CN1031542C - 防护干草品质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及以有效量短小芽孢杆菌或其突变体处理防护干草的方法。本发明亦涉及上述防护干草品质方法所使用的短小芽孢杆菌。

Description

防护干草品质的方法

美国干草年产量约为一亿五千万吨。生产损失较其他农作物高，主要是由于紫花苜蓿成熟时间不利，雨水损害，田间收获损失与及贮藏损失造成。损失一般为百分之二十到四十，但在遇上恶劣天气时，损失又可能高达百分之七十。造成损失的原因包括植物继续呼吸，机器引起落叶，及雨水淋溶所至。将干草以较高(25-30％)含水量打捆当然可以减少雨水及机器造成的损害，但含水量超过百分之二十时打捆又会使贮藏时氧化及发霉情况加剧引致损失。

贮藏损失为养分损失主要原因，但此损失却可控制。如贮藏的地方湿度在百分之二十以下，正常干物质损失量为百分之五至十。较高湿度会加速有氧氧化微生物活动，引致产生热量。而太多热量又会令植物呼吸产生二氧化碳和水，造成干物质损失。热量同时带来非酶褐变反应，使养分受损。热量产生多少则要看干草内的水分浓度，环境气温，微生物群体数目和打捆面积，密度而定。

热量损害过分会减低蛋白质消化率和可用能源。以酸法去污纤维氮(ADIN或ADF-N)确定纤维内含氮量从而计算热量损害的蛋白质。一般来说，纤维内含氮量应少于总氮量的百分之七。如数字上升至百分之十五，则说明过分热量损害已经出现。

贮藏期间，霉带来的损害亦可造成重大损失。虽然只有百分之五霉菌产生粘毒素，但这对干草适口性及作饲料用仍会起不良作用。将有霉菌的干草给牲畜喂食会显著降低干物质的摄入，减慢牲畜增重及减少饲料转化。与喂食无霉干草比较，这方面的损失可能增加百分之二十五。

贮藏干草会自然产生因时附生植物。这些附生植物对干草草质可能有害或无害，但却一定互相竞争以便取得在贮藏干草内的生态优势。它们可能是细菌或真菌。一般细菌变质生物多为孢子八叠球菌属及芽孢杆菌属，而真菌性变质则大部分又曲霉属，青霉属及毛霉属造成。附生植物令农作物变质，要控制其繁殖方法有多种。其中最简单的是在贮藏时在农作物上喷上如丙酸一类的霉抑制剂。但要把农作物彻底喷好又得使用大量酸类，成本因此大增。这是此方法欠理想的主要地方。此外，酸的内在毒性和腐蚀性要求农人使用丙酸一类的化学物时又须懂得特别处理技术以免身体受损。所有使用过的设备亦要彻底洗净避免腐蚀。另一种控制方法，其详情请参阅本人同时候决的名为“干草防腐”的一般转让申请。该项申请于1986年7月28日提出，编号891260。方法为将氧化锌，氧化镁无机盐混合物跟水溶铜离子源与酸性酸，丙酸或山梨酸一类有机酸混合使用。

