NO318080B1

NO318080B1 - 4,4- og 3,3-disubstiterte piperidin-forbindelser med veksthormonfrigjorende egenskaper,farmasoytiske preparater som omfatter forbindelsene, samt anvendelse av forbindelsene eller preparatene til fremstilling av medikamenter

Info

Publication number: NO318080B1
Application number: NO20005668A
Authority: NO
Inventors: Thomas Kruse Hansen; Michael Ankersen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 2000-11-10
Publication date: 2005-01-31
Also published as: DE69941255D1; CN1142911C; JP4142253B2; CY1109626T1; TWI222969B; ATE439346T1; JP2004500312A; AU3701099A; UA72210C2; CZ20004129A3; PL344042A1; EP1077941A1; HUP0102071A2; IL139090A0; NO20005668D0; WO1999058501A1; CN1300281A; KR100593601B1; HUP0102071A3; PT1077941E

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye forbindelser, nemlig 4,4-disubstituerte og 3,3-disubstituerte piperidinforbindelser, preparater som inneholder dem, og deres anvendelse til fremstilling av medikamenter for behandling av medisinske forstyrrelser som skriver seg fra en mangel på veksthormon.

Oppfinnelsens bakgrunn

Veksthormon er et hormon som stimulerer vekst av alle vev som er i stand til å vokse. I tillegg er veksthormon kjent for å ha en rekke virkninger på metabolske prosesser, f.eks. stimulering av proteinsyntese og mobilisering av fri fettsyre, og for å forårsake et skifte i energimetabolisme fra karbo-hydrat- til fettsyremetabolisme. Mangel på veksthormon kan resultere i en rekke alvorlige medisinske forstyrrelser, f.eks. dvergvekst.

Veksthormon frigjøres fra hypofysen. Frigjørelsen er under nøye kontroll av et antall hormoner og neurotransmit-tere, enten direkte eller indirekte. Veksthormpnfrigjørelse kan stimuleres ved hjelp av veksthormonfrigjørende hormon (GHRH) og inhiberes ved hjelp av somatostatin. I begge tilfel-lene frigjøres hormonene fra hypotalamus, men deres virkning formidles primært via spesifikke reseptorer lokalisert i hypofysen. Andre forbindelser som stimulerer frigjørelsen av veksthormon fra hypofysen, er også blitt beskrevet. For eksempel frigjør arginin, L-3,4-dihydroksyfenylalanin (L-Dopa), glukagon, vasopressin, PACAP (hypofyseadenylylsyklase-aktiverende peptid), muskarinreseptoragonister og et syntetisk heksapeptid, GHRP (veksthormonfrigjørende peptid), endogent veksthormon enten ved hjelp av en direkte virkning på hypofysen eller ved å påvirke frigjørelsen av GHRH og/eller somatostatin fra hypotalamus.

Ved forstyrrelser eller tilstander hvor forøkte nivåer av veksthormon er ønsket, gjør veksthormonets protein-type alt annet enn parenteral administrering ikke-levedyktig.

Dessuten er andre, direkte virkende, naturlige sekretagoga, f.eks. GHRH og PACAP, lengre polypeptider, av hvilken grunn parenteral administrering er foretrukket.

Anvendelsen av visse forbindelser til økning av nivåene av veksthormon hos pattedyr er tidligere blitt foreslått i f.eks. EP 18 072, EP 83 864, WO 89/07110, WO 89/01711, WO 89/10933, WO 88/9780, WO 83/02272, WO 91/18016,

WO 92/01711, WO 93/04081, WO 9517422, WO 9517423, WO 9514666, WO 9419367, WO 9534311, WO 9602530, WO 9615148, WO 9613265,

WO 9622997, WO 9635713, WO 9638471, WO 9632943, WO 9700894,

WO 9706803, WO 9709060, WO 9707117, WO 9711697, WO 9722620,

WO 9723508, WO 9724369 og WO 9734604.

Sammensetningen av veksthormonfrigjørende forbindelser er viktig for deres veksthormonfrigjørende styrke samt deres biologiske tilgjengelighet. Det er derfor et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye forbindelser med veksthormonfrigjørende egenskaper. Dessuten er det et formål å tilveiebringe nye veksthormonfrigjørende forbindelser (vekst-hormonsekretagoga) som er spesifikke og/eller selektive, og som ikke har noen eller ingen vesentlige bivirkninger, slik som f.eks. frigjørelse av LH, FSH, TSH, ACTH, vasopressin, oksytocin, kortisol og/eller prolaktin. Det er også et formål å tilveiebringe forbindelser som har god oral biologisk tilgjengelighet.

Oppsummering av oppfinnelsen

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt nye forbindelser som virker direkte på hypo-fysecellene under normale forsøksbetingelser in vi tro slik at veksthormon frigjøres derfra.

Disse veksthormonfrigjørende forbindelser kan benyt-tes in vitro som unike forskningsredskaper for blant annet å forstå hvordan veksthormonsekresjon reguleres på hypofysenivå.

Dessuten kan de veksthormonfrigjørende forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse også administreres in vivo for å øke endogen veksthormonfrigjørelse.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører således de følgende forbindelser:

1-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-metylheks-2-enoyl)-N-metylamino]-3-(2-naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyremetylamid l-{ (2.R)-2-[N-( (2E)-5-amino-3,5-dimetylheke-2-enoyl)-N-metylamino ]-3-(2-naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyremetylamid l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-metylheks-2-enoyl)-N-metylamino]-3-(bifenyl-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyremetylamid 1-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3,5-dimetylheks-2-enoyl)-N-metylamino ]-3-(bifeny1-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyremetylamid 1-((2R)-2-{N-[(2E)-4-(1-aminosyklobutyl)but-2-enoyl]-N-metylamino }-3-(bifeny1-4-yl)propionyl)-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyremetylamid 2-amino-N-[(lR)-2-[4-benzyl-4-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl )piperidin-l-yl]-1-((lH-indol-3-yl)metyl)-2-oksoetyl]-2-metylpropionamid 2-amino-N-{(lR)-2-[(3R)-3-benzyl-3-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-1-yl]-l-benzyloksymetyl-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid 2-amino-N-[(lR)-2-[(3R)-3-benzyl-3-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-1-((lH-indol-3-yl)metyl)-2-oksoetyl]-2-metylpropionamid 1-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-metylheks-2-enoyl)-N-metylamino]-3-(bifenyl-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre-etylester l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3,5-dimetylheks-2-enoyl)-N-metylamino ]-3-(bifenyl-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboks-ylsyreetylester l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-metylheks-2-enoy1)-N-metylamino]-3-(2-naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre-etylester l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3,5-dimetylheks-2-enoyl)-N-metylamino ]-3-(2-naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksyl-syreetylester {3S)-1-[(2R)-2-((2E)-5-amino-5-metylheks-2-enoylamino)-3-(1H-indol-3-yl)propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboksylsyre-etylester (3S)-1-[(2R)-2-((2E)-5-amino-3,5-dimetylheks-2-enoylamino)-3-(lH-indol-3-yl)propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboksylsyre-etylester (3S)-1-[(2R)-2-(3-(aminometyl)benzoylamino)-3-(lH-indol-3-yl)-propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboksylsyreetylester (2E)-5-amino-5-metylheks-2-ensyre-N-{(IR)-2-[4-benzy1-4-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-1-yl]-l-((2-naftyl)-metyl)-2-oksoetyl}-N-metylamid (2E)-5-amino-5-metylheks-2-ensyre-N-[(IR)-2-[3-benzy1-3-(N<*>,N'-dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-y1]-l-((lH-indol-3-yl)metyl)-2-oksoetyl]amid (2E)-5-amino-5-metylheks-2-ensyre-N-{{lR)-2-[3-benzyl-3-(N<1>,N'-dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-((2-naftyl)-metyl)-2-oksoetyl}-N-metylamid (2E)-5-amino-5-metylheks-2-ensyre-{(IR)-2-[3-benzyl-3-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-(benzyloksymetyl)-2-oksoetyl}amid 2-amino-N-{2-[3-benzy1-3-(N', N'-dimetylhydrazinokarbonyl)-piperidin-l-y1]-1-((2-naftyl)metyl)-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid 2-amino-N-{(lR)-2-[3-benzyl-3-(N<1>,N'-dimetylhydrazinokarbonyl )piperidin-l-yl]-l-((bifenyl-4-yl)metyl)-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid 2-amino-N-{(lR)-2-[3-benzyl-3-(N'^'-dimetylhydrazinokarbonyl )piperidin-l-yl]-1-({lH-indol-3-yl)metyl)-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid 2-amino-N-{2-[3-benzyl-3-(N'-metylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl] -1-(benzyloksymetyl)-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid 2-amino-N-{(IR)-2-[3-benzyl-3-(N'-metylhydrazinokarbonyl)-piperidin-l-yl]-1-(lH-indol-3-ylmetyl)-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid 1-[(2R)-2-{2-amino-2-metylpropionylamino)-3-(lH-indol-3-yl)-propionyl] -3-benzylpiperidin-3-karboksylsyre(pyrrolidin-l-yl)-amid 2-amino-N-{(IR)-2-[3-benzyl-3-(N,N',N'-trimetylhydrazinokarbo-nyl)piperidin-l-yl]-1-(lH-indol-3-ylmetyl)-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid og farmasøytisk akseptable salter derav. Generell fremgangsmåte Reaksjonsskjema I Fremgangsmåtene som anvendes i dette patentet og som er illustrert i reaksjonsskjema I ovenfor, er basert på peptidkoblinger som er vel kjent innen teknikken. I det første trinnet kobles et amin (1) og en karboksylsyre til et amid ved hjelp av et slikt koblingsmiddel som et karbodiimid og hydrok-syazabenzotriazol (HOAt). Før den neste koblingen kan en egnet beskyttelsesgruppe, slik som tert.-butyloksykarbonyl (Boe), fjernes ved hjelp av metoder som er vel kjent for fagfolk innen teknikken, hvorved forbindelse (2) fremstilles. Det er også mulig å unngå bruken av beskyttelsesgrupper. Deretter kobles (2) til en karboksylsyre med formel D-COOH ved hjelp av et koblingsmiddel, hvorved forbindelse (3) fremstilles. Reaksjonsskjema II

