NO318009B1 - Forbindelse, farmasoytisk preparat inneholdende den samme samt anvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye rensede ringsystemforbindelser, et farmasøytisk preparat inneholdende en slik forbindelse samt anvendelse derav.

Steroidforstadier eller pro-hormoner som har en sulfatgruppe

i 3-stillingen av steroidkjernen, heretter simpelthen omtalt ' som steroidsulfater, er kjent til å spille en viktig rolle som mellomprodukter i steroidmetabolisme i menneskekroppen, østronsulfat og dehydroepiandrosteron(DHA)sulfat er for eksempel kjent til å spille en viktig rolle som mellomprodukter i kroppens produksjon av østrogener som østron og østradiol. Østronsulfat er for eksempel særlig kjent til å repre-sentere et av de viktigste sirkulerende østrogenforstadier særlig hos kvinner etter overgangsalderen og østronsulfatase-aktivitet i brysttumorer er fra 100-1000 ganger større enn aktiviteten av andre enzymer involvert i østrogendannelse

(James et al, Steroids, 50, 269-279 (1987)).

Østrogener som østron og østradiol og særlig overproduksjonen av disse er sterkt implisert i maligne tilstander som brystcancer, se Breast Cancer, Treatment and Prognosis: Ed. R.A. Stoll, s. 156-172, Blackwell Scientific Publications (1986),

og kontroll av østrogenproduksjon er det spesifikke mål i en rekke anti-cancerterapier, både kjemoterapi og operativ terapi, f.eks. ooforektomi og adrenalektomi. Når det gjelder endokrin terapi har forsøk til nå hatt en tilbøyelighet til å konsentrere seg om aromataseinhibitorer, dvs. forbindelser som inhiberer aromataseaktivitet, hvis aktivitet er involvert i omdannelsen av androgener som androstendion og testosteron til henholdsvis østron og østradiol som det vedlagte flyt-skjema for østrogenmetabolisme viser (fig. l).

I den nylig publiserte internasjonale patentsøknad WO91/13083 er det blitt foreslått å rette søkelyset mot et annet punkt i det metabolske spor vedrørende østrogen, eller heller to andre punkt, det vil si omdannelsen av DHA-sulfat og østronsulfat til henholdsvis DHA og østron ved steroid-sulf ataseaktivitet og anvendelse av 3-monoalkyltiofosfonat-steroidestere som en steroidsulfataseinhibitor, mer spesielt østron-3-monometyltiofosfonat.

Det er et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye forbindelser som kan inhibere steroidsulfa-taséaktivitet in vitro og in vivo.

Det er også et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye forbindelser med forbedret aktivitet som steroidsulfataseinhibitorer både in vitro og in vivo.

Det er også et formål med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe farmasøytiske preparater som er effektive i behandlingen av østrogenavhengige tumorer.

Det er videre et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe farmasøytiske.preparater som er effektive i behandlingen av brystcancer.

Et formål med den foreliggende oppfinnelse er også anvendelse

av en forbindelse for fremstilling av et medikament for å inhibere steroidsulfaktaseaktivitet.

Den foreliggende oppfinnelse er basert på funnet av nye forbindelser som har steroidsulfataseinhiberende aktivitet og i enkelte tilfeller ekstremt høye aktivitetsnivåer. Disse forbindelser er sulfamsyreesterne av polycykliske alkoholer, som er polycykliske alkoholer hvor sulfatet derav er et substrat for enzymer med steroidsulfataseaktivitet (EC 3.1.6.2).

Som anvendt heri vil henvisningen til polycyklisk alkoholer hvis sulfat er et substrat for enzymer med steroidsulfataseaktivitet referere til polycykliske alkoholer hvor sulfatet derav nemlig derivatene med formelen:

ved inkubasjon med steroidsulfatase EC 3.1.6.2 ved pH 7,4 og 37°C, tilveiebringer en i^-verdi på mindre enn 50 //mol. Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en renset forbindelse som er kjennetegnet ved at den er valgt fra forbindelsene med formlene

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et farmasøytisk preparat som er kjennetegnet ved at det inneholder en farmasøytisk aksepterbar bærer eller fortynningsmiddel pg en forbindelse valgt fra forbindelsene med formlene

Endelig vedrører den foreliggende oppfinnelse anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for å inhibere steroidsulfataseaktivitet, hvor forbindelsen er