虽然人类积极研究发展各种农作物接种剂，干草变质情况仍未能彻底改善。

因此，本发明主要的目的是要提供一种仅含自然生物的干草防腐组合物，其加入可制止变质生物在干草内的生长及减少高水分干草中的热量。

本发明另一目的是提供一种改良的防腐剂，该防腐剂可令人惊讶地使干草在无须加入非天然干草添加剂的情况下有效地减低高水分干草中的热量。

本发明另一目的是提供一种绝无环境污染危险的干草防腐组合物。

本发明再一目的是提供一种干草防腐剂，使用后提供从温度、干物质再生、氮特色、颜色及包括酵母和霉菌的微生物数量角度来衡量都可确定为高品质的干草产品。

本发明的再另一目的是提供一种干草防腐剂以及干草防腐方法，该方法包括以干草防腐水平将短小芽孢杆菌微生物加至干草中。

本发明最后目的是提供干草防腐组合物，该组合物当施用于干草时，足以降低热量降解的危险，并同时防止如黄曲霉一类变质生物的生长。

以下发明介绍将详述达到上述及其他目的的各种方法。

本发明以短小芽孢杆菌处理干草，防护干草品质。短小芽孢杆菌有能力抑止使长期贮存的干草变质的变质生物。

因此，本发明提供一种的处理干草的方法以提高它的防腐能力，该方法包括将有效量的短小芽孢杆菌或其突变体或其等同物加到干草中。

本发明同时提供一种包含短小芽孢杆菌的处理干草的组合物。组合物可以是固体或液体。

由于变质生物的生长而使干草变质是农业社会中的一个主要问题。典型的变质生物包括曲霉属黄曲霉种，及青霉属和毛霉属。

田间调查指出，以超过百分之二十五水分打包的干草有百分之九十七时间会发热及发霉。这些包装干草的颜色及营养价值严重受损，有较为明显的霉变。

短小杆菌菌株已被证实能防护干草品质。无论是否有解释适用性的理论作依据，一般人却相信短小芽孢杆菌可能产生某些抑制性化合物足以抑制真菌及细菌如细菌分离物孢子八叠球的生长。人们常常从贮藏只有数天的干草茎上看到的碍眼的白菌绒即是由孢子八叠球菌造成。这种生物在极热包装里最易看到。另外，孢子八叠球菌又好象同时或在较后时间助长了真菌的生长。

要提高贮藏的干草的品质，理解微生物间的相互作用是使用该菌株的必备条件。当干草打包时，最先会有一种微生物大菌绒出现(革兰氏阴性组)。这种情况在最初一到三天最常见。之后，这组菌又会由另一组取代(革兰氏阳性组)。短小芽孢杆菌即属于之后一组的革兰氏阳性菌。如经挑选的短小杆菌大量存在，如下文定义，则干草不会发热或发霉。及后短小芽孢杆菌数量下降，接着其他微生物种群取得优势。当用贮藏期满的干草喂食牲畜时，芽孢杆菌将成为微生物区系一部分。再次声明，在不受任何理论制约的情况下，申请人认为芽孢杆菌可能因为与其他共存生物竞争养分而影响干草品质。根据本发明的方法，是用有效量的短小芽孢杆菌或其突变体或相等同物处理干草以提高它的防腐能力，保持干草草质与及消除变质生物增殖。

因为使用了干草里低水平自然生长的非病源生物，所以本发明的方法是特别有用的，并且牲畜食用了防腐的农产品后不会致病。与许多其他使用昂贵，危险化学药品的防腐剂不同，本发明方法是通过提高所需的自然生物与自然的变质生物，如黄曲霉竞争的能力，而增强其增殖。许多与防腐的农产品变质有关的生物是真菌，已知真菌产生有效的真菌毒素。牲畜吃进真菌污染的饲料后，真菌毒素会引起动物生病，甚至死亡。如何控制此类有害生物成为本发明主要考虑所在。

某类已分离出的优选的短小芽孢杆菌菌株对组成本发明品特别有用。这些菌株签定为菌株编号288，289，290，296，299，302，305及307。这些菌株已于1988年10月18日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏号分别为CCTCC No.M88104、88105、88106、88107、88108、88109、88110和99111。人们可使用这些令人满意的优选菌株的混合物，或其任何较少种类的组合物或简单的一种菌株。可以本领域熟知的和上述的技术从贮藏的干草中分离短小芽孢杆菌。此外亦可以分离其它的短小芽孢杆菌，并按常规试验方法，评估短小芽孢杆菌在防护干草品质中的功效。

所谓“有效突变体”包括所有具有本发明菌株所需的真菌抑制性能的短小芽孢杆菌的突变体或其基本等同物。这些突变体功效应相当于母本株。本领域专业人员都知道自发突变是微生物中的一种常见现象。他们亦可用各种已知方法诱发产生各类突变体。例如可通过如化学的，放射活性的及重组技术诱发产生各类突变体。

无论使用的是何种诱导突变的方法，最重要的问题还是突变体是否能够如母本株一样防护农产品。换句话说，本发明包括导致微小改变的突变体，如那种微小的分类上的改变的情况，如某类糖发酵时所产生的突变体。

