NO326762B1

NO326762B1 - Polyfenolfraksjoner av te, anvendelse derav, og formuleringer inneholdende slike

Info

Publication number: NO326762B1
Application number: NO974188A
Authority: NO
Inventors: Ezio Bombardelli; Giuseppe Mustich; Paolo Morazoni
Original assignee: Indena Spa
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 2009-02-09
Also published as: JP2002187848A; ES2181873T3; CA2215210A1; ITMI950493A1; US5989557A; DK0814823T3; EP0814823B1; RU2185070C2; ITMI950493A0; EP0814823A1; NO974188D0; JP3264934B2; ATE222113T1; AU696676B2; IT1275905B1; CA2215210C; NO974188L; WO1996028178A1; DE69622998D1; KR100301678B1

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved ekstraksjon av polyfenolfraksjoner av Camellia sinensis (te), anvendelse derav, samt formuleringer inneholdende slike som angitt i henholdsvis krav 1, 11, 13, 16, 17 og 18.

Formålet ved oppfinnelsen vedrører spesielt ekstrakter fri for koffein, men inneholdende i hovedsak polyfenolene avledet fra epigallokatekin i deres naturlige forhold.

Koffein er kjent for å ha uønskede effekter på det kardiovaskulære system samt en mutagen effekt, og det fjernes normalt ved ekstraksjon med karbondioksid i hyperkritisk fase eller klorinerte løsningsmidler; imidlertid tar ikke disse prosedyrer sikte på å beholde et standardisert innhold av alle disse polyfenolkomponenter som er ansvarlig for fordelaktige biologiske effekter.

Disse substanser, karakteristisk for teplanten, har i det siste vært gjenstand for stor interesse p.g.a. deres sterke antioksidante effekt, som beskrevet i litteratur (1,2). En slik effekt er åpenbart i en viss grad relatert til evnen noen av disse polyfenolene {f.eks. epigallokatekin-3-0-gallat) har til å inhibere dannelsen av neoplasiaer kunstig indusert i laboratoriedyr (3,4).

Ytterligere viste noen nylig epidemologiske studier hvordan konsumpsjonen av store mengder grønn te er forbundet med en lavere hyppighet av degenerative kroniske sykdommer, f.eks. noen former for cancer og aterosklerose (5-8).

Pram til nå har ikke virkningsmekanismene i te-substanser inneholdt i grønn te-derivater blitt fullstendig forklart, med unntak av en generell antioksidant-effekt beskrevet over. Det er i løpet av grundige studier funnet at polyfenol-komponenten i grønn te evner å utøve en differensiert cytotoksisk effekt som avhenger av typen av den studerte celle, og at en slik differensiasjon spesielt er relatert til den selektive innsikting som noen av disse polyfenol-molekylene har mot subcelle-seter så som mitokondrier.

Det er fra JP patent 3228664 og fra US patent 4.248.789 tidligere kjent ekstraksjon av materialer te og kaffe hvor det benyttes kokende eller vann ved høy temperatur ved ekstraksjonen. I foreliggende oppfinnelse blir imidlertid slik ekstraksjon utført med kaldt vann, noe som overraskende øker ekstraksjonsutbyttet samt bedrer sammen-setningen av det ekstraherte produktet.

Det er følgelig åpenbart at det er viktig med en ekstrak-sjonsmetode som tillater å erholde ekstrakter av Camellia sinensis karakterisert ved et standardisert innhold av polyfenolsubstanser og et lavt koffeininnhold.

