NL8802126A - Bacteriele behandeling voor het bewaren van de kwaliteit van hooi door toevoeging van micro-organismen van het genus bacillus. - Google Patents

Description

vd^/^O. κ

BACTEHIELE BEHANDELING VOOR HET BEWAREN VAN DE KWALITEIT VAN HOOI DOOR TOEVOEGING VAN MICRO-ORGANISMEN VAN HET GENUS BACILLUS

Ongeveer 150 miljoen ton hooi wordt jaarlijks geoogst in de Verenigde Staten. Het verlies aan opbrenst is verraoedelijk groter dan bij om het even welk ander gewas. Het verlies is te wijten aan ongunstige rijpheid van alfalfa, regenschade, oogstverlies op het veld 5 en opslagverlies. Het verlies beloopt typisch 20 a 40%, maar kan ook oplopen tot 70% als de weersomstandiheden ongunstig zijn. Dit verlies is het resultaat van voortgezette ademhaling van planten, bladerver-gruizeling door mechanische schade en uitloging ten gevolge van regen. Verpakking van hooi in balen bij hoger dan normale vochtigheid (25 a 10 30%) minimaliseert het risico van regenschade of mechanischeblader- schade. Verpakking van hooi in balen bij hoger dan 20% vochtigheid verhoogt echter aanzienlijk het risico van opslagverlies ten gevolge van oxidatie en beschimmeling.

Opslagverlies is een belangrijke maar controleerbare 15 oorzaak van verlies aan voedingswaarde. Hooi dat opgeslagen wordt in een gebouw bij vochtigheid onder 20% verliest normaal 5 a 10% aan droge stof. Hogere vochtigheid bevordert de werking van aërobe oxiderende micro-organismen wat leidt tot warmteproduktie. Excessieve warmte leidt tot verlies van droge stof ten gevolge van ademhaling waar-20 door CC>2 en water vrijkomt. De warmte veroorzaakt ook verlies aan voedingswaarde ten gevolge van niet-enzymatische bruiningsreacties.

De hoeveelheid opgewekte warmte is afhankelijk van de vochtigheidscon-centratie van het hooi, de omgevingstemperatuur, de bestaande microbi-ële populaties en de grootte en dichtheid van de balen.

25 Excessieve warmteschade reduceert de opneembaarheid van eiwit en de bruikbare energie. Door warmte aangetast eiwit wordt gemeten door het stikstofgehalte van de vezel te berekenen als zuur-zui- <880212$ •v » - 2 - verende vezelstikstof (acid detergent fiber nitrogen: ADIN o ADF-N). Onder normale omstandigheden mag er maar minder dan 7% van de totale stikstof in de vezel aanwezig zijn. Excessieve schade ten gevolge van warmte heeft zich voorgedaan als deze waarde 15% beloopt.

5 Schade door schimmelen tijdens de opslag kan ook sig nificant verlies veroorzaken. Slechts ongeveer 5% van de schimmels produceren mycotoxines, maar ze kunnen echter een negatieve invloed hebben op eetbaarheid en voedselopname. Het voederen van beschimmeld hooi aan dieren leidt tot significant lagere opname van droge stof, 10 verminderde gewichtstoename en slechtere voederconversie. Deze verlie zen kunnen zelfs tot 25% meer bedragen dan bij niet-beschimmelde controlegroepen .

Opgeslagen hooi bevat natuurlijk voorkomende opportunistische epifyten. Deze epifyten kunnen zowel heilzaam als schade-15 lijk zijn voor de kwaliteit van het hooi en met elkaar concurreren voor het ecologische overwicht in het opgeslagen hooi. Genoemde epifyten kunnen zowel bacteria als fungi zijn. Veel voorkomende bacteri-ële bederfveroorzakende organismen zijn diegene die lid zijn van de genera Sporosarcina en Bacillus. Fungusschade wordt vaak veroorzaakt 20 door leden van de genera Aspergillus, PeniciIlium en Mucor.

Er zijn verscheidene methodes ontwikkeld die de vermenigvuldiging van deze bij landbouwprodukten bederfveroorzakende epifyten bestrijden. Een eenvoudige methode bestaat erin de landbouwprodukten op het moment van het opslaan te besproeien met een schimmel-25 werend middel, zoals bijvoorbeeld propionzuur. Een aanzienlijk nadeel van een dergelijke methode zijn de kosten: er moeten namelijk grote hoeveelheden van het zuur gebruikt worden om de landbouwprodukten voldoende te behandelen. Bovendien is het nodig dat, vanwege de inherent toxische en corrosieve aard van zuren zoals propionzuur, de boer er-30 voor zorgt dat bijzondere hanteringstechnieken gebruikt worden ter be scherming van het personeel dat met het zuur omgaat. Voorts moeten ook alle benodigdheden die in contact met het zuur komen, grondig worden schoongemaakt om corrosiê-schade te vermijden.

