NO168944B

NO168944B - Fremgangsmaate for fremstilling av alfa-l-aspartyl-l-fenylalanin-methylester eller hydrokloridet derav

Info

Publication number: NO168944B
Application number: NO861189A
Authority: NO
Inventors: Ryuichi Mita; Toshio Katoh; Chojiro Higuchi; Takeshi Oura; Akihiro Yamaguchi
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date: 1985-03-26
Filing date: 1986-03-25
Publication date: 1992-01-13
Also published as: NO168944C; NO861189L; DE3674830D1; EP0200311A3; MX161989A; US4778916A; ES8705365A1; KR890005038B1; CA1278400C; AU5435486A; SU1556542A3; EP0200311A2; EP0200311B1; ES553390A0; BR8601335A; AU561384B2; KR860007283A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av a-L-aspartyl-L-fenylalaninmethylester eller dets hydroklorid. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av a-L-aspartyl-fenylalaninmethylester eller dets hydroklorid, kjennetegnet ved at N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid kondenseres med L-fenylalanin i vann i en vektmengde på ti ganger eller mindre av mengden av fenylalanin, i nærvær eller fravær av methanol i en mengde på 6 mol eller mindre pr. mol L-fenylalanin ved en pH i området 7-12, under dannelse av N-formyl-L-aspartyl-L-fenylalanin, reaksjonsblandingen surgjøres suksessivt med saltsyre i nærvær av methanol, hvori konsentrasjonen av saltsyre er 3-30 vekt% uttrykt ved konsentrasjonen definert som [HC1]/[HC1 + H20], og hvor methanol anvendes i en mengde på 1-6 mol pr. mol L-fenylalanin, uten isolering av N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin for å bringe dette i kontakt med saltsyre i nærvær av methanol og derved utskille og separere a-L-aspartyl-L-fenylalanin-methylesterhydroklorid, og nøytralisere angitte hydroklorid om ønsket.

a-L-aspartyl-L-fenylalaninmethylester (heretter forkortet som ot-APM) er en forbindelse som vanligvis angis so "Aspartame". Den har en søthet på ca. 200 ganger søt-heten av rørsukker og er således stadig økende etterstrebet som et diet-søtningsmiddel.

Utallige kjemiske fremstillingsprosesser for a-APM er hittil blitt beskrevet. Det kan således nevnes et utall av prosesser, for eksempel (1) en fremgangsmåte som omfatter kondensering av hydrokloridet av aspartinsyreanhydrid og L-fenylalaninmethylester (japansk patentpublikasjon 40069/ 1976), (2) en fremgangsmåte som omfatter kondensering av N-beskyttet asparaginsyreanhydrid og L-fenylalaninmethylester, etterfulgt av avbeskyttelse (japansk offentliggjørelses-skrift 1370/1971 og 113841/1976), (3) en fremgangsmåte som omfatter omsetning av N-beskyttet asparaginsyre-(3-benzyl-ester med L-fenylalaninmethylester i nærvær av et konden-seringsmiddel etterfulgt av avbeskyttelse (japansk offent-liggjørelsesskrift 130846/1984) og (4) en fremgangsmåte som omfatter omsetning av N-carboxyasparaginsyreanhydrid og L-fenylalaninmethylester (japansk offentliggjørelsesskrift 86557/1973).

Alle disse fremgangsmåter anvender imidlertid L-fenylalaninmethylester som et av råmaterialene, hvilket krever komplekse trinn for methylforestring av L-fenylalanin før reaksjonen med de aktive derivater av asparaginsyre.

I flere undersøkelser har ennvidere blitt fast-slått at L-fenylalaninmethylester er en forbindelse hvori dens to fri molekyler i en løsning er tilbøyelig til å kon-densere og syklisere til 2,5-dibenzyl-diketopiperazin. Dette faktum kan være ansvarlig for at forskjellige ulemper finner sted ved industriell produksjon av a-APM.

Følgelig er det ønskelig å utvikle en fremgangsmåte som er fri for disse ulemper ved fremstilling av a-

APM, dvs. en fremgangsmåte hvori L-fenylalaninmethylester anvendes som et råmateriale.

Som en fremgangsmåte for fremstilling av a-APM

som ikke gjør bruk av L-fenylalaninmethylester er det funnet en fremgangsmåte for fremstilling av a-APM som omfatter kondensering av N-formylasparaginsyreanhydrid med L-fenylalanin i iseddik under dannelse av N-formyl-a-L-asparagyl-L-fenylalanin, deformulering av N-formyl-a-L-asparagyl-L-fenylalanin under dannelse av a-L-asparagyl-L-fenylalanin, og forestring av angitte forbindelser i methanol (japansk patentpublikasjon 26133/1980) og en fremgangsmåte hvori forestrings-trinnet for a-L-asparagyl-L-fenylalanin til a-APM forbedres (japansk offentliggjørelsesskrift 82752/1978).

