1,44 (m, 2H), 1,73 (m, 2H), 2,22 (s, 6H), 4,06 (t, J=6,30 Hz, 2H), 7,06 (d, J=8,61 Hz, 2H), 7,56 (s, 2H), 7,58 (d, J=15,5 Hz, 1H), 7,82 (d, J=15,5 Hz, 1H), 8,13 (d, J=6,61 Hz, 2H).

MS [ES-MS]:437,2[M-1].

Forbindelse 34: 2-( 3, 5- dimetvl- 4- tertbutvloksvkarbonvldimetvlmetvloksvfenyl)- 7- klor- 4H- 1-benzopyran- 4- on: Forbindelse 35: 2-( 3, 5- dimetvl- 4- karboksydimetvlmetvloksyfenyl)- 7- klor- 4H- 1- benzopvran- 4- on: Forbindelse 36: 1-[ 2- metvloksy- 4- klorfenvll- 3- r3, 5- dimetvl- 4- tertbutvloksykarbonvldimetvlmetyl-oksyfenyllprop- 2- en- 1- on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[2-metyloksy-4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-hydroksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on (mellomforbindelse 7) og tertbutylbromisobutyrat ved generell fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Forbindelse 37:

1-[ 2- metvloksv- 4- klorfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- karboksvdimetvl- metvloksvfenyll prop- 2- en- 1- on:

Denne forbindelse ble fremstilt ble fremstilt fra 1-[2-metoksy-4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyloksykarbonyldimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on (forbindelse 36) ved generell fremgangsmåte 5 som er beskrevet ovenfor. Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (eluering:diklormetan/metanol= 98:2).

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 1,38 (s, 6H), 2,19 (s, 6H), 3,89 (s, 3H), 7,12 (dd, J=7,98 Hz, J=1,71 Hz, 1H), 7,23 (d, J=15,56 Hz, 1H), 7,29 (s, J=1,71 Hz, 1H), 7,38 (d, J=15,7 Hz, 1H), 7,41 (s, 2H), 7,48 (d, J=7,98 Hz, 1H).

MS[ES-SM]:401,2[M-1].

Forbindelse 38:

1-[4-heptylfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyloksykarbonyldimetylmetyloksyfenyl] prop-2-en-1-on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-heptylfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-hydroksy-fenyl]prop-2-en-1-on (mellomforbindelse 9) og tertbutylbromisobutyrat ved generell fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (eluering/cykloheksan/etylacetat= 9:1).

Forbindelse 39:

1- r4- heptvlfenvll- 3- r3, 5- dimetvl- 4- karboksvdimetvlmetvloksvfenvllprop- 2- en- 1-on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-heptylfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyl-oksykarbonyldimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on (forbindelse 38) og tert-butylisobutyrat ved generell fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Rensning var ved kromatografi-på-silikagel (eluering:diklormetan/metanol= 98:2).

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 0,85 (m, 3H), 1,30-1,24 (m, 8H), 1,39 (s, 6H), 1,60 (m, 2H), 2,22 (s, 6H), 2,67 (t, 2H, J=7,4 Hz), 7,37 (d, J=8,04 Hz, 2H), 7,57 (s, 2H), 7,62 (d, J=15,66 Hz, 1H), 7,82 (d, J=15,69 Hz, 1H), 8,07 (d, J=8,07 Hz, 2H).

MS[ES-MS]:435,3[M-1].

Forbindelse 40:

1-[ 4- bromfenvll- 3- r3, 5- dimetvl- 4- tertbutvloksykarbonvldimetvlmetvloksyfenyll prop- 2- en- 1- on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-bromfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-hydroksy-fenyl]prop-2-en-1-on (mellomforbindelse 8) og tertbutylbromisobutyrat ved generell fremgangsmåte 4 som er beskrevet ovenfor.

Forbindelse 41:

1-[ 4- bromfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- karboksvdimetvlmetvloksvfenyllprop- 2- en- 1-on:

Denne forbindelse ble fremstilt fra 1-[4-bromfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyl-oksykarbonyldimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on (forbindelse 40) ved generell fremgangsmåte 5 som er beskrevet ovenfor.