Forbindelser ifølge oppfinnelsen som inneholder et hydrazin i C-enden, kan fremstilles som illustrert ovenfor i reaksjonsskjema II. Fremgangsmåtene som anvendes i dette patentet, og som er illustrert i reaksjonsskjema II ovenfor, er basert på peptidkoblinger som er vel kjent innen teknikken. I det første trinnet kobles et mono-, di- eller trisubstituert hydrazin eller hydrazon (4) og en passende beskyttet aminosyre, hvorved det dannes en forbindelse (5) under anvendelse av et egnet koblingsreagens, slik som l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidhydroklorid, 1-hydroksybenzo-triazol eller et annet koblingsreagens som er kjent i peptidkoblingsteknikken, i et passende oppløsningsmiddel, slik som dimetylformamid eller diklormetan. Deretter kobles amidet (5) og en karboksylsyre ved hjelp av et koblingsmiddel, hvorved forbindelse (6) fremstilles. Deretter kobles (6) til en karboksylsyre med formel D-COOH ved hjelp av et koblingsmiddel, hvorved forbindelse (7) fremstilles. Før den neste koblingen i fremgangsmåten kan en egnet beskyttelsesgruppe, slik som tert.-butyloksykarbonyl (Boe), fjernes ved hjelp av metoder som er vel kjent for fagfolk innen teknikken. Det er også mulig å unngå bruken av beskyttelsesgrupper. De passende aminosyrene kan beskyttes og avbeskyttes ved hjelp av metoder som er kjent innen teknikken, og som er beskrevet f.eks. av T.W. Greene (Protective Groups in Organic Synthesis, 2. utg., John Wiley and Sons, New York, 1991).

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen utviser en for-bedret resistens overfor proteolytisk nedbrytning ved hjelp av enzymer fordi de er ikke-naturlige, særlig fordi de naturlige amidbindingene er erstattet av ikke-naturlige amidbindings-etterligninger. Den forbedrede resistens overfor proteolytisk nedbrytning av forbindelsene ifølge oppfinnelsen sammenlignet med kjente hormonfrigjørende peptider forventes å forbedre deres biologiske tilgjengelighet, sammenlignet med den til peptidene som er foreslått i litteraturen.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan ha ett eller flere asymmetriske sentre (kirale karbonatomer), og det er ment at stereoisomerer, som separerte, rene eller del-vis rensede stereoisomerer, eller racemiske blandinger derav, er inkludert innenfor omfanget av oppfinnelsen.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan eventuelt være på en farmasøytisk akseptabel saltform, slik som de farmasøytisk akseptable syreaddisjonssaltene av forbindelsene ifølge oppfinnelsen som omfatter de som fremstilles ved å omsette forbindelsen ifølge oppfinnelsen med en uorgan-isk eller organisk syre, slik som saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, eddiksyre, fosforsyre, melkesyre, maleinsyre, mandelsyre, ftalsyre, sitronsyre, glutarsyre, glukonsyre, metansulfonsyre, salisylsyre, ravsyre, vinsyre, toluensul-fonsyre, trifluoreddiksyre, sulfaminsyre eller fumarsyre, og/eller vann.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres i farmasøytisk akseptabel syreaddisjonssaltform eller, når det er passende, som et alkalimetall- eller jordalkalimetall-eller lavere alkylammoniumsalt. Slike saltformer antas å utvise omtrent den samme størrelsesorden av aktivitet som de frie baseformene.

I et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse et farmasøytisk preparat som omfatter som en aktiv bestanddel en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynner.

Farmasøytiske preparater som inneholder en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, kan fremstilles ved hjelp av vanlige teknikker, f.eks. som beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985, eller i Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. utgave (1995). Preparatene kan fremstå i vanlige former, f.eks. kapsler, tabletter, aeroso-ler, oppløsninger, suspensjoner eller topiske applikasjoner.

Den farmasøytiske bærer eller fortynner som anvendes, kan være en vanlig fast eller flytende bærer. Eksempler på faste bærere er laktose, terra alba, sukrose, syklodekstrin, talkum, gelatin, agar, pektin, akasie, magnesiumstearat, stearinsyre eller lavere alkyletere av cellulose. Eksempler på flytende bærere er sirup, peanøttolje, olivenolje, fosfo-lipider, fettsyrer, fettsyreaminer, polyoksyetylen eller vann.

Likeledes kan bæreren eller fortynneren omfatte hvilket som helst materiale med langvarig frigjørelse som er kjent innen teknikken, slik som glyserylmonostearat eller glyseryldistearat, alene eller blandet med en voks.

Dersom det anvendes en fast bærer for oral administrering, kan preparatet være tablettert, plassert i en hard gelatinkapsel i pulver- eller pelletform, eller det kan være i form av en pastill eller sugetablett. Mengden av fast bærer vil variere bredt, men vil vanligvis være fra ca. 25 mg til ca. lg. Dersom det anvendes en flytende bærer, kan preparatet være i form av en sirup, emulsjon, myk gelatinkapsel eller steril, injiserbar væske, slik som en vandig eller ikke-vandig, flytende suspensjon eller oppløsning.

En typisk tablett som kan fremstilles ved hjelp av vanlige tabletteringsteknikker, kan inneholde:

Kj erne:

Belegg:

<*>Acylert monoglyserid brukt som mykner for filmbelegging.

For nasal administrering kan preparatet inneholde en forbindelse ifølge oppfinnelsen oppløst eller oppslemmet i en flytende bærer, særlig en vandig bærer, for aerosolapplika-sjon . Bæreren kan inneholde slike additiver som oppløselig-gjøringsmidler, for eksempel propylenglykol, overflateaktive midler, absorpsjonsfremmere, slik som lecitin (fosfatidyl-cholin) eller syklodekstrin, eller slike konserveringsmidler som parabener.

Generelt dispenseres forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse i endoseform som omfatter 50-200 mg aktiv bestanddel sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer pr. enhetsdose.

Doseringen av forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen er passende 0,01-500 mg/dag, f.eks. fra ca. 5 til ca. 50 mg, slik som ca. 10 mg pr. dose, når de administreres til pasienter, f.eks. mennesker, som et legemiddel.

Ved et ytterligere aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse et farmasøytisk preparat i endoseform som omfatter som en aktiv bestanddel fra ca. 10 til ca. 200 mg av forbindelsen ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Det er blitt demonstrert at forbindelser ifølge oppfinnelsen har evne til å frigjøre endogent veksthormon in vivo. Forbindelsene kan derfor anvendes ved behandlingen av tilstander som krever forøkte plasmaveksthormonnivåer, slik som hos mennesker med veksthormonmangel eller hos eldre pasienter eller hos buskap.