Da den førstnevnte prosess imidlertid utfører for-estringsreaksjonen i en hovedsakelig ikke-vandig løsning, foreligger det praktisk talt ingen mulighet for selektivitet ved reaksjonen, slik at ikke bare den beregnede forestring men også forestringen av B-carboxylgruppen av asparaginsyre såvel som en diestring finner sted i stor grad. Derfor lider fremgangsmåten av slike ulemper som et lavt utbytte av a-APM.

Den sistnevnte fremgangsmåte som var en forbedring av den førstnevnte fremgangsmåte, utfører methylforestring av a-L-asparagin-L-fenylalanin i nærvær av en betydelig mengde vann, og det således dannede a-APM omsettes som dets hydroklorid som er tungt løselig i reaksjonssystemet, som derved øker selektiviteten mot a-APM. Utbyttet ved isolering av a-APM i den sistnevnte fremgangsmåte er imidlertid maksimalt 50 - 60 % (basert på a-L-asparagin-L-fenylalanin) og således tilstede.

Som en annen fremgangsmåte hvori L-fenylalanin-methy lester ikke anvendes, er det nylig blitt beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av a-APM som omfatter kondensering av N-carboxylsyreanhydridet av L-asparaginsyre-6-methylester og L-fenylalanin under dannelse av a-L-asparagin-L-fenylalanin-3-methylester, hvorpå angitte forbindelse underkastes intramolekylær omestring i en vandig saltsyre-løsning inneholdende methanol (japansk offentliggjørelses-skrift 225152/1984 og 225153/1984).

Ved denne fremgangsmåte har forestringen for fremstilling av L-asparaginsyre-Ø-methylester imidlertid lav selektivitet og således lavt utbytte. Ennvidere er dets N-carboxylsyreanhydrid, som fremstilles ved omsetning av L-asparaginsyre-B-methylester med fosgen, tilbøyelig til å polymerisere når den bringes i kontakt med base eller av andre grunner. Denne fremgangsmåte er derfor ufordelaktig ut fra et industrielt synspunkt.

Som ovenfor beskrevet medfører de konvensjonelle fremstillingsprosesser for a-APM flere kompliserte trinn og medfører ufordelaktige trekk når det gjelder stabilitert av mellomprodukter og i utbytte eller sikkerhet. Ifølge den foreliggende kjente teknikk finnes det således en effektiv prosess for fremstilling av a-APM.

En ny fremstillingsprosess for a-APM hvori a-L-asparagin-L-fenylalanindimethylester hydrolyseres i en vandig methanol-saltsyreløsning er i det siste blitt beskrevet (japansk offentliggjørelsesskrift 219258/1984). Ifølge denne beskrivelse fremstilles a-L-asparagin-L-fenylalanin-dimethylester-utgangsforbindelsen <y>.ed deformulering og forestring av N-formyl-a-L-asparagin-L-fenylalaninmethylester eller ved kondensering av N-carboxylsyreanhydridet av L-asparaginsyre-3-methylester med L-fenylalaninmethylester. Således anvendes det ved fremgangsmåten L-fenylalaninmethylester for fremstilling av utgangsmaterialet, og prosessen innbefatter derfor de ovenfor beskrevne problemer.

Foreliggende oppfinnere har anstrengt seg for å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av a-APM på en effektiv måte i lys av de eksisterende a-APM-fremstillings-teknikker, uten å anvende L-fenylalaninmethylester som innbefatter problemer når det gjelder stabilitet i- oppløsning som ovenfor beskrevet. I betraktning av det faktum at fremstillingsprosesser for a-APM generelt omfatter, som ovenfor beskrevet, flere trinn fra utgangsmaterialet til a-APM-prdoukter, har foreliggende oppfinnere utført grundige undersøkelser med hensyn til en effektiv prosess for fremstilling av a-APM ved forenkling av trinnene i størst mulig grad.

Som et resultat av dette har foreliggende oppfinnere funnet at kondensasjonsreaksjonen av N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid og L-fenylalanin praktisk talt ikke fremkal-ler noen biproduksjon av forurensninger og gir a-isomeren (N-formyl-a-L-asparagin-L-fenylalanin) i meget større mengder enn g-isomeren (N-formyl-B-L-asparagin-L-fenylalanin) i vann eller et vandig medium inneholdende methanol. Når ennvidere reaksjonen utføres i en begrenset mengde av kondensasjons-løsningsmiddel, er det funnet at reaksjonsblandingen kan underkastes ytterligere reaksjon uten å isolere kondensa-sjonsproduktet ved å bringe det i kontakt med saltsyre i nærvær av methanol, som derved muliggjør fremstilling av a-APM i en reaktor.

