MXPA04012392A - Anticuerpo del receptor anti-igf-i. - Google Patents

Anticuerpo del receptor anti-igf-i.

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Abstract

Anticuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos restaurados, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos derivados y conjugados de los mismos con agentes citotoxicos, que s e enlazan especificamente e inhiben al receptor del factor-I de crecimiento semejante a insulina, antagonizan los efectos del IGF-I, IGF-II y suero en el crecimiento y supervivencia de las celulas tumorales y se encuentras sustancialmente desprovistos de actividad agonista. Dichos anticuerpos y sus fragmentos pueden utilizarse en el tratamiento de tumores que expresan elevados niveles del receptor IGF-I, tales como cancer de mama, cancer de colon, cancer pulmonar, cancer de prostata, carcinoma ovarico, sarcoma sinovial y cancer pancreatico y dichos anticuerpos derivados pueden utilizarse en el diagnostico y representacion de imagenes de tumores que expresan elevados niveles del receptor IGF-I.

Description

ANTICUERPO DEL RECEPTOR ANTI-IGF-I CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos que se enlazan al receptor del factor- I de crecimiento semejante a la insulina humana (receptor IGF-I) . Más particularmente, la invención se refiere a anticuerpos del receptor anti-IGF-I que inhiben las funciones celulares del receptor IGF-I. Aún más particularmente, la invención se refiere a anticuerpos del receptor anti-IGF-I que antagonizan los efectos de IGF-I, IGF- II y el suero en el crecimiento y supervivencia de las células tumorales y que se encuentran sustancialmente desprovistos de actividad agonista. La invención se refiere también a fragmentos de dichos anticuerpos, versiones humanizadas y restauradas de dichos anticuerpos, conjugados de dichos anticuerpos, derivados de anticuerpos y los usos de los mismos en aplicaciones de diagnóstico, de investigación y terapéuticas. La investigación se refiere además a anticuerpos mejorados o fragmentos de los mismos que se elaboran a partir de los anticuerpos antes descritos y sus fragmentos. En otro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido que codifica los anticuerpos o sus fragmentos y a vectores que comprenden los polinucleotidos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El receptor del factor-I de crecimiento semejante a la insulina (receptor IGF-I) es una proteína heterotetramérica de transmembrana, que tiene dos cadenas alfa extracelulares y dos cadenas beta de expansión de membrana en una configuración ß-a-a-ß enlazada por disulfuro. El enlace de los ligandos, que son el factor-I de crecimiento semejante a la insulina (IGF-I) y el factor-II de crecimiento semejante a la insulina (IGF-II) , por medio del dominio extracelular del receptor IGF-I, activa su dominio intracelular de tirosina cinasa dando como resultado la autofosforilación del receptor y la fosforilación del sustrato. El receptor IGF-I es homólogo al receptor de insulina, teniendo una alta similitud de secuencia de 84% en el dominio de cadena beta de tirosina cinasa y una baja similitud de secuencia de 48% en el dominio de cadena alfa extracelular rico en cisteína (Ulrich, A., et al., 1986, EMBO, 5, 2503-2512; Fuj ita-Yamaguchi y., et al., 1986, J". Biol. Chem. , 261, 16727-16731; LeRoith, D., et al . , 1995, Endocrine Reviews, 16, 143-163) . El receptor IGF-I y sus ligandos (IGF-I e IGF-II) juegan importantes papeles en numerosos procesos fisiológicos incluyendo el crecimiento y el desarrollo durante la embriogénesis , metabolismo, proliferación celular y diferenciación celular en adultos (LeRoith, D., 2000, Endocrinology, 141, 1287-1288; LeRoith, D., 1997, New England J. Med. 336, 633-640). El IGF-I e IGF-II funcionan ambos como hormonas endocrinas en la sangre, en donde se encuentran predominantemente presentes en complejos con proteínas que enlazan IGF y como factores de crecimiento paracrino y autocrino que se producen localmente (Humbel, R.E., 1990, Eur. J. Biochem. , 1990, 445-462; Cohick, W.S. y Clemmons, D.R., 1993, Annu. Rev. Physiol., 55, 131-153). El receptor IGF-I se ha implicado en la promoción del crecimiento, la transformación y la supervivencia de las células tumorales (Baserga, R., et al., 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1332, F105-F126; Blakesley, V.A. , et al., 1997, Journal of Endocrinology, 152, 339-344; Kaleko, M . , Rutter, W.J. y Miller, A.D., 1990, Mol. Cell Biol . , 10, 464-473) . De este modo, se sabe que varios tipos de tumores expresan niveles más altos que los normales del receptor IGF-I, incluyendo el cáncer de seno, el cáncer de colon, el carcinoma ovárico, el sarcoma sinovial y el cáncer pancreático (Khandwala, H.M.,et al., 2000, Endocrine Reviews, 21. 215-244; Werner, H. y LeRoith, D.,1996, Adv. Cáncer Res., 68, 183-223; Happerfield, L.C., et al., 1997, J. Pathol . , 183, 412-417; Frier, S. et al., 1999, Gut, 44, 704-708; van Dam, P.A., et al., 1994, J. Clin. Pathol., 47, 914-919; Xie y. et al., 1999 Cáncer Res., 59, 3588-3591; Bergmann, U. et al., 1995, C ncer Res., 55, 2007-2011). El IGF-I e IGF-II in vitro, han demostrado ser potentes mitógenos para varias líneas celulares tumorales humanas tales como el cáncer pulmonar, cáncer de seno, cáncer de colon, osteosarcoma y cáncer cervical (Ankrapp, D.P.,y Bevan, D.R., 1993, Cáncer Res., 53, 3399-3404; Cullen, K.J.,1990, Cáncer Res., 50, 48-53; Hermanto, U., et al., 2000, Cell Growth & Differentiation, 11, 655-664; Guo y.S., et al., 1995, J. Am. Coll. Surg. , 181, 145-154; Kappel, C.C., et al., 1994, Cáncer Res., 54, 2803-2807; Steller, M.A., et al., 1996, Cáncer Res., 56, 1761-1765) . Varios de estos tumores y líneas celulares tumorales también expresan altos niveles de IGF-I o IGF-II, que pueden estimular su crecimiento de manera autocrina o paracrina (Quinn, K.A. , et al., 1996, J". Biol . Chem. , 271, 11477-11483). Estudios epidemiológicos han demostrado la correlación de un elevado nivel en plasma del IGF-I (y menor nivel de la proteína de enlace IGF 3) con un incrementado riesgo de cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de pulmón y cáncer de seno (Chan, J.M. , et al., 1998, Science, 279, 563-566; Wolk, A., et al., 1998, J. Nati., Cáncer Inst. , 90, 911-915; Ma, J., et al., 1999, J. Nati. Cáncer Inst., 91, 620-625; Yu, H. , et al . , 1999, J. Nati. Cáncer Inst., 91, 151-156; Hankinson, S.E., et al., 1998, Lancet, 351, 1393-1396) . Se han sugerido estrategias para disminuir el nivel de IGF-I en plasma o para inhibir la función del receptor IGF-I para la prevención del cáncer (Wu y., et al., 2002, Cáncer Res., 62, 1030-1035; Grimberg, A. y Cohén P. , 2000, J".
