HUT66097A

HUT66097A - Steroid sulphatase inhibitors and pharmaceutical compositions containing the same

Info

Publication number: HUT66097A
Application number: HU9400583A
Authority: HU
Inventors: Michael John Reed; Barry Victor Lloyd Potter
Original assignee: Imperial College
Priority date: 1991-08-29
Filing date: 1992-08-28
Publication date: 1994-09-28
Also published as: NO995075L; GEP20022803B; DK0928609T3; EP0982032A3; DE69233020T2; DE69231280T2; GEP20022766B; NO940635L; SG106116A1; DE69233020D1; UA41875C2; ATE194843T1; ES2148178T3; RU2001125673A; AU1007799A; SK282188B6; ATE239753T1; RU94019334A; UA70958C2; RU2210574C2

Description

A találmány új, szteroid-szulfatáz inhibitorokként használható vegyületekkel és azokat tartalmazó gyógyszerészeti készítményekkel kapcsolatos.

Azok a szteroid prekurzorok, vagy prohormonok, melyek szteroid magjában a 3-as helyzetben egy szulfát-csoport van, és amelyekre ezentúl itt egyszerűen mint szteroid-szulfátokra hivatkozunk, tudvalevőleg fontos szerepet játszanak az emberi szervezetben a szteroid anyagcserében, mint intermedierek. Például az oestron-szulfát és a dehidroepiandroszteron (DHA)szulfát köztudomásúan fontos szerepet játszik a testben az oestrogenek, például az oestron és az oestradiol előállításában, mint intermedier. Különösen az oestronról köztudott, hogy az egyik fő körforgásban lévő oestrogén prekurzor, főként a klimaxon túl lévő nőknél; és az oesron-szulfatáz aktivitás melldaganatokban 1001000-szeresen nagyobb, mint más, az oestrogen-képződésben szerepet játszó enzimek aktivitása (James és munkatársai, Steroids, 50, 269-279 (1987)).

Ezen túlmenően az oestrogenek, mint amilyen az oestron és az oestradiol, különösen túltermelésük esetén, erősen közrejátszanak rosszindulatú betegségek, például a mellrák (lásd Breast Cancer, Treatment and Prognosis: Ed. R.A. Stoll, 156-172 old., Blackwell Scientific Publications (1986)) kialalkulásában, és az oestogen termelés irányítása kiemelt célpontja sok rák elleni terápiának, így a chemoterápiának és a sebészi beavatkozásnak is (pl. petefészek-eltávolítás és mellékvesekiirtás). Az endokrin terápia esetében eddig a figyelmet általában az aromatáz inhibitorok • · · ra koncentrálták, például olyan vegyületekre, melyek gátolják, az aromatáz aktivitást, mely aktivitás, amint azt a mellékelt oestrogen anyagcsere folyamatábra mutatja (1. Ábra), szerepet játszik az androgének, mint például az androsztenedion és a tesztoszteron oestrónná illetve oestradiollá alakításában.

A nemrég kiadott WO91/13083 számú nemzetközi szabadalmi alkalmazásban javaslatot tettek az oestrogen anyagcserefolyamat egy, sőt inkább két másik pontjának megcélzására, melyek a DHAszulfát és az oestron-szulfát DHA-vá illetve oestronná történő alakulása szteroid-szulfatáz hatására, szteroid-szulfatáz inhibitorként 3-monoalkil-tiofoszfonát-szteroid-észtereket, még konkrétabban oesztron-3-monometil-tiofoszfonátot használva szteroid-szulfatáz inhibitorként.

A találmány első célja olyan új vegyületek megadása, melyek képesek a szteroid-szulfatáz aktivitás gátlására mind in vitro, mind in vivő körülmények között.

A találmány második célja olyan új vegyületek megadása, melyeknek bizonyítottan szteroid-szulfatáz gátló hatásuk van mind in vitro, mind in vivő körülmények között.

A találmány harmadik célja olyan gyógyszerészeti készítmények megadása, melyek hatékonyak az oestrogentől függő daganatok kezelésében.

A találmány negyedik célja olyan gyógyszerészeti készítmények megadása, amelyek hatékonyak a mellrák kezelésében.

A találmány ötödik célja egy módszer megadása az oestrogentől függő daganatok kezelésére vonatkozólag, az emlősök és külö• · · nősen az ember esetében.

A találmány hatodik célja egy módszer megadása a mellrák kezelésére vonatkozólag az emlősök és különösen a nők esetében.

A találmány alapját olyan új vegyületek felfedezése képzi, melyek szteroid-szulfatáz gátló hatással bírnak, egyes esetekben kiemelkedően magas hatásszinttel. Ezek a vegyületek policiklikus alkoholok szulfaminsav-észterei, ahol a policiklikus alkoholok szulfát csoportja a szteroid-szulfatáz (EC 3.1.6.2.) aktivitással rendelkező enzimek szubsztrátja, ezeknek a szulfaminsavésztereknek az N-alkil- és N-aril-származékai, valamint ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói.

Általánosabban beszélve, a találmány új vegyületei az (I) általános képletű vegyületek, ahol

R]_ és R₂ egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, cikloalkil-csoport, alkenil-csoport vagy aril-csoport, vagy együttesen egy, adott esetben az alkilén láncban egy vagy több hetero-atomot vagy -csoportot tartalmazó alkilén-csoportot alkotnak; és az -O-policíklus-csoport policiklikus alkohol re ziduumát jelöli, mely policiklikus alkohol szulfátcsoportja a szteroid-szulfatáz aktivitással rendelkező enzimek (EC 3.1.6.2.) szubsztrátja.