Ved enda et ytterligere aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse anvendelsen av en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav til fremstilling av et medikament for stimulering av frigjørelsen av veksthormon fra hypofysen.

For fagfolk innen teknikken er det velkjent at de nåværende og potensielle anvendelser av veksthormon hos mennesker er varierte og mangfoldige. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan således administreres for slike formål som å stimulere frigjørelse av veksthormon fra hypofysen, og vil da ha lignende effekter eller anvendelser som veksthormon selv. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til stimulering av veksthormonfrigjørelse hos de eldre; forhindring av kata-bolske bivirkninger av glukokortikoider, forhindring og/eller behandling av osteoporose, behandling av kronisk tretthetssyndrom (CFS), behandling av akutt tretthetssyndrom og muskeltap etter utvelgelseskirurgi, stimulering av immunsystemet, akselerasjon av sårheling, akselerering av ben-bruddsreparasjon, akselerering av kompliserte brudd, f.eks. skivetraksjonsosteogenese, behandling av svinn etter brudd, behandling av vekstretardasjon, behandling av vekstretardasjon som skriver seg fra nyresvikt eller -insuffisiens, behandling av kardiomyopati, behandling av kronisk leversykdom, behandling av trombocytopeni, behandling av Crohns sykdom, behandling av kort tarm-syndrom, behandling av kronisk obstruktiv pulmonal sykdom (COPD), behandling av komplikasjoner forbundet med transplantasjon, behandling av fysiologisk kortvoksthet, inkludert veksthormonmanglende barn og kortvoksthet forbundet med kronisk sykdom, behandling av fedme og vekstretardasjon forbundet med fedme, behandling av anoreksi, behandling av vekstretardasjon forbundet med Prader-Willi-syndromet og Turn-ers syndrom; økning av veksthastigheten til en pasient som har partielt veksthormonufølsomt syndrom, fremskyndelse av helbredelse og reduksjon av hospitalisering av forbrennings-pasienter; behandling av intrauterin vekstretardasjon, skjelettdysplasi, hyperkort i sol isme og Cushings syndrom,-induksjon av pulserende veksthormonfrigjørelse; erstatning av veksthormon hos stressede pasienter, behandling av osteo-kondrodysplasier, Noonans syndrom, schizofreni, depresjoner, Alzheimers sykdom, forsinket sårheling og psykososial depri-vasjon, behandling av pulmonal dysfunksjon og ventilatoravh-engighet, behandling av hjertesvikt eller beslektet vaskulær dysfunksjon, behandling av forstyrret hjertefunksjon, behandling eller forhindring av hjerteinfarkt, senking av blodtrykk, beskyttelse mot ventrikulær dysfunksjon eller forhindring av reperfusjonshendeleer, behandling av voksne ved kronisk dialyse, attenuering av proteinkatabolske responser etter omfattende kirurgi, reduksjon av kakeksi og proteintap på grunn av kronisk sykdom, slik som kreft eller AIDS; behandling av hyperinsulinemi, inkludert nesidioblastose, adjuvansbehandling for ovulasjonsinduksjon; for å stimulere thymisk utvikling og forhindre det aldersrelaterte fall i thymisk funksjon, behandling av immunundertrykte pasienter, behandling av sarkopeni, behandling av svinn i forbindelse med AIDS, forbedring av muskelstyrke, mobilitet, opprettholdelse av hudtykkelse, metabolsk homøostase, renal homøostase hos svake eldre, stimulering av osteoblaster, benremodellering og bruskvekst, regulering av matinntak, stimulering av immunsystemet hos kjæledyr og behandling av forstyrrelser ved aldring hos kjæledyr, fremming av vekst hos buskap og stimulering av ullvekst hos sau, behandling av metabolsk syndom (syndrom X), behandling av insulinresistens, inkludert NIDDM, hos pattedyr, f.eks. mennesker, forbedring av søvn-kvalitet og korreksjon av den relative hyposomatotropisme ved aldring på grunn av høy økning i REM-søvn, og en reduksjon i REM-latens, og behandling av hypotermi. Behandling er også ment å omfatte profylaktisk behandling.

For de ovenfor nevnte indikasjoner vil doseringen variere, avhengig av forbindelsen ifølge oppfinnelsen som anvendes, av administreringsmåten og av den ønskede terapi. Generelle doseringsnivåer mellom 0,0001 og 100 mg/kg kroppsvekt daglig administreres imidlertid til pasienter og dyr for å oppnå effektiv frigjørelse av endogent veksthormon. Dessuten har forbindelsene ifølge oppfinnelsen ingen eller i det vesentlige ingen bivirkninger når de administreres i de ovenfor nevnte doseringsnivåer, idet slike bivirkninger f.eks. er frigjørelse av LH, FSH, TSH, ACTH, vasopressin, oksytocin, kortisol og/eller prolaktin. Vanligvis omfatter doseformer egnet for oral, nasal, pulmonal eller transdermal administrering fra ca. 0,0001 mg til ca. 100 mg, fortrinnsvis fra ca. 0,001 mg til ca. 50 mg av forbindelsene ifølge oppfinnelsen blandet med en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynner.

Administreringsveien kan være hvilken som helst vei som effektivt transporterer den aktive forbindelse til det passende eller ønskede virkningssted, slik som oral, nasal, pulmonal, transdermal eller parenteral, idet den orale vei er foretrukket.

Bortsett fra den farmasøytiske anvendelse av forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan de være nyttige in vitro-redskaper for undersøkelse av reguleringen av veksthormonfrigj ørelse.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også være nyttige in vivo-redskaper for evaluering av veksthormonfrigj øreIsesevnen til hypofysen. For eksempel kan serumprøver tatt før og etter administrering av disse forbindelsene til mennesker analyseres med hensyn på veksthormon. Sammenligning av veksthormonet i hver serumprøve vil direkte bestemme evnen til pasientens hypofyse når det gjelder å frigjøre veksthormon.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres til kommersielt viktige dyr for å øke deres veksthastighet og

-omfang, og for å øke melkeproduksjon.

En ytterligere anvendelse av veksthormonsekretagoga-forbindelsene ifølge oppfinnelsen er i kombinasjon med andre sekretagoga, slik som GHRP (2 eller 6), GHRH og dets analoger, veksthormon og dets analoger eller somatomediner, inkludert IGF-1 og IGF-2.

Farmakologiske metoder

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan evalueres in vi tro med hensyn på deres virkningsfullhet og styrke når det gjelder å frigjøre veksthormon i primærkulturer av rottehypofyse, og slik evaluering kan utføres som beskrevet nedenunder.

Isoleringen av rottehypofyseceller er en modifikasjon av 0. Sartor et al., Endocrinology, 116, 1985, s. 952-957. Albino-Sprague-Dawley-hannrotter (250 +/- 25 g) ble innkjøpt fra Møllegaard, Lille Skensved, Danmark. Rottene ble oppbevart i gruppebur (fire dyr/bur) og plassert i rom med 12 t lys-syklus. Romtemperaturen varierte fra 19 til 24 °C og fuktig-heten fra 30 til 60 %.

Rottene ble dekapitert og hypofysene dissekert. Neurointermediatlappene ble fjernet, og det gjenværende vev ble umiddelbart plassert i iskald isoleringsbuffer (Geys medium (Gibco 041-04030) supplert med 0,25 % D-glukose, 2 % ikke-essensielle aminosyrer (Gibco 043-01140) og 1 % bovint serumalbumin (BSA) (Sigma A-4503)). Vevet ble kuttet i små stykker og overført til isoleringsbuffer supplert med 3,8 mg/ml trypsin (Worthington nr. 3707 TRL-3) og 330 mg/ml DNase (Sigma D-4527). Denne blandingen ble inkubert ved 70 rotasjoner/min i 35 min ved 37 °C i en 95/5 % atmosfære av O2/CO2. Vevet ble så vasket tre ganger i den ovenfor nevnte buffer. Ved å anvende en standard pasteurpipette ble vevet så aspirert til enkeltceller. Etter dispersjon ble cellene filtrert gjennom et nylonfilter (160 mm) for å fjerne ufordøyd vev. Cellesuspensjonen ble vasket tre ganger med isolerings-buf f er supplert med trypsininhibitor (0,75 mg/ml, Worthington nr. 2829), og til sist på nytt oppslemmet i dyrkningsmedium; DMEM (Gibco 041-01965) supplert med 25 mM HEPES (Sigma H-3375), 4 mM glutamin (Gibco 043-05030H), 0,075 % natrium-bikarbonat (Sigma S-8875), 0,1 % ikke-essensiell aminosyre, 2,5 % kalvefosterserum (FCS, Gibco 011-06290), 3 % hesteserum (Gibco 034-06050), 10 % ferskt rotteserum, 1 nM T3 (Sigma T-. 2752) og 40 mg/l deksametason (Sigma D-4902), pH 7,3, til en tetthet på 2 x 10s celler/ml. Cellene ble inokulert i mikro-titerplater (Nunc, Danmark) , 200 |al/brønn, og dyrket i 3 dager ved 37 °C og 8 % C02.

