NO319793B1 - N-[2-hydroksy-3-(1-piperidinyl)propoksy]pyridin-1-oksid-3-karboksimidoylklorid og dets anvendelse til fremstilling av et farmasoytisk preparat, samt farmasoytisk preparat. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører et 0-(3-piperidino-2-hydroksy-l-propyl)hydroksymsyre halogenidderivat, anvendelse derav og de farmasøytiske produkter inneholdende dette derivat som aktiv bestanddel. Oppfinnelsen vedrører således N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)propoksy]pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylk!orid, dets stereoisomerer, så vel som deres syreaddisjonssalter. Oppfinnelsen kan anvendes ved behandling av insulinresistens.

0-(3-piperidino-2-hydroksy-l-propyl)hydroksymsyre halogenidderivater er allerede kjent fra europeisk patentskrift 0 417 210 Bl. Ifølge dette patentskrift fremviser disse forbindelser en selektiv beta-blokkerende virkning og er således egnet for behandling av diabetisk angiopati, mer spesifikt diabetisk retinopati og nefropati.

Ifølge PCT Publication WO 98/06400, er 0-(3-piperidino-2-hydroksy-l-propyl)hydroksymsyre halogenidderivatene og andre forbindelser med lignende struktur effektive ved beskyttelse og regenerering av vaskulære endoteliale celler og er således egnede aktive midler for behandling av sykdommer bevirket ved dysfunksjonen av endotelium.

Den chaperon-uttrykksøkende virkning av flere hydroksylaminderivater, blant dem O-(3-piperidino-2-hydroksy-l-propyl)hydroksymsyre halogenider, og anvendelse av disse forbindelser ved behandling av sykdommer forbundet med funksjoneringen av chaperon-systemet er kjent fra WO 97/16439. I denne patentsøknaden er 0-(3-piperidino-2-hydroksy-1 -propyl)-3-pyridyl hydroksymsyreklorid N-oksidderivater (blant andre) definert og angitt som nye produkter, men produksjonsprosedyren er imidlertid bare beskrevet for piperidin-N-oksid og for forbindelsen inneholdende N-oksidgrupper både i piperidin- og pyridinringene. Forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse er ikke nevnt i den ovennevnte patentsøknad.

Insulinresistens er en patologisk tilstand som blokkerer virkningene av insulin. Den er generelt assosiert med diabetes, selv om dens fremkomst også er mulig uavhengig. På grunn av insulinresistens behøver kroppen høyere og høyere konsentrasjoner av insulin for karbohydrat-, lipid- og proteinmetabolisme, som fører til en ekstremt høy konsentrasjon av insulin. En langvarig høy insulinkonsentrasjon er blitt vist å være en uavhengig kardio-cerebrovaskulær risikofaktor.

Reduksjonen av insulinresistens er essensiell i begge typer av diabetes: i tilfellet av diabetes type 2, er den til stede som en vesentlig etiologisk faktor, mens i tilfellet av diabetes type 1, bevirkes insulinresistens av glukosetoksisitet og også ettersom store mengder insulin tilført eksogent for terapeutiske formål.

Flere aktive midler er blitt tilveiebrakt for reduksjonen av insulinresistens. Blant disse er de mest signifikante insulin sensibilisatorproduktene, idet det best kjente middel av disse er troglitazon, et medlem av tiazolidin-diongruppen (A.R.Saltiel et al., Diabetes 45/12/1996 s. 1661 - 1669, og S. Kumar et al., Diabetologia 1996/39/6 s. 701 - 709). Den vesentlige virkning av denne forbindelsen er reduksjonen av insulinresistens ved å senke perifere insulinkonsentrasjoner både i basaltilstanden og etter glukosestimulasjon. Som et resultat forbedrer den karbohydratmetabolismen så vel som korrigerer et antall patologiske deviasjoner som oppstår som den sekundære virkning av høyt insulinnivå, som for eksempel hyperlipidemi og patologisk hemostase. Dens endelige positive virkning er reduksjonen av den kardiovaskulære risiko. En ulempe er imidlertid at den kan bevirke alvorlige, hovedsakelig patotoksiske bivirkninger og dens anvendelse er derfor begrenset og krever stor forsiktighet.

Under undersøkelser i området av 0-(3-piperidino-2-hydroksy-l-propyl)hydroksymsyrehalogenider er det blitt utført detaljert undersøkelse av maleinatet av 0-(3-piperidino-2-hydroksy-l-propyl)-3-pyridyn hydroksymsyrekloridet, kjent som bimoklomol og det er funnet at dets mest signifikante virkning er på de patologiske konsekvenser av kronisk nevropati: det forbedrer signifikant motorisk og sensoriske nerveledningshastighetsmangler i diabetes og påvirker også gunstig patologiske deviasjoner som resulterer fra autonom nevropati. Videre vil det både i dyreforsøk og i fase II tester på mennesker reduserer patologisk diabetisk urinalbuminutskilling og i dyreforsøkene reduserer det patologiske histologiske og elektrofysiologiske endringer som resulterer fra diabetisk retinopati. I reduksjonen av insulinresistens var imidlertid bimoklomol ikke effektivt.

Ingen medisinske produkter er hittil blitt tilgjengelige som kunne redusere insulinresistens og samtidig effektivt helbrede deviasjoner som resulterer fra alle tre kroniske diabetiske komplikasjoner.