Timikor itt olyan policiklikus alkoholokra hivatkozunk, melyek szulfát-csoportja a szteroid-szulfatáz aktivitással rendelkező enzimek szubsztrátja, akkor pontosabban olyan policiklikus alkoholokra gondolunk, melyek szulfát-csoportja az (a) általános képletű vegyület egy származéka, és amelyiket az EC 3.1.6.2. szteroid-szulfatázzal 7,4-es pH mellett, 37 °C hőmérsékleten inkubálva 5 0 μπιοίηέΐ kisebb K-j- értéket ad.

Az l.Ábra sematikusan bemutatja a metabolikus folyamatot, az oestradiol in vivő termelésével kapcsolatos enzimeket és szteroid köztitermékéket.

A találmány vegyületeinek hatékonyságát, mint szteroidszulfatáz inhibitorok, a további ábrák szemléltetik:

A 2. Ábra egy hisztogram, mely az oestron-3-szulfamát dózis-függő, a szteroid-szulfatáz aktivitását gátló hatását mutatja emberi MCF-7 sejtekben, in vitro körülmények között.

A 3. Ábra egy hisztogram, mely az oestron-3-Ν,N-dimetilszulfamát dózis-függő, a szteroid-szulfatáz aktivitását gátló hatását mutatja emberi MCF-7 sejtekben, in vitro körülmények között.

A 4. Ábra egy grafikon, mely az oestron-3-szulfamátnak és az oestron-3-N,N-dimetil-szulfamátnak emberi MCF-7 sejtekben, in vitro körülmények között, a szteroid-szulfatáz aktivitására vonatkozó logaritmikus dózis-hatás görbéit hasonlítja össze.

Az 5. Ábra egy grafikon, mely az oestron-3-szulfamát dózisfüggő, a szteroid-szulfatáz aktivitását gátló hatását mutatja emberi placentaris mikroszómákban, in vitro körülmények között, a rá vonatkozó IC^q értékkel együtt (az a koncentáció, mely az 50 %-os gátlás eléréséhez szükséges).

A találmány egyik vonatkozásában megad új vegyületeket,

nevezetesen policiklikus alkoholok szulfaminsav-észtereit, ahol a policiklikus alkoholok szulfát-csoportja szteroid-szulfatáz aktivitással rendelkező enzimek szubsztrátja, összhangban a fent megadott definícióval, valamint azok Ν-alkil-, N-cikloalkil-, Ν’alkenil- és N-aril-származékait. Ezen vegyületek a fentebb megadott (I) általános képlettel rendelkeznek.

A policiklikus csoport előnyösen maximum 40 szénatomot tartalmaz, beleértve az összes szubsztituenst is, általában azonban a szénatomok száma nem haladja meg a 30-at. Az előnyben részesített policiklikus csoportok azok, amelyek tartalmaznak egy szteroidális gyűrűs szerkezetet, azaz egy ciklopentano-fenantrén szkeletont. Előnyösen a szulfamil- vagy szubsztituált szulfamilcsoport e szkeletonhoz a 3-as helyzetben kapcsolódik, azaz ezek a vegyületek a (II) általános képlettel rendelkeznek, ahol R^ és R₂jelentése a fenti, és az ABCD gyűrűrendszer egy szubsztituált vagy nem szubsztituált, telített vagy telítetlen szteroid magot jelöl, előnyösen oestront vagy dehidroepiandroszteront.

Más megfelelő szteroid gyűrűrendszerek a következők: szubsztituált oestronok, úgymint:

2-OH-oestron 2-metoxi-oestron 4-OH-oestron 6a-OH-oestron

7a-0H-oestron 16a-0H oestron Ιββ-ΟΗ-oestron oestradiolok és szubsztituált oestradiolok, úgymint

2-OH-17£-oestrádiói

4-OH-17£-oestradiol

7a-OH-176-oestrádiói

16β-ΟΗ-17a~oestradiol

17a-oestradiol

2-metoxi-17fi-oestradiol

6α-0Η-17β-οθ3ίΓ3άίο1

16α-OH-17a-oestradiol

16β-ΟΗ-17β-θθΞίrádiói

17β-ΟΘΞίΓ3άίθ1

17a-etinil-17β-οθ5ίΓαάίο1

oestriolok és szubsztituált oestriolok, úgymint:

oestriol

2-OH-oestriol

2-metoxi-oestriol

4-OH-oestriol 6a-0H-oestriol 7a-0H-oestriol szubsztituált dehidroepiandroszteronok, úgymint:

6a-0H-dehidroepiandroszteron 7a-0H-dehidroepiandroszteron

16a-0H-dehidroepiandroszteron 16E-0H-dehidroepiandroszteron

Általában szólva az ABCD szteroid gyűrűrendszer tartalmaz hat a mi szempontunkból semleges egyéb szubsztituenseket. Az ABCD gyururendszer jellemzően tartalmazhat egy vagy több hidroxicsoportot, alkil-csoportot, különösen alacsonyabb szénatomszámú (1-6 szénatomos) alkil-csoportot, például metil-csoportot, etilcsoportot, n-propil-csoportot, izopropil-csoportot, n-butilcsoportot, szek-butil-csoportot, terc-butil-csoportot, n-pentilcsoportot és más pentil-izomereket, n-hexil-csoportot és más hexil-izomereket, alkoxi-csoportot, különösen alacsonyabb szénatomszámú (1-6 szénatomos) alkoxi-csoportot, például metoxicsoportot, etoxi-csoportot, propoxi-csoportot, stb., alkinilcsoportot, például etinil-csoportot, vagy halogén atomot, például fluor-szubsztituenseket.