Når flere trinn ved reaskjonen fra utgangsmaterialet til det ønskede a-APM utføres i en reaktor, taes det generelt i betraktning at et utall forurensninger som oppstår i hvert reaksjonstrinn utviser en ugunstig virkning på den beregnede reaksjon og kvaliteten av a-APM-produktet. Spesifikt vil kondensasjonsreaksjonen for N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid og L-fenylalanin gi g-isomeren som biprodukt i et utbytte på 20 % eller mer, i tillegg til den beregnede a-isomer. Ennvidere inneholder ofte kondensasjonsreaksjonsblandingen N-formyl-L-aspartinsyre og/eller dens methylester dannet ved omsetning av N-formmyl-L-asparaginsyreanhydrid med vann og/eller methanol for å åpne ringen, og i enkelte til-feller også uomsatt L-fenylalanin og andre forbindelser, som danner et relativt komplisert system.

Foreliggende oppfinnere har imidlertid funnet at når N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid og L-fenylalanin omsettes med hverandre i vann eller et vannmedium inneholdende methanol, og den resulterende reaksjonsblanding deretter bringes i kontakt med saltsyre i nærvær av methanol, forløper reaksjonen innbefattende deformulering under milde betingelser under dannelse av a-APM, som sammen med andre forbindelser dannet ved reaksjonen, utfelles ene og alene ut av systemet som dets hydroklorid uten å bli påvirket av forskjellige forurensninger. Foreliggende oppfinnelse er blitt fullført på basis av denne antagelse.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innbefatter følgende to prosessutførelsesformer.

Den første fremgangsmåteutførelsesform omfatter: Kondensering av N-formyl-L-asparaginsyreanhyrid med L-fenylalanin i vann ved en pH i området 7-12 under dannelse av N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin; surgjøring av reaksjonsblandingen suksessivt med saltsyre i nærvær av methanol uten isolering av det dannede N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin for å bringe det i kontakt med saltsyre i nærvær av methanol, og derved utfelle a-APM-hydroklorid; separering av a-APM-hydrokloridet; og nøytralisering av angitte hydroklorid om nødvendig, ved dannelse av a-APM eller dets hydroklorid.

Den andre fremgangsmåteutførelsesform omfatter: Kondensering av N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid med L-fenylalanin i vann inneholdende methanol i en mengde på 6 ekvivalenter eller mindre til L-fenylalanin ved en pH i området 7-12, under dannelse av N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin; surgjøring av reaksjonsblandingen suksessivt med saltsyre uten isolering av N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin for å bringe det i kontakt med saltsyre i nærvær av methanol, og derved utfelle a-APM-hydroklorid; separering av a-APM-hydrokloridet; og nøytralisering av angitte hydroklorid etter behov, under dannelse av a-APM eller dets hydroklorid.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er fordelaktig ved at L-fenylalanin kan anvendes direkte i stedet for L-fenylalaninmethylester som innbefatter problemer når det gjelder dets stabilitet i løsning. Ennvidere er det ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen mulig å fremstille det ønskede produkt, a-APM, fra L-fenylalanin anvendt som et råmateriale i en reaktor.

Det er blitt beskrevet et utall prosesser for fremstilling av a-APM ved hjelp av isolerte mellomprodukter. Sammenlignet med disse prosesser kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstille a-APM uten å tape det kostbare råmateriale, L-fenylalanin, og er meget effektivt ut fra et prosessmessig synspunkt. I tillegg gir Ø-isomeren, som biproduseres ved kondensasjonen av N-formyl-L-aspartinsyreanhydrid med L-fenylalanin, forskjellige forbindelser ved deformulering og forestring ved at den bringes i kontakt med saltsyre i nærvær av methanol. Disse forbindelser utviser imidlertid ingen ugunstig effekt på utskillelsen av a-APM-hydroklorid, men beveger seg utelukkende til modervæsken fra hvilken det utskilte a-APM-hydroklorid separeres. Hvis denne modervæske derfor underkastes hydrolyse, gjenvinnes L-fenylalanin og L-asparaginsyre som råmateriale i relativt høye konsentrasjoner. Når følgelig disse forbindelser isoleres fra modervæsken etter hydrolysen, er det unødvendig å underkaste den ene konsentrering som generelt krever en betydelig mengde av energi.