Forbindelsestesting

Etter dyrkning ble cellene vasket to ganger med stimuleringsbuffer (Hanks balanserte saltoppløsning (Gibco 041-04020) supplert med 1 % BSA (Sigma A-4503), 0,25 % D-glukose (Sigma G-5250) og 25 mM HEPES (Sigma H-3375), pH 7,3) og forinkubert ilt ved 37 °C. Bufferen ble byttet ut med 90 ml stimuleringsbuffer (37 °C) . 10 ml testforbindelsesoppløs-ning ble tilsatt, og platene ble inkubert i 15 min ved 37 °C og 5 % C02. Mediet ble dekantert og analysert med hensyn på GH-innhold i et rGH-SPA-testsystem.

Alle forbindelsene ble testet i doser som varierte fra 10 pM til 100 mM. Et dose-responsforhold ble konstruert ved å anvende Hill-ligningen (figur P, Biosoft). Virknings-fullheten (maksimalt GH frigjort, E^ e) ble uttrykt i % av Emaks for GHRP-6. Styrken (EC50) ble bestemt som den konsentrasjon som induserte halvmaksimal stimulering av GH-frigjørelsen.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan evalueres med hensyn på deres metabolske stabilitet ved å anvende fremgangsmåten beskrevet nedenunder: Forbindelser oppløses ved en konsentrasjon på 1 mg/ml i vann. 25 ml av denne oppløsningen tilsettes til 175 ml av den respektive enzymoppløsning (noe som gir et forhold mellom enzym og substrat (vekt/vekt) på ca. 1:5). Oppløsningen får stå ved 37 °C over natten. 10 ml av de forskjellige nedbryt-ningsoppløsningene analyseres mot en tilsvarende nullprøve under anvendelse av strømningsinjeksjonselektrospraymasse-spektrometri (ESMS) med utvalgt ioneovervåkning av det molekylære ion. Dersom signalet har avtatt mer enn 20 % sammenlignet med nullprøven, analyseres det gjenværende av oppløs-ningen ved hjelp av HPLC og massespektrometri for å identi-fisere omfanget av og stedet eller stedene for nedbrytning nøyaktig.

Flere standardpeptider (ACTH 4-10, angiotensin 1-14 og glukagon) er blitt inkludert i stabilitetstestene for å verifisere evnen til de forskjellige oppløsningene når det gjelder å bryte ned peptider.

Standardpeptider (angiotensin 1-14, ACTH 4-10 og glukagon) ble innkjøpt fra Sigma MO, USA.

Enzymer (trypsin, chymotrypsin, elastaseamino-peptidase M og karboksypeptidase Y og B) ble alle innkjøpt fra Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Tyskland).

Pankreatisk enzymblanding: trypsin, chymotrypsin og elastase i 100 mM ammoniumbikarbonat, pH 8,0 (alle konsentrasjoner 0,025 mg/ml).

Karboksypeptidaseblanding: karboksypeptidase Y og B i 50 mM ammoniumacetat, pH 4,5 (alle konsentrasjoner 0,025 mg/ml).

Aminopeptidase M-oppløsning: aminopeptidase M

(0,025 mg/ml) i 100 mM ammoniumbikarbonat, pH 8,0.

Massespektrometrisk analyse ble utført ved å anvende to forskjellige massespektrometre. Et Sciex "API III triple quadrupole LC-MS"-instrument (Sciex Instruments, Thornhill, Ontario) utstyrt med en elektrosprayionekilde og et Bio-Ion "20 time-of-flight Plasma Desorption"-instrument (Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Sverige).

Kvantifisering av forbindelsene (før og etter nedbrytning) ble gjort på API III-instrumentet ved å anvende enkeltioneovervåkning av det aktuelle molekylære ion med strømningsinjeksjon av analytten. Væskestrømmen (MeOH:vann = 1:1) på 100 ml/min ble kontrollert ved hjelp av en ABI 140B ' HPLC-enhet (Perkin-Elmer Applied Biosystems DiviBions, Foster City, CA). Instrumentparametrene ble innstilt på standard driftsbetingelser, og SIM-overvåkning ble utført ved å anvende det sterkeste molekylære ion (i de fleste tilfeller svarte dette til det dobbeltladede molekylære ion).

Identifikasjon av nedbrytningsprodukter omfattet videre bruken av plasmadesorpsjonsmassespektrometri (PDMS) med prøveapplikasjon på nitrocellulosebelagte mål og standard instrumentelle innstillinger. Nøyaktigheten av de herved bestemte masser er generelt bedre enn 0,1 %.

Separasjon og isolering av nedbrytningsprodukter ble gjort ved å anvende en HY-TACH C-18-reversfase-HPLC-kolonne, 4,6 x 105 mm (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA) med en standard acetonitril:TFA-separasjonsgradient. HPLC-systemet som ble brukt, var HP1090M (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA).

Ethvert nytt trekk eller enhver ny kombinasjon av trekk som her er beskrevet, anses som å være av avgjørende betydning for denne oppfinnelsen.

Eksempler

Fremgangsmåten for fremstilling av forbindelser ifølge oppfinnelsen, og preparater som inneholder dem, er ytterligere illustrert i de etterfølgende eksempler.

Strukturene til forbindelsene er bekreftet enten ved hjelp av væskekromatografi med høy yteevne (HPLC), kjerne-magnetisk resonans (NMR, Bruker 400 MHz) eller væskekromato-graf i -massespektrometri (LC-MS). NMR-skift (d) er angitt i deler pr. million (ppm), og bare utvalgte topper er angitt. Smp. er smeltepunkt og er angitt i °C. Kolonnekromatografi ble utført ved å anvende teknikken beskrevet av W.C. Still et al., J. Org. Chem., 1978, 43, 2923-2925, på Merck silikagel 60 (art. 9385). Forbindelser som ble brukt som utgangsmaterialer, er enten kjente forbindelser eller forbindelser som lett kan fremstilles ved hjelp av fremgangsmåter som er i og for seg kjente. Oppløsningen av metanol og ammoniakk som ble anvendt, er en 10 % ammoniakkoppløsning i metanol.

HPLC- analyse

Metode Al

RP-analysen ble utført ved å anvende UV-påvisninger ved 214, 254, 276 og 301 nm på en 218TP54, 4,6 mm x 250 mm, 5 m C-18-silikakolonne (The Seperations Group, Hesperia), som ble eluert ved 1 ml/min ved 42 °C. Kolonnen ble ekvilibrert med 5 % acetonitril i en buffer bestående av 0,1 M ammoniumsulfat som ble regulert til pH 2,5 med 4 M svovelsyre. Etter injeksjon ble prøven eluert ved hjelp av en gradient på 5 % til 60 % acetonitril i den samme buffer i løpet av 50 min.

Metode Bl

RP-analysen ble utført ved å anvende UV-påvisninger ved 214, 254, 276 og 301 nm på en 218TP54, 4,6 mm x 250 mm, 5 m C-18-silikakolonne (The Seperations Group, Hesperia), som ble eluert ved 1 ml/min ved 42 °C. Kolonnen ble ekvilibrert med 5 % acetonitril + 0,1 % TFA i en vandig oppløsning av TFA i vann (0,1 %). Etter injeksjon ble prøven eluert ved hjelp av en gradient på 5 % til 60 % acetonitril + 0,1 % TFA i den samme vandige buffer i løpet av 50 min.

LC- MS- analyse

LC-MS-analysene ble utført på et PE Sciex API 100 LC/MS-system under anvendelse av en "Waters" 3 mm x 150 mm

3,5 m C-18-symmetrikolonne og positiv ionespray med en strømningshastighet på 20 ml/min. Kolonnen ble eluert med en lineær gradient på 5-90 % acetonitril, 85-0 % vann og 10 % trifluoreddiksyre (0,1 %)/i vann i løpet av 15 min ved en strømningshastighet på 1 ml/minutt.