Maar ondanks uitgebreid onderzoek naar verscheidene 35 produkten die als inoculatiestof voor landbouwprodukten gebruikt kun nen worden, is hooibederf een aanhoudend probleem gebleven.

Het belangrijkste doel van onderhavige uitvinding is dan ook een samenstelling voor de bewaring van hooi te verschaffen, ‘8802126 •5' » - 3 - waarbij aan het hooi alleen maar natuurlijk voorkomende organismen worden toegevoegd in hoeveelheden die de groei van de bederfveroor-zakende organismen remmen en broeiing van hooi met hoge vochtigheid doen afnemen.

5 Een ander doel van de onderhavige uitvinding is een verbeterd bewaarmiddel voor hooi te verschaffen, dat de ongewone werking heeft broei van hooi met hoge vochtigheid doelmatig te doen afneraen zonder dat het nodig is onnatuurlijke hooi-additieven toe te voegen.

10 Een verder doel van onderhavige uitvinding is een sa menstelling voor het bewaren van hooi te verschaffen die geen milieuvervuilende risico's inhoudt.

Nog een verder doel van onderhavige uitvinding is een bewaarmiddel voor hooi te verschaffen waarmee kwaliteitshooi blijkend 15 uit temperatuur, recuperatie van droge stof, stikstofprofiel, kleur en aantallen micro-organismen (gisten en schimmels incluis) geleverd wordt.

Zelfs nog een verder doel van onderhavige uitvinding is een bewaarmiddel voor hooi te verschaffen alsook een methode voor 20 het bewaren van hooi, waarbij aan het hooi Bacillus pumillus-micro- organismen in hooi-bewarende hoeveelheden worden toegevoegd.

Nogmaals een verder doel van onderhavige uitvinding is hooi-bewarende samenstellingen te verschaffen die bij toevoeging aan hooi, het risico van degradatie door broei doen afnemen en tegelijker-25 tijd de groei van bederfveroorzakende organismen zoals Aspergillus flavus remmen.

De methode en de middelen om elk van deze, evenals andere, doeleinden te verwezenlijken, worden duidelijk gemaakt in de volgende gedetailleerde omschrijving van de uitvinding.

30

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

Bij onderhavige uitvinding wordt hooi behandeld met Bacillus pumilus voor het behoud van de kwaliteit van het hooi.

Bacillus pumilus is in staat de bederfveroorzakende organismen die be-35 schadiging veroorzaken van hooi dat voor lange tijd opgeslagen wordt, af te remmen.

Bijgevolg verschaft deze uitvinding een behandelingsmethode om het behoud van hooi te verbeteren. De methode houdt in dat •8602126

V

** - 4 - aan het hooi een doelmatige hoeveelheid Bacillus pumilus of mutanten of equivalenten ervan wordt toegevoegd.

De uitvinding verschaft eveneens een samenstelling voor de behandeling van hooi die Bacillus pumilus bevat. Deze samenstelling 5 kan zowel vast als vloeibaar zijn.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

Bederf van hooi ten gevolge van beschadiging door be-derfveroorzakende organismen is een van de belangrijkste problemen 10 voor de landbouwgemeenschap. Typische bederfveroorzakende organismen zijn het genus Aspergillus en het species Aspergillus flavus alsook het genus Penicillium en Mucor.

Hooi dat in balen wordt verpakt bij vochtigheid hoger dan ongeveer 25% broeit en beschimmelt in 97% van de gevallen, zoals 15 blijkt uit veldonderzoek. Deze verbroeide balen zijn duidelijk slech ter van kleur en voedingswaarde, en hebben ook meer zichbare schimmel.