Más megfelelő, nem szteroidális gyűrűrendszerek közé tartozik például:

a dietil-stilboestrol, a stilboestrol és más olyan gyűrűrendszerek, melyek szulfátjainak Kj értékei 50 ^mólnál kisebbek az EC 3.1.6.2. szteroid-szulfatázra vonatkozólag.

Amennyiben a találmány vegyületei szubsztituáltak, az Nszubsztituált vegyületek tartalmazhatnak egy vagy két N-alkilcsoportot, N-alkenil-csoportot, N-cikloalkenil-csoportot vagy Naril-csoportot szubsztituensként, melyek mindegyike kedvezően « · • ♦ · · · · · · • ··· ·· « *·· ····· ··» . - 8 - .......... * maximum 10 szénatomot tartalmaz. Amikor az Rj_ és/vagy az R₂alkil-csoport, a kedvező esetek azok, ahol R-l és R₂ egymástól függetlenül alacsony szénatomszámú (1-5 szénatomos) alkil-csoport, azaz metil-csoport, etil-csoport, propil-csoport, stb. Előnyösen mind Rp mind R₂ metil-csoport. Amikor és/vagy R₂aril-csoport, akkor a fenil-csoport és a tolil-csoport (-PhCH^; o-, m- vagy p-) előfordulása a jellemző. Amikor R^és R₂ cikloalkil-csoportot jelöl, akkor a ciklopropil-csoport, a ciklopentilcsoport, a ciklohexil-csoport, a tolil-csoport, stb. előfordulása a jellemző. Amikor az R]_ és az R₂ összekapcsolódik, akkor jellemzően egy olyan alkilén-csoportot alkotnak, ami egy 4-6 szénatomos gyűrűt ad, melybe adott esetben egy vagy több hetero-atom vagy -csoport is beépülhet, például -0- vagy -NH-, így egy 5-, 6vagy 7-tagú heterociklust alkotva, például morfolino-csoportot, pirrolidono-csoportot vagy piperidino-csoportot.

Az alkil-csoportba, cikloalkil-csoportba, alkenil-csoportba és aril-csoportba beleértünk olyan szubsztituált csoportokat is, melyek szubsztituensként egy vagy több olyan csoportot is tartalmaznak, melyek nem befolyásolják a kérdéses vegyület szulfatáz gátló hatását. Például a gátlást nem befolyásoló szubsztituensek közé tartozik a hidroxi-csoport, az amino-csoport, a halocsoport, az alkoxi-csoport, az alkil-csoport és az aril-csoport.

A legelőnyösebbek a (III) és a (IV) általános képlettel rendelkező vegyületek, ahol R-]_ és R₂ hidrogénatom vagy 1-5 szénatomos alkil-csoport, például oestron-3-szulfamát és dehidroepiandroszteron-3-szulfamát, valamint ezek 1-5 szénatomos Nalkil származékai, különösen dimetil-származékai, R^ = R₂ = metil-csoport.

• · ·

A találmány szulfaminsav-észtereit a policiklikus alkohol, például oestron vagy dehidroepiandroszteron szulfamoil-kloriddal (R^R2NSO₂C1) való reakciójával állítjuk elő, például az (I) reakcióvázlat szerint.

Az (I) reakcióvázlat szerinti reakció kivitelezéséhez a kővetkező feltételek szükségesek:

°C hőmérsékletű, vízmentes dimetil-formamidban lévő oestron oldatához nátrium-hidridet és egy szulfamoil-kloridot adunk állandó kevergetés közben. Ezután a reakcióelegyet szobahőmérsékletűre engedjük melegedni és a keverést további 24 órán keresztül folytatjuk. A reakcióelegyet egy hideg, telített nátrium-bikarbonát oldatra öntjük és a keletkező vizes fázist diklorometánnal extraháljuk. Az összeöntött szerves extraktumokat vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. Szűrés, majd az oldószer vákuumban való elpárologtatása és toluénnel történő további párologtatás egy visszamaradó nyers anyagot ad, amit flash kromatográfiával tovább tisztítunk.

Amikor az szükséges, a policiklikus alkohol (szterol) adott funkciós csoportjait ismert módszerekkel protektálhatjuk, és a protektáló csoportot vagy csoportokat ilyenkor a reakció végén eltávolítjuk.