I en leting etter egnede aktive materialer ble N-oksidderivater av bimoklomol testet for biologisk aktivitet. I en foreløpig test ble effektiviteten av de tre N-oksidderivater av bimoklomol på motor- og sensorneuropati i STZ diabetiske Wistar-rotter undersøkt. Effektiviteten av de tre bimoklomol N-oksidderivater til å forbedre den perifere motor-og sensor nerveledningshastighetsmangel bevirket ved streptozotokin-indusert diabetes ble bestemt ved bruken av metoden beskrevet detaljert i forsøk 2. Resultatene er oppsummert i den følgende tabell.

Som det ses fra de ovennevnte resultater er pyridin N-oksidderivatet av bimoklomol ekvivalent med bimoklomol mens de andre to N-oksidderivater har signifikant svakere virkning på motor- og sensorneuropatien. Basert på denne erfaring ble undersøkelsene fortsatt med pyridin N-oksidderivatet av bimoklomol, nemlig N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-l -propoksyj-pyridin-1 -oksid-3-karboksimidoylklorid.

Undersøkelsene ga det uventede resultat at N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid reduserer perifer insulinresistens i tillegg til å fremvise en virkning lik eller i noen tilfeller større enn virkningen av bimoklomol i behandlingen av de ovennevnte tre diabetiske hovedkomplikasjoner. På grunn av denne egenskap er forbindelsene egnet for behandling av kroniske diabeteskomplikasjoner, særlig av retinopati, neuropati og nefropati og for den samtidige reduksjon av perifer insulinresistens, men den er også egnet for behandling av ikke-diabetisk patologisk insulinresistens og hvilke som helst patologiske tilstander relatert dertil.

De gunstige biologiske egenskaper av N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)propoksy]pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid ble påvist ved hjelp av de følgende forsøk. For disse testene ble maleinatet av N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)propoksy]pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid eller maleinatet av den egnede optisk aktive forbindelse anvendt som testforbindelser. I beskrivelsen av forsøkene er maleinatet av den racemiske forbindelse referert til som forbindelse A, mens maleatet av den optisk aktive stereoisomer hele tiden er angitt spesifikt.

Foreliggende oppfinnelse omfatter N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-1 -oksid-3-karboksimidoylklorid, dets stereoisomerer og syreaddisjonssaltene derav.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid, dets stereoisomerer og syreaddisjonssaltene derav for fremstilling av et farmasøytisk preparat for patologisk insulinresistens, og for behandling av patologiske tilstander assosiert dermed.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid, dets stereoisomerer og syreaddisjonssaltene derav for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av patologisk insulinresistens, og behandling av patologiske tilstander assosiert dermed, ved samtidig behandling og forebygging av diabetesinduserte kroniske komplikasjoner, spesielt retinopati, neuropati og nefropati og/eller med samtidig økende patologisk nedsatt periferisk neuroregenerasjon forårsaket av diabetes.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også et farmasøytisk preparat inneholdende N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid eller en av dets stereoisomerer eller et syreaddisjonssalt derav som aktiv bestanddel i blanding med minst en vanlig anvendt, farmasøytisk, tålbar hjelpesubstans og bærer.

Forsøk 1

Virkning av behandling med forbindelse A og bimoklomol på

karbohydratmetabolismen i fete, insulinresistente, hyperinsulinemiske Zucker fa/fa rotter med nedsatt glukosetoleranse ved å følge en 2-måneders behandling.

Materialer og metoder:

I forsøkene ble det anvendt såkalte Zucker fa/fa rotter (Charles River Laboratories Inc.). I monozygotiske dyr resulterer fedme, insulinresistens, høyt blodinsulinnivå, nedsatt glukosetoleranse og hypertriglyceridaemi fra hypothalamisk leptin reseptormutasjon. På grunn av de ovennevnte egenskaper er dette en akseptert modell på tidlig type 2 diabetes.

Dyrene ble anbrakt i individuelle metaboliske bur i 24 timer ved begynnelsen av undersøkelsen og etter 1 eller 2 måneders behandling i 24 timer for urinoppsamling.

Dyrene ble tilført enten testsubstansene eller fysiologisk saltoppløsning ved tvangsforing for kontroll en gang daglig mellom uker 14 - 22.

Biokjemiske parametre av blodet og urinen ble målt ved hjelp av en Kodak "Ectachem" 700 automatisk analysator. Det totale proteinnivå i urinen ble bestemt spektrofotometrisk ved bruk av Bradford farging (Hitachi U-3200) ved 59 nm. Insulinkonsentrasjonen i serum ble bestemt ved hjelp av RIA-metoden ved bruk av rotte anti-insulin antistoffer.

Systolisk, diastolisk blodtrykk og hjerte virksomheten ble målt ukentlig på halene av rottene (såkalt hale mansjettmetoden) ved hjelp av en "Letica" 200 automatisk analysator. Etter to måneders behandling ble nivået av glukosetoleranse bestemt ved hjelp av denne intraperitoneale glukosetoleransetest (2 g/kg ip).

Resultater:

Bimoklomol tilført i daglige doser på 20 mg/kg p.os reduserte signifikant nivået av fastende blodglukose, men påvirket ikke den fastende insulinkonsentrasjonen.

I sammenligning med tidligere data var det uventede resultat at forbindelsen A tilført i daglige doser på 20 mg/kg p. os reduserte signifikant både fastende blodglukose og insulinkonsentrasjoner, de sistnevnte med omtrent 50%. Resultatene er gitt i Tabell 1 og Figur 1.