<1>H NMR DMSO 6 ppm: 1,39 (s, 6H), 2,22 (s, 6H), 7,58 (s, 2H), 7,65 (d, J=15,39 Hz, 1H), 7,84-7,77 (m, 3H), 8,09 (d, J=8,19 Hz, 1H), 13,01 (s, 1H).

MS[ES-MS]:417,2[M-1].

Forbindelse 42: 1-[ 3- hvdroksvfenvll- 3-[ 3, 5- dimetvl- 4- isopropvloksvkarbonvldimetvlmetyloksv-fenyllprop- 2- en- 1 - on:

EKSEMPEL 2: Evaluering av PPAR- aktivering in vitro

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen som ble testet er de forbindelser hvis fremstilling er beskrevet i eksemplene ovenfor, så vel som forbindelser 1-6, 8-10, 12-14, 18-24, 26, 34 og 35.

Nukleære reseptorer av PPAR-underfamilien som aktiveres av 2 hovedklasser avfarmasøytika, fibrater og glitazoner, som anvendes mye i klinikken til behandling av dyslipidemier og diabetes, spiller en viktig rolle i lipid- og glukose-homeostase. De etterfølgende forsøksdata viser at forbindelsene ifølge oppfinnelsen aktiverer PPARa og PPARy in vitro.

PPAR-aktivering ble testet in vitro i RK13-fibroblastcellelinjer ved måling av transkripsjonen aktivitet av kimerer bestående av det DNA-bindende domenet av gjæren gal4-transkripsjonsfaktor og det ligandbindende domenet av de forskjellige PPAR'er. Disse sistnevnte resultater ble bekreftet i cellelinjer ved følgende protokoller:

Eksemplet er gitt for RK13-celler.

a. Kulturprotokoller

RK13-cellervarfra ECACC (Porton Down, UK) og ble dyrket i DMEM-medium supplert med 10% (volum/volum) føtalt kalveserum, 100 U/ml penicillin (Gibco, Paisley, UK) og 2 mM L-glutamin (Gibco, Paisley, UK). Dyrkningsmediet ble forandret hver annen dag. Celler ble holdt på 37°C i en fuktig atmosfære av 95% luft/5% C02.

b. Beskrivelse av plasmider anvendt for transfeksjon

Plasmidene pG5TkpGL3, pRL-CMV, pGal4-hPPARa, pGAI4-hPPARy og pGal4-<)> er beskrevet av Raspe, Madsen et al. (1999). pGAI4-mPPARa og pGAI4-hPPARy-konstruktene ble oppnådd ved kloning i pGAI4-<t>-vektoren av PCR-mangfoldiggjørte DNA-fragmenter som svarte til DEF-domenene i de humane PPARa og PPARynukleære reseptorer.

c. Transfeksjon

RK13-celler ble podet i kulturskåler med 24 brønner i 5x10<4>celler/brønn og transfektert i 2 t med reporterplasmidet pG5TkpGL3 (50 ng/brønn), ekspre-sjonsvektorene pGAI-<)>, pGAI4-mPPARa, pGAI4-hPPARa, pGal4-hPPARy (100 ng/brønn) og transfeksjonseffektivitetskontrollvektoren pRL-CMV (1 ng/brønn) ifølge den ovenfor beskrevne protokoll (Raspe, Madsen et al., 1999), deretter inkubert i 361 med prøveforbindelsene. Ved slutten av forsøket ble cellene lysert (Gibco, Paisley, UK), og luciferaseaktivitet ble bestemt med «Dual-Luciferase» reporterprøvesystemkit (Promega, Madison, Wl, USA) etter leverandørens instruksjoner som beskrevet ovenfor (Raspe, Madsen et al., 1999).

Det ble påvist en økning i luciferaseaktivitet i cellene som var behandlet med forbindelsene ifølge oppfinnelsen og transfektert med pGAI4-hPPARa-plasmidet. Denne induksjon av luciferaseaktivitet indikerer at forbindelsene ifølge oppfinnelsen er aktivatorer av PPARa.

Resultatene er eksemplifisert i fig. 2-1, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6 som viser PPARa-aktivatoregenskapene til følgende forbindelser: 3,4,7,8,9,11,12,13,14,17,19,20,21,22,23,24,25,26,29,31,33,37,38,41.