Er werd gevonden dat stammen van Bacillus pumilus de kwaliteit van het hooi kunnen bewaren. Zonder dat aanvrager zich gebonden wenst te voelen door enige operabiliteitstheorie, wordt aange-20 nomen dat Bacillus pumilus (een) groeiremmende verbinding (en) kan produceren die de groei van fungi en andere bacteria zoals het bac-teriële isolaat Sporosarcina kan/kunnen afremmen. Sporosarcina veroorzaken de ongewenste witte bloei die wordt waargenomen op de stengels van het hooi enkele dagen al na het opslaan. Deze organismen worden 25 typisch waargenomen in balen van zeer hoge temperatuur. Ze blijken ook een zodanige werking te hebben dat ze, gelijktijdig met hun eigen groei of in een later stadium, de groei van fungi aanmoedigen.

Inzicht in de microbiële intercatiesis een belangrijke factor bij het gebruik van deze stam voor de verbetering van de kwa-30 liteit van opgeslagen hooi. Bij het verpakken van hooi in balen treedt aanvankelijk bloei op van een klasse van micro-organismen (de gram-negatieve groep). Dit wordt waargenomen tijdens de eerste 1 a 3 dagen. Daarna komt een tweede groep (de gram-positieve groep) in de plaats. Bacillus pumilus behoort tot deze groep, de gram-positieve groep. Als 35 de geselecteerde Bacillus punilus in grote aantallen, als hierna be paald, aanwezig zijn, zal het hooi in dit stadium niet broeien of beschimmelen. Nadien worden andere groepen microflora dominant terwijl de populaties Bacillus pumilus afnemen. Bij het einde van de opslagtijd, 8802126 * - 5 - als het hooi gevoerd wordt, maakt de Bacillus deel uit van de micro-flora. Nogmaals: aanvrager wenst zich niet gebonden te voelen door enige theorie, maar stelt dat het mogelijk is dat de Bacillus van invloed is op de kwaliteit van het hooi eenvoudigweg door met andere 5 aanwezige organismen te concurreren voor nutriënten.

In de werkwijze volgens de uitvinding wordt hooi behandeld met een voor het bewaren van het hooi doelmatige hoeveelheid Bacillus pumilus of mutanten of equivalenten ervan, teneinde de bewaring te verbeteren en de kwaliteit van het hooi te behouden, en 10 eveneens de vermenigvuldiging van bederfveroorzakende micro-organismen te verminderen.

De werkwijze volgens de uitvinding is in het bijzonder nuttig doordat het organisme van de uitvinding niet-pathogeen is en in kleine hoeveelheden natuurlijk voorkomt in het hooi, en daarom ook 15 geen ziektes zal veroorzaken bij een dier dat van het bewaarde land- bouwprodukt eet. In tegenstelling tot vele soorten bewaarmethodes waarbij dure en vaak gevaarlijke chemicaliën gebruikt worden, steunt de methode volgens de uitvinding integendeel op de toename van kolo-nievorming door gewenste natuurlijk voorkomende organismen door hun 20 vermogenom te concurreren met natuurlijk voorkomende bederfveroor zakende organismen, zoals As^ór^lllus rlnvuz, te verbeteren. Het onder controle houden van deze bederfveroorzakende organismen is een belangrijke zaak, omdat vele van de organismen die met bederf aan bewaarde landbouwprodukten in verband gebracht worden, fungi zijn die bekend 25 staan voor het produceren van krachtige mycotoxines. Men weet dat deze mycotoxines ziekte en zelfs de dood tot gevolg kunnen hebben bij dieren die voedsel eten dat met deze fungi verontreinigd is.

Er zijn bepaalde geprefereerde stammen van Bacillus pumilus, welke geïsoleerd en bijzonder verkieslijk bevonden werden 30 voor de samenstelling overeenkomstig de uitvinding. Deze stammen zijn op aanvraag te verkrijgen bij aanvrager en werden geïndentificeerd als stammen nummers 2S8, 289, 290, 296, 299, 302, 305 en 307. De stammen zijn gedeponeerd bij de American Type Culture Collection in Rockville,

Maryland (Verenigde Staten), onder de ATCC nummers 53682, 53683, 35 53684, 53685, 53686, 53687, 53688 en 53689.

Men kan gebruik maken van een toereikende combinatie van deze geprefereerde stammen, of een combinatie van een kleiner aantal, of eenvoudigweg een enkele stam.

- 8802129 •w « - 6 -

Bacillus pumilus werd geïsoleerd uit opgeslagen hooi met bekende technieken en werd hierboven in het algemeen beschreven. Andere Bacillus pumilus kunnen geïsoleerd en volgensgebruikelijke experimentele technieken getest worden om de doeltreffendheid van de 5 Bacillus pumilus voor het bewaren van de kwaliteit van het hooi vast te stellen.