Forkortelser

TLC: tynnsj iktskromatografi

DMSO: dimetylsulfoksid

min: minutter

t: timer

Boe: tert.-butyloksykarbonyl

DMF: dimetylformamid

THF: tetrahydrofuran

EDAC: N-etyl-N'-dimetylaminopropylkarbodiimid-hydroklorid

DIEA: diisopropyletylamin

TFA: trifluoreddiksyre

Byqqeblokker

N-metylerte aminosyrer som er brukt i de etter-følgende eksempler, ble fremstilt som i Can. J. Chem., 1977, 55, 906.

Eksempel 1

1- f( 2R )- 2- fN- f f 2E)- 5- amino- 5- metylheks- 2- enovl)- N- metvlamino1-3- f 2- naftyl) propionyl1- 4- benzvlpiperidin- 4- karboksvlsvre-metylamid

Trinn A

N- tert.- butvloksvkarbonyl- 4- benzylpiperidin- 4- karboksylsyre

N-tert.-butyloksykarbonyl-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyreetylester (fremstilt som i Gilligan et al., J. Med. Chem., 1994, 364-370, under anvendelse av benzylbromid som alkyleringsmiddel) (11,0 g, 32 mmol) ble kokt under til-bakeløpskjøling i 7 timer i en blanding av etanol (190 ml) og vandig natriumhydroksid (18 %, 190 nil). Volumet ble redusert til en tredjedel under vakuum, og pH ble regulert til 3 med natriumhydrogensulfat. Vann (300 ml) ble tilsatt, og blandingen ble ekstrahert med etylacetat (2 x 250 ml). De kombinerte organiske faser ble inndampet, hvorved man fikk 8,6 g N-tert.-butyloksykarbonyl-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre.

<1>H-NMR: d (CDC13) 1,45 (s, 9 H); 1,5 (m (br), 2 H); 2,08 (m (br), 2 H); 2,88 (m (br), 2 H); 2,89 (s, 2 H); 3,95 (m (br), 2 H); 7,09-7,30 (5 arom. H).

Trinn B

4- benzvl- 4- metylkarbamoylpiperidin- l- karboksylsyre- tert.-butylester

N-tert.-butyloksykarbonyl-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre (3,0 g, 9,0 mmol) ble oppløst i metylenklorid (25 ml), og EDAC (1,8 g, 9,0 mmol) og HOAt (1,3 g, 9,0 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 15 minutter, så ble metylamin (33 % i etanol, 2,3 ml, 18 mmol) og DIEA (1,6 ml, 9,0 mmol) tilsatt, og blandingen ble omrørt over natten. Metylenklorid (100 ml) ble tilsatt, og blandingen ble vasket med en mettet, vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat (50 ml) og en vandig oppløsning av natriumhydrogensulfat (10 %, 50 ml), tørket (MgSC<4) og inndampet under vakuum. Resten ble kromatografert på silika (90 g) under anvendelse av en blanding av vandig ammoniakk/etanol/metylenklorid (1:7:92) som elueringsmiddel, hvorved man fikk 2,8 g 4-benzyl-4-metylkarbamoylpiperidin-1-karboksylsyre-tert.-butylester.

<1>H-NMR: d (CDC13) 1,44 (s, 9 H); 1,55 (m (br), 2 H); 1,98 (m (br), 2 H); 2,70 (d, 3 H); 2,98 (m (br), 2 H); 2,89 (s, 2 H); 3,87 (m (br), 2 H); 5,15 (q (br), 1 H); 7,01-7,32

(5 arom. H).

Trinn C

4- benzvlpiperidin- 4- karbokBylsyremetylamid

4-benzyl-4-metylkarbamoylpiperidin-l-karboksylsyre-tert.-butylester (2,8 g) ble oppløst i en blanding av TFA og metylenklorid, og det ble omrørt i 40 minutter. Oppløsnings-midlet ble fjernet under vakuum, og resten ble oppløst i vann (30 ml), og pH ble regulert til 13 med vandig natriumhydroksid (1 N). Vannfasen ble ekstrahert med metylenklorid (3 x 75 ml), og de kombinerte organiske faser ble tørket (MgSC«4) og inndampet under vakuum, hvorved man fikk 1,50 g 4-benzylpiperidin-4-karboksylsyremetylamid.

<1>H-NMR: d (CDCI3) 1,80 (td, 2 H); 2,14 (d (br), 2 H); 2,70 (d, 3 H); 2,81 (s, 2 H); 2,85 (dt, 2 H); 3,21 (dt, 2 H); 5,25 (t, 1 H); 7,00-7,35 (5 arom. H).

Trinn D

4- benzvl- l- f f 2R )- 2- metYlamino- 3-( 2- naftyl) propionyl) piperidin-4- karboksy1syremety1amid

(2R)-2-tert.-butyloksykarbonylamino-N-metyl-3-(2-naftyljpropionsyre (709 mg, 2,15 mmol), HOAt (293 mg,

2,25 mmol) og EDAC (412 mg, 2,25 mmol) ble oppløst i metylenklorid (5 ml), og det ble omrørt i 15 minutter. 4-benzylpiperidin-4-karboksylsyremetylamid (500 mg, 2,25 mmol) og DIEA (0,35 ml) ble tilsatt, og blandingen ble omrørt over natten. Metylenklorid (30 ml) ble tilsatt, og blandingen ble vasket med en mettet, vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat (20 ml) og en vandig oppløsning av natriumhydrogensulfat (10 %, 20 ml), tørket (MgS04) og inndampet under vakuum. Resten ble kromatografert på silika (40 g) under anvendelse av etylacetat som elueringsmiddel, hvorved man fikk 810 mg 4-benzyl-1-((2R)-2-(N-metyl-tert.-butyloksykarbonylamino)-3-(2-naftyl)propionyl)piperidin-4-karboksylsyremetylamid, som ble oppløst i TFA/metylenklorid (8 + 8 ml) og omrørt i 40 minutter ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble fjernet under vakuum, og resten ble nøytralisert med en mettet oppløsning av natriumhydrogenkarbonat og ekstrahert med etylacetat (50 ml). Den organiske fase ble tørket (MgS04) og inndampet, hvorved man fikk 729 mg 4-benzyl-l-((2R)-2-metylamino-3-(2-naftyl)-propionyl)piperidin-4-karboksylsyremetylamid.

Trinn E

4-benzyl-l-((2R)-2-metylamino-3-(2-naftyl)propionyl)-piperidin-4-karboksylsyremetylamid (360 mg, 0,82 mmol) ble koblet til (2E)-5-(tert.-butyloksykarbonylamino)-5-metyl-2-heksensyre under anvendelse av den samme koblingsfremgangsmåte som i trinn D. Fjerning av den N-terminale Boc-gruppe ble ut-ført som i trinn D, men ved -10 °C. Råproduktet ble renset på en RP-18-Seppak (5 g, Waters) under anvendelse av en gradient fra 0,1 % TFA i vann/acetonitril 100/0 til 0,1 % TFA i 60/40 vann/acetonitril, hvorved man fikk 306 mg av tittelforbindel-sen som et trifluoracetat.

<1>H-NMR: 8 (MeOH) (utvalgte topper for hovedrotamer) 1,30 (s, 3 H); 1,31 (a, 3 H); 2,10 (AB-syst., 2 H); 2,55 (s, 3 H); 5,81 (m, 1 H).

HPLC: Rt = 31,88 min (Al)

Rt = 33,30 min (Bl).

ESMS: m/z: 569,4 (M + H)<+>.

Eksempel 2

1- f( lR^- 2- rN- f( 2E)- 5- amino- 3. 5- dimetylheks- 2- enovl)- N- metylamino 1- 3-( 2- naftyl) propionyll- 4- benzylpiperidin- 4- karboksvl-syremetylamid

Forbindelsen ble fremstilt som i eksempel 1 ved å anvende (2E)-5-(tert.-butyloksykarbonylamino)-5,3-dimetyl-2-heksensyre i stedet for (2E)-5-(tert.-butyloksykarbonylamino)-5-metyl-2-heksensyre i trinn E.

HPLC: Rt = 33,70 min (Al)

Rt = 34,22 min (Bl).

ESMS: m/z: 583,4 (M + H)<+>.