Det ble påvist en økning i luciferaseaktivitet i celler behandlet med forbindelsene ifølge oppfinnelsen og transfektert med pGAI4-hPPARy-plasmidet. Denne induksjon av luciferaseaktivitet indikerer at forbindelsene ifølge oppfinnelsen er aktivatorer av PPARy.

Resultatene er eksemplifisert i fig. 2-7 som viser PPARy-aktivatoregenskapene til forbindelsene 17, 33 og 29 ifølge oppfinnelsen.

Ett aspekt av oppfinnelsen belyses ved behandlingen av sykdommer som aterosklerose og psoriasis hvis manifestasjoner er hhv. vaskulær og kutan. Disse 2 patologier kjennetegnes ved kronisk, systemisk betennelse og ukon-trollert celleproliferasjon (glatte muskelceller ved aterosklerose og epidermale keratinocytter i psoriasis). Disse 2 patologier har felles ekspresjonen av inflammatoriske cytokiner, formidlet av en transkripsjonsfaktor av den inflammatoriske respons NF-kB, AP-1 og NFAT (Komuves, Hanley et al., 2000; Neve, Fruchart et al., 2000). Ved nedregulering av NF-kB og AP1-signalbanen inhi-berer PPARa ekspresjonen av gener involvert i den inflammatoriske respons, så som genene som koder for interleukin-6-, cyklooksygenase-2, og endotelin-1 og hemmer derfor mobiliseringen av monocytter og skummende celler til de ateromatøse skader.

EKSEMPEL 3: Evaluering av virkningene på lipidmetabolisme in vivo Forbindelsene som ble testet er de forbindelser hvis fremstilling er beskrevet i eksemplene ovenfor.

Fibrater, som anvendes mye i klinikken for behandlingen av dislipidemier som ligger til grunn for utviklingen av aterosklerose, én av hovedårsakene til morbi-ditet og mortalitet i den industrialiserte verden, er sterke aktivatorer av den PPARa-nukleære reseptor, som regulerer ekspresjonen av gener som er involvert i lipidtransport (apolipoproteiner, så som Apo Al, Apo All og Apo CMI, membrantransportører så som FAT) og katabolisme (ACO, CPT-I og CPT-II). I mennesker og i gnagere fører derfor behandling med PPARa-aktivatorer til en minskning i sirkulerende nivåer av kolesterol og triglyserider.

De etterfølgende protokoller ble utformet for å vise en minskning i sirkulerende triglyserid- og kolesterolnivåer og interessen til forbindelsene ifølge oppfinnelsen i sammenheng med forebygging og/eller behandling av kardiovaskulære sykdommer.

a) Behandling av dyr

Apo E2/E2-transgene mus ble holdt på en 12-timers lys/mørk syklus ved en

konstant temperatur på 20±3°C. Etter 1 ukes akklimatisering ble musene veid og delt i grupper på 6 dyr valgt slik at kroppsvekten ville være jevnt fordelt.

Prøveforbindelsene ble suspendert i karboksymetylcellulose og administrert

ved intragastrisk gavage i de angitte doser, 1 gang pr. dag i 7 eller 8 dager. Dyr hadde adgang til for og vann ad libitum. Ved slutten av forsøket ble dyrene veid og avlivet under bedøvelse. Blod ble oppsamlet på EDTA. Plasma ble fremstilt ved sentrifugering ved 3000 omdr./min. i 20 min. Leverprøver ble tatt og lagret frosset i flytende nitrogen for etterfølgende analyse.

b) Måling av serumlipider og apolipoproteiner

Serumlipidkonsentrasjoner (totalt kolesterol og fritt kolesterol, triglyserider og

fosfolipider) ble bestemt ved en kolorimetrisk prøve (Boehringer, Mannheim, Tyskland) etter leverandørens instruksjoner. Serumkonsentrasjoner av apolipoproteiner Al, All og CMI ble bestemt som beskrevet ovenfor (Raspe et al., J. Lipid Res., vol 40, pp 2099-2110, 1999, G. Asset et al., Lipids, Vol 34, p 39-44, 1999).