Foreliggende oppfinnelse gjør bruk av N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid som et råmateriale. N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid kan fremstilles lett etter hvilken som helt kjent fremgangsmåte innen faget, for eksempel ved omsetning av L-asparaginsyre med maursyre og eddiksyrean-hydrid.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kondenseres N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid med L-fenylalanin i vann eller vann inneholdende methanol ved en pH i området 7-12 under dannelse av N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin.

N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid kan anvendes i en støkiometrisk mengde eller mer i forhold til L-fenylalanin, men bør ikke anvendes i urimelig overskytende mengder. Generelt anvendes N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid i en mengde på mindre enn 2 mol pr. mol L-fenylalanin. Anvendelse av N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid i en mengde mindre enn den ekvivalente i forhold til L-fenylalanin behøver ikke å skape noen problemer ut fra et reaksjonsstandpunkt. Det kan imidlertid bevirke at noe av det kostbare L-fenylalanin forblir uomsatt og dette er således ikke fordelaktig ut fra et øko-nomisk synspunkt.

KOndensasjonsreaksjonen av N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid og L-fenylalanin utføres i vann eller i vann inneholdende methanol. Vann kan anvendes i en mengde på 1 - 10 ganger vekten av L-fenylalanin anvendt som råmateriale, i lys av det faktum at den resulterende reaksjpnsblanding som sådan, suksessivt underkastes en a-APM-dannende reaksjon etter kondensasjonsreaksjonen, og ut fra et reaksjonsteknisk synspunkt. Mengden av vann kan fortrinnsvis være 8 ganger mengden eller mindre enn av L-fenylalanin.

Når kondensasjonsreaksjonen utføres i vann inneholdende methanol, kan mengden av anvendt methanol være 6 ekvivalenter eller mindre basert på L-fenylalanin. Enhver methanolmengde over 6 ekvivalenter i forhold til L-fenylalanin vil bevirke at konsentrasjonen av methanol i det suksessive a-APM-dannende trinn øker, og således at løselig-heten av a-APM-hydroklorid øker, med det resultat at utbyttet av a-APM ugunstig vil bli nedsatt.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres praktisk kondensasjonen av N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid med L-fenylalanin på følgende måte: L-fenylalanin og et alkali oppløses eller suspenderes i en gitt mengde av vann eller vann inneholdende methanol. Deretter tilsettes N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid litt etter litt til den resulterende løsning eller suspensjon, enten kontinuerlig eller satsvis. Under tilsetningen tilsettes dråpevis en vandig alkalisk løsning til reaksjonsvæsken for å justere og opprettholde pH i området 7-12. Som alkali for anvendelse ved oppløsning eller suspendering av L-fenylalanin i begynnelsestrinnet og ved justering av pH under reaksjonen kan hensiktsmessig anvendes hydroxyder, oxyder, carbonater eller hydrogencarbonater av alkalimetaller slik som lithium, natrium og kalium, og hydroxyder, oxyder, carbonater eller hydrogencarbonater av jordalkalimetaller slik som kalsium og magnesium. Ingen problemer eller vanskeligheter vil opp-stå selv om organiske baser representert med triethylamin, som er inaktive overfor anhydridet, anvendes.

.Under sterkt alkaliske betingelser hvori pH på reaksjonsvæsken overskrider 12, akselereres ringåpningsreak-sjonen av N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid av vann eller methanol, hvorved en forøket del av

N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid brukes, samtidig som andre biprodukter enn 3-isomeren ugunstig dannes. Ennvidere vil en sterkt sur pH under reaksjonen forårsake at reaksjonen med L-fenylalanin retarderes ufordelaktig og at ringåpnings-reaskjonen av anhydridet med vann eller methanol preferen-sielt finner sted.

Reaksjonstemperaturen kan være 50° C eller lavere, eller fortrinnsvis 30° C eller lavere, med det formål å for-hindre ringåpning av N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid med vann eller methanol så langt som mulig. Selv om ingen be-stemte restriksjoner finnes med hensyn til den nedre grense, er det fordelaktig å utføre reaksjonen ved en temperatur over -20° C ut fra et industrielt synspunkt. I kondensasjonsreaksjonen er det ennvidere mulig å anvende organiske løsningsmidler som er inaktive overfor reaksjonen og som ikke innvirker på avsetningen av a-APM-hydroklorid i det etterfølgende a-APM-dannelsestrinn.

N-formyl-a-L-aspartylfenylalanin dannes således som det primære produkt ved kondensasjonsreaksjonen av N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid med L-fenylalanin i vann eller vann inneholdende methanol. som ovenfor angitt vil isomeren, N-formyl-3-L-aspartylfenylalanin delvis biproduseres. Dannelsesforholdet mellom a-isomer og 3-isomer er vanligvis i området 70 : 30- 80 : 20, og det totale utbytte av det ønskede produkt og 3-isomeren er generelt 95 % eller mer basert på L-fenylalanin. Det således dannede N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin isoleres ikke ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, men reaksjonsblandingen som sådan underkastes suksessivt a-APM-dannelsestrinnet som nedenfor beskrevet.