Cell Physiol., 183, 1-9). El receptor IGF-I protege las células tumorales de la apoptosis ocasionada por la privación del factor de crecimiento, la independencia al anclaje o el tratamiento con drogas citotóxicas (Navarro, M. y Baserga, . , 2001, Endocrinology, 142, 1073-1081; Baserga, R. , et al., 1997, Biochem. Biophys, Acta, 1332, F105-F126) . Los dominios del receptor IGF-I que son críticos para sus actividades mitogénas, de transformación y anti-apoptóticas se han identificado mediante análisis mutacional. Por ejemplo, el residuo 1251 de tirosina del receptor IGF-I se ha identificado como crítico para las actividades anti-apoptóticas y de transformación pero no para su actividad mitógena (O'Connor, R . , et al., 1997, Mol. Cell Biol., 17, 427-435; Miura, M. , et al., 1995, J". Biol . Che . , 270, 22639-22644) . La trayectoria de señalización intracelular del receptor IGF-I activado por ligando implica la fosforilación de los residuos de tirosina de los sustratos receptores de insulina (IRS-1 e IRS-2) , que reclutan fosfatidilinositol-3-cinasa (??-3-cinasa) para la membrana. Los productos de fosfolípidos unidos a la membrana de PI-3-cinasa activan una cinasa de serina/treonina Akt, cuyos sustratos incluyen la proteína pro-apoptótica BAD que se fosforila a un estado inactivo (Datta, S.R., Brunel, A. y Greenberg, .E., 1999, Genes & Development, 13, 2905-2927; Kulik, G . , Klippel, A. y Weber, M.J., 1997, Mol, Cell Biol . , 17, 1595-1606) . La señalización mitogena del receptor IGF-I en las células de cáncer de seno humano CF-7 requiere la PI-3-cinasa y es independiente de una cinasa de proteína activada por mitógeno, mientras que la señalización de supervivencia en células diferenciadas de feocromocitoma de rata PC12 requiere las trayectorias tanto de PI -3 -cinasa como de cinasa de proteína activada por mitógeno (Dufourny, B., efc al., 1997, J. Biol. Chem. , 272, 31163-31171; Parrizas, M. , Saltiel, A.R. y LeRoith, D., 1997, J". Biol. Chem., 272, 154-161) . La sub-regulación del nivel del receptor IGF-I mediante estrategias anti-sentido ha demostrado reducir la tumorigenidad de varias líneas celulares tumorales in vivo e in vitro, tales como el melanoma, carcinoma pulmonar, cáncer ovárico, glioblastoma, neuroblastoma y rabdomiosarcoma (Resnicoff, M. , et al., 1994, Cáncer Res., 54, 4848-4850; Lee, C.T. et al., 1996, Cáncer Res., 56, 3038-3041; Muller, M. et al., 1998, Int. J. Cáncer, 77, 567-571; Trojan, J. , et al., 1993, Science, 259, 94-97; Liu, X., et al., 1998, Cáncer Res., 58, 5432-5438; Shapiro, D.N. et al., 1994, J". Clin, Invest., 94, 1235-1242) . De manera similar, se ha reportado que un mutante dominante negativo del receptor IGF-I reduce la tumorigenia in vivo y el crecimiento in vitro de las células de Rata-1 transformadas que sobreexpresan el receptor IGF-I (Prager, D . , et al. , 1994, Proc. Nati . _¾cad Sci ¡7SA, 91, 2181-2185) . Las células tumorales que expresan un antisentido al AR m del receptor IGF-I experimentan una apoptosis masiva al inyectarse en animales en cámaras de biodifusión. Esta observación convierte al receptor IGF-I en un atractivo objetivo terapéutico, en base a la hipótesis de que las células tumorales son más susceptibles que las células normales a la apoptosis por la inhibición del receptor IGF-I (Resnicoff, M . , et al., 1995, Cáncer Res., 55, 2463-2469; Baserga, R. , 1995, Cáncer Res., 55, 249-252). Otra estrategia para inhibir la función del receptor IGF-I en células tumorales ha sido el uso de anticuerpos del receptor anti-IGF-I que se enlazan a los dominios extracelulares del receptor IGF-I e inhiben su activación. Se han reportado varios intentos para desarrollar anticuerpos monoclonales de ratón contra el receptor IGF-I, de los cuales se encuentran disponibles dos anticuerpos inhibidores - IR3 y 1H7 - y su uso se ha reportado en varios estudios del receptor IGF-I. El anticuerpo IR3 se desarrolló utilizando una preparación parcialmente purificada de placenta del receptor de insulina para inmunizar ratones, que produjo un anticuerpo, IR1, selectivo para enlazar al receptor de insulina y dos anticuerpos, IR2 e IR3, que mostraron una inmunoprecipitacion preferencial del receptor IGF-I (receptor somatomedin-C) pero también una débil inmunoprecipitacion del receptor de insulina (Kull, F.C., et al., 1983, J". Biol . Chem. , 258, 6561-6566). El anticuerpo 1H7 se desarrolló inmunizando ratones con una preparación purificada de placenta del receptor IGF-I, que produjo el anticuerpo inhibidor 1H7 además de tres anticuerpos estimuladores (Li, S.-L., et al., 1993, Bioche . Biophys. Res. Commun. , 196, 92-98; Xiong, L., et al., 1992, Proc. Nati. Acad Sci USA, 89, 5356-5360). En otro reporte, se obtuvo un panel de anticuerpos monoclonales de ratón específicos para el receptor IGF-I humano mediante la inmunización de ratones con células 3T3 transfectadas que expresan altos niveles del receptor IGF-I, que se categorizaron en siete grupos mediante estudios de competencia de enlace y por su inhibición o estimulación de enlace de IGF-I a las células 3T3 transfectadas (Soos, M.A. , et al., 1992, J". Biol. Chem., 267, 12955-12963). De este modo, aunque el anticuerpo IR3 es el anticuerpo inhibidor más comúnmente utilizado para estudios in vi tro del receptor IGF-I, éste sufre la desventaja de exhibir actividad agonística en células 3T3 y en células CHO transfectadas que expresan el receptor IGF-I humano (Kato, H., et al., 1993, J". Biol. Chem., 268, 2655-2661; Steele-Perkins, G. y Roth, R.A., 1990, Biochem. Biophys. Res.
Commun. , 171, 1244-1251). De manera similar, entre el panel de anticuerpos desarrollado por Soos et al., los anticuerpos más inhibidores 24-57 y 24-60 mostraron también actividades agonísticas en las células 3T3 transfectadas (Soos, M.A. , et al., 1992, J. Biol . Chem. , 267, 12955-12963). Aunque se reporta que el anticuerpo IR3 inhibe el enlace de IGF-I (pero no de IGF- II) a los receptores expresados en células intactas y después de la solubilización, se demuestra que inhibe la capacidad tanto de IGF-I como de IGF-II para estimular la síntesis de ADN en células In vitro (Steele-Perkins , G. y Roth, R.A., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun., 171, 1244-1251) . Se ha inferido a partir de construcciones quiméricas de insulina-receptor IGF-I, que el epítope de enlace del anticuerpo IR3 es la región 223-274 del receptor IGF-I (Gustafson, T.A. y Rutter, W.J., 1990, J". Biol. Chem., 265, 18663-18667; Soos, M.A., et al., 1992, J". Biol. Chem., 267, 12955-12963) . La línea celular humana MCF-7 de cáncer de seno se utiliza típicamente como una línea celular modelo para demostrar la respuesta de crecimiento del IGF-I e IGF- II in vitro (Dufourny, B., et al., 1997, J". Biol. Chem., 272, 31163-31171) . En células MCF-7, el anticuerpo IR3 bloquea de manera incompleta el efecto estimulante del IGF-I e IGF-II agregados de manera exógena en condiciones libres de suero por aproximadamente 80%. También, el anticuerpo IR3 no inhibe significativamente (menos del 25%) el crecimiento de células MCF-7 en suero al 10% (Cullen, K.J., et al., 1990, Cáncer Res., 50, 48-53) . Esta débil inhibición del crecimiento estimulado por suero de las células MCF-7 por medio del anticuerpo IR3 in vitro puede relacionarse con los resultados de un estudio in vivo en el cual el tratamiento con anticuerpo IR3 no inhibió significativamente el crecimiento de un xenoinjerto MCF-7 en ratones atímicos (Arteaga, C.L., et al., 1989, J". Clin. Invest. , 84, 1418-1423) . Debido a las débiles actividades agonísticas del IR3 y otros anticuerpos reportados y a su incapacidad para inhibir significativamente el crecimiento de células tumorales tales como las células MCF-7 en la condición más fisiológica de estimulación con suero (en lugar de la estimulación mediante IGF-I e IGF-II agregados de manera exógena en una condición libre de suero) , existe la necesidad de nuevos anticuerpos del receptor anti-IGF-I que inhiban significativamente el crecimiento estimulado con suero de las células tumorales pero que no muestren una actividad agonística significativa por sí mismos. SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con loanterior, es un objetivo de la invención proporcionar anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y derivados de anticuerpo que se enlazan específicamente al receptor del factor-I de crecimiento semejante a la insulina e inhiban la actividad celular del receptor antagonizando el receptor y también se encuentren sustancialmente exentos de actividad agonista hacia el receptor. De este modo, en una primera modalidad, se proporciona un anticuerpo murino EM164, que se caracteriza completamente en la presente con respecto a las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables de cadena tanto ligera como pesada, las secuencias de ADNc de los genes para las regiones variables de cadena ligera y pesada, la identificación de sus CDRs (regiones determinantes de complementariedad) , la identificación de sus aminoácidos de superficie y medios para su expresión en forma recombinante . En una segunda modalidad, se proporcionan versiones restauradas o humanizadas del anticuerpo EM164 en donde los residuos expuestos a la superficie del anticuerpo o sus fragmentos se reemplazan en ambas cadenas ligera y pesada para asemejarse más cercanamente a superficies conocidas del anticuerpo humano. Tales anticuerpos humanizados pueden tener una utilidad incrementada, en comparación con el EM164 murino, como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Las versiones humanizadas del anticuerpo EM164 se encuentran también completamente caracterizadas en la presente con respecto a sus respectivas secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ambas cadenas ligera y pesada, a las secuencias de ADN de los genes para las regiones variables de cadena ligera y pesada, a la identificación de las CDRs, a la identificación de sus aminoácidos de superficie y a la descripción de un medio para su expresión en forma recombinante . En una tercer modalidad, se proporciona un anticuerpo capaz de inhibir el crecimiento de una célula cancerosa por más de aproximadamente el 80% en presencia de un estimulante del crecimiento tal como, por ejemplo, el factor-I de crecimiento semejante a la insulina y el factor-II de crecimiento semejante a la insulina. En una cuarta modalidad, se proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una cadena pesada que incluye CDRs que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 1-3, respectivamente: SY MH (SEQ ID NO: 1) , EINPSNGRTNYNEKF R (SEQ ID NO: 2), GRPDYYGSSKWYFDV (SEQ ID NO: 3), y que tienen una cadena ligera que comprende CDRs que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID N0S:4-6: RSSQSIVHSNVNTYLE (SEQ ID NO : 4 ) , KVSNRFS (SEQ ID NO: 5), FQGSHVPPT (SEQ ID NO: 6). En una quinta modalidad, se proporcionan anticuerpos que tienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO : 7 : QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSY MHWV QRPGQGLEWIGEI NPSNGRTNYNEKFKRKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDY YGSSKWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 7) . De manera similar, se proporcionan anticuerpos que tienen una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8 : DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTK LEIKR (SEQ ID NO: 8) . En una sexta modalidad, se proporcionan anticuerpos que tienen una región variable de cadena ligera humanizada o restaurada que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una de las SEQ ID NOS: 9-12: DWMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGT KLEIKR (SEQ ID NO:9) ; DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGT KLEIKR (SEQ ID NO:10); DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNV TYLEWYLQKPGQSPRLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGT KLEIKR (SEQ ID N0:11); O DWMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHS VNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGT KLEIKR (SEQ ID N0:12). De manera similar, se proporcionan anticuerpos que tienen una región variable de cadena pesada humanizada o restaurada que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ ID NO: 13: QVQLVQSGAEW PGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEI NPSNGRTNYNQKFQGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDY YGSSKWYFD GQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 13) . En una séptima modalidad, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la presente invención que tienen propiedades mejoradas. Por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que tienen una afinidad mejorada para el receptor IGF-I se elaboran por maduración de afinidad de un anticuerpo o fragmento de la presente invención. La presente invención proporciona además conjugados de dichos anticuerpos, en donde un agente citotóxico se une covalentemente, directamente o a través de un enlazador desdoblable o no-desdoblable, a un anticuerpo o un fragmento de enlace de epítope de un anticuerpo de la presente invención. En modalidades preferidas, el agente citotóxico es un taxol, un maitansinoide, CC-1065 o un análogo de CC-1065. La presente invención proporciona además anticuerpos o fragmentos de los mismos que se marcan posteriormente para su uso en aplicaciones de investigación y diagnóstico. En modalidades preferidas, el marcador es un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de representación de imágenes o un ion metálico. También se proporciona un método para el diagnóstico en el cual dichos anticuerpos o fragmentos marcados se administran a un sujeto que se sospecha que tiene un cáncer y la distribución del marcador dentro del cuerpo del sujeto se mide y se monitorea. En una octava modalidad, la invención proporciona métodos para el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer, administrando un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención ya sea solo o en combinación con otros agentes citotóxicos o terapéuticos. El cáncer puede ser uno o más, por ejemplo, de cáncer de seno, cáncer de colon, carcinoma ovárico, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, carcinoma sinovial, cáncer pancreático u otro cáncer aún por determinar en el cual los niveles del receptor IGF-I se encuentran elevados .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el análisis de clasificación de las células activadas por fluorescencia (FACS) del enlace específico del anticuerpo EM164 purificado a las células que sobreexpresan el receptor Y1251FIGF-I humano o el receptor de insulina humana. La Figura 2 muestra una curva de valoración de enlace para el enlace del anticuerpo EM164 al receptor IGF-I humano biotínilado. La Figura 3 muestra la inhibición del enlace del IGF-I biotinilado a las células MCF-7 de cáncer humano de seno por medio del anticuerpo EM164. La Figura 4 muestra la inhibición de la autofosforilación estimulada con IGF-I del receptor IGF-I en células MCF-7 por medio del anticuerpo EM164. La Figura 5 muestra la inhibición de la fosforilación IRS-1 estimulada por IGF-I en células MCF-7 por medio del anticuerpo EM164. La Figura 6 muestra la inhibición de la transducción de señal estimulada con IGF-I en células SaOS-2 por medio del anticuerpo EM164. La Figura 7 muestra el efecto del anticuerpo EM164 sobre el crecimiento y supervivencia de las células MCF-7 bajo diferentes condiciones de crecimiento, como se determina por el ensayo MTT.