Et slikt mål har blitt oppnådd ved hjelp av en fremgangsmåte som omfatter: a) ekstraksjon av den vegetabilske biomasse med vann-alkohol eller vann-keton-blandinger; b) total eller delvis fordamping av ekstraksjonsløsnings-middelet; c) suspensjon av resten i en vandig blanding av 30-60 volum% metanol; d) ekstraksjon av hydrometanolsuspensjon med klorinerte løsningsmidler e) filtrasjon av de uløselige rester og konsentrasjon av hydr orne t ano 1 f a sen ,-f) alternativ acidifisering med organiske syrer; g) ekstraksjon av den konsentrerte hydrometanolfase og

alternativ acidifisering med løsningsmidler valgt fra alifatiske estere, alkoholer eller ketoner, forutsatt at de er ikke-blandbare med hydrometanolblandingen;

h) ytterligere tilsats av et aromatiske eller alifatisk hydrokarbon etterfulgt av vasking med fortynnede vandige

mineralsyrer;

i) konsentrasjon av den vann-ikke-blandbare organiske fase

og fortynning med klorinerte løsningsmidler;

k) i fravær av trinnene f) og h), behandlingen med makro-molekylære sterkt sure kationebyttere i tørre alifatiske ketoner eller alkoholer, fortrinnsvis alkoholer.

I henhold til en første utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ekstraheres den vegetabilske biomasse med alifatiske alkoholer og ketoner fortynnet med vann eller alene, fortrinnsvis med vandige acetonblandinger i området 40 til 90 volum% (spesielt med 70% aceton). De resulterende ekstrakter konsentreres, avhengig av det anvendte løsningsmiddel, enten til et lite volum (fra om lag 1/5 til om lag 1/15 utgangsvolum) eller til eliminering av det organiske løsningsmiddelet.

I det første tilfelle fortynnes det vandige konsentrat med metanol til 50% (v/v) mens resten suspenderes i en vandig metanolblanding i området 30-60%, fortrinnsvis 50% i det andre tilfellet. Hydrometanolblandingen motekstraheres med klorinerte løsningsmidler, fortrinnsvis metylenklorid, til eliminering av uønskede substanser så som klorofyll, terpener og koffein som ikke er kompleksert med de oligo-meriske polyfenoler som foreligger i den vegetabilske biomasse. De klorinerte organiske faser kastes mens hydrometanol fasen konsentreres til metanolet er fjernet, idet man filtrerer alt uløselig materiale omfattende tannin-komplekser med koffein. Den vandige løsning ekstraheres med ikke-blandbare løsningsmidler så som alifatiske ketoner og alkoholer eller alifatiske estere. Eksempler på slike løsningsmidler omfatter metyletylketon i nærvær av salter så som ammoniumklorid eller sulfat (som kan kløyve kom-pleksene med koffein p.g.a. deres sure og saline natur, idet de holdes i vann og det samtidig muliggjøres en selektiv ekstraksjon av polyfenolene), butanol i dets isomere former, etylformat eller acetat. Disse løsningsmidler, fortrinnsvis etylacetat, tillater en selektiv gjenvinning av fenolsubstansene etter konsentrasjon og fortynning med klorinerte løsningsmidler, spesielt metylenklorid. De resulterende ekstrakter inneholder fortsatt en mengde høyere enn 1% av restkoffein kompleksert med polyfenoler, som kan fjernes ved absorbsjon på sulfongruppeinneholdende resiner i et vannfritt medium ved anvendelse av løsnings-midler så som metanol, etanol eller aceton, hvorved det erholdes et ekstrakt inneholdende ikke mer enn 0,2% koffein.

I en ytterligere utførelsesform omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ekstraksjonen av den vegetabilske biomasse med 40-50% (v/v) vandig metanol eller aceton, konsen-trer ing av eluat inntil eliminering av det organiske løsningsmiddel, fortrinnsvis til om lag samme vekt som vekten for det ekstraherte vegetabilske materialet. Etter å ha filtrert av det uløselige materialet, motekstraheres dette konsentrat med klorinerte løsningsmidler, fortrinnsvis metylenklorid, for å fjerne det frie koffein og de terpen-lignende inerte substanser. Den vandige løsning acidifiseres med organiske syrer, fortrinnsvis sitronsyre i nærvær av ammoniumcitrat og motekstraheres med alifatiske estere, fortrinnsvis etylacetat. Den organiske fase til-settes aromatiske eller alifatiske hydrokarboner i en mengde i området 2-20 volum%, fortrinnsvis toluen i en mengde på 5 volum% basert på det totale volum av den organiske fase, og vaskes deretter med fortynnede mineralsyrer, fortrinnsvis 1% svovelsyre inntil koffeinet er fjernet.