Under forløpet av den intraperitoneale glukose toleransetest, påvirket verken bimoklomol eller forbindelse A arealene under kurven for blodglukose (AUC). I tilfellet av AUC for insulin er der imidlertid en forskjell mellom de to forbindelser: bimoklomol hadde ingen virkning, mens forbindelse A reduserte den signifikant, til det samme nivå som mager, kontroll. Resultatene er gitt i Tabell 2 og Figur 2.

Tabellene inneholder verdiene for arealene under kurven (AUC) mellom 0 til 60 minutter.

Oppsummering:

Forbindelse A reduserer signifikant perifer insulinresistens, mens bimoklomol ikke gjør dette.

Forsøk 2

Virkning av behandling med forbindelse A og bimoklomol på de patologiske deviasjoner som resulterer fra periferal neuropati i STZ-diabetiske Wistar-rotter ved å følge en 1-måneds behandling.

Materialer og metoder:

I forsøkene ble det anvendt Wistar hannrotter (Charles River Laboratories Inc.). Ved begynnelsen av forsøket var rottenes vekt 340 - 370 g. Diabetes ble indusert ved den intravenøse tilførsel av en enkelt 45 mg/kg dose av streptozotokin (STZ, Sigma, St. Louis, MO) oppløst i fysiologisk saltoppløsning. Utviklingen av diabetes ble kontrollert etter dag 1 ved hjelp av en blodglukosetest som var følsom for en verdi over 15 mmol/1.

Test- og referansesubstanser ble tilført p.os til dyrene en gang daglig.

For bestemmelsen av nerveledningshastigheten (NCV) ble metoden til Stanley, modifisert av De Konig og Gispen, anvendt. Dyrene ble bedøvet med den samtidige tilførsel av Hyponorm (1 mg/kg ip., Janssen, Tilburg, Danmark), fluanison (10 mg/ml) og fentanylcitrat (0,2 mg/ml). Deretter ble den venstre ischiadicus og tibialnerven stimulert ved standardpunkter. Supramaksimal stimulus (kvadratisk impuls, 0,03 ms) ble anvendt med en platina nål elektrode, ved hjelp av en Nihon-Kohden (modell SEN-1104, Japan) stimulator. Elektromyogrammet (EMG) overført fra fotsålemusklene og intensivert ved hjelp av en myograf (Elema-Schonander, Stockholm, Sverige) ble analysert videre ved hjelp av Matlab for Windows (Mathwork Inc., UK) programmet. Graden av NCV skade bevirket ved diabetes ble uttrykt i m/s. Effektiviteten av behandlingen ble sammenlignet med denne på prosentbasis (%). De statistiske beregninger ble foretatt ved hjelp av uparet t-test eller enkeltkriterium ANOVA test (sammen med Newman-Keuls post hoc test). (Graphpad Instat, San Diego, CA).

Resultater:

Bimoklomol tilført en gang daglig i en dose på 20 mg/kg og forbindelse A tilført en gang daglig i en dose på 5 mg/kg forbedret signifikant motor (MNCV) og sensor (SNCV) nerveledningshastigheter i den samme signifikante grad i diabetiske dyr. En økning i dosen av forbindelse A over 10 mg/kg økte ikke virkningen. Resultatene er gitt i Tabell 3.

Forsøk 3

Virkningen av behandling med forbindelse A og bimoklomol på de patologiske deviasjoner som resulterer fra diabetisk autonom neuropati i STZ-diabetiske Wistar rotter, etter 1 måneds behandling.

Materialer og metoder:

I forsøkene ble det anvendt Wistar hannrotter (Charles River Laboratories Inc.), ved begynnelsen av forsøket var deres vekter 340 - 370 g. Diabetes ble indusert ved intravenøs tilførsel av en enkel 45 mg/kg dose av streptozotokin (STZ, Sigma, St. Louis, MO) oppløst i fysiologisk saltoppløsning. Utviklingen av diabetes ble kontrollert etter dag 1 ved hjelp av en blodglukosetest, følsom for en verdi over 15 mmol/1.

Test- og referansesubstanser ble tilført p.os til dyrene en gang daglig.

Forsøkene ble utført under bedøvelse oppnådd ved tilførsel av 60 mg/kg ip. pentobarbital natrium (Nembutal, Sanofi, Phylaxia). Deretter ble et intratrakealt rør eller polyetylenkanyle innført i femoral arteri og vene. Arteriekateteret ble forbundet til en trykkomformer for samtidig måling av systolisk og diastolisk blodtrykk (online automatisk måling og overføringssystem, med et Haemosys computer program). Etter 20 minutter ekvilibrasjonsmetode ble de følgende substanser tilført intravenøst: Noradrenalin, 5 ug/kg iv. - Isoproterenol 0,4 ug/kg iv. - N. vagus stimulering (2 V, varighet: 500 usek., forsinkelse: 1 msek.). Virkningene av substansene ble overvåket i 10 minutter.

Resultater:

Autonom neuropati er en av de viktigste årsaker til plutselig hjertedød både i tilfellet med diabetes og andre sykdommer (for eksempel leversykdommer). Alle produktene som effektivt kan redusere patologiske deviasjoner som resulterer fra autonom neuropati er derfor meget viktige.

I forsøkene reduserte signifikant en daglig 20 mg/kg enkeltdose av enten bimoklomol eller forbindelse A signifikant flere patologiske deviasjoner som resulterte fra autonom neuropati.

En oppsummering og sammenligning av resultatene er vist i Tabell 4.

Den doble pil i Tabellen indikerer at testsubstansen er statistisk mer effektiv enn den andre.

