DK173084B1 - Quinuclidinderivater, fremgangsmåde til fremstilling heraf samt farmaceutisk præparat indeholdende disse - Google Patents

Description

DK 173084 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte spiro(1,3-oxathio-lan-5,3')quinuclidiner og en hidtil ukendt hydroxymercaptomethylquinu-clidin; fremgangsmåder til fremstilling af de hidtil ukendte forbindelser; farmaceutiske præparater, som omfatter spiroforbindelseme; 5 og anvendelse af sådanne spiroforbindelser eller farmaceutiske præparater til behandling af sygdomme i centralnervesystemet.

USA-patentskrift nr. 4.083.985 beskriver en række kondenseret-ring-quinuclidiner, som er beskrevet som psykomotoriske stimulatorer, og som strukturmæssigt kan anses for at være en quinuclidinkerne, som er 10 fusioneret til en cyclohexanon-, cyclohexenon- eller delta-lacton-del.

Disse forbindelser angives at være anvendelige til behandling af (bl.a.) Parkinsons sygdom og depression og har åbenbart anticholinerg virkning. Der er i dette patentskrift ikke tegn på, at nogen af disse forbindelser har cholinerg virkning.

15 USA-patentskrift nr. 4.104.397 beskriver spiro(1,3-dioxolan-4,3')qui-nuclidiner, som kan have én eller to alkyl- og/eller arylsubstituenter i 2-stillingen i dioxolan-ringen. Patentskriftet beskriver især monomethyl-, dimethyl- og diphenylforbindelserne. Monomethylforbindelsen påvises at have cholinerg virkning og diphenylforbindelsen at 2 0 have anticholinerg virkning. Beskaffenheden af den farmokologiske aktivitet, som udvises af de andre forbindelser, som er omfattet af dette patentskrift, er ikke beskrevet deri.

En kronisk mangelfuldhed in vivo i centralcholinergfunktion, dvs. i acetylcholine funktion som neurotransmitter, er involveret i en række 25 neurologiske og psykiatriske sygdomme, herunder senil demens af Alz-heimers type (SDAT), tardiv dyskinesi, Picks sygdom, Huntingtons chorea, Gilles de la Tourettes sygdom, Friedrichs ataksi og Downs syndrom. Kliniske data viser« at cholinerg transmission kan have været kompromitteret hos personer, som lider af disse sygdomme {Fisher og 30 Hanin, Life Sciences 27. 1980, s. 1815).

Blandt disse sygdomme er SDAT den mest udbredte neuropsykiatriske sygdom (jfr. henholdsvis Schneck et al.. Am. J. Psychiatry 139. 1982, s. 165 og Coyle et al., Science 219, 1983, s. 1184). Udviklingen af en effektiv behandling af SDAT er et af de mest presserende behov, som 35 den medicinske videnskab stAr overfor i dag. Denne aldersrelaterede sygdom får tiltagende prævalens, eftersom den ældre population tiltager i takt med den ældre populations progressivt højere forventede levetid.

SDAT karakteriseres morfologisk ved et øget antal af senile plaques i 40 udvalgte hjerneområder; biokemisk ved en signifikant reduktion af DK 173084 B1 2 præsynaptiske cholinerge markører i de samme hjerneområder, især cortex og hippocampus; og adfærdsmæssigt ved et tab af kognitive funktioner hos de enkelte patienter.

Eftersom SDAT ser ud til at være associeret med cholinerg hypofunktion 5 i hjernen, er der blevet udført forsøg, hvor ACh-precursorer (cholin eller lecithin), acetylcholinesterase-inhibitorer (physostigmin eller tetrahydroaminoacridin) eller direkte virkende muscarine agonister (arecolin) er blevet indgivet til SDAT-patienter på grund af disse midlers evne til at øge og således antagelig genskabe cholinerg 10 aktivitet i hjernen. Op til nu har resultaterne ikke været konklusive med hensyn til behandlingseffektiviteten med de ovennævnte midler; dette skyldes hovedsageligt uønskede bivirkninger, snævert terapeutisk vindue eller mangel på terapeutisk effektivitet.

Der er et presserende behov for medikamenter, som er effektive til 15 behandling af SDAT. Fremskridt på dette område er blevet hindret af manglen på adækvate dyremodeller, som direkte kan efterligne den cholinerge abnormalitet, som er involveret i SDAT, og af knaphed på langtidsvirkende centralcholinerge agonister, som kan skelne mellem receptor-underklasser, og som primært aktiverer dem, som er involveret 20 i kognitive funktioner. De fleste kendte cholinerge agonister (muscarine medikamenter) har uønskede bivirkninger. Et langtidsvirkende centralaktivt cholinomimetisk medikament uden perifere bivirkninger ville derfor være særdeles anvendeligt. Forskning og udvikling af sådanne medikamenter ville kræve, at de blev vurderet i passende 25 dyremodeller for SDAT.

I denne forbindelse er der for nylig blevet udviklet et selektivt præsynaptisk cholinergt neurotoxin, ethylcholin-aziridinium-ion (AF64A), som ved intracerebroventriculær (i.c.v.) injektion i rotter inducerer persisterende cholinerg hypofunktion, som efterligner den 30 corticale og hippocampale cholinerge mangelfuldhed og den kognitive forringelse, som ses ved SDAT. Denne dyremodel kunne være særdeles nyttig ved udvikling af hidtil ukendte behandlingsmåder for SDAT (Fisher et al. i "Behavorial Models and Analysis of Drug Action", red. Spiegelstein og Levy, Elsevier, Amsterdam, 1983, s. 333; Fisher og 35 Hanin, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 26. 1986, s. 161-81).

Tilgængeligheden af centralaktive muscarine forbindelser, som har langtidsvarende central cholinerg virkning uden signifikante perifere uønskede bivirkninger, og som er i stand til at reversere de kognitive forringelser, som er induceret af AF64A i rotter, kunne være særdeles 40 nyttige til behandling af SDAT og de ovenfor nævnte relaterede sygdomstilstande .

DK 173084 B1 3

Terapeutisk aktive oxathiolanforbindelser og deres farmakologi er relativt ukendt. Litteraturen er endvidere fuld af forgæves forsøg på at erstatte et specielt atom eller en speciel gruppe i en farmakologisk aktiv kemisk forbindelse med et antageligvis analogt atom eller 5 analog gruppe i et forsøg på at forbedre den terapeutiske profil af den oprindelige forbindelse. Når fx et oxygenatom erstattes med et svovlatom, som har den dobbelte atomvægt af oxygen, kan resultatet med hensyn til farmakologiske betingelser således ikke med vished forudsiges .

10 Imidlertid har det nu overraskende vist sig, og dette fund udgør basis for den foreliggende opfindelse, at hvis man i spiro(dioxolan)qui-nuclidinerne ifølge USA-patentskrift nr. 4.104.397 erstatter oxygenatomet i den dioxolanring, som er fjernest fra quinuclidinkernen, med et svovlatom og samtidig udvider virkefeltet for substituenterne i 15 2-stillingen til at omfatte diarylmethylol, og erstatter alkyl med aryl, så (i) udviser den mest aktive isomer af monomethylforbindelsen signifikant mindre udtalte bivirkninger (spytfremkaldende og tremor-fremkaldende virkning) end den nævnte forbindelse vinder lignende omstændigheder, samtidig med at den sammenlignet med den mest aktive 20 isomer af den analog, der er beskrevet i det nævnte USA-patentskrift, har en lignende virkning (målt ved induceret marsvine-ileum-kontraktion og muscarine receptorbindingstests); og (ii) den mest aktive isomer af monomethylforbindelsen har et interessant potentiale til behandling af SDAT, hvilket er vist ved forsøgene på de dyremodeller, 25 der er nævnt ovenfor.

På den anden side har det store flertal af de andre 2-substituerede medlemmer af den serie, som indeholder svovlatomet i stedet for det ovenfor nævnte oxygenatom, og især de medlemmer, som indeholder mindst én 2-substituent, som er alkyl med tre eller flere carbonatomer, 30 cyclopentyl, cyclohexyl, aryl, diarylmethylol eller alkyl substitueret med aryl, anticholinerg virkning i modsætning til monome thyl forbindelsens cholinerge virkning.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således quinuclidinderiva-ter med den almene formel I

C

35 og geometriske isomerer, enantiomerer, diastereoisomerer, racemater og/eller syreadditionssalte deraf, hvor Z betegner gruppen >CRlR2 eller to hydrogenatomer; og R* er valgt fra gruppen bestående af hydrogen, alkyl, cyclopentyl, cyclohexyl, aryl og diarylalkyl, og R2 er valgt fra DK 173084 B1 4 gruppen bestående af alkyl, cyclopentyl, cyclohexyl, aryl eller diarylalkyl.

Ifølge én af opfindelsens udførelsesformer betegner Z i den almene formel I gruppen >CRJR2, R1 betegner hydrogen, og R2 betegner alkyl 5 eller diarylalkyl.

Ifølge en anden af opfindelsens udførelsesformer betegner Z i den almene formel I gruppen >CR!R2, R1 betegner alkyl, og R2 betegner cyclopentyl, cyclohexyl, aryl eller diarylalkyl.

Når Z i den almene formel I betegner gruppen >CR*R2, har de således 10 definerede forbindelser virkning på centralnervesystemet. Disse forbindelser kan betegnes som 2,2-disubstituerede spiro(l,3-oxathio-lan-5,3'>quinuclidiner. Ikke-begrænsende eksempler på sådanne forbindelser er beskrevet i den følgende tabel: R1 R2 15 _ hydrogen methyl (la) hydrogen ethyl hydrogen propyl hydrogen phenyl 20 hydrogen diphenylmethyl (Ib) methyl phenyl (Ic) ethyl phenyl cyclohexyl phenyl phenyl phenyl 25 Opfindelsen omfatter således også den forbindelse med den almene formel I, hvor Z betegner to hydrogenatomer, dvs. 3-hydroxy-3-mercapto-methylquinuclidin, ud fra hvilke forbindelser ifølge opfindelsen, hvor Z i den almene formel I betegner gruppen >CR*R2, kan fremstilles.

Som tidligere anført omfatter opfindelsen de geometriske isomerer, 30 enantiomerer, diastereoisomerer, racemater og/eller syreadditionssalte af forbindelserne med den almene formel i.

Det er klart, at geometrisk isomeri opstår ud fra det forhold, at R1 i spiroforbindelserne ifølge opfindelsen fx enten kan være på den samme side af oxathiolanringen som nitrogenatomet i quinuclidinringen, eller 35 på den modsatte side. Hvis R1 og R2 i spiroforbindelserne ifølge opfindelsen er identiske, vil der være et enkelt asymmetricentrum ved DK 173084 B1 5 5,3'(spiro)-carbonatomet, hvilket ligeledes vil give anledning til enantiomerer og racemater deraf. Hvis på den anden side R1 og R2 i spiroforbindelserne ikke er identiske, vil der yderligere være et asymmetricentrum ved 2-stillingen i oxathiolanringen, hvilket giver 5 anledning til diastereoisomerer og racemater deraf i tilgift til de geometriske isomerer, som allerede er nævnt. Endvidere er det klart, at der i den forbindelse ifelge den foreliggende opfindelse, som er 3-hydroxy-3-mercaptomethylquinuclidin, ikke er mulighed for geometrisk isomeri; imidlertid er der også her et asymmetricentrum ved 3-stil-10 lingen i quinuclidinringen, hvilket giver anledning til enantiomere og racemiske former.

Forbindelserne med den almene formel I danner, hvadenten de er som isomere blandinger eller forbindelser eller som enkeltisolerede geometriske eller optiske isomerer, stabile additionssalte med or-15 ganiske eller uorganiske syrer eom fx med saltsyre. Det ses, at medens sådanne salte bor være farmaceutisk acceptable til terapeutisk anvendelse, kan det imidlertid være hensigtsmæssigt, fx til isolationsformål, at anvende syreadditionssalte, som ikke er farmaceutisk acceptable, og opfindelsen angår endvidere syreadditionssalte af denne 20 art. Hvis forbindelserne fx opnås som resultat af isolation under deres fremstillingsproces i form af frie baser, kan de, som det vil kunne ses af fagmanden, omdannes til syreadditionssaltene ved omsætning med den passende syre, og omvendt kan de forbindelser, der er isoleret i form af deres syreadditionssalte, omdannes til de til-25 svarende frie baser ved omsætning med en base såsom et alkalimetal-hydroxid.

Geometriske isomerer isoleres sædvanligvis ved en fysisk metode såsom fraktioneret krystallisation (af isomererne per se eller salte deraf), fraktioneret destillation eller søjlekromatografi (under anvendelse af 30 høj- eller lavtryksvæskekromatografi-teknikker), medens optiske isomerer isoleres ved dannelse af en saltblanding med et optisk aktivt komplementært reagens (i det foreliggende tilfælde en optisk aktiv syre), efterfulgt af fraktionering af blandingen og isolering af de ønskede optiske isomerer fra saltfraktionerne.

35 I en speciel udførelsesform tilvejebringer opfindelsen de isolerede geometriske isomerer af den forbindelse, hvor R* er hydrogen, og R2 er methyl (la). Disse isomerer kan skelnes fra hinanden ved, at deres salte med saltsyre helt tydeligt har relativt højere og relativt lavere smeltepunkter. Salteyresaltet fra blandingen af geometriske 40 isomerer af forbindelse (la), som isoleres ved fremstillingsprocessen ifølge opfindelsen, såvel som saltsyresaltene af de enkelte geometriske isomerer er også omfattet af opfindelsen.

DK 173084 B1 6

Ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles de forbindelser med den almene formel I, hvor Z betegner gruppen >CR1R2, ved en fremgangsmåde, som omfatter omsætning af 3-hydroxy-3-mercaptomethylquinuclidin med en carbonylforbindelse med den almene formel r'-CO-R2 og isolering af det 5 ønskede produkt fra reaktionsblandingen. Fremgangsmåden udføres fortrinsvis i nærværelse af en syrekatalysator såsom en Lewis-syre, fx bortrifluorid, som hensigtsmæssigt anvendes i form af dens complex med diethylether, også kendt som bortrifluoridetherat.

Fremgangsmåden udføres endvidere fortrinsvis i nærværelse af et inert 10 organisk opløsningsmiddelmedium som fx chloroform eller dichlormethan.

Den temperatur, hvorved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres, er ikke kritisk, men det vil klart være fordelagtigt at anvende en så lav temperatur, som er konsistent med et rimeligt udbytte for at undgå forurening af det ønskede produkt med biprodukter, som kunne opstå ved 15 sønderdeling og/eller bireaktioner ved højere temperaturer. Det ses, at når fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres i nærværelse af en katalysator såsom bortrifluoridetherat, er en temperatur i området ca.

20'30°C hensigtsmæssig, men højere eller lavere temperaturer kan naturligvis anvendes; en reaktionstemperatur på ca. 25°C foretrækkes.

20 For også at undgå uønsket forurening på grund af oxidation foretrækkes det at udføre reaktionen i en atmosfære af inert gas såsom nitrogen.

I en speciel udførelsesform for opfindelsen omfatter en fremgangsmåde til fremstilling af de forbindelser med den almene formel I, hvor Z betegner gruppen >CR’r2, således omsætning af 3-hydroxy-3-mercaptopro-25 pylquinuclidin med en carbonylforbindelse med den almene formel R1-CO-R2 i en atmosfære af nitrogen ved en temperatur i området fra ca.

20 til ca. 30°C, fortrinsvis ca. 25eC, i nærværelse af bortrifluoridetherat som katalysator og i dichlormethan og/eller chloroform som opløsningsmiddelmedium og isolering af det ønskede produkt fra reak-30 tionsblandingen.

I denne specielle udførelsesform for fremgangsmåden foretrækkes det, at reaktionsingredienserne først blandes i en atmosfære af nitrogen ved en temperatur mellem -10 og +20°C, fx ved ca. 0°C, og den således opnåede blanding lades herefter stige til reaktionstemperaturen.

35 Opfindelsen tilvejebringer yderligere en fremgangsmåde til fremstilling af den forbindelse med den almene formel I, som er 3-hydroxy-- 3-mercaptomethylquinuclidin, hvor epoxidet af 3-methylenquinuclidin omsættes med hydrogensulfid; i et alternativ kan denne reaktion udføres i nærværelse af en base såsom natriumhydroxid, fortrinsvis i 40 et vandigt medium, medens reaktionen med hydrogensulfid i et andet alternativ kan udføres fx i DMSO + (chloroform og/eller toluen) som DK 173084 B1 7 opløsningsmiddelmedium. Epoxidet selv kan fremstilles ved omsætning af quinuclidin-3-on med dimethylsulfoxonium-methylid.