Etter vasking til nøytralitet konsentreres den organiske løsning til små volum og helles i en metylenkloridmengde som er tilstrekkelig til å gjenvinne polyfenolene.

Bladene av Camellia sinensis, som fortrinnsvis er finmalt, anvendes som vegetabilsk biomasse. Ekstraksjonene utføres ved romtemperatur {om lag 18-25°C) . Medikament/løsnings-middel-forhold er ikke kritisk, men det ligger generelt i området 1:1 og 1:5 (w/v) for hver enkelt ekstraksjon. Produktene erholdt ifølge denne fremgangsmåte har et midle-re innhold av de viktigste katekinderivatene på: 50-65% epigallocatechin-3-O-gallat, 13-20% epicatechin-3-0-gallat, 2-4% epicatechin og 1,5-3% epigallocatechin.

Polyfenolfraksjonen erholdt ifølge en av de rapporterte fremgangsmåter er karakterisert ved en antioksidantstyrke som er lik eller høyere enn den observert for kjente antioksidanter, hvilket fremkommer fra den følgende tabell.

I denne "in vitro"-test ble anti-lipoperoksidant-aktiviteten av produktene undersøkt ved anvendelse av en ekspe-rimentell modell som omfatter sonikering av fosfatidylcholinliposomer i et reagensrør og måling av produktene fra deres oksidative degradering ved hjelp av kjente teknikker (9) .

Inkubasjonen av liposomer i nærvær av antioksidantene reduserer dannelsen av konjungerte diener i et dose-relatert forhold, hvilken dannelse er et innledende trinn i den oksidative degradering av fosfolipider.

TABELL

Antioksidant-aktivitet av polyfenolfraksjonen av grønn te på sonikerte fosfatidylcholinliposomer (propagasjonfase).

Sammenligning med epigallokatekin-3-0-gallat, vitamin E og vitamin C

<*> under antagelse av at molekylvekten er som for epigallokatekin- 3 -O-gallat

Data er gitt som produktkonsentrasjon (uM) påkrevd for å redusere dannelsen av konjugatdiener etter sonikering av fosfatidylcholinliposomer med 50% (CI50).

Antioksidant-aktiviteten av polyfenolene er antatt å være viktig også når det gjelder den antimutagene effekt, hvilket nylig har blitt beskrevet for noen polyfenoler så som de ekstrahert fra druesteiner (10).

Det er overraskende funnet at polyfenoler erholdt fra grønn te (selv om de har en høy antioksidant-aktivitet) ved samme konsentrasjoner som de som er antimutagene for produktene ekstrahert fra drue-frø var antimutagene, ikke har slik aktivitet; på den annen side er de karakterisert ved differensiell cytotoksitet (høyere i cellelinjer hvori en mitokondrien mutasjon er letal) som er antatt å være av stor interesse.

Cytoksiteten er ulik avhengig av anvendt cellelinje; i tumorale ovarialceller utviser f.eks. produktet ifølge oppfinnelsen en cytotoksisk effekt ved konsentrasjoner på om lag 50 uM mens effekten kan bli målt ved mye høyere konsentrasjoner (1000 uM) når den evalueres på normale ovarialceller.

I henhold til teknikkens nåværende stand har ulike hypote-ser blitt formulert for å klargjøre mekanismene som er basis for den spontane mutasjon, og blant dem har antagel-sen om at noen metabolske produkter i cellecyklusen, spesielt frie radikaler, er ansvarlige for modulasjonen av den mitokondriene arvelighet gjennom peroksidasjon av membran-systemet som den mitokondriene DNA-replikasjon avhenger, av (11,12) vunnet innpass.