Met de term "doelmatige mutanten ervan" wordt bedoeld alle en om het even welke mutanten van Bacillus pumilus die de gewenste fungus-remmende eigenschappen van onderhavige stam of substantiële 10 equivalenten ervan, vertonen. Zulke mutanten worden als functioneel equivalent aan hun moederstam beschouwd. Het is deskundigen op dit gebied wel bekend dat spontane mutatie normaal voorkomt in micro-organismen, en dat mutaties eveneens opzetterlijk teweeggebracht kunnen worden met een verscheidenheid van bekende technieken. Zo kunnen 15 mutanten teweeggebracht worden door gebruik van chemische, radioac tieve en recombinant technieken.

Hoe deze mutaties ook opgewekt worden, het kritieke punt is dat, wat het bewaren van landbouwprodukten betreft, de mutanten functioneren op de wijze beschreven voor de moederstam. Met 20 andere woorden, de onderhavige uitvindingleeft ook betrekking op mu taties die kleinere veranderingen tot gevolg hebben, zoals kleinere taxonomische wijzigingen (bijvoorbeeld de fermentatie van bepaalde suikers).

Hoewel de uitvinding beschreven wordt met bijzondere 25 verwijzing naar de geprefereerde Bacillus pumilus, en bepaalde spe cifieke stammen ervan, moet ervan uitgegaan worden dat bij de uitvinding gebruik gemaakt kan worden van andere genetisch nauw verwante organismen van het genus Bacillus. Het is dus mogelijk dat de meeste, zo niet alle, doeleinden van de uitvinding verwezenlijkt kunnen wor-30 den met andere species van het genus Bacillus, zoal Bacillus subtilus en Bacillus cereus. Bacillus pumilus geniet een een duidelijke voorkeur omdat deze species behoort tot de normale hooiflora.

Met de term "hooi" wordt bedoeld alle vormen van hooi zoals die term normaal gebruikt wordt in de landbouw. Hooi is gewoon-35 lijk samengesteld uit alfalfa, gras of mengelingen van alfalfa en gras.

Het is mogelijk dat de hooi-bewarende samenstelling overeenkomstig de uitvinding ook gebruikt kan worden als een doelmatig kuilvoederinocu-lum teneinde bederf van kuilvoeder te verminderen. Een andere stellige 8802129 $ £ - 7 - mogelijkheid is dat de samenstelling doeltreffend zou werken bij het bewaren van granen, zoals mals, tarwe, rijst en soyabonen.

Bij de onderhavige uitvinding wordt de afremming van hooibederf-veroorzakende organismen verwezenlijkt door het hooi te 5 behandelen met organismen van het genus Bacillus, in het bijzonder

Bacillus pumilus of samenstellingen die Bacillus pumilus of nauw verwante organismen bevatten, en eveneens door behandeling met doelmatige mutanten of equivalenten van Bacillus pumilus en samenstellingen ermee.

De samenstellingen die bij de werkwijze volgens de uit-10 vinding gebruikt worden, kunnen ofwel vloeibaar ofwel vast zijn en kunnen additionele bacteriële stammen bevatten. Bij behandeling met vaste samenstellingen kan de samenstelling de Bacillus pumilus bevatten te zamen met een drager. De drager kan een waterachtige of nietwaterachtige vloeistof of vaste stof zijn. In vast vorm kan de samen-15 stelling vaste dragers of fysische extenders bevatten. Voorbeelden van dergelijke vaste dragers, vaste verdunners of fysische extenders zijn malto-dextrine, zetmelen, calciumcarbonaat, cellulose, wei, gemalen maïskolven en siliciumdioxide. Om kort te gaan, de drager kan een organische of anorganische fysische extender zijn. De vaste samenstel-20 ling kan onmiddellijk aan het hooi toegevoegd worden in de vorm van een licht stuifpoeder of, als de samenstelling in een vloeibare drager gedispergeerd is, kan die met succes op het hooi gesproeid worden.

Typische samenstellingen nuttig voor de behandeling van 2 12 hooi volgens de uitvinding bevatten 10 -10 levensvatbare organismen/g, 4 10 25 bij voorkeur 10 -10 levensvatbare organismen/g, en nog verkieslijker 5 7 10 -10 levensvatbare organismen/g.

Het behandelingsbereik voor hooi is typisch 10~*-10^ 7 13 levensvatbare organismen/ton, bij voorkeur 10 -10 levensvatbare or- 8 10 ganismen/ton, en nog verkieslijker 10 -10 levensvatbare organismen/ 30 ton.