La Figura 8 muestra el efecto del anticuerpo EM164 sobre el crecimiento y supervivencia de las células MCF-7 en presencia de varias concentraciones de suero. La Figura 9 muestra la inhibición del crecimiento y la supervivencia de las células NCI-H838, estimulada con IGF-I y suero, por medio del anticuerpo EM164. La Figura 10 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo EM164, taxol o una combinación del anticuerpo EM164 y taxol, sobre el crecimiento de un xenoinjerto Calu-6 de cáncer pulmonar en ratones. La Figura 11 muestra la competencia entre el enlace del anticuerpo humanizado EM164 (v.1.0) y el anticuerpo murino EM164. La Figura 12 muestra el ADNc (SEQ ID NO: 49) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 50) de la región líder y variable de cadena ligera del anticuerpo EM164 del receptor anti-IGF-I murino. La flecha marca el inicio de la estructura 1. Se subrayan las 3 secuencias de CDR de acuerdo con Kabat. La Figura 13 muestra el ADNc (SEQ ID NO: 51) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 52) de la región líder y variable de cadena pesada para el anticuerpo EM164 del receptor anti-IGF-I murino. La flecha marca el inicio de la estructura 1. Se subrayan las 3 secuencias de CDR de acuerdo con Kabat . La Figura 14 muestra las secuencias de aminoácidos COR de cadena ligera y pesada del anticuerpo EM164 como se determina a partir de las definiciones de clases canónicas de Chothia. También se muestran las definiciones del software AbM de modelado para las CDRs de cadena pesada. Cadena Ligera: CDR1 es la SEQ ID NO: 4, CDR2 es la SEQ ID NO : 5 y la CDR3 es la SEQ ID NO: 6. Cadena Pesada: CDR1 es la SEQ ID NO:l, CDR2 es la SEQ ID NO: 2 y CDR3 es la SEQ ID NO : 3. Cadena Pesada AbM: CDR1 es la SEQ ID NO: 53, CDR2 es la SEQ ID NO: 54 y CDR3 es la SEQ ID NO: 55. La Figura 15 muestra las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y de cadena pesada para el anticuerpo EM164 del receptor anti-IGF-I alineadas con las secuencias de línea germinal para los genes Crl (SEQ ID NO: 56) y J558.C (SEQ ID NO: 57) . Los guiones (-) indican la identidad de secuencia. La Figura 16 muestra los plásmidos utilizados para construir y expresar los anticuerpos EM164 recombinantes quiméricos y humanizados. A) un plásmido de clonación de cadena ligera, B) un plásmido de clonación de cadena pesada, C) un plásmido de expresión de anticuerpo de mamífero. La Figura 17 muestra las 10 secuencias de aminoácidos más homologas de las cadenas ligeras identificadas de los 127 anticuerpos en la serie de los archivos de estructura utilizados para predecir los residuos de superficie de EM164. eml64 LC (SEQ ID NO:58), 2jel (SEQ ID NO:59), 2pcp (SEQ ID NO:60), lnqb (SEQ ID NO: 61), lkel (SEQ ID NO:62), Ihyx (SEQ ID NO:63), ligf (SEQ ID NO:64), ltet (SEQ ID NO: 65), lclz (SEQ ID NO: 66), lbln (SEQ ID NO: 67), lcly (SEQ ID NO:68), Consenso (SEQ ID NO:69). La Figura 18 muestra las 10 secuencias de aminoácidos más homologas de las cadenas pesadas identificadas de los 127 anticuerpos en el conjunto de archivos de estructura utilizados para predecir los residuos de superficie de EM164. eml64 HC (SEQ ID NO:70), Inqb (SEQ ID NO: 71), lngp (SEQ ID NO:72), lfbi (SEQ ID NO:73), lafv (SEQ ID NO:74), lyuh (SEQ ID NO:75), lplg (SEQ ID NO:76), ld5b (SEQ ID NO: 77), lae6 (SEQ ID NO: 78), laxs (SEQ ID NO: 79), 3hfl (SEQ ID NO:80), Consenso (SEQ ID NO:81). La Figura 19 muestra la accesibilidad promedio para cada uno de los residuos de región variable de cadena (A) ligera y (B) pesada de las 10 estructuras más homologas. Los números representan los números Kabat de la posición de la secuencia de anticuerpos. La Figura 20 muestra las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena ligera para los anticuerpos EM164 murino (muEM164) y EM164 humanizado (huEM164) . muEM164 (SEQ ID NO: 82), huEM164 VI .0 (SEQ ID NO: 83), huEM164 VI .1 (SEQ ID NO:84), huEM164 VI .2 (SEQ ID NO:85), huEM164 VI .3 (SEQ ID NO: 86) . La Figura 21 muestra las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada para anticuerpos EM164 murino (muEM164, SEQ ID NO:87) y humanizado (huEM164; SEQ ID NO:88) . La Figura 22 muestra las secuencias de ADN y de aminoácidos de región variable huEM164 vi .0 para ambas cadenas ligera (ADN, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 de aminoácidos) y pesada (ADN, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 de aminoácidos) . La Figura 23 muestra las secuencias de ADN y de aminoácidos de región variable de cadena ligera para el EM164 vl.l humanizado (ADN, SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO : 94 de aminoácidos), vi .2 (ADN, SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO:96 de aminoácidos) y vi .3 (ADN, SEQ ID NO: 97; y SEQ ID NO: 98 de aminoácidos) . La Figura 24 muestra la inhibición del crecimiento y supervivencia estimulados por IGF-I de las células MCF-7 mediante el anticuerpo EM164 vi .0 humanizado y el anticuerpo EM164 murino. La Figura 25 muestra que el EM164 suprime el ciclo estimulado por IGF-I de las células MCF-7. La Figura 26 muestra que el EM164 suprime el efecto anti-apoptótico de IGF-I y suero. El tratamiento con EM164 da como resultado la muerte celular apoptótica como se demostró por medio de los niveles incrementados de proteína CK18 desdoblada. La Figura 27 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo EM164, gemcitabina, o una combinación de anticuerpo EM164 y gemcitabina, sobre el crecimiento de xenoinjertos humanos de cáncer pancreático BxPC-3 en ratones inmunodeficientes . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han descubierto y mejorado nuevos anticuerpos que se enlazan específicamente al receptor del factor-I de crecimiento semejante a la insulina humano (IGF- IR) sobre la superficie celular. Los anticuerpos y fragmentos tienen la capacidad única de inhibir las funciones celulares del receptor sin la capacidad de activar el receptor por si mismos. De este modo, aunque los anticuerpos previamente conocidos que se enlazan específicamente e inhiben el IGF-IR también activan el receptor aún en ausencia de los ligandos IGF- IR, los anticuerpos o fragmentos de la presente invención antagonizan el IGF-IR pero se encuentran sustancialmente exentos de actividad agonista. Además, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente invención inhiben el crecimiento de las células tumorales humanas tales como las células MCF-7 en presencia de suero por más del 80%, lo cual es un mayor grado de inhibición que el obtenido utilizando anticuerpos anti-IGF-IR previamente conocidos . La presente invención procede de un anticuerpo anti-IGF-IR murino, en la presente EM164, que se encuentra completamente caracterizado con respecto a las secuencias de aminoácidos de cadenas tanto ligera como pesada, de la identificación de las CDRs, de la identificación de los aminoácidos de superficie y de los medios para su expresión en forma recombinante . Las secuencias de línea germinal se muestran en la Figura 15 alineadas con la secuencia de EM164. La comparación identifica probables mutaciones somáticas en el EM164, incluyendo una en cada CDR1 en la cadena ligera y en CDR2 en la cadena pesada. Se describen en la presente las principales secuencias de aminoácidos y de ADN de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo EM164 y de las versiones humanizadas. Sin embargo, el alcance de la presente invención no se limita a anticuerpos y fragmentos que comprenden estas secuencias. Más bien, todos los anticuerpos y fragmentos que se enlazan específicamente a un receptor del factor-I de crecimiento semejante a la insulina y antagonizan la actividad biológica del receptor, pero que se encuentran sustancialmente exentos de actividad agonista, caen dentro del alcance de la presente invención. Así, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pueden diferir del anticuerpo EM164 o de los derivados humanizados en las secuencias de aminoácidos de su andamiaje, CDRs, cadena ligera y cadena pesada y aún caer dentro del alcance de la presente invención.