Med disse betingelser er to klasser av forbindelser funnet å være interessante, hvilke klasser virker på to ulike fronter selv om de anvender minst delvis analoge grunn-leggende mekanismer (antioksidant-aktivitet på det mito-kondrielle nivå): det antimutagene (som er tilfelle for druestein-derivatene) og det differensierende cytotoksiske (som er tilfelle for produktene ifølge foreliggende oppfinnelse) . Begge klasser av produkter kan følgelig anvendes i den profylaktiske behandling av degenerative sykdommer så som neoplasiaer, kardiovaskulære sykdommer så som aterosklerose og artrittiske og artrosiske former av ulik opp-rinnelse .

Ytterligere kan produktene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes ved terapi, alene eller i kombinasjon med andre substanser for å utøve en synergistisk effekt. I onkologi kan f.eks. produktene kombineres med den alminnelige kjemo-terapi med den doble fordel av både reduserende oksidativ skade som generelt er involvert i noen behandlinger (f.eks. med noen antracykliner eller platinakomplekser så som cis-platina), og ødeleggelse av en del av tumorcellene, gjennom en differensiell cytotoksisk mekanisme.

Ved forhindring av den neoplastiske aktivitet er polyfenolfraksjonen sammen med diett et effektivt middel for å ødelegge muterte celler i pre-cancerstadiet. I andre tilstander så som aterosklerose, kan produktene ifølge oppfinnelsen fordelaktig kombineres med andre antioksidanter så som karotenoider, spesielt lycopen og zeaxantin for å konservere og opprettholde integriteten av den samlede mengde fysiologiske antioksidanter.

I spesielle degenererende tilstander kan produktene ifølge foreliggende oppfinnelse kombineres med svovelinneholdende aminosyrer så som metionin, cystein eller prolin og hydrok-syprolin, og alternativt administreres i blanding med glukosamin og hyaluronsyre. Rollen polyfenolfraksjonen spiller i denne kombinasj er både antioksidativ og anti-degenerativ for kondroblaster p.g.a. stimuleringen av syn-tesen av kollagen og proteoglikaner i nærvær av syn-ergerende midler.

De aktive doser av disse ekstrakter varierer fra 10 til 1.000 mg/dag, en til fire ganger per dag, fortrinnsvis 50-3 00 mg/dag en til to ganger per dag. Den orale LD50 er over 2.000 mg/kg i rotte og mus.

Produktene kan inkorporeres i konvensjonelle farmasøytiske former så som myke eller harde gelatinkapsler, tabletter, lukteposer, siruper, suppositorier og ampuller. I tilfelle av kombinasjon med andre aktive prinsipper vil sammen-setningene ifølge oppfinnelsen alternativt være egnet for den sekvensielle eller separate administrasjon av de enkel-te aktive prinsipper.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere.

Eksempel I. Fremstilling av det polyfenol-standardiserte innhold dekoffeinert ekstrakt av grønn te.

1 kg ikke-fermenterte, finmalte blader av Camellia sinensis ekstraheres 4 ganger med 3 1 hver med aceton/vann-blanding 7:3 (v/v). De kombinerte ekstrakter konsentreres til 1 kg under vakuum ved en temperatur som ikke er høyere enn 45°C. Under konsentreringen dannes en rikelig gummimasse som består av klorofyll og andre uønskede lipofile substanser som i hvert fall inneholder polyfenoler. Konsentratet fortynnes med 1 1 metanol og 0,5 1 metylenklorid. Gummimassen oppløses i mediet og etter 30 min omrøring separeres fase-ne; ekstraksjonen med metylenklorid repeteres 3 ytterligere ganger og klorometylenfasen kastes deretter. Hydrometanol-fasen konsentreres under vakuum til eliminasjon av metanol, konsentratet ekstraheres 3 ganger med 0,5 1 etylacetat. Den vandige fase kastes mens den organiske fase tørkes over Na2S04 og konsentreres i små volum (0,22 1). Konsentratet helles på 1,2 1 metylenklorid under sterk omrøring for å oppnå et rikelig brunaktig bunnfall som, etter tørking under vakuum, veier 0,12 kg. Resten inneholder 1,6 % av alkaloider og underkastes en endelig rensing ved oppløsning i 1,5 1 metanol under nitrogenatmosfære. Metanolløsningen