Forsøk 4

Virkningen av behandlingen med forbindelse A og bimoklomol på de patologiske histologiske endringer bevirket ved tidlig diabetisk retinopati i STZ-diabetiske Wistar rotter, etter 1 måneds behandling.

Materialer og metoder:

I forsøkene ble det anvendt Wistar hannrotter (Charles River Laboratories Inc.), ved begynnelsen av forsøket var deres vekter 340 - 370 g. Diabetes ble indusert ved intravenøs tilførsel av en enkelt 45 mg/kg dose av streptozotokin (STZ, Sigma, St. Louis, MO) oppløst i fysiologisk saltoppløsning. Utviklingen av diabetes ble kontrollert etter dag 1 ved hjelp av en blodglukosetest som var følsom for en verdi over 15 mmol/1.

Test og referansesubstanser ble tilført p.os til dyrene en gang daglig.

Etter bedøvelse ("Calypsovet, 125 mg/kg. Ip., Richter Rt. Ungarn), ble øynene enukleert og fiksert i 4% formaldehyd oppløst i en fosfatbuffer (pH: 7,4).

Deretter ble øynene innleiret i parafin (Medim DDM P800, innleiringssenter: Lignifer L-120-92-014, innfarging: Shandon Eliott, Microtome: Leica SM 2000 R, Microscope: Jenaval Karl Zeiss Jena). Flere 6 mikrometer snitt av øynene ble fremstilt og hematoksylin/eosin (Fluka) og PAS (perjodsyre-Schiff, Fluka) farging ble anvendt. Den lysmikroskopiske evaluering ble utført ved en forstørrelse på 40x og 100x. Fotografier og diaspositiver ble fremstilt av representative prøver.

Den histologiske evaluering ble utført på kodede prøver, idet gruppeoppdelingen var ukjent for undersøkeren. Patologiske deviasjoner av retina ble gradert på en skala fra 0 til 20, mens tilsvarende i linsen på en skala på 0 til 3.

De statistiske beregninger ble foretatt med statistika 4,5 (SatSoft, USA) programmet. Den gitte verdi for negative tilfeller var 0,1. En "Box and Whisker" grafisk fremstilling ble også fremstilt.

For hver gruppe i forsøket ble midlere ± SE (Standard feil) verdier beregnet og sammenligningen ble foretatt ved hjelp av en ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test (Graphpad Instat, San Diego, CA).

Resultater:

En daglig 5 mg/kg dose av forbindelse A og en daglig enkelt 20 mg/kg dose av bimoklomol forbedret signifikant de diabetiske retinopati-induserte patologiske histologiske endringer etter 1 måneds behandling. Av disse to forbindelser var forbindelse A statistisk mer effektiv i sammenligning med de diabetiske, ikke-behandlede dyr. Resultatene er gitt i Tabell 5.

Forsøk 5

Virkningen av behandling med forbindelse A og bimoklomol på patologisk urinproteintap bevirket ved diabetisk neuropati i STZ-diabetiske Wistar rotter etter 1 måneds behandling.

Materialer og metoder:

I forsøkene ble det anvendt Wistar hannrotter (Charles River Laboratories Inc.), idet deres vekter ved begynnelsen av forsøket var 340 - 370 g. Diabetes ble indusert ved intravenøs tilførsel av en enkel 45 mg/kg dose av streptozotokin (STZ, Sigma, St. Louis, MO) oppløst i fysiologisk saltoppløsning. Utviklingen av diabetes ble kontrollert etter dag 1 ved hjelp av en blodglukosetest, som var følsom for en verdi over 15 mmol/1.

Test- og referansesubstanser ble tilført p.os til dyrene en gang daglig.

For den 24 timers perioden med urinoppsamling ble dyrene anbrakt i individuelle metaboliske bur. Under denne periode ble de tilført vann ad libitum, men ikke noe føde. Den siste foranstaltning var nødvendig for å hindre mulig forurensning av proteininnholdet i føden. Urin ble samlet i kalibrerte glassbeholdere hvori Thymol krystall (Reanal 3135-1-08-38) var anbrakt for å hindre bakterieforurensningen.

Før måling ble urinprøvene sentrifugert (2500 rpm) og filtrert gjennom et papirfllter (Whatman 1). Om nødvendig ble de lagret ved -20°C inntil måling.

Det totale proteininnholdet i urinen ble bestemt ved hjelp av Bradford fargemetode (Sigma B-6916, St. Louis, MO) og fargeintensiteten ble detektert ved hjelp av spektrofotometri (Hitachi-U-3200).

Resultater:

Bimoklomol, tilført i en daglig dose på 20 mg/kg reduserte signifikant STZ-diabetesindusert forhøyet urinproteintap. Forbindelse A, tilført i en daglig enkelt dose på 10 mg/kg, reduserte ikke signifikant proteintapet. (+) enantiomeren av forbindelse A, tilført i en daglig enkelt dose på 5 mg/kg reduserte imidlertid signifikant det diabetiske proteintap. Resultatene er gitt i Tabell 6.

Forsøk 6

Virkningen av forbindelse A og dens (+) og (-) enantiomerer på patologiske endringer av periferal neuropati i STZ-diabetiske Wistar rotter etter 1 måneds behandling.

Materialer og metoder:

Forsøksdyr og alle de anvendte metoder er de samme som beskrevet i Forsøk 2.