虽然本发明只提及优选的短小芽孢杆菌及某类具体的菌株，但应该理解，本发明亦可用其他与芽孢杆菌属遗传上接近的生物。使用如枯草芽孢杆菌及蜡状芽孢杆菌一类的芽孢杆菌属的其它芽孢杆菌即使未能完全达致本发明的目的亦相去不远。我们特别选择短小芽孢杆菌主要是由它是干草中常见的菌丛，所以它是特别优选的。

“干草”在本发明中的定义为农业常见的各类干草。干草一般包括紫花苜蓿，草及紫花苜蓿和草的混合物。本发明的干草防腐组合物亦可能作减低青贮饲料变质的有效接种剂使用。此外，另一可能性是，本发明的组合物还可有效地防护如玉米，小麦，米及大豆一类的谷物。

本发明以芽孢杆菌属的生物，特别是短小芽孢杆菌或含有短小芽孢杆菌的组合物、或短小芽孢杆菌的有效突变体或其等同物及含其的组合物处理干草，抑制造成干草变质的生物。

本发明方法所使用的组合物可以是液体或干状体，亦可含有其他细菌菌株。以固体形式处理时，组合物可含有短小芽孢杆菌和载体。载体可以是一种含水或不含水的液体或固体。如果是固体形式，该组合物还可含有固体载体或物理增充剂。此类固体载体、固体稀释剂或物理增补剂的包括如麦芽糊精，淀粉，碳酸钙，纤维素，乳精，玉米糊及二氧化硅等物体。简单来说，载体可以是有机或无机的物理增充剂。固体组合物可以粉末形状直接撒在干草上面。如它已散布在液体载体内，则又可直喷到干草上去。

根据本发明可使用的有效处理的组合物应含有10²-10¹²活生物/克。较好的为10⁴-10¹⁰活生物/克。而最好是10⁵-10⁷活生物/克。

标准干草处理范围为10⁵-10¹⁵活生物/吨。较好的为10⁷-10¹³活生物/吨。而最好又为10⁸-10¹⁰活生物/吨。

本发明组合物除应包括短小芽孢杆菌或其突变体或等同物外，也可含有其他如乳杆菌，链球菌，足球菌一类常用的农作物防腐生物，以及可含有来自真菌或细菌的酶。

本领域专业人员应熟识或可通过常规实验找出其他适用的载体及剂量。

此外，本领域专业人员亦可用标准技术使用上述各类组合物。

上述公开为本发明的一般性说明资料。如要全面理解本发明又须参看以下具体实施例。不过此等具体实施例只作说明用。除经特别指明外，不应起任何限定作用。

实施例

用编号288，289，290，296，299，302，306及307短小芽孢杆菌菌株混合制成接种剂处理干草。

干草品质通过分析干草温度，微生物区系及养分来决定。并以计分方法决定处理干草在颜色，白垢及霉孢子的可见情况。

紫花苜蓿由割草-压扁作业机割下后放在正常情况的田间干燥。把割好干草制成草条，并在打捆前先耙一次。将干燥率，成熟度及天气数据记录下来。在各项实验中，干草大捆的水分百分率为百分之二十二到三十四。但在每一次试验里，处理与对照大捆的干草水分应只相差百分之二到五。

小型平方草捆实验是用以下方法进行。用喷雾器将水溶防腐剂喷在干草上。在属于较长时间的田间实验，处理干草应为15-20至100磅捆。并同时预备15-20未经接种的草捆作对照用。将干草从田间运走，堆好及存放在货棚内水泥地上的木货盘内。每堆中间放置一温度探针。每小时记录温度一次。

另外又使用一种小型模型系统来模拟大捆研究。在这实验中，将一磅干草放入一面积大约6′×10′×6′的泡沫聚苯乙烯装运容器内(厚壁二寸)。在干草中间放入热电阻后再在干草上面放上一块砖头将干草压缩。把泡沫聚乙烯盖在上面轻轻盖上后再将整个容器放入温度37℃的温箱内并开始起热工作。再用玻璃薄层色谱法(TLC)喷雾器将处理料喷在干草上。