Resultatene er eksemplifisert i fig. 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-11 og 3-12, som viser aktiviteten til forbindelsene 7, 17, 29, 33 og 41 ifølge oppfinnelsen på triglyserid- og kolesterolmetabolisme.

c) RNA-analyse

Total RNA ble isolert fra leverprøver ved ekstraksjon med en blanding av

guanidintiocyanat-sur fenol/kloroform, ifølge den ovenfor beskrevne protokoll (Raspe et al., J. Lipid Res., vol 40, pp 2099-2110, 1999). Messenger RNA ble bestemt kvantitativt ved kvantitativ RT-PCR med en Light Cycler Fast Start DNA Master Sybr Green I kit (Hoffman-La Roche, Basel, Sveits) på et Light Cycler System (Hoffman-La Roche, Basel, Sveits). Primerpar som var spesifikke for genene ACO, Apo CMI og Apo All ble anvendt som prober. Primerpar som var spesifikke for genene 36B4, p-aktin og cyklofilin ble anvendt som kontrollprober. Alternativt ble RNA analysert ved Northern Blot eller Dot Blot ifølge den ovenfor beskrevne protokoll (Raspe et al., J. Lipid Res., Vol 40, p 2099-2110, 1999).

EKSEMPEL 4: Evaluering av antioksidantegenskapene til forbindelsene ifølge oppfinnelsen

Et spesielt fordelaktig aspekt ved oppfinnelsen illustreres av rollen til de egentlige antioksidantegenskaper av forbindelsene som anvendes i preparatene ifølge oppfinnelsen ved styring av oksidativt stress. Denne originale tilknytning mellom PPARa-agonistegenskapen og antioksidantegenskapen representerer et effektivt middel ved behandling av patologier relatert til en forandring av en celles redoksstatus. Denne illustrasjon gjelder spesielt en patologi som Alzheimers Sykdom hvor frie radikaler spiller en avgjørende rolle.

Hos pasienter med Alzheimers Sykdom modifiseres oksidativ status i hjerne-celler. Frie radikaler forårsaker derved lipidperoksidasjon og oksidasjon av proteiner og nukleinsyrer (DNA/RNA). Disse oksidasjoner forandrer biomolekylers biologiske egenskaper og fører til nervedegenerering (Butterfield, Drake et al., 2001). NF-kB er en transkripsjonsfaktor som er kjent for å være følsom for cellers redoksstatus. Den er derfor nøye involvert i reaksjonen på oksidativt stress pga. at den muliggjør aktivering av målgenene for inflammasjon (Butterfield, Drake et al., 2001). Forbindelsene som anvendes i preparatene ifølge oppfinnelsen har derfor den originale egenskap at de hindrer aktivering av NF-kB-banen på 2 forskjellige nivåer, ved å inhibere dens aktivering av frie radikaler (antioksidant), men også ved at den hindrer dens transkripsjonene aktivitet (PPARa-agonist).

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen representerer et nytt middel i kampen mot virkningene av aldring, spesielt mot virkningen av UV-indusert lysaldring hvor frie radikaler deltar aktivt i patogenesen av forstyrrelser fra huderytem og rynke-dannels til mer alvorlige patologier som hudkreft (basalcelle- og skvamøst celle-karsinom samt melanom).

Metabolisme er det som ligger under dannelsen av frie radikaler, men omgivel-sesfaktorer som eksiterende ioniserende stråling (ultrafiolett) eller betennelses-mediatorer (cytokiner) kjemoterapeutiske legemidler og hypertermi er sterke aktivatorer av frie radikalarter og danner en ulikevekt i cellens redoksbalanse. Når stresset er alvorlig avhenger overlevelsen av cellen på dens kapasitet til å tilpasse seg, motstå stresset og bryte ned skadede molekyler. Under aldring er cellers kapasitet til å forsvare seg skikkelig mot et oksidativt angrep avgjørende, og derved skulle en økning i cellers kapasitet til å motstå slike angrep kunne hjelpe til å fremskaffe en løsning på kampen mot opptredenen av virkningene av aldring og skulle kunne fremme en økning av organismens levetid.

Solstråling kan forandre sammensetningen av visse molekyler i kroppen. UVB ble lenge ansett for å være den eneste årsak til solens skadelige virkninger på kroppen. Det er nå kjent at UVA-stråling kan ha en direkte motsatt effekt, men fremfor alt forsterker den virkningene av UVB. De viktigste molekyler som er utsatt for forandring, ofte på en skadelig måte, men også på en gunstig måte, er: DNA, hvor tymindimerer kan dannes under innvirkningen av UVB. Selv om DNA ikke absorberer UVA-stråler, kan disse skade det genetiske materialet og derfor være mutagene. En patologi så som Xeroderma pigmentosum som er skyld i et fravær eller en forandring av DNA-reparasjonsmekanismer, predispo-nerer for utviklingen av kreft av basalkeratinocytter.