Fremstillingsprocesserne ifølge den foreliggende opfindelse, herunder de fremgangsmåder, hvorved relevante udgangsmaterialer fremstilles, 5 illustreres i en foretrukken udførelsesf orm i følgende reakt ions skema:

♦ - CH

CH -S —>0 I N.H DHSO CHr S ~>0 ♦ H * Nal i ----—> 2 | 2

CH

3 CH 0 / \ I 3 DHSO / \l \

I ! ♦ CH = S — >0 -----> I 1“ « DHSO

\N/ 2| \H /

CH

3

O OH

/ \J \ vandigt NaOH / \|

I Γ ♦ H S -----------> I |\_SH

2 eller opløsnings- middel« * * R 2

OH O bor- O---}- R

/ \! 1 " 2 trifluorid- / \J I

I i \_SH ♦ R - C - R -----------------> I i \_S

\H/ etheret + \H/ CH Cl og/eller CHCl, (DMSO = dimethylsulfoxid) 2 2 (I) *DMSO + (chloroform og/eller toluen)

Spiroforbindelseme med den almene formel I har virkning på centralnervesystemet. Således er fx forbindelsen la en muscarin agonist med 10 en høj specificitet for centralnervesystemet. På grund af dens farmakologiske egenskaber kan den anvendes til at aktivere centralcho-linerge funktioner under omstændigheder, hvor det cholinerge system er hypofunktionelt. Den kan således anvendes til behandling af tilstande DK 173084 B1 8 såsom senil demens af Alzheimers type (SDAT), dyskinesia tardiva,

Picks sygdom, Huntingtons chorea, Gilles de la Tourettes sygdom,

Friedrichs ataksi og Downs syndrom, eftersom alle disse er forstyrrelser, hvor en centralcholinerg hypofunktion til en vis grad er in-5 volveret. Denne forbindelse ser ud til at være af speciel værdi til behandling af SDAT, eftersom den er effektiv til reversering af hukommelsessygdomme på grund af AF64A-induceret cholinotoxicitet i en dyremodel egnet for denne sygdom. Særligt de geometriske isomerer af forbindelsen la, hvoraf HCl-saltet har relativt lavere smeltepunkt 10 (cis-isomeren), og som er blevet tildelt kodetallet AF102B, reverserer hukommelsesforringelser hos AF64A-behandlede rotter som vist i en passiv undgåelsestest "passive avoidance test"), i Morris' svømme-labyrint ("Swimming Maze") (jfr. Morris, Learning and Motivation 12, 1978, s. 239-261) og i den ottearmede strålelabyrint ("8-Arm Radial 15 Maze"). [De andre geometriske isomerer af forbindelsen la, hvis HCl-salt har relativt højere smeltepunkt (trans-isomeren). er blevet tildelt kodenummeret AF102A]. I denne forbindelse inducerer AF64A (3 nmol/2μl/side, i.c.v.) betydelige kognitive forringelser i en træd-igennem passiv undgåelsestest ("step-through passive avoidance test") , 20 i Morris' svømmelabyrint og i den ottearmede strålelabyrint, når rotterne analyseres 4-8 uger efter behandling (Brandeis et al., i "Alzheimer's and Parkinson's Disease: Strategies in Research and Development", red. Fisher et al., Plenum Press, New York, under trykning; Fisher og Hanin, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 26. 1986, 25 S. 161-181).

De fordelagtige virkninger af AF102B i de passive undgåelsestests og Morris' svømmelabyrinttests forekommer ved lave doser (0,1-1 mg/kg, intraperitonealt (i.p.) eller 1 mg/kg, peroralt (p.o.)), og det terapeutiske indeks er henholdsvis 78-780 og >156. Dette terapeutiske 30 indeks er bredere end det, som er fundet for physostigmin (5-17).

Endvidere er hældningen af den akutte toxicitetskurve meget stejl, og ingen åbenbare adfærdsmæssige virkninger, herunder parasympathomime-tiske virkninger såsom spytflåd eller tremor, blev bemærket op til den letale dosis. I denne henseende er forbindelsen bedre end velkendte 35 muscarine agonister, herunder arecolin og oxotremorin, hvor sådanne uønskede bivirkninger komplicerer deres eventuelle anvendelse i SDAT-behandling. AF102B har endvidere en lang virkningsvarighed i de ovennævnte hukommelsestests.

Det er interessant, at forbindelsen absorberes godt til blodet efter 40 indgift p.o., eftersom dens virkningsindtræden er kort, dvs. 10-15 minutter. Dette er indlysende i følgende farmakologiske tests: anal-gesi, hypothermi og letalt dosisniveau induceret af AF102B.

DK 173084 B1 9

Sammenlignet med physostigmin (0,1 mg/kg, i.p.) er AF102B (5 mg/kg, i.p.) overlegen, eftersom den forbedrer AF64A-inducerede hukommelses-forringelser i den ottearmede strålelabyrint, en test, hvori physostigmin mislykkedes under de samme eksperimentelle betingelser.

5 Mangel på AF102B-inducerede uønskede bivirkninger er endvidere bemærkelsesværdig i analgesitests {hos mus) og hypothermitests (hos rotter), to farmakologiske tests, som anvendes til at vurdere central muscarin virkning. I disse tests fremkaldte kun høje doser af forbindelsen signifikante bivirkninger. Sådanne doser er mindst 15-150 10 (i.p.) eller 40 (p.o.) gange højere, end hvad der kræves til at rev ersere AF64A-inducerede hukommelsesforringelser hos rotter i den passive undgåelsestest.

Biokemiske undersøgelser afslørede, at AF102B er en specifik centralt aktiv muscarin Ml-type-agonist, og den er den første kendte forbin-15 delse af en sådan art. Denne selektivitet blev åbenbar, når AF102B

blev vurderet ved fortrængning af [3H]-pirenzepin, [3H]-PNZ (en Ml-spe-cifik antagonist) versus [3H]-quiniclidinyl-benzilat, [3H]-QNB (en Ml-og M2-antagonist) fra rottehjernehomogenater fTrends in Pharmacol.

Sci.(SuppI). jan. 1984].

20 I denne henseende viste det sig, at de Ml-type muscarine receptorer, som først og fremmest findes i cortex og hippocampus, er relativt uforandrede i SDAT (Mash et al., Science 228. 1985, s. 115-117). Disse to hjerneområder i SDAT udviser de mest udtalte præsynaptiske cho-linerge hypofunktioner og histologiske abnormaliteter, og de er 25 hovedsageligt forbundet med kognitive dysfunktioner, som ses ved SDAT.

AF102B's specificitet for muscarine receptorer i almindelighed og Ml-receptorer i særdeleshed er endvidere åbenbar ved manglen på nogen signifikant virkning på høj-affinitetscholintransport (fra rottehjer-nesynaptosomer) eller cholinacetyltransferase-aktivitet (fra rotte-30 hjemehomogenater) .

AF102B's Ml-agonist-type-virkning kan være ansvarlig for i det mindste en del af AF102B's høje selektivitet både in vitro og in vivo (især ved reversering af kognitive forringelser, som er induceret af AF64A).

Mutagenicitetsundersøgelser af AF102B in vitro har vist, at forbin-35 delsen ikke er mutagen op til høje koncentrationer. Sammen med det høje terapeutiske indeks for denne forbindelse gør disse data den til et potentielt medikament til behandling af SDAT-patienter.

DK 173084 B1 10

Hos SDAT-patienter kan AF102B anvendes i kombination med anticholinesterase- inhibitorer såsom physostigmin eller tetrahydroaminoacridin; i kombination med acetylcholin-precursorer såsom cholin eller lecithin; i tilgift til "nootrope" medikamenter såsom piracetam, anirace-5 tam, oxiracetam eller pramiracetam; i tilgift til forbindelser, som indvirker på Ca2+-kanaler såsom 4-aminopyridin eller 3,4-diaminopyri-din; eller i tilgift til peptider, som kan have modulerende virkninger på acetylcholin-frigivelse såsom somatostatin.

AF102B, med eller uden de ovennævnte andre aktive stoffer, kan fx 10 indgives ved injektion i en passende diluent eller bærer, p.o., rek-talt i form af suppositorier, ved insufflation, ved infusion eller transdermalt i et passende vehikel med eller uden physostigmin, fx ved anvendelse af den indretning, som er beskrevet i israelsk patentansøgning nr. 72684 {se nedenfor). Denne forbindelse kan endvidere 15 anvendes ved forstyrrelser, hvor cholinerg hypoaktivitet er induceret af medikamenter.

Forbindelsen la, enten i form af en geometrisk isomer eller en blanding af sådanne isomerer, er endvidere nyttig til behandling af sygdomme, som kræver anvendelse af et langtidsvirkende cholinergt middel 20 med mild lokal virkning. Et sådant middel er nødvendigt ved sygdomme såsom glaucom, eftersom forbindelsen ikke nedbrydes af det enzym, som inaktiverer acetylcholin, dvs. acetyl- og butyryl-cholinesterase.

Denne forbindelse kan endvidere anvendes til behandling af perifere cholinerge sygdomme såsom myastenia gravis, urinblære-dysfunktioner, 25 Adies syndrom og Eaton-Lamberts syndrom.

Når Rl og/eller R2 i spiroforbindelserne med den almene formel I er propyl eller højere alkylgrupper, cyclopentyl, cyclohexyl, aryl, di-arylalkyl er beskaffenheden af disse forbindelsers farmakologiske virkning ændret, idet de således stadig har virkning på centralnerve-30 systemet, men virkningen er nu blevet anticholinerg i stedet for cholinerg. Sådanne anticholinerge forbindelser kan anvendes til at behandle sygdomme, som skyldes cholinerg hyperfunktion, hvadenten denne er spontan eller medikament-induceret. Disse forbindelser kan således anvendes til behandling af Parkinsons sygdom, pseudo-Parkin-35 sons sygdom, mental depression og som supplement til kirurgi i stedet for (fx) atropin eller scopolamin. De kan endvidere anvendes i ophthalmology , når forlænget mydriasis kræves til diagnostiske og terapeutiske formål.

Når udtrykket "farmaceutisk præparat" anvendes i beskrivelsen og kra-40 vene, skal det forstås på den måde, at præparatet er egnet til human og/eller veterinær behandling.

DK 173084 B1 11

Ifølge et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse er der således tilvejebragt et farmaceutisk præparat, som omfatter et quinu-clidinderivat med den almene formel I, hvor Z betegner gruppen >CRIR2, eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf sammen med 5 en inert bærer eller fortyndingsmiddel. Udtrykket "farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt", som er anvendt heri, refererer til en kombination af nævnte quinuclidinderivat med relativt ikke-toxiske uorganiske eller organiske syrer. Blot til illustration af passende syrer kan nævnes svovl-, phosphor-, salt-, brombrinte-, jodbrinte-, 10 sulfamid-, methansulfon-, benzensulfon-, p-toluensulfon-, eddike-, mælke-, rav-, malein-, vin-, citron-, glucon-, ascorbin-, benzoe- og kanelsyrer. Egnede farmaceutiske bærere og fortyndingsmidler, som både omfatter faste stoffer og væsker, kan for blot at nævne nogle eksempler vælges blandt majsstivelse, lactose, calciumphosphat, stearin-15 syre, polyethylenglykol, vand, sesamfrø-olie, jordnøddeolie, pro- pylenglycol o.s.v. Dette præparat kan være i en form, som er egnet til oral, rektal eller parenteral indgift eller til indgift ved insufflation, eller det kan især være i en form, som er egnet til transdermal indgift, og i alle tilfælde kan præparatet være i en enhedsdoserings-20 form. Præparateksempler kan være i form af tabletter, pulvere, granuler, kapsler, suspensioner, opløsninger, suppositorier, eliksirer, salver og lignende.

Det farmaceutiske præparat kan som spiroforbindelse med den almene formel I fx indeholde den forbindelse, som er identificeret ovenfor 25 som la,og især den geometriske isomer (AF102B), hvis saltsyresalt har relativt lavere smeltepunkt. Af de ovenfor nævnte grunde kan et sådant præparat som yderligere ingrediens eller ingredienser indeholde én eller flere forbindelser valgt fra gruppen bestående af physostigmin, tetrahydroaminoacridin, cholin, lecithin, piracetam, aniracetam, 30 pramiracetam, oxiracetam, 4-aminopyridin, 3,4-diaminopyridin og somatostatin.

Det farmaceutiske præparat kan alternativt som spiroforbindelse med den almene formel I indeholde en sådan forbindelse, hvor Rl er valgt fra den gruppe, som består af alkyl, cyclopentyl, cyclohexyl, aryl og 35 diarylalkyl, og R2 er som tidligere defineret, og denne forbindelse kan især være én af dem, der er identificeret heri som Ib og Ic.

Når det farmaceutiske præparat skal indgives transdermalt, foretrækkes det at anvende medikamentleveringssystemet ifølge israelsk patentansøgning nr. 72.684, selv om den transdermale indgift ifølge den fore-40 liggende opfindelse naturligvis ikke er begrænset til dette system.

Ifølge den foreliggende opfindelse er der således tilvejebragt et farmaceutisk præparat til transdermal indgift, som omfatter en for- bindelse med den almene formel I, hvor z betegner gruppen >CR*R2, eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf samt en fedtsyre med lav molekylvægt.

DK 173084 B1 12

Opfindelsen angår endvidere forbindelser med den almene formel I eller 5 et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf til behandling af sygdomme i centralnervesystemet hos pattedyr (dvs. hos mennesker eller hos andre pattedyr). Administration af forbindelser med den almene formel I eller farmaceutiske præparater heraf kan ske under anvendelse af medikamentleveringssystemet ifølge den ovenfor beskrevne israelske 10 patentansøgning.

Opfindelsen angår mere specifikt forbindelsen la herunder de geometriske isomerer, enantiomerer, diastereoisomerer, racemater og/eller syreadditionssalte deraf, eventuelt i form af et farmaceutisk præparat til behandling af sygdomme, som skyldes mangelfuldhed i det centrale 15 cholinerge system hos pattedyr.

Endnu et aspekt af den foreliggende opfindelse angår en spiroforbin-delse med den almene formel I, hvor én af R1 og R2 er valgt fra gruppen bestående af alkyl med tre eller flere carbonatomer, cyclopentyl, cyclohexyl, aryl og diarylalkyl, og hvor den anden af R* og R2 er som 20 defineret ovenfor, såsom fx én af forbindelserne Ib og Ic, herunder de geometriske isomerer, enantiomerer, diastereoisomerer, racemater og/eller syreadditionssalte af sådanne spiroforbindelser med den almene formel I; til behandling af sygdomme i centralnervesystemet hos pattedyr, der skyldes en cholinerg hyperfunktion hos pattedyr, ovenfor 25 nævnte forbindelse kan indgives i form af farmaceutiske præparater, som eventuelt til transdermal indgift kan understøttes i form af indretningen ifølge den ovenfor beskrevne israelske patentansøgning nr. 72.684.

Et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse angår den geo-30 metriske isomer af forbindelsen la, hvis saltsyresalt har det relativt lavere smeltepunkt, herunder enantiomerer, diastereoisomerer, racemater og/eller syreadditionssalte af denne geometriske isomer til behandling af senil demens af Alzheimers type hos mennesker. Den geometriske isomer af forbindelsen la kan anvendes i form af farmaceu-35 tiske præparater, som eventuelt til transdermal indgift kan være understøttet i form af indretningen ifølge israelsk patentansøgning nr. 72.684, som allerede er beskrevet ovenfor. Eventuelt kan der samtidig med den tidligere nævnte geometriske isomer af forbindelsen la i almindelighed indgives én eller flere forbindelser valgt fra 40 gruppen, som består af physostigmin, tetrahydroaminoacridin, cholin, lecithin, piracetam, aniracetam, pramiracetam, oxiracetam, 4-amino- DK 173084 B1 13 pyridin, 3,4-diaminopyridin og somatostatin. I tilfælde af transdermal indgift er den yderligere ingrediens imidlertid fortrinsvis én eller flere forbindelser valgt fra gruppen bestående af physostigmin, tetrahydroaminoacridin, 4-aminopyridin og 3,4-diaminopyridin.

5 Forbindelsen med den almene formel I kan desuden anvendes til fore-byggelse af medikamentinducerede sygdomme i centralnervesystemet.

Hvad angår egnede doseringer til indgift af forbindelserne ifølge opfindelsen, er der opnået nogle angivelser fra de biologiske forsøg, hvis resultater og yderligere detaljer er anført nedenfor. Det ser for 10 øjeblikket ud til, at det til indgift p.o. er usandsynligt, at en enkelt dosering på mere end ca. 60 mg/kg eller mindre end ca. 0,1 mg/kg legemsvægt ville være egnet, og at en enkelt dosering i størrelsesordenen fra ca. 0,5 til ca. 10 mg/kg, især i størrelsesordenen fra ca.