■valgt fra forbindelser med formlene

Kort beskrivelse av tegningene

Aktiviteten til blant annet østron-3-sulfamat som steroid-sulf ataseinhibitor er vist i de etterfølgende tegninger. Fig. 1 er et skjema som viser de metabolske spor, enzymer og steroidmellomprodukter som er forbundet med dannelsen av østradiol in vivo. Fig. 2 er et histogram som viser den doseavhengige inhiberende virkning av østron-3-sulfamat på steroidsulfataseaktivitet i humane MCF-7-celler in vitro. Fig. 3 er en kurve som sammenligner log dose-respons kurvene for østron-3-sulfamat og østron-3-N,N-dimetylsulfamat på steroidsulfataseaktivitet i human MCF-7-celler in vitro. Fig. 4 er en kurve som viser den doseavhengige inhiberende virkning av østron-3-sulfamat, sammen med dets IC50-verdi {konsentrasjon som kreves for å gi 50 % inhibering), på steroidsulfataseaktivitet i humane placentamikrosomer in vitro.

De nye forbindelser ifølge oppfinnelsen er sulfamsyreestere av polycykliske alkoholer, som er polycykliske alkoholer hvor sulfatet derav er et substrat for enzymer med steroid-sulif ataseaktivitet i overensstemmelse med den allerede tilveiebragte definisjon. Disse forbindelser har formlene som angitt i det foregående.

Sulfamsyreesterne i henhold til oppfinnelsen fremstilles ved å reagere den polycykliske alkohol, f.eks. østron med et sulfamoylklorid R.]R2NS02C1, dvs. reaksjonsskjemaet I Betingelser for å gjennomføre reaksjonsskjema I er som følger: Natriumhydrid og et sulfamoylklorid tilsettes til en omrørt oppløsning av østron i vannfri dimetylformamid ved 0°C. Deretter ble reaksjonsblandingen oppvarmet til romtemperatur og omrøringen fortsettes i ytterligere 24 timer. Reaksjonsblandingen helles inn i en kald mettet oppløsning av natriumbikarbonat og den oppnådde vandige fase ekstraheres med diklormetan. De kombinerte organiske ekstrakter tørkes over vannfritt MgS04. Filtrering etterfulgt av løsningsmiddel-avdamping i vakuum og samtidig avdamping med toluen gir en uren rest som renses ytterligere ved flashkromatografi.

Om nødvendig kan funksjonelle grupper i den polycykliske alkohol (sterol) beskyttes på kjent måte og beskyttelses-gruppen eller -gruppene kan fjernes etter endt reaksjon.

For farmasøytisk tilførsel kan steroidsulfataseinhibitorene i henhold til oppfinnelsen utformes på en hvilken som helst

passende måte ved anvendelse av konvensjonelle farmasøytiske teknikker og farmasøytiske bærere, eksipienser, fortynnings-midler osv. og vanligvis for parenteral tilførsel. Omtrent-lige effektive dosemengder er i området fra 100 til 800 mg/dag avhengig av de individuelle aktiviteter til de aktuelle forbindelser for en pasient med gjennomsnittlig kroppsvekt på 70 kg. Mer vanlige dosemengder for foretrukne og mer aktive forbindelser vil være i området fra 200 til 800 mg/dag, mere foretrukket fra 200 til 500 mg/dag og mest foretrukket fra 2 00 til 25 0 mg/dag. De kan gies i form av enkeltdoser, som oppdelte doser og/eller i form av multiple doser som varer over flere dager. For oral tilførsel kan de være i form av tabletter, kapsler, oppløsninger eller suspensjoner som inneholder fra 100 til 500 mg forbindelse pr. doseenhet. Alternativt og foretrukket vil forbindelsene være utformet for parenteral tilførsel i en passende bærer som kan tilføres parenteralt og med tilveiebringelse av en eneste daglig dosemengde i området fra 200 til 800 mg, foretrukket fra 2 00 til 50 0 og mer foretrukket fra 200 til

250 mg. Slik effektiv daglig dose vil imidlertid variere avhengig av den aktive bestanddels iboende aktivitet og av pasientens kroppsvekt, idet slike variasjoner er innenfor legens faglige bedømning.

I forbindelse med spesielle anvendelser mener man at steroid-sulf ataseinhibitorene i henhold til oppfinnelsen kan anvendes i kombinasjonsterapier, enten med andre sulfataseinhibitorer eller for eksempel i kombinasjon med en aromataseinhibitor som for eksempel 4-hydroksyandrostendion (4-OHA).