Proteiner, hvis rommelige struktur kan bli endret. Mange proteiner kan bli inaktivert på denne måte: enzymer, transportører, ionekanaler, cytoskjelett-proteiner, reseptorer. Disse forandringer kan forårsakes av UVA- og UVB-stråling.

Lipider som kan gjennomgå UVA-indusert peroksidasjon hvor peroksida-sjonen er proporsjonal med graden av fettsyreumettethet.

De etterfølgende protokoller ble utformet for å vise de egentlige antioksidantegenskaper til forbindelsene som ble anvendt i preparatene ifølge oppfinnelsen for forebygging og/eller behandling av forstyrrelser relatert til oksidativt stress.

1. Beskyttelse mot LDL- oksidasjon med kobber:

Forbindelsene som ble testet er forbindelser hvis fremstilling er beskrevet i eksemplene ovenfor. LDL-oksidasjon er en viktig forandring og spiller en dominerende rolle i etab-leringen og utviklingen av aterosklerose (Jurgens, Hoff et al., 1987). Den etter-følgende protokoll gjør det mulig å vise forbindelsenes antioksidantegenskaper. Med mindre annet er angitt var reagensene fra Sigma (St. Quentin, Frankrike).

LDL ble fremstilt ved fremgangsmåten som er beskrevet av Lebeau et al.

(Lebeau, Furman et al., 2000).

Løsningene av prøveforbindelsene ble fremstilt i en konsentrasjon på 10"<2>M i hydrogenkarbonatbuffer (pH 9) og tynnet i PBS for å oppnå sluttkonsentra-sjoner på fra 0,1-100 u.M for en total etanolkonsentrasjon på 1% (volum/volum).

Før oksidasjon ble EDTA fjernet fra LDL-preparatet ved dialyse. Oksidasjon fant deretter sted ved 30°C ved tilsetning av 100 jlxI av 16,6 u.M CuS04-løsning til 160 jlxI av LDL (125 u.g protein/ml) og 20 jlxI av en prøveforbindelseløsning. Dannelsen av diener, artene under observasjon, ble fulgt ved måling av optisk densitet ved 234 nm i prøvene som var behandlet med forbindelsene, men i nærvær eller fravær av kobber. Optisk densitet ved 234 nm ble målt hvert 10. min. i 8 t i et termostatert spektrofotometer (Tecan Ultra 380). Analysene ble utført in triplo. Forbindelsene ble ansett for å ha antioksidantaktivitet når de forårsaket en lengre forsinkelsesfase og senket oksidasjonshastigheten og mengden diener som ble dannet sammenlignet med kontrollprøven. Det viser seg at forbindelsene ifølge oppfinnelsen har minst én av de ovenfor beskrevne antioksidantegenskaper, noe som indikerer at forbindelsene ifølge oppfinnelsen har egentlig antioksidantaktivitet. Fig. 1, 2 og 3 gir et eksempel på resultatene som viser antioksidantegenskapene til forbindelser 2 og 5.

Resultater er gitt i fig. 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12. 1-13 og 1-14, som viser antioksidantegenskapene til følgende forbindelser: 2,3,4,5,6,7,8,9,10,14,17,18,19,21,22,25,29,31,33,35,37,38 og 41. 2. Evaluering av beskyttelse frembragt av forbindelsene ifølge oppfinnelsen mot lipidperoksidasjon: Forbindelsene ifølge oppfinnelsen som ble testet er forbindelsene hvis fremstilling er beskrevet i eksemplene ovenfor, så vel som forbindelser 1- 6, 8- 10, 12- 14, 18- 24, 26, 34 og 35.

LDL-oksidasjon ble bestemt ved TBARS-metoden.