1 til ca. 5 mg/kg, foretrækkes. Til parenteral indgift (hvilket 15 omfatter fx intramuskulær, intravenøs (i.v.) og subcutan indgift) ser det for øjeblikket ud til at være usandsynligt, at en enkelt dosering på mere end ca. 40 mg/kg eller mindre end ca. 0,01 mg/kg legemsvægt ville være egnet, og at en enkelt dosering i størrelsesordenen fra ca.

0,05 til ca. 5 mg/kg, især i størrelsesordenen fra ca. 0,1 til ca.

20 2 mg/kg, foretrækkes. Ved ordination af en særlig indgiftsform eller -hastighed vil lægen naturligvis tage de sædvanlige faktorer i betragtning såsom symptomernes sværhedsgrad, patientens fysiske omstændigheder o.s.v.

Under hensyntagen til patienters almindelige vægtintervaller, de fore-25 gående doseringsintervaller og den mulighed, at det snarere end at indgive enkeltdoseringer kan være ønskeligt at indgive flere, kan farmaceutiske præparater ifølge den foreliggende opfindelse, som er tilpasset oral eller parenteral indgift, indeholde den aktive bestanddel (og især den forbindelse, som er identificeret heri ved 30 kodenummeret AF102B) fx i en mængde i størrelsesordenen fra ca. 0,5 til ca. 500 mg, fortrinsvis fra ca. 5 til ca. 100 mg, især i størrelsesordenen fra ca. 10 til ca. 50 mg.

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere belyst under henvisning til tegningen, på hvilken 35 fig. 1 viser NMR(250MHz)-spektret for 3-hydroxy-3-mercaptomethyl-quinuclidin, fig. 2 viser NMR(250MHz)-spektret for cis:trans Ia-HCl-saltet [AF102] , fig. 3 viser NMR(250MHz)-spektret for den geometriske isomer af Ia-HCl-saltet identificeret som AF102A, DK 173084 B1 14 fig. 4 viser NMR(250MHz)-spektret for den geometriske isomer af Ia-HCl-saltet identificeret som AF102B, fig. 5 viser strukturen af AF102B bestemt ved røntgenkrystallografi af dets HCl-salt, hvilket viser, at AF102B er cis-isomeren.

5 fig. 6 viser IR-spektret (på Nicolet 20XB FTIR) for den geometriske isomer af Ia-HCl-saltet identificeret som AF102A, fig. 7 viser IR-spektret for den geometriske isomer af Ia-HCl-saltet identificeret som AF102B, fig. 8 viser initiale og retentionstest-latensmålinger på AF64A- og 10 cerebrospinalvæske-injicerede grupper, før og efter physostigmin eller saltvand, fig. 9 viser initiale og retentionstest-latensmålinger på AF64A- og cerebrospinalvæske-injicerede grupper, før og efter AF102B eller saltvand, 15 fig. 10 viser retentionstest-latensmålinger for (bl.a.) AF102B i extinctionsforsøg, fig. 11 viser retentionstest-latensmålinger for (bl.a.) AF102B i "extinctions + latent extinctions"-forsøg, fig. 12 viser retentionstest-latensmålinger for AF64A- og cerebrospi-20 naivæske-injicerede grupper, efter anden indgift af AF102B eller saltvand, fig. 13 viser retentionstest-latensmålinger for AF64A- og cerebrospinalvæske-inj icerede grupper, efter indgift af AF102B (0,1 mg/kg i.p.) eller saltvand, 25 fig. 14 viser latensmålinger (sekunder) for AF64A- og cerebrospinalvæske-inj icerede grupper, før og efter indgift af AF102B (1 mg/kg, p.o.) eller saltvand, fig. 15 viser retentionstest-latensmålinger (sekunder) for AF64A- og cerebrospinalvæske-injicerede grupper, før og efter indgift af AF102B 30 (1 mg/kg, p.o.) eller saltvand, fig. 16 viser undslippelses-latensmålinger i blokke på 2 forsøg for AF64A- og cerebrospinalvæske-injicerede grupper, efter indgift af physostigmin, fig. 17 viser undslippelses-latensmålinger i blokke på 2 forsøg for 35 AF64A- og cerebrospinalvæske-injicerede grupper, efter indgift af AF102B (1 mg/kg, i.p.), fig. 18 viser gennemsnitsfejl i den 8-armede strålelabyrint (RAM) hos AF64A- og cerebrospinalvæske-injicerede rotter, efter indgift af AF102B (5 mg/kg, i.p.), og 40 fig. 19 viser gennemsnitsfejl i RAM hos AF64A- og cerebrospinalvæske-injicerede rotter, efter indgift af saltvand og physostigmin.

Den foreliggende opfindelse belyses nærmere i de følgende eksempler på fremstillingen af forbindelserne ifølge opfindelsen og biologisk undersøgelse af spiro-forbindelserne ifølge opfindelsen.

DK 173084 B1 15 EKSEMPEL 1

Fremstilling af 2-methylspd.ro (1,3-oxathiolan-5', 3) quinuclidin [AF102 (cis:trans); AF102A og AF102B] a) Epoxidet af 3-methylenquinuclidin 5 (i) I en treliters trehalset kolbe forsynet med en mekanisk omrører og et termometer blev der anbragt natriumhydrid (42 g, 0,88 mol, som en 50%'s dispersion i olie) og 300 ml petroleumsether (30-60°C). Suspensionen blev omrørt, hydridet lodes bundfælde, petroleumsetheren blev dekanteret, og 1200 ml tørt DMSO blev tilsat under omrøring efterfulgt 10 af trimethyloxosulfoniumiodid (214 g, 0,97 mol), som blev tilsat portionsvis over en periode på 15 minutter, og omrøringen blev derpå fortsat i yderligere 30 minutter. Reaktionskolben blev udstyret med en forseglet trykkompenserende tildrypningstragt, som indeholdt quinucli-din-3-on (100 g, 0,8 mol) opløst i 300 ml tørt DMSO. Denne opløsning 15 blev derpå sat til reaktionsblandingen i løbet af en periode på 15 minutter. Efter omrøring i 15 minutter blev reaktionsblandingen opvarmet til 50°C i 2 timer og hældt ned i 1 liter koldt vand, og blandingen blev ekstraheret med 3 x 500 ml benzenportioner. De forenede ekstrakter blev vasket med 100 ml mættet vandig saltopløsning, 20 tørret over vandfrit natriumsulfat, og opløsningsmidlet afdampet. Den olieagtige remanens blev opløst i ether og præcipiteret som saltet med saltsyre ved tilsætning af ether mættet med gasformigt HC1. Epoxidproduktet blev fraskilt ved filtrering, vasket med ether og tørret, hvilket gav 100 g af et produkt, som var tilstrækkeligt rent til 25 anvendelse i det næste trin. Rf * 0,3 på neutralt aluminiumoxid (ethyl-acetat) ,· M+ 139 (massespektrum-bestemmelser på et VG 7035-instrument) ; HCl-saltet har smeltepunkt 200,7-202°C.

(ii) I en anden syntese, som yderligere kan optrappes, blev 2,2 kg quinuclidin-3-on (HCl-salt) sat til en femliters kolbe, og 2 liter 30 ledningsvand blev derpå tilsat efterfulgt af 1 kg NaOH. Blandingen blev mekanisk omrørt ved 50°C, indtil de faste stoffer var opløst.

Under disse betingelser opnås 3 faser, 2 øvre faser (væsker) og en nedre fase (fast stof).

Blandingen holdes ved 60eC. Den øvre fase sættes til 1 liter toluen.

35 De to nedre faser, herunder den faste fase, blev filtreret. Det faste stof blev knust i 1 liter toluen, som endvidere blev anvendt til at vaske vandfasen. Toluenfaserne blev forenede, behandlet med pulveriseret trækul til fjernelse af farve (og urenheder), tørret over magnesiumsulfat og filtreret til udvinding af 3,3 kg produkt inklusive DK 173084 B1 16 toluen; en prøve på 215 g opløsning blev inddampet til udvinding af 106 g quinuclidin-3-on (fri base) som et hvidt fast stof, som var tilstrækkeligt rent til praktiske formål. (Under disse betingelser kan der således opnås et ekstraktionsudbytte på mindst 88-90%). Toluenop-5 løsningen tørres ved azeotrop destillation; den tørrede opløsning kan anvendes til det næste trin.

I en treliters trehalset kolbe blev der indført quinuclidin-3-on (193 g, 1,54 mol) i azeotrop-tørret toluenopløsning (opløsningens vægt 563 g), trimethyloxosulfoxoniumiodid (380 g, 1,72 mol) og NaH 55-60%'s 10 dispersion i paraffinolie (70 g, 1,68 mol), og blandingen blev derpå mekanisk omrørt. En svag udvikling af H2, som fulgte efter, ophørte efter 2-3 minutter.

Reaktionskolben blev afkølet i koldt vand, og DMSO (0,5 liter, tørret 1 måned på molekylsier) blev tilsat dråbevis; 100 ml blev tilsat i ét 15 trin, og den resterende mængde blev tilsat dråbevis i løbet af 1,5 time under omrøring og afkøling af reaktionsblandingen ved 10~30°C. Reaktionsblandingen blev derefter opvarmet til 50-55°C i 1 time, indtil reaktionen var fuldført, hvilket blev bestemt ved TLC på neutralt aluminiumoxid (methanol:dichlormethan, 5:95). Reaktionsblandingen blev 20 hældt ned i l liter koldt vand, og blandingen blev ekstraheret med 0,5 liters portioner af chloroform. I hver ekstraktion blev grænsefladen fjernet ved filtrering; 2,4 liter organisk fase blev opsamlet og tørret over 160 g MgS04. NMR-spektret (250 MHz) viser ca. 120 ml DMSO (beregningen baseret på forholdet DMSO/toluen). 80% af DMSO blev såle-25 des fjernet ved denne behandling. TLC viser, at produktet er lidt urent på grund af DMSO og en anden/andre forbindelse(r). Denne opløsning blev delvis inddampet til 1900 ml og opbevaret ved 0-4°C i 5 dage uden ændring. Denne opløsning er tilstrækkelig ren til anvendelse i det næste trin.

30 b) 3-Hydroxy-3-mercaptomethylquinuclidin (i) I en enliters trehalset kolbe udstyret med en magnetisk omrører, en indgang og en udgang til hydrogensulfid og et termometer blev der anbragt 80 g NaOH og 390 ml vand. Opløsningen blev afkølet på et isbad, og gasformigt hydrogensulfid blev ledt gennem den omrørte opløs-35 ning, indtil den begyndte at boble ud. Produktet ifølge trin a) (80 g, 0,46 mol) blev derpå tilsat, og omrøringen blev fortsat i 15 minutter. Reaktionsblandingen blev opvarmet til 45°C i 2,5 timer under en langsom strøm af hydrogensulfid. Opløsningen blev afkølet til 0°C, og 10N HC1 blev omhyggeligt tilsat for at bringe pH til 8; den vandige opløs-40 ning blev derpå ekstraheret med chloroform (6 x 300 ml). De forenede ekstrakter blev tørret over vandfrit natriumsulfat og inddampet til DK 173084 B1 17 tørhed. Det dannede faste stof blev tørret over phosphorpentoxid i en exsicator, hvilket gav 32,9 g råt produkt. Efter oprensning (TLC, neutralt aluminiumoxid, 10:1 dichlormethan + methanol) Rf 0,5; M+ (se fig. 5) = 173; basetop - 140; NMR (se fig. l) top ved 250 MHz(CDCl3) δ 5 2,8 -> dobbelt dublet, -CH2-SH, AB-type spektrum; iR-spektrum v,,^ 2900-3300 cm'1 (bred). Forbindelsen blev anvendt til det næste trin uden yderligere oprensning.

(ii) I en alternativ fremgangsmåde blev chloroformopløsningen ifølge trin a)(ii) ovenfor (1520 g) indført i en treliters trehalset kolbe 10 udstyret med en mekanisk omrører, en h2s -indgang og to fælder med koncentreret NaOH-opløsning til opsamling af overskud af H2S. Reaktionsblandingen blev opbevaret ved 25 ± 5°C, og H2S blev boblet ind i 8,5 timer, hvorefter blandingen henstod natten over. Næste dag blev H2S igen boblet ind i yderligere 5 timer, hvorefter reaktionen var fuld-15 ført (TLC), og produktet kunne uden yderligere oprensning anvendes i det næste trin.

c) 2-Methylspiro(l,3-oxathiolan-5,3‘)quinuclidin [AF102 cis:transi (i) I en 0,5 liters trehalset kolbe, som var udstyret med en magnetisk omrører, en indgang og en udgang til nitrogengas og et termometer, 20 anbragtes produktet ifølge trin b)(i) (32 g, 0,18 mol), 200 ml di chlormethan (tørret over molekylsier) og nyligt destilleret acetalde-hyd (110 ml, 1,97 mol). Opløsningen blev afkølet på isbad under nitrogengas, og bortrifluoridetherat (60 ml, 0,40 mol) blev tilsat over en periode på 30 minutter. Blandingen blev omrørt i 3 timer ved 25 25°C, afkølet til 0°C og derpå behandlet med 10%'s vandig NaOH-opløs ning, indtil den var basisk med lakmus. Den basiske opløsning blev ekstraheret med chloroform (4 x 400 ml), og de forenede ekstrakter blev tørret over vandfrit natriumsulfat og inddampet. Den olieagtige remanens blev opløst i ether og præcipiteret ved tilsætning af gasfor-30 migt HCl. Hydrochloridproduktet blev fraskilt ved filtrering, vasket med ether og tørret, hvilket gav 26,5 g (udbytte: 62%) som en blanding af to geometriske isomerer i et forhold på 0,8-1,2:1. Rf (TLC, neutralt aluminiumoxid, chloroform) 0,7; IR-spektrum v,,,,, (under anvendelse af et Perkin-Elmer 457 infrarødt gitterspektrofotometer) C-0 1200-1250, 35 1150 cm'1; M+ = 199; molekylvægtsbestemmelse med høj opløsningsevne: beregnet for C]oH]7NOS: 199,1020, fundet: 199,1017.

NMR for HCl-saltet er vist i fig. 2. Opspaltning af spektret muliggør, at forekomsten af begge isomerer kan ses. Beliggenheden af -S- i oxothiolanringen ses tydeligt ud fra de kemiske skift i henholdsvis 40 Ha- og Hb-protoneme. Disse protoner i den isomere blanding og også i DK 173084 B1 18 hver af isomereme fremkommer ved højere felt end deres eventuelle kemiske skift, hvis de havde været bundet til -O- som i den analoge 1,3-dioxolanstruktur. Produktet kan omkrystalliseres af ethylacetat (600 ml pr. gram) eller af acetone (220 ml pr. gram).

5 Den isomere blanding af hydrochlorider kan adskilles i sine komponenter ved fraktioneret omkrystallisation i redestilleret tørt acetone. Smeltepunkter såvel som NMR-sprektre ved 250 MHz kan anvendes som tegn på renhed for hver isomer. En sådan adskillelse beskrives i trin d).

(ii) I en alternativ fremgangsmåde fremstilles AF102 i fri baseform 10 direkte fra opløsningen af rå thioalkohol. En sådan opløsning fra trin c) (ii), som indeholdt 240 g thioalkohol (1,38 mol), blev således sat til en femliters trehalset kolbe og afkølet i koldt vand til 10°C, og acetaldehyd (680 ml; nyligt destilleret på p-toluensulfonsyre) blev derpå tilsat i løbet af 30 minutter, og temperaturen blev holdt ved 20 15 i 5°C i løbet af denne periode. Opløsningen blev derpå afkølet til 15°C og omrørt i yderligere 30 minutter. 450 ml BF3-etherat blev tilsat dråbevis i løbet af 30 minutter, og opløsningen blev holdt ved 20 ± 5“C og omrørt i yderligere 30 minutter. En opløsning af 20%'s NaOH (1 liter) blev tilsat dråbevis, og reaktionstemperaturen blev holdt på 20 20 ± 5°C i løbet af denne tilsætning.