I det etterfølgende er det angitt fremstillingseksempler og forsøksdata:

EKSEMPEL 1

Fremstilling av østron-3-sulfamat

Natriumhydrid (60 % dispersjon, 2 ekv.) og sulfamoylklorid

(2 ekv.) ble tilsatt til en omrørt oppløsning av østron (1 ekv.) i vannfri dimetylformamid ved 0°C. Deretter ble reaksjonsblandingen oppvarmet til romtemperatur og omrøringen ble fortsatt ytterligere 24 timer.

Reaksjonsblandingen ble helt inn i en kald mettet oppløsning av natriumbikarbonat og den oppnådde vannfase ble ekstrahert med diklormetan. De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket over vannfritt MgS04. Filtrering etter avdamping av løsningsmiddel i vakuum og ko-avdamping med toluen ga en uren rest som ble ytterligere renset ved flashkromatografi.

Analyser viste de etterfølgende data:

6<1>H(270MHz; CD3OD): 0,91 (s, 3H, C1B-Me), 1,40-2,55 (serier av m, 13H), 2,90-2,92 (m, 2H), 7,04 (br d, 2H, J=10,44Hz), 7,33 (br d, 1H, J=8,42Hz).

6<13>C (67,8MHZ; CD3OD): 14,53 (q, Cie-Me), 22,80 (t), 27,24 (t), 27,73 (t), 30,68 (t), 33,05 (t) , 37,01 (t) , 39,76 (d),

45,73 (s, Cie) , 51,86 (d) , 120,76 (d) , 123,54 (d) , 127,89 (d) , 139,83 (s), 150,27 (s) , 223,87 (s, C=0). m/z (%): 349 (9) (m<+>), 270 (100), 213 (26), 185 (43), 172 (31), 159 (21), 146 (36), 91 (33), 69 (37), 57 (73), 43 (56), 29 '(24) .

Mikroanalyse:

REFERANSEEKSEMPEL 1

Fremstilling av østron-3-N,N-dimetylsulfamat

Prosedyren i eksempel 1 ble gjentatt med unntak av at sulfamoylklorid ble erstattet med den samme mengde N,N-dimetylsulfamoylklorid.

Analyse viste de etterfølgende data:

6<1>H(270MHZ; CDC13):0,92 (s, 3H, C18-Me) , 1,39-1,75 (m, 5H) , 1,95-2,60 (serier av m, 6H) , 2,82 (s, 3H, Me_N-) , 2,96-3,00 (m, 4H) , 2,98 (s, 3H, Me_N-) , 7,04 {brd, 2H, J=7,69Hz), 7,29 (br d, 1H, J=7,88HZ).

m/Z (%) : 377 [M] <+>

Mikroanalyse:

EKSEMPEL 2

Inhibering av steroidsulfataseaktivitet i MCF-7-celler med østron-3-sulfamat

Steroidsulfatase er definert som: Sterylsulfatase EC 3.1.6.2.

Steroidsulfataseaktivitet ble målt in vitro ved anvendelse av intakte MCF-7 humane brystcancerceller. Denne hormon-avhengige cellelinje anvendes i stor grad for å studere kon-trollen av human brystcancer-cellevekst. Den utviser signi-fikant steroidsulfataseaktivitet (Maclndoe et al Endocrino-logy, 123, 1281-1287 (1988); Purohit & Reed/ Int. J. Cancer, 50, 901-905 (1992)) og er tilgjengelig i U.S.A. fra the American Type Culture Collection (ATCC) og i U.K. (f.eks. fra The Imperial Cancer Research Fund). Celler ble holdt i Minimal Essential Medium (MEM) (Flow Laboratories, Irvine, Skottland) inneholdende 20 mM HEPES, 5 % føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, ikke-essensielle aminosyrer og 0,075 % natriumbikarbonat. Opp til 30 replikat 25 cm<2> vevsdyrkingskolber ble inokulert med omtrent l x IO<5> celler/kolbe ved anvendelse av det ovennevnte medium. Cellene ble dyrket til 80 % konfluens og mediet ble skiftet hver tredje dag.

i

Intakte monolag av MCF-7-celler i 25 cm<2> vevsdyrkingskolber in triplo ble vasket med Earle's Balanced Salt Solution (EBSS fra ICN Flow, High Wycombe, U.K.) og inkubert i 3-4 timer ved 37°C med 5 pmol (7 x 10<5> dpm) [6,7-<3>H]østron-3-sulfat (spesifikk aktivitet 60 Ci/mmol fra New England Nuclear, Boston, Mass., U.S.A.) i serumfritt MEM (2,5 ml) sammen med østron-3-sulfamat (11 konsentrasjoner: 0; lfM; 0,0lpM; 0,lpM; lpM; 0,01nM; 0,lnM; 1 nM; 0,01//M; 0,1/iM; IflM) . Etter inkubasjon ble hver kolbe avkjølt og mediet (1 ml) ble pipettert inn i separate rør inneholdende [14C] østron (7 x IO<3> dpm) (spesifikk aktivitet 97 Ci/mmol fra Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, U.K.). Blandingen ble rystet inngående i 3 0 sekunder med toluen (5 ml). Forsøk viste at >90 %