Las CDRs del anticuerpo EM164 se identifican por su modelado y sus estructuras moleculares se han predicho. De nuevo, aunque las CDRs son importantes para el reconocimiento del epítope, no son esenciales para los anticuerpos y fragmentos de la invención. De acuerdo con esto, se proporcionan anticuerpos y fragmentos que tienen propiedades mejoradas producidas, por ejemplo, por maduración de afinidad de un anticuerpo de la presente invención. Pueden producirse fácilmente diversos anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, así como miméticos de anticuerpo por mutación, supresión y/o inserción dentro de las secuencias de región variable y constante que flanquean un conjunto particular de CDRs. Así, por ejemplo, son posibles diferentes clases de Ab para un conjunto dado de CDRs mediante la sustitución de diferentes cadenas pesadas, por medio de lo cual pueden producirse, por ejemplo, los tipos e isotipos de anticuerpos de IgGl-4, IgM, IgAl-2, IgD, IgE. De manera similar, pueden producirse anticuerpos artificiales dentro del alcance de la invención intercalando un conjunto dado de CDRs dentro de una estructura completamente sintética. El término "variable" se utiliza en la presente para describir ciertas porciones de los dominios variables que difieren en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en el enlace y la especificidad de cada anticuerpo particular a su antígeno. Sin embargo, la variabilidad comúnmente no se encuentra distribuida uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra típicamente en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan la estructura (FR) . Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera comprenden cada uno cuatro regiones de estructura, que adoptan mayormente una configuración beta-capa, conectada por tres CDRs, que forman bucles que conectan y en algunos casos forman parte de la estructura beta-capa. Las CDRs en cada cadena se sostienen juntas en proximidad cercana por medio de las regiones FR y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de los anticuerpos (E.A., Kabat et al., Sequences of Proteins of I unological Interest, quinta edición, 1991, NIH) . Los dominios constantes no se encuentran directamente implicados en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo . Los anticuerpos humanizados, o los anticuerpos adaptados para el no-rechazo por otros mamíferos, pueden producirse utilizando varias tecnologías tales como la restauración y el injerto de CDR. En la tecnología de restauración, se combinan modelado molecular, análisis estadístico y mutagenesis para ajustar las superficies no CDR de las regiones variables para asemejarse a las superficies de anticuerpos conocidos del huésped objetivo. Las estrategias y métodos para la restauración de anticuerpos y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos dentro de un huésped diferente, se describen en la Patente de E.U. 5,639,641, que se incorpora en la presente en su totalidad mediante la referencia. En la tecnología de injertos de CDR, las CDRs de murino de cadena pesada y ligera se injertan en de una secuencia de estructura totalmente humana . La invención incluye también equivalentes funcionales de los anticuerpos descritos en esta especificación. Los equivalentes funcionales tienen características de enlace comparables a las de los anticuerpos, e incluyen, por ejemplo, anticuerpos quimerizados, humanizados y de cadena única, así como sus fragmentos. Los métodos para producir tales equivalentes funcionales se describen en la Solicitud del PCT WO 93/21319, la Solicitud de Patente Europea No. 239,400; la Solicitud del PCT WO 89/09622; la Solicitud de Patente Europea 338,745; y la Solicitud de Patente Europea EP 332,424, que se incorporan en su respectiva totalidad mediante la referencia.
Los equivalentes funcionales incluyen polipéptidos con secuencias de aminoácidos que son sustancialmente la misma que la secuencia de aminoácidos de las regiones variable o hipervariable de los anticuerpos de la invención. "Sustancialmente la misma" como se aplica a una secuencia de aminoácidos se define en la presente como una secuencia con al menos aproximadamente 90% y más preferentemente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con otra secuencia de aminoácido, como se determina por el método de investigación FASTA de acuerdo con Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad Sel USA 85, 2444-2448 (1998) . Los anticuerpos quimerizados tienen preferentemente regiones constantes derivadas sustancialmente o exclusivamente de las regiones constantes de anticuerpo humano y las regiones variables derivadas sustancialmente o exclusivamente de la secuencia de la región variable de un mamífero diferente de un humano. Las formas humanizadas de los anticuerpos se elaboran sustituyendo las regiones determinantes de complementariedad, por ejemplo, de un anticuerpo de ratón, en un dominio de estructura humano, e.g., ver Pub. del PCT No. W092/22653. Los anticuerpos humanizados tienen preferentemente regiones constantes y regiones variables diferentes de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) derivadas sustancialmente o exclusivamente de las regiones del anticuerpo humano correspondiente y las CD s derivadas sustancíalmente o exclusivamente de un mamífero diferente a un humano. Los equivalentes funcionales incluyen también fragmentos de anticuerpo de cadena única, también conocidos como anticuerpos de cadena única (scFvs) . Estos fragmentos contienen al menos un fragmento de un anticuerpo de secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable (VH) atada a al menos un fragmento de un anticuerpo de secuencia de cadena ligera variable (VL) con o sin uno o más enlazadores de interconexión. Tal enlazador puede ser un péptido corto, flexible seleccionado para asegurar que se presente la duplicación tridimensional apropiada de los dominios (VL) y (VH) una vez enlazados a fin de mantener la especificidad de enlace de la molécula objetivo de todo el anticuerpo a partir de la cual se deriva el fragmento de anticuerpo de cadena única. Generalmente, la terminal carboxilo de la secuencia (VL) o (VH) puede enlazarse covalentemente mediante tal enlazador de péptido a la terminal de aminoácido de una secuencia (VL) y (VH) complementaria. Los fragmentos de anticuerpo de cadena única pueden generarse mediante clonación molecular, bibliotecas de anticuerpos de imagen fago o técnicas similares. Estas proteínas pueden producirse ya sea en células eucarióticas o en células procarióticas, incluyendo bacterias . Los fragmentos de anticuerpo de cadena única contienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos una de las regiones determinantes de variable o complementariedad (CDRs) de todos los anticuerpos descritos en esta especificación, pero carecen de uno o todos los dominios constantes de esos anticuerpos. Estos dominios constantes no son necesarios para el enlace de antígeno, pero constituyen una porción principal de la estructura de los anticuerpos completos. Los fragmentos de anticuerpo de cadena única pueden superar en consecuencia algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos que contienen una parte o todo un dominio constante. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo de cadena única tienden a encontrarse libres de interacciones no deseadas entre las moléculas biológicas y la región constante de cadena pesada u otra actividad biológica no deseada. Adicionalmente, los fragmentos de cadena única son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos y por tanto pueden tener una mayor permeabilidad capilar que los anticuerpos completos, permitiendo que los fragmentos de anticuerpo de cadena única localicen y se enlacen a sitios objetivo de enlace de antígeno más eficientemente. También los fragmentos de anticuerpo pueden producirse relativamente a gran escala en células procarióticas, facilitando así su producción. Además, el tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de anticuerpo de cadena única los hace menos propensos a provocar una respuesta inmune en un recipiente que los anticuerpos completos . Los equivalentes funcionales incluyen además fragmentos de anticuerpos que tienen las mismas o comparables características de enlace que las del anticuerpo completo. Tales fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2- Preferentemente los fragmentos de anticuerpo contienen todas las seis regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo completo, aunque los fragmentos que contienen menos de todas tales regiones, tales como tres, cuatro o cinco CDRs, también son funcionales. Además, los equivalentes funcionales pueden ser o pueden combinar miembros de cualquiera de las siguientes clases de inmunoglobulina : IgG, IgM, IgA, IgD o IgE y sus subclases. El conocimiento de las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico para el anticuerpo EM164 del receptor anti-IGF-I y sus variantes humanizadas, que se describen en la presente, pueden utilizarse para desarrollar otros anticuerpos que también se enlazan al receptor IGF-I humano e inhiben las funciones celulares del receptor IGF-I. Varios estudios han sobrevivido los efectos de introducir uno o más cambios de aminoácidos en varias posiciones en la secuencia de un anticuerpo, en base al conocimiento de la secuencia primaria de anticuerpos, en sus propiedades tales como enlace y nivel de expresión (Yang, W.P., et al., 1995, J". Mol.