I det andre trinn ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen dannes a-APM suksessivt i en reaktor fra den ovenfor angitte kondensasjonsreaksjonsvæske inneholdende N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin. Spesifikt kan dette utføres ved surgjøring av reaksjonsvæsken med saltsyre i nærvær av methanol for å bringe den i kontakt med saltsyre i nærvær av methanol og derved utfelle det således dannede a-APM fra reaksjonssystemet som dets hydroklorid.

For å surgjøre den ovenfor angitte kondensasjons-reaks jonsblanding med saltsyre, innføres gassformig hydrogenklorid deri eller konsentrert saltsyreløsning tilsettes der-til.

Den resulterende blanding bringes således i kontakt med saltsyre i nærvær av methanol, som derved forårsaker at deformuleringen og forestringen av N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin forløper med det resultat at a-APM dannes og utskilles av systemet i form av dets hydroklorid.

Mengden av tilstedeværende methanol i reaksjonssystemet i det a-APM-dannende trinn kan være minst én ekvivalent i forhold til N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin dannet i kondensasjonsreaksjonen, eller fortrinnsvis en ekvivalent eller mere i forhold til L-fenylalanin-utgangsmaterialet. Med hensyn til den øvre grense av mengden av methanol, vil anvendelse av urimelig overskytende mengder av methanol forårsake at konsentrasjonen av methanol i reaksjonssystemet øker og således at løseligheten av a-APM-hydrokloridet dannet ved reaksjonen økes. Følgelig vil dette vanskeliggjøre avsetningen av a-APM-hydroklorid, samtidig som det dannede a-APM ytterligere forestres til en økende mengde av det ugunstige biprodukt a-L-aspartyl-L-fenylalanindimethylester. Derfor anvendes methanol generelt i en mengde på 6 mol eller mindre pr-.- mol L-fenylalanin eller fortrinnsvis i en konsentrasjon på 30 vekt% eller mindre med hensyn til konsentrasjonen definert som (methanol)/(methanol + HC1 + H20)) X 100.

Methanol kan tilsettes til reaksjonsvæsken dannet ved kondensasjonen av L-fenylalanin med N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid enten før eller etter surgjøring med saltsyre. Når imidlertid kondensasjonsreaksjonen utføres i vann inneholdende methanol i en mengde på 1 mol eller mer pr. mol L-fenylalanin, er det mulig å danne a-APM uten ytterligere tilsetning av methanol.

Mengden av saltsyre som skal bringes i kontakt med N-formy1-a-L-asparty1-L-fenylalanin kan være 1-10 ekvivalenter i forhold til L-fenylalanin-utgangsmaterialet. Et høyt utbytte av a-APM ved foreliggende fremgangsmåte oppnås ennvidere ved suksessiv avsetning av a-APM dannet ved reaksjonen fra systemet i form av dets hydroklorid.

Konsentrasjonen av saltsyre i reaksjonssystemet under kontakten er derfor også en vesentlig faktor for å lette avsetningen av a-APM-hydroklorid. Konsentrasjonen av saltsyre er 3 - 34 vekt%, eller fortrinnsvis 5-30 vekt% uttrykt ved konsentrasjonen definert som ((HCl)/(HC1 + 1^0)): Hvis konsentrasjonen av saltsyre er for lav, for-hindres den beregnede forestring i betydelig grad. Hvis på den annen side konsentrasjonen av saltsyre er for høy, økes løseligheten av det dannede a-APM-hydroklorid, og vanskelig-gjøres således i å utfelles fra reaksjonssystemet, slik at utbyttet av a-APM ugunstig nedsettes og splitting av peptidbindingen er tilbøyelig til å finne sted.

Temperaturen ved kontakten med saltsyre er under reaksjonsblandignens kokepunkt, eller mere fortrinnsvis 10 - 60° C.

Hvis temperaturen er for lav, vil den ønskede reaksjon innbefattende deformulering retarderes, slik at det vil ta meget lang tid å utføre reaskjonen, hvilket ikke er gunstig ut fra et industrielt synspunkt. På den annen side vil for høye temperaturer under kontakten ikke bare bevirke ugunstige bireaksjoner slik som splitting av peptidbindingen, men også øke løseligheten av a-APM-hydrokloridet i reaksjonssystemet. Som et resultat av dette vil utfellingen av a-APM-hydroklorid ut av reaksjonssystemet vanskeliggjøres, hvilket resulterer i reduksjon i utbyttet av a-APM.