[<14>C]østron og <0,1 % [<3>H]østron-3-sulfat var fjernet fra vannfasen ved denne behandling. En del (2 ml) av den organiske fase ble fjernet, avdampet og <3>H og 14C innholdet i resten ble bestemt ved scintillasjonsspektrometri. Massen av hydrolysert østron-3-sulfat ble beregnet fra de oppnådde <3>H-tellinger (korrigert for anvendte volumdeler medium og organisk fase og for utvinning av tilsatt [14C-] østron) og den spesifikke aktivitet til substratet. Hver gruppe av forsøk omfattet inkubasjoner av mikrosomer fremstilt fra sulfatase-positiv human placenta (positiv kontroll) og kolber uten celler (for å bestemme tilsynelatende ikke-enzymatisk

hydrolyse av substratet). Antallet cellekjerne pr. kolbe ble bestemt ved anvendelse av en Coulter Counter etter behandling av cellemonolagene med Zaponin. En kolbe i hver gruppe ble

anvendt for å vurdere cellemembranstatus og levedyktighet ved anvendelse av Trypan Blue utelukkelsesmetoden (Phillips, H.J.

(1973) In: Tissue culture and applications, [eds: Kruse, D.F. & Patterson, M.K.]; s. 406-408; Academic Press, New York).

Data for østron-3-sulfamat er vist i tabell I og figurene 2 og 3. Resultater av steroidsulfataseaktivitet er uttrykt som gjennomsnittet + 1 standardavvik av det totale produkt (østron + østradiol) dannet under inkubasjonsperioden (20 timer) beregnet for IO<6> celler og, for verdier som viser statistisk signifikans, som en prosentvis reduksjon (inhibering) i forhold til inkubasjoner som ikke inneholdt østron-3-sulfamat. Uparet Student's t-test ble anvendt for å teste resultatenes statistiske signifikans.

EKSEMPEL 3

Inhibering av steroidsulfataseaktivitet i MCF-7-celler ved forbehandling med østron-3-N,N-dimetylsulfamat og østron-3-sulfamat

En forsøksprosedyre som er lik den som er beskrevet i eksempel 2 ble anvendt for å bestemme virkningen av å forbehandle MCF-7-celler med østron-3-sulfamat og østron-3-N,N-dimetylsulfamat.

Intakte monolag ble først inkubert i 2 timer ved 37°C med 0,1 /iM østron-3-sulfamat, østron-3-N,N-dimetylsulfamat eller medium alene (kontroll). Mediet som badet cellene ble deretter fjernet ved avsugning og cellene ble vasket 3 ganger påfølgende med 5 ml medium hver gang. De oppnådde vaskede cel.ler ble deretter resuspendert og inkubert i 3-4 timer ved 37°C i et medium som inneholdt 5 pmol (7 x IO<5> dpm) [6,7-<3>H]østron-3-sulfat. Alle andre trinn var identiske med dem som er beskrevet i referanseeksempel 1 og eksempel 2.

Resultater for østron-3-sulfamat og østron-3-N,N-dimetylsulfamat er vist i tabell II og er uttrykt på samme måte som i tabell I.

EKSEMPEL 4

Inhibering av steroidsulfataseaktivitet i placentamikrosomer ved østron-3-sulfamat

r

Sulfatase-positive human placenta fra fullbyrdede svangerskap (Obstetric Ward, St. Mary's Hospital, London) ble finskåret med sakser og vasket en gang med kald fosfatbuffer (pH 7,4, 50 mM) og deretter resuspendert i kald fosfatbuffer (5 ml/g vev). Homogenisering ble gjennomført med en Ultra-Turax homogenisator ved anvendelse av tre omganger av 10 sekunder separert med 2 minutters perioder for avkjøling på is. Kjerne- og cellebiter ble fjernet ved sentrifugering (4°C) ved 2 000 g i 30 minutter og porsjoner (2 ml) av supernatanten ble lagret ved -20°C. Proteinkonsentrasjonen i supernatan-tene ble bestemt ved metoden etter Bradford (Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)).