Biol., 254, 392-403; Arder, C, et al., Proc. Nati. Acad Sci USA 95, 8910-8915; Vaughan, T.J., et al . , 1998, Nature Biotechnology, 16 535-539) . En estos estudios, se han generado las variantes del anticuerpo primario cambiando las secuencias de los genes de cadena pesada y ligera en la CDR1, CDR2, CDR3 o las regiones de estructura, utilizando métodos tales como mutagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleótido , mutagénesis de cásete, PCR propenso a error, redistribución de ADN, o especies mutadoras de E. coli (Vaughan, T.J., et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, N.B., et al., 1996, Capítulo 16, pp. 277-291, en "Phage Display of Peptides and Proteins" , Eds . Kay, B.K., et al., Academic Press) . Estos métodos de cambio de la secuencia del anticuerpo primario han dado como resultado afinidades mejoradas de los anticuerpos secundarios (Gram, H. , et al., 1992, Proc. Nati. Acad Sci USA, 89, 3576-3580; Boder, E.T., et al., 2000, Proc. Nati. Acad Sci USA, 97, 10701-10705; Davies, J. y Riechmann, L., 1996, Immunotechnology, 2, 169-179; Thompson, J. , et al., 1996, J. Mol. Biol., 256, 77-88; Short, M.K. et al., J. Biol. Chem. , 277, 16365-16370; Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276, 27622-27628). Mediante una estrategia dirigida similar de cambiar uno o más residuos de aminoácidos del anticuerpo, las secuencias de anticuerpo descritas en esta invención pueden utilizarse para desarrollar anticuerpos del receptor anti-IGF-I con funciones mejoradas. Los conjugados de la presente invención comprenden el anticuerpo, fragmentos y sus análogos como se describe en la presente, enlazados a un agente citotóxico. Los agentes citotóxicos preferidos son maitansinoides, taxanos y análogos de CC-1065. Los conjugados pueden prepararse mediante métodos in vi tro. A fin de enlazar el agente citotóxico al anticuerpo, se utiliza un grupo de enlace. Los grupos de enlace adecuados son muy conocidos en la técnica e incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos de ácido lábil, grupos fotolábiles, grupos de peptidasa lábil y grupos esterasa lábil . Los grupos de enlace preferidos son los grupos disulfuro y los grupos tioéter. Por ejemplo, los conjugados pueden construirse utilizando una reacción de intercambio disulfuro o formando un enlace tioéter entre el anticuerpo y el agente citotóxico. Los maitansinoides y los análogos de maitansinoide se encuentran entre los agentes citotóxicos preferidos . Ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen maitansinoides y análogos de maitansinoide. Los maitansinoides adecuados se describen en las Patentes de E.U. Nos. 4,424,219, 4.256,746; 4,924,757; 4.307, 016; 4,313, 945; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,332,348; 4,371,533; 6,33,419; 5,475,092; 5,585,499 y 5,486,545.
También los taxanos son agentes citotóxicos preferidos. Los taxanos adecuados para su uso en la presente invención se describe en las Patentes de los E.U. Nos. 6,372, 738 y 6,340,701. También son drogas citotóxicas preferidas para su uso en la presente invención CC-1065 y sus análogos. El CC-1065 y sus análogos se describen también en las Patentes de E.U. Nos. 6,372,738; 6,340,701; 5,846,545 y 5,585,499. Un candidato atractivo para la preparación de tales conjugados citotóxicos es CC-1065, que es un potente antibiótico anti-tumoral aislado del caldo de cultivo de Streptomyces zelensis . El CC-1065 es aproximadamente 1000 veces más potente in vitro de lo que son las drogas anticáncer comúnmente utilizadas, tales como doxorubicin, metotrexato y vincristina (B.K. Bhuyan et al., Cáncer Res., 42, 3532-3537 (1982) ) . Las drogas citotóxicas tales como metotrexato, daunorubicin, doxorubicin, vincristina, vinblastina, malfalan, mitomicina C, clorambucil y caliqueamicina también son adecuadas para la preparación de los conjugados de la presente invención y las moléculas de drogas también pueden enlazarse a las moléculas del anticuerpo a través de una molécula portadora intermediaria tal como una albúmina de suero . Para aplicaciones diagnósticas, los anticuerpos de la presente invención típicamente se marcarán con un residuo detectable. El residuo detectable puede ser cualquiera capaz de producir ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el residuo detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 1C, 32P, 35S, o 131I; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluorescencia, rodamina, o luciferina; o un enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante . Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo al residuo detectable, incluyendo los métodos descritos por Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol . Meth. 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem and Cytochem. 30:407 (1982). Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de enlace competitivo, ensayos de intercalado directo e indirecto y ensayos de inmunoprecipi ación (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)). Los anticuerpos de la invención también son útiles para la visualización in vivo, en donde un anticuerpo marcado con un residuo detectable tal como un agente radio-opaco o radioisótopo se administra a un sujeto, preferentemente en la corriente sanguínea y se analiza la presencia y la localización de un anticuerpo marcado en el huésped. Esta técnica de visualización se útil en las etapas y tratamiento de malignidades. El anticuerpo puede marcarse con cualquier residuo que sea detectable en un huésped ya sea mediante resonancia magnética nuclear, radiología, u otro medio de detección conocido en la técnica. Los anticuerpos de la invención también son útiles como agentes de purificación de afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o papel filtro, utilizando métodos muy conocidos en la técnica. Los anticuerpos de la invención también son útiles como reactivos en la investigación biológica, en base a su inhibición de la función del receptor IGF-I en las células. Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos o conjugados de la invención se administran a un sujeto, en una forma de dosis farmacéuticamente aceptable. Pueden administrarse de manera intravenosa como una inyección rápida o mediante infusión continua a lo largo de un período de tiempo, por vías intramuscular, subcutánea, intra-articular, intra-sinovial , intratecal, oral, tópica o por inhalación. El anticuerpo también puede administrarse mediante vías intratumoral , peritumoral, intralesional , o perilesional , para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos . Los vehículos, diluyentes y excipientes adecuados farmacéuticamente aceptables son muy conocidos y pueden determinarse por los expertos en la técnica según lo garantice la situación clínica. Ejemplos de vehículos, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen: (1) salina de fosfato amortiguada de Dulbecco, pH aproximadamente 7.4, conteniendo aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml de albúmina de suero humano, (2) salina al 0.9% (0.9% w/v NaCl) y (3) 5% (w/v) dextrosa. El método de la presente invención puede practicarse in vítro, in vivo o ex vivo. En otros tratamientos terapéuticos, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o conjugados de la invención se co-administran con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes citotóxicos o citostáticos . Taxol es un agente terapéutico preferido que es también un agente citotóxico. Los agentes terapéuticos para el cáncer son aquellos agentes que buscan destruir o limitar el crecimiento de las células cancerosas mientras hace un daño mínimo al huésped. De este modo, tales agentes pueden explotar cualquier diferencia en las propiedades de la célula cancerosa (e.gr., metabolismo, vascularización o presentación del antígeno de superficie celular) de células huésped sanas. Las diferencias en la morfología del tumor son sitios potenciales para la invención: por ejemplo, el segundo terapéutico puede ser un anticuerpo tal como un anticuerpo anti-VEGF útil para retrasar la vascularización del interior de un tumor sólido, por medio de lo cual muestra su tasa de crecimiento. Otros agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, auxiliares tales como granisetron HCL, inhibidores andrógenos tales como acetato de leuprolida, antibióticos tales como doxorubicin, antiestrógenos tales como tamoxifen, antimetabolitos tales como alfa-2a interferon, agentes citotóxicos tales como taxol , inhibidores de enzima tales como el inhibidor ras farnesil-transferasa, inmunomoduladores , tales como aldesleucina y derivados de mostaza de nitrógeno tales como melfalan HCl y lo similar. Cuando se encuentra presente en forma de dosis acuosa, en lugar de encontrarse liofilizado, típicamente el anticuerpo se formulará a una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a 100 mg/ml, aunque se permite una amplia variación fuera de estos rangos. Para el tratamiento de enfermedad, la dosis apropiada del anticuerpo o conjugado dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, como se definió anteriormente, la severidad y el curso de la enfermedad, de si los anticuerpos se administran para propósitos preventivos o terapéuticos, el curso de la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo y la discreción del médico que lo atiende. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la severidad de la enfermedad, aproximadamente 0.015 a 15 mg de anticuerpo/kg del peso del paciente es una dosis candidato inicial para su administración al paciente ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Para administraciones repetidas o de varios días o más largas, dependiendo de la condición, el tratamiento se repite hasta que se presenta la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, no se excluyen otros regímenes de dosificación y pueden utilizarse. EJEMPLOS La invención se describe ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que son solo ilustrativos y no pretenden limitar la presente invención. EJEMPLO 1 ; Anticuerpo EM164 Murino En este primer ejemplo, se describe la estructura primaria de aminoácido completa y la secuencia de ADNc de un anticuerpo murino de la presente invención, junto con sus propiedades de enlace y medios para su expresión en forma recombinante . De acuerdo con esto, se proporciona una total y completa descripción de un anticuerpo de la invención y su preparación, de modo que el de experiencia ordinaria en la técnica inmunológica será capaz de preparar dicho anticuerpo sin experimentación indebida. A. Generación del Hibridoma de Anticuerpo Monoclonal del Receptor Anti-IGF-I Se utilizó una linea celular que expresa el receptor IGF-I humano con una mutación Y1251F para la inmunización dado que expresó un alto número de receptores IGF-I (~107 por célula) . La mutación Y1251F en el dominio citoplásmico del receptor IGF-I dio como resultado la pérdida de transformación y una señalización anti-apoptótica, pero no afectó el enlace de IGF-I y la señalización mitogénica estimulada por IGF-I (O'Connor, R. , et al., 1997, Mol. Cell Biol., 17, 427-435; Miura, . , et al., 1995, J. Biol . Chem. , 270, 22639-22644) . La mutación no afectó de otra manera la generación de anticuerpos debido a que el anticuerpo de este ejemplo se enlazó al dominio extracelular del receptor IGF-I, que fue idéntico tanto para el receptor Y1251F como para el receptor de tipo silvestre. Se generó una línea celular que expresa el receptor IGF-I con una mutación Y1251F a partir de las células semejantes a 3T3 de un ratón deficiente en receptor IGF-I mediante transfección con el gen mutante Y1251F del receptor IGF-I humano junto con un gen de resistencia a puromicina y se seleccionó utilizando puromicina (2.5 microgramos/mL) y mediante selección FACS para alta expresión del receptor IGF-I (Miura, M. , et al., 1995, J. Biol. Che ., 270, 22639- 22644) . Se seleccionó además una línea celular que tiene un alto nivel de expresión del receptor IGF-I utilizando una alta concentración de puromicina tal como 25 microgramos/mL, que fue tóxica para la mayoría de las células. Las colonias sobrevivientes se eligieron y se seleccionaron las que mostraron un alto nivel de expresión del receptor IGF-I. Ratones hembra CAF1/J, de 6 meses de edad, se inmunizaron intraperitonealmente en el día 0 con células imitante Y1251F que sobreexpresan el receptor IGF-I humano (células 5xl05, suspendidas en 0.2 mL PBS) . Los animales se reforzaron con 0.2 mL de suspensión celular como sigue: día 2, células 2 x 106; días 7, 9, 12 y 23, células 1 x 107. En el día 26, se sacrificó un ratón y se retiró su bazo. El bazo se apoyó entre dos hojas delgadas de vidrio congelado para obtener una suspensión de célula única, que se lavó con medio RPMI libre de suero conteniendo penicilina y estreptomicina (SFM) . El granulo celular de bazo se resuspendió en 10 mL de solución de cloruro de amonio 0.83% (w/v) en agua durante 10 min. sobre hielo para lisar las células de sangre roja y se lavó entonces con medio libre de suero (SMF) . Las células del bazo (1.2 x 108) se concentraron con células de mieloma (4xl07) de la línea celular P3X63Ag8.653 de mieloma de ratón no secretora (ATCC, Rockville, MD; Cat # CRL1580) en un tubo y se lavaron con medio RPMI-1640 libre de suero. El sobrenadante se retiró y el gránulo celular se resuspendió en el medio residual . El tubo se colocó en un vaso de precipitación con agua a 37 °C y se agregó lentamente 1.5 mL de solución de glicol polietileno (50% PEG (w/v) , peso molecular promedio 1500 en 75 mM HEPES, pH 8) a una tasa de goteo de 0.5 mL/minuto mientras que el tubo se agitó suavemente. Después de una espera de un minuto, se agregaron 10 mL de SFM como sigue: 1 mL a lo largo del primer minuto, 2 mL a lo largo del segundo minuto y 7 mL a lo largo del tercer minuto. Otros 10 mL se agregaron entonces lentamente a lo largo de un minuto. Las células se aglomeraron por centrifugación, se lavaron con SFM y se resuspendieron en medio de crecimiento RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 5% (FBS) , hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT) , penicilina, estreptomicina y suplemento de clonación de hibridoma al 10% (HCS) . Las células se sembraron en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos en células de bazo 2xl05 en 200 i por pozo. Después de 5-7 días, 100 mL por pozo se retiraron y se recolocaron con medio de crecimiento suplementado con hipoxantina/timidina (HT) y FBS al 5%. Las condiciones generales utilizadas para la inmunización y la producción de hibridoma fueron como se describió por J. Langone y H. Vunakis (Eds., Methods in Enzymology, Vol . 121, "Immunochemical Techniques, Part I", 1986; Academic Press, Florida) y E. Harlow y D Lañe ( "Antibodies : A Laboratory Manual"; 1988; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) . También pueden utilizarse otras técnicas de inmunización y producción de hibridoma, como se conocen bien por los expertos en la técnica. Se identificaron sobrenadantes de clones de hibridoma para enlazarse al receptor IGF-I humano purificado mediante ELISA, para su enlace específico a células que sobreexpresan el receptor IGF-I humano y por la carencia de enlace a células que sobreexpresan el receptor de insulina humano mediante detección ELISA y FACS como se describe abajo. Los clones que exhiben mayor afinidad de enlace a las células que sobreexpresan el receptor IGF-I humano que a las células que sobreexpresan el receptor de insulina humano se expandieron y se sub-clonaron. Los sobrenadantes del cultivo de los sub-clones se identificaron posteriormente mediante los ensayos de enlace anteriores. Mediante este procedimiento, se seleccionó el sub-clon 3F1-C8-D7 (EM164) y los genes de cadena pesada y ligera se clonaron y secuenciaron como se describe abajo. El receptor IGF-I humano se aisló para su uso en la detección de sobrenadantes a partir de clones de hibridoma por su enlace al receptor IGF-I mediante el método abajo. Se preparó IGF-I biotinilado mediante la modificación de IGF-I recombinante utilizando reactivos de biotinilación tales como sulfo-NHS-LC-biotina, sulfo-NHS-SS-biotina o NHS-PE04-biotina. El IGF-I biotinilado se absorbió en perlas de estreptavidina-agarosa y se incubó con lisado de células que sobreexpresaron el IGFR humano de tipo silvestre o Y1251F. Las perlas se lavaron y se eluyeron con un amortiguador conteniendo 2 a 4 de urea y detergente tal como protón X-100 u octil-^-glucosida . El receptor IGF-I eluido se dializó contra el PBS y se analizó para su pureza mediante SDS-PAGE bajo condicionéis reducidas, que mostraron bandas de cadena alfa y beta del receptor IGF-I de pesos moleculares de aproximadamente 135 kDa y 95 kDa, respectivamente. Para verificar el enlace de los sobrenadantes de hibridoma al receptor IGF-I purificado, se recubrió una placa Immulon-4HB ELISA (Dynatech) con una muestra del receptor IGF-I humano purificado (preparado mediante diálisis a partir de la elusión urea/octil^-glucosida de la muestra de afinidad purificada) diluido en 50 mM de amortiguador CHES a pH 9.5 (100 L; 4°C, durante la noche). Los pozos se bloquearon con 200 mL de amortiguador de bloqueo (10 µg mL de BSA en amortiguador TBS-T conteniendo 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7.5 y 0.1% de tween-20) y se incubaron con sobrenadantes de clones de hibridoma (100 uL; diluidos en amortiguador de bloqueo) durante aproximadamente 1 h a 12 h, se lavaron con amortiguador TBS-T y se incubaron con un conjugado de cabra-anti-ratón-IgG-Fc-anticuerpo-peroxidasa de rábano picante (HRP) (100 µL; 0.8 g/mL en amortiguador de bloqueo; Jackson ImmunoResearch Laboratories) , seguido por lavados y detección utilizando sustrato ABTS/H202 a 405 nm (0.5 mg/mL ABTS , 0.03% H202 en 0.1 M de amortiguador de citrato, pH 4.2). Típicamente, un sobrenadante de un sub-clon de hibridoma 3F1 produjo una señal de aproximadamente 1.2 unidades de absorbencia dentro de los 3 min de desarrollo, en contraste con los valores de 0.0 obtenidos por sobrenadantes de algunos otros clones de hibridoma. Las condiciones generales para este ELISA fueron similares a las condiciones estándar de ELISA para el enlace y detección de anticuerpo como se describió por E. Harlow y D. Lañe ("Using Antibodies : A Laboratory Manual"; 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) , cuyas condiciones también pueden utilizarse . La identificación de los sobrenadantes de hibridoma para el enlace específico al receptor IGF-I humano y no al receptor de insulina humano se llevó a cabo utilizando ELISA en líneas celulares que sobreexpresaron el receptor Y1251F-IGF-I humano y en líneas celulares que sobreexpresaron el receptor de insulina humano. Ambas líneas celulares se generaron de células similares a 3T3 de ratones deficientes en receptor IGF-I. Las células que sobreexpresan el receptor IGF-I y las células que sobreexpresan el receptor de insulina se cosecharon por separado de matraces de cultivo de tejido mediante tratamiento rápido de tripsina/EDTA, se suspendieron en un medio de crecimiento conteniendo 10% FBS, se granularon por centrifugación