Når kondensasjonsreaksjonsblandingen ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen bringes i kontakt med saltsyre, dannes et tilsvarende uorganisk salt ved nøytralisering mellom et alkali anvendt i kondensasjonsrealcsjonen og saltsyren. Hvis saltet utfelles fra reaksjonssystemet ved kontakttids-punktet, er det mulig å separere dette under kontakten.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utskilles a-APM dannet ved reaksjonen fra reaksjonssystemet som dets hydroklorid. Etter reaksjonen isoleres følgelig a-APM-hydroklorid ved filtrering fra reaksjonsblandingen etter at denne er blitt avkjølt etter behov. Det således isolerte a-APM-hydroklorid kan omdannes til fritt a-APM ved nøytralisering i vann i suspensjon eller oppløsning med et alkali slik som natriumhydroxyd, natriumcarbonat, natrium-hydrogencarbonat eller ammoniakk.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved de etter-følgende eksempler. De analytiske betingelser for væskekromatografi ved høy hastighet anvendt i eksemplene, var som følger:

Eksempel 1

I 66 g vann ble oppløst 5,0 fast natriumhydroxyd og deretter 19,8 g (0,12 mol) L-fenylalanin, og den resulterende løsning ble avkjølt til 0° C. Til løsningen ble langsomt tilsatt 18,8 g (0,13 mol) N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid ved 0 - 5° C i 30 minutter. Under tilsetningen ble 45 % vandig natriumhydroxydløsning dråpevis tilsatt til reaksjonsvæsken for å holde pH ved 9 - 11. Deretter ble reaksjonen utført ved samme temperatur i 1 time.

En del av reaksjonsvæsken ble analysert ved væske-kromatograf i med høy hastighet, med det resultat at dannelsesforholdet mellom N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin og N-formyl-6-l-aspartyl-L-fenylalanin var 75,4 : 24,6, mens det totale utbytte av forbindelser var 96,8 % basert på L-fenylalanin.

Til reaksjonsblandingen ble tilsatt 14,4 g methanol, hvoretter det ble innført 26,8 g hydrogenklorid ved en temperatur under 55° C. Den resulterende reaksjonsblanding ble underkastet omsetning ved 50 - 55° C i 1 time. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til 25° C og underkastet ytterligere reaksjon ved 20 - 25° C i 4 dager.

Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til under 5° C og ble omrørt ved 0 - 5° C i 3 timer. Det derved utfelte a-APM-hydroklorid ble filtrert og vasket med kaldt vann under dannelse av en våt kake av hvitt a-APM-hydroklorid.

Den våte kake ble analysert ved væskekromatografi med høy hastighet, med det resultat at den inneholdt 19,3 g a-APM i et utbytte på 54,7 % basert på L-fenylalanin-utgangsmaterialet.

Eksempel 2

Den våte kake av a-APM-hydroklorid erholdt i eksempel 1 ble suspendert i 200 ml vann og ble nøytralisert ved 20 - 25° C med 20 % vandig natriumcarbonatløsning (pH = 5,0). Den resulterende suspensjon ble avkjølt til 5° C og omrørt ved samme temperatur i 1 time. De derved utskilte krystaller ble filtrert, vasket med kaldt vann og tørket i vakuum under dannelse av 17,4 g fritt a-APM.

Analyse av dette ved væskekromatografi med høy hastighet viste at ingen forurensninger ble påvist i a-APM.

Den spesifikke rotasjon av a-APM var som følger:

20

(a)D = 16,07 (C = 4, 15N maursyre).

Eksempel 3

I 110 g vann ble oppløst 7,9 g kaliumhydroxydflak og deretter 19,8 g (0,12 mol) L-fenylalanin, og den resulterende løsning ble avkjølt til 0° C. 18,8 g (0,13 mol) N-formyl-asparaginsyreanhydrid ble langsomt tilsatt til den resulterende vandige løsning ved 0 - 5° C i 30 minutter. Under tilsetningen ble 16,0 g 50 % vandig kaliumhydroxyd-løsning samtidig dråpevis tilsatt til reaksjonsvæsken for å opprettholde pH ved 8-11. Reaksjonsvæsken ble deretter omrørt i 1 time ved samme temperatur.

En del av reaksjonsvæsken ble analysert ved væske-kromatograf i med høy hastighet, med det resultat at dannelsesforholdet mellom N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin og N-formyl-3-L-aspartyl-L-fenylalanin ved 77 : 23, mens det totale utbytte av disse forbindelser var 98,9 %.