Gyógyszerészeti alkalmazásra a találmány szteroid-szulfatáz inhibitorait bármilyen megfelelő módszer szerint formulázhatjuk, hagyományos gyógyszerészeti technikák és gyógyszerészeti hordozók, excipiensek, oldószerek, stb. felhasználásával, általában parenterális beadásra. A hatásos dózis körülbelül 100-800 mg/nap egy átlagos, 70 kg tömegű beteg esetében, az egyes szóban forgó vegyületek hatékonyságától függően. Az előnyösebb és hatékonyabb »

·«·

vegyületek dózisértékei általában a 200-800 mg/nap tartományba, előnyösen a 200-500 mg/nap tartományba, legelőnyösebben pedig a 200-250 mg/nap tartománybaesnek. Beadhatók egyszeri adagokban, osztott adagokban és/vagy több napig ható többszörös adagokban. Orális beadáshoz előállíthatok tabletták, kapszullák, oldatok vagy szuszpenziók formájában, melyek adagonként 100-500 mg vegyületet tartalmaznak. Másik lehetőségként és előnyösebben a vegyületek parenteális beadásra készíthetők elő egy megfelelő parenteálisan beadható hordozóban, amikor is az egyszeri napi adag 200-800 mg közé, előnyösebben 200-500 mg közé, még előnyösebben 200-250 mg közé esik. A hatásos napi dózis azonban függ az aktív hatóanyag inherens aktivitásától és a beteg testsúlyától, az aktuális adag meghatározása az orvos hatáskörébe tartozik majd.

Egyes alkalmazásokban előreláthatólag a találmány szteroidszulfát inhibitorai kombinált terápiákban is felhasználhatók, akár más szulfatáz inhibitorokkal, akár például egy aromatáz inhabitorral kombinálva, mint amilyen például a 4hidroxiandrosztenedion (4-OHA).

A találmányt a következő preparatív példák és mérési eredmények illusztrálják:

1. Példa

Oestron-3-szulfamát előállítása

Vízmentes dimetil-formamidban lévő oestron (1 eq) oldatához nátrium-hidridet (2 eq, 60 %-os diszperzió) és szulfamoilkloridot (2 eq) adunk 0 °C hőmérsékleten, állandó keverés közben. Ezt követően a reakcióelegyet szobahőmérsékletűre engedjük me• 4· ··· legedni, és a keverést további 24 órán keresztül folytatjuk. A reakcióelegyet egy hideg, telített nátrium-bikarbonát oldatra öntjük és a keletkező vizes fázist diklorometánnal extraháljuk. Az összeöntött szerves extraktumokat vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. Szűrés, majd az oldószer vákuumban való elpárologtatása és toluénnel történő további párologtatás egy visszamaradó nyers anyagot ad, amit flash kromatográfiával tovább tisztítunk. Az anyag analízise a következő adatokat adja:

δ^Η (270 MHz; CD3OD): 0,91 (s, 3H, C₁₈Me), 1,40-2,55 (m sorozatok 13H), 2,90-2,92 (m, 2H), 7,04 (br d, 2H, J=10,44 Hz), 7,33 (br d, 1H, J=8,42 Hz).

ő¹³C (67,8 MHz: CD3OD): 14,53 (q, C₁₈~Me), 22,80 (t), 27,24 (t),

27,73 (t) , 30,68 (t) , 33,05 (t), 37,01 (t) , 39,76 (d) , 45,73 (s,

C₁₈) , 51,86 (d) , 120,76 (d) , 123,54 (d) , 127,89 (d) , 139,83 (s), 150,27 (s), 223,87 (s, C=O).

m/z (%) : 349 (9) (m⁺), 270 (100), 213 (26), 185 (43), 172 (31),

159 (21), 146 (36), 91 (33), 69 (37), 57 (73), 43 (56), 29 (24).

Mikroanalizis:

Várt

C

61,87%

H

6,63%

N

4,01%

Talált

61,90%

6,58%

3,95% ·♦ *·« • · « · « ·* • ··· »· · *···« ·«· ·»· ·· «te ·«· ·

2. Példa

Oestron-3-N-metilszulfamát előállítása

Az 1. példa eljárását követjük azzal a különbséggel, hogy szulfamoil-klorid helyett azonos mennyiségű N-metil-szulfamoilkloridot használunk.

Az anyag analízise a következő adatokat adja:

δ¹Η (270 MHz; CDCI3): 0,91 (s, 3H, C₁₈-Me), 1,28-1,68 (m, 6H),

1,93-2,60 (m sorozatok, 7H), 2,90-2,95 (m, 2H), 2,94 (d, 3H,

J=5,13Hz, MeN-), 4,68-4,71 (brm, változhat, 1H, -NH), 7,02-7,07 (m, 2H), 7,26-7,32 (m, 1H).

m/z (%) : 364 [M+H]⁺

3. Példa

Oestron-3-N,N-dimetil-szülfamát előállítása

Az 1. példa eljárását követjük azzal a különbséggel, hogy szulfamoil-klorid helyett azonos mennyiségű N,N-dimetil-szulfamoil-kloridot használunk.

Az anyag analízise a következő adatokat adja:

δ¹Η (270 MHz; CDCI3): 0,92 (s, 3H, C₁₈~Me), 1,39-1,75 (m, 5H),

1,95-2,60 (m sorozatok, 6H), 2,82 (s, 3H, MeN-), 2,96-3,00 (m,

4H), 2,98 (s, 3H, MeN-), 7,04 (br d, 2H, J=7,69 Hz), 7,29 (br d, 1H, J=7,88 Hz).

m/z (%): 377 [M]⁺

Mikroanalízis:

	c	H	N
Várt	63,63%	7,21%	3,71%
Talált	63,50%	7,23%	3,60%

4. Példa

A szteroid-szulfatáz aktivitás gátlása oestron-3-szulfamáttal MCF-7 sejtekben

A szteriod-szulfatáz jelentése itt: szteril-szulfatáz EC 3.1.6.2.