Blandingen blev filtreret, og vandopløsningen blev ekstraheret med 1 liter chloroform. Chloroformekstrakterne blev forenet, tørret over MgS04 og inddampet. Den vundne olie kunne destilleres ved ca. 90°C/1 mm Hg, hvilket gav AF102 (cis:trans). eller alternativt fortyndes med 2,5 25 liter toluen. I sidstnævnte tilfælde blev 5-10 g fast stof, som var aflej ret på kolbens vægge, fjernet, og HC1 (gasformigt) blev boblet ind i toluenopløsningen, indtil den organiske opløsning reagerede surt med pH-papir; den faste kage blev frafiltreret, vasket med toluen, opløst i 3/4 liter isopropanol ved 50-60°C og filtreret, hvilket 30 fjernede uopløselige urenheder. Filtratet blev inddampet med tilsætning af 1 liter toluen, hvilket gav 168 g råt AF102-produkt (cis:trans) (HCl) med let urenhed som vist ved TLC. Dette produkt (råt udbytte 51%) kan yderligere oprenses som beskrevet nedenfor i trin d).

d) Adskillelse af AF102 i dets komponenter AF102A og AF102B

35 En 1:1 isomerblanding af hydrochlorider blev krystalliseret af 4,7 liter redestilleret tørt acetone. Produktet, som præcipiterede, blev atter krystalliseret (se tabel), hvilket efter flere krystallisationer gav 1,9 g rent AF102A, smeltepunkt 240-242°C. Koncentrering af moderluden (se tabel) resulterede i et olieagtigt produkt, som blev op-40 renset på en aluminiumoxidsøjle (som en fri base, 1% methanol i di- DK 173084 B1 19 chlormethan), hvilket hovedsageligt gav (10:1) af isomeren AF102B, smeltepunkt 176-179°C, som HCl-saltet.

TABEL: Adskillelse af AF102A og AF102B som HCl-salte 23 g 1:1 blanding (smp. 190-192°C) 4,7 1 acetone I(5°C, 4 dage) _i_

i I

M/ \{/

Koncentrering til 2 1 13,3 g smp. 201-205 C

i I

i I 3 1 acetone : ------------- moder- <----—------- \: / \S / lud A V,/

Koncentrering til 2',7 g, 7,5 g, smp. 205-210°C

1 1 smp. 195-198°C I

I 1 (1,9 1 5 i acetone) ---------------— moder- <-------———- M/ \l/ lud B \l/

Koncentrering til 1,8 g, 4,5 g, smp. 215°c

0,65 1 smp. 190-194°C I

I I

-------- ------—---- moder- <—— ------------ M/ M/ lud c M/

Inddampning af 1,5 g, · 2,8 q, smp. 220°c«

moderlud smp. 190°C I

j j (0,7 l ) \{/ moder- ------------

Søjleoprensning lud D

af fri base 1,9 g, smp. 240-242°C

på aj.uminiumnxjd AF102A**(HC1)

1,0 g, smp. 176-179°C

AF102B**«. (præcipiteret som HCl-salt) * isomerratio 10:1 ** ren isomer (NMR) 5 *** isomerratio ca. 1:10 (NMR) AF102A(HCl): NMR-spektrum (se fig. 3), 250 MHz (CDC13) δ 5,24 (kvartet, top for r‘=H, som er en kvartet, eftersom den er koblet til R2=CH3) .

DK 173084 B1 20 AF102B(HCl): NMR-spektrum (se fig. 4), 250 MHz (CDC13) δ 5,17 (kvartet, top af R2=H, som er en kvartet, eftersom den er koblet til Rl=CH3) .

EKSEMPEL 2

Fremstilling af 2-diphenylmethylspiro(1,3-oxathiolan-5,3')quinuclidin 5 Til en 100 ml*s trehalset kolbe, som var udstyret med en magnetisk omrører, en indgang og en udgang til nitrogen og et termometer, blev der anbragt 3-hydroxy-3-mercaptomethylquinuclidin (8 g, 0,045 mol), 40 ml dichlormethan (tørret over molekylsier) og diphenylacetaldehyd (15 ml, 0,085 mol). Opløsningen blev afkølet på isbad og holdt under 10 nitrogen, medens destilleret bortrifluoridetherat (20 ml, 0,13 mol) blev tilsat over en periode på 30 minutter. Blandingen blev omrørt i 2 timer ved 25°C, afkølet til 0°C og derpå behandlet med 10%'s vandigt natriumhydroxid, indtil opløsningen var basisk med lakmus. Den basiske opløsning blev ekstraheret med benzen 4 x 400 ml), og de forenede 15 ekstrakter blev tørret over vandfrit natriumsulfat og inddampet. Den olieagtige remanens blev opløst i ether og præcipiteret som saltsyresaltet ved tilsætning af gasformigt HCl. Produktet blev yderligere oprenset på en neutral aluminiumoxidsøjle som fri base under anvendelse af 1:10 petroleumsether (40-60°C)/ethylacetat som elueringsmiddel.

20 Under disse betingelser blev 2 g af titelforbindelsen isoleret. M+ = 351.

EKSEMPEL 3 2-Methyl-2-phenylspiro(1,3-oxathiolan-5,3')quinuclidin

Denne forbindelse blev fremstillet ved en fremgangsmåde svarende til 25 eksempel 1 og 2 ved omsætning af acetophenon med 3-hydroxy-3-mercapto-methylquinuclidin. Udbyttet var relativt lavt (10-20%). M+= 275.

Forskellige andre forbindelser inden for den almene formel I kan fremstilles ved den eksemplificerede fremgangsmåde under anvendelse af det relevante aldehyd R2-CH0 eller keton r'-CO-R2, hvor R* og R2 er som 30 defineret med hensyn til den almene formel I.

Som det allerede er nævnt, kan spiroforbindelserne med den almene formel I, herunder deres farmaceutisk acceptable syreadditionssalte, formuleres sammen med konventionelle farmaceutiske inerte bærere, diluenter, adjuvanser o.s.v. til farmaceutiske præparater, som kan 35 være i en form, som er egnet til oral, rektal eller parenteral indgift DK 173084 B1 21 eller til indgift ved insufflation, eller de kan være i en form, som er egnet til transdermal indgift, og i alle tilfælde kan præparatet være i enhedsdoseringsform.

Spiroforbindelseroe med den almene formel I eller farmaceutiske præ-5 parater, som indeholder dem, kan indgives til mennesker såvel som til laboratoriedyr såsom gnavere, katte, hunde og aber, fx ved perifere eller intracerebrale eller intracerebroventrikulære injektioner (til dyr) , ved infusion, gennem huden eller p.o. Det er klart, at doseringen og indgiftsvejen må justeres i overensstemmelse med den specifikke 10 biologiske anvendelse og særlig i overensstemmelse med beskaffenheden og sværhedsgraden af den sygdom eller forstyrrelse, som skal behandles .

Af grunde, som allerede er anført ovenfor, kan sådanne farmaceutiske præparater i tilfælde af forbindelse la som yderligere ingrediens 15 indeholde én eller flere forbindelser valgt fra gruppen, som består af physostigmin, tetrahydroaminoacridin, cholin, lecithin, piracetam, aniracetam, pramiracetam, oxiracetam, 4-aminopyridin, 3,4-diaminopyri-din og somatostatin.

Som det allerede tidligere detaljeret er nævnt ovenfor, foretrækkes 20 det, når de farmaceutiske præparater skal indgives transdermalt, at anvende medikamentindgiftsystemet ifølge israelsk patentansøgning nr.

72.684.

Biologisk test af spiroforbindelseme ifølge opfindelsen

Den generelle toxicitetsprofil blev først fastlagt for AF102A og 25 AF102B. Denne undersøgelsesfase blev rutinemæssigt opdelt i 2 dele, dvs. "doseringsinterval-bestemmelse" og LD^-bestemmelse. I førstnævnte tilfælde blev sædvanligvis par bestående af mus indgivet doseringer med bred afstand, og dyrene blev herefter observeret. Arten, starttidspunktet og varigheden af reaktionerne på behandlingen blev regi-30 streret. LD^-bestemmelser blev baseret på de præliminære fund i forbindelse med intervalbestemmelses-undersøgelserne. Under disse undersøgelsesbetingelser blev testmaterialeopløsningeme indgivet til mindst 5 dosisniveau-grupper pi mindst 5 dyr af samme køn pr. gruppe og med doseringer med geometriske intervaller. På basis af mortalite-35 ten blev LD^-værdien og 95% ©onfidence-intervallet (C. I.) beregnet ifølge Weils metode tw»ll. Blom^t-rics 8. 1952, s. 249-283).

DK 173084 B1 22

AF102A

(a) LDjQ-mus; peroral indgift

Forsøgsbetingelser - hanmus, 20-24 g - N = 5/gruppe 5 - konstant volumen-dosering på 20 ml/kg

Dosis Mortalitet (mg/kg p.o.) antal døde/antal i gruppen 160 5/5 10 139 5/5 120 4/5 104 2/5 90 2/5 78 0/5 15 LDso (95% C.I.) = 102 (89-117) mg/kg (b) LDjø-mus; intravenøs indgift

Forsøgsbetingelser - hanmus, 20-24 g - N - 6/gruppe 20 - variabel volumen-dosering på 9,0-11,5 ml/kg

Dosis Mortalitet (mg/kg i.v.) (antal døde/antal i gruppen) 45.0 6/6 25 42,5 4/6 40.0 2/6 37,9 3/6 36.0 2/6 30 LDjo (95% C. I.) = 40,4 (35,5 - 45,9) mg/kg.

Det relativt snævre ratio på ca. 1:2,5 mellem LDjø-værdieme for den intravenøse og perorale indgiftsvej antyder en effektiv, hurtig og tilsyneladende uændret absorption af testmaterialet via tarmkanalen.

DK 173084 B1 23 (c) Observerede symptomer

Symptomer som reaktion på behandling af mus (anført nedenfor) var oftest begrænset til de mus, der døde, eftersom overlevende i behand-lingsgruppeme, som havde fået indgivet doser, som kun forårsagede 5 delvis letalitet, sjældent viste nogle af de virkninger, som blev registreret hos dem, som døde. Dette fund peger utvivlsomt på en temmelig stejl toxisk-letal hældning for testmaterialet.

Endvidere var der stort set ingen tydelig forskel med hensyn til de virkninger, der blev observeret mellem peroralt og intravenøst be-10 handlede dyr, med undtagelse af starttidspunkt, varighed og dødstidspunkt. Undersøgelse med henblik på at bedømme pupilforandringer blev kun udført på de overlevende dyr.

Symptomer er anført i den rækkefølge, hvori de optrådte: let forbigående formindskelse af spontan motorisk aktivitet (kun 15 hos peroralt behandlede dyr) alvorlig tremor, især i hovedregionen (inden for 2-3 minutter eller 10 sekunder efter henholdsvis peroral og intravenøs indgift) dyspnoea kloniske krampeanfald 20 - gispen, cyanose enkelte kloniske-toniske krampeanfald efterfulgt af død.

Dødsfald hos mus, som var blevet indgivet omtrentlige LDjQ-doser, indtrådte henholdsvis ca. 10-15 minutter efter peroral indgift og efter ca. 30 sekunder efter intravenøs injektion. Hos de overlevende dyr 25 kunne der registreres en forbigående delvis analgetisk virkning ved respons på hale-prikning. Fuldstændig restitution skete, selv blandt overlevende hos hvem ét af de ovenfor beskrevne symptomer blev set, ligeledes ekstremt hurtigt. Et yderligere nævneværdigt aspekt er fundet af let til moderat mydriasis ved pupilundersøgelse hos de 30 overlevende dyr i den intravenøst behandlede gruppe.

Det bør understreges, at ingen af testdyrene udviste virkninger, som anses for karakteristiske for parasympatho-virkning eller cholinomime-tisk virkning, dvs. vedvarende generaliseret tremor, spytflåd, tåreflåd eller diarré eller miosis.

35 Rotter, som fik indgivet en oral dosis på 100 mg/kg, viste følgende: 10 minutter efter indgift (e.i.) var den spontane motoriske aktivitet let reduceret DK 173084 B1 24 15 minutter e.i. mydriasis med pupilstørrelse ca. 3 gange større end hos kontrollerne 20 minutter e.i. pludselig start af korte kloniske krampeanfald, som 5 minutter senere overgik i periodisk hovedrykning og tremor 5 30 minutter e.i. forekom dyrene somnolente, ledsaget af delvis tab af udrettelsesrefleks, dyspnoeiske og cyanotiske med ganske let spytflåd og tåreflåd.

Alle de ovennævnte symptomer angår for størstedelen det dyr ud af gruppen på tre, som blev fundet død 40 minutter efter indgift. Hos de 10 resterende to rotter var alle de ovenfor anførte virkninger meget mindre i deres relative intensitet, og fuld restitution optrådte efter adskillige timer.

AF102B

(a) LDjQ-mus; peroral indgift 15 Forsøgsbetingelser - hanmus, 20-24 g - N = 5/gruppe - konstant volumen-dosering på 20 ml/kg

Dosis Mortalitet (mg/kg p.o.) (antal døde/antal i gruppen) 20 _ 113 4/5 101 3/5 90 2/5 80 2/5 25 71 0/5 64 0/5 LDjo (95% C.I.) = 92 (74-116) mg/kg DK 173084 B1 25 b) LD5Q-1TIUS; intravenøs indgift

Forsøgsbetingelser - hanmus, 20-24 g - N - 6/gruppe - variabel volumen-dosering på 9,0-11,5 ml/kg 5 Dosis Mortalitet (mg/kg i.v.) (antal døde/antal i gruppen) 39 5/6 37 6/6 10 35 5/6 33 1/6 31 3/6 LDjq (95% C.I.) = 33 (31-35) mg/kg 15 Det relativt snævre forhold på ca. 1:2,5 mellem LD^-værdierne for den intravenøse og perorale indgiftsvej antyder en effektiv, hurtig og tilsyneladende uændret absorption af testmaterialet via tarmkanalen.

c) Observerede symptomer

Eftersom både LDjq-værdierne for AF102B efter intravenøs og peroral 20 indgift af AF102B var en anelse lavere end dem, der blev opnået med AF102A, var de generelle reaktionssymptomer på behandling med førstnævnte i det store hele af lignende art som dem, der blev registreret for sidstnævnte, blot med den forskel, at der var en let forøget intensitet i forbindelse med AF102B.

2 5 Det skal bemærkes, at som med AF102A udviste ingen af forsøgsdyrene virkninger, der blev anset for karakteristiske for parasympathomime-tisk eller cholinomimetisk virkning, dvs. kontinuerlig generaliseret tremor, spytflåd, tåreflåd eller diarré og myosis. Denne egenskab står i modsætning til den cholinergt aktive forbindelse ifølge US 4.104.39-30 7, nemlig cis-2-methvlsPiro(1.3-dioxolan-4.3)cruinuclidin. som i det følgende betegnes med kodenummeret AF30, og som udviste sådanne bivirkninger.

DK 173084 B1 26 AF102B's intraperitonale toxicitet hos rotter

Den akutte intraperitoneale toxicitet ved AF102B (HCl) blev undersøgt i fem grupper med fem hanrotter og fem hunrotter af Charles Riverstammen ved doseringer i intervallet 20,0-197,0 mg/kg. Testmaterialet 5 blev fremstillet i forskellige koncentrationer i saltvand og blev indgivet med en konstant volumen-dosering på 10 ml/kg. Mortalitet og reaktionssymptomer på behandlingen blev registreret under en 14 dages observationsperiode. Tidligt afdøde dyr og dyr, som blev aflivet på dag 15, blev underkastet obduktion. Det viste sig, at dødsfald forekom 10 ved de tre højeste dosisniveauer (61, 107, 187 mg/kg), inden for 20 minutter efter dosering.

De væsentligste reaktionssymptomer på behandling, hvilke symptomer blev observeret både hos de dyr, som døde, og de dyr, som overlevede, var spastiske og toniske kramper, tremor, tachypnoea og dyspnoea, 15 nedsat motorisk aktivitet, let til udtalt spytflåd og vandladning. Hos de overlevende dyr forsvandt alle reaktionssymptomer på behandling inden for 2 timer efter dosering. De overlevende dyr opnåede i almindelighed den forventede vægtforøgelse i løbet af undersøgelsesperioden. Ved obduktion sås de grove observationer, som relaterede til 20 behandlingen, kun hos de dyr, som døde. Overfyldte blodkar sås i hjernen hos højdoseringsgruppen. Ingen abnormaliteter blev registreret ved obduktion af de dyr, som overlevede. LD50 (95% C.I.) = 77,6 (60,1-100,2); hældning = 83°.