y se lavaron con PBS . Las células lavadas (100 mL de aproximadamente 1-3 x 105 células/mL) se agregaron a pozos de una placa Immulon-2HB recubierta con fitohemaglutinina (100 mL de 20 pg/mL de PHA) , se centrifugaron y se dejaron adherir a los pozos recubiertos con PHA durante 10 min. La placa con células se sacudió ligeramente para retirar el PBS y entonces se secó durante la noche a 37°C. Los pozos se bloquearon con 5 mg/mL de solución de BSA en PBS durante 1 h a 37°C y después se lavaron suavemente con PBS . Los alícuotas de sobrenadantes de los clones de hibridoma (100 pL; diluidos en amortiguador de bloqueo) se agregaron entonces a pozos conteniendo células que sobreexpresan el receptor IGF-I y a pozos conteniendo células que sobreexpresan el receptor de insulina y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Los pozos se lavaron con PBS, se incubaron con conjugado de cabra-anti-ratón-IgG-Fc-anticuerpo-peroxidasa de rábano picante (HRP) (100 yL; 0.8 pg/mL en amortiguador de bloqueo) durante 1 h, seguido por lavados y entonces se detectó el enlace utilizando un sustrato ABTS/H202) . Un sobrenadante típico de un sub-clon de hibridoma 3F1 a su incubación con células que sobreexpresan el receptor IGF-I produjo una señal de 0.88 unidades de absorbencia dentro de los 12 min de desarrollo, en contraste con un valor de 0.22 unidades de absorbencia obtenidas a su incubación con células que sobreexpresan el receptor de insulina humano. El hibridoma se cultivó en matraces Integra CL 350 (Integra Biosciences, Maryland) , de acuerdo con las especificaciones del fabricante, para proporcionar anticuerpo EM164 purificado. Se obtuvo un rendimiento de aproximadamente 0.5-1 mg/mL de anticuerpo en los sobrenadantes cosechados de los matraces Integra, en base a la cuantificación por ELISA y por SDS-PAGE/teñido con azul de Coomassie utilizando los estándares de anticuerpo. El anticuerpo se purificó mediante cromatografía de afinidad en una columna de perlas de Proteína A-agarosa bajo condiciones estándar de purificación de carga y lavado en 100 mM de amortiguador Tris, pH 8.9, conteniendo 3 M de NaCl, seguido por la elusión en 100 mM de solución de ácido acético conteniendo 150 mM de NaCl . Las fracciones eluidas conteniendo anticuerpo se neutralizaron con 2 M solución fría de K2HP04 y se dializaron en PBS a 4°C. La concentración del anticuerpo se determinó midiendo la absorbencia a 280 nm (coeficiente de extinción = 1.4 mg-1 mL cm-1) . La muestra de anticuerpo purificada se analizó mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y teñido con azul de Coomassie, lo cual indicó solo bandas de cadena pesada y ligera del anticuerpo a aproximadamente 55 kDa y 25 kDa, respectivamente. El isotipo del anticuerpo purificado fue IgGl con cadena ligera kappa. B. Caracterización del enlace del Anticuerpo EM164 El enlace específico del anticuerpo EM164 purificado se demostró mediante selección celular de fluorescencia activada (FACS) utilizando células que sobreexpresan el receptor IGF-I humano y utilizando células que sobreexpresan el receptor de insulina humano (Figura 1) . La incubación del anticuerpo EM164 (50-100 mM) en 100 ]i de amortiguador FACS frío (1 mg/mL de BSA en medio MEM de Dulbecco) se llevó a cabo utilizando células que sobreexpresan el receptor IGF-I y utilizando células que sobreexpresan el receptor de insulina (2 x 105 células/mL) en una placa de 96 pozos de fondo redondeado durante 1 h. Las células se granularon por centrifugación y se lavaron con amortiguador FACS frío sacudiendo ligeramente, seguido por incubación con el conjugado de cabra-anti-ratón-IgG-Fc-anticuerpo-peroxidasa de rábano picante (HRP) (100 ]iL; 10 µg/mL en amortiguador FACS) sobre hielo durante 1 h. Las células se granularon, se lavaron y se resuspendieron en 120 mL de solución de formaldehído al 1% en PBS . La placa se analizó utilizando un lector FACSCalibur (BD Biosciences) . Se obtuvo un fuerte cambio de fluorescencia al incubar las células que sobreexpresan el receptor IGF-I con anticuerpo EM 164, en contraste con un cambio insignificante al incubar células que sobreexpresan el receptor de insulina con anticuerpo EM164 (Figura 1) , lo que demostró que el anticuerpo EM164 fue selectivo en su enlace al receptor IGF-I y no se enlazó al receptor de insulina. Los anticuerpos de control, el anticuerpo del receptor anti-IGF-I 1H7 (Santa Cruz Biotechnology) y el anticuerpo alfa del receptor antiinsulina (BD Pharmingen Laboratories) , produjeron cambios de fluorescencia a su incubación con células que sobreexpresan el receptor IGF-I y el receptor de insulina, respectivamente (Figura 1) . Un fuerte cambio de fluorescencia se observó también por medio del ensayo FACS utilizando anticuerpo EM 164 y células MCF-7 de cáncer de seno humano, que expresaron el receptor IGF-I (Dufourny, B. et al., 1997, J. Biol .. Chem. 272, 31163-31171), que mostraron que el anticuerpo EM164 enlazado al receptor IGF-I humano en la superficie de células tumorales humanas . La constante de disociación (¾) para el enlace del anticuerpo EM164 con el receptor IGF-I humano se determinó mediante valoración ELISA del enlace del anticuerpo a varias concentraciones ya sea con el receptor IGF-I directamente recubierto (purificado por afinidad utilizando IGF-I biotinilado como anteriormente) , o el receptor IGF-I biotinilado indirectamente capturado. El receptor biotinilado IGF-I se preparó mediante la biotinilación del lisado solubilizado con detergente a partir de células que sobreexpresan el receptor IGF-I utilizando reactivo PEO-maleimida, biotina (Pierce, Molecular Biosciences) , que se purificó por afinidad utilizando un anticuerpo de cadena beta del receptor anti-IGF-I inmovilizado en perlas de NHS-agarosa y se eluyó con 2-4 M de urea en amortiguador conteniendo detergente NP-40 y dializado en PBS . La determinación de i¾ para el enlace del anticuerpo EM164 con receptor IGF-I biotinilado se llevó a cabo recubriendo placas Immulon-2HB con 100 µL de 1 pg/mL de estreptavidina en amortiguador de carbonato (150 mM de carbonato de sodio, 350 mM de bicarbonato de sodio) a 4°C durante la noche. Los pozos recubiertos con estreptavidina se bloquearon con 200 de amortiguador de bloqueo (19 mg/mL de BSA en amortiguador TBS-T) , se lavaron con amortiguador TBS-T y se incubaron con receptor IGF-I biotinilado (10 a 100 ng) durante 4 h a temperatura ambiente . Los pozos conteniendo receptor IGF-I biotinilado indirectamente capturado se lavaron entonces y se incubaron con anticuerpo EM164 en amortiguador de bloqueo a varias concentraciones (5.1 x 10"13 M para 200 nM) durante 2 h a temperatura ambiente y se incubaron después durante la noche a 4°C. Los pozos se lavaron enseguida con amortiguador TBS-T y se incubaron con conjugado de cabra-anti-ratón-IgG-Fc-anticuerpo-peroxidasa de rábano picante (100 L; 0.5 pg/mL en amortiguador de bloqueo) , seguido por lavados y detección utilizando sustrato ABTS/¾02 a 405 nm. El valor de i¾ se estimó mediante regresión no lineal para el enlace en un sitio. Se llevó a cabo una valoración de enlace similar utilizando el fragmento Fab del anticuerpo EM164, preparado mediante digestión de papaína del anticuerpo como se describe por E. Harlow y D. Lañe ("Using Antibodies: A Laboratory Manual"; 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) . El declive de valoración de enlace para el enlace del anticuerpo EM164 al receptor IGF-I humano biotinilado produjo un valor Kd de 0.1 nM (Figura 2) . El fragmento Fab del anticuerpo EM164 también se enlazó al receptor IGF-I humano muy estrechamente con un valor Kd de 0.3 nM, lo que indicó que el enlace monomérico del anticuerpo EM164 al receptor IGF-I también fue muy fuerte. Este valor extremadamente bajo de la constante de disociación para el enlace del receptor IGF-I por el anticuerpo EM164 se debió en parte a una proporción Kotf muy lenta como se verificó por las fuertes señales de enlace observadas después de lavados prolongados de 1-2 días del anticuerpo enlazado al receptor IGF-I. El anticuerpo EM164 puede utilizarse para la inmunoprecipitación del receptor IGF-I, como se demostró mediante la incubación del lisado solubilizado con detergente de las células MCF-7 de cáncer de seno humano con el anticuerpo E 164 inmovilizado en perlas de proteína G-agarosa (Pierce Chemical Co pany) . Un inmunoanálisis del inmunoprecipitado del anticuerpo EM164 se detectó utilizando anticuerpo policlonal de conejo anti-IGF-I de cadena beta (C-terminus) (Santa Cruz Biotechnology) y un conjugado de cabra-anti-ratón-IgG-Fc-anticuerpo-peroxidasa de rábano picante, seguido por lavados y detección mejorada de quimioluminiscencia (ECL) . El inmunoanálisis del inmunoprecipitado EM164 de las células MCF-7 exhibió bandas correspondientes a la cadena beta del receptor IGF-I a aproximadamente 95 kDa y el receptor pro-IGF-I a aproximadamente 220 kDa. Inmunoprecipitaciones similares se llevaron a cabo para otros tipos celulares para verificar la especificidad de especie del enlace del anticuerpo EM164, que también se enlazó al receptor IGF-I de células cos-7 (mono verde Africano) , pero no se enlazó al receptor IGF-I de células 3T3 (ratón) , células CHO (hámster Chino) o células de fibroblasto de cabra (cabra) . El anticuerpo EM164 no detectó el receptor IGF-I humano desnaturalizado con SDS en el inmunoanálisis de Usados de células MCF-7, lo que indicó que se enlazó a un epítope conformacional del receptor IGF-I humano no desnaturalizado, natural. El dominio de enlace del anticuerpo EM164 se caracterizó además utilizando