A szteroid-szulfatáz aktivitást in vitro körülmények között mérjük ép MCF-7 emberi mellrák sejtek felhasználásával. Ezt a hormonfüggű sejtvonalat széles körben használják az emberi mellrák sejtek növekedésének ellenőrzésére vonatkozó kutatásoknál. Szignifikáns szteroid-szulfatáz aktivitással rendelkezik (Maclndoe és munkatársai, Endocrinology, 123, 1281-1287 (1988); Purohit & Reed, Int. J. Cancer, 50, 901-905 (1992)) és az USA-ban beszerezhető az Amerikai Törzsgyüjteményből (ATCC) és Angliában példá-

- 14 ul a Birodalmi Rákkutatási Alapítványtól. A sejteket minimális alaptáptalajban (Minimál Essential Médium, MÉM) tartjuk fenn (Flow Laboratories, Irvine, Scotland) ami 20 mM HEPES-t, 5 % magzati borjú szérumot, 2 mM glutamint, nem-esszenciális aminosavakat és 0,075 % nátrium-bikarbonátot tartalmaz. Egészen 30 ismétlésig 25 cm² alapterületű szövettenyésztő lombikokat oltunk be körülbelül lxlO⁵ sejt/lombik mennyiségben, a fenti táptalajt használva. A sejteket 80 %-os összeérésig növesztjük és a táptalajt minden harmadik nap kicseréljük.

Intakt egyrétegű MCF-7 sejteket háromszoros, 25 cm²-es szövettenyésztő lombikokban Earle-féle kiegyenlített sóoldattal (EBSS, az ICN Flow-ból, High Wycombe, U.K.) mosunk, majd 3-4 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubálunk 5 pmol (7x10dpm) [6,7-²H]-oestron-3-szulfáttal (specifikus aktivitás 60 Ci/mmol, származási hely a New England Nuclear, Boston, Mass., USA) szérummentes MEM-ben (2,5 ml), oestron-3-szulfamátal együtt (11 különböző kioncentrációban: 0; 1 fM; 0,01 pM; 0,1 pM; 1 pM; 0,01 nM;

0,1 nM; 1 nM; 0,01 μΜ; 0,1 μΜ; ΙμΜ). Az inkubálás után minden egyes lombikot lehűtünk és a táptalajt (1 ml) [¹⁴C]oestront (7xl0² dpm)(specifikus aktivitás 97 Ci/mmol, származási hely: Amersham Nemzetközi Rádiokémiai Központ, Amersham, UK.) tartalmazó különálló kémcsövekbe pipettázzuk. Az elegyet 30 másodpercen keresztül alaposan összerázzuk toluénnel (5 ml). A kísérletek azt mutatják, hogy több mint 90 % [¹⁴C]oestront és kevesebb mint 0,1 % [²H]oestron-3-szulfátot távolítunk el a vizes fázisból ezzel a kezeléssel. A szerves fázis egy részét (2 ml) elválasztjuk, párologtatjuk, és a visszamaradó anyag és ¹⁴C tartalmát szcintcillációs spektrometriával meghatározzuk. A hidrolizált :··. .. í ·· ·· ··· ·

- 15 oestron-3-szulfát tömegét a szubsztrát specifikus aktivitásából és a kapott ³H beütésekből számítjuk ki (korrigálva a táptalaj és a felhasznált szerves fázis térfogatára és a hozzáadott [¹⁴C]oestron visszanyerésére). Minden kísérletsorozat tartalmaz szulfatáz-pozitív humán placentából készített mikroszóma-inkubátumokat (pozitív kontroll) és sejtmentes lombikokat (a szubsztrát nyilvánvalóan nem enzimatikus hidrolízisének megbecsülésére). A lombikonkénti sejtmagszámot egy Coulter számláló segítségével határozzuk meg, miután a sejtrétegeket Zaponinnal kezeljük. Minden sorozatból egy lombikot arra használunk, hogy megbecsüljük a sejtmembránok állapotát és életképességét a Tripán Kék kizárásos módszer felhasználásával (Phillips, H.J. (1973), Tissue culture and applications, [kiadó: Kruse, D.F. & Patterson, M.K.J; 406-408 old.; Academic Press, New York).

Az oestron-3-szulfamátra vonatkozó adatok az 1. táblázatban és a 2. és 4. ábrán láthatók. A szteroid-szulfatáz aktivitásra vonatkozó eredmények átlag + 1 S.D. -ben vannak kifejezve az inkubálás során (20 óra) képződött teljes termékre (oestron + oestradiol) vonatkozólag, 10⁶ sejtre számolva, míg a statisztikus szignifikanciát mutató értékek mint százalékos csökkenések (gátlás) jelentkeznek az oestron-3-szulfamátot nem tartalmazó inkubátumokhoz képest. Az eredmények statisztikus szignifikanciájának meghatározására a páratlan Student t-próbát használjuk.