Ifølge det samme prinsipp som er beskrevet ovenfor ble LDL oksidert med CUSO4, og lipidperoksidasjon ble bestemt som følger: TBARS ble målt ved en spektrofotometrisk metode, lipidhydroperoksidasjon ble målt ved anvendelse av lipidavhengig peroksidasjon av jodid til jod. Resultatene uttrykkes som nmol malondialdehyd (MDA) eller som nmol hydroperoksid/ml protein.

De tidligere resultater oppnådd ved måling av inhibering av dannelse av konjugerte diener ble bekreftet ved forsøkene hvor LDL-lipidperoksidasjon ble målt. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen beskytter også LDL effektivt mot lipidperoksidasjon forårsaket av kobber (oksidasjonsmiddel).

BIBLIOGRAFI

O. Braissant og W. Wahli (1898). «Differential expression of peroxime proliferator-activated receptor -alpha, -beta, and -gamma during rat embryonic development» Endocrinology, Vol 139(6): p 2748-54. D.A. Butterfield, J. Drake et al. (2001). «Evidence of oxidative damage in Alzheimers disease brain: central fole for amyloid beta-peptide». Trends Mol Med, Vol 7(12): p 548-54.

B. Desvergne and W. Wahli (1999). «Peroxisome proliferator-activated reseptors: nuclear control of metabolism». Endocr Rev, Vol 20(5): p 649-88.

T. Finkel and N. J. Holbrook (2000). «Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing». Nature 408(6809): p 239-47.

J.C. Fruchart, B. Staels et al., (2001). «PPARS, metabolic disease and atherosclerosis». Pharmacol Res, Vol 44(5): p 345-52.

Y. Gilgun-Sherki, E. Melamed et al. (2001). «Oxidative stress induced-neurodegenerative diseases: the need for antioxidants that penetrate the blood brain barrier». Neuropharmacology, Vol 40(8): p 959-75. M. Guerre-Millo, P. Gervois et al. (2000). «Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activators improve insulin sensitivity and reduce adiposity».

J. Biol Chem, Vol 275(22): p 16638-42.

D. Hourton, P. Delerive et al. (2001). «Oxidized low-density lipoprotein and peroxisome-proliferator-activated receptor alpha down-regulate platelet-Activating-factor receptor expression in human macrophages». Biochem J, Vol 354(Pt1): p 225-32.

S.A. Kliewer, S.S. Sundseth et al. (1997). «Fatty acids and eicosanoids regulate gene expression through direct interactions with peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma». Proe nati Acad Sei USA, Vol 94(9): p 4318-23. L.G. Komuves, K. Hanley et al. (2000). «Stimulation of PPARalpha promotes epidermal keratinocyte differentiation in vivo». J. Invest Dermatol, Vol 115(3): p 353-60.

J. Lebeau, C. Furman et al. (2000). «Antioxidant properties of di-tert-butylhydroxylated flavonoids». Free Radic Biol Med, vol 29(9): pp 900-12.

J.M. Mates. C. Perez-Gomez et al. (1999). «Antioxidant enzymes and human diseases». Clin Biochem. Vol 32(8): p 595-603.

P. Morliere, A. Moysan et al. (1991). «UVA-induced peroxidation in cultured human fibroblasts». Biochim Biophvs Acta, Vol 1084(3): p 261-8.

B.P. Neve, J.C. Fruchart et al. (2000). «Role of the peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) in atherosclerosis». Biochem Pharmacol, Vol 60(8): p 1245-50. V.J. Ram (2003). «Therapeutic role of peroxisome proliferator-activated receptors in obesity, diabetes and inflammation». Prog Drug Res., Vol 60: p 93-132. Review.

E. Raspe, L. Madsen et al. (1999). «Modulation of rat liver apolipoprotein gene expression and serum lipid levels by tetradecylthioacetic acid (TTA) via PPARalpha activation». L Lipid Res., Vol 40(11): p 2099-110.

B. Staels og J. Auwerx (1998). «Regulation of apo A-I gene expression by fibrates». Atherosclerosis, Vol 137 Suppl: p S19-23.