De samenstelling volgens de uitvinding kan naast Bacillus pumilus of mutanten of equivalenten van dit organisme, andere bij het bewaren van landbouwprodukten normaal aangewende organismen bevatten, zoal Lactobacillus, Streptococcus en Pediococcus, en bepaalcfe 35 enzymen uit fungi of bacteria.

Deskundigen op dit gebied zijn eveneens bekend met andere geschikte dragers en doseringsvormen of zijn in staat die vast te stellen door gebruik te maken van routine experimenten. Voorts kunnen * 9802128 /

J

- 8 - de verscheidene samenstellingen toegevoegd worden met de voor deskundigen ter zake gebruikelijke standaardtechnieken.

De bovenstaande omschrijving is een algemene beschrijving van onderhavige uitvinding. Vollediger inzicht kan verkregen 5 worden aan de hand van de volgende voorbeelden die uitsluitend ter illustratie gegeven worden en geen beperkende bedoeling hebben tenzij anders vermeld is.

VOORBEELDEN

10

Hooi werd behandeld met inocula bestaande uit een combinatie van Bacillus pumilus-stammen nummers 288, 289, 290, 296, 299, 302, 306 en 307.

De kwaliteit van het hooi werd gemeten aan de tempera-15 tuur, microflora en analyse van de voedingswaarde. Voor alle behande lingen werden visuele scores inzake kleur, witte schilfers en schimmelsporen opgetekend.

Alfalfa werd gemaaid met een maaier-conditioneerder en liet men in het veld drogen onder normale veldomstandigheden. Het ge-20 maaide hooi werd in zwaden geplaatst en maar eenmaal geharkt voordat het in balen verpakt werd. Droogsnelheid, rijpheid en gegevens inzake het weer werden opgetekend. Het hooi werd in balen verpakt bij 22 a 34% vochtigheid voor alle experimenten, maar binnen een gegeven ejqpe-riment was er slechts 2 ! 5% variatie tussen behandelde balen en con-25 trolebalen.

Voor experimenten met kleine vierkante balen werd het volgendeprotocol gevolgd. Het hooi werd behandeld met in water oplosbare vormen van het hooibewaarmiddel. Er werd gebruik gemaakt van een sproeier. Bij het langere velexperiment werd de behandeling toegepast 30 op 15 S 20 balen (1 baal = 45,4 kg). Niet-geïnoculeerde controlebalen werden eveneens klaargemaakt. In totaal werden 15 a 20 controlebalen klaargemaakt. Het hooi werd van het veld weggevoerd, opgestapeld en opgeslagen op houten pallets op een cementen vloer in een omheinde loods. Temperatuursondes werden in het midden van elke mijt aangebracht 35 en de temperatuur werd om het uur gemeten.

Een kleiner systeem op schaal werd eveneens opgezet teneinde onderzoek met grotere balen te simuleren. 454 g hooi werd verpakt in een styrofoam (piepschuim) verzendingscontainer (wanddikte -8802126 £ - 9 _ van 5 cm) met afmetingen van ongeveer 15 cm x 25 cm x 15 cm. Nadat een thermistor in het centrum van de hooimassa was aangebracht werd het hooi samengeperst door er een baksteen bovenop te plaatsen. Het styrofoam (piepschuim) deksel werd losjes bovenop geplaatst en de 5 hele container werd in een incubator van 37° C geplaatst om broeien teweeg te brengen. Het hooi werd behandeld door besproeien met een glazen TLC sproeier.

Steekproeven van de balen werden genomen door zes boor-monsters per monstertijd te trekken met een Penn State Forage Sampler 10 (monstertrekker voor voeder). Om variabiliteit binnen de mijten te minimaliseren, werden voor elke mijt monsters getrokken uit twee balen onderaan, twee balen in het midden en twee balen bovenaan. Boormons-ters werden in whirl' pac steriele zakken gebracht, bij elkaar gehouden per behandeling en bewaard op ijs voor vervoer naar het labora-15 torium. De proeftrekking uit de styrofoam modelcontainers bestond uit het nemen van één monster uit het centrum van elke container. Monster-tijden waren bij benadering 0, 2, 7, 14, 21, 30 en 60 dagen.

Micro-organismen-tellingen van Bacillus pumilus die £ door besproeien op de hooimonsters were gebracht, bedroegen 10 /g hooi.