behandles med 250 ml av den sulfongruppeinneholdende resin Amberlyst<®> til koffeinet forsvinner, hvilket sjekkes ved tynnsjiiktkromatografi. Metanolløsningen konsentreres til tørrhet under vakuum ved en temperatur som ikke er over 50°C. I henhold til denne fremgangsmåte erholdes 0,11 kg av et beige produkt, hvilket produkt har følgende sammen-setning :

Eksempel II - Fremstilling av det polyfenol-standardiserte innhold av dekoffeinert ekstrakt av grønn te. 1 kg ikke-fermenterte, finmalte blader av Camellia sinensis ekstraheres 4 ganger med 3 1 hver av en aceton/vann-blanding 4:6. De kombinerte ekstrakter konsentreres til l kg under vakuum ved en temperatur som ikke er over 45°C. Under konsentrasjonen dannes noe bunnfall som avsepareres og kastes. Konsentratet ekstraheres 3 ganger med 0,5 1 metylenklorid, og klormetylenfasen kastes deretter. Den vandige fase acidifiseres til pH 1,5 med sitronsyre i nærvær av ammoniumcitrat og ekstraheres 3 ganger med 0,5 ml etylacetat. Den vandige fase kastes deretter mens den organiske fase fortynnes med 75 ml toluen og motekstraheres 3 ganger med 150 ml hver av 1 % H2S04. Etter vasking med vann til nøytralitet og tørking over Na2S04, konsentreres den organiske fase til 300 ml, og konsentratet helles på 1,5 ml metylenklorid. Etter tørking og vakuum over natten erholdes 0,1 kg av et beige pulver, hvilket pulver har de samme karakteristikker som produktet i eksempel 1.

Eksempel III - Fremstilling av det polyfenol-standardiserte innhold dekoffeinert ekstrakt av grønn te. 1 kg ikke-fermenterte, finmalte blader av Camellia sinensis ekstraheres 4 ganger med 3 1 hver av en metanol/vann-blanding 1:1. De kombinerte ekstrakter kombineres til 1 kg under vakuum ved en temperatur som ikke er over 45°C. Under konsentrasjonen dannes noe bunnfall som avsepareres og kastes. Konsentratet ekstraheres 3 ganger med 0,5 1 metylenklorid, og klormetylenfasen kastes deretter. Den vandige fase acidifiseres til pH 1,5 med sitronsyre i nærvær av ammoniumcitrat og ekstraheres 3 ganger med 0,5 1 etylacetat. Den vandige fase kastes deretter mens den organiske fase fortynnes med 75 ml toluen og motekstraheres 3 ganger med 150 ml hver av 1 % H2S04. Etter vasking med vann til nøytralitet og tørking over Na2S04 konsentreres den organiske fase til 300 ml, konsentratet helles deretter på 1,5 ml metylenklorid. Etter tørking under vakuum ved 50°C over natten erholdes 0,1 kg av et beige pulver, hvilket produkt har de samme karakteristikker som produktet i eksempel 1.

Eksempel IV - Gelatinkapsler inneholdende polyfenolfraksjonen av grønn te. 50 mg av polyfenolfraksjon av grønn te blandes med opptil 88 mg mikrokrystallinsk cellulose (Avicel PH 102), 3 mg kollodialt silika (Aerosil 200), 8 mg fornettet natriumkarboksymetylcellulose (Ac-Di-Sol) og 1 mg magnesiumstearat. Den resulterende blanding innkapsles i hardgelatinkapsler (3).