Akut peroral toxicitet af AF102B hos rotter 25 Den akutte perorale toxicitet af AF102B (HCl) blev undersøgt i fire grupper med fem hanrotter og fire hunrotter (Charles River CD-stamme). Testmaterialet blev fremstillet i forskellige koncentrationer i saltvand og blev indgivet ved en konstant volumendosering på 5 ml/kg. Doseringerne blev valgt i overensstemmelse med tilgængeligheden af 30 testmaterialet. Mortalitet og reaktionssymptoner på behandlingen blev registreret i løbet af en 14-dages periode. De tidligt afdøde dyr og de overlevende dyr blev underkastet obduktion på dag 15. Det viste sig, at dødstilfælde forekom ved alle de fire undersøgte dosisniveauer indenfor 3,5 time efter doseringen.

35 De væsentligste reaktionssymptomer på behandling, hvilke symptomer blev observeret hos både de døde dyr og de overlevende dyr, var kloniske kramper, tremor, spytflåd, urogenital farvning, diarré og pigmenteret orbital sekretion. Hos de overlevende dyr forsvandt alle tegn på behandlingsreaktion i løbet af 24 timer efter dosering. Det DK 173084 B1 27 væsentligste behandlingsrelaterede fund hos de afdøde dyr ved obduktion var spytflåd. Indvendigt blev der fundet et enkelt tilfælde af haemorrhagisk indhold og lejlighedsvis congestioneret gastrisk mucosa. Obduktion af de dyr, som overlevede, viste ingen abnormaliteter. De 5 overlevende dyr opnåede i almindelighed den forventede vægtforøgelse i løbet af undersøgelsesperioden. Den perorale LDjq for AF102B skønnes at være større end 156 mg/kg.

ΆΒ102Β: Resumé af undersøgelserne af akut toxicitet hos mus og rotter (mg/kg) (LD50 + 95% konfidens-grænser) 10 ________

Dyreart Intravenøst Intraperitonealt Peroralt

Mus 33(31-35) * 92(74-116)

Rotter - 77,6(60,1-100,2) >156 15 _ *Alle mus døde ved 80 mg/kg, intraperitonealt.

AF102B's analgetiske virkning på mus (antinociception) AF102B-testmaterialets potentielle analgetiske virkning blev bestemt i grupper (n=5) med han- og hunmus ved anvendelse af 2 primære analge-20 tiske tests: Hale-klip og phenylquinon-vridning. Testmaterialet blev indgivet enten ad peroral eller ad intraperitoneal vej ved 3 forskellige dosisniveauer, og den analgetiske virkning blev sammenlignet med virkningen af 2 referenceforbindelser. Ved foreløbige undersøgelser blev codeinphosphat (50 mg/kg indgivet subcutant 1 time inden test-25 ning) og oxotremorin (enten 0,1 mg/kg indgivet peroralt l time inden testning eller 0,05 mg/kg indgivet intraperitonealt 30 minutter inden testning) udvalgt som henholdsvis analgetiske og cholinomimetiske referenceforbindelser. Dnder forsøgsbetingelserne havde AF102B kun antinociceptiv virkning ved dosisniveauer større end 20 mg/kg peroralt 30 og 10 mg/kg intraperitonealt. Denne dosisafhængige antinociceptive virkning var ikke fuldt udviklet ved 60 mg/kg peroralt og 40 mg/kg intraperitonealt, hvilket var de højeste ikke-letale dosisniveauer, som blev undersøgt, og virkningen forblev åbenbart svagere end co-deinphosphats og oxotremorins virkning.

DK 173084 B1 28 AF102B-testmaterialets potentielle hypotermi-inducerende virkning AF102B-testmaterialets potentielle hypotermi-inducerende virkning blev bestemt i grupper med 8 hanrotter i sammenligning med 2 referencematerialer. Rektaltemperaturen blev registreret før og på forskellige 5 tidspunkter efter indgift af testmaterialet enten ad oral eller intraperitoneal vej i 3 forskellige dosisniveauer. Ved foreløbige undersøgelser blev chlorpromazin (10 mg/kg indgivet intraperitonealt) og oxotremorin (enten 3,2 mg/kg indgivet peroralt eller 1,2 mg/kg indgivet intraperitonealt) valgt som henholdsvis neuroleptisk og choli-10 nomimetisk referencemateriale. Under disse undersøgelsesbetingelser udviste AF102B kun hypotermi-inducerende virkning i dosisniveauer større end 40 mg/kg (peroralt) og 15 mg/kg (intraperitonealt). Ved de maksimale dosisniveauer på 80 mg/kg peroralt og 60 mg/kg intraperitonealt (de højeste undersøgte dosisniveauer, som ikke inducerede 15 kramper) inducerede AF102B en nedsættelse af rektaltemperaturen, som svarede til omfanget af dem, som blev induceret af chlorpromazin og oxotremorin. Let diarré var den eneste cholinomimetiske manifestation, som blev induceret af AF102B ved disse maksimale dosisniveauer, medens oxotremorin inducerede et fuldstændigt cholinomimetisk syndrom asso-20 cieret med toniske-kloniske kramper, når dette referencemateriale blev indgivet intraperitonealt.

AF102B's mutagene virkning AF102B blev undersøgt med henblik på mutagen virkning hos 5 histidin-afhængige auxotrofer af Salmonella tvphimurium. stamme TA-1535, 25 TA-100, TA-1538, TA-98 og TA-1537, under anvendelse af hældeplade-as-says ("pour-plate"). De anvendte procedurer fulgte OECD-retnings-linierne 471, tiltrådt maj 1983. Undersøgelserne, som blev udført under fraværelse og nærværelse af et aktiverende system, som var deriveret fra rottelever (S-9-blanding), anvendte en række niveauer, 30 som var udvalgt efter en foreløbig toxicitetstest hos stamme TA-98.

Hver test blev udført som dobbeltbestemmelse og udført ved to adskilte lejligheder. Positive kontroller såsom de kendte mutagene stoffer, na-triumazid, 4-nitro-o-phenylendiamin (NPD), ICR-191 og 2-aminoanth-racen, blev anvendt under de samme forsøgsbetingelser. Ingen forøgede 35 forekomster af reversering til prototrofi blev opnået med nogen af de fem bakteriestammer ved de undersøgte niveauer for forbindelsen, enten i nærværelse eller fraværelse af S-9-blanding. Ingen vækstinhibition observeret som udtynding eller fravær af baggrundsplænen af ikke-reverterende celler blev iagttaget hos nogen af stammerne efter 40 udsættelse for testmaterialet i form af 1000 /ig pr. plade. Det blev DK 173084 B1 29 konkluderet, at AF102B ikke besidder mutagen virkning under disse forsøgsbetingelser.

De formodede cholinerge agonisters bindingsaffiniteter til muscarine receptorer 5 A) Scatchard-plot: PNZ anses for at være en specifik Mj-antagonist (jfr. det bind, der omhandler dette emne, i Trends Pharmacol. Sci. (SupdI.). januar 1984). Dens affinitet for receptoren er ikke så høj som QNB's affinitet, hvorfor den tilsyneladende Kd bør være højere end for QNB. I 10 realiteten viste det sig, at Kd for PNZ ifølge de i denne beskrivelse omtalte undersøgelser var 13,0 nM sammenlignet med 0,048 nM, som blev fundet for QNB. Den Kd-værdi for PNZ, som blev fundet i de her beskrevne eksperimenter, er i overensstemmelse med de publicerede data.

B) Testforbindelsens fortrængning af bundet [3H]-PNZ: 15 Fordelen ved anvendelse af PNZ bygger på dens selektivitet over for

Mj-receptor. Det forventes, at forbindelser, som er mere selektive over for M]-receptorer, vil fortrænge den mere effektivt. Fortrængningen af (¾]-PNZ af den muscarine antagonist, atropin, og den muscarine agonist, oxotremorin, resulterer i rc^-værdier på henholdsvis 5 x 10'10M 20 og 8 x 10'7M, og begge disse værdier er højere end de koncentrationer, der er nødvendige til at fortrænge [3HJ-QNB. Disse resultater er ikke overraskende i lyset af pirenzepins højere Kd. Forholdet mellem disse to IC5ø-værdier og den samme forbindelses IC5Q med hensyn til fortrængningen af [3H]-QNB kan anvendes som reference for andre undersøgte 25 forbindelsers præferencebinding til pirezepinbindingssted-Mj-receptorer.

Den følgende tabel viser IC^-værdierne for de undersøgte forbindelser, hvad angår fortrængning af 1¾] -PNZ eller [3H)-QNB. Det ses, at de undersøgte forbindelser fortrængte [3H]-PNZ mere effektivt end [3h] -QN-30 B. AF102B var imidlertid én størrelsesorden mere selektiv over for Mj-receptorer end resten af de undersøgte forbindelser udtrykt ved forholdet DK 173084 B1 30 TABEL 1

Formodede cholinerge forbindelsers evne til at fortrænge [^H]-PNZ fra centrale muscarine receptorer (udtrykt som 10¾)

Forbindelse 1¾1 [M] IC502 [M] IC^1 : IC502 5 _

Oxotremorin 8 x 10'7 3 x 10'6 0,27 AF102B 4 X 10'7 10'5* 0,04 AF102A 3 x 10'5 7 x 10'5 0,43 10 *cirka 2 gange så potent som AF30 (cis).

IC»1 = ic50 for fortrængning af [3H] -PNZ ICjo2 = IC50 for fortrængning af [3H]-QNB

(Muscarin-receptor-assay blev udført ifølge Yamamura og Snyder, PNAS US 71, 1974, S. 1725).

15 TABEL 2

Inducerede kontraktioner af marsvine-ileum Forbindelse Virkningstype EC^ [M] IC5Q [M] *

Acetylcholin agonist 5,0 x 10‘8 20 AF30** agonist 4,0 x 10"6 AF102B agonist 4,0 x 10"6 AF102A agonist >10'5 (lb) antagonist 2 x 10'8 (lc) antagonist 2 x 10"6 25 __________ ♦Denne dosis er IC^-værdien for inhibition af acetylcholin-inducerede kontraktioner af ileum.

** cis-2-methylspiro-(1,3-dioxolan-4,3')-quinuclidin

Fra tabel 1 og 2 ses det, at AF102B er en potent muscarin agonist, 30 hvorimod dens geometriske isomer AF102A næsten er én størrelsesorden DK 173084 B1 31 mindre aktiv; det ses endvidere fra tabel l, at AF102B er en selektiv Mj-agonist.

ADFÆRDSUNDERSØGELSER Resumé af resultater 5 Adfærdsundersøgelser af rotter, som er behandlet intracerebroventriku-laert med AF64A (3 nmol/2 μΐ/side), viste betydelige cognitive dysfunktioner i en træd-igennem-passiv-undgåelsestest. Disse hukommelsesforringelser kunne reverseres med physostigmin og med AF102B.

Denne reversering forekommer som vist i følgende tabel ved lave doser 10 af physostigmin (0,06 mg/kg, intraperitonealt) og AF102B (0,1 og 1 mg/kg, intraperitonealt og 1 mg/kg peroralt). Det terapeutiske indeks for AF102B er derfor 78-780. Dette terapeutiske indeks er afgjort bredere end det, som er fundet for physostigmin (5-17).

AF64A-inducerede cognitive forringelser reverseret af physostigmin og 15 AF102B samt deres relative toxicitet hos rotter

Physostigmin (mg/kg) AF102B (mg/kg) intraperitonealt intraperitonealt peroralt

AF64A

20 (3 nmol/side)

Passiv 0,06 1 1 undgåelse

Morris svømme- 0,1 (forværres) 1 labyrint 25 8-armet stråle- 0,1 (NS) 5 armslabyrint LDjo 1-2 78 >156 30 Terapeutisk 10-17 78-780 >156 indeks 15* (NS s ikke-signifikant) *Dette tal fås ved at dele LDjg-værdien med den dosis, der er anvendt i 35 den strålearmede labyrint-test (intraperitoneal indgift).

Det er endvidere vigtigt at bemærke, at hældningen af den akutte toxi-citetskurve for AF102B er stejl, og ingen åbenbare adfærdsmæssige DK 173084 B1 32 symptomer, herunder parasympathomimetiske virkninger såsom spytflåd og tremor, blev bemærket op til den letale dosis. Valget af "symptomfri1' dosis er således temmelig bredt, hvilket understreger den potentielle anvendelse af dette medikament til behandling af SDAT.

5 I extinctionsundersøgelserne, som blev udført på de AF64A-behandlede rotter, blev der yderligere fundet en meget lang fordelagtig virkning for AF102B, hvilket viser, at denne forbindelse har en langsigtet virkningsvarighed på cognitive funktioner (fig. 10 og 11).

Det er endvidere af den største vigtighed at bemærke, at AF64A (3 10 nmol/2 μΙ/side) inducerede markante hukommelsesforringelser i Mor- ris-svømme-labyrint-testen (Morris, loc.cit.), som blev modvirket af AF102B (1 mg/kg, intraperitonealt), hvorimod physostigmin (0,1 mg/kg, intraperitonealt) havde en negativ virkning (fig. 16 og 17). Det er interessant, at AF102B i denne test virkede fordelagtigt på de rumlige 15 hukommelsesdysfunktioner, som var induceret af AF64A. I denne henseende er det bemærkelsesværdigt, at en væsentlig hukomme1sesdys-funktion hos SDAT-patienter er forringelse af den rumlige hukommelse.

Det er endvidere af den største vigtighed at bemærke, at AF64A (3 nmol/2 μΐ/side) inducerede hukommelsesforringelser i den 8-armede 20 strålearmslabyrint (RAM), som blev modvirket af AF102B (5 mg/kg, intraperitonealt) , hvorimod physostigmin (0,1 mg/kg) ikke havde signifikant virkning (fig. 1Θ og 19).

EKSPERIMENTER

Bilaterale intracerebroventrikulære injektioner af AF64A forårsagede 25 cognitive forringelser hos rotter i (a) en træd-igennem-passiv-und- gåelsestest; (b) Morris-svømmelabyrinten; og (c) strålearmslabyrinten; og mulighed for reversering af de af AF64A fremkaldte virkninger af physostigmin som referenceforbindelse og af AF102B.

DK 173084 B1 33

Fremstilling af AF64A

AF64A blev fremstillet frisk hver dag i 10 mM koncentration og derpå fortyndet med kunstig cerebrospinalvæske (CSF) til en koncentration egnet til injektion. Præparatet med den kunstige CSF-opløsning, pH 5 7,1-7,3, bestod af:

mM

NaCl 147 KC1 2,9

MgCl2.6H20 1,6 1o Dextrose 2,2

CaCl2.2H20 1,7

Træd-igennem-passiv-undgåelse: Eksperiment 1

Physostigmins virkning på ydeevnen og 24 timers retentionen af en inhibitorisk indlæring (træd-igennem-passiv-undgåelses)-opgave på 15 AF64A- og CSF-injicerede rotter blev undersøgt under anvendelse af et e f t e r t ræn i ngs-medikamentbehandlingsparadigme.

Hanrotter (Sprague-Dawley, opdrættet af Charles River), 90-110 dage gamle, vægt 230-360 g, fik fri adgang til føde og vand. Forud for kirurgisk indgreb blev rotterne bedøvet med Equithesin (0,3 ml/ioo g 20 i.p.) Bilaterale injektioner blev udført ved stereotaktisk anbringelse af AF64A eller vehikel i de laterale cerebroventrikler (i.c.v.) (AP -0,8 mm fra bregma, L-1,5 mm fra bregma og - 4,7 mm fra kraniets overflade). 23 rotter blev infunderet med 3 mol AF64A i et volumen på 2 μΐ* i hver lateralventrikel (gruppe 1), og 20 kontrolrotter blev in-. 25 funderet på lignende måde med det samme volumen CSF (gruppe 2). I alt 43 rotter blev opereret. Infusionen blev udført med en 28-ga.-injektionskanyle. Injektionshastigheden blev holdt konstant på 0,25 μΐ/minut. Injektionskanylen blev efterladt på stedet i 4 minutter efter injektion med henblik på at muliggøre diffusion af opløsningerne ind i 30 ventriklerne.

27-28 dage efter injektion** blev hver rottegruppe post-operativt randomiseret opdelt i 2 grupper med hver 10 rotter; undergruppe 1 blev henvist til physostigminbehandling, og undergruppe 2 blev behandlet med saltvand. Hver rotte blev anbragt enkeltvis i et lille oplyst 35 forrum i en torumskasse. Efter en 60 sekunders bekendtskabs/adaptationsperiode, blev den dør, der adskiller de to rum, åbnet, og en klokke blev aktiveret. Rottens latenstid inden indgang i det store mørke rum i kassen (træd-igennem) blev målt. Umiddelbart efter indgang i det mørke rum blev rotten underkastet et uundgåeligt "scrambled foot DK 173084 B1 34 shock" som blev appliceret til gittergulvet (0,6 mA i 3 sekunder). 60 sekunder efter afslutningen af shocket ved slutningen af træningsproceduren blev rotten fjernet fra det mørke rum, og physostigmin opløst i saltvand (0,06 mg/kg) eller placebosaltvand blev indgivet intraperi-5 tonealt. Rotterne blev derpå bragt tilbage til deres opholdsbur.