Eksempel 3

1- f( 2R)- 2- rN-(( 2E)- 5- amino- 5- metvlheks- 2- enoyl)- N- metylamino1-3-( bifenvl- 4- yl) propionyl>- 4- benzylpiperidin- 4- karboksvlsvre-metvlamid

Denne forbindelsen ble fremstilt som i eksempel 1 ved å anvende (2R)-2-tert.-butyloksykarbonylamino-N-metyl-3-(4-bi-fenylyl)propioriByre i stedet for (2R)-2-tert.-butyloksykarbo-nylamino-N-metyl-S-^-naftylJpropionsyre i trinn D.

HPLC: Rt = 34,53 min (Al)

Rt = 36,15 min (Bl).

ESMS: m/z: 595,4 (M + H)<+>.

Eksempel 4

1- ff2R)- 2- f N- ff 2E)-5-amino-3, 5- dimetvlheks- 2- enovl)-N-metvl-amino1- 3-( bifenyl- 4- yl) propionyl>- 4- benzylpiperidin- 4- karboksylsyremetylamid

Denne forbindelsen ble fremstilt som i eksempel 1 ved å anvende (2R)-2-tert.-butyloksykarbonylamino-N-metyl-3-(4-bi-fenylyl)propionsyre i stedet for (2R)-2-tert.-butyloksykarbo-nylamino-N-metyl-3-(2-naftyl)propionsyre i trinn D, og ved å anvende (2E)-5-(tert.-butyloksykarbonylamino)-5,3-dimetyl-2-heksensyre i stedet for (2E)-5-(tert.-butyloksykarbonylamino)-5-metyl-2-heksensyre i trinn E.

. HPLC: Rt = 35,15 min (Al)

Rt = 36,83 min (Bl).

ESMS: m/z: 609,4 (M + H)<+>.

Eksempel 5

1- f f 2R)- 2- fN- r f 2E)- 4- f1- aminosvklobutvl>but- 2- enovl1- N- metvl-amino)- 3- f bifenyl- 4- yl) propionyl)- 4- benzvlpiperidin- 4- karboksylsyremetylamid

Denne forbindelsen ble fremstilt som i eksempel 1 ved å anvende (2R)-2-tert,-butyloksykarbonylamino-N-metyl-3-(4-bi-fenylyl)propionsyre i stedet for (2R)-2-tert.-butyloksykarbo-nylamino-N-metyl-3-(2-naftylJpropionsyre i trinn D, og ved å anvende (2E)-4-(1-(tert.-butyloksykarbonylamino)syklobutyl)-but-2-ensyre i stedet for (2E)-5-(tert.-butyloksykarbonyl-amino )-5-metyl-2-heksensyre i trinn E.

HPLC: Rt = 35,15 min (Al)

Rt = 36,68 min (Bl).

ESMS: m/z: 607,4 (M + H)<+>.

Eksempel 6

2- amino- N- r f IR)- 2- r4- benzvl- 4-( N', N'- dimetylhydrazinokarbonyl ) piperidin- 1- vi1( lH- indol- 3- yl) metyl)- 2- oksoetyl1- 2-metylpropionamid

4- benzyl- 4-( N', N'- dimetylhydrazinokarbonyl) piperidin- 1-karboksylsyre- tert.- butylester

Til en oppløsning av 4-benzylpiperidin-l,4-dikarboks-ylsyre-l-tert.-butylester (0,75 g, 2,35 mmol) (fremstilt som i Gilligan et al., J. Med. Chem., 1994, 364-370) i metylenklorid

(10 ml) ble det tilsatt l-hydroksy-7-azabenzotriazol (0,32 mg, 2,35 mmol) og l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidhydro-klorid (0,45 g, 2,35 mmol), og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Så ble N',N<1->dimetylhydrazin (0,27 ml, 3,53 mmol) og diisopropyletylamin (0,52 ml, 3,06 mmol) tilsatt, og blandingen ble omrørt i 2 dager. Metylenklorid (100 ml) ble tilsatt, og blandingen ble vasket med mettet, vandig natriumhydrogenkarbonat (20 ml), vann (20 ml), tørket (MgS04), filtrert og konsentrert under vakuum. Den erholdte olje ble kromatografert på silika (40 g) med heptan/etylacetat (1:2), hvorved man fikk 0,76 g 4-benzyl-4-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl )piperidin-l-karboksylsyre-tert.-butylester som en fargeløs olje.

HPLC: Rt = 9,66 min (HB)

LC-MS: Rt = 9,29 min, m/z = 362,0 (m + 1).

4- benzvlpiperidin- 4- karboksvlsvre- N', N'- dimetvlhydrazid

Til en oppløsning av 4-benzyl.-4-(N1 ,N"-dimetylhydrazinokarbonyl) piper idin-1-karboksylsyre—tert .-butylester (0,76 g, 2,02 mmol) i metylenklorid (2 ml) ved 0 °C ble det tilsatt trifluoreddiksyre (5 ml), og blandingen ble omrørt i 60 minutter. Blandingen ble tilsatt etanol (20 ml), konsentrert under vakuum og strippet tre ganger med metylenklorid, hvorved man fikk 4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre-N',N'-di-metylhydrazid i kvantitativt utbytte.

LC-MS: Rt = 5,64 min, m/z = 262,0 (m + 1).

( 2- ( 4- benzvl- 4- f N', N'- dimetylhydrazinokarbonyl) piperidin- l-vl)- 1-( lH- indol- 3- ylmetvl)- 2- oksoetyl) karbaminsvre- tert.-butylester

Til en oppløsning av 2-tert.-butoksykarbonylamino-3-(lH-indol-3-yl)propionsyre (0,37 g, 1,2 mmol) i metylenklorid (15 ml) og dimetylformamid (5 ml) ble det tilsatt 1-hydroksy-7-azabenzotriazol (0,16 mg, 1,20 mmol) og l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)karbodiimidhydroklorid (0,23 g, 1,20 mmol), og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Så ble 4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre-N',N'-dimetylhydrazin (0,26 g, 1,0 mmol) og diisopropyletylamin (0,69 ml, 4,0 mmol) tilsatt, og blandingen ble omrørt over natten. Metylenklorid (100 ml) ble tilsatt, og blandingen ble vasket med mettet, vandig natriumhydrogenkarbonat (20 ml), vann (20 ml), tørket (MgS04), filtrert og konsentrert under vakuum. Den erholdte olje ble kromatografert på

silika (40 g) med metylenklorid (10 % ammoniakk i metanol)

(9:1), hvorved man fikk 0,43 g (2-(4-benzyl-4-(N'^'-dimetylhydrazinokarbonyl )piperidin-l-yl)-l-(lH-indol-3-ylmetyl)-2-oksoetyl)karbaminsyre-tert.-butylester som en fargeløs olje.

HPLC: Rt - 10,45 min (H8)

LC-MS: Rt = 9,92 min, m/z = 548,2 (m + 1).

l-( 2- amino- 3-( lH- indol- 3- yl) propionvl)- 4- benzvlpiperidin- 4-karboksvlsvre- N', N'- dimetylhydrazid

Til en oppløsning av (2-(4-benzyl-4-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl )piperidin-l-yl)-1-(lH-indol-3-ylmetyl)-2-oksoetyl)karbaminsyre-tert.-butylester (0,40 g, 0,73 mmol) i metylenklorid (3 ml) ved 0 °C ble det tilsatt trifluoreddiksyre (3 ml), og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Blandingen ble tilsatt etanol (20 ml), konsentrert under vakuum og strippet tre ganger med metylenklorid, hvorved man fikk 0,63 g l-(2-amino-3-(lH-indol-3-yl)propionyl)-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre-N',N"-dimetylhydrazid som en fargeløs olje.

HPLC: Rt = 7,52 min (H8)

LC-MS: Rt = 7,61 min, m/z = 448,4 (m + 1).