Resultater:

Forbindelse A i en enkelt dose på 10 mg/kg og forbindelse A(+) i en enkelt daglig dose på 5 mg/kg var like aktive og forbedret begge signifikant defektiv motor (MNCV) og sensor (SNCV) nerveledningshastighetsmangler i diabetiske dyr. I motsetning til dette hadde forbindelse A(-) ikke signifikant forbedrende virkning på noen av parameterne. Resultater er vist i Tabell 7.

Forsøk 7

Virkningene av forbindelse A og dens A(+) og A(-) enantiomerer på patologiske histologiske endringer av tidlig diabetisk retinopati i STZ-diabetiske rotter etter 2 måneders behandling.

Materialer og metoder:

Forsøksdyrene og alle anvendte metoder er de samme som beskrevet i Forsøk 4.

Resultater:

A(+) enantiomeren i en enkelt daglig dose på 5 mg/kg forbedret signifikant både lentikulære og retinale patologiske histologiske endringer bevirket av diabetisk retinopati etter to måneders behandling, mens virkningen av forbindelse A i en enkelt daglig dose på 10 mg/kg ikke var signifikant og A(-) enantiomeren i en enkelt daglig dose på S mg/kg ikke var effektiv. Med hensyn til retinale histologiske endringer alene, var både forbindelse A og dens A(+) enantiomer effektive mens virkningen av A(-) enantiomeren ikke var signifikant. Resultatene er vist i Tabell 8.

Forsøk 8

Virkningene av A(+) og A(-) enantiomerer på in vivo insulinavhengig glukoseopptak i diettindusert insulinresistent dyremodell.

Materialer og metoder:

I forsøkene ble det anvendt Wistar hannrotter (Charles River Laboratories Inc.) med en initial kroppsvekt på 300 - 350 g.

Insulinresistens ble indusert ved hjelp av diettmanipulasjon: dyrene ble tilført en høy fett (HF) diett i 3 uker. I HF-dietten var andelen av mettede fettstoffer dominant og ga 70% av det totale daglige kaloriinntak. A(+) og A(-) enantiomerene ble tilført en gang daglig i forebyggende tilførsel i en dose på 20 mg/kg/dag.

Ved slutten av den 3 ukers behandling ble de følgende parametre undersøkt: 1. karbohydrat- og lipidparametere fra serum og 2. in vivo insulinmediert glukoseopptak ved hjelp av den euglykemiske glukose klemmemetode som for tiden er den mest nøyaktige metode for kvantitativ bestemmelse av glukoseopptak (DeFronzo et al., American Journal of Physiology, 1979/237/E214-223 sider). Kort sagt: den fastende blodglukosekonsentrasjonen i forskjellige dyregrupper må være identisk. Forsøk ble gjennomført i bevisste, fritt bevegelige, kronisk kanylerte rotter: først ble en insulininfusjon (6,4 mU/kg/min) igangsatt, etterfulgt av en parallelt gjennomført kontinuerlig glukoseinfusjon for å opprettholde blodglukosekonsentrasjonen i det euglykemiske området. Etter stabilisasjon ble mengden av infusert glukose målt i en 90 min. periode (glukoseinfusjonstakt = GIR, mg/kg/min.) som er den kvantitative parameter for insulinsensitivitet.

Resultater:

A(+) og A(-) enantiomerer i en daglig dose på 20 mg/kg/min. påvirket ikke kroppsvekten og fødeinntaket og de fastende blodglukosenivåer i rottene.

I motsetning til dette normaliserte begge forbindelser HF-diett indusert forhøyet fastende insulin- og triglyceridkonsentrasjoner og minsket signifikant også muskeltriglyceridinnholdet. Den euglykemiske glukose klemmetest viste at HF-dietten signifikant undertrykket in vivo insulinmediert glukoseopptak: kontroll: 26,7 ± 0,68 mg/kg/min., HF diett: 15,0 ± 0,39 mg/kg/min.

Dette undertrykte insulinmedierte glukoseopptak økes av begge enantiomerer: HF+ A(+): 20,5 + 0,89 mg/kg/min. og HF+ A(-): 19,7 + 1,38 mg/kg/min. (en signifikant økning i begge tilfeller i et nivå med p<0,01).

Ifølge disse resultater økte begge enantiomerer det insulin-medierte glukoseopptak som viser fra et nytt perspektiv den insulinresistens-reduserende virkning av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Forsøk 9

Den antidiabetiske aktivitet av A(+) enantiomer i Zucker diabetiske fete rotter etter kronisk tilførsel.

Materialer og Metoder:

En genetisk diabetisk dyremodell ble valgt og Zucker diabetiske fete (ZDF) rotter ble anvendt i forsøkene. Denne modell er den diabetiske variant av den insulin-resistente, fete, men ikke-diabetiske Zucker fa/fa dyremodell (se Forsøk 1). I ZDF rottene utviklet seg diabetes i en alder av 6 til 8 uker foregått av en insulinresistent fase.

Virkningen av A(+) enantiomeren ble undersøkt i en behandling med en dose på 2 x 20 mg/kg/dag igangsatt i den ikke-diabetiske fase, i en alder av 7 uker og ble fortsatt i 6 uker.

Kliniske kjemiparametere ble målt ved hjelp av standardmetoder.

Serum insulinkonsentrasjonene ble målt ved hjelp av en nylig utviklet metode (ELISA metode, DRG International, Inc., USA).

Resultater:

Det er i dette forsøk som et nytt resultat påvist at A(+) enantiomeren har en sterk antidiabetisk aktivitet i diabetiske dyr.

Resultater oppnådd etter 3 og 5 ukers behandling er vist i Tabell 9.