用宾州饲料取样器将每次六个核心样品取出作草捆取样检查。每堆从下层，中层及顶层各取两大捆样以减少堆内变异性。将核心样品放在涡动封口无菌袋里。将同次处理的草样全部放在一起，贮在冰上，然后运到实验室去。对泡沫聚乙烯容器内的模型草样是从每容器的中部取走一样本作实验用。取样时间约为0，2，7，14，21，30及60天。用喷雾法处理样品干草的短小芽孢杆菌的微生物量经计算为10⁶生物量/每克干草。这相等于10⁹生物量/每吨草。使用生物为编号288，289，290，296，299，302，305及307的数目均等的短小芽孢杆菌株混合体。将这八种菌株个别放进温度37℃的胰蛋白酶大豆发酵液内二十四个小时即可生产短小芽孢杆菌处理物。再用离心分离方法于4℃时将细胞除去，并将细胞小球再悬浮于0.04M磷酸盐缓冲液内。细胞置于冰上运到田间立刻使用，或者以-70℃加以冻存作将来使用。在应用在干草前，先把细胞分散在5加仑水内，再以喷雾器喷附于干草上(每吨5加仓)。应用时即可决定菌落形成单位/处理。

将取样分别作干物质，ADF，ADF-N，NDF及N含量分析，并使用准确度高达±0.2℃的精确温度热敏电阻每小时监视温度。再后以协变干物质(DN)及0日温度分析所得数据。

整段实验期内及贮藏终止时都应用肉眼观察干草霉度及白色变质微生物区的情况。并以零到十计分方法评估干草发霉及出现的白色变质现象。其中十分代表最坏品质。贮藏期终止时又以涂条比较方法决定颜色差别。颜色计分方法为一至二十三，其中一代表绿色，而二十三则代表褐色。

在小型模型系统方面，因为使用的是准确度高达±0.2℃的热敏电阻，而且又每小时进行量度，所以不同试验的温度差别最有评估价值。这方面大约可以在每个实验中的每次处理样内取得500数据点。

在各实验模型当中又以芽孢杆菌(表一及表二)处理温度最低。此处理方法产生的酵母及霉菌群体最少。芽孢杆菌处理方法同时显著提高干草营养价值(较低的ADF)。此外，虽然差别并非十分大，NDF，ADF-N，WSC，N及可用蛋白质亦偏向较高营养值。经芽孢杆菌处理的干草目视得分大量提高。这表示可见的霉菌已明显减少。但颜色得分方面与上述情况未能一致。小模型捆的颜色经各种处理后并无任何差别。

                         表一

           选择处理对实验干草模型捆在平均温度，

             微生物统计及目视品质方面的影响处理    重复数      温度    需氧微生物量    YM      颜色      霉芽孢杆菌     3        36.57*      8.10       2.72     10.5     4.5 *对照         5        37.28       8.36       3.30     9.25     7.51实验终止时的YM值2霉量：以得1分(无霉)到得10分(极多霉)决定霉的可见数量*以星号标志的平均数据与对照显著性差异P＜.1。

                                          表二

                       选择处理对实验模型草捆最后化学组成的影响处理    重复数N     N        DF        ADF      ADF-N    半纤维素    AP芽孢杆菌    3        3.01     55.11     39.60*    .25       15.51*    17.25对照        5        2.80     57.30     43.58     .32       13.72     15.501可用蛋白质(N％)(％ADF-N)(6.25)＝AP*以星号标志的平均数据与对照显著性差异P＜.1。

表三，表四及表五大干草捆所显示的各种倾向与表一及表二模型系统相同。这就是说，经芽孢杆菌处理的干草比对照温度低。在各种干草捆中，酵母及霉数量相同。但经短小芽孢杆菌处理的干草，可见霉菌数量减少，颜色又较绿。养分分析与表一及表二所载倾向相同。可用蛋白质(AP)在经芽孢杆菌处理的草捆较高。同时ADF及NDF值亦显示芽孢杆菌处理的草捆具有最高营养品质。