Eksempel V - Gelatinkapsler inneholdende polyfenolfraksjonen av grønn te.

150 mg av polyfenolfraksjon fra grønn te blandes med 264 mg mikrokrystallinsk cellulose {Avicel PH 102), 9 mg kollodialt silika (Aerosil 200) , 24 mg fornettet natriumkarboksymetylcellulose og 3 mg magnesiumstearat. Den resulterende blanding innkapsles i hardgelatinkapsler (størrelse 0) .

Eksempel VI - Belagte tabletter inneholdende polyfenolfraksjonen av grønn te. 50 mg av polyfenolfraksjon av grønn te blandes med 50 mg mikrokrystallinsk cellulose (Avicel PH 101), 33 mg dibasisk kalsiumfosfat (Encompress A), 3 mg kollodialt silika (Aerosil 200), 12 mg fornettet natriumkarboksymetylcellulose (Ac-Di-Sol) og 2 mg magnesiumstearat. Pulvrene blandes i 10 min og doseres deretter i tabletter på 150 mg/tablett. De resulterende tabletter (diameter: 7 mm) belegges med et filmsjikt inneholdende 4,5 mg hydroksy-propylmetylcellulose (Methocel E5), 0,9 mg polyetylen-glykol 6000 (Carbowax 6000), 1,2 mg titandioksid og 0,9 mg talk.

Eksempel VII - Belagte tabletter inneholdende polyfenolfraksjonen av grønn te.

150 mg av polyfenolfraksjon fra grønn te blandes med 150 mg mikrokrystallinsk cellulose (Avicel PH 101), 99 mg dibasisk kalsiumfosfat (Emcompress A), 9 mg kollodialt silika (Aerosil 200), 36 mg fornettet natriumkarboksymetylcellulose

(Ac-Di-Sol) og 6 mg magnesiumstearat. Pulvrene blandes i 10 min og doseres i tabletter på 450 mg/tablett. De resulterende tabletter (diameter: llmm) belegges med et filmsjikt inneholdende 13,5 mg hydroksypropylmetylcellulose (Methocel E5), 2,7 mg polyetylenglykol 6000 (Carbowax 6000), 3,6 mg titandioksid og 2,7 mg talk.

Eksempel VIII - Ampuller inneholdende polyfenolfraksjonen av grønn te. 10 mg av polyfenolfraksjon av grønn te blandes med 200 mg glukose og oppløses i vann for injiserbare preparater q.s. til 5 ml. Denne løsning (pH 4,5) kan deretter anvendes ved fremstilling av injiserbare ampuller som skal fremstilles ved konvensjonelle teknikker.

Referanser

1 - Zhao B. et al., Cell Biophys. 14, 175, 1989

2 - Huang M-T. et al., Carcinogenesis 13, 947, 1992

3 - Conney A.H. et al., Prev. Med. 21, 361, 1992

4 - Mukhtar H. et al., J. Invest. Dermatol. 102, 3, 1994

5 - Kono S. et al., Jpn. J. Cancer Res. 79, 1067, 1988

6 - Oguni I. et al., Agric. Biol. Chem. 52, 1879, 1988

7 - Kato I. et al., Jpn. J. Cancer Res. 81, 1101, 1990

8 - Kono S. et al., Prev. Med. 21, 526, 1992

9 - Maffei-Facino R. et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res. 44, 592, 1994

10 - Liviero L. et al., Fitoterapia LXV, 203, 1994

11 - Dujon B., in "Mitochondrial genetics and functions", Straton J.N. et al. (Eds.), Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1981

12 - De Flora S. et al-, Mutation Res. 214, 153, 1989.