12 20 Dit komt overeen met een organisme-telling van 10 /ton hooi. De or ganismen waren een combinatie van gelijke delen van de Bacillus pumilus-stammen nummers 288, 289, 290, 296, 299, 302, 305 en 307. De Bacillus pumilus-behandelssamenstellingen werden aangemaakt door de acht stammen individueel te kweken in een tryptische soyabodem gedurende een 25 periode van 24 uur bij 37°C. Cellen werden verwijderd door centrifu geren bij 4°C en de celmassa werd opnieuw gesuspendeerd in een 0,04 M fosfaatbuffer. De cellen werden ofwel op ijs naar het veld gebracht waar ze onmiddellijk toegediendwerden ofwel werden ze ingevroren bij

O

70 C voor later gebruik. Voor aanbrenqen op het hooi werden de cellen 30 gelijkmatig verdeeld in 18,9 1(5 gallon) water en werd de dispersie (in een heoveelheid van 18,9 1/ton) met een aan de baalvorminrichting bevestigde sproeier op het hooi gebracht. De kolonievormende eenheden/ behandeling werd vastgesteld op het tijdstip van aanbrengen.

De monsters werden geanalyseerd op droge stof, ADF, 35 ADF—N, NDF, en N gehalte. De temperatuur werd om het uur genoteerd met tot op -0,2°C nauwkeurige temperatuurthermistors. De gegevens werden geanalyseerd met gebruikmaking van de covarianten droge stof (DM) en dag-O-temperatuur.

‘3802126 * > - 10 -

Tijdens het hele experiment en op het einde van de bewaarperiode werd het hooi visueel bekeken op sporen van schimmel en witte bederfveroorzakende microflora. Het hooi werd geëvalueerd op be-schimmeling en wit bederf op een schaal van 1 tot 10 waarbij 10 de 5 slechtste kwaliteit voorstelt. Kleurverschillen werden aan het einde van de bewaarperiode vastgesteld met behulp van stroken verf voor vergelijking. Kleuren varieerden van 1, groen, tot 23, bruin.

De meest informatieve resultaten bij het kleinere mo-delsysteem waren de temperatuurverschillen tussen de ejqperimenten, om-10 dat de thermistors tot op Z 0,2°C nauwkeurig zijn en de temperatuur om het uur gemeten werd. Dit leidde tot ongeveer 500 gegevens per behandeling per experiment. De behandeling met de duidelijk laagste temperatuur in alle experimentele modellen was die met Bacillus (tabellen 1 en 2). Deze behandeling bleek lagere gist- en schimmel-15 populaties tot gevolg te hebben. Bij de Bacillus-behandeling waren de voedingswaarden ook significant hoger (lager ADF). De metingen van NDF, ADF-N, WSC, N en opneembaar eiwit wezen eveneens op hogere voedingswaarden, hoewel deze verschillen niet significant waren. De Bacillue-behandelingen leverden ook significant betere visuele scores 20 op, wat wees op minder visuele beschimmeling. Kleurscores waren min der consistent en vertoonden geen verschillen tussen de behandelingen in deze kleine modelbalen.

TABEL 1 25 EFFECT VAN DE GESELECTEERDE BEHANDELING OP DE GEMIDDELDE TEMPERATUUR, MICROBIELE (LOGIO) TELLINGEN EN VISUELE KWALITEIT VAN HOOI IN EXPERIMENTELE MODELBALEN.

Gist/ 1 2 30 Behandeling Reps Temp Aëroben Schimmel Kleur Schimmel

Bacillus 3 36,57 8,10 2,72 10,5 4,5 i

Controle 5 37,28 8,36 3,30 9,25 7,5

Gist/Schimmelwaarden hebben betrekking op het einde van het experiment 2 35 Beschimmeldheid; de hoeveelheid visueel waargenomen schimmel in ba len uitgedrukt op een schaal van 1 (niet beschimmeld) tot 10 (zeer beschimmeld)

Behandelingsgemiddelden gevolgd door een asterisk hebben een signi- “8802126

V

- 11 - ficante afwijking van de controle P <.0,1.