经短小芽孢杆菌菌株处理的干草比未经接种的控制干草捆的温度低，霉量较少，颜色较绿。经牲畜喂食这些干草捆时，牲畜又可从中吸取较高蛋白质，较可消化的养分及每日所需的能量。

                     表三

         处理对小型平方干草堆平均温度，微

         生物学(LOG10)与及目视品质的影响

           #590干草捆实验(第二次收割)处理       温度    需氧菌全数    YM     颜色     W     霉芽孢杆菌  19.92*    8.82        3.33     6.5    0.0    0.0*对照      24.92     9.00        3.00    10.5    3.5    2.51实验终止时的YM值*以星号标志的处理后数据与对照显著性差异(P＜.1)

                  表四

       处理对小型平方干草捆堆最后化学组成的影响

                 #590干草捆实验处理       N       NDF       ADF      ADF-N    半纤维素    AP芽孢杆菌  3.42*   52.70     38.32     .221       14.38    19.99*对照      3.23    56.30     40.49     .246       15.81    18.65

N起始值  ＝3.61

NDF起始值＝51.42

ADF起始值＝38.66

半纤维素 ＝12.76

ADF-N    ＝.276

AP       ＝可用蛋白质＝20.83

DM       ＝70.15

*以星号标志的处理后数据与对照显著性差异(P＜.1)

当以撒粉末方法代替上述喷雾方法并且微生物施用量达至上述例子水平范围时，得到的结果相似，即干草捆温度较低，热量下降，微生物区系内变质生物增长受阻。同时干草的营养价值变得更高。

由此可见本发明实在已能完成所有既定目标。

Claims (17)

1.一种以贮存的高湿性干草的形式保存干草品质的方法，该方法主要包括在通气条件下以小量但干草品质保存及降热有效量的短小杆菌微生物处理新鲜干草。

2.根据权利要求1的方法，其中所述处理为喷雾处理。

3.根据权利要求2的方法，其中处理每吨干草的活生物体数量约为每吨干草10⁵至10¹⁵。

4.根据权利要求3的方法，其中所述的生物体数量为每吨干草由10⁷至10¹³。

5.根据权利要求4的方法，其中所述的生物体数量为每吨干草约10⁸至10¹⁰。

6.根据权利要求1的方法，其中所述的短小杆菌选自编号CCTCCNo.M88104、88105、88106、88107、88108、88109、88110和88111的短小杆菌株。

7.根据权利要求1的方法，其中进一步包括加入其他干草防护剂。

8.根据权利要求7的方法，其中所述其他干草防护剂选自乳杆菌，链球菌，足球菌及由真菌或细菌产生的酶。

9.一种以贮存的高湿性干草的形式保存干草品质的方法，该方法主要包括在促进微生物集落化的有氧条件下，于新鲜干草内加入干草防护有效量的短小杆菌或其突变体；及容许所述微生物显著集落化并以此防止自然发生的变质微生物的集落生长(其集落化因此被阻止)，及允许所述微生物在所述干草中降热。

10.根据权利要求9的方法，其中所述微生物是通过将含有它们的液体喷雾到上述干草上而加入的。

11.根据权利要求10的方法，其中所述微生物的使用量为每吨干草约10⁵至10¹⁵。

12.根据权利要求11的方法，其中微生物的使用量为每吨干草10⁷至10¹³。

13.根据权利要求12的方法，其中微生物使用量为每吨干草由约10⁸至10¹⁰。

14.根据权利要求9的方法，其中所述短小芽孢杆菌选自编号CCTCC No.88104、88105、88106、88107、88108、88109、88110和88111的短小杆菌株。

15.根据权利要求9的方法，其中进一步包括向所述新鲜干草中加入其他干草防护有机体。

16.根据权利要求15的方法，其中所述的其他干草防护有机体选自乳杆菌，链球菌，足球菌及由真菌或细菌生产的酶。

17.一种抑制在贮存的高湿性的干草中造成干草变质的有机体生长的方法，该方法主要包括：

以防护干草有效量的短小杆菌或其他相近生物处理新鲜的干草；

上述处理在有利于所述短小杆菌或其他相近生物的生长的有氧条件下进行，从而抑制了自然发生的变质微生物的生长并降低所述干草中的热量。