Selv om behandlingen med A(+) enantiomeren ikke normaliserte blodglukosekonsentrasjoner, gir de kombinerte virkninger av sterk antidiabetisk aktivitet og den tidligere identifiserte signifikante helbredende effektivitet på kroniske diabetiske komplikasjoner denne forbindelse en enestående karakter.

Det terapeutiske indikasjonsområdet for A(+) enantiomeren kan signifikant utvides på basis av denne nye kombinerte effektivitet.

Ytterligere forsøk har ført til den konklusjon at forbindelsene ifølge oppfinnelsen, i tillegg til deres effektivitet på patologiske komplikasjoner av diabetes er nyttige ved behandlingen av andre skader på perifere nerver bevirket av diabetes. Denne konklusjonen understøttes av resultatene i det følgende nevroregenerasjonsforsøk.

Forsøk 10

Den terapeutiske virkning av forbindelse A og A(+) enantiomeren på nevroregenerasjon i STZ-diabetiske Wistar rotter.

Materialer og metoder:

Forsøkene ble gjennomført på Wistar rotter med en kroppsvekt på 320 - 350 g. Diabetes ble indusert og kontrollert som beskrevet i Forsøk 2. I forsøksdyrene som hadde vært diabetiske i 3 uker, ble venstre nervus ischidiacus skadet ved frysing og den høyre side ble anvendt som ikke-skadet kontroll. Regenerasjon ble iakttatt ved overvåking av signalene av flexor refleks, fremkalt ved irritasjon av sålen som er arealer under kurven (AUC) av elektromyogrammet overført fra den fremre tibialmuskel. For stimulasjon og påvisning ble systemet beskrevet i Forsøk 2, anvendt.

Enkle daglige doser på 10 mg/kg av forbindelse A og 5 mg/kg av A(+) enantiomeren ble tilført i 5 uker etter skaden påført ved frysing.

Resultater:

Ved slutten av den 3 ukers periode med diabetes, før skaden ved frysing, utviklet det seg en sensomevropati og bevirket en 23 - 25% minsking i AUC på begge ben. Ingen respons ble iakttatt i 2 uker etter skaden ved frysing. Graden av neuroregenerasjon var 63% etter den 5. uke. Regenerasjonen ble forsterket til 73% ved hjelp av forbindelse A, A(+) enantiomeren var effektiv i en grad på 93%. Neuroregenerasjoner på 83% og bare 44% av de ikke-fryste nerver, ble iakttatt som et resultat av behandling med A(+) enantiomer henholdsvis forbindelse A. Følgelig har A(+) enantiomeren en sterk neuroregenerativ virkning.

N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid kan fremstilles ved hjelp av den følgende prosedyre som ikke er kjent fra tidligere.

Ifølge oksidasjonsmetoden beskrevet i WO 97/16349, kan et derivat oksidert på nitrogenatomene i begge ringer, eller med mindre reagens, et derivat oksidert på den alicykliske ring, fremstilles fraO-(3-pipeirdino-2-hydroksy-l-propyl)-3-pyridin hydroksymsyreklorid, ettersom det alicykliske nitrogenatom foretrekkes i oksidasjonsreaksjonen.Regioselektiviteten ved oksidasjonen måtte rettes mot pyridinringen for produksjonen av forbindelsen ifølge oppfinnelsen, og prosedyren ble derfor modifisert. Det vesentlige modifikasjonspunkt er at for å lette den selektive oksidasjon av pyridinringen, utføres persyreoksidasjonen i nærvær av en sterk syre, foretrukket metansulfonsyrer, som protonerer det alicykliske nitrogen og hindrer således dets oksidasjon. Oksidasjonen av pyridinet blir derfor primær. Som et oksidasjonsmiddel kan det anvendes en hvilken som helst type persyre, foretrukket pereddiksyre.

De optisk aktive enantiomerer av forbindelsen ifølge oppfinnelsen fremstilles ved å anvende den passende optisk aktive 0-(3-piperidino-2-hydroksy-l-propyl)-3-pyridin hydroksymsyreklorid enantiomer som utgangsmateriale, som kan fremstilles for eksempel ifølge EP 0 417 210 Bl, ved å resolvere den racemiske forbindelse. Under reaksjonsforløpet skades ikke chiraliteten av molekylet, og det resulterende produkt har den samme optiske renhet som utgangssubstansen.

Om ønsket kan det oppnådde N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid eller en av dets optisk aktive enantiomerer omdannes til et syreaddisjonssalt med mineralsyre eller organisk syre, ved hjelp av kjente metoder.

N-[2-hydroksy-3-(l -piperidinyl)-propoksy]-pyridin-1 -oksid-3-karboksimidoylklorid, dets optisk aktive (+) eller (-) enantiomer, en blanding av enantiomerer i et hvilket som helst forhold, og den racemiske forbindelse og videre syreaddisjonssaltene dannet fra hvilke som helst av de ovennevnte forbindelser med mineralsyre eller organisk syre utgjøre gjenstander ifølge den foreliggende oppfinnelse. Alle mulige geometriske isomerformer av N-[2-hydroksy-3-( 1 -piperidinyl)-propoksy]-pyridin-1 -oksid-3-karboksimidoylklorid hører til innenfor oppfinnelsens ramme. Betegnelsen "stereoisomerene av N-[2-hydroksy-3-(l -piperidinyl)-propoksy]-pyridin-1 -oksid-3-karboksimidoylklorid" refererer til alle mulige optiske og geometriske isomerer av forbindelsen.