TABEL· 2 5 EFFECT VAN GESELECTEERDE BEHANDELINGEN OP DE CHEMISCHE EINDSAMENSTEL-

LING VAN HOOI IN EXPERIMENTELE MODELBALEN

Hemi- l

Behandeling Reps N NDF ADF ADF-N Cellulose AP

Bacillus 3 3,01 55,11 39,60* 0,25 15,51* 17,25 10 Controle 3 2,80 57,30 43,58 0,32 13,72 15,50 AP = "available protein" (opneembaar eiwit)

(N%) (%ADF-N) (6,25)=AP

4 Behandelingsgemiddelden gevolgd door een asterisk hebben een significante afwijking (P<0,1) van de controle.

15 De voor het model-systeem weergegeven tendensen in tabellen 1 en 2 werden eveneens waargenomen in de grotere hooibalen zoals blijkt uit tabellen 3, 4 en 5 hieronder. Dit betekent dat het met Bacillus behandelcfe hooi een lagere temperatuur had dan het contro-lehooi. De gist- en schimmeltellingen waren vergelijkbaar in alle 20 balen maar er was minder zichtbare schimmel in met Bacillus pumilus behandeld hooi en de kleur was groener. Analyse van de voedingswaarde wees ook op tendensen vergelijkbaar met die voor het model-systeem zoals weergegeven in tabellen 1 en 2. De waarde voor opneembaar eiwit (AP) was hoger in de met Bacillus pumilus behandelde balen en de ADF 25 en NDF waarden wezen op de hogere voedingskwaliteit in deze behandel de balen.

De behandeling van hooi met stammen van Bacillus pumi-lus leidde tot balen met lagere temperatuur, met minder beschimmeling en groenere kleur vergeleken met niet-geïnoculeerde controlebalen, Be-30 handeling met Bacillus pumilus leidde eveneens tot balen met hogere waarden voor opneembaar eiwit, totale opgenomen verteerbare nutriënten en dagelijks opgenomen energie.

i 6802.120 'i - 12 -TABEL 3

EFFECT VAN DE BEHANDELINGEN OP DE GEMIDDELD TEMPERATUUR, MICROBIELE (LOGIO) EN VISUELE KWALITEIT VAM HOOI IN HOOIMIJTEN MET KLEINE VIERKANTE BALEN

5 EXPERIMENT 590 BALEN (26 MAAIING) °q Totaal Gist/ Witte Beschim-

Behandeling Temp Aëroben Schimmel'1' Kleur Schilfers meldheid Bacillus 19,92* 8,82 3,33 6,5 0,0 0,0*

Controle 24,92 9,00 3,00 10,5 3,5 2,5 10 Gist/Schimmel-waarden hebben betrekking op het einde van het e>q?eri- ment üfe

Behandelingsgemiddelden gevolgd door een asterisk hebben een significante afwijking van de controle P<0,1.

15 TABEL 4

HET EFFECT VAN BEHANDELINGEN OP DE CHEMISCHE EINDSAMENSTELLING VAN -HOOI IN MIJTEN VAN KLEINE VIERKANTE BALEN EXPERIMENT 590 BALEN

Hemi-

20 Behandeling N NDF ADF ADF-N Cellulose AP

Bacillus 3,42* 52,70 38,32 0,221 14,38 19,99*

Controle 3,23 56,30 40,49 0,246 15,81 18,65

Aanvangwaarde N = 3,61 Aanvangwaarde NDF = 51,42 25 Aanvangwaarde ADF =38,66

Hemicellulose = 12,76 ADF-N = 0,276 AP = "available protein" (opneembaar eiwit) = 20.83 DM = 70,15 30 Behandelingsgemiddelden gevolgd door een asterisk hebben een signi ficante afwijking (P^0,1) van de controle.

Indien de behandeling met stuifpoeder gebeurt in plaats van met besproeiing.zoals in de voorbeelden, en leidt tot dezelfde ge-35 specificeerde organismeconcentraties als in de specifieke voorbeelden, worden dezelfde resultaten verkregen: d.w.z. broei in de balen neemt 8802126 - 13 - af, de groei van de bederfveroorzakende organismen in de microflora wordt afgeremd en er zijn tekenen dat de voedingswaarde van het hooi toeneemt.

Er blijkt dus dat de uitvinding tenminste alle van de 5 gestelde doeleinden verwezenlijkt.

.eeo me

Claims (25)

1. Werkwijze voor het bewaren van de kwaliteit van hooi met het kenmerk dat: vers hooi wordt behandeld met een kleine maar hooikwaliteit-behoudende hoeveelheid van het micro-organisme Bacillus pumilus. 5

2. Werkwijze volgens conclusie 1 waarbij het micro-organisme Bacillus pumilus is, of doelmatige mutanten of equivalenten ervan.