Til reaksjonsblandingen ble tilsatt 19,2 g methanol, hvorpå 40,2 g hydrogenklorid ble innført ved en temperatur under 55° C. Den resulterende reaksjonsblanding ble deretter underkastet omsetning ved 50 - 55° C i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til romtemperatur og underkastet ytterligere reaksjon ved romtemperatur i 5 dager.

Etter omsetningen ble reaksjonsblandingen avkjølt til under 5° C og ble omrørt ved 0 - 5° C i 3 timer. Det derved utfelte a-APM-hydroklorid ble filtrert og vasket med kaldt vann under dannelse av rent a-APM-hydroklorid. Analyse ved væskekromatografi med høy hastighet viste at det inneholdt 17,4 g a-APM i et utbytte på 49,3 % basert på L-fenylalanin-utgangsmaterialet.

Eksempel 4

I 66 g vann ble oppløst 5,0 g natriumhydroxyd og deretter 19,8 g (0,12 mol) L-fenylalanin, og den resulterende vandige løsning ble avkjølt til -5° C. 18,8 g (0,13 mol) N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid ble deretter tilsatt litt etter litt til den vandige løsning ved en temperatur under 10° C i løpet av ca. 1 time. Under tilsetningen ble 19,0 g 3 0 % vandig natriumhydroxydløsning dråpevis tilsatt til reaskjonsvæsken for å holde pH ved 8-11. Deretter ble reaskjonen utført ved samme temperatur i 1 time.

En porsjon av reaksjonsvæsken ble analysert ved væskekromatografi med høy hastighet, med det resultat at dannelsesforholdet mellom N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin og N-formyl-B-L-aspartyl-L-fenylalanin var 76,1 : 24,9, mens det totale utbytte av de to forbindelser var 97,4 % basert på L-fenylalanin-utgangsmaterialet.

Til reaksjonsblandingen ble tilsatt 8,3 g methanol, hvorpå 35,9 g hydrogenklorid ble innført ved en temperatur under 55° C. Den resulterende reaksjonsblanding ble underkastet omsetning ved 50 - 55° C i 1 time og ble deretter av-kjølt til 30° C. Reaksjonen ble ytterligere forsatt i 7 dager ved samme temperatur.

Etter endt reaksjon ble reaksjonsblandingen behand-let på samme måte som beskrevet i Eksempel 1, under dannelse av a-APM-hydroklorid som inneholdt 20,5 g a-APM i et utbytte på 58,1 % basert på L-fenylalanin-utgangsmaterialet.

Eksempel 5

I 66 g vann ble oppløst 14,4 g methanol, 5,1 g

fast natriumhydroxyd og 19,8 g (0,12 mol) L-fenylalanin, og deri; resulterende løsning ble avkjølt til 0° C. 18,8 g (0,13 mol) N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid ble langsomt tilsatt løsningen ved en temperatur på 0 - 5° C i løpet av 30 minutter. Under tilsetningen ble 45 % vandig natriumhydroxyd-løsning dråpevis tilsatt' til reaks jonsvæsken for å holde pH ved 9-12. Reaksjonen ble deretter utført i 1 time ved samme temperatur.

En del av reaksjonsvæsken ble analysert ved væske-kromatograf i ved høy hatighet, med det resultat at dannelsesforholdet mellom N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin og N-formyl-3-L-aspartyl-L-fenylalanin var 74,3 : 25,7, mens det totale utbytte at de to forbindelser var 98,4 % basert på L-fenylalanin-utgangsmaterialet.

29,5 g hydrogenklorid ble innført i reaksjonsblandingen ved en temperatur under 60° C, og den resulterende reaksjonsblanding ble underkastet omsetning ved 50 - 60° C

i 1 time. Den resulterende reaksjonsblanding ble avkjølt til 25° C og underkastet ytterligere omsetning ved 20 - 25° C i 4 dager. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til under

5° C og ble omrørt ved 0 - 5° C i 3 timer.

Det derved utfelte a-APM-hydroklorid ble filtrert

og vasket med kaldt vann under dannelse av en våt kake av rent a-APM-hydroklorid. Analyse av den våte kake ved væskekromatografi med høy hastighet fatslo at den inneholdt 19,8 g av a-APM i et utbytte på 56,1 % basert på L-fenylalanin-utgangsmaterialet .

Eksempel 6

Den våte kake av a-APM inneholdt i Eksempel 5 ble suspendert i 200 ml vann og ble nøytralisert ved 20 - 25° C med 20 % vandig natriumhydroxydløsning (pH = 5,0). Suspen-sjonen ble deretter avkjølt til 5° C og ble omrørt i 1 time ved samme temperatur. De derved utfelte krystaller ble filtrert, vasket med kaldt vann og tørket i vakuum under dannelse av 17,5 g fritt a-APM.