Disse forbindelser kan anvendes for behandling av patologisk insulinresistens og for behandling og forebygging av patologiske tilstander assosiert dermed.

Spesielt kan disse forbindelser anvendes for samtidig behandling eller forebygging av kroniske diabetesinduserte komplikasjoner, spesielt retinopati, neuropati og nefropati og av patologisk insulinresistens og de patologiske tilstander assosiert dermed.

Videre kan oppfinnelsen anvende N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid eller dets stereoisomerer eller syreaddisjonssalter derav ved behandlingen av patologisk insulinresistens og patologiske tilstander assosiert dermed og en samtidig økning av en diabetesindusert patologisk nedsatt periferisk neuroregenerasj on.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan anvendes både innen human- og veterinærterapi.

Den muliggjør en fremgangsmåte for behandling av patologisk insulinresistens og behandling og forebygging av patologiske tilstander assosiert dermed, hvorunder pasientene tilføres N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid eller en av dets stereoisomerer i form av base eller syreaddisjonssalt. Den foretrukne fremgangsmåten er når N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid eller en av dets stereoisomerer, eller et syreaddisjonssalt derav, tilføres en pasient som lider av diabetisk retinopati, neuropati eller nefropati.

Ifølge en ytterligere, spesiell fremgangsmåte blir N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyi)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid eller en av dets stereoisomerer eller syreaddisjonssalt derav tilført en pasient i tilfellet med patologisk nedsettelse av neuroregenerasj onen bevirket av diabetes.

Dosen av forbindelsene avhenger av pasientens tilstand og sykdommen, og den daglige dose er 0,1 - 400 mg/kg, foretrukket 0,1-100 mg/kg. Ved humanterapi er den orale dose foretrukket 10 - 300 mg, i tilfellet med rektal tilførsel 1-15 mg, mens i tilfellet med parenteral tilførsel er dosen 1 - 15 mg for en voksen pasient. Disse doser tilføres foretrukket i enhets doseformer som kan være oppdelt i 2 - 3 mindre doser pr. dag i visse tilfeller, spesielt ved oral behandling.

Foretrukket anvendes stereoisomeren av den racemiske forbindelse, mest foretrukket (+) enantiomeren. I dette tilfellet er en mindre mengde aktiv bestanddel innenfor de ovennevnte grenser tilstrekkelig for behandlingen.

Farmasøytiske preparater egnet for behandlingen er også oppfinnelsesgjenstand. Disse farmasøytiske preparater inneholder i tillegg til de vanlige hjelpestoffer og bærere, N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid eller en av dets stereoisomerer, eller et syreaddisjonssalt av en av de ovennevnte forbindelser, som aktive bestanddeler.

De farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen kan fremstilles i form av et fast eller flytende preparat generelt anvendt innenfor human- eller veterinærterapien. Enkle eller overtrukne tabletter, dragerte tabletter, granulater, kapsler, oppløsninger eller siruper kan fremstilles for oral tilførsel, stikkpiller for rektal tilførsel og frysetørket eller ikke-frysetørket injeksjons- eller infusjonsoppløsninger for parenteral tilførsel. Disse kan fremstilles ved hjelp av de vanlige metoder. Produktene for oral anvendelse kan inneholde fyllstoffer som for eksempel mikrokrystallinsk cellulose, stivelse eller laktose, smøremidler som for eksempel stearinsyre eller magnesiumstearat, overtrekksmaterialer som sukker, filmdannende materialer som for eksempel hydroksymetylcellulose, aromastoffer eller søtningsmidler som for eksempel metylparaben eller sakkarin, eller fargesubstanser. Stikkpillene kan inneholde kakaosmør eller polyetylenglykol som hjelpestoff. De parenterale produkter kan i tillegg til den effektive substans inneholde saltoppløsning eller i visse tilfeller dispergerende og fuktighetssubstanser som for eksempel propylenglykol.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved hjelp av de følgende eksempler:

Eksempel 1

Fremstilling av N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid (Z)-2-butendioat (1:1) 40,4 g (0,136 mol) N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-3-pyridin-karboksimidoylklorid ble oppløst i blandingen av 238 ml iseddik og 13,0 g (0,136 mol) metansulfonsyre. 61,5 ml (0,591 mol) 30% hydrogenperoksidoppløsning ble tilsatt ved 60°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60°C i 3,5 - 4 timer. Oppløsningen ble avkjølt til 10°C og deretter ble 91 ml 0,5 M Na2S205 oppløsning tilsatt dertil. 315 ml vann-eddiksyreblanding ble avdestillert fra oppløsningen, 250 ml 4N NaOH oppløsning ble tilsatt til resten (pH = 10,55) og utristet med kloroform. Kloroformfasen ble vasket med vann, tørket, behandlet med trekull og deretter inndampet. Vann ble tilsatt til resten og denne ble ekstrahert med isopropyleter og deretter med kloroform. Kloroformfasen ble tørket, behandlet med trekull, filtrert og inndampet. Resten ble oppløst i aceton og omdannet til salt med maleinsyre. Utfellingen ble filtrert, vasket med aceton og tørket. Produktet ble krystallisert fra kokende etanol.

Utbytte: 20 g (35%)

Smeltepunkt: 150,5 - 154,5°C

'H-NMR (løsningsmiddel: DMSO; referanse: DMSO; v = 300 MHz) [ppm]: 8,55 (s, 1H, 2-pyridin); 8,35 (d, 1H, 6-pyridin); 7,68 (d, 1H, 4-pyridin); 7,55 (m, 1H, 5-pyridin); 6,00 (s, 2H, CH=CH); 4,23 - 4,48 (m, 3H, CH-OH og NOCH2); 2,95 - 3,50 (m, 6H, 3 x NCH2); 1,20 - 1,90 (m, 6H, piperidin: 3 x CH2).