Claims

1. Preparat for behandling eller profylakse av en patologi relatert til betennelse, neurodegenerasjon, dereguleringer av lipid og/eller glukosemetabolisme, celleproliferasjon og/eller differensiering og/eller hud- eller sentralnervesystemaldring, omfattende, i en farmasøytisk akseptabel bærer, minst ett substituert 1,3-difenylprop-2-en-1-on-derivat med formelen (I) nedenfor:

hvor Xi er et halogen eller en -R1-gruppe eller en gruppe med formelen -G1-R1, hvor G1 er et oksygen- eller svovelatom, og R1 er et hydrogenatom eller et usubstituert alkylgruppe med 1-7 karbonatomer, X2er et hydrogenatom eller en hydroksygruppe eller en usubstituert alkyloksygruppe hvor alkylenheten til alkoksygruppen har 1-7 karbonatomer, X3er en usubstituert alkylgruppe med 1-7 karbonatomer, X4er en gruppe med formelen: -G4-R4, hvor G4 er et oksygenatom, og R4 er en alkylgruppe med 1-7 karbonatomer, og substituert med en substituent som er del av gruppe (1), X5er en usubstituert alkylgruppe med 1-7 karbonatomer, X6er et oksygenatom, substituentene fra gruppe 1 er valgt blant karboksygrupper med formelen: -COOR6 og karbamoylgrupper med formelen: -CONR6R7, hvor R6og R7, som er like eller forskjellige, er et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-7 karbonatomer, samt de optiske og geometriske isomerene, racematene, tautomerene, saltene, hydratene og blandingene derav.

2. Preparat i samsvar med krav 1, hvori derivatene har cis- eller transstruktur eller en blanding derav.

3. Preparat i samsvar med et av de foregående krav, hvori X2 er et hydrogenatom.

4. Preparat i samsvar med et av de foregående krav, hvori X1 er en -G1-R1-gruppe.

5. Preparat i samsvar med et av de foregående krav, hvori X4 er en -G4-R4-gruppe hvor G4 er et oksygenatom, og X3 eller X5 er hhv. R3 og R5, hvor R3 og R5 er en metylgruppe.

6. Preparat i samsvar med et av de foregående krav, hvori X4 er OC(CH3)2COOR6, og R6 er som definert i krav 1.

7. Preparat i samsvar med et av de foregående krav, hvori derivatet er valgt blant 1-[2-hydroksy-4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyl-oksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[2-hydroksy-4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-/'sopropyloksykarbonyldimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[2-hydroksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-fertbutyloksykarbonyldimetyl-metyloksyfenyl]prop-2-en-1 -on, 1-[4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-/sopropyloksykarbonyldimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[2-hydroksy-4-bromfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyl-oksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[4-metyltiofenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyloksykarbonyldimetylmetyl-oksyfenyl]]prop-2-en-1-on, 1-[4-metyltiofeny]l-3-[3,5-dimetyl-4-isopropyloksykarbonyldimetylmetyl-oksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[4-metyltiofenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[2-metoksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyloksykarbonyldimetyl-metyloksyfenyl]prop2-en-1 -on, 1-[2-metoksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[4-heksyloksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-fetrbutyloksykarbonyldimetyl-metyloksybenzyl]prop-2-en-1 -on, 1-[4-heksyloksyfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[2-metyloksy-4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyloksykarbonyldimetylmetyl-oksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[2-metyloksy-4-klorfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksy-fenyl]prop-2-en-1 -on, 1-[4-heptylfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-fertbutyloksykarbonyldimetylmetyl-oksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[4-heptylfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[4-bromfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-tertbutyloksykarbonyldimetyl-metyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, og 1-[4-bromfenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on.

8. Preparat i samsvar med et av de foregående krav, hvori derivatet er valgt fra gruppen som består av: 1-[4-metyltiofenyl]-3-[3,5-dimetyl-4-karboksydimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, 1-[4-metyltiofeny]l-3-[3,5-dimetyl-4- tertbutyloksykarbonyldimetylmetyloksyfenyl]prop-2-en-1-on, og 1-[4-metyltiofenyl]-3-[3,5-dimetyl-4- isopropyloksykarbonyldimetylmetyloxyfenyl]prop-2-en-1-on.

9. Preparat i samsvar med et av kravene 1-8, hvori patologien relatert til dereguleringer av lipid- og/eller glukosemetabolisme er diabetes, aterosklerose eller fettsyre.

10. Preparat i samsvar med et av kravene 1-8, hvori patologien relatert til celleproliferasjon og/eller -differensiering er karsinogenese, psoriasis eller aterosklerose.