( 1-( 2-( 4- benzyl- 4-( N', N'- dimetylhydrazinokarbonyl) piperidin- l-yl )- 1-( lH- indol- 3- ylmetyl)- 2- oksoetylkarbamoyl)- 1- metyletyl)-karbaminsvre- tert.- butylester

Til en oppløsning av 2-tert.-butoksykarbonylamino-2-metylpropionsyre (0,18 g, 0,88 mmol) i metylenklorid (10 ml) ble det tilsatt l-hydroksy-7-azabenzotriazol (0,12 mg,

0,88 mmol) og l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidhydro-klorid (0,12 g, 0,88 mmol), og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Så ble l-(2-amino-3-(lH-indol-3-yl)propionyl)-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre-N',N'-dimetylhydrazid (0,46 g, 0,73 mmol) og diisopropyletylamin (0,50 ml, 2,92 mmol) tilsatt, og blandingen ble omrørt over natten. Metylenklorid (100 ml) ble tilsatt, og blandingen ble vasket med mettet, vandig natriumhydrogenkarbonat (20 ml), vann (20 ml), tørket (MgS04), filtrert og konsentrert under vakuum. Den erholdte olje ble kromatografert på silika (40 g) med metylenklorid (10 % ammoniakk i metanol) (9:1), hvorved man fikk 0,31 g (1-

(2-(4-benzyl-4-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl )-l-{lH-indol-3-ylmetyl)-2-oksoetylkarbamoyl)-1-metyletyl)-karbaminsyre-tert.-butylester som en fargeløs olje.

HPLC: Rt = 10,25 min (H8)

LC-MS: Rt = 9,66 min, m/z = 633,2 (m + 1).

2- amino- N- r llR )- 2- r4- benzyl- 4-( N', N'- djjnetylhydrazinokarbo-nyl) piperidin- l- vl 1 - 1- f( lH- indol- 3- vl) metyl)- 2- oksoetvl1- 2-metylpropionamid

Til en oppløsning av (l-(2-(4-benzyl-4-(N',N"-dimetylhydrazinokarbonyl ) piperidin-l-yl )-1-(lH-indol-3-ylmetyl)-2-oksoetylkarbamoyl)-1-metyletyl)karbaminsyre-tert.-butylester (0,29 g, 0,46 mmol) i metylenklorid (3 ml) ved 0 °C ble det tilsatt trifluoreddiksyre (3 ml), og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Blandingen ble tilsatt etanol (20 ml), konsentrert under vakuum og strippet tre ganger med metylenklorid, hvorved man fikk 0,25 g 2-amino-N-[(lR)-2-[4-benzyl-4-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-((lH-indol-3-yl)-metyl)-2-oksoetyl]-2-metylpropionamid som et hvitt, amorft pulver.

HPLC: Rt = 24,56 min (Al), Rt - 24,95 min (Bl),

Rt = 7,73 min (H8).

LC-MS: Rt - 1, 1 At min, m/z = 533,4 (m + 1).

Eksempel 7

2- amino- N- f( lR)- 2- r( 3R)- 3- benzyl- 3-( N', N'- dimetylhydrazinokarbonyl) piperidin- l- yl l- l- ben2ylokBYmetyl- 2- oksoetyl>- 2-metvlpropionamid

Denne forbindelsen ble fremstilt ved å anvende fremgangsmåten i eksempel 6.

ESMS: m/z: 524,4 (M + H)<+>.

Eksempel 8

2- amino- N- r i IR)- 2- r( 3R)- 3- benzvl- 3-( N', N'- dimetylhydrazinokarbonyl ) piperidin- l- yl1- 1-(( i. H- indol- 3- yl ) metyl)- 2- oksoetvl1-2- metylpropionamid

Denne forbindelsen ble fremstilt ved å anvende fremgangsmåten i eksempel 6.

ESMS: m/z: 533,4 (M + H)<+>.

HPLC: Rt = 27,60 min (Al)

Rt = 26,84 min (Bl).

Eksempel 9

1- H 2R)- 2- r N- < < 2E)- 5- amino- 5- metylheks- 2- enovl)- N- metylamino1-3-( bifenyl- 4- yl) propionyl1- 4- benzylpiperidin- 4- karboksylsvre-etvlester

LC-MS: Rt = 12,11 min, m/z: 610,4 (M + H).

HPLC: Rt = 42,075 min (Al)

HPLC: Rt = 44,383 min (Bl).

Eksempel 10

1- f( 2R)- 2- rN-(( 2E)- 5- amino- 3, 5- dimetvlheks- 2- enovl)- N- metvl-amino1- 3-( bifeny1- 4- yl) propionyl)- 4- benzylpiperidin- 4- karboks-ylsyreetylester

LC-MS: Rt = 12,36 min, m/z: 624,4 (M + H).

HPLC: Rt = 42,785 min (Al)

HPLC: Rt = 45,148 min (Bl).

Eksempel 11

1- ff2R)- 2- TN- ff2E)- 5- amino- 5- metylheks- 2- enoyl)- N- metylamino]-3-( 2- naftyl) propionyl}- 4- benzvlpiperidin- 4- karboksylsyre-etylester

LC-MS: Rt = 11,92 min, m/z: 584,4 (M + H).

HPLC: Rt = 39,893 min (Al)

HPLC: Rt = 42,046 min (Bl).

Eksempel 12

1- f f2R)- 2- TN- f f2E)- 5- amino- 3, 5- dimetvlheks- 2- enovl)- N- metvl-amino1- 3- f 2- naftyl) propionyl)- 4- benzylpiperidin- 4- karboksvl-syreetvlester

LC-MS: Rt = 12,21 min, m/z: 598,2 (M + H).

HPLC: Rt ~ 40,541 min (Al)

HPLC: Rt = 42,780 min (Bl).

Eksempel 13

f 3S)- 1- r( 2R)- 2-(( 2E)- 5- amino- 5- metvlheks- 2- enovlamino)- 3-( 1H-indol- 3- yl) propionyl1- 3- benzylpiperidin- 3- karboksylsyre-etylester

LC-MS: Rt = 10,07 min, m/z: 559,4 (M + H).

HPLC: Rt = 35,585 min (Al)

HPLC: Rt = 37,441 min (Bl).

Eksempel 14

( 3S)- 1- f( 2R)- 2-(( 2E)- 5- amino- 3, 5- dimetylheks- 2- enoylamino)- 3-( lH- indol- 3- yl) propionyll- 3- benzvlpiperidin- 3- karboksvlsvre-etylester

LC-MS: Rt = 10,42 min, m/z: 573,2 (M + H).

HPLC: Rt = 36,680 min (Al)

HPLC: Rt = 38,563 min (Bl).

Eksempel 15

1 3S)- 1- r f 2R)- 2- 1 3- f aminometvl>benzovlamino)~ 3 -( lH- indol- 3- vl)-propionyl1- 3- benzvlpiperidin- 3- karboksvlsvreetvleBter

LC-MS: Rt = 10,24 min, m/z: 567,4 (M + H).

HPLC: Rt = 36,118 min (Al)

HPLC: Rt = 38,052 min (Bl).

Eksempel 16

( 2E)- 5- amino- 5- metylheks- 2- ensyre- N- f f IR)- 2- r4- benzvl- 4-( N', N'- dimetylhydrazinokarbonyl) piperidin- l- vl1- 1-(( 2- naftvi)-metyl)- 2- oksoetyl>- N- metylamid'

LC-MS: Rt = 8,82 min, m/z: 598,4 (M + H).

HPLC: Rt = 30,858 min (Al)

HPLC: Rt = 31,198 min (Bl).

Eksempel 17

f 2E)- 5- amino- 5- metylheks- 2- ensyre- N- T flIO- 2- f3- benzyl- 3-fN', N'- dimetvlhvdrazinokarbonyl) piperidin- l- yll- l-( l lH- indol-3- vl) metyl)- 2- oksoetvl1amid

ESMS: m/z: 573,2 (M + H)<+.>

Eksempel 18

l 2E)- 5- amino- 5- metvlheks- 2- ensyre- N- f( IR )- 2- f3- benzvl- 3-( N', N'- dimetylhydrazinokarbonyl) piperidin- l- yl1- 1-( t 2- naftvi)-metyl)- 2- oksoetyl>- N- metylamid

ESMS: m/z: 598,4 (M + H)<+>.

Eksempel 19

( 2E)- 5- amino- 5- metvlheks- 2- ensvre- f( lR)- 2- r3- benzyl- 3- f N'. N'-dimetylhydraz inokarbony1) piperidin-l-yl]-l-( benzyloksymety1)-2- oksoetvlVamid

LC-MS: Rt = 8,77 min, m/z: 564,2 <M + H).

HPLC: Rt = 29,829 min (Al)

HPLC: Rt - 29,250 min (Bl).

Eksempel 20

2- amino- N- f 2- r 3- benzyl- 3-( N1, N'- dimetylhydrazinokarbonyl)-piperidin- l- vl1- 1- f( 2- na£tylImetvl)- 2- oksoetyl)- 2- metvlpropionamid

LC-MS: Rt = 4,77 min, m/z: 544,4 (M + H).