Den spesifike rotasjon av a-APM var som følger: (c)D 20

16,0 (C = 4, 15N maursyre).

Eksempel 7

I et blandet løsningsmiddel bestående av 115 g vann og 19,2 g methanol ble oppløst 7,0 g kaliumhydroxydflak og 19,8 g (0,12 mol) L-fenylalanin, og den resulterende vandige løsning ble avkjølt til 0° C. 18,8 g (0,13 mol) N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid ble langsomt tilsatt til

den vandige løsning ved en temperatur på 0 - 5° C i løpet av 30 minutter. Under tilsetningen ble 15,5 g 50 % vandig kaliumhydroxydløsning samtidig tilsatt dråpevis til reaksjonsvæsken for å holde pH ved 8-11. Reaksjonsvæsken ble deretter omrørt i 1 time ved samme temperatur.

En del av reaksjonsvæsken ble analysert ved væske-kromatograf i med høy hastighet, med det resultat at dannelsesforholdet mellom N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin og N-formyl-B-L-aspartyl-L-fenylalanin var 75,7 : 24,3 mens det totale utbytte av de to forbindelser var 98,6 %.

45,0 g hydrogenklorid ble innført i reaksjonsblandingen ved en temperatur under 55° C, og reaksjonsblandingen ble underkastet omsetning ved 50 - 55° C i 1 time. Deretter

ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og underkastet ytterligere omsetning ved romtemperatur i 6 dager. Etter endt reaksjon ble reaksjonsblandingen avkjølt til under 5° C og ble omrørt ved 0 - 5° C i 2 timer. Det således utfelte a-APM-hydroklorid ble filtrert og vasket med kaldt vann, under dannelse av rent a-APM-hydroklorid.

Analyse av a-APM-hydrokloridet ved væskekromatografi med

høy hastighet viste at det inneholdt 17,6 g a-APM i et utbytte på 49,9 % basert på L-fenylalanin-utgangsmaterialet.

Eksempel 8

I et blandet løsningsmiddel bestående av 66 g vann og 7,7 g methanol ble oppløst 5,0 g natriumhydroxyd og 19,8 g (0,12 mol) L-fenylalanin, og den resulterende løsning ble avkjølt til 5° C. 18,8 g (0,13 mol) N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid ble tilsatt litt etter litt til løsningen ved en temperatur under 10° C i løpet av 1 time. Under tilsetningen ble 19,0 g 30 % vandig natriumhydroxydløsning dråpevis tilsatt til reaksjonsvæsken for å holde pH ved 8-12. Reaksjonen ble utført i 1 time ved samme temperatur.

En porsjon av reaksjonsvæsken ble analysert ved væskekromatografi med høy hastighet, med det resultat at dannelsesforholdet mellom N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin og N-formyl-3-L-aspartyl-L-fenylalanin var 74,8 : 25,2 mens det totale utbytte av de to forbindelser var 97,8 %.

I reaksjonsblandingen ble innrørt 31,0 g hydrogenklorid ved en temperatur under 60° C, og den resulterende reaksjonsblanding ble underkastet omsetning ved 50 - 60° C

i løpet av 1 time. Det således utskilte natriumklorid ble filtrert og vasket med en liten mengde på 20 % saltsyre. Filtratet og vaskevannet ble kombinert og underkastet omsetning ved 30° C i 7 dager.

Etter endt omsetning ble reaksjonsblandingen be-handlet på samme måte som beskrevet i Eksempel 1, under dannelse av a-APM-hydroklorid som inneholdt 19,4 g a-APM i et utbytte på 55,0 % basert på L-fenylalanin-utgangsmaterialet.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av a-L-aspartyl-L-fenylalaninmethylester eller hydroklorid derav, karakterisert ved at N-formyl-L-asparaginsyreanhydrid kondenseres med L-fenylalanin i vann i en vektmengde på ti ganger eller mindre av mengden av fenylalanin, i nærvær eller fravær av methanol i en mengde på 6 mol eller mindre pr. mol L-fenylalanin ved en pH i området 7-12, under dannelse av N-formyl-L-aspartyl-L-fenylalanin, reaksjonsblandingen surgjøres suksessivt med saltsyre i nærvær av methanol, hvori konsentrasjonen av saltsyre er 3-30 vekt% uttrykt ved konsentrasjonen definert som [HC1]/[HC1 + H20], og hvor methanol anvendes i en mengde på 1-6 mol pr. mol L-fenylalanin, uten isolering av N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin for å bringe dette i kontakt med saltsyre i nærvær av methanol og derved utskille og separere a-L-aspartyl-L-fenylalanin-methylesterhydroklorid, og nøytralisere angitte hydroklorid om ønsket.