3. Werkwijze volgens conclusie 2 waarbij genoemde behandeling gebeurt 10 door besproeien.

4. Werkwijze volgens conclusie 3 waarin de hoeveelheid levensvatbare 5 15 organismen per ton behandeld hooi ligt tussen 10 en 10 organismen per ton hooi. 15

4 'i -π-

5. Werkwijze volgens conclusie 4 waarbij de hoeveelheid organismen 7 13 ligt tussen 10 en 10 per ton hooi.

6. Werkwijze volgens conclusie 5 waarbij de hoeveelheid organismen 8 10 20. ligt tussen 10 en 10 per ton hooi.

7. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies waarbij de Bacillus pumilus gekozen wordt uit de groep bestaande uit Bacillus pumilus, stammen nummers 288, 289, 290, 296, 299, 302, 305 en 307. 25

8. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies waarbij de behandelende samenstelling ook andere landbouwprodukt-bewarende organismen bevat.

9. Werkwijze volgens conclusie 8 waarbij genoemde andere organismen gekozen worden uit de groep Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus en uit van fungi of bacteria afgeleide enzymen. 8802126 * A -t$ -

10. Werkwijze voor het behoud van de kwaliteit van hooi met het kenmerk dat men: aan vers hooi, onder omstandigheden die kolonievorming van organismen bevorderen, Bacillus pumilus, of mutanten of equivalenten ervan toe-5 voegt en het mogelijk maakt dat genoemde organismen een significante kolonie vormen en zo de groei voorkomen van natuurlijk voorkomende bederfveroorzakende organismen, waarvan de kolonievorming zo belemmerd wordt.

11. Werkwijze volgens conclusie 10 waarbij genoemde organismen toege voegd worden door het genoemde hooi te besproeien met een vloeistof die deze organismen bevat.

12. Werkwijze volgens conclusie 11 waarbij genoemde organismen toege- 15 voegd worden teneinde een aantal levensvatbare organismen te verschaffen 5 15 dat ligt tussen 10 en 10 levensvatbare organismen per ton hooi.

13. Werkwijze volgens conclusie 12 waarbij de hoeveelheid organismen 7 13 ligt tussen 10 en 10 per ton hooi. 20

14. Werkwijze volgens conclusie 13 waarbij de heoveelheid organismen 8 10 ligt tussen 10 en 10 per ton hooi.

15. Werkwijze volgens conclusie 10-14 waarbij de Bacillus pumilus 25 gekozen wordt uit de groep bestaande uit Bacillus pumilus, stammen nummers 288, 289, 290, 296, 299, 302, 305 en 307.

16. Werkwijze volgens conclusie 10-15 waarbij de behandelingssamenstelling ook andere landbouwprodukt-bewarende organismen bevat. 30

17. Werkwijze volgens conclusie 16 waarbij genoemde andere organismen gekozen worden uit de groep Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus en uit van fungi of bacteria afgeleide enzymen.

18. Samenstelling voor gebruik als bewaarmiddel voor hooi, bestaande uit: een cultuur van Bacillus pumilus of doelmatige mutanten ervan, gedis-pergeerd in een suspensie-drager. *880212$ * ( -ιί - 2

19. Samenstelling volgens conclusie 18 waarbij de samenstelling IQ 12 tot 10 levensbatbare organismen per gram bevat.

20. Samenstelling volgens conclusie 18 of 19 waarbij de samenstelling 4 10 5 10 tot 10 levensvatbare organismen per gram bevat.

21. Samenstelling volgen conclusie 18-20 waarbij de samenstelling 10~* 7 tot 10 levensvatbare organismen per gram bevat.

22. Samenstelling volgens conclusie 18-21 waarbij de suspensiedrager een vloeistof is.

23. Samenstelling volgens conclusie 18-21 waarbij de suspensiedrager een vaste stof is. 15

24. Samenstelling volgens conclusie 18-21 of 23 waarbij de vaste drager wateroplosbaar is en gekozen is uit de groep van calciumcar-bonaat, zetmeel en cellulose.

25. Werkwijze voor het remmen van organismen die bederf van hooi ver oorzaken, met het kenmerk dat men vers hooi behandelt met een doelmatige hooibewarende hoeveelheid van Bacillus pumilus of andere nauw verwante organismen: waarbij genoemde behandeling gebeurt onder omstandigheden die de groei 25 van genoemd Bacillus pumilus of andere nauw verwante organismen be vorderen en zo de groei remmen van natuurlijk voorkomende bederfver-oorzakende organismen. '8802126