I. Táblázat

Szteroid-szulfatáz aktivitás MCF-7 sejtekben oestron-3-szulfamát j elenlétében

oestron-3	szteroid-szulfatáz	%-os csökkenés a
szulfamát	aktivitás q (fmol/20	kontrolhoz képest
koncentráció	hr/10⁶sejt)	(%-os gátlás)
0 (kontrol)	319,7+18,5
1 fM	353,3+39,0
0,01 pM	362,3+21,2
0,1 pM	330,7+17,8
1 pM	321,8+6,2
0,01 nM	265,1+11,0*	17,2 %
0,1 nM	124,8+12,4***	60,9 %
1 nM	16,49+4,7***	95,0 %
0,01 μΜ	3,92+0,4***	98,8%
0,1 μΜ	- — ~ * * * 2,5 3 + 1,1	99,2 %
1 μΜ	- >- ~ - „ * * * 1,6 8+.0,7	99,5%

q átlag + 1 S.D. n=3 *p á0,05 ***p<0,001

5. Példa

A szteroid-szulfatáz aktivitás gátlása oestron-3-N,N-dimetilszulfamáttal MFC-7 sejtekben

A 4. példában leírttal azonos kísérleti eljárást használunk az oestron-3-N,N-dimetil-szulfamátra vonatkozó eredmények összegyűjtésére is, azzal a különbséggel, hogy az inkubálásokat oeston-3-N,N-dimetil-szulfamáttal (5 különböző koncentráció: 0, 0,001 μΜ, 0,01 μΜ, 0,1 μΜ, 1 μΜ) végezzük az oestron-3-szulfamát helyett.

Az oestron-3-N,N-dimetil-szulfamátra vonatkozó eredményeket a II. táblázat és a 3. ábra mutatja, az I. táblázat illetve a 2. ábra jelöléseit megtartva. Ezenkívül a 4. ábra összehasonlítja az oestron-3-N,N-dimetil-szulfamát és az oestron-3-szulfamát logaritmikus dózis-hatás görbéit.

II. Táblázat

Szteroid-szulfatáz aktivitás MCF-7 sejtekben oestron-3-Ν,Νdimetil-szulfamát jelenlétében

oestron-3-Ν,Ν-	szteroid-szulfatáz	%-os csökkenés a
dimetil-szülfamát	aktivitás q (fmol/20	kontrolhoz képest
koncentráció	hr/10⁶sejt)	(%-os gátlás)
0 (kontrol)	82,63+3,6
0,001 μΜ	68,33+3,2**	17,3%
0,01 μΜ	46,0+4,9***	44,3%
0,1 μΜ	17,43+4,3***	78,9 %
1 μΜ	11,89+3,7***	85,6%

q átlag + 1 S.D. n=3 **p <0,01 ***p<0,001

6. Példa

A szteroid-szulfatáz aktivitás gátlása oestron-3-szulfamáttal és oestron-3-N,N-dimetil-szulfamáttal való előkezeléssel MFC-7 sej tekben

A 4. példában leírthoz hasonló kísérleti eljárással határ18 ózzuk meg az MCF-7 sejtek oestron-3-szulfamáttal illetve oestron-3-N,N-dimetil-szulfamáttal való előkezelésének hatását.

Intakt monorétegeket előzetesen 0,1 μΜ oestron-3-szulfamáttal, oestron-3-N,N-dimetil-szulfamáttal illetve csak táptalajjal (kontrol) 2 órán keresztül inkubálunk 37 °C hőmérsékleten. Ezt követően a sejteket tartalmazó táptalajt levegőztetéssel eltávolítjuk, és a sejteket háromszor egymás után 5-5 ml táptalajjal mossuk. Ezután a kapott kimosott sejteket újra szuszpendáljuk és 3-4 órán keresztül inkubáljuki 37 °C hőmérsékleten 5 pmol (7xl0⁵ dpm) [6,7-³H]oestron-3-szulfátot tartalmazó táptalajban. Minden más vonatkozásban a 3. és 4. példában leírtakat követjük.

Az oestron-3-szulfamátra és az oestron-3-N,N-dimetilszulfamátra vonatkozó eredményeket a III. táblázat mutatja, megtartva az I. táblázat jelöléseit.

III. Táblázat

Szteroid-szulfatáz aktivitás oestron-3-szulfamátokkal elő-inkubált MCF-7 sejtekben elő-kezelés szteroid-szulfatáz %-os csökkenés a aktivitás q (fmol/20 kontrolhoz képest hr/10^sej t) (%-os gátlás) kontrol

65,4+6,4 oestron-31,7+0,2***

97,4 % szulfamát oestron-353,1+3,4*

18,8%

N,N-dimetil szulfamát q átlag + 1 S.D. n=3 *p á0,05 ***p<0,001

7. Példa

A szteroid-szulfatáz aktivitás gátlása oestron-3-szulfamáttal placentális mikroszómákban

Normál idejű terhességekből származó szulfatáz-pozitív emberi placentát (Obstetric Ward, St Mary's Hospital, London) ollóval apróra vágunk és egyszer hideg foszfát pufferrel (pH 7,4; 50 mM) mossuk, majd hideg foszfát pufferben újra szuszpendáljuk (5 ml/g szövet). Az elegyet Ultra-Turrax homogenizátorral homogenizáljuk háromszor 10 másodperces menetben, köztük 2-2 perc jégben való hűlési idővel. A sejtmagokat és a sejtek roncsait 30 percig tartó centrifugálással távolitjuk el (4 °C, 2000 g), és a felülúszó réteg 2 ml-es adagjait -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A felülúszó rétegek protein koncentrációját Bradford módszerével határozzuk meg (Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)).

Az inkubálásokat (1 ml) 100 μg/ml protein koncentráció és 20 μΜ [6,7-²H]oestron-3-szulfát koncentráció (60 Ci/mmol specifikus aktivtiás, származási hely: New England Nuclear, Boston, Mass., USA) mellett végezzük 20 percen keresztül, 37 °C hőmérsékleten. Az oestron-3-szulfamát 8 különböző koncentrációját alkalmazzuk: 0 (kontol); 0,05 μΜ; 0,1 μΜ; 0,2 μΜ; 0,4 μΜ; 0,6 μΜ; 0,8 μΜ, 1,0 μΜ. Az inkubáció után mindegyik mintát lehűtjük és a táptalajokat (1 ml) különálló kémcsövekbe pipeptázzuk, melyek 7xl0² dpm [¹⁴]oestront (97 Ci/mmol specifikus aktivitás, származási hely: Amersham Nemzetközi Radiokémiái Központ, Amersham, UK.) tártál20

maznak. Az elegyet 30 másodpercen keresztül alaposan összerázzuk 5 ml toluénnel. A kísérletek tanúsága szerint ezzel a kezeléssel a [¹⁴C]oestron több mint 90, a [³H]oestron-3-szulfát kevesebb mint 0,1 %-át távolítsuk el a vizes fázisból. A szerves fázis egy részét (2 ml) eltávolítjuk, párologtatjuk, és a visszamaradó anyag ³H és ¹⁴C tartalmát szcintcillációs spektrometriával határozzuk meg. A hidrolizált oestron-3-szulfát tömegét a szubsztrát specifikus aktivitásából és a kapott ³H beütésekből számítjuk ki (korrigálva a táptalaj és a felhasznált szerves fázis térfogatára és a hozzáadott [¹⁴C]oestron visszanyerésére).

Az oestron-3-szulfamátra vonatkozó eredményeket a IV táblázat és az 5. ábra mutatja. A szteroid-szulfatáz aktivitásra vonatkozó adatok a IV táblázatban az inkubálás ideje alatt képződött összes termék (oestron + oestradiol) mennyiségében , valamint az oestron-3-szulfamátot nem tartalmazó (kontrol) inkubációkhoz képesti százalékos csökkenés (gátlás) formájában vannak kifejezve. A 4. ábrán a szteroid-szulfatáz aktivitásra vonatkozó adatok az oestron-3-szulfamát koncentrációjának függvényében megadott, a kontrolhoz képesti százalékos csökkenés (gátlás) formájában vannak kifejezve, és tartalmazzák a számított 0,07 μΜ-os IC5Q értéket is (azaz azt az oestron-3-szulfamát koncentrációt, ami a kontrolhoz képest 50 %-os gátlást eredményez).

IV. Táblázat

Szteroid-szulfatáz aktivitás placentális mikroszómákban oestron-3-szulfamát jelenlétében oestron-3 szteroid-szulfatáz %-os csökkenés a

szulfamát koncentráció	aktivitás q (pmol/hr/ 0,1 mg protein)	kontrolhoz képest (%-os gátlás)
0 (kontrol)	768,6
0,05 μΜ	430,4	44,0%
0,1 μΜ	305,9	60,2 %
0,2 μΜ	140,0	81,8 %
0,4 μΜ	83,3	89,2 %
0,6 μΜ	61,8	92,0 %
0,8 μΜ	49,2	93,6 %
1,0 μΜ	51,6	93,3 %

q 2 becslés átlaga

8. Példa

A szteroid-szulfatáz aktivitás gátlása szubkután oestron-3-szulfamáttal kezelt patkányokból származó máj mikroszóma preparátumokban

3-3 Wistar nősténypatkány (80-110 mg testtömeg) 4 csoportjának 100 μΐ szubkután injekciót adunk (7 napon keresztül napi egyszer, hordozó: propilén-glikol) a következő hatóanyagok egyikével :

Propilén-glikol (hordozóanyag-kontrol)

Oestron-3-szulfamát (10 mg/kg/nap)

Oestron-3-szulfát (10 mg/kg/nap) (szubsztrát kontrol)

Oestron-3-szulfát (10 mg/kg/nap) + Oestron-3-szulfamát (10 mg/kg/nap)

A nyolcadik napon az összes patkányt megöljük és a májukat boncolással kivesszük. A máj mikroszóma preparátumokat a 6. példában leírt eljárás szerint készítjük el azzal a különbséggel, hogy a szövetek forrása most patkánymáj és a szteroid-szulfatáz aktivitásának meghatározására szolgáló kontrolkísérleteket 6,7²H]oestron-3-szulfát és [7-^]dehidroepiandroszteron-3-szulfát, mint különálló szubsztrátok felhasználásával végezzük el.

A szteroid-szulfatáz aktivitására vonatkozó adatok az V. táblázatban láthatók, és az inkubálás ideje alatt képződött teljes termékmennyiségben vannak kifejezve, átlag + 1 S.D. formájában. Az oestron-3-szulfamáttal kezelt patkánycsoportokból származó szövetek inkubációjára vonatkozó eredmények szintén megtalálhatók az V. táblázatban, mint a szteroid-szulfatáz aktivitásában beálló százalékos csökkenés (gátlás) a megfelelő kontrolokhoz viszonyítva.

V. Táblázat

Szteroid-szulfatáz aktivitás szubkután oestron-3-szulfamáttal kezelt patkányokból származó máj mikroszóma preparátumokban

A kezelő	vizsgálati	szteroid-szulfatáz	%-os csökkenés a
csoport	szubsztrát	aktivitás q	kontrolhoz képest
		(nmol/30 min/200	(%-osgátlás)
		μρ protein)
kontrol	E₁-S	20,95+0,2
(hordozó)
e₁-so₃nh₂	E₁~S	0,34+0,1***	98,4 %
kontrol	e^l-s	20,6+0,4

(E₁-S) • ··

e₁-s+e₁-so₃nh₂	e^s	0,21+0,03***	99,0 %
kontol	DHA-S	1,73+0,4	--
(hordozó)
e₁-so₃nh₂	DHA-S	0,1+0,01***	94,2 %
kontrol	DHA-S	1,71+0,1
(E₁-S)
e₁-s+e₁-so₃nh₂	DHA-S	0,09+0,01***	94,7 %

q átlag + 1 S.D. n=3 ***p<0,001

E^-S = oestron-3-szulfamát

DHA-S = dehidroepiandroszteron-3-szulfát

E^-SO₃NH₂ = oestron-3-N,N-dimetil-szulfamát

Claims

1. Policiklikus alkoholok szulfaminsav-észterei azzal jellemezve, hogy a policiklikus alkoholok szulfát-csoportja a szteroid-szulfatáz aktivitással rendelkező enzimek egy szubsztrátja; valamint ezek N-alkil-, Ν-alkenil-, N-cikloalkil- és N-aril-származékai.

2. Az 1. igénypont szerinti szulfaminsav-észterek azzal jellemezve, hogy szerkezetüket az I általános képlet írja le, ahol és R₂ egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, cikloalkil-csoport, alkenil-csoport vagy aril-csoport, vagy együttesen egy, adott esetben az alkilén láncban egy vagy több hetero-atomot vagy -csoportot tartalmazó alkilén-csoportot alkotnak; és az -O-policiklus-csoport a policiklikus alkohol említett reziduumát jelöli, mely policiklikus alkohol szulfát-csoportja a szteroid-szulfatáz aktivitással rendelkező enzimek (EC 3.1.6.2.) szubsztrátja.

3. A 2. igénypont szerinti szulfaminsav-észterek azzal jellemezve, hogy bennük az említett policiklikus alkohol egy szterol.

4. A 3. igénypont szerinti szulfaminsav-észterek azzal jellemezve, hogy bennük az említett szterol egy 3-szterol.

5. A 4. igénypont szerinti szulfaminsav-észterek azzal jellemezve, hogy bennük az említett szterol oestron, egy dehidroepiandroszteron, egy szubsztituált oestron vagy egy szubsztituált dehidroepiandroszteron.

6. A 2.-5. igénypontok bármelyike szerinti szulfaminsavészterek azzal jellemezve, hogy az N-alkil-szubsztituált vegyületekben az N-alkil-szubsztituens(ek) 1-10 szénatomszámú alkilcsoport (ok) .

7. A 6. igénypont szerinti szulfaminsav-észterek azzal jellemezve, hogy bennük az N-alkil-szubsztituens(ek) 1-5 szénatomos alkil-csoport(ok).

8. A 6. igénypont szerinti szulfaminsav-észterek azzal jellemezve, hogy bennük az N-alkil-szubsztituens(ek) metil-csoport(ok).

9. Oestron-3-szulfamát.

10. Oestron-3-N,N-dimetil-szulfamát.

11. Egy, egy gyógyszerészetileg elfogadható oldószer vagy hordozó és egy szteroid-szulfatáz inhibitor keverékét tartalmazó, az oestrogen függő daganatok kezelésére szolgáló gyógyszerészeti készítmény azzal jellemezve, hogy benne a szteroid-szulfatáz inhibitor vagy maga egy, az 1.-10. igénypontok bármelyike szerinti szulfaminsav-észter, vagy annak egy hatékony mennyiségét tartalmazza.

12. Az emlősökben lévő oestrogen függő daganatok kezelésére szolgáló eljárás tökéletesítése azzal jellemezve, hogy az emlős- ··· · ···· • ··· ·· * ··«

- 26 nek adott esetben egy vagy több más chemoterapikus vagy egyéb gyógyszerészetileg aktív vegyülettel együtt, mint egy kombinált terápia része, egy szteroid-szulfatáz in vivő aktivitást gátló szert adunk be, ahol a szteroid-szulfatáz inhibitor egy, az I általános képlettel rendelkező vegyület egy hatékony mennyisége,

ahol és R₂ egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, cikloalkil-csoport, alkenil-csoport vagy aril-csoport, vagy együttesen egy, adott esetben az alkilén láncban egy vagy több hetero-atomot vagy -csoportot tartalmazó alkilén-csoportot alkotnak; és az -O-policiklus-csoport a policiklikus alkohol említett reziduumát jelöli, mely policiklikus alkohol szulfát-csoportja a szteroid-szulfatáz aktivitással rendelkező enzimek (EC 3.1.6.2.) szubsztrátja.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy benne az említett szteroid-szulfatáz inhibitor általános képletében az O-policiklus 3-szterol-reziduumot jelöl.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy benne az említett 3-szterol-reziduum 3-oestron- vagy 3-dehidroepiandroszteron-reziduum.

15. A 12. igényopnt szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy benne a szteroid-szulfatáz inhibitor oestron-3-szulfamát, oestron-3alkil-szulfamát, ahol az alkil-csoport 1-5 szénatomot tartalmaz, dehidroepiandroszteron-3-szulfamát vagy dehidroepiandroszteron27

-3-alk.il-szülfámát, ahol az alkil-csoport 1-5 szénatomot tartal-

16. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy benne a szteroid-szulfatáz inhibitor oestron-3-szulfamát, oestron-3-Ν,N-dimetii-szülfamát vagy oestrón-3-N-monometil-szülfamát.