Claims

1. Fremgangsmåte ved ekstråksjonen av polyfenolfraksjoner fra Camellia sinensis inneholdende ikke mer enn 0,2 vekt% koffein, hvilken fremgangsmåte omfatter: a) ekstraksjon av den vegetabilske biomasse med vann-alkohol eller vann-keton blandinger; b) total eller delvis fordamping av ekstraksjonsløsnings-middelet; c) suspensjon av resten i en vandig blanding av 30-60 volum% metanol; d) ekstraksjon av hydrometanolsuspensjon med klorinerte løsningsmidler e) filtrasjon av de uløselige rester og konsentrasjon av hydrornetano1fasen; f) alternativ acidifisering med organiske syrer; g) ekstraksjon av den konsentrerte hydrometanolfase og alternativ acidifisering med løsningsmidler valgt fra alifatiske estere, alkohol eller ketoner, forutsatt at de er ikke-blandbare med hydrometanol blandingen; h) ytterligere tilsats av et aromatisk eller alifatisk hydrokarbon etterfulgt av vasking med fortynnede vandige mineralsyrer; i) konsentrasjon av den vann-ikke-blandbare organiske fase og fortynning med klorinerte løsningsmidler; k) i fravær av trinnene f) og h), behandling med sulfongruppeinneholdende resiner i tørre alifatiske ketoner eller alkoholer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 hvori 40 - 90 volum%, fortrinnsvis 70 volum%, vandig aceton anvendes i trinn a).

3. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-2 hvori 50 volum% vandig metanol anvendes i trinn c).

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3 hvori metylenklorid anvendes i trinn d).

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4, hvori sitronsyre anvendes i nærvær av ammoniumcitrat i trinn f).

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5, hvori løsningsmidlene i trinn g) velges fra etylacetat, etylformat, metyletylketon, 1-butanol, tert-butanol, 2-butanol, fortrinnsvis etylacetat.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de ovenfornevnte krav, hvori toluen i en mengde på 5 volum% basert på det totale volum av den organiske fase og 1 volum% vandig svovelsyre anvendes i trinn h).

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de ovenfornevnte krav, hvori metylenklorid anvendes i trinn i).

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-8, omfattende trinnene a) til e), g), i) og k).

10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-8, omfattende trinnene a) til i).

11. Polyfonylfraksjoner av Camellia sinensis inneholdende ikke mer enn 0,2% koffein, hvilket erholdes ved fremgangsmåten ifølge krav 1-10.

12. Grønn te-polyfonylfraksjoner inneholdende 50-65% epigallokatekin- 3 -O-gallat, 13-20% epikatekin-3-O-gallat, 2-4 % epikatekin og 1,5-3% epigallokatekin og ikke mer enn 0,2 % koffein.

13. Farmasøytiske sammensetninger inneholdende polyfenolfraksjoner ifølge krav 11 eller 12 i blanding med en egnet bærer eller eksipient.

14. Farmasøytiske sammensetninger ifølge krav 13 i form av tabletter, gelatinkapsler, lukteposer, sirup, ampuller.

15. Farmasøytiske sammensetninger ifølge kravene 13 eller 14 ytterligere omfattende antracyklin eller cis-platina eller derivater derav, alternativt i en form som er egnet for sekvensiell eller separat administrasjon.

16. Kosmetiske sammensetninger inneholdende polyfenol-fraksjonene ifølge krav 11 eller 12 i blanding med egnede bærere eller eksipienter.

17. Diettsammensetninger inneholdende polyfenolfraksjoner ifølge kravene 11 eller 12 i blanding med egnede bærere eller eksipienter.

18. Anvendelse av polyfenolfraksjoner ifølge krav 11 eller 12 for fremstilling av medikamenter med differensielle cytotoksiske og antioksiderende aktiviteter.

19. Anvendelse av polyfenolfraksjoner ifølge krav 11 eller 12 ved fremstilling av medikamenter for behandlingen av tumorale former, kronisk-degenerative tilstander i det kardiovaskulære system, artrosiske tilstander, aterosklerose.