Retention af den passive undgåelsesopgave blev målt 24 timer efter træning ved igen at anbringe rotten i det oplyste forrum og efter en 60 sekunders adaptationsperiode at måle latenstiden til indgang i det mørke rum. Forsøget blev afsluttet, når en rotte gik ind i det mørke 10 rum, eller når der var gået 600 sekunder. Dyr, som ikke gik igennem inden for 600 sekunder, blev fjernet fra apparatet, og en latenstid på 600 sekunder blev registreret for disse dyr.

•Denne dosis blev fundet at være effektiv til at forringe den passive undgåelses-træd-igennem-ydeevne hos rotter.

15 **27-dages-intervallet blev fundet at være effektivt til forringelse af den passive undgåelses-træd-igennem-ydeevne hos 3 nmol/2 μΐ AF6-4A-injicerede rotter.

RESULTATER: Mortalitet og legemsvægt

Umiddelbart efter kirurgi viste de AF64A-injicerede dyr sig ikke at 20 reagere på omgivelsesstimuli. Nogle få dyr (2 ud af 20 i den AF64A-in-jicerede gruppe og 6 ud af 20 i den CSF-injicerede gruppe) viste tab i legemsvægt (henholdsvis 2 og 12,5%), hvilket blev observeret 7 dage efter dosering. Inden for 4Θ timer efter dosering var der en kumuleret mortalitet på 13% i den AF64A-injicerede gruppe.

25 RESULTATER: Passiv undgåelses-test

De initiale latenstidsmålinger og retentions-test-latenstidsmålingerne blev analyseret med en tovejs ANOVA, injektion (AF64A/CSF) versus behandling (physostigmin/saltvand). Tabel (i) viser middelværdi ± S.E.M. af de initiale latenstidsmålinger, medens tabel (ii) viser mid-30 delværdi ± S.E.M. for retentions-test-latenstidsmålingerne.

DK 173084 B1 35 TABEL (i)

Initial-test-latenstidsmålinger (sekunder)

Injektion AF64A CSF

Forbehandling 3 nmol/2 μΐ 2 μΐ 5 _

Physostigmin 25,50 ± 5,68 29,70 ± 7,93 (0,06 mg/kg)

Saltvand 33,80 ± 9,66 16,10 ± 3,73 10 TABEL (ii)

Retentionstest-latenstidsmålinger (sekunder)

Injektion AF64A CSF

Behandling 3 nmol/2 μΐ 2 μΐ 15

Physostigmin 458,90 ± 63,33 576,10 ± 22,69 (0,06 mg/kg)

Saltvand 247,90 ± 52,26 556,60 ± 28,44 20 Ingen signifikante forskelle blev registreret i løbet af træningsfor-søget mellem nogen af de undersøgte grupper (se fig. 8): F(l,36) = 0,81, p>0,05.

"Træd-igennem-latenstiden" for den AF64A-injicerede gruppe var signifikant kortere, F(l,36) = 20,18, p<0,01, i løbet af 24 timers-reten-25 tions-testen end latenstiden for den CSF-injicerede gruppe. Endvidere var træd-igennem-latenstiden for den physostigmin-behandlede gruppe signifikant længere, F(l,36) = 5,91, p<0,05, i løbet af 24-timers-retentions-testen end latenstiden for den saltvandsbehandlede gruppe. Retentionen af et træd-igennem-passiv-undgåelses-respons hos den 30 AF64A-injicerede gruppe blev signifikant forbedret af physostigminind-gift, medens retentionen hos den CSF-injicerede gruppe ikke blev påvirket af denne behandling (se fig. 8), F(l,36) = 4,08, p = 0,05.

Shiffe's kontrastsammenligninger af træd-igennem-latenstids-målingerne under retentionstesten viste en signifikant forskel mellem de salt-35 vandsbehandlede AF64A-grupper og CSF-injicerede grupper (p<0,05). De tre andre kontrastsammenligninger var ikke signifikante, skønt latenstiden for den saltvandsbehandlede AF64A-injicerede gruppe synes at være kortere end latenstiden for den physostigmin-behandlede AF64A-in-j icerede gruppe.

DK 173084 B1 36

Træd-igennem-passiv-undgåelse: Eksperiment 2 AF102B‘s virkninger på ydeevnen og 24 timers retentionen af en in-hibitorisk indlæring (passiv undgåelses-træd-igennem)-opgave hos AF64A- og CSF-injicerede rotter blev undersøgt under anvendelse af et 5 efter-behandlings-medikament-paradigme.

Den kirurgiske procedure var identisk med den i eksperiment 1 anvendte med undtagelse af, at (1) vægten af de opererede rotter var 250-325 g; (2) 20 rotter blev infunderet med 3 nmol AF64A i et volumen på 2 μΐ i hver ventrikel (gruppe 1), og 20 kontrolrotter blev infunderet med et 10 volumen på 2 μΐ CSF i hver lateralventrikel (gruppe 2). I alt 40 rotter blev opereret.

Den adfærdsmæssige tidsprocedure omfattede 4 faser.

Fortest: 28 Sprague-Dawley naive hanrotter, 90-110 dage gamle, vægt 270-310 g, blev randomiseret opdelt i 4 grupper med hver 7 rotter; 3 15 grupper blev henvist til behandling med AF102B opløst i saltvand (0,1, 1,0 eller 5,0 mg/kg), og den fjerde gruppe blev behandlet med saltvand. Trænings- og test-retentionsproceduren var som i eksperiment 1 med undtagelse af, at der ved afslutningen af træningsproceduren blev indgivet forskellige doser af AF102B eller saltvandsplacebo intraperi-20 tonealt.

Fase 1: 27-28 dage efter injektion blev hver rottegruppe postopera tivt randomiseret inddelt i 2 grupper med 10 rotter i hver; undergruppe 1 blev henvist til AF102B-behandling, og undergruppe 2 blev behandlet med saltvand. Trænings- og testretentionsproceduren var som 25 i eksperiment 1 med undtagelse af, at rotten ved slutningen af træningsproceduren blev fjernet fra det mørke rum, og doser af AF102B opløst i saltvand (1 mg/kg) eller saltvand blev indgivet intraperi-tonealt.

Fase 2: 6 dage efter retentionstesten blev rotterne underkastet 6 30 daglige forsøg med extinctionsprocedure. Rotten blev anbragt i det oplyste forrum, og latenstiden til indgang i det mørke rum blev målt.

Denne procedure var som i retentionstestproceduren i fase 1.

Fase 3: Efter extinctionsproceduren blev rotterne underkastet en latensextinctionsprocedure. Rotten blev anbragt i det oplyste forrum 35 og blev efter en 60 sekunders adaptationsperiode skubbet ind i det mørke rum og holdt der i 60 sekunder. Denne procedure blev udført én gang dagligt i tre dage. Efter latensextinctionsproceduren blev rotterne underkastet en "extinction + latensextinction"-procedure. Rotten DK 173084 B1 37 blev anbragt i det oplyste forrum, og efter en 60 sekunders adaptationsperiode blev latenstiden til indgang i det mørke rum målt.

Testrækken blev afsluttet, når en rotte gik ind i det mørke rum. De dyr, som ikke gik ind inden for 600 sekunder, blev skubbet ind i det 5 mørke rum, og en latenstid på 600 sekunder blev registreret for disse dyr. Denne procedure blev udført én gang dagligt i 4 dage. Ved slutningen af den fjerde forsøgsrække, umiddelbart efter indgangen i det mørke rum, blev rotten underkastet en trænings- og retentionstestprocedure identisk med proceduren i fase l med undtagelse af, at de 2 10 undergrupper, som i fase 1 blev behandlet med AF102B, nu blev behandlet med saltvandsplacebo og omvendt. (Det skal bemærkes, at denne behandling fandt sted 2 måneder efter AF64A-/CSF-injektionen).

RESULTATER: Mortalitet og legemsvægt

Umiddelbart efter kirurgi viste de AF64A-inj icerede dyr sig ikke at 15 reagere på omgivelsesstimuli. Nogle få dyr (2 ud af 20 i den AF64A-injicerede gruppe) havde et 2%'s vægttab, som blev observeret 7 dage efter dosering. Inden for 4Θ timer efter dosering forekom der ingen mortalitet i nogen af grupperne.

RESULTATER: Passiv undgåelsestest 20 Fortest

De initiale latensmålinger og retentions-test-latenstidsmålingerne blev analyseret med en énvejs ANOVA. Tabel (iii) viser middelværdi ± S.E.M. af de initiale latenstidsmålinger, medens tabel (iv) viser middelværdi ± S.E.M. af retentionstest-latenstidsmålingerne.

25 TABEL (iii)

Initiale latenstidsmålinger (sekunder) AF102B AF102B AF102B Saltvand 0,1 mg/kg 1 mg/kg 5 mg/kg 30 16,71*4,77 1I,86±1,23 19,71*5,39 20,00±5,64 TABEL (iv)

Retentions-test-latens tidsmålinger (sekunder) AF102B AF102B AF102B Saltvand 35 0,1 mg/kg 1 mg/kg 5 mg/kg 330,57*75,55 348,14*81,66 551,71*32,92 513,00*56,39 DK 173084 B1 38

Der blev i løbet af træningsforsøget ikke påvist signifikante forskelle mellem nogen af de undersøgte grupper, F(3,24) = 0,57; p>0,05. Endvidere blev der i løbet af 24 timers retentionstesten ikke fundet signifikante forskelle mellem de forskellige doser af AF102B, F(3,24) 5 = 2,61; p>0,05, skønt retentions-latenstiden for 0,1 mg/kg- og 1 mg/kg -grupperne tenderer mod at være kortere end latenstiden for 5 mg/kg og saltvandsgrupperne.

FASE 1

De initiale latenstidsmålinger og retentions-test-latenstidsmålingeme 10 blev analyseret med en tovejs ANOVA, injektion (AF64A/CSF) versus behandling (AF102B/saltvand). Tabel (v) viser middelværdien ± S.E.M. af de initiale latenstidsmålinger, medens tabel (vi) viser middelværdien ± S.E.M. af retentions-test-latenstidsmålingerne.

TABEL (v) 15 Initiale latenstidsmålinger (sekunder)

Injektion AF64A CSF

Behandling 3 nmol/2 μΐ 2 μΐ AF102B 18,40±3,74 15,30+2,83 20 (1 mg/kg)

Saltvand 22,66*4,43 15,20±2,10 TABEL (vi)

Retentions-test-latenstidsmålinger (sekunder)

25 Injektion AF64A CSF

Behandling 3 nmol/2 μΐ 2 μΐ AF102B 514,10*38,21 447,60*58,09 (1 mg/kg) 30 Saltvand 182,44*29,90 574,30*16,39

Der blev i løbet af træningsforsøget ikke påvist signifikante forskelle mellem nogen af de undersøgte grupper (se fig. 9): F (1,35) = 2,16, p>0,05, hvad angår hovedvirkningen af injektionsvariablen 35 (AF64A/CSF). Hvad angår de øvrige hovedvirkninger (de to grupper, der blev behandlet med AF102B eller saltvand): F(l,35) = 0,29; p>0,05.

DK 173084 B1 39

Træd-igennem-latenstiden for den AF64A-injicerede gruppe var sig nifikant kortere, F(l,35) » 13,89; p<0,01, i løbet af 24-timers retentions-testen end latenstiden for den CSF-injicerede gruppe. Endvidere var træd-igennem-latenstiden for den AF102B-behandlede gruppe signifi-5 kant længere, F(l,35) * 4,98; p<0,05, i løbet af 24 timers retentionstesten end latenstiden for den saltvandsbehandlede gruppe.

Retentionen af et træd-igennem-passiv-undgåelses-respons i den AF6-4A-injicerede gruppe blev signifikant forbedret af AFl02B-indgift, medens responset i den CSF-injicerede gruppe blev signifikant forringet 10 (se fig. 9), F(l,35) « 31,18, p<0,01. Shiffe's kontrastsammenligninger af træd-igennem-latenstidsmålingerne i løbet af retentionstesten viste, at alle forskellene mellem grupperne var signifikante (0,01 < p < 0,05) med undtagelse af AF64A + AF102B versus CSF + AF102B-forskellen .

15 FASE 2

Retentions-test-latenstidsmålingerne i løbet af extinctionsperioden blev analyseret ved en trevejs ANOVA (6x2x2) med én gentagen variabel (forsøg) og to ikke-gentagede variabler (injektion - AF64A/CSF og behandling - AF102B/CSF). Fig. 10 viser, at træd-igennem-latenstiden 20 for den AF64A-injicerede gruppe var signifikant kortere, F(l,36) = 16,83,- p<0,01, end latenstiden for den CSF-injicerede gruppe. Træd-i-gennem-latenstiden for den AF102B-behandlede gruppe var endvidere signifikant længere, F(l,36) * 31,45, p<0,01, end den saltvandsbehandlede gruppes latenstid. Retentionen af et træd-igennem-passiv-und-25 gåelses-respons for både den AF64A- og den CSF-injicerede gruppe i løbet af extinctionen var signifikant forbedret ved AFl02B-indgift.

F(i,36) « 15,80, p<0,01. Shiffe's kontrastsammenligninger af træd-i-gennem-latenstids-målingerne i løbet af extinctionsperioden viste, at alle forskellene mellem grupperne var signifikante (p<0,0l) med 30 undtagelse af AF64A + AF102B versus CSF + AF102B-forskellen.

Forsøgenes variable hovedvirkning i løbet af extinctionen var signifikant, F(5180) 2,68, p<0,05. Kontrastsammenligningsanalyse viste, at retentions-latenstiden for det andet extinctionsforsøg var signifikant længere end latenstiden for det sjette forsøg (p<0,05). Der var 35 ingen andre signifikante forskelle.

interaktionen mellem behandling og prøver var signifikant, F(5180) * 3,30, p<0,05. Signifikante enkelte hovedvirkningskontraster blev fundet mellem de AF102B-behandlede grupper og de saltvandsbehandlede grupper i løbet af alle extinctionsprøverne med undtagelse af den DK 173084 B1 40 første prøve. Retentions-latenstids-extinctionskurven var endvidere signifikant forskellig fra kurven for de saltvandsbehandlede grupper (p<0,05). Retentions-latenstiden for de AF102B-behandlede grupper forøgedes fra den første til den fjerde prøve og aftog derpå. Reten-5 tions-latenstiden for de saltvandsbehandlede grupper aftog fra den første til den sjette prøve.

FASE 3

A. Retentionstest-latenstids-målingerne i løbet af "extinction + latensextinction"-perioden blev analyseret med en trevejs ANOVA

10 (4x2x2) med én gentagen variabel (prøver) og to ikke-gentagne varia bler (injektion - AF64A/CSF og behandling AF102B/CSF). Der blev i løbet af "extinction + latensextinction"-perioden ikke fundet signifikante forskelle mellem nogen af de undersøgte betingelser i reten-tionstest-latenstids-målingerne, skønt retentions-latenstiden for den 15 saltvandsbehandlede AF64A-injicerede gruppe synes at være kortere end retentions-latenstiden for de tre andre grupper (se fig 11).

B. Retentionstest-latenstids-målingerne for den anden indgift af AF102B/saltvand blev analyseret med en tovejs ANOVA, injektion (AF6-4A/CSF) versus behandling (AFl02B/saltvand). Tabel (vii) viser middel- 20 værdien ± S.E.M. af retentions-test-latenstids-målingerne.

TABEL (vii)

Retent ions-test-latenst ids-målinger (sekunder) af anden indgift af AF102B/saltvand

Injektion AF64A CSF

25 Behandling 3 nmol/2 μΐ 2 μΐ

AF102B

(1 mg/kg) 580,40tl8,61 600 30 (tidligere saltvand)

Saltvand 35 (tidligere AF102B) 600 600

Efter den anden AF102B/saltvands-indgift blev der ikke fundet signifikante forskelle mellem nogen af de undersøgte grupper (p>0,05) (se 40 fig 12). Retentions-latenstiden for den saltvandsbehandlede AF64A-injicerede gruppe, som tidligere var blevet behandlet med AF102B, forblev på det samme niveau, medens retentions-latenstiden for den 41 DK 173084 B1 AF102B-behandlede AF64A-injicerede gruppe, som tidligere var behandlet med saltvand, blev forøget og nåede niveauet for de CSF-injicerede grupper.