HPLC: Rt = 30,900/31,586 min (Al)

HPLC: Rt = 30,188/30,727 min (Bl).

Eksempel 21

2- amino- N- f <lR)- 2- r3- benzyl- 3-( N', N'- dimetylhydrazinokarbonyl ) piperidin- l- yl1- 1- ti bifenyl- 4- yl) metyl)- 2- oksoetyl>- 2-metylpropionamid

LC-MS: Rt = 4,98 min, m/z: 570,4 (M + H).

HPLC: Rt = 33,839/34,313 min (Al)

HPLC: Rt = 33,297/33,640 min (Bl).

Eksempel 22

2- amitio- N- f l lR)- 2- r3- benzvl- 3-( N' , N' - dimetylhydrazinokarbonyl ) piperidin- l- vn- l- f( lH- indol- 3- vl) metvl)- 2- oksoetvl)- 2-metvl<p>ropionamid

LC-MS: Rt = 4,32 min, m/z: 533,4 (M + H).

HPLC: Rt = 25,946/27,231 min (Al)

HPLC: Rt = 25,822/26,685 min (Bl).

Eksempel 23

2- amino- N- f2- f 3- benzyl- 3- fN*- dimetylhydrazinokarbonyl) piperidin- l- yl 1- 1- fbenzyloksymetyl)- 2- okBoetyl}- 2- metvlpropionamid

LC-MS: Rt = 4,33/4,75 min, m/z: 510,4 (M + H).

HPLC: Rt = 30,737/30,945 min (Al)

HPLC: Rt = 26,809/27,307 min (Bl).

Eksempel 24

2- amino- N- f( lR)- 2- f3- benzyl- 3- fN', N'- dimetylhydrazinokarbonyl ) piperidin- l- yl1- 1-( benzyloksymetyl)- 2- oksoetyl>- 2- metvlpropionamid

LC-MS: Rt = 4,25/5,27 min, m/z: 519,4 (M + H).

HPLC: Rt = 24,994 min (Al)

HPLC: Rt = 25,742 min (Bl).

Eksempel 25

I- Tf2R)- 2-( 2- amino- 2- metvlpropionvlamino)- 3-( l- H- indol- 3- yl)-propionyl1- 3- benzylpiperidin- 3- karboksylsyre lpvrrolidin - l- yl)-amid

Blanding av diastereomerer

Diastereomer I

LC-MS: Rt = 4,40 min, m/z: 559,4 (M + H).

HPLC: Rt = 26,04 min (Al)

HPLC: Rt = 25,79 min (Bl).

Diastereomer II

HPLC: Rt = 27,38 min (Al).

Eksempel 26

2- amino- N- f flR)- 2- r3- benzvl- 3-( N, N', N'- trimetylhydrazinokarbo-nvl ) piperidin- l- vn- 1- fbenzyloksymetyl)- 2- oksoetyl}- 2- metylpropionamid

Blanding av diastereomerer

Diastereomer I

LC-MS: Rt = 5,07 min, m/z: 547,4 (M + H). HPLC: Rt = 32,16 min (Al).

Diastereomer II

LC-MS: Rt = 5,24 min, m/z: 547,4 (M + H), HPLC: Rt = 33,60 min (Al).

Forbindelsene i eksemplene 9-26 ble fremstilt ved å anvende fremgangsmåtene ifølge eksemplene 1-6.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved at den er valgt fra: 1-{(2R)-2-[N-{(2E)-5-amino-5-metylheks-2-enoyl)-N-metylamino]-3-(2-naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre- metylamid l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3,5-dimetylheks-2-enoyl)-N-metylamino] -3-(2-naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksyl-syrerne t ylami d l-{{2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-metylheks-2-enoyl)-N-metylamino]-3-(bifenyl-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre- rne tyl amid l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3,5-dimetylheks-2-enoyl)-N-metylamino] -3-(bifenyl-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyremetylamid 1-((2R)-2-{N-[{2E)-4-(1-aminosyklobutyl)but-2-enoyl]-N-metylamino }-3-(bifenyl-4-yl)propionyl)-4-benzylpiperidin-4-karboks- ylsyremetylamid 2-amino-N-[(lR)-2-[4-benzyl-4-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl )piperidin-l-yl ]-1-((lH-indol-3-yl)metyl)-2-oksoetyl]-2- metylpropionamid 2-amino-N-{(lR)-2-[(3R)-3-benzyl-3-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl )piperidin-l-yl]-l-benzyloksymetyl-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid 2-amino-N-[(lR)-2-[(3R)-3-benzyl-3-(N'^'-dimetylhydrazinokarbonyl )piperidin-l-yl]-1-((lH-indol-3-yl)metyl)-2-oksoetyl]- 2-metylpropionamid l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-metylheks-2-enoyl)-N-metylamino]-3-(bifenyl-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre- etylester l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3,5-dimetylheks-2-enoyl)-N-metylamino ]-3-(bifenyl-4-yl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboks-ylsyreetylester l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-5-metylheks-2-enoyl)-N-metylamino]-3-(2-na£tyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksylsyre- etylester l-{(2R)-2-[N-((2E)-5-amino-3,5-dimetylheks-2-enoyl)-N-metylamino ]-3-(2-naftyl)propionyl}-4-benzylpiperidin-4-karboksyl- syreetylester (3S)-1-[(2R)-2-((2E)-5-amino-5-metylheks-2-enoylamino)-3-(1H-indol-3-yl)propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboksylsyre-etylester (3S)(2R)-2-((2E)-5-amino-3,5-dimetylheks-2-enoylaraino)-3-(lH-indol-3-yl)propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboksylsyre- etylester (3S)-l-[(2R)-2-(3-(aminomety1)benzoylamino)-3-(lH-indol-3-yl)- propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboksylsyreetylester (2E)-5-amino-5-metylheks-2-ensyre-N-{(IR)-2-[4-benzyl-4-(N',N<1->dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-1-((2-naftyl)-metyl)-2-oksoetyl}-N-metylamid (2E)-5-amino-5-metylheks-2-ensyre-N-[(XR)-2-[3-benzyl-3-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-((lH-indol- 3-yl)metyl)-2-oksoetyl]amid (2E)-5-amino-5-metylheks-2-ensyre-N-{(lR)-2-[3-benzyl-3-(N<*>,N'-dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-((2-naftyl)— metyl)-2-oksoetyl}-N-metylamid (2E)-5-amino-5-metylheks-2-ensyre-{(IR)-2-[3-benzyl-3-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl)piperidin-l-yl]-l-(benzyloksymetyl)-2-oksoetyl}amid 2-amino-N-{2-[3-benzyl-3-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl)-piperidin-l-yl]-1-((2-naftyl)metyl)-2-oksoetyl}-2-metyl- propionamid 2-amino-N-{(lR)-2-[3-benzyl-3-(N',N'-dimetylhydrazinokarbonyl) piperidin-l-yl ]-l-{ (bifeny1-4-yl)metyl)-2-oksoetyl}-2- metylpropionamid 2-amino-N-{(lR)-2-[3-benzyl-3-(N"^'-dimetylhydrazinokarbonyl )piperidin-l-yl]-l-((lH-indol-3-yl)metyl)-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid 2-amino-N-{2-[3-benzyl-3-(N<1->metylhydrazinokarbonyl)piperidin- l-yl] -1-(benzyloksymetyl)-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid 2-amino-N-{(IR)-2-[3-benzyl-3-(W-metylhydrazinokarbonyl)-piperidin-l-yl]-l-((lH-indol-3-yl)metyl)-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid l-[(2R)-2-(2-amino-2-metylpropionylamino)-3-(iH-indol-3-yl)-propionyl]-3-benzylpiperidin-3-karboksylsyre(pyrrolidin-l-yl)-amid 2-amino-N-{(IR)-2-[3-benzyl-3-(N,N<1>,N'-trimetylhydrazinokarbo-nyl)piperidin-l-yl]-1-((lH-indol-3-yl)metyl)-2-oksoetyl}-2-metylpropionamid i og farmasøytisk akseptable salter derav.

2. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel omfatter en forbindelse ifølge krav 1 sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynner.

3. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1, eller et farmasøytisk preparat ifølge krav 2, til fremstilling av et medikament for stimulering av frigjørelsen av veksthormon fra hypofysen til et pattedyr.