una estructura truncada de cadena alfa, que comprendió el dominio rico en cisteína flanqueado por los dominios Ll y L2 (residuos 1-468) fusionados con la pieza 16-mer-C-terminus (residuos 704-719) y que se terminó por una marca de epítope del C-terminus. Este receptor IGF-I más pequeño, que carecía de los residuos 469-703, se ha reportado que enlaza IGF-I, aunque menos estrechamente en comparación con el receptor IGF-I natural de longitud total (Molina, L. , et al., 2000, FEBS Letters, 467, 226-230, Kristensen, C. et al., 1999, J. Biol . Chem. , 274, 37251-37356) . De este modo, se preparó una estructura truncada de cadena alfa del receptor IGF-I que comprende los residuos 1-468 fusionados a la pieza del C-terminus que es los residuos 704-719 y flanqueado por una marca de epítope myc del C-terminus. Se construyó una línea celular estable que expresó esta estructura y que también expresa la estructura transitoriamente en células 293T de riñon embrional humano. Se observó un fuerte enlace del anticuerpo EM164 a esta estructura truncada de cadena alfa del receptor IGF-I. De los dos anticuerpos probados, el IR3 (Calbiochem) también se enlazó a esta cadena alfa truncada, pero el anticuerpo 1H7 (Santa Cruz Biotechnology) no se enlazó, lo que indicó que el epítope del anticuerpo EM164 fue claramente distinto al del anticuerpo 1H7. C. Inhibición del enlace de IGF-I a las células MCF-7 mediante el anticuerpo EM164 El enlace del IGF-I a las células MCF-7 de cáncer de seno humano se inhibió por el anticuerpo EM164 (Figura 3) . Las células MCF-7 se incubaron con o sin 5 mg/mL de anticuerpo EM164 durante 2 h en un medio libre de suero, seguido por la incubación con 50 ng/mL de IGF.I biotinilado durante 20 min a 37°C. Las células se lavaron entonces dos veces con un medio libre de suero para retirar biotina-IGF-I no enlazada y después se lisaron en 50 mM de HEPES, pH 7.4, conteniendo 1% de NP-40 e inhibidores de proteasa. Una placa de ELISA Immulon-2HB se recubrió con un anticuerpo monoclonal de ratón de cadena beta del receptor anti-IGF-I y se utilizó para capturar el receptor IGF-I y la biotina-IGF-I enlazada del lisado. El enlace del anticuerpo recubierto al dominio citoplásmico C-terminal de la cadena beta del receptor IGF-I no interfirió con el enlace de la biotina-IGF-I al dominio extracelular del receptor IGF-I. Los pozos se lavaron, se incubaron con conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante, se lavaron de nuevo y después se detectaron utilizando sustrato ABTS/H202. La inhibición del enlace de IGF-I a las células MCF-7 por 5 mg/mL de anticuerpo EM164 fue esencialmente cuantitativa y fue casi equivalente a la del antecedente de ELISA obtenido utilizando una biotina-IGF-I desprovisto de control. En adición al ensayo descrito anteriormente para la inhibición del enlace de IGF-I a las células MCF-7 mediante el anticuerpo EM164, el siguiente ensayo demostró que el anticuerpo EM164 fue altamente efectivo para desplazar el IGF-I enlazado de las células MCF-7, según se desee bajo condiciones fisiológicas para un anticuerpo antagonista del receptor anti-IGF-I para desplazar el ligando fisiológico endógeno enlazado (tal como IGF-I o IGF-II) . En este ensayo de desplazamiento de IGF-I, las células MCF-7 cultivadas en una placa de 12 pozos se sub-alimentaron de suero y después se incubaron con IGF-I biotinilado (20-50 ng/mL) en un medio libre de suero a 37°C (o a 4°C) durante 1 a 2 h. Las células con IGF-I biotinilado enlazado se trataron entonces con anticuerpo EM164 o un anticuerpo de control (10-100 mg/mL a 37°C (o a 4°C) durante 30 min a 4 h. Las células se lavaron después con PBS y se Usaron en amortiguador de lisis conteniendo 1% de NP-40 a 4°C. Se llevó a cabo un ELISA como se describió anteriormente para capturar el receptor IGF-I del lisado y después detectar el IGF-I enlazado al receptor utilizando conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Este ELISA demostró que el anticuerpo EM164 fue capaz de desplazar el IGF-I biotinilado pre-enlazado de las células casi completamente (90% dentro de 30 min - y 100% dentro de 4 h) a 37°C por aproximadamente 50% en 2 h a 4°C. En otro experimento, se incubaron células NCI-H838 de cáncer pulmonar con biotina- IGF-I, después se lavaron y se incubaron con anticuerpo EM164 a 4°C durante 2 h, lo cual dio como resultado una disminución de 80% en el enlace de la biotina- IGF-I. En consecuencia, el anticuerpo EM164 fue altamente efectivo para desplazar el IGF-I pre-enlazado de las células cancerosas, lo cual serla importante terapéuticamente para el antagonismo del receptor IGF-I mediante el desplazamiento del ligando fisiológico endógeno enlazado. La incubación de las células MCF-7 con anticuerpo EM164 a 4°C durante 2 h (o a 37°C durante 30 min) no dio como resultado una sub-regulación significativa del receptor IGF-I en base al inmunoanálisis utilizando un anticuerpo de cadena beta del receptor anti-IGF-I (Santa Cruz Biotechnology; sc-713) , aunque una incubación más larga con anticuerpo EM164 a 37 °C durante 2 h dio como resultado una sub-regulación de 25% del receptor IGF-I. En consecuencia, la inhibición de enlace del IGF-I y el desplazamiento del enlace de IGF-I por el anticuerpo EM164 tanto a 4°C como a 37°C en estos experimentos a corto plazo puede no explicarse por la sub-regulación del receptor debida al enlace del anticuerpo EM164. El mecanismo para la potente inhibición del enlace de IGF-I al receptor IGF-I y para el desplazamiento del IGF-I pre-enlazado por medio del anticuerpo EM164 es probablemente la competencia para el enlace ya sea a través de compartir el sitio de enlace o a través de una oclusión estérica o a través de efectos alostéricos . D. Inhibición de la señalización celular mediada por el receptor IGF-I mediante el anticuerpo EM164 El tratamiento de las células MCF-7 de cáncer de seno y las células SaOS-2 de osteosarcoma con anticuerpo EM164 inhibió casi completamente la señalización intracelular del receptor IGF-I, como se mostró por la inhibición de la autofosforilación del receptor IGF-I y por la inhibición de la fosforilación de sus efectores de corriente descendente tales como el sustrato-1 del receptor de insulina (IRS-1) , Akt y Erkl/2 (Figuras 4-6) . En la Figura 4, las células MCF-7 se cultivaron en una placa de 12 pozos en un medio regular durante 3 días y se trataron después con 20 de anticuerpo EM164 (o anticuerpo de control anti-B4) en un medio libre de suero durante 3 h, seguido por estimulación con 50 ng/mL de IGF-I durante 20 min a 37°C. Las células se lisaron entonces en amortiguador de lisis helado conteniendo inhibidores de proteasa y fosfatasa (50 mM de amortiguador HEPES, pH 7.4, 1% NP-40, 1 mM de ortovanadato de sodio, 100 mM de fluoruro de sodio, 10 mM de pirofosfato de sodio, 2.5 mM de EDTA, 10µ? de leupeptina, 5 µ? de pepstatina, 1 mM de PMSF, 5 mM de benzamidina y 5 ug/mL de aprotinina) . Una placa de ELISA se pre-recubrió con anticuerpo monoclonal TC123 de receptor anti- IGF-I de cadena beta C-terminus y se incubó con las muestras de lisado durante 5 h a temperatura ambiente para capturar el receptor IGF-I. Los pozos conteniendo el receptor IGF-I capturado se lavaron entonces y se incubaron con anticuerpo biotinilado anti -fosfotirosina (PY20; 0.25 pg/mL; BD Transduction Laboratories) durante 30 min, seguido por lavados e incubación con conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (0.8 pg/mL) durante 30 min. Los pozos se lavaron entonces y se detectaron con sustrato ABTS/H202. El uso de un anticuerpo de control anti-B4 no mostró inhibición de la autofosforilación estimulada del IGF-I del receptor IGF-I. En contraste, se obtuvo una completa inhibición de la autofosforilación estimulada del IGF-I del receptor IGF-I al tratamiento con anticuerpo EM164 (Figura 4) . Para demostrar la inhibición de la fosforilación del sustrato-1 receptor de insulina (IRS-1) , se utilizó un ELISA utilizando anticuerpo anti-IRS-1 inmovilizado para capturar el IRS-1 de los lisados, seguido por la medición de la subunidad asociada p85 de fosfatidilinositol-3-cinasa (PI-3-cinasa) que se enlaza al IRS-1 fosforilado (Jackson, J.G. , et al., 1998, J". Biol . Chem. , 273, 9994-10003). En la Figura 5, se trataron células MCF-7 tratadas con 5 pg/mL de anticuerpo (EM164 o IR3) en medio libre de suero durante 2 h, seguido por estimulación con 50 ng/mL de IGF-I durante 10 min a 37°C. El anticuerpo anti-IRS-I (policlonal de conejo; Upstate Biotechnology) se capturó indirectamente mediante incubación con anticuerpo recubierto de cabra-conejo-IgG en una placa de ELISA, que se utilizó entonces para capturar IRS-I de las muestras de lisado celular por medio de incubación durante la noche a 4°C. Los pozos se incubaron entonces con anticuerpo monoclonal anti-p85-PI-3-cinasa (Upstate Biotechnology) durante 4 h, seguido por tratamiento con conjugado de cabra-anti-ratón-IgG-anticuerpo-HRP durante 30 min. Los pozos se lavaron entonces y se detectaron utilizando sustrato ABTS/H202 (Figura 5) . Como se muestra en la Figura 5, el anticuerpo EM164 fue más efectivo para inhibir la fosforilación IRS-1 del IGF-I estimulado de lo que fue el anticuerpo IR3 y el anticuerpo E 164 no mostró ninguna actividad agonística en la fosforilación IRS-1 al incubarse con las células en ausencia del IGF-I. La activación de tros efectores en corriente descendente, tales como Akr y Erkl/2, también se inhibió de una manera dependiente de la dosis mediante el anticuerpo EM164 en células SaOS-2 (Figura 6) y en células MCF-7, como se mostró utilizando inmunoