NO173785B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av farmasoeytisk virksomme kinuklidinderivater samt mellomprodukt for fremstillingen - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av nye, terapeutisk aktive spiro(1,3-oksatiolan-5,3')kinuklidiner og et nytt hydroksymerkaptometylkinu-klidin.

US patent nr. 4.083.985 beskriver en rekke kinuklidiner med kondensert ring som er beskrevet som psykomotoriske stimu-lanter, og som strukturelt kan betraktes som en kinuklidin-kjerne kondensert til en cykloheksanon-, cykloheksenon- eller delta-laktondel. Disse forbindelsene angis å være nyttige for behandling av (bl.a.) Parkinsons' sykdom og depresjon, og har tydeligvis antikolinergisk aktivitet. Det foreligger ingen indikasjon i dette patentet på at noen av disse forbindelsene har kolinergisk aktivitet.

US patent nr. 4.104.397 beskriver spiro(1,3-dioksolan-4,3')kinuklidiner som kan ha en eller to alkyl- og/eller arylsubstituenter i 2-posisjonen på dioksolanringen. Patentet beskriver spesifikt monometyl-, dimetyl- og difenylfor-bindelser. Monometylforbindelsen er vist å ha kolinerg aktivitet og difenylforbindelsen å ha antikolinerg aktivitet. Naturen av den farmakologiske aktiviteten som vises av andre forbindelser innbefattet i dette patentet er ikke beskrevet.

En kronisk utilstrekkelighet in vivo i sentral kolinerg funksjonen, dvs. i funksjonen av acetylkolin som en neuro-transmitter, er funnet ved en rekke neurologiske og psykia-triske sykdomstilstander, innbefattende senil demens av Alzheimer's type (SDAT), tardiv dyskinesi, Pick's sykdom, Huntington's sanktveitsdans, Gilles de la Tourette sykdom, Friedrich's ataksi og Down's syndrom. Kliniske resultater tyder på at den kolinergiske transmisjonen kan ha vært påvirket hos personer som lider av disse sykdommene (Fisher og Hanin, Life Sciences, 27: 1615, 1980).

Blant disse sykdomstilstandene er SDAT den mest utbredte neuropsykiatriske sykdommen (for en oversikt se Schneck et al., Am. J. Psychiatry, 139: 165, 1982 og Coyle et al., Science 219: 1184, 1983). Utviklingen av en effektiv behandling for SDAT er et av de mest påtrengende behovene medisinen idag står overfor. Denne aldersbetingede sykdommen brer stadig om seg ettersom populasjonen av eldre mennesker vokser som en følge av den stadig høyere forventede levetiden for den eldre befolkningsgruppen.

SDAT er karakterisert morfologisk ved et forøket antall senile plaketter i utvalgte hjerneområder; biokjemisk ved en betydelig reduksjon i presynaptiske kolinergisk markører i de samme hjerneområdene, spesielt i korteks og hippokampus; og oppførselsmessig ved et tap av kognitive funksjoner hos de individuelle pasientene.

Siden SDAT synes å være forbundet med kolinergisk hypofunksjon i hjernen, har det vært gjennomført forsøk hvori man har administrert ACh-forstadier (kolin og lecitin), acetylkolin-esterase-inhibitorer (fysostigmin eller tetrahydroaminoakridin) eller direktevirkende muskarin-agonister (arekolin) til SDAT-pasienter på grunn av disse midlenes evne til å heve, og derved antagelig gjenopprette den kolinergiske aktiviteten i hjernen. Frem til idag har man ikke kunnet trekke noen konklusjoner av resultatene vedrørende virksom-heten av behandling med de ovenfor nevnte midlene; dette skyldes hovedsakelig uønskede bivirkninger, trangt terapeutisk vindu, eller mangel på terapeutisk effektivitet.

Det foreligger et stort behov for legemidler som er effektive ved behandling av SDAT. Fremgangen på dette området har vært hindret av mangelen på adekvate dyremodeller som direkte kan etterlikne den kolinergiske abnormaliteten som finnes ved SDAT, og av mangelen på sentrale kolinergiske agonister med langvarig virkning som kan skille mellom underklasser av reseptorer, og først og fremst aktivere de som er innbefattet i kognitive funksjoner. De fleste kjente kolinergiske agonistene (muskarinlegemidler) har uønskede bivirkninger. Et lenge-virkende, sentralaktivt kolinomimetisk legemiddel uten perifere bivirkninger ville derfor være meget nyttig. Forskning vedrørende, og utvikling av, slike legemidler ville kreve vurdering i egnede dyremodeller for SDAT.

I denne sammenheng er det i den senere tid utviklet et selektivt presynaptisk kolinergisk neurotoksin, etylkolina-ziridiniumion (AF64A), som ved intracerebroventrikulær injeksjon i rotter induserer vedvarende kolinergisk hypofunksjon som etterlikner den hjernebark- og hippokampus-kolinergiske mangelen og de kognitive skadene som rapporteres ved SDAT. Denne dyremodellen kan være meget nyttig ved utvikling av nye behandlingsfremgangsmåter for SDAT. (Fisher et al., i "Behavorial Models and the Analysis of Drug Action", redaktører Spiegelstein og Levy, Elsevier, Amsterdam, 1983, s. 333; Fisher og Hanin, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 26: 161-81 (1986 ). )

Tilgjengeligheten av sentralt aktive muskarinforbindelser som har langvarig sentral kolinergisk aktivitet uten betydelige negative perifere bivirkninger og som er i stand til å reversere de kognitive skadene indusert av AF64A hos rotter, kan være meget nyttige ved behandling av SDAT og de ovenfor nevnte beslektede sykdomstilstandene.

Terapeutisk aktive oksatiolanforbindelser og deres farmako-logi er relativt lite kjent. Videre er litteraturen spekket med mislykkede forsøk på å erstatte et spesielt atom eller en gruppe i en farmakologisk aktiv kjemisk forbindelse med et antatt analogt atom eller en gruppe, i et forsøk på å forbedre den terapeutiske profilen for den opprinnelige forbindelsen. Ved erstatning av f.eks. et oksygenatom med et svovelatom som har dobbelt så høy atommasse som oksygen, kan følgelig resultatet når det gjelder farmakologiske egenskaper ikke forutsies med noen grad av sikkerhet.

Det er imidlertid nå overraskende funnet at dersom man i spiro-(dioksolan)kinuklidinene ifølge US patent nr. 4.104.397, erstatter det oksygenatomet i dioksolanringen som befinner seg lengst borte fra kinuklidinkjernen med et svovelatom, og samtidig omfanget av substituentene ved 2-posisjonen utvides til å innbefatte diarylmetylol, og alkyl substituert med aryl, så vil (i) den mest aktive isomeren av monometylforbindelsen, samtidig som den har en ikke ulik aktivitet (mål ved den marsvin ileum-induserte kontraksjonen og muskarinreseptorbindingsforsøkene) sammenliknet med den for den mest aktive isomeren av analogen beskrevet i det tidligere nevnte US patentet, imidlertid vise betydelig mindre uttalte bivirkninger (sialogen og tremorigen aktivitet) enn sistnevnte forbindelse under tilsvarende betingelser; og (ii) den mest aktive isomeren av monometylforbindelsen ha interessant potensial for behandlingen av SDAT som vist ved forsøkene på dyremodellene omtalt ovenfor.

På den annen side vil hoveddelen av de andre 2-substituerte medlemmene av seriene inneholdende svovelatomet istedenfor oksygen som nevnt ovenfor, og spesielt de forbindelsene som inneholder minst en 2-substituent som er alkyl med tre eller flere karbonatomer, cyklopentyl, cykloheksyl, aryl, diarylmetylol eller alkyl substituert med aryl, ha antikolinergisk aktivitet, i motsetning til den kolinergiske aktiviteten av monometylforbindelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig fremstilling av farmasøytisk virksomme kinuklidinderivater med den generelle formel (I) hvori Z står for gruppen >CR<1>R<2>, hvor R<1> er valgt fra laverealkyl og difenyllaverealkyl, og R<2> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og fenyl, og geometriske isomerer, enantiomerer, diastereoisomerer, racemater og/eller syreaddisjonssalter derav.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen har aktivitet på sentralnervesystemet. Disse forbindelsene kan betegnes som 2,2-disubstituerte spiro(1,3-oksatiolan-5,3')kinuklidiner. Eksempler på slike forbindelser er beskrevet i følgende tabell:

Oppfinnelsen innbefatter også utgangsforbindelsen 3-hydroksy-3-merkaptometylkinuklidin, hvorfra forbindelsene med formel (I) kan fremstilles.

Som angitt ovenfor innbefatter oppfinnelsen de geometriske isomerene, enantiomerene, diastereoisomerene, racematene og/eller syreaddisjonssaltene av forbindelsene av formel (I).

Det bør bemerkes at den geometriske isomerien oppstår på grunn av det faktum at i spiro-forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan Ri f.eks. være på enten på den samme siden av oksatiolanringen som nitrogenatomet av kirruklidinringen eller på den motsatte siden. Dersom R<1> og R<2> er identiske i spiro-forbindelsene vil det være et enkelt asymmetrisentrum ved 5,3'(spiro)karbonatomet, dette vil også gi opphav til enantiomerer og racemater derav. Dersom på den annen side R^ og R<2> i spiro-forbindelsene ikke er identiske, vil det finnes et ytterligere asymmetrisentrum ved 2-posisjonen av oksatiolanringen, dette gir opphav til diastereoisomerer og racematene derav, i tillegg til de allerede nevnte geometriske isomerene. Det skal videre bemerkes at i forbindelsene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse som er 3-hydroksy-3-merkaptometylkinuklidin, finnes det ingen mulighet for geometrisk isomeri; det finnes imidlertid et asymmetrisentrum ved 3-posisjonen av kinuklidinringen, som følgelig gir opphav til enantiomere og racemiske former.

Forbindelsene av formel (I), enten de foreligger som isomere blandinger eller forbindelser, eller som individuelle isolerte geometriske eller optiske isomerer, danner stabile addisjonssalter med organiske og uorganiske syrer, som f.eks. med saltsyre. Det skal imidlertid observeres at selv om slike salter skulle være farmasøytisk kompatible for terapeutiske anvendelser, kan det ikke desto mindre være hensiktsmessig, f.eks. for isolering, å anvende syreaddisjonssalter som ikke er farmasøytisk kompatible, og oppfinnelsen vedrører også fremstiling av syreaddisjonssaltene av den sistnevnte typen. Det vil være innlysende for fagmannen at dersom forbindelsene oppnås f.eks. som et resultat av isolering fra fremstillingsprosessen i form av frie baser, kan de omdannes, til syreaddisjonssaltene ved omsetning med den egnede syren, og omvendt, forbindelsene isolert i form av syreaddisjonssalter kan omdannes ved omsetning med en base, såsom et alkalimetallhydroksyd, til de tilsvarende frie basene.

Geometriske isomerer isoleres generelt ved en fysikalsk fremgangsmåte såsom fraksjonert krystallisasjon (av isomerene per se, eller av deres salter), fraksjonert destillasjon eller kolonnekromatograf1 (ved anvendelse av høy- eller lavtrykksvæskekromatografiteknikker), mens optiske isomerer isoleres ved at det dannes en saltblanding med en optisk aktiv komplementær reagens (i foreliggende tilfelle som optisk aktiv syre), etterfulgt ved fraksjonering av blandingen, og isolering av de ønskede optiske isomerene fra saltfraksjonene.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles forbindelsene med formel (I) ved en fremgangsmåte som innbefatter omsetning av 3-hydroksy-3-merkaptometylkinuklidin med en karbonylforbindelse av formelen R^-CO-R<2>, hvor R<1> og R<2> har samme betydning som ovenfor, eventuelt i nærvær av et inert organisk oppløsnings-middel og/eller en syrekatalysator, og isolering av det ønskede produket fra reaksjonsblandingen, og etter isolering gjennomføres minst et av de følgende trinnene, det ønskede produktet separeres i dets geometriske isomerer, det omvandles fra den frie basen til dets syreaddisjonssalt, og (eller) det omvandles fra dets syreaddisjonssalt til den frie basen.

Fremgangsmåten utføres også fortrinnsvis i nærvær av et inert organisk oppløsningsmiddelmedium, som f.eks. kloroform eller diklormetan. Den temperaturen hvorved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres er ikke kritisk, men det vil helt klart være fordelaktig å anvende en så lav temperatur som mulig som er forenelig med et tilfredsstillende utbytte, for å unngå forurensning av det ønskede produktet med biprodukter som kan oppstå ved dekomponering og/eller bireaksjoner ved høyere temperaturer. Det er funnet at når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres i nærvær av en katalysator såsom bortrifluorideterat, er en temperatur i området fra 20-30°C velegnet, men høyere eller lavere temperaturer kan naturligvis benyttes; en reaksjonstemperatur på ca. 25 °C er foretrukket. For også å unngå uønsket forurensning forårsaket av oksydasjon, er det foretrukket å gjennomføre reaksjonen i en atmosfære av inert gass såsom nitrogen.

I en spesiell utførelse av foreliggende oppfinnelse innbefatter en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser av formel (I) omsetning av 3-hydroksy-3-merkaptopropylkinuklidin med en karbonylf orbindelse av formelen R-^-CO-R2, i en atmosfære av nitrogen, ved en temperatur i området fra 20 til 30°C, fortrinnsvis ved ca. 25°C, i nærvær av bortrifluorideterat som katalysator og i diklormetan og/eller kloroform som oppløsningsmiddelmedium, og isolering av det ønskede produktet fra reaksjonsblandingen.

I denne spesielle utførelsen av fremgangsmåten er det foretrukket at reaksjonsbestanddelene først blandes i en atmosfære av nitrogen ved en temperatur mellom -10 og +20°C, dvs. ved ca. 0°C og temperaturen av blandingen som derved oppnås får stige til reaksjonstemperaturen.

Et annet alternativ er videre en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen av formel (I) som er 3-hydroksy-3-merkaptometylkinuklidin, hvori epoksydet av 3-metylenkinuklidin omsettes med hydrogensulfid; i et alternativ kan omsetningen utføres i nærvær av en base såsom natriumhydroksyd, fortrinnsvis i et vandig medium, mens i et annet alternativ kan omsetningen med hydrogensulfid bevirkes f.eks. i DMSO + (kloroform og/eller toluen) som oppløsningsmiddel-medium. Epoksydet kan selv fremstilles ved omsetning av kinuklidin-3-on med dimetylsulfoksoniummetylid.

Fremstillingsprosessene ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefattende fremgangsmåtene hvorved relevante utgangs-materialer fremstilles, illustreres i en foretrukket utførelse, i følgende reaksjonsskjerna:

Spiro-forbindelsene av formel (I) har sentralnervesystem-aktivitet. Følgelig er f.eks. forbindelse (Ia) en muskarinagonist med en høy spesifisitet for sentralnervesystemet. På grunn av dens farmakologiske egenskaper kan den benyttes til å aktivere sentrale kolinergiske funksjoner under betingelser hvor det kolinergiske systemet er hypofunksjonelt. Den kan følgelig benyttes for behandling av tilstander såsom senil demens av Alzheimer's type (SDAT), tardiv dyskinesia, Pick's sykdom, Huntington's sanktveitsdans, Gilles de la Tourette sykdom, Friedrich's ataksi og Down's syndrom, fordi alle disse er forstyrrelser hvori en sentral kolinergisk hypofunksjon er påvirket i noen grad. Denne forbindelsen synes også å være av spesiell verdi for behandling av SDAT, siden den er effektiv ved reversering av hukommelsesforstyrrelser forårsaket av AF64A-indusert kolinotoksisitet ved en egnet dyremodell for denne sykdommen. Spesielt den geometriske isomeren av forbindelse (Ia), hvorav HCl-saltet har det relativt lavere smeltepuntet (cis-isomeren), og som er gitt kodenummer AF102B, reverserer hukommelsesskader hos AF64A-behandlede rotter vist ved et passivt unngåelsesforsøk, ved Morris svømmelabyrint (se Morris, Learning and Motivation, 12: 239-61, 1978) og i den 8-armede radielle labyrinten. [Den andre geometriske isomeren av forbindelsen (Ia), hvorav HCl-saltet har det relativt høyere smeltepunktet (trans-isomeren), er gitt kodenummer AF102A.] I denne sammenheng induserer AF64A (3 nmol/2 jjl/side, icv) markert kognitiv forverring i en gjennomgangs passiv unnlatelsestest, i Morris svømmelabyrint og i den 8-armede radielle labyrinten, når rottene ble analysert 4-8 uker etter behandling (Brandeis et al., i "Alzheimer's and Parkinson's Disease: Strategies in Research and Development", redaktører Fisher et al., Plenum Press, New York, under trykking; Fisher og Hanin, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 26: 161-81 (1986).

De fordelaktige virkningene av AF102B i de passive unnlatelses- og i Morris svømmlabyrintforsøkene finner sted ved lave doser (0,1-1 mg/kg, ip eller 1 mg/kg, po) og den terapeutiske indeksen er henholdsvis 78-780 og >156. Denne terapeutiske indeksen er videre enn den funnet for fysostigmin (5-17). Videre er stigningen av den akutte toksisitetskurven svært bratt, og ingen åpenbare behavioristiske virkninger innbefattende parasympatomimetiske virkninger, såsom spyttavsondring og skjelvinger, ble detektert opp til den dødelige dosen. I dette henseende er forbindelsen overlegen de velkjente muskarin agonistene innbefattende arekolin og oksotremorin, hvori slike negative bivirkninger kompliserer den mulige anvendelsen ved SDAT-terapi. I tillegg har AF102B en langvarig virkning ved de ovenfor nevnte hukommelsesforsøkene.

Det er interessant at forbindelsen absorberes godt i blodet etter per os administrering idet tiden før virkningen inntrer er kort, dvs. 10-15 minutter. Dette fremgår ved følgende farmakologiske forsøk: analgesi, hypotermi og dødelig dosenivå, indusert ved AF102B.

Sammenliknet med fysostigmin (0,1 mg/kg, i.p.), er AF102B (5 mg/kg, i.p.) overlegen siden den forbedrer den AF64A-induserte hukommelsesskaden i den 8-armede radielle labyrinten, et forsøk hvori fysostigmin viste seg mislykket under de samme eksperimentelle betingelsene.

Mangelen på negative bivirkninger indusert ved AF102B er bemerkelsesverdig også ved analgesiforsøk (hos mus) og hypotermiforsøk (hos rotter), to farmakologiske forsøk som anvendes for å vurdere den sentrale muskarinaktiviteten. I disse forsøkene utløste bare høye doser av forbindelsen noen betydelige bivirkninger. Slike doser er minst 15-150 (i.p.) eller 40 (p.o. ) ganger høyere enn de som er påkrevet for å reversere AF64A-indusert hukommelsessvekkelse hos rotter i det passive unngåelsesforsøket.

Biokjemiske studier har avslørt at AF102B er en spesifikk sentralt aktiv muskarin Ml-type agonist, og den er den første slike forbindelse som er kjent for opphavsmennene til foreliggende oppfinnelse. Denne selektiviteten ble tydelig når AF102B ble vurdert ved erstatning av [<3>H]-pirenzepin, [<3>H]-PNZ, (en Ml-spesifikk antagonist) mot [<3>H]-kinikli-dinylbenzilatet, [<3>H]-QNB (som Ml- og M2-antagonist) fra rottehjernehomogenater. [Trends in Pharmacol. Sei. (Suppl), jan. 1984],

I dette henseende ble det funnet at Ml-type muskarinreseptorer som hovedsakelig finnes i hjernebarken og hippokampus er relativt uendrede ved SDAT (Mash et al., Science 228: 115-117, 1985). Disse to hjerneområdene ved SDAT viser de alvorligste presynoptiske kolinergiske hypofunksjonene, og histologiske abnormalitetene, og er hovedsakelig forbundet med kognitiv dysfunksjon rapportert ved SDAT.

Spesifisiteten av AF102B til muskarinreseptorer generelt og Ml-reseptorer spesielt, fremgår også fra mangelen på noen betydelig aktivitet på høy-affinitetskolin transport (fra rottehjerne-synoptosomer) eller kolin acetyltransferase-aktivitet (fra rottehjerne-homogenater).

Ml-agonisttypen av aktivitet av AF102B kan i det minste delvis være ansvarlig for den høye selektiviteten av AF102B både in vitro og in vivo (spesielt ved reversering av kognitive svekkelser indusert av AF64A).

Mutagenisitetsundersøkelser av AF102B in vitro har avslørt at forbindelsen ikke er mutagen opp til høye konsentrasjoner. Disse resultatene sett sammen med den høye terapeutiske indeksen for denne forbindelsen, gjør den til et potensielt legemiddel for behandling av pasienter med SDAT.

Hos SDAT-pasienter kan AF102B benyttes sammen med anti-kolinesterase-inhibitorer såsom fysostigmin eller tetrahydroaminoakridin; sammen med acetylkolin-forstadier såsom kolin eller lecitin; i tillegg til "nootrope" legemidler såsom piracetam, aniracetam, oksiracetam eller pramiracetam; i tillegg til forbindelser som vekselvirker med Ca<2+->kanaler såsom 4-aminopyridin eller 3,4-diaminopyridin; eller i tillegg til peptider som kan ha modulerende virkninger på acetylkolinfrigivelsen, såsom somatostatin.

ÅF102B, med eller uten de tidligere nevnte aktive stoffene, kan administreres f.eks. ved injeksjon i et egnet fortynningsmiddel eller en "bærer, per os, rektalt i form av suppositorier, ved hjelp av innblåsning, ved infusjon eller transdermalt i en egnet bærer med eller uten fysostigmin. Denne forbindelsen kan også benyttes ved forstyrrelser hvor kolinergunderaktiviteten er indusert av legemidler.

Forbindelse (Ia), i form av enten geometrisk isomer, eller en blanding av slike isomerer, kan også anvendes for behandling av sykdomstilstander som krever tilførsel av et kolinergisk middel med lang varighet av mild lokal aktivitet. Et slikt middel er påkrevet ved sykdomstilstander såsom glaukom, idet forbindelsen ikke ødelegges av enzymet som deaktiverer acetylkolin, dvs. acetyl- og butyryl-kolinesterase. Denne forbindelsen kan også benyttes for behandling av perifere kolinergiske forstyrrelser såsom myastenia gravis, urin-blæredysfunksjoner, Adi's sykdom og Eaton-Lambret-sykdom.

Når R<1> i spiro-forbindelsene av formel (I) er propyl eller høyere alkylgrupper, cyklopentyl eller cykloheksyl, endrer naturen av den farmakologiske aktiviteten av disse forbindelsene seg, for såvidt som de, mens de fremdeles har sentralnervesystem-aktivitet, får en aktivitet som nå er antikolinergisk istedenfor kolinergisk. Slike antikolin-ergiske forbindelser kan benyttes til å behandle forstyrrelser som skyldes kolinergisk hypofunksjon, enten denne er spontan eller medisin-indusert. Disse forbindelsene kan følgelig benyttes ved behandlingen av Parkinson's sykdom, pseudo-Parkinson's sykdom, mental depresjon og som supplement ved kirurgi istedenfor (f.eks.) atropin eller skopolamin. De kan også anvendes ved oftalmologi når forlenget mydriase er påkrevet for diagnostiske og terapeutiske formål.

Der hvor betegnelsen "farmasøytisk preparat" anvendes i foreliggende beskrivelse og krav, skal denne forstås i den forstand at den er egnet for human og/eller veterinær behandling.

Forbindelsene fremstilt ifølge opprinnelsen kan følgelig anvendes i et farmasøytisk preparat som innbefatter et kinuklidinderivat av formel (I), eller et farmasøytisk kompatibelt syreaddisjonssalt derav, sammen med en inert bærer eller et fortynningsmiddel. Betegnelsen "farmasøytisk kompatibelt syreaddisjonssalt" slik den her benyttes refererer til en kombinasjon av nevnte kinuklidinderivat med relativt ikke-toksiske uorganiske eller organiske syrer. Eksempler på egnede syrer er svovelsyre, fosforsyre, saltsyre, hydrobromsyre, hydrojodsyre, sulfaminsyre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre, para-toluensulfonsyre, eddiksyre, melkesyre, ravsyre, maleinsyre, vinsyre, sitron-syre, glukonsyre, askorbinsyre, benzosyre og kanelsyre. Egnede farmasøytiske bærere og fortynningsmidler, som innbefatter både faste stoffer og væsker, kan f.eks. være valgt fra gruppen maisstivelse, laktose, kalsiumfosfat, stearinsyre, polyetylenglykol, vann, sesamfrøolje, peanøtt-olje, propylenglykol, osv. Dette preparatet kan foreligge i en form som er egnet for oral, rektal eller parenteral administrering, eller for administrering ved innblåsning, eller spesielt være i en form som er egnet for transdermal administrering, og i ethvert tilfelle kan preparatet foreligge i enhetsdoseform. Eksempler på preparater kan ta form av tabletter, pulvere, korn, kapsler, suspensjoner, oppløsninger, suppositorier, eliksirer, salver og liknende.

Det farmasøytiske preparatet kan som spiro-forbindelsen av formel (I) f.eks. inneholde forbindelsen som her er angitt som (Ia), og spesielt den geometriske isomeren (AF102B) hvorav saltsyresaltet har det relativt lavere smeltepunktet. Av grunnene angitt ovenfor kan et slikt preparat som en ytterligere bestanddel eller bestanddeler, inneholde en eller flere forbindelser valgt fra gruppen bestående av fysostigmin, tetrahydroaminoakridin, kolin, lecitin, piracetam, aniracetam, pramiracetam, oksiracetam, 4-aminopyridin, 3,4-diaminopyridin og somatostatin.

Alternativt kan det farmasøytiske preparatet som spiro-forbindelse av formel (I) inneholde en slik forbindelse hvori R<1> er valgt fra gruppen bestående av alkyl inneholdende tre eller flere karbonatomer, cyklopentyl, cykloheksyl, og R<2> har den tidligere angitte betydning, og spesielt kan denne forbindelsen være en av de som er angitt som (Ib) og (Ic).

Når det gjelder egnede doser for administrering av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, ved anvendelsen i farmasøytiske preparater, har man oppnådd noen indikasjoner fra de biologiske forsøkene, resultatene og andre detaljer som er rapportert nedenfor. Det synes på det nåværende tidspunkt at for administrering per os er det usannsynlig at en enkelt dose på mer enn 60 mg/kg eller mindre enn 0,1 mg/kg kroppsvekt vil være egnet, og at en enkelt dose i området fra 0,5 til 10 mg/kg, spesielt i området fra 1 til 5 mg/kg er å foretrekke. For parenteral administrering (som f.eks. innbefatter intramuskulær, intravenøs og subkutan administrering) synes det på det nåværende tidspunkt å være usannsynlig at en enkelt dose på mer enn 40 mg/kg eller mindre enn 0,01 mg/kg kroppsvekt vil være egnet, og at en enkelt dose i området fra 0,05 til 5 mg/kg, spesielt i området fra 0,1 til 2 mg/kg er å foretrekke. Ved fore-skrivelse av en spesiell form og tilførselsomfang vil legen naturligvis ta hensyn til de vanlige faktorene såsom alvoret av symptomene, pasientens fysiske tilstand osv.

Når man tar i betraktning de vanlige vektområdene for pasienter, de foregående doseringsområdene, og muligheten for at det kan være ønskelig å administrere flere fremfor enkeltdoser, kan de farmasøytiske preparatene som er tilpasset for oral eller parenteral administrering inneholde den aktive bestanddelen (og spesielt forbindelsen som her er angitt ved kodenummeret AF102B) f.eks. i en mengde i området fra 0,5 til 500 mg, fortrinnsvis 5 til 100 mg, mer foretrukket i området fra 10 til 50 mg. Fig. 1 viser NMR (250 <MHz)-spekteret for 3-hydroksy-3- merkapto metylkinuklidin. Fig. 2 viser NMR (250 MHz)-spekteret for cisrtrans (Ia)-HCl-salt [AF102]. Fig. 3 viser NMR (250 MHz)-spekteret for den geometriske isomeren av (Ia)-HCl-saltet angitt som AF102A. Fig. 4 viser NMR (250 MHz )-spekteret av den geometriske isomeren av (Ia)-HCl-saltet angitt som AF102B. Fig. 5 viser strukturen av Afl02B, bestemt ved røntgen-krystallografi av dens HCl-salt, som viser at AF102B er cis-isomeren. Fig. 6 viser IR-spekteret (på "Nicolet 20XB FTIR") av den geometriske isomeren av (Ia)-HCl-saltet angitt som AF102A. Fig. 7 viser IR-spekteret for den geometriske isomeren

av (Ia)-HCl-saltet angitt som AF102B.

Fig. 8 viser innledende og retensjonsforsøk-latens-målinger av AF64A- og CSF-injiserte grupper, før og etter fysostigmin eller saltvann. Fig. 9 viser innledende og retensjonsforsøk-latens-målinger av AF64A- og CSF-injiserte grupper, før og etter AF102B eller saltvann. Fig. 10 viser retensjonsforsøk-latensmålinger for (bl.a.)

AF102B i ekstinksjonsforsøk.

Fig. 11 viser retensjonsforsøk-latensmålinger for (bl.a.)

Afl02B i "ekstinksjon + latent ekstinksjon"-forsøk. Fig. 12 viser retensjonsforsøk-latensmålinger av AF64A-og CSF-injiserte grupper, etter andre administrering av AF102B eller saltvann. Fig. 13 viser retensjonsforsøk-latensmålinger av AF64A-og CSF-injiserte grupper, etter AF102B (0,1 mg/kg, i.p.) eller saltvannsadministrering. Fig. 14 viser 1atensmålinger (sek.) av AF64A- og CSF-inj iserte grupper, før og etter AF102B (1 mg/kg, p.o.) eller saltvannsadministrering. Fig. 15 viser retensjonsforsøk-latensmålinger (sek.) av AF64A- og CSF-injiserte grupper, før og etter AF102B (1 mg/kg, p.o.) eller saltvannsadministrering. Fig. 16 viser bergingslatensmålinger, i blokker av to forsøk, av AF64A- og CSF-injiserte grupper, etter fysostigmin-administrering. Fig. 17 viser bergingslatensmålinger, i blokker av to forsøk, av AF64A- og CSF-injiserte grupper, etter AF102B (1 mg/kg, i.p.) administrering. Fig. 18 viser gjennomsnittlig feil i den 8-armede radielle labyrinten (RAM) for AF64A- og CSF-injiserte rotter, etter AF102B (5 mg/kg, i.p.) administrering. Fig. 19 viser gjennomsnittlig feil i RAM av AF64A- og CSF-injiserte rotter, etter saltvann- og fysostigmin-administrering.

Oppfinnelsen skal nå beskrives i større detalj med referanse til eksemplene på fremstilling av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, og biologisk undersøkelse av spiro-forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen.

EKSEMPEL I

Fremstilling av 2-metylspiro(1,3-oksatiolan-5',3)kinuklidin. fAF102 ( cis;trans) : AF102A og AF102B1

(a) Epoksvd av 3- metylenkinuklidin

(i) I en 3 1 tre-halset kolbe utstyrt med en mekanisk rører og termometer ble det plassert natriumhydrid (42 g, 0,88 mol, som en 50$ dispersjon i olje) og 300 ml petroleumseter (30-60°C). Suspensjonen ble omrørt, hydridet fikk sedimentere, petroleumseteren ble dekantert, og under omrøring ble det tilsatt 1200 ml tørr DMSO, etterfulgt av trimetyloksosulfoniumjodid (214 g, 0,97 mol) som ble tilsatt porsjonsvis i løpet av et tidsrom på 15 minutter, og omrøringen ble deretter fortsatt i ytterligere 30 minutter. Reaksjonskolben var utstyrt med en forseglet trykk-kompen-serende dråpetrakt inneholdende kinuklidin-3-on (100 g, 0,8 mol) oppløst i 300 ml tørr DMSO. Oppløsningen ble deretter tilsatt til reaksjonsblandingen i løpet av et tidsrom på 15 minutter. Etter omrøring i 15 minutter ble reaksjonsblandingen oppvarmet til 50°C i 2 timer, helt ill kaldt vann og blandingen ble ekstrahert med 3 x 500 ml porsjoner av benzen. De samlede ekstraktene ble vasket med 100 ml mettet vandig saltoppløsning, tørket over vannfritt natriumsulfat, og oppløsningsmidlet ble avdampet. Den oljeformige resten ble oppløst i eter og utfelt som saltet med saltsyre med tilsats av eter mettet med gassformig HC1. Epoksydproduktet ble separert ved filtrering, vasket med eter og tørket slik at man fikk 100 g produkt som var tilstrekkelig rent til å anvendes i det neste |rinnet. Rf 0,3 på nøytralt aluminiumoksyd (etylacetat); M<*> = 139 (massespektrumbestemmelser på et "VG 7035#-instrument); HCl-salt har smeltepunkt 200,7-202°C. (ii) I en alternativ syntese som også kan oppskaleres ble 2,2 kg kinuklidin-3-on (HCl-salt) tilsatt til en 5 1 flaske og 2 1 ledningsvann ble deretter tilsatt etterfulgt av 1 kg NaOH. Blandingen ble mekanisk omrørt ved 50°C inntil de faste stoffene var oppløst. Under disse betingelsene ble det oppnådd tre faser, to øvre faser (væsker) og en nedre fase (faststoff).

Blandingen holdes ved 60°C. Den øvre fasen tilsettes til 1 1 toluen. De to nedre fasene innbefattet den faste fasen ble filtrert. Det faste stoffet ble utrørt ill toluen som også ble benyttet til å utrøre den vandige fasen. Toluenfasene ble samlet, behandlet med pulverisert trekull for å fjerne farge (og forurensninger), tørket over MgS04 og filtrert slik at man fikk 3,3 kg produkt innbefattende toluen; en prøve på 215 g oppløsning ble inndampet slik at man fikk 106 g kinuklidin-3-on (fri base) som et hvitt faststoff, som var tilstrekkelig rent for praktiske formål. (Derfor kan under disse betingelsene et ekstraksjonsutbytte på minst 88-90$ oppnås.) Toluenoppløsningen tørkes ved azeotropisk destillasjon; den tørkede oppløsningen kan benyttes i det neste trinnet.

I en 3 1 tre-halset kolbe ble det innført kinuklidin-3-on (193 g, 1,54 mol) i azeotropisk-tørket toluenoppløsning (vekt av oppløsning 563 g), trimetylsulfoksoniumjodid (380 g, 1,72 mol) og NaH 55-60$ dispersjon i parafinolje (70 g, 1,68 mol) og deretter ble blandingen mekanisk omrørt. En svak utvikling av H2 fulgte som opphørte etter 2-3 minutter.

Reaksj onsf lasken ble avkjølt i kaldt vann og DMSO (0,5 1, tørket en måned på molekylarsikter) ble dråpevis tilsatt; 100 ml ble tilsatt i et trinn og resten ble tilsatt dråpevis i løpet av 1,5 timer med omrøring og avkjøling av reaksjonsblandingen til mellom 10 og 30°C. Reaksjonsblandingen ble deretter oppvarmet til 50-55°C i en time inntil reaksjonen var fullstendig, bedømt ved hjelp av TLC på nøytralt aluminiumoksyd (metanol:diklormetan, 5:95). Reaksjonsblandingen ble helt ill kaldt vann og blandingen ble ekstrahert med 0,5 1 porsjoner av kloroform. I hver ekstraksjon ble mellomfasen fjernet ved filtrering; 2,4 1 organisk fase ble samlet og tørket over 160 g MgS04. NMR (250 MHz) viser ca. 120 ml DMSO (beregning basert på forholdet DMSO/toluen). Følgelig ble 80$ av DMSO fjernet ved denne behandlingen. TLC viser at produktet er svakt forurenset på grunn av DMSO og andre forbindelser. Denne oppløsningen ble delvis inndampet til 1900 ml og holdt ved 0-4° C i 5 dager uten endring. Denne oppløsningen er tilstrekkelig ren til å anvendes i det neste trinnet.

(b) 3- hydroksy- 3- merkaptometylkinuklidin

(i) I en 1 1 tre-halset kolbe utstyrt med en magnetisk rører, et inntak og et uttak for hydrogensulfid og termometer ble det plassert 80 g NaOH og 390 ml vann. Oppløsningen ble

avkjølt i et isbad og gassformig hydrogensulfid ble ført inn i den omrørte oppløsningen inntil den begynte å boble ut. Produktet fra trinn (a) (80 g, 0,46 mol) ble deretter tilsatt, og omrøringen ble fortsatt i 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 45 °C i 2,5 timer under en langsom strøm av hydrogensulfid. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C, og ION HC1 ble forsiktig tilsatt slik at pE-verdien ble brakt til 8; den vandige oppløsningen ble deretter ekstrahert med kloroform (6 x 300 ml). De samlede ekstraktene ble tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Det resulterende faste stoffet ble tørket over fosfor-pentoksyd i en eksikator slik at man fikk 32,9 g råprodukt. Etter rensing (TLC, nøytral aluminiumoksyd, 10:1 diklormetan + metanol) Rf 0,5; M<+> (se fig. 5) = 173; basistopp = 140; NMR (se fig. 1) topp ved 250 MHz (CDC13) S 2,8-> dobbelt dublett, -CH2- SH, AB-type-spektrum; IR vmaks 2900-3300 cm-<1> (bred). Forbindelsen ble benyttet i det neste trinnet uten noen ytterligere rensing. (ii) I en alternativ fremgangsmåte ble kloroformoppløs-ningen fra trinn (a) (ii) ovenfor (1520 g) innført i en 3 1 tre-halset kolbe utstyrt med en mekanisk rører, et EtøS-inntak og to feller med konsentrert NaOH-oppløsning for å oppfange overskudd av HgS. Reaksjonsblandingen ble holdt ved 25±5°C og HgS ble boble inn i denne i 8,5 timer, hvoretter den fikk stå over natten. Den neste dagen ble E2S igjen boblet inn i ytterligere 5 timer, hvoretter reaksjonen var fullstendig (TLC) og produktet kunne benyttes i det neste trinnet uten noen ytterligere rensing. (c ) 2- metvlspiro( 1. 3- okstiolan- 5 . 3' ) kinuklidin. fAF102 cis:trans! (i) I en 0,5 1 tre-halset kolbe utstyrt med en magnetisk rører, et innløp og et uttak for nitrogengass og et termometer ble det plassert produktet fra trinn (b) (i) (32 g, 0,18 mol), 200 ml diklormetan (tørket over molekylaersikter) og nydestillert acetaldehyd (110 ml, 1,97 mol). Oppløsningen ble avkjølt på et isbad under nitrogengass, og bortrifluorideterat (60 ml, 0,40 mol) ble tilsatt i løpet av et tidsrom på 30 minutter. Blandingen ble omrørt i 3 timer ved 25° C, avkjølt til 0°C, og deretter behandlet med 10$ vandig NaOH-oppløsning inntil den var alkalisk på lakmus. Den alkaliske oppløsningen ble ekstrahert med kloroform (4 x 400 ml), og de samlede ekstraktene ble tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet. Den oljeformige resten ble oppløst i eter og utfelt ved tilsats av gassformig HC1. Produkthydrokloridet ble separert ved filtrering, vasket med eter og tørket, slik at man fikk 26,5 g (utbytte: 62$) som en blanding av to geometriske isomerer i et forhold på 0,8-1,2 : 1. Rf (TLC, nøytralt aluminiumoksyd, kloroform) 0,7; IRmaks (ved anvendelse av et "Perkin-Elmer 457"-raster infrarødt spektro-fotometer) C-0 1200-1250, 1150 cm-<1>; M<+> = 199; høy oppløs-nings molekylvektbestemmelse: beregnet for C^oEl7NOS: 199,1020, funnet: 199,1017.

NMR for HCl-saltet er vist i fig. 2. Oppløsning av spekteret gjør det mulig å se eksistensen av begge isomerene. Plasser-ingen av -S-atomet i oksotiolanringen fremgår fra de kjemiske forskyvningene av de respektive Ha- og Hb-protonene. Disse protonene i isomerblandingen og også i hver av isomerene kommer til syne ved høyere felt enn deres mulige kjemiske forskyvninger, dersom de var knyttet til -0- som i den analoge 1,3-dioksolan-strukturen. Produktet kan rekrystal-liseres fra etylacetat (600 ml pr. g) eller fra aceton (220 ml pr. g).

Isomerblandingen av hydroklorider kan separeres i dens komponenter ved fraksjonert krystallisasjon i redestillert tørr aceton. Smeltepunkter så vel som NMR-spektre for 250 MHz kan benyttes som en indikasjon på renheten for hver isomer. En slik separasjon vil bli beskrevet i trinn (d). (ii) I en alternativ fremgangsmåte fremstilles AF102 i fri baseform direkte fra oppløsningen av rå tioalkohol. Følgelig ble en slik oppløsning fra trinn (c) (ii) inneholdende 240 g tioalkohol (1,38 mol) tilsatt til en 5 1 tre-halset kolbe, avkjølt i kaldt vann til 10°C og deretter ble acetaldehyd (680 ml; nydestillert på para-toluensulfonsyre) tilsatt i løpet av 30 minutter og temperaturen ble holdt ved 20±5°C i løpet av denne tiden. Oppløsningen ble deretter avkjølt til 15°C og omrørt i ytterligere 30 minutter. BF3-eterat (450 ml) ble tilsatt dråpevis i løpet av 30 minutter og oppløsningen ble holdt ved 20±5°C og omrørt i ytterligere 30 minutter. En oppløsning av 20$ NaOH (1 1) ble tilsatt dråpevis og reaksjonstemperaturen ble holdt ved 20±5°C i løpet av denne tilsatsen.

Blandingen ble filtrert og vannoppløsningen ble ekstrahert med 1 1 kloroform. Kloroformekstraktene ble samlet, tørket over MgS04 og inndampet. Den oppnådde oljen kunne destilleres ved ca. 90'C/l mm Eg slik at man fikk AF102 (cis:trans), eller alternativt fortynnes med 2,5 1 toluen. I det sistnevnte tilfellet ble 5-10 g faststoff, som ble avsatt på veggene av flasken, fjernet og BX1 (gassformig) ble boblet inn i toluenoppløsningen inntil den organiske oppløsningen var sur, bedømt ved hjelp av pH-papir; den faste kaken ble filtrert fra, vasket med toluen, oppløst i 3/4 1 isopropanol ved 50-6CC og filtrert for å fjerne uoppløselige forurensninger. Filtratet ble inndampet ved tilsats av 1 1 toluen slik at man fikk 168 g råprodukt AF102 (cis:trans)

(HC1) med en svak forurensning som demonstrert ved TLC. Dette produktet (råutbytte 51$) kan renses ytterligere som beskrevet nedenfor i trinn (d).

(d) Separasjon av AF102 i dens komponenter AF102A og AF102B En 1:1 isomerblanding av hydroklorider ble krystallisert fra 4,7 1 redestillert tørr aceton. Produktet som ble utfelt ble igjen krystallisert (se tabell), slik at man etter fire krystallisasjoner fikk 1,9 g rent AF102A, smeltepunkt 240-242°C. Konsentrasjon av moderluten (se tabell) resulterte i et oljeformig produkt som ble renset på en aluminiumoksyd-

kolonne (som en fri base, 1$ metanol i diklormetan) slik at man fikk hovedsakelig (10:1) isomeren AF102B, smeltepunkt 176-179°C som HCl-saltet.

AF102A(EC1): NMR (se fig. 3), 250 MHz (CDC13) S 5,24 (kvartett, topp av R<1> = H, som er en kvartett siden den er koplet til R<2> = CH3).

AF102B(HC1): NMR (fig. 4), 250 MHz (CDC13) 5 5,17 (kvartett, topp av R<2> = H, som er en kvartett siden den er koplet til R<1 >= CH3).

EKSEMPEL II

Fremstilling av 2- difenylmetylspiro( 1. 3- okstiolan- 5, 3') kinuklidin

I en 100 ml tre-halset kolbe utstyrt med en magnetisk rører, et inntak og uttak for nitrogen og et termometer, ble det plassert 3-hydroksy-3-merkaptometylkinuklidin (8 g, 0,045 mol), 40 ml diklormetan (tørket over molekylarsikter) og difenylacetaldehyd (15 ml, 0,085 mol). Oppløsningen ble avkjølt i et isbad, og holdt under nitrogen, mens destillert bortrifluorideterat (20 ml, 0,13 mol) ble tilsatt i løpet av et tidsrom på 30 minutter. Blandingen ble omrørt 2 timer ved 25° C, avkjølt til 0°C og deretter behandlet med 10$ vandig natriumhydroksyd inntil oppløsningen var alkalisk på lakmus. Den basiske oppløsningen ble ekstrahert med benzen (4 x 400 ml), og de samlede ekstraktene ble tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet. Den oljeformige resten ble oppløst i eter og utfelt som saltsyresaltet ved tilsats av gassformig HC1. Produktet ble ytterligere renset på en nøytral aluminiumoksydkolonne som fri base ved anvendelse av 1:10 petroleumseter (40-60°C)/etylacetat som eluerings-middel. Under disse betingelsene ble 2 g av forbindelsen i overskriften isolert. M<+> = 351.

EKSEMPEL III

2- metvI- 2- fenylspiro( 1. 3- okstioIan- 5, 3') kinuklidin Denne forbindelsen ble fremstilt ved en fremgangsmåte tilsvarende fremgangsmåten i eksemplene I og II, ved å omsette acetofenon med 3-hydroksy-3-merkaptometylkinuklidin. Utbyttet var relativt lavt (10-20$). M<+> = 275.

Forskjellige andre forbindelser innenfor omfanget av formel (I) kan fremstilles ved de eksemplifiserte fremgangsmåtene ved å anvende det egnede aldehydet R^-CHO eller ketonet R<1->

CO-R<2>, hvor R<1> og R<2> er som definert i forbindelse med formel

(I).

Som allerede nevnt kan spiro-forbindelsene av formel (I), innbefattet deres farmasøytisk kompatible syreaddisjonssalter settes sammen med konvensjonelle farmasøytiske inerte bærere, fortynningsmidler, adjuvanser osv., som farmasøytiske preparater, som kan foreligge i en form egnet for oral, rektal eller parenteral administrering, eller ved administrering ved innblåsning, eller de kan foreligge i en form egnet for transdermal administrering, og i ethvert tilfelle kan preparatet foreligge i enhetsdoseform.

Spiro-forbindelsene av formel (I), eller farmasøytiske preparater som inneholder disse, kan administreres til mennesker, så vel som til forsøksdyr såsom gnagere, katter, hunder eller aper, som f.eks. ved perifere eller intracere-brale eller intracerebroventrikulære injeksjoner (for dyr), ved infusjon, gjennom huden eller per os. Det er åpenbart at dosen og fremgangsmåten må reguleres avhengig av den spesifikke biologiske anvendelsen, og spesielt avhengig av sykdommens eller tilstandens natur og dens grad.

Av grunner som allerede er angitt ovenfor kan slike farmasøy-tiske preparater, i tilfelle (Ia) som en ekstra bestanddel inneholde en eller flere forbindelser valgt fra gruppen bestående av fysostigmin, tetrahydroaminoakridin, kolin, lecitin, piracetam, aniracetam, pramiracetam, oksiracetam, 4-aminopyridin, 3,4-diaminopyridin og somatostatin.

Biologisk undersøkelse av spiro- forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen

For AF102A og AF102B ble den generelle toksisitetsprofilen først etablert. Denne fasen av undersøkelsen ble rutinemessig inndelt i to deler, dvs. "doseområdeundersøkelse" og LD5Q-bestemmelse. I førstnevnte ble vanligvis par av mus administrert med svært forskjellige doser og dyrene ble deretter observert. Typen, tidspunktet for inntreden og varighet av reaksjonene på behandlingen ble registrert. LDsQ-bestem-melser ble basert på de innledende funnene fra doseom-rådestudiene. Under betingelsene for denne undersøkelsen ble oppløsninger av forsøksmaterialet administrert til minst fem dosenivågrupper av minst fem dyr av samme kjønn i gruppen og ved geometrisk-adskilte doser. På basis av mortaliteten ble LD5Q-verdien og 95$ konfidensintervallet (CI.) beregnet ifølge Weil's fremgangsmåte (Weil, Biometrics, 8: 249-283, 1952).

AF102A

(a) LD50 mus; oral administrering.

Forsøksbetingelser - hannmus, 20 - 24 g

- N = 5/gruppe

- konstant volum-dose på 20 ml/kg

(b) LD50 mus; intravenøs administrering.

Forsøksbetingelser - hannmus, 20-24 g

- N = 6/gruppe

- variable volum-doser på 9,0- 11,5 ml/kg

Det relativt lave forholdet på ca. 1:2,5 mellom LDsg-verdiene for den i.v. og orale administreringsmåten tyder på en effektiv, rask og tilsynelatende uendret absorpsjon av forsøksmaterialet ved den enteriske fremgangsmåten.

(c) Observerte signaler.

Signaler som reaksjon på behandling hos mus oppført nedenfor kom tilnærmet utelukkende til uttrykk i mus som døde, siden overlevende i behandlingsgruppen, administrert med doser som bare forårsaket partiell letalitet, sjelden viste noen av de angitte symptomene. Dette funnet peker utvilsomt i retning av en relativt skarp toksisk-letal stigningskoeffisient for forsøksmaterialet.

Videre var det tilnærmet ingen synlige endringer i virkninger observert mellom oralt og intravenøst behandlede dyr, med unntak av tidspunktet for inntreden, varighet og dødstids-punkt. Undersøkelser for å fastslå pupilleendringer ble utført bare i overlevende dyr.

Reaksjonssignalene er oppført i den rekkefølgen de opptrer:

- svak transientreduksjon av spontan motorisk aktivitet (bare i oralt behandlede dyr) - alvorlige skjelvinger, spesielt i hodeområdet (i løpet av 2-3 min. eller 10 sek. etter henholdsvis oral eller intravenøs administrering)

- åndenød

- krampeanfall (kloniske)

- gjesping, cyanose

- enkelt klonisk-tonisk krampeanfall etterfulgt av død.

Død hos mus som hie administrert med tilnærmet LDsø-doser fant sted 10-15 min. etter oral administrering og henholdsvis ved ca. 30 sek. etter intravenøs injeksjon. Hos overlevende dyr kunne transientpartiell analgetisk aktivitet detekteres som respons på halestikking. Blant de overlevende hvorav et av de ovenfor angitte signalene opptrådte, fant fullstendig rekonvalens raskt sted. Et annet trekk det er verdt å nevne er at det ble funnet svak til moderat mydriase etter bedømmelse av pupiller hos overlevende dyr i den intravenøst-behandlede gruppen.

Det bør understrekes at ingen av forsøksdyrene viste effekter som betraktes som karakteristiske for parasympato- eller kolinomimetisk aktivitet, dvs. kontinuerlige generaliserte skjelvinger, øket spyttutskillelse, tåredannelse, eller diaré og miose.

Rotter som ble administrert en oral dose på 100 mg/kg viste følgende symptomer: 10 min. etter administrering (p.a. - post administration), ble den spontane motoriske aktiviteten svakt redusert. 15 min. p.a. ble det observert mydriase, hvor pupille-størrelsen var ca. tre ganger størrelsen hos kontrolldyr. 20 min. p.a. brå inntreden av en kort krampetrekning som 5 min. senere endret seg til hodetrekninger og skjelvinger . 30 min. p.a. synes dyrene søvnige, ledsaget av delvis tap av stabiliseringsrefleksen, viste åndenød og cyanose, med svak spyttdannelse og tåredannelse.

Alle de ovenfor nevnte symptomene refererer først og fremst til det ene dyret, av en gruppe på tre, som ble funnet dødt 40 min. etter administreringen. I de gjenværende to rottene var alle de ovenfor omtalte virkningene av mindre relativ intensitet, og fullstendig tilfriskning fant sted i løpet av noen timer.

AF102B

(a) LD50 mus; oral administrering

Forsøksbetingelser - hannmus, 20-24 g

- N = 5/gruppe

- konstant volum-dose på 20 ml/kg

(b) LD50 mus; intravenøs administrering

Forsøksbetingelser - hannmus, 20-24 g

- N = 6/gruppe

- variabel volum-dose på 9,0-11,5 ml/kg

Det relativt lave forholdet på ca. 1:2,5 mellom LD5Q-verdiene for den i.v. og orale administreringsmåten tyder på en effektiv, rask og tilsynelatende uendret absorpsjon av forsøksmaterialet ved den enteriske fremgangsmåten.

(c) Observerte signaler

Ettersom LX^g-verdiene etter både i.v. og per os administrering av AF102B var noe lavere enn verdiene observert med AF102A, var de generelle tegnene på reaksjon på behandlingen med førstnevnte i det vesentlige tilsvarende det som er rapportert for sistnevnte, den eneste forskjellen er begrenset til en noe forhøyet intensitet i tilfellet AF102B.

Det bør bemerkes at, som med AF102A, viste ingen av forsøks-dyrene virkninger som betraktes som karakteristiske for parasympto- eller kolinomimetisk aktivitet, dvs. kontinuerlige generaliserte skjelvinger, spyttdannelse, tåredannelse, eller diaré og miose. Dette trekket står i motsetning til den kolinergisk aktive forbindelsen fra US patent nr. 4.104.397, nemlig cis-2-metylspiro(1,3-dioksolan-4,3')kinuklidin, heretter referert til under kodenummer AF30, som viste slike bivirkninger.

Intraperitoneal toksisitet for AF102B i rotter

Den akutte intraperitoneale toksisiteten av AF102B (HC1) ble undersøkt i fem grupper av fem hann- og fem hunnrotter av Charles River-stammen ved doser i området 20,0 - 187,0 mg/kg. Forsøksmaterialet ble fremstilt i forskjellige konsentrasjoner i saltvann og ble administrert ved en konstant volum-dose på 10 ml/kg. Mortaliteten og tegn på reaksjon på behandlingen ble registrert i løpet av en 14 dagers observa-sjonsperiode. Tidlig avdøde og dyr avlivet på dag 15 ble underkastet nekropsi. Det ble funnet at dødsfallene fant sted ved de tre høyeste dosenivåene (61, 107, 187 mg/kg) i løpet av 20 min. etter doseringen.

De viktigste tegnene på reaksjon på behandlingen som ble observert i både avdøde og overlevende dyr var spastiske og toniske kramper, skjelvinger, hurtig åndedrett og åndenød, nedsatt motorisk aktivitet, svak til svært sterk spyttdannelse og urinering. Hos overlevende dyr forsvant alle tegnene på reaksjon på behandlingen i løpet av 2 timer etter dosering. Overlevende dyr viste generelt den ventede økningen av kroppsvekt i løpet av undersøkelsesperioden. Ved nekropsi ble alvorlige observasjoner forbundet med behandlingen bare observert hos avdøde dyr. Sprengte blodkar ble observert i hjernen i gruppen behandlet med høy dose. Ingen abnormaliteter ble oppdaget ved nekropsi av overlevende dyr. LD5Q (95$ CI.) = 77,6 (60,1 - 100,2); stigning = 83°

Akutt oral toksisitet av AF102B i rotter

Den akutte orale toksisiteten av AF102B (HC1) ble undersøkt i fire grupper av fem hann- og fem hunnrotter (Charles River CD-stamme). Forsøksmaterialet ble fremstilt ved forskjellige konsentrasjoner i saltvann og ble administrert ved en konstant volum-dose på 5 ml/kg. Doser ble valgt avhengig av tilgjengeligheten av forsøksmaterialet. Mortalitet og tegn på reaksjon på behandlingen ble registrert i løpet av en 14 dagers periode. Tidlig avdøde og overlevende dyr ble underkastet nekropsi på dag nr. 15. Det ble funnet at dødsfall fant sted ved alle de fire dosenivåene som ble undersøkt, i løpet av 3 timer og 30 minutter etter doseringen .

Hovedtegnene på reaksjon på behandlingen som ble observert hos både avdøde og overlevende dyr var krampetrekninger, skjelvinger, øket spyttdannelse, urogenital flekking, diaré og pigmentert orbitalsekresjon. Hos overlevende dyr forsvant alle kliniske tegn på reaksjon på behandlingen i løpet av 24 timer etter doseringen. Det viktigste behandlings-relaterte funnet hos overlevende dyr ved nekropsi var forøket spyttdannelse. I det indre ble det oppdaget et enkelt tilfelle av blodinnhold og ødelagt mageslimhinne. Nekropsi av overlevende dyr viste ikke noen abnormaliteter. Overlevende dyr viste generelt den forventede økningen av kroppsvekten i løpet av undersøkelsesperioden. Den orale LD50 for AF102B anslås å være større enn 156 mg/kg.

AF102B: Sammenfatning av akutt toksisitet ved studier av mus

og rotter (mg/kg) (LD50 + 95$ konfidensgrenser).

Analgetisk ( antinociseps. ions ^ aktivitet i mus av AF102B

Den potensielle analgetiske aktiviteten av forsøksmaterialet AF102B ble vurdert i grupper (n=5) av hann- og hunnmus, ved anvendelse av to grunnleggende analgeiforsøk: Haleklyping og fenylkinonkrampe. Forsøksmaterialet ble administrert enten ved oral eller intraperitoneal fremgangsmåte ved tre forskjellige dosenivåer, og den analgetiske virkningen ble sammenliknet med den for to referanseforbindelser. I innledende forsøk ble kodeinfosfat (50 mg/kg, administrert s.c. en time før undersøkelse) og oksotremorin (enten 0,1 mg/kg, administrert p.o. en time før undersøkelse, eller 0,05 mg/kg, administrert i.p. 30 minutter før undersøkelse) valgt som henholdsvis analgetiske og kolinomimetiske referanseforbindelser. Under betingelsene for foreliggende under-søkelse viste AF102B antinociseptiv aktivitet bare ved dosenivåer høyere enn 20 mg/kg p.o. og 10 mg/kg i.p. Denne dose-avhengige antinociseptive virkningen var ikke fullstendig utviklet ved 60 mg/kg p.o. og 40 mg/kg i.p. som var de høyeste ikke-letale dosenivåene som ble undersøkt ved foreliggende undersøkelse og forble tydelig svakere enn de for kodeinfosfat og oksotremorin.

Potensiell hypotermi- induserende aktivitet av AF102B i rotter Den potensielle hypotermi-induserende aktiviteten av forsøksmaterialet AF102B ble vurdert i grupper på 8 hannrotter, sammenliknet med to referansematerialer. Den rektale temperaturen ble registrert før og ved forskjellige tider etter administrering av forsøksmaterialet, enten ved den orale eller den intraperitoneale fremgangsmåten ved tre forskjellige dosenivåer. I innledende studier ble klorpromazin (10 mg/kg administrert i.p.) og oksotremorin (enten 3,2 mg/kg, administrert p.o. eller 1,2 mg/kg administrert i.p.) valgt som henholdsvis neuroleptisk- og kolinomimetisk referansemateriale. Under betingelsene for foreliggende undersøkelse viste AF102B hypotermi-induserende aktivitet bare ved dosenivåer større enn 40 mg/kg (p.o.) og 15 mg/kg (i.p.). Ved de maksimale dosenivåene på 80 mg/kg p.o. og 60 mg/kg i.p. (de høyeste undersøkte dosenivåene som ikke induserte kramper), induserte F102B en reduksjon i rektal-temperaturen som var tilsvarende i amplitude med amplituden indusert av klorpromazin og oksotremorin. Svak diaré var den eneste kolinomimetiske manifestasjonen indusert av AF102B ved disse maksimale dosenivåene, mens oksotremorin induserte et fullstendig kolinomimetisk syndrom forbundet med tonisk-kloniske kramper når dette materialet ble administrert i.p.

Mutagen aktivitet av AF102B

AF102B ble undersøkt for mutagen aktivitet i fem histidin-avhengige auksotroper av Salmonella typhimurium, stammer TA-1535, TA-100, TA-1538, TA-98 og TA-1537, ved å anvende helle-plate-analyser. Fremgangsmåtene som ble benyttet var i samsvar med OECD retningslinjene 471, vedtatt mai 1983. Studiene, som ble gjennomført i fravær eller nærvær av et aktiverende system avledet fra rottelever (S-9-blanding), anvendte et område av nivåer valgt i overensstemmelse med et innledende toksisitetsforsøk i stamme TA-98. Hvert forsøk ble gjennomført i duplikat og ble utført ved to separate tidspunkt. Positive kontroller, såsom de kjente mutagenene natriumazid, 4-nitro-o-fenylendiamin (NPD), ICR-191 og 2-aminoantracen, ble benyttet under de samme forsøksbe-tingelsene. Ingen økninger i reversjon til prototropi ble oppnådd med noen av de fem bakteriestammene ved forbindelses-nivåene som ble undersøkt, hverken i nærvær eller fravær av S-9-blanding. Ingen inhibering av vekst observert som fortynning eller fravær av bakgrunnsmengden av ikke-rever-tante celler fant sted i noen av stammene etter eksponering mot forsøksmaterialet ved 1000 pg pr. plate. Konklusjonen er at AF102B er uten mutagen aktivitet under betingelsene for foreliggende undersøkelse.

Bindingsaffiniteter for antatte kolinergiske agonister til muskarin-

reseptorer

A) Scatchard- plott:

PNZ betraktes som en spesifikk M^-antagonist [Se bindet viet dette emne i Trends Pharmacol. Sei. (Suppl) januar 1984]. Dens affinitet til reseptoren er ikke så høy som den for QNB, derfor bør den tilsynelatende Kd være høyere enn den for QNB. Det viste seg også at Kd for PNZ, bestemt i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, ble funnet å være 13.0 nM sammenliknet med 0,048 nM funnet for QNB. Kd-verdien som ble funnet for PNZ i forbindelse med foreliggende oppfinnelse stemmer overens med de publiserte resultatene. B) Fortrengning av bundet ["— Hl- PNZ ved den undersøkte forbindelsen: Fordelen ved å anvende PNZ ligger i dens selektivitet overfor M^-reseptoren. Det er å vente at forbindelser som er mer selektive overfor M^-reseptorer vil fortrenge dem mest effektiv. Fortrengningen av [<3>H]-PNZ av muskarinantagonisten, atropin og muskarinagonisten, oksotremorin resulterer i IC5o'er på henholdsvis 5 x IO-10 M og 8 x IO"<7> M, og disse er begge høyere enn konsentrasjonene som er påkrevet for å fortrenge [<3>H]-QNB. Disse resultatene er ikke overraskende i lys av den høyere Kd for pirenzepin. Forholdet mellom disse to IC5o'ene og IC5Q'ene for den samme forbindelsen for fortrengning av [<3>H]-QNB kan benyttes som en referanse for foretrukket binding av andre undersøkte forbindelser av pirenzepinbindingssete M^-reseptorer.

Den følgende tabellen viser IC5o'ene for de undersøkte forbindelsene for fortrengningen av [<3>H]-PNZ eller [<3>H]-QNB. Det fremgår at de undersøkte forbindelsene fortrenger [<3>H]-PNZ mer effektivt enn [<3>H]-QNB. Imidlertid var AF102B en størrelsesorden mer selektiv for M^-reseptorer enn resten av de undersøkte forbindelsene, som uttrykt ved forholdet ICgo^ICgQ<2.>

TABELL 1.

Potensen av antatt kolinergiske forbindelser ved fortrengning av f— Hl- PNZ fra sentrale muskarinreseptorer ( uttrykt som IC50I

IC50<1> = I<C>50 for fortrengning av [<3>H]-PNZ

IC50<2> = IC50 for fortrengning av [<3>H]-QNB

[Muskarinreseptoranalyse ble utført ifølge Yamamura og Snyder, PNAS US 71: 1725, (1974).]

Fra tabellene 1 og 2 fremgår det at AF102B er en potent muskarinagonist, mens dens geometriske isomer AF102A er tilnærmet en størrelsesorden mindre aktiv; videre fremgår det fra tabell 1 at AF102B er en selektiv M^-agonist.

ADFEEDSUNDEESØKELSEE

Sammenfatning av resultater

Adferdsstudier av rotter behandlet icv med AF64A (3 nmol/2 pl/side) avslørte markerte kognitive dysfunksjoner i en gjennomgangs-passiv unnlatelsestest. Disse hukommelsessvekkelsene kunne reverseres ved fysostigmin og ved AF102B.

Denne reverseringen finner, som angitt i den følgende

tabellen, sted ved lave doser av fysostigmin (0,06 mg/kg, i.p.) og AF102B (0,1 og 1 mg/kg, i.p. og 1 mg/kg, p.o.). Derfor er den "terapeutiske indeksen" for AF102B 78-780. Denne "terapeutiske indeksen" er definitivt videre enn den som finnes i fysostigmin (5-17).

Videre er det viktig å legge merke til at stigningen for den akutte toksisitetskurven for AF102B er bratt og ingen tydelige adferdssymptomer innbefattende parasympatomimetiske virkninger, såsom spyttdannelse og skjelvinger, ble observert opptil den letale dosen. Følgelig er området for den "symptomfrie" dosen relativt bredt, dette fremhever den potensielle anvendelsen av dette legemidlet for behandling av

SDAT.

I tillegg ble det, ved ekstinksjonsundersøkelse utført med AF64A-behandlede rotter, funnet en meget langvarig fordelaktig virkning av AF102B, hvilket indikerer at denne forbindelsen har langvarige virkninger på kognitive funksjoner (fig. 10 og 11).

Det er også av stor betydning å legge merke til at AF64A (3 nmol/2 pl/side) induserte markerte hukommelsessvekkelser ved Morris-svømmelabyrintforsøket (Morris, loe. eit.), som AF102B (1 mg/kg, i.p.) motvirket, mens fysostigmin (0,1 mg/kg, i.p.) hadde en negativ virkning (fig. 16 og 17). Det er interessant at de fordelaktige virkningene av AF102B i dette forsøket berørte de spatielle hukommelsesfunksjonene indusert av AF64A. I denne forbindelse er det verdt å legge merke til at en viktig hukommelsesdysfunksjon hos SDAT-pasienter er svekkelse av spatiell hukommelse. Videre er det også av stor betydning å legge merke til at AF64A (3 nmol/2 ul/side) induserte hukommelsessvekkelser i den 8-armede radielle armlabyrinten (RAM - Radial Arm Maze) som AF102B (5 mg/kg, i.p.) motvirket, mens fysostigmin (0,1 mg/kg) ikke hadde noen betydelig virkning (fig. 18 og 19).

Bilaterale icv-injeksjoner av AF64A produserte kognitive svekkelser hos rotter i (a) en positiv unnlatelse-gjennom-gangstest; (b) Morris-svømmelabyrint; og (c) radiell armlabyrint; og muligheten for reversering av de AF64A-produserte virkningene ved hjelp av fysostigmin som en refe-ranseforbindelse, og ved hjelp av AF102B.

AF64A ble nyfremstilt hver dag i 20 mM konsentrasjon og deretter fortynnet i kunstig cerebrospinalvæske (CSF) til den egnede konsentrasjonen for injeksjon. Sammensetningen av den kunstige CSF-oppløsningen med pH 7,1-7,3 var:

Passiv unnlatelse av gjennomgang: Forsøk 1

Virkningen av fysostigmin på prestasjonen og 24 timers retensjonen for en inhiberingsinnlærings (passiv unnlatelse av gjennomgang) ble undersøkt på AF64A- og CSF-injiserte rotter, ved anvendelse av et medisinbehandlingsparadigme etter treningen.

Sprague-Dawley-hannrotter (oppdrettet av Charles River), 90-110 dager gamle, med vekt 230-360 g, fikk fri tilgang til for og vann. Før den kirurgiske prosedyren ble rottene bedøvet med "Equithesin" (0,3 ml/100 g, i.p.). Bilaterale injeksjoner ble utført ved stereotaksisk tilførsel av AF64A eller bærer inn i de laterale cerebroventriklene (icv) (AP - 0,8 mm fra bregma, L - 1,5 mm fra bregma og - 4,7 mm fra skalleover-flaten). 23 rotter ble infusert med 3 mol AF64A i et volum på 2 pl, i hver lateralventrikkel (gruppe 1), og 20 kontrollrotter ble infusert på tilsvarende måte med det samme volumet av CSF (gruppe 2). Totalt ble 43 rotter operert. Infusjonen ble utført ved hjelp av en injeksjonskanyle nr. 28. Hastig-heten for injeksjonen ble holdt konstant ved 25 pl/min. Injeksjonskanylen fikk stå på plass i 4 min. etter injeksjon for å tillate diffusjon av oppløsningene inn i ventriklene. <1> Denne dosen ble funnet effektiv ved svekkelse av den unnlatelses-gjennomgangsprestasjonen for rotter.

27-28 dager etter injeksjon<2> ble hver gruppe av rotter postoperativt underinndelt tilfeldig i to grupper på 10 rotter hver; undergruppe 1 fikk fysostigminbehandling og undergruppe 2 ble behandlet med saltvann. Ever rotte ble individuelt plassert i et lite opplyst frontkammer av en to-kammerboks. Etter en 60 sek. tilvenning/tilpasningsperiode ble døren som separerte de to kamrene åpnet og en klokke ble aktivert. Rottens latens til å tre inn i det mørke kammeret av boksen (å gå gjennom) ble målt. Straks etter inngang i det mørke kammeret ble rotten underkastet et omkastet fotsjokk som ikke kunne unngås påført på gulvgitteret (0,6 mA - i 3 sek.). 60 sek. etter termineringen av sjokket, ved avslutningen av treningsprosedyren, ble rotten fjernet fra det mørke kammeret og fysostigmin oppløst i saltvann (0,06 mg/kg) eller saltvannsplacebo ble administrert i.p. Rottene ble deretter ført tilbake til oppholdsburet. Retensjon av den passive unnlatelsesoppgaven ble målt 24 timer etter trening ved igjen å plassere rotten i det opplyste frontkammeret og etter en 60 sek. tilpasningsperiode å måle latensen for inngang i det mørke kammeret. Forsøkssesjonen endte når en rotte trådte inn 1 det mørke kammeret, eller etter at 600 sek. var forløpt. Dyr som ikke gikk gjennom i løpet av 600 sek. ble fjernet fra apparaturen og en 600 sek. latens ble registrert for disse.

Resultater: Mortalitet og kroppsvekt

Straks etter operasjon synes de AF64A-injiserte dyrene ikke å vise noen respons på miljømessige stimuli. Noen få av dyrene (2 av 20 i den AF64A-injiserte gruppen og 6 av 20 i den CSF-inj iserte gruppen) viste et tap av kroppsvekt (henholdsvis 2$ og 12,5$) som ble observert 7 dager eter doseringen. I løpet av 48 timer etter doseringen forelå det en kumulativ mortalitet på 13$ av den AF64A-injiserte gruppen. <2> 27-dagers intervallet ble funnet å være effektivt ved svekkelse av den passive unnlatelses-gjennomgangsprestasjonen i rotter injisert med 3 nmol/2>jl AF64A.

Resultater: Passiv unnlatelsesforsøk.

De innledende latensmålingene og retensjonsforsøk-latensmålingene ble analysert ved hjelp av en toveis "ÅNOVA", injeksjon (AF64A/CSF) som funksjon av behandling (fysostigmin/saltvann). Tabell (i) presenterer gjennomsnittet ± S.E.M.

(standard feil for middelverdien) for de innledende latensmålingene, mens tabell (ii) presenterer gjennomsnittet ± S.E.M. for retensjonsforsøk-latensmålingene.

Ingen signifikante forskjeller ble funnet i løpet av treningsforsøket mellom noen av de undersøkte gruppene (se fig. 8): F(l,36) = 0,81, p>0,05.

Gjennomgangslatensen for den AF64A-injiserte gruppen var betydelig kortere, F(l,36) = 20,18, p<0,01 under det 24 timers retensjonsforsøket enn den CSF-injiserte gruppens latens. I tillegg var gjennomgangslatensen for den fysostigmin-behandlede gruppen betydelig lengre, F(l,36) = 5,91, p<0,05, under det 24 timers retensjonsforsøket enn den saltvann-behandlede gruppens latens. Retensjon av en gjennomgangs-passiv unnlatelsesrespons for den AF64A-injiserte gruppen ble betydelig forbedret ved fysostigminad-ministrering, mens retensjonen for den CSF-injiserte gruppen ikke ble påvirket av denne behandlingen (se fig. 8), F(l,36) = 4,08, p = 0,05. Shiffee's kontraster for gjennomgangs-latensmålinger under retensjonsforsøket avslørte en betydelig forskjell mellom de saltvannsbehandlede AF64A- og CSF-inj iserte gruppene (p<0,05). De tre andre kontrastene var ikke betydelige selv om latensen for den saltvannsbehandlede AF64A-injiserte gruppen synes å være kortere enn latensen for den fysostigminbehandlede AF64A-injiserte gruppen.

Passiv unnlatelse av gjennomgang: Forsøk 2

Virkningene av AF102B på virkningen og 24 timers retensjonen av en inhiberingsinnlærings(passiv unnlatelse-gjennomgang)oppgave, i AF64A- og CSF-injiserte rotter ble undersøkt, ved anvendelse av et post-behandlingsmedisinparadigme.

Den kirurgiske fremgangsmåten var identisk med den i forsøk 1 bortsett fra at (1) vekten av de opererte rottene var 250-325 g; (2) 20 rotter ble infusert med 3 nmol AF64A i et volum på 2 pl, inn i hver ventrikkel (gruppe 1), og 20 kontrollrotter ble infusert med et volum på 2 pl av CSF i hver lateral ventrikkel (gruppe 2). Tilsammen 40 rotter ble operert.

Fremgangsmåten for adferdsundersøkelsen innbefattet fire faser.

Forforsøk: 28 Sprague-Dawley-hannrotter, 90-110 dager gamle, med vekt 270-310 g ble tilfeldig fordelt i fire grupper på 7 rotter hver; 3 grupper ble behandlet med AF102B oppløst i saltvann (0,1, 1 eller 5 mg/kg) og den fjerde gruppen ble behandlet med saltvann. Fremgangsmåten for opplæring og forsøksretensjonen var identisk med den angitt i eksempel 1, bortsett fra at ved avslutningen av innlæringsprosedyren, ble forskjellige doser av AF102B eller saltvannsplacebo administrert i.p.

Fase 1: 27-28 dager etter injeksjonen ble hver gruppe av rotter postoperativt underinndelt tilfeldig i to grupper på 10 rotter hver; undergruppe 1 ble gitt AF102B-behandling og undergruppe 2 ble behandlet med saltvann. Treningen og forsøksretensjonsfremgangsmåten var identisk med den i forsøk 1, bortsett fra at ved avslutningen av treningsprosedyren, ble rotten fjernet fra det mørke kammeret og doser av AF102B oppløst i saltvann (1 mg/kg) eller saltvann ble administrert i.p.

Fase 2: 6 dager etter retensjonsforsøket ble rottene underkastet 6 daglige sesjoner av en ekstinksjonsprosedyre. Rotten ble plassert i det opplyste frontkammeret og latensen for inngang i det mørke kammeret ble målt. Denne fremgangsmåten var identisk med retensjonsforsøkfremgangsmåten i fase 1.

Fase 3: Etter ekstinksjonsprosedyren ble rotter underkastet en latensekstinksjonsprosedyre. Rotten ble plassert i det opplyste frontkammeret og etter en 60 sek. tilpasningsperiode, ble den puffet inn i det mørke kammeret og holdt der i 60 sek. Denne prosedyren ble fulgt en gang om dagen i 3 dager. Etter latens-ekstinksjonsprosedyren ble rottene underkastet en "ekstinksjon + latent ekstinksjon"-prosedyre. Rotten ble plassert i det opplyste frontkammeret og etter en 60 sek. tilpasningsperiode ble latensen for inngang i det mørke kammeret målt. Forsøkssesjonen endte når en rotte gikk inn i det mørke kammeret. Dyr som ikke gikk gjennom i løpet av 600 sek. ble puffet inn i det mørke kammeret og en 600 sek. latens ble registrert for disse. Denne fremgangsmåten ble fulgt en gang om dagen i 4 dager. Ved avslutningen av den fjerde sesjonen, ble rotten, straks etter inngang i det mørke kammeret, underkastet en innlæring og retensjons-forsøksprosedyre identisk med den i fase 1, bortsett fra at de to undergruppene behandlet i fase 1 med AF102B nå ble behandlet med saltvannsplacebo og vice versa. (Det bør bemerkes at denne behandlingen fant sted 2 måneder etter AF64A/CSF-injeksjonen.)

Resultater: Mortalitet og kroppsvekt.

Straks etter operasjonen synes de AF64A-injiserte dyrene ikke å vise noen respons på miljømessige stimuli. Noen få av dyrene (2 av 20 i den AF64A-injiserte gruppen) viste et 2$ tap av kroppsvekt som ble observert 7 dager etter doseringen. I løpet av 48 timer etter doseringen fant ingen dødsfall sted i noen av gruppene.

Resultater: Passiv unnlatelsesforsøk.

Forforsøk.

De innledende latensmålingene og retensjonsforsøks-latensmålingene ble analysert med en enveis "ANOVA". Tabell (iii) viser gjennomsnittet ± S.E.M. for de innledende latensmålingene, mens tabell (iv) presenterer gjennomsnittet ± S.E.M. for retensjonsforsøks-latensmålingene.

Ingen betydelige forskjeller ble funnet under innlærings-forsøkene mellom noen av de undersøkte gruppene, F(3,24) = 0,57; p>0,05. I tillegg ble det ikke funnet noen betydelig forskjeller i løpet av det 24 timers retensjonsforsøket mellom de forskjellige dosene av AF102B, F(3,24) = 2,61; p>0,05, selv om retensjonslatensen for 0,1 mg/kg- og 1 mg/kg-gruppene synes å være kortere enn latensen for 5 mg/kg-gruppen og saltvannsgruppen.

Fase 1.

De innledende latensmålingene og retensjonsforsøk-latensmålingene ble analysert ved hjelp av en toveis "ANOVA", injeksjon (AF64A/CSF) som funksjon av behandling (AF102B/- saltvann). Tabell (v) presenterer gjennomsnitt ± S.E.M. for de innledende latensmålingene, mens tabell (vi) presenterer den gjennomsnittlige ± S.E.M. for retensjonsforsøk-latensmålingene.

Ingen betydelige forskjeller ble funnet, i løpet av trenings-forsøket, mellom de undersøkte gruppene (se fig. 9): F(l,35) = 2,16, p>0,05 for den injeksjonsvariable (AF64A/CSF)-hovedeffekten. For den andre hovedeffekten (de to gruppene som skal behandles med AF102B eller saltvann): F(l,35) = 0,29; p>0,05.

Gjennomgangslatensen for den AF64A-injiserte gruppen var betydelig kortere, F(l,35) = 13,89; p<0,01, i løpet av det 24 timers retensjonsforsøket enn den CSF-injiserte gruppens latens. I tillegg var gjennomgangslatensen for den AF102B-behandlede gruppen betydelig lengre, F(l,35) = 4,98; p<0,05,

i løpet av det 24 timers retensjonsforsøket enn den saltvannsbehandlede gruppens latens.

Retensjon av en gjennomgangs-passiv unnlatelsesrespons for den AF64A-injiserte gruppen ble betydelig forbedret ved AF102B-administrering, mens den for den CSF-injiserte gruppen ble betydelig svekket (se fig. 9), F(l,35) = 31,18, p<0,01. Shiffee's kontraster for gjennomgangslatensmålingene under retensjonsforsøket avslørte at alle forskjellene mellom gruppene var betydelige (0,01 < p < 0,05) bortsett fra AF64A + AF102B vs. CSF + AF102B forskjellen.

Fase 2.

Retensjonsforsøk-latensmålingene under ekstinksjonsperioden ble analysert ved hjelp av en treveis "AN0VA" (6x2x2) med en gjentatt variabel (forsøk) og to ikke-gjentatte variabler (injeksjon - AF64A/CSF og behandling - AF102B/CSF). Fig. 10 viser at gjennomgangslatensen for den AF64A-injiserte gruppen var betydelig kortere, F(l,36) = 16,83; p<0,01, enn den CSF-inj iserte gruppens latens. I tillegg var gjennomgangslatensen for den AF102B-behandlede gruppen betydelig lengre, F(l,36) = 31,45, p<0,01, enn den saltvannsbehandlede gruppens latens. Retensjon av en gjennomgangs-passiv unnlatelsesrespons for begge de AF64A- og CSF-injiserte gruppene, under ekstinksjon, ble betydelig forbedret ved AF102B-administrering. F(l,36) = 15,80, p<0,01. Shiffee's kontraster for gjennomgangs-latensmålingene under ekstinksjonsperioden avslørte at alle forskjellene mellom gruppene var signifikante (p<0,01) bortsett fra forskjellen mellom AF64A + AF102B og CSF + AF102B.

Forsøkenes variable hovedvirkning under ekstinksjonen var signifikant, F(5,180) = 2,68, p<0,05. Kontrastanalyser viste at retensjonslatensen for det andre ekstinksjonsforsøket var betydelig lengre enn latensen for det sjette forsøket (p<0,05). Det var ingen andre betydelige forskjeller.

Interaksjonen mellom behandling og forsøk var signifikant, F(5,180 = 3,30, p<0,05). Signifikante enkle hovedvirknings-kontraster ble funnet mellom de AF102B-behandlede gruppene og de saltvannsbehandlede gruppene under alle ekstinksjonsfor-søkene bortsett fra det første forsøket. I tillegg var retensjonslatens-ekstinksjonskurven betydelig forskjellig fra den for de saltvannsbehandlede gruppene (p<0,05). Retensjonslatensen for de AF102B-behandlede gruppene økte fra det første til det fjerne forsøket og avtok deretter. Reten-sj onslatensen for de saltvannsbehandlede gruppene avtok fra det første forsøket til det sjette forsøket.

Fase 3.

A. Retensjonsforsøk-latensmålingene under "ekstinksjon + latent ekstinksjon"-perioden ble analysert ved hjelp av en treveis "ANOVA" (4x2x2) med en gjentatt variabel (forsøk) og to ikke-gjentatte variabler (injeksjon - AF64A/CSF og behandling AF102B/CSF). Ingen betydelige forskjeller ble funnet under "ekstinksjon + latent ekstinksjon"-perioden mellom noen av de undersøkte betingelsene, i retensjons-forsøk-latensmålingene, selv om retensjonslatensen for den saltvannsbehandlede AF64A-injiserte gruppen synes å være kortere enn retensjonslatensen for de tre andre gruppene (se fig. 11).

B. Retensjonsforsøk-latensmålingene for den andre administreringen av AF102B/saltvann ble analysert ved hjelp av en toveis "ANOVA", injeksjon (AF64A/CSF) som funksjon av behandling (AF102B/saltvann). Tabell (vii) presenterer gjennomsnittet ± S.E.M. for retensjonsforsøk-1atensmålingene.

Ingen signifikante forskjeller ble funnet etter den andre AF102B/saltvanns-administreringen mellom noen av de under-søkte gruppene (p>0,05) (se fig. 12). Retensjonslatensen for den saltvannsbehandlede AF64A-injiserte gruppen, tidligere behandlet med AF102B, forble på det samme nivået, mens retensjonslatensen for den AF102B-behandlede AF64A-injiserte gruppen, tidligere behandlet med saltvann, økte og nådde nivået for de CSF-injiserte gruppene.

ADFERDSFORSØK

I forbindelse med foreliggende oppfinnelse har man videre undersøkt muligheten for reversering av de AF64A-induserte virkningene ved hjelp av forskjellige doser av AF102B ved den passive unnlatelsesoppgaven og ved to andre oppgaver, nemlig Morris-svømmelabyrinten og den 8-armede radielle labyrinten.

Passiv unnlatelsesoppgave

Forsøk 1

I dette forsøket ble virkningen av AF102B (0,1 mg/kg, i.p.)-administrering på virkningen og 24 timers retensjonen av en inhiberingsinnlærings(passiv unnlatelses-gjennomgang)oppgave i AF64A- og CSF-injiserte rotter undersøkt, ved anvendelse av et medisinbehandlingsparadigme etter treningen.

Kirurgi

Sprague-Dawley-hannrotter (oppdrettet av Charles River), 90-110 dager gamle, med vekt 265-340 g ble injisert icv. 10 rotter ble infusert med 3 nmol AF64A i et volum på 2 pl inn i hver laterale ventrikkel (gruppe 1), og 10 kontrollrotter ble infusert med CSF (gruppe 2). Totalt 20 rotter ble operert.

Adferdsundersøkelse

Fremgangsmåten for adferdsundersøkelse innbefattet to faser, 1 og 2. I en innlæringsprosedyre i et forforsøk ble hver rotte individuelt plassert i et lite opplyst frontkammer i en to-kammerboks. Etter en 60 sek. periode for å gjøre seg kjent/tilpasning, ble døren som separerte de to kamrene åpnet og en klokke aktivert. Rottens latens for å tre inn i det større mørke kammeret av boksen (å gå gjennom) ble målt. Straks etter inngang i det mørke kammeret, ble rotten underkastet et omkastet fotsjokk som ikke kunne unngås tilført til gulvnettet (0,6 mA i 2 sek.). 60 sek. etter terminering av sjokket, ved avslutningen av opplærings-prosedyren, ble rotten fjernet fra det mørke kammeret og saltvannsplacebo ble administrert i.p. Rotten ble deretter plassert i sitt hjembur. Retensjon av den passive unnlatelsesoppgaven ble målt 24 timer etter treningen ved igjen å plassere rotten i det opplyste frontkammeret, og etter en 60 sek. tilpasningsperiode, ble latensen for inngang i det mørke kammeret målt. Forsøkssesjonen endte når rotten gikk inn i det mørke kammeret eller etter at 600 sek. var forløpt. Dyr som ikke gikk gjennom i løpet av 600 sek. ble fjernet fra apparaturen og en 600 sek. latens ble registrert for disse.

Fase 1

27-29 dager etter AF64A- eller CSF-injeksjon, ble hver gruppe rotter underkastet den samme treningen og forsøksretensjons-fremgangsmåten var som i forforsøket bortsett fra at: a) ved treningsprpsedyren ble rotten behandlet i.p. med saltvannsplacebo; b) varigheten av sjokket var 3 sek.

Fase 2

13-20 dager etter retensjonsforsøket (40-47 dager etter AF64A- eller CSF-injeksjonen) ble rottene underkastet et andre passivt unnlatelsesforsøk. Hver rotte ble plassert i det opplyste frontkammeret og etter en 60 sek. tilpasningsperiode, ble latensen for inntreden i det mørke kammeret målt. Dyr som ikke gikk gjennom i løpet av 600 sek. ble puffet inn i det mørke kammeret og en 600 sek. latens ble registrert for disse. Rottene ble underkastet trenings- og retensjonsforsøksprosedyrer identiske med prosedyrene i fase 1, bortsett fra at grupper behandlet med saltvann nå ble behandlet med AF102B (0,1 mg/kg, i.p.).

Resultater

Mortalitet og kroppsvekt

Straks etter operasjon synes de AF64A-injiserte dyrene ikke å vise noen respons på miljømessig stimuli. Et dyr (av 20 AF64A-injiserte dyr) viste et 2$ tap av kroppsvekt, og to dyr viste ingen økning i kroppsvekt 7 dager etter injeksjonen. Ingen mortalitet fant sted i noen av gruppene.

Passiv unnlatelsestest: Forforsøk

Ingen signifikante forskjeller ble funnet under opplærings-forsøkene mellom noen av de undersøkte gruppene [F(3,24) = 0,22; p>0,05].

AF102B ( 0. 1 mg/ kg. i. p.)

Sammenlikning ble utført mellom retensjonsforsøk-latensene oppnådd etter administrering av AF102B (0,1 mg/kg, i.p.)

(andre gjennomgang) og retensjonsforsøk-latensene oppnådd etter saltvannsadministrering (første gjennomgang). Reten-sj onsforsøk-latensmålingene ble analysert ved hjelp av en toveis "ANOVA" (2x2) med en gjentatt variabel (behandling + gjennomgang) og en ikke-gjentatt variabel [injeksjon (AF64A/CSF)].

Retensjonslatensen for den AF64A-injiserte gruppen var fremdeles betydelig kortere [F(l,18) = 29,48; p<0,001] enn den CSF-injiserte gruppens latens (se fig. 13). I tillegg var retensjonslatensen for de AF102B-behandlede gruppene (andre gjennomgang) betydelig lengre [F(l,18) = 33,71; p<0,001] enn den saltvannsbehandlede gruppens latens (første gjennomgang). Retensjon av en gjennomgangs-passiv unnlatelsesrespons for den AF64A-injiserte gruppen ble betydelig forbedret ved AF102B-administrering [A(l,18) = 33,27; p<0,00l], mens den for den CSF-injiserte gruppen ikke endret seg signifikant ved denne behandlingen. Siden latensene for CSF-behandlede rotter allerede var tilnærmet lik 600 sek., var ingen endring egentlig ventet. Shiffee's kontraster avslørte at forskjellene mellom AF64A + AF102B og AF64A + saltvann og AF64A + saltvann og CSF + saltvann var signifikante (p<0,001). Det skal imidlertid understrekes at forbedringen for den AF64A-injiserte gruppen ved AF102B-administrering i dette tilfellet ble registrert etter et andre sjokk, et faktum som kan ha påvirket forbedringen av retensjonen.

Forsøk 2

I dette forsøket ble virkningen av AF102B (p.o.^administreringen på virkningen og 24 timers retensjonen for en inhi-ber ingsinnlærings(passiv unnlatelses-gjennomgang)oppgave undersøkt, i AF64A- og CSF-injiserte rotter, ved å benytte behandlingsparadigme etter treningen.

Fremgangsmåte

Kirurgi

Den kirurgiske fremgangsmåten var identisk med operasjonspro-sedyren i forsøk 1, bortsett fra at: 1) vekten av de opererte rottene var 265-320 g; 2) 10 rotter ble infusert med 3 nmol AF64A i et volum på 2 pl, i hver laterat ventrikkel (gruppe 1) og 10 kontrollrotter ble infusert med 2 volumdeler av 2 pl CSF i hver laterale ventrikkel (gruppe 2). Totalt 20 rotter ble operert.

Adferdsundersøkelse

Fremgangsmåten for undersøkelse av adferden innbefattet to faser.

Fase 1

Treningen og forsøksretensjonsfremgangsmåtene for fase 1 var identiske med fremgangsmåten for fase 2 i forsøk 1, bortsett fra at: 1) hver gruppe av rotter ble underinndelt etter operasjonen; og 2) ved avslutningen av innlæringsprosedyren ble rotten fjernet fra det mørke kammeret og AF102B (1 mg/kg, p.o.) eller saltvann ble administrert.

Fase 2

19-22 dager etter retensjonsforsøket (49 dager etter AF64A-eller CSF-injeksjon) ble rottene som bare hadde fått saltvannsbehandling underkastet en andre treningsgjennomgang. Treningen og forsøksretensjonsfremgangsmåtene var identiske med fremgangsmåtene i fase 2 av forsøk 1 bortsett fra at de to undergruppene behandlet i fase 1 med saltvann nå ble behandlet med AF102B (1 mg/kg, p.o.).

Resultater

Fase 1

De innledende latensmålingene av de AF64A- og CSf-injiserte gruppene ble analysert ved hjelp av et t-forsøk for uavhen-gige prøver. De følgende tabellene presenterer henholdsvis (a) gjennomsnitt ± S.E.M. for de innledende latensmålingene og (b) gjennomsnitt ± S.E.M. for retensjonsforsøk-latensmålingene.

Ingen signifikante forskjeller ble funnet i løpet av innlæringsforsøket, mellom de AF64A- og CSF-injiserte gruppene (se fig. 14), t(57) = 0,05; p>0,05. Den første analysen av retensjonslatensmålingene viste at gjennomgangslatensen for den AF64A-injiserte gruppen var betydelig kortere [F(l,36) = 37,01; p<0,001] (se fig. 14) i løpet av det 24 timers retensjonsforsøket enn den CSF-injiserte gruppens latens.

Den andre analysen av retensjonslatensmålingene viste at gjennomgangslatensen for den AF64A-injiserte gruppen var betydelig kortere [F(l,35) = 37,93; p<0,001] (se fig. 14) i løpet av det 24 timers retensjonsforsøket enn den CSF-inj iserte gruppens latens. I tillegg var gjenomgangslatensen for den AF102B-behandlede gruppen betydelig lengre [F(l,35) = 28,46; p<0,001] enn den saltvannsbehandlede gruppens latens. Retensjon av en gjennomgangs-passiv unnlatelsesrespons for den AF64A-injiserte gruppen ble betydelig forbedret ved AF102B-administrering [F(l,35) = 13,94 ; p<0,001], mens det ikke var noen signifikant forskjell mellom den AF102B-behandlede CSF-injiserte gruppen og den saltvannsbehandlede-CSF-injiserte gruppen. Shiffee's kontraster avslørte at forskjellen mellom AF64A + AF102B og AF64A + saltvann var signifikant (p<0,001).

Fase 2

I en første analyse, ble retensjonsforsøk-latensmålingene før sjokkadministreringen i den andre gjennomgangen sammenliknet med retensjonsforsøk-latensmålingene under den første gjennomgangen. Retensjonsforsøk-latensmålingene ble analysert ved hjelp av en toveis "ANOVA" 2x2) med en gjentatt variabel (gjennomgang) og en ikke-gjentatt variabel [injeksjon (AF64A/CSF)]. Retensjonslatensen for den AF64A-injiserte gruppen var fremdeles betydelig kortere [F(l,18) = 49,51; p<0,001] 19-22 dager etter den første gjennomgangen enn den CSF-injiserte gruppens latens (se fig. 15). Det fantes hverken en signifikant gjennomgangseffekt [F(l,18) = 0,91; p>0,05] eller noen signifikant interaksjonseffekt [F(l,18) = 1,28; p>0,05].

I den andre analysen ble retensjonsforsøk-latensmålingene etter sjokkadministreringen under den andre gjennomgangen sammenliknet med retensjonsforsøk-latensmålingene under den første gjennomgangen. Retensjonsforsøk-latensmålingene ble analysert ved hjelp av en toveis "ANOVA" (2x2) med en gjentatt variabel (gjennomgang + behandling) og en ikke-gjentatt variabel [injeksjon (AF64A/CSF)]. Retensjonslatensen for den AF64A-injiserte gruppen var fremdeles signifikant kortere [F(l,18) = 40,81, p<0,001] enn den CSF-injiserte gruppens latens (se fig. 15). I tillegg var retensjonslatensen for den AF102B-behandlede gruppen (andre gjennomgang) "betydelig lengre [F(l,18) = 65,71; p<0,001] enn latensen for den saltvannsbehandlede gruppen (første gjennomgang). Retensjon for en gjennomgangs-passiv unnlatelsesrespons for den ÅF64A-injiserte gruppen ble betydelig forbedret ved AF102B-administrering [F(l,18) = 40,81; p<0,001], mens den for den CSF-injiserte gruppen ikke endret seg signifikant ved denne behandlingen. Shiffee's kontraster avslørte at forskjellen mellom AF64A + AF102B og AF64A + saltvann var signifikant.

Morris- svømmelabyrint

Kolinergisk mangel, så vel som behandlinger med antikoliner-giske legemidler ble vist å forårsake hukommelsesforstyrrelser og forstyrrelse av innlaeringsprosesser forbundet med spatiell orientering (Sutherland et al., J. Comp. Physiol. Psychol. 96; 563-573, 1982). I denne forbindelse synes vannlabyrinten (Morris, Learning and Motivation, 12: 239-261, 1978) å være et egnet adferdsparadigme for deteksjon av kognitive skader indusert av AF64A i rotter, og reversering av disse skadene ved hjelp av kolinergiske legemidler. Siden fysostigmin på det nåværende tidspunkt er et av de få kolinergiske legemidlene som benyttes hos pasienter med Alzheimer's sykdom, ble dette valgt for innledende under-søkelse av forbindelsens egenskaper på AF64A-behandlede rotter. 38 Sprague-Dawley-hannrotter (oppdrettet av Charles River) 5-6 måneder gamle med en gjennomsnittlig vekt på 500 g ble benyttet. Rottene ble plassert i grupper på fem og ble gitt fri tilgang til mat og vann. Undersøkelsen ble utført i et rundt hvitt metallkar, 1,4 m i diameter og 0,4 m dypt. Karet ble fylt med vann, gjort opakt ved hjelp av melkepulver til et nivå på 18 cm. En plattform av 12 cm diameter og ved en høyde på 16 cm ble plassert i karet 2 cm under vann-nivået. Plattformen var dekket med gassbind for å forhindre at dyrene gled tilbake i vannet etter at de hadde nådd plattformen. Før undersøkelsen ble rotten plassert på plattformen i 120 sek., plassert forsiktig i vannet, med ansiktet mot veggen av bassenget, ved en av fire startposisjoner (nord, syd, øst eller vest) rundt bassengets omkrets. Innenfor hver bokk av fire forsøk ble hver rotte startet en gang i hver av de fire startretningene, rekkefølgen for startplasseringene var tilfeldig valgt. Undersøkelsen ble utført på to etterfølgende dager og hver rotte ble daglig utsatt for åtte forsøk. Under forsøkene 1-12 var plattformen plassert i sentrum av den sydøstre kvadranten og under forsøkene 13-16 var plattformen overført til sentrum av den nordvestre kvadranten. Dersom rotten i løpet av et spesielt forsøk fant plattformen, ble den tillatt å forbli på denne i 60 sek. før det neste forsøket startet. Dersom en rotte ikke fant plattformen, ble forsøket avsluttet etter en tid på 120 sek., og den ble deretter plassert på plattformen i 60 sek. før det neste forsøket ble startet. Latensen for å finne plattformen ble målt.

For legemiddelundersøkelse ble rotter injisert med AF64A eller CSF (3 nmol/2 pl/side) som beskrevet i forsøk 2 ovenfor. Rottene ble først underkastet en gjennomgangsinn-læringsprosedyre (se forsøk 1 ovenfor) og ble deretter 3-3,5 måneder etter injeksjonen undersøkt i vannlabyrinten. Rottene ble inndelt i fire grupper; 18 CSF-injiserte rotter ble behandlet enten med fysostigmin (0,1 mg/kg, i.p.) (10 rotter) eller med saltvann (8 rotter). 20 AF64A-injiserte rotter ble inndelt på tilsvarende måte. Rottene ble injisert med fysostigmin straks før undersøkelsen hver dag.

Resultater

Bergingslatensen ble analysert ved hjelp av en treveis "ANOVA" (4x2x2) med en gjentatt variabel (forsøk) og to ikke-gjentatte variabler (injeksjon - AF64A/CSF og behandling

- fysostigmin/saltvann). Tabell (viii) presenterer bergingslatensen for de undersøkte gruppene. Fig. 16 viser at AF64A-injiserte rotter viste en økning i bergingslatens (i sek.)

relativt til CSF-behandlede rotter. Denne effekten er meget signifikant, F(l,34) = 14,88, p<0,001. Den innledende bergingslatensen for alle fire grupper var tilsvarende. Imidlertid avtok bergingslatensen for de CSF-behandlede rottene raskere enn bergingslatensen for de AF64A-behandlede rottene. Fysostigmin svekket tilsynelatende ytelsen for både AF64A-og CSF-injiserte grupper, sammenliknet med ikke-behandlede AF64A- og CSF-injiserte grupper, men dette resultatet var ikke statistisk signifikant. Forsøkenes effekt var statistisk signifikant, F(15,510) = 5,9, p<0,001. I tillegg ble det funnet en signifikant interaksjon mellom forsøk og fysostigmin, F(15,510) = 4,3, p<0,001; fysostigmin inhiberte reduksjonen av bergingslatenskurven, uavhengig av inj eksj onsgruppen.

Når Morris-svømmelabyrintforsøk ble utført på AF102B (1

mg/kg, i.p.), ble det funnet at denne forbindelsen definitivt forbedret hukommelsessvekkelsene indusert av AF64A (fig. 17), mens fysostigmin (0,1 mg/kg, i.p.) hadde en negativ virkning. De fordelaktige virkningene av AF102B i dette forsøket var på den spatielle hukommelsesdysfunksjonen indusert av AF64A. Det er i denne sammenheng verdt å merke seg at en viktig

hukommelsesdysfunksjon hos SDAT-pasienter er svekkelse av den spatielle hukommelsen. Detaljer vedrørende disse forsøkene er gitt i beskrivelsen som følger.

Morris vannlabyrint: Fremgangsmåte og resultater

a. Obj ekter

40 Spraque-Dawley-hannrotter (fra Charles River Breeding Laboratories, U.K.), 5-6 måneder gamle med vekt 450-580 g ble brukt som forsøksobjekter under forsøket. Rotter ble plassert i grupper på 5 og ble gitt fri tilgang til mat og vann. 2,5-3,5 måneder før adferdsundersøkelsen ble rottene injisert med AF64A (3 nmol/2 pl/side) (20 rotter - gruppe 1) eller CSF (20 rotter - gruppe 2) som beskrevet under den kirurgiske fremgangsmåten.

b. Medisinadministrerin<g>

Hver av de injiserte gruppene ble tilfeldig underinndelt i to like store behandlingsgrupper. Ved avslutningen av innlæringsprosedyren, den første og andre dagen av adferds-undersøkelsen, ble en av de AF64A-injiserte undergruppene og en av de CSF-injiserte undergruppene (n=20) behandlet med AF102B oppløst i saltvann (1 mg/kg, i.p.), mens de to andre undergruppene (n=20) ble behandlet med saltvann.

AF102B ( 1 mg/ kg. i. p.)

Redningslatensen for denne behandlingen ble analysert ved hjelp av en treveis "ANOVA" (4x2x2) med en gjentatt variabel (forsøk) og to ikke-gjentatte variabler [injeksjon (AF64A/CSF) og behandling (AF102B/saltvann)]. Fig. 17 viser at AF64A-injiserte rotter viste en betydelig økning i redningslatens relativt til CSF-injiserte rotter [F(l,36) = 11,26; p<0,005]. I tillegg viste AF102B-behandlede rotter en betydelig reduksjon i bergingslatens relativt til saltvannsbehandlede rotter [F(l,36) = 4,89; p<0,05] uavhengig av injiserte grupper. Forsøksvirkningen var statistisk signifikant [F(5,180) = 33,34; p<0,001]; i tillegg ble det funnet en signifikant interaksjon mellom forsøk og injeksjon [F(5,180) = 5,53; p<0,001]; redningslatensen for de CSF-injiserte rottene avtok raskere enn redningslatensen for de AF64A-injiserte rottene.

8- armet radiell armlabyrint

I den 8-armede radielle armlabyrinten induserer AF64A (3 nmol/2 pl/side) hukommelsessvekkelser. I dette forsøket ble virkningene av AF102B og fysostigmin vurdert i AF64A- og CSF-behandlede rotter. Forsøk ble utført på virkningen av AF102B (5 mg/kg, i.p.), så vel som på fysostigmin (0,1 mg/kg, i.p.) i begge tilfeller 2 timer etter at rottene hadde trent.

Fremgangsmåte

I alle forsøkene ble Spraque-Dawley-rotter benyttet (Charles River Breeding Laboratories, U.K.); de ble oppbevart hver for seg og fikk ikke mat inntil de nådde 85$ av vekten ved fri tilgang på f6r. Rommet var opplyst 12 timer pr. dag (6.00 til 18.00) og adferdstrening og undersøkelses-seksjoner ble utført i løpet av dagen. Etter at de nådde 85$ av vekten ved fri tilgang på fdr, fikk rottene tre f6rpellets (Labena) pr. dag og hadde fri tilgang på vann. To dager før treningen begynte, ble rottene gjort kjent med 45 mg presisjonspellets (Bioserv Ic.) som senere ble benyttet for forsterkning i labyrinten.

Det ble benyttet samme kirurgiske prosedyre som i den passive unnlatelses- og Morris-svømmelabyrint-forsøkene.

Prosedyre

En gruppe på 20 rotter som først ble benyttet i et passivt unnlatelsesforsøk, ble trenet i den nye labyrinten 7 uker etter injeksjon. Etter 6 dagers trening ble det innlagt en 2 timers forsinkelsesperiode. Rottene ble tillatt å samle fire pellets, deretter ble de ført tilbake fra labyrinten til burene. Etter 4 timers forsinkelse ble de satt tilbake i labyrinten inntil de hadde samlet de gjenværende fire pellets eller inntil 5 min. var gått.

Forsøk 1:

Den samme gruppen av rotter ble injisert med AF102B (5 mg/kg, i.p.) eller saltvann (1 ml/kg, i.p.) straks etter at de hadde plukket de fire første agnene. Virkningene på ytelsen ble undersøkt 2 timer etter injeksjon. Hver rotte fikk begge behandlingene to ganger. Et intervall på en dag ble anvendt mellom AF102B-behandlingen og saltvannsbehandlingen, og 2 dager mellom seriene av behandlinger.

Forsøk 2:

En uke senere ble den samme gruppen rotter injisert med fysostigmin (0,1 mg/kg, i.p.) eller saltvann (1 ml/kg, i.p.), straks etter at de hadde tatt de første fire agnene. Virkningene på ytelsen ble undersøkt 2 timer etter injeksjon.

Resultater og diskusjon

Forsøk 1:

Behandlingen med AF102B (5 mg/kg, i.p.) straks etter avslutningen av de første fire utplukkingene hadde en

betydelig virkning på ytelsen (fig. 18). Analyse av resultatene i en 2-faktors blandet utførelse: gjentatte målinger av en faktor viste en signifikant (p<0,001, F = 17,5) reduksjon i det gjennomsnittlige antallet feil for de AF64A-injiserte rottene sammenliknet med kontrollrottene (AF64A-injiserte rotter behandlet med saltvann). En signifikant effekt (p<0,005, F = 14,5) ble funnet mellom forsøk (behandling med AF102B vs. saltvann) og betingelser (AF64A icv-injeksjoner vs. CSF-icv-injeksjoner ). AF102B-behandlingen forbedret ytelsen bare når rottene på forhånd var injisert icv med AF64A.

Forsøk 2:

Behandling med fysostigmin (0,1 mg/kg, i.p.) hadde ingen signifikant virkning på ytelsen for rottene (p>0,05, F = 4,03) (fig. 19) selv om det er en tendens til en tilsynelatende bedring som en følge av fysostigmin. Imidlertid forble forskjellene mellom de AF64A-injiserte rottene og de CSF-injiserte rottene signifikante (p<0,005, F = 11,4).

Konklusjoner

Fremgangsmåten i den radielle armlabyrinten beviste på utmerket måte at: (1) det er en signifikant forskjell i ytelsene av AF64A- sammenliknet med de CSF-behandlede rottene, og (2) hukommelsessvekkelsen kunne reverseres ved hjelp av AF102B (5 mg/kg, i.p.).

SAMMENFATNING AV ADFERDSUNDERSØKELSER

Tabellen som følger oppsummerer de relevante resultatene vedrørende AF102B, oksotremorin og pirenzepin, og viser de fremragende egenskapene av forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen som en tilsynelatende M^-type agonist. Selv om eksperimentene ikke i alle forsøkene ble utført på det samme spesies (mus eller rotter) og under de samme betingelsene, kommer det tilsyne en slående parallellitet når det gjelder de relative aktivitetsprofilene mellom pirenzipin (M^-antagonist) og AF102B (M^-agonist). For begge forbindelsene finner hukommelsessvekkelser (indusert av pirenzepin) og reversering av AF64A-indusert hukommelsessvekkelse (forårsaket av AF102B) sted ved mye lavere doser enn påkrevet for å antagonere sentrale virkninger indusert av oksotremorin (i tilfellet pirenzepin) eller å indusere den samme typen av sentrale bivirkninger (i tilfellet AF102B).

Følgelig er kognitive funksjoner som bevirkes av en M^-antagonist (pirenzepin) eller en M^-agonist (AF102B) mer følsomme for slike kolinergiske intervensjoner enn andre sentrale virkninger såsom skjelvinger eller antinocisepsjon. Dette funnet er uhyre viktig, siden det kan benyttes til å forklare hvorfor AF102B har en slik bemerkelsesverdig selektivitet og hvorfor det kan betraktes som en utmerket kandidat for en medisin for behandling av SDAT.

(a) Minimum effektiv dose av PNZ som gir svekket passiv

unnlatelsesinnlæring.

(b) Effektiv dose av AF102B som gir reversering av AF64A

(3 nmol/side, icv)-indusert svekket passiv unnlatelsesinnlæring (den minimalt effektive dosen kan nedsettes for p.o.-fremgangsmåten av administrering). (c) Dose av PNZ påkrevet for å redusere virkningen av oksotremorin (0,5 mg/kg, i.p.) med 50$ [Caulfield et al., J. Pharm. Pharmacol. 35: 131-132 (1983)]. (d) Skjelvinger og antinocisepsjon (analgesi) indusert ved AF102B i mus og rotter; disse virkningene observeres rundt de toksiske dosene for forbindelsen (antinocisepsjon bevirkes ved hale-kuttingsforsøket på mus).

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av farmasøytisk virksomme kinuklidinderivater med den generelle formel (I) hvori Z står for gruppen >Cr<1>r<2>, hvor R<1> er valgt fra laverealkyl og difenyllaverealkyl, og R<2> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og fenyl, og geometriske isomerer, enantiomerer, diastereoisomerer, racemater og/eller syreaddisjonssalter derav, karakterisert ved at den innbefatter omsetning av 3-hydroksy-3-merkaptometylkinuklidin med en karbonylforbindelse av formelen R^-CO-R<2>, hvor R^ og R<2> har samme betydning som ovenfor, eventuelt i nærvær av et inert organisk oppløsningsmiddel og/eller en syrekatalysator, og isolering av det ønskede produket fra reaksjonsblandingen, og etter isolering gjennomføres minst et av de følgende trinnene, det ønskede produktet separeres i dets geometriske isomerer, det omvandles fra den frie basen til dets syreaddisjonssalt, og (eller) det omvandles fra dets syreaddisjonssalt til den frie basen.

2. Mellomprodukt, karakterisert ved at det utgjøres av 3-hydroksy-3-merkaptometylkinuklidin.