<13>C-NMR (løsningsmiddel: DMSO; referanse: DMSO; v = 300 MHz) [ppm]: 167,6 (2C, 2 COOH); 141,0 (2-pyridin); 136,8 (6-pyridin); 136,4 (2C, CH=CH); 133,4 (CC1); 131,9 (3-pyridin); 127,2 (4-pyridin); 123,6 (5-pyridin); 77,9 (NOCH2); 63,6 (CH2N); 58,3 (CHOH); 52,0 - 55,0 (2C, piperidin: 2 x NCH2); 22,6 og 21,7 (3C, piperidin: 3 x CH2).

Eksempel 2

Fremstilling av (+)-/R/-N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-1 -oksid-3-karboksimidoylklorid (Z)-2-butendioat (1:1).

Prosedyren beskrevet i Eksempel 1 ble gjentatt med den forskjell at i stedet for det racemiske N- [2-hydroksy-3 -(1 -piperidinyl)-propoksy] - 3 -pyridin-karboksimidoylklorid ble dets R enantiomer anvendt. Den rene form av forbindelsen ble isolert fra den rå base ved krystallisasjon med heksan.

Utbytte: 31%

Smp.: 91 - 93°C

IR (KBr, cm"<1>): 3167 (br); 2840; 2710; 1575; 1560; 1480; 1443 (br); 1293(s); 1279 (s); 1093; 1053; 1043; 1023 (s); 834 (s); 810; 688.

Om ønsket kan maleatsaltet også fremstilles fra den rå basen i acetonoppløsning som beskrevet i Eksempel 1.

Utbytte: 33%

Smp.: 132,0 - 133,0°C.

Enantiomerforhold: 98/2 (HPLC måling på en Chiral AGP 100 x 4 mm kolonne)

H-NMR og,<J>C-NMR; de samme som spektra av den racemiske forbindelse.

Eksempel 3

Fremstilling av (-)-/S/-N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-1 -oksid-3-karboksimidoylklorid (Z)-2-butendioat (1:1).

Prosedyren i Eksempel 1 ble fulgt, med den forskjell at i stedet for det racemiske N-[2-hydroksy-3-(l -piperidinyl)-propoksy]-3-pyridin-karboksimidoylklorid ble S-enantiomeren anvendt.

Utbytte: 34%

Smp.: 132,0 - 133,0°C.

Enantiomerforhold: 98/2 (HPLC måling på en Chiral AGP 100 x 4 mm kolonne).

'H-NMR og <13>C-NMR: de samme som spektra av den racemiske forbindelse.

Eksempel 4

Den finmalte aktive bestanddel ble blandet med hjelpestoffene, blandingen ble homogenisert og granulert. Granulatet ble så komprimert til tabletter.

Eksempel 5

Kapsel

Den aktive bestanddel ble blandet med hjelpestoffene, blandingen ble homogenisert og fylt i gelatinkapsler.

Eksempel 6

Dragé

Den aktive bestanddel og polyvinylpyrrolidonet ble oppløst i etanol. En blanding av laktose og potetstivelsen ble fuktet jevnt med den granulerende oppløsning av den aktive bestanddel. Etter filtrering ble granulatet tørket ved 50°C og siktet. Magnesiumstearatet ble tilsatt og blandingen presset til tablettform som så ble overtrukket med et sukkerbelegg og polert ved hjelp av bivoks.

Eksempel 7

Stikkpiller

Kakaosmøret og stikkpillemassen ble oppvarmet til 40°C og den aktive bestanddel ble dispergert i den smeltede blanding og deretter ble massen fylt i stikkpilleformer.

Eksempel 8

Oppløsning

Eksempel 9 Inj eksj onsoppløsning

Oppløsningen ble helt i 2 ml hetteglass som deretter ble forseglet.

Eksempel 10

Infusjonsopp løsning

500 ml infusjonsoppløsning ble fremstilt med den følgende sammensetning:

Claims (4)

1. N-[2-hydroksy-3-( 1 -piperidinyl)-propoksy]-pyridin-1 -oksid-3-karboksimidoylklorid, dets stereoisomerer og syreaddisjonssaltene derav.

2. Anvendelse av N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid, dets stereoisomerer og syreaddisjonssaltene derav for fremstilling av et farmasøytisk preparat for patologisk insulinresistens, og for behandling av patologiske tilstander assosiert dermed.

3. Anvendelse av N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-1 -oksid-3-karboksimidoylklorid, dets stereoisomerer og syreaddisjonssaltene derav for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av patologisk insulinresistens, og behandling av patologiske tilstander assosiert dermed, ved samtidig behandling og forebygging av diabetesinduserte kroniske komplikasjoner, spesielt retinopati, neuropati og nefropati og/eller med samtidig økende patologisk nedsatt periferisk neuroregenerasjon forårsaket av diabetes.

4. Farmasøytisk preparat inneholdende N-[2-hydroksy-3-(l-piperidinyl)-propoksy]-pyridin-l-oksid-3-karboksimidoylklorid eller en av dets stereoisomerer eller et syreaddisjonssalt derav som aktiv bestanddel i blanding med minst en vanlig anvendt farmasøytisk tålbar hjelpesubstans og bærer.