Inkubasjoner (1 ml) ble gjennomført ved anvendelse av en proteinkonsentras jon på 10 0 /ig/ml, substratkonsentrasjon på 20 [ iM [6, 7-3H] østron-3-sulfat (spesifikk aktivitet 60 Ci/mmol fra New England Nuclear, Boston, Mass., U.S.A.) og en inkuba-sjonstid på 2 0 minutter ved 3 7°C. Åtte konsentrasjoner av østron-3-sulfamat ble anvendt: 0 (dvs. kontroll); 0,05 fiM; 0,1 ^M; 0,2 /iM; 0,4 flVl; 0,6 /tM; 0,8 /iM; 1,0 //M. Etter inkubasjon ble hver prøve avkjølt og mediet (1 ml) ble pipettert inn i separate rør inneholdende [<14>C]østron (7 x IO3 dpm) (spesifikk aktivitet 97 Ci/mmol fra Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, U.K.). Blandingen ble rystet inngående i 30 sekunder med toluen (5 ml). Forsøk viste at >90 % [14C] østron og <0,1 % [3H] østron-3-sulfat var fjernet fra vannfasen ved denne behandling. En porsjon (2 ml) av den organiske fase ble fjernet, avdampet og <3>H- og <14>C-innholdet i resten ble bestemt ved scintillasjons-spéktrometri. Massen av hydrolysert østron-3-sulfat ble beregnet fra oppnådde <3>H-tellinger {korrigert for volumdelene av anvendt medium og organisk fase og for gjenvinning av tilsatt [<14>C]østron) og den spesifikke aktivitet av substratet.

Resultatene for østron-3-sulfamat er vist i tabell IV og figur 5. Resultatene av steroidsulfataseaktivitet er uttrykt i tabell IV som totalt produkt (østron + østradiol) dannet under inkubasjonsperioden (tid) og som en prosentvis reduksjon (inhibering) i forhold til inkubasjoner som ikke inneholdt østron-3-sulfamat og som virket som kontroll. Resultatene for steroidsulfataseaktivitet er uttrykt i figur 4 som prosentvis reduksjon (inhibering) i forhold til kontroll mot konsentrasjonen av østron-3-sulfamat og inkluderer den beregnede IC50-verdi (dvs. konsentrasjonen av østron-3-sulfamat som gir 50 % inhibering i forhold til kontroll) på 0,07 ^M.

EKSEMPEL 5

Inhibering av steroidsulfataseaktivitet i levermikrosompreparater fra rotter behandlet med subkutan østron-3-sulfamat

Fire grupper av 3 Wistar hunnrotter (vekt fra 80-110 g) ble gitt subkutane injeksjoner på 100 fil (en gang daglig i 7 dager, bærermedium: propylenglykol) av enten:

Propylenglykol (bærerkontroll)

Østron-3-sulfamat (10 mg/kg/dag)

østron-3-sulfat (10 mg/kg/dag) (substratkontroll) østron-3-sulfat (10 mg/kg/dag) + østron-3-sulfamat

(10 mg/kg/dag)

På den åttende dag ble alle rottene avlivet og leverne ble fjernet ved dissekering. Levermikrosompreparater ble fremstilt ved en prosedyre som er analog med den som er beskrevet i eksempel 3 med unntak av at vevskilden var rottelever og at forsøk in duplo for å bestemme steroidsulfataseaktivitet ble gjennomført ved anvendelse av [6,7-<3>H]østron-3-sulfat og [7-<3>H]dehydroepiandrosteron-3-sulfat som separate substrater.

Resultater for steroidsulfataseaktivitet er vist i tabell IV og er uttrykt som totalt produkt dannet under inkubasjonsperioden i form av gjennomsnitt + l st.avvik. Resultater for inkubasjoner av vev oppnådd fra grupper av rotter behandlet med østron-3-sulfamat er også uttrykt som en prosentandel reduksjon (inhibering) i steroidsulfataseaktivitet sammenlignet med deres respektive kontroller. Steroidsulfatase (STS) IC50 for hver forbindelse ble bestemt. IC50 for hver forbindelse er angitt i den etterfølgende tabell V.

Claims (1)

1. i. Renset forbindelse,

   karakterisert ved at den er valgt fra forbindelsene med formlene 2. Farmasøytisk preparat,karakterisert ved at det inneholder en farmasøytisk aksepterbar bærer eller fortynningsmiddel og en forbindelse valgt fra forbindelsene med formlene 3. Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for å inhibere steroidsulfataseaktivitet, hvor forbindelsen er valgt fra forbindelser med formlene