ADFÆRDSMÆSSIGE EKSPERIMENTER

5 I det foreliggende arbejde blev der endvidere undersøgt muligheden af reversering af de AF64A-inducerede virkninger ved hjælp af forskellige doser af AF102B i den passive undgåelses-opgave og i to andre opgaver, nemlig Morris svømmelabyrint og den 8-armede strålelabyrint.

Passiv undgåelses-opgave 10 EKSPERIMENT 1 I dette eksperiment blev virkningen af AF102B-indgift {0,1 mg/kg, intraperitonealt) på ydeevnen og 24 timers retentionen af en inhibi-torisk indlæringsopgave (passiv undgåelses-træd-igennem) undersøgt hos AF64A- og CSF-injicerede rotter under anvendelse af et efter-ind-15 lærings-me dikamentbehandlings-paradigme.

Kirurgi

Sprague-Dawley (opdrættet af Charles River) hanrotter, 90-110 dage gamle, vægt 265-340 gr, blev injiceret i.c.v. 10 rotter blev infun-deret med 3 nmol AF64A i et volumen på 2 μΐ i hver lateralventrikel 20 (gruppe i), og 10 kontrolrotter blev infunderet med CSF (gruppe 2) . I alt 20 rotter blev opererede.

Adfærdstestning

Adfærdstestningsproceduren omfattede to faser, 1 og 2. I en fortest-træningsprocedure blev hver rotte placeret enkeltvis i et lille oplyst 25 forrum i en torums-æske. Efter en 60 sekunders bekendtskabs/adaptationsperiode blev den dør, der adskilte de to rum, åbnet, og en klokke blev aktiveret. Rottens latenstid til indgang i det store mørke rum i æsken (til træd-igennem) blev målt. umiddelbart efter indgang i det mørke rum blev rotten underkastet et uundgåeligt "scrambled foot 30 shock", som blev appliceret til ristgulvet (0,6 mA i 2 sekunder). 60 sekunder efter afslutningen af shocket ved slutningen af træningsproceduren blev rotten fjernet fra det mørke rum, og saltvandsplacebo blev indgivet intraperitonealt. Rotterne blev bragt tilbage til deres DK 173084 B1 42 opholdsbur. Retention af den passive undgåelsesopgave blev målt 24 timer efter træningen ved igen at placere rotten i det oplyste forrum og efter en 60 sekunders adaptationsperiode at måle latenstiden til indgang i det mørke rum. Testrækken blev afsluttet, når en rotte gik 5 ind i det mørke rum, eller efter at der var gået 600 sekunder. De dyr, som ikke gik igennem inden for 600 sekunder, blev fjernet fra appara-tet, og der blev noteret en latenstid på 600 sekunder for disse dyr.

FASE 1 27-29 dage efter AF64A- eller CSF-injektion blev hver rottegruppe 10 underkastet den samme træning, og test-retentionsproceduren blev udført som i fortesten med undtagelse af, at : a) rotten blev i træningsperioden behandlet intraperitonealt med saltvandsplacebo; b) varigheden af shocket var 3 sekunder.

FASE 2 15 13-20 dage efter retentionstesten (40-47 dage efter AF64A- eller CSF-injektion) blev rotterne underkastet en anden passiv undgåelsestest. Hver rotte blev placeret i det oplyste forrum, og efter en 60 sekunders adaptationsperiode blev latenstiden til indgang i det mørke rum målt. De dyr, som ikke gik igennem inden for 600 sekunder, blev 20 skubbet ind i det mørke rum, og en latenstid på 600 sekunder blev noteret for disse dyr. Rotterne blev underkastet trænings- og retentionstestprocedurer som i fase l med undtagelse af, at de grupper, der blev behandlet med saltvand, nu blev behandlet med AF102B (0,1 mg/kg intraperitonealt).

25 RESULTATER

Mortalitet og legemsvægt

Umiddelbart efter kirurgi viste de AF64A-injicerede dyr sig ikke at reagere på omgivelsesstimuli. Ét dyr (ud af 20 AF64A-injicerede dyr) viste 2% tab af legemsvægt, og to dyr viste ingen forøgelse af legems-30 vægt 7 dage efter injektion. Der forekom ikke mortalitet i nogen af grupperne.

Passiv undgåelsestest: Fortest I løbet af træningsprøverne blev der ikke fundet signifikante forskelle mellem nogen af de undersøgte grupper [F{3,24) s 0,22; p>0,05].

DK 173084 B1 43 AF102B (0,1 mg/kg, intraperitonealt)

Sammenligning blev foretaget mellem de retentionstest-latenstider, som var opnået efter indgift af AF102B (0,1 mg/kg, intraperitonealt) (anden kørsel), og de retentionstest-latenstider, som blev opnået 5 efter saltvandsindgift (første kørsel). Retentionstest-latenstids-målingeme blev analyseret ved en tovejs ANOVA (2x2) med én gentagen variabel (behandling + kørsel) og én ikke-gentaget variabel [injektion (AF64A/CSF) ] .

Retent ions-latenstiden for den AF64A-injicerede gruppe var stadig 10 signifikant kortere [F(l,18) * 29,48,- p<0,001] end latenstiden for den CSF-injicerede gruppe (se fig. 13). Retentions-latenstiden for de AF102B-behandlede grupper (anden kørsel) var desuden signifikant længere [F(l,18) = 33,71; p<0,001) end latenstiden for den saltvandsbehandlede gruppe (første kørsel). Retention af et træd-igennem-pas-15 siv-undgåelses-respons i den AF64A-injicerede gruppe blev signifikant forbedret af AF102B-indgift [A(l,18) = 33,27; p<o,001), medens den for den CSF-injicerede gruppe ikke ændredes signifikant ved denne behandling. i virkeligheden forventedes reelt ingen ændring, eftersom latenstideme for de CSF-behandlede rotter allerede var nær ved 600 20 sekunder. Shiffe’s kontrastsammenligninger viste, at AF64A + AF102B

versus AF64A + saltvand-forskel og AF64A + saltvand versus CSF + saltvand-forskel var signifikant (p<0,00l). Det understreges imidlertid, at forbedringen i den AF64A-injicerede gruppe på grund af AF102B-ind-gift i dette tilfælde blev registreret efter et andet shock, et fak-25 tum, som kan have haft indflydelse på retentionsforbedringen.

EKSPERIMENT 2

Ved dette eksperiment blev virkningen af AF102B-indgift (peroral) på ydeevnen og 24 timers retentionen af en inhibitorisk indlæringsopgave (passiv-undgåelses-træd-igennem) hos AF64A- og CSF-injicerede rotter 30 undersøgt under anvendelse af et efterindlærings-behandlings-para-digme.

METODER

Kirurgi

Den kirurgiske procedure var som i eksperiment 1 med undtagelse af, 35 at: 1) vægten af de opererede rotter var 265-320 g,- 2) 10 rotter blev infunderet med 3 nmol AF64A i et volumen på 2 μΐ i hver lateralventrikel (gruppe l) , og 10 kontrolrotter blev infunderet med 2 volumener af DK 173084 B1 44 2 μΐ CSF i hver lateralventrikel (gruppe 2). I alt blev 20 rotter opereret.

Adfærdstestning

Adfærdstestningsproceduren omfattede 2 faser.

5 FASE 1

Trænings- og testretentions-procedurerne i fase 1 var som i fase 1 i eksperiment 1 med undtagelse af, at; 1) hver rottegruppe blev post-operativt underinddelt; og 2) ved slutningen af træningsproceduren blev rotten fjernet fra det mørke rum, og AF102B (1 mg/kg, p.o.) eller 10 saltvand blev indgivet.

FASE 2 19-22 dage efter retentionstesten (49 dage efter AF64A- eller CSF-in-jektion) blev kun de saltvandsbehandlede rotter underkastet endnu en kørsel. Trænings- og testretentions-procedurerne var som i fase 2 i 15 eksperiment 1 med undtagelse af, at de 2 undergrupper, som i fase l blev behandlet med saltvand, nu blev behandlet med AF102B (1 mg/kg, p.o.).

RESULTATER FASE 1 20 De initiale latensmålinger for de AF64A- og CSF-injicerede grupper blev analyseret ved en t-test for uafhængige prøver. Nedenstående tabeller viser henholdsvis (a) middelværdierne ± S.E.M. af de initiale latenstids-målinger og (b) middelværdierne ± S.E.M. for retentionstest - latenst ids-målingerne.

25 (a) Initialtest-latenstids-målinger (sekunder)

AF64A CSF

3 nmol/2 μΐ/side 2 μΐ/side 19,0 ± 2,18 18,86 ± 2,07 30 _ DK 173084 B1 45 (b) Retentionstest-latenstids-målinger (sekunder)

Injektion AF64A CSF

Behandling 3 nmol/2 μΐ/side 2 μΐ/side 5 AF102B 524,55 ± 45,60 600

Saltvand 168,90 ± 28,91 548,90 ± 48,51 I løbet af træningsprøven blev der ikke fundet signifikante forskelle mellem de AF64A- og CSF-injicerede grupper (se fig. 14), t(57) = 0,05; 10 p>0,05. Den første analyse af retentions-latenstids-målingerne viste, at træd-igennem-latenstiden for den AF64A-injicerede gruppe i løbet af 24 timers retentionstesten var signifikant kortere [F(l,36) » 37,01,-p<0,001] (se fig. 14) end latenstiden for den CSF-injicerede gruppe.

Den anden analyse af retentions-latenstids-målingerne viste, at 15 træd-igennem-latenstiden for den AF64A-injicerede gruppe i løbet af 24 timers retentionstesten var signifikant kortere [F(l,35) = 37,93; p<0,001] (se fig. 14) end latenstiden for den CSF-injicerede gruppe. Endvidere var træd-igennem-latenstiden for den AF102B-behandlede gruppe signifikant længere [F(l,35) = 28,46; p<0,00l] end latenstiden 20 for den saltvandsbehandlede gruppe. Retentionen af et træd-igen- nem-passiv-undgåelses-respons i den AF64A-injicerede gruppe blev signifikant forbedret af AF102B-indgift [F(l,35) = 13,94,- p<0,00l], medens der ikke var nogen signifikant forskel mellem den AF102B-behand-lede-CSF-injicerede gruppe og den saltvandsbehandlede-CSF-injicerede 25 gruppe. Shiffe's kontrastsammenligninger viste, at AF64A + AF102B versus AF64A + saltvand-forskellen var signifikant (p<0,001).

FASE 2 I en første analyse blev retentionstest-latenstids-målingerne før shock-indgiften i den anden kørsel sammenlignet med retentionstest-30 latenstids-målingerne i løbet af den første kørsel. Retentionstest- latenstids-målingerne blev analyseret med en tovejs ANOVA (2x2) med én gentagen variabel (kørsel) og én ikke-gentaget variabel [injektion (AF64A/CSF)]. Retentions-latenstiden for den AF64A-injicerede gruppe 19-22 dage efter den første kørsel var stadig signifikant kortere 35 [F(1,18) - 49,51; p<0,001] end latenstiden for den CSF-injicerede gruppe (se fig. 15). Der var hverken signifikant kørselseffekt [F(1,18) = 0,91; p>0,05] eller signifikant interaktionseffekt [F(l,18) * 1,28; p>0,05].

DK 173084 B1 46 I den anden analyse blev retentionstest-latenstids-målingerne efter shock-indgiften i løbet af den anden kørsel sammenlignet med reten-tionstest-latenstids-målingerne i løbet af den første kørsel. Reten-tionstest-latenstids-målingerne blev analyseret med en tovejs ANOVA 5 (2x2) med én gentagen variabel (kørsel + behandling) og én ikke-gen- taget variabel [injektion (AF64A/CSF)]. Retentions-latenstiden for den AF64A-injicerede gruppe var stadig signifikant kortere [F(l,18) = 40,81, p <0,001] end latenstiden for den CSF-injicerede gruppe (se fig. 15). Endvidere var retentions-latenstiden for den AF102B-behand-10 lede gruppe (anden kørsel) signifikant længere [F(l,18) = 65,71; p<0,001] end latenstiden for den saltvands-behandlede gruppe (første kørsel). Retentionen af et træd-igennem-passiv-undgåelses-respons for den AF64A-injicerede gruppe blev signifikant forbedret af AF102B-ind-gift [F(1,18) = 40,81; p<0,001], medens værdien for den CSF-injicerede 15 gruppe ikke ændredes signifikant ved denne behandling. Shiffe's kontrastsammenligninger viste, at forskellen mellem AF64A + AF102B versus AF64A + saltvand var signifikant.

Morris svømmelabyrint

Cholinerg mangel såvel som behandlinger med anticholinerge medikamen-20 ter påvistes at forringe hukommelse og indlæringsprocesser forbundet med rumlig orientering (Sutherland et al., J. Comp. Phvsiol. Psvchol.

96, 1982, s. 563-573). I denne henseende så vand-labyrinten (Morris, Learning and Motivation 12. 1978, s. 239-261) ud til at være et egnet adfærdsparadigme til opdagelse af cognitive forringelser, som var in-25 duceret af AF64A hos rotter, samt reversering af disse ved hjælp af cholinerge medikamenter. Eftersom physostigmin for tiden er ét af de få cholinerge medikamenter, som anvendes til patienter med Alzheimers sygdom, blev den udvalgt til foreløbig testning af dens virkninger på AF64A-behandlede rotter.

30 38 Sprague Dawley hanrotter (opdrættet af Charles River), 5-6 måneder gamle med en gennemsnitsvægt på 500 g, blev anvendt. Rotterne blev holdt i grupper på 5 og blev givet fri adgang til føde og vand. Testning blev udført i en rund hvid metalbalje, 1,4 m i diameter og 0,4 m dyb. Baljen blev fyldt med vand og gjort opaque med mælkepulver til et 35 niveau på 18 cm. En platform på 12 cm i diameter og med en højde på 16 cm blev placeret i baljen 2 cm under vandniveau. Platformen blev dækket med gaze for at forhindre dyret i at glide tilbage i vandet efter at have nået platformen.

Før testning blev rotten placeret på platformen i 120 sekunder og 40 forsigtigt anbragt i vandet over for poolens væg ved ét ud af fire startsteder (nord, syd, øst eller vest) langs poolens omkreds. Inden DK 173084 B1 47 for hver blok på fire prøver lod man hver rotte starte ved hver af de fire startsteder, således at rækkefølgen af startsteder var randomise-ret udvalgt. Testningen blev udført på to konsekutive dage og med hver rotte dagligt udsat for otte prøver. I løbet af prøverne 1-12 blev 5 platformen anbragt i centrum af syd-øst kvadranten, og i løbet af prøverne 13-16 blev platformen overført til centret af nord-vest kvadranten. Hvis rotten i en bestemt prøve fandt platformen, lod man den forblive på platformen i 60 sekunder inden påbegyndelse af den næste prøve. Hvis det ikke lykkedes rotten at finde platformen, blev 10 prøven afsluttet efter en cut-off-tid på 120 sekunder og blev herefter anbragt på platformen i 60 sekunder før påbegyndelse af den næste prøve. Latenstiden, indtil platformen blev fundet, blev målt.

Med henblik på medikament-testning blev rotterne injiceret med AF64A eller CSF (3 nmol/2 μΐ/side) som beskrevet ovenfor i eksperiment 2.

15 Rotterne blev først underkastet en træd-igennem-indlærings-procedure (se eksperiment 1 ovenfor) og blev 3-3,5 måneder efter injektion testet i vandlabyrinten. Rotterne blev opdelt i fire grupper; 18 CSF-injicerede rotter blev enten behandlet med physostigmin (0,1 mg/kg, i.p.) (10 rotter) eller med saltvand (8 rotter). 20 AF64A-injicerede 20 rotter blev opdelt på lignende måde. Rotterne blev injiceret med physostigmin umiddelbart før testning hver dag.

RESULTATER

Undvigelses-latenstiden blev analyseret med en trevejs ANOVA (4x2x2) med én gentagen variabel (prøver) og to ikke-gentagne variabler (in-25 jektion - AF64A/CSF og behandling - physostigmin/saltvand). Tabel (viii) viser undvigelses-latenstiden for de undersøgte grupper. Fig.

16 viser, at AF64A-injicerede rotter viste en forøgelse i undvigelses-latenstiden (i sekunder) i forhold til CSF-behandlede rotter.

Denne effekt er højsignifikant, F(l,34) = 14,BB, p<0,001. Den in-30 itiale undvigelses-latenstid for alle fire grupper var uden større forskel. Imidlertid aftog undvigelses-latenstiden for de CSF-behand-lede rotter hurtigere end undvigelses-latenstiden for AF64A-rotterne. Physostigmin forringede tilsyneladende ydeevnen for både de AF64A- og CSF-injicerede grupper sammenlignet med ikke-behandlede AF64A- og 35 CSF-injicerede grupper, men dette resultat var ikke statistisk signifikant. Prøvernes effekt var statistisk signifikant, F(15.510) = 5,9, p<0,001. Yderligere blev der fundet en signifikant interaktion mellem prøver og physostigmin, F(15.510) = 4,3, p<0,001; physostigmin in-hiberede formindskelsen af undvigelses-latenstids-kurven, uanset 40 hvilken injiceret gruppe, der var tale om.

DK 173084 B1 48 Når der blev udført lignende Morris svømmelabyrint-eksperimenter på AF102B (1 mg/kg, i.p.)( blev det fundet, at denne forbindelse definitivt forbedrede de hukommelsesmangler, som var induceret af AF64A {fig. 17), hvorimod physostigmin (0,1 mg/kg, i.p.) havde negativ ef-5 fekt. De fordelagtige virkninger af AF102B i denne test angik rumlig hukommelses-dysfunktioner, som var induceret af AF64A. Det er i denne henseende bemærkelsesværdigt, at en væsentlig hukommelses-dysfunktion hos SDAT-patienter er en forringelse af rumlig hukommelse. Detaljer fra disse eksperimenter angives i følgende beskrivelse.

10 Morris vandlabyrint: Metode og resultater a) Forsøgsobjekter 40 Sprague-Dawley hanrotter (opdrættet af Charles River Breeding Laboratories U.K.), 5-6 måneder gamle, vægt 450-580 g, tjente som forsøgsobjekter. Rotterne blev holdt i grupper på 5 og blev givet fri 15 adgang til føde og vand. 2,5-3,5 måneder før adfærdstestning blev rotterne injiceret med AF64A (3 nmol/2 μΐ/side) (20 rotter i gruppe 1) eller CSF (20 rotter i gruppe 2) som beskrevet under den kirurgiske procedure.

b) Medikament-indgift 20 Hver af de injicerede grupper blev randomiseret opdelt i to lige store behandlingsgrupper. Ved slutningen af træningsproceduren på den første og anden dag af adfærdstestningen blev én af de AF64A-injicerede undergrupper og én af de CSF-injicerede undergrupper (n=20) behandlet med AF102B opløst i saltvand (1 mg/kg, i.p.), medens de andre to 25 undergrupper (n=20) blev behandlet med saltvand.

AF102B (1 mg/kg, i.p.)

Undvigelses-latenstiden for denne behandling blev analyseret med en trevejs ANOVA (4x2x2) med én gentaget variabel (prøver) og to ikke-gentagne variabler [injektion (AF64A/CSF) og behandling (AF102B/salt-30 vand)]. Fig. 17 viser, at de AF64A-injicerede rotter viste en signifikant forøgelse i undvigelses-latenstid i forhold til de CSF-inji-cerede rotter [F(l,36) = 11,26; p<0,005]. De AF102B-behandlede rotter viste endvidere en signifikant formindskelse i undvigelses-latenstid i forhold til saltvandsbehandlede rotter [F(l,36) = 4,89; p<0,05] uanset 35 hvilke af de injicerede grupper, der var tale om. Prøvernes effekt var statistisk signifikant [F(5180) = 33,34; p<0,001]; yderligere blev der fundet en signifikant interaktion mellem prøver og injektion (F(5180) = 5,53; p<0,001]; undvigelses-latenstiden for de CSF-injicerede rotter DK 173084 B1 49 formindskedes hurtigere end undvigelses-latenstiden for de AF64A-in-jicerede rotter.

8-armet strålearmslabyrint

Introduktion 5 AF64A (3 nmol/2 μΙ/side) inducerer hukommelsesforringelser, hvad angår den 8-armede strålearmslabyrint. I denne undersøgelse blev virkningerne af AF102B og physostigmin vurderet hos AF64A- og CSF-behandlede rotter. Eksperimenterne blev udført med henblik på virkningen af AF1C2B (5 mg/kg, i.p.) såvel som physostigmin (0,1 mg/kg, i.p.), i 10 begge tilfælde på trænede rotter med 2 timers forsinkelse.

Metode

Sprague-Dawley rotter (Charles River Breeding Laboratories U.K.) blev anvendt i alle eksperimenter; de blev holdt enkeltvis og blev frataget føde, indtil de nåede 85% af deres "fri-føde-vægt". Rummet blev oplyst 15 12 timer pr. dag (fra kl. 6,00 til kl. 18,00), og adfærdstræning og testninger blev udført i løbet af dagen. Da rotterne nåede 85% af deres "fri-føde-vægt", fik de 3 foderpiller (Labena) pr. dag og fik fri adgang til vand. To dage før træningen begyndte, blev dyrene gjort bekendt med 45 mg præcisions-piller (Bioserv Inc.), som senere blev 20 brugt til reinforcement i labyrinten.

Der blev anvendt den samme kirurgiske procedure som i de passive undgåelses- og Morris svømmelabyrint-forsøg.

Procedure

En gruppe på 20 rotter, som først blev anvendt i en passiv undgåel- 25 ses-test, blev trænet i den nye labyrint 7 uger efter injektion. Efter en træningsperiode på 6 dage blev der indført en 2 timers forsinkelse.

Man lod rotterne opsamle 4 piller, hvorefter de blev bragt fra labyrinten tilbage til deres bure. Efter 4 timers forsinkelse blev de ført tilbage til labyrinten, indtil de opsamlede de 4 resterende 30 piller, eller indtil der var gået 5 minutter.

Eksperiment 1

Den samme gruppe rotter blev injiceret med AF102B (5 mg/kg, i.p.) eller saltvand (1 ml/kg, i.p.) umiddelbart efter opsamling af de første 4 stykker lokkemad. Virkningerne på ydeevnen blev testet 2 35 timer efter injektion. Hver rotte fik begge behandlinger 2 gange. Et DK 173084 B1 50 1-dags interval blev indført mellem AF102B-behandlingen og saltvandsbehandlingen og 2 dage mellem behandlingssættene.

Eksperiment 2

En uge senere blev den samme gruppe rotter injiceret med physostigmin 5 (0,1 mg/kg, i.p.) eller saltvand (1 ml/kg, i.p.) umiddelbart efter opsamling af de første 4 stykker lokkemad. Virkningerne på ydeevnen blev testet 2 timer efter injektion.

Resultater og diskussion

Eksperiment 1 10 Behandlingen med AF102B (5 mg/kg, i.p.) umiddelbart efter fuldførelse af de første fire valg havde en signifikant virkning på ydeevnen (fig.

18). Analyse af resultaterne i et 2-faktorer-blandet-design: gentagne målinger på én faktor viste en signifikant (p<0,001, F * 17,5) formindskelse i gennemsnitsantallet af fejl for de AF64A-injicerede 15 rotter sammenlignet med deres kontroller (AF64A-injicerede rotter behandlet med saltvand). En signifikant effekt (p<0,005, F = 14,5) blev fundet mellem prøver (behandling med AF102B versus saltvand) og betingelser (AF64A i.c.v.-injektioner versus CSF i .c.v.-injektioner).

AF102B-behandlingen forbedrede kun ydeevnen, når rotterne forinden var 20 blevet i.c.v.-injiceret med AF64A.

Eksperiment 2

Behandling med physostigmin (0,1 mg/kg, i.p.) havde ingen signifikant virkning på ydeevnen hos rotterne (p>0,05, F = 4,03) (fig. 19), skønt der er en tendens til en tilsyneladende forbedring efter physostigmin.

25 Forskellene mellem de AF64A-injicerede rotter og de CSF-injicerede rotter forblev imidlertid signifikant (p<0,005, F = 11,4).

KONKLUSIONER

Strålearmslabyrint-proceduren var yderst succesrig med hensyn til at bevise, at : (1) der er en signifikant forskel på ydeevnen for AF64A 30 sammenlignet med de CSF-behandlede rotter, og (2) hukommelsesforringelse kunne reverteres ved hjælp af AF102B (5 mg/kg, i.p.).

Resumé af adfærdsundersøgel seme

Den følgende tabel resummerer de relevante data, hvad angår AF102B, oxotremorin og pirenzepin, hvilket belyser de enestående egenskaber DK 173084 B1 51 ved forbindelsen ifølge opfindelsen som en åbenbar Mj-type-agonist.

Skønt eksperimenterne i alle forsøgene ikke blev udført på den samme art (mus eller rotter) og under de samme eksperimentelle betingelser, fremstår der en slående parallellitet i de relative aktivitetsprofiler 5 mellem pirenzepin (Mj-antagonist) og AF102B (Mj-agonist). Med begge forbindelser forekommer der hukommelsesforringelser (induceret af pirenzepin) og reversering af de AF64A-inducerede hukommelsesforringelser (forårsaget af AF102B) ved meget lavere doser end de doser, der er nødvendige til at modvirke de centrale virkninger, der in-10 duceres af oxotremorin (i forbindelse med pirenzepin), eller til at inducere den samme slags centrale bivirkninger (i forbindelse med AF102B).

De cognitive funktioner, som er medieret af en Mj-antagonist (pirenzepin) eller en M]-agonist (AF102B), er således mere sensitive over for 15 sådanne cholinerge interventioner end andre centrale virkninger såsom tremor eller antinociception. Dette fund er yderst vigtigt, eftersom det kan anvendes til at forklare, hvorfor AF102B har en sådan bemærkelsesværdig selektivitet, og hvorfor den kan anses for at være en excellent kandidat som medikament til behandling af SDAT.

20 Oxotremorin i forskellige in vivo- og in vitro-tests

Test Pirenzepin (PNZ) AF102B

(M,-antagonist) (M,-agonist)

Mg/mus, i.c.v. mg/kg, rotter* 25 Passiv undgåelse 0,1 (a) 0,1-1 i.p. (b) 1 p.o. (b) tremor 5,8 (c) >60-80 i.p.**(d) >78 i.p.(d) >100 p.o.(d) 30 antinociception 4.6(c) 60 p.o.**(d) 20 i.p.**(d)

Oxotremorin AF102B

35 EC*,, M

[3H] -PNZ-binding 8 x 10'7 4 x 10‘7 [3H] -QNB-binding 3 x 10"6 10'5

Claims (30)

1. Quinuclidinderivater, kendetegnet ved, at de har den almene formel I 25 og geometriske isomerer, enantiomerer, diastereoisomerer, racemater og/eller syreadditionssalte deraf, hvor Z betegner betegner gruppen >CR*R1 eller to hydrogenatomer,· R1 er valgt fra gruppen bestående af hydrogen, alkyl, cyclopentyl, cyclohexyl og aryl, og R1 er valgt fra gruppen bestående af alkyl, cyclopentyl, cyclohexyl, aryl og diarylal-30 kyl. Quinuclidinderivater ifølge krav l, kendetegnet ved, at Z betegner gruppen >CR1R1, R1 er hydrogen, og R1 er valgt fra gruppen bestående af alkyl og diarylalkyl. DK 173084 B1 53

3. Quinuclidinderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Z betegner gruppen >CRlR2, R* er alkyl, og R2 er valgt fra gruppen bestående af cyclopentyl, cyclohexyl, aryl og diarylalkyl.

4. Quinuclidinderivat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R1 er hydrogen, og R2 er valgt fra gruppen bestående af methyl, ethyl, propyl, phenyl og diphenylmethyl.

5. Quinuclidinderivat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at R* er methyl, ethyl, og R2 er phenyl.

6. Quinuclidinderivat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at R1 er hydrogen, og R2 er methyl, herunder de enkelte geometriske isomerer deraf.

7. Geometrisk isomer af forbindelsen ifølge krav 6, kendetegnet ved, at saltsyresaltet deraf har det relativt 15 laveste smeltepunkt (cis-isomeren). og saltsyresaltet deraf.

8. Geometrisk isomer af forbindelsen ifølge krav 6, kendetegnet ved, at saltsyresaltet deraf har det relativt højeste smeltepunkt (trans-isomeren). og saltsyresaltet deraf.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af quinuclidinderivater ifølge krav 20 l, hvor Z betegner gruppen >CR*R2, kendetegnet ved, at 3-hydroxy-3-mercaptomethylquinuclidin omsættes med en carbonylforbindelse med den almene formel r'-CO-R2, og det ønskede produkt isoleres fra reaktionsblandingen.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, 25 kendetegnet ved, at reaktionen udføres i nærværelse af et inert organisk opløsningsmiddel.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det inerte organiske opløsningsmiddel omfatter ét eller flere medlemmer valgt fra gruppen bestående af di-30 chlormethan og chloroform.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved, at den udføres i nærværelse af en syrekatalysator. DK 173084 B1 54

13. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at reaktionen udføres i en atmosfære af nitrogen ved en temperatur i intervallet fra ca. 20 til ca. 30°C i nærværelse af bortrifluoridetherat som katalysator og i et opløsnings-5 middelmedium, som omfatter ét eller flere medlemmer valgt fra gruppen bestående af dichlormethan og chloroform, og det ønskede produkt isoleres fra reaktionsblandingen.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at reaktionsingredienserne først blandes i 10 en atmosfære af nitrogen ved en temperatur mellem ca. -10 og ca. +200C, og den således opnåede blanding lades komme op på reaktionstemperaturen .

15. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at der efter isolering udføres mindst ét 15 af følgende trin, nemlig at det ønskede produkt adskilles i sine geometriske isomerer, det omdannes fra fri base til dets syreadditionssalt, og/eller det omdannes fra dets syreadditionssalt til den frie base.

16. Quinuclidinderivat ifølge krav 1, 20 kendetegnet ved, at Z betegner to hydrogenatomer.

17. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse ifølge krav 16, kendetegnet ved, at epoxidet af 3-methylenquinuclidin omsættes med hydrogensulfid.

18. Farmaceutisk præparat, 25 kendetegnet ved, at det omfatter et quinuclidinderivat med den almene formel I ifølge krav i, hvor Z betegner gruppen >Cr'r2 eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf sammen med en inert bærer eller diluent.

19. Farmaceutisk præparat ifølge krav 18, 30 kendetegnet ved, at det er i en form, som er egnet til oral, rektal eller parenteral indgift eller til indgift ved insufflation .

20. Farmaceutisk præparat ifølge krav 18, kendetegnet ved, at det er i en form, som er egnet til 35 transdermal indgift.

21. Farmaceutisk præparat ifølge krav 18, kendetegnet ved, at det er i enhedsdoseringsform. DK 173084 B1 55

22. Farmaceutisk præparat til transdermal indgift, kendetegnet ved, at det omfatter et quinuclidinderivat med den almene formel I ifølge krav l, hvor z betegner gruppen >CR*R2, eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf såvel som en 5 fedtsyre med lav molekylvægt.

23. Farmaceutisk præparat ifølge krav 18, kendetegnet ved, at quinuclidinderivatet med den almene formel I er som defineret i krav 7.

24. Farmaceutisk præparat ifølge krav 23, 10 kendetegnet ved, at det yderligere indeholder én eller flere forbindelser valgt fra gruppen bestående af physostigmin, tetra-hydroaminoacridin, cholin, lecithin, piracetam, aniracetam, pramirace-tam, oxiracetam, 4-aminopyridin, 3,4-diaminopyridin og somatostatin.

25. Farmaceutisk præparat, som er i enhedsdoseringsform, 15 kendetegnet ved, at det omfatter et quinuclidinderivat med den almene formel I ifølge krav l, hvor Z betegner gruppen >CRlR2, eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf i en mængde i intervallet fra ca. 0,5 til ca. 500 mg sammen med en inert bærer eller diluent.

26. Farmaceutisk præparat ifølge krav 25, kendetegnet ved, at det omfatter quinuclidinderivatet eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf, i en mængde i intervallet fra ca. 5 til ca. 100 mg.

27. Farmaceutisk præparat ifølge krav 26, 25 kendetegnet ved, at det omfatter quinuclidinderivatet eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf i en mængde i intervallet fra ca. 10 til ca. 50 mg.

28. Farmaceutisk præparat ifølge krav 25, kendetegnet ved, at quinuclidinderivatet med den almene 30 formel i er som defineret i krav 7.

29. Farmaceutisk præparat ifølge krav 28, kendetegnet ved, at det yderligere indeholder én eller flere forbindelser valgt fra gruppen bestående af physostigmin, tetra-hydroaminoacridin, cholin, lecithin, piracetam, aniracetam, pramirace-35 tam, oxiracetam, 4-aminopyridin, 3,4-diaminopyridin og somatostatin.

30. Farmaceutisk præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 25-29, DK 173084 B1 56 kendetegnet ved, at det er tilpasset til peroral indgift.

31. Farmaceutisk præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 25-29, kendetegnet ved, at det er tilpasset til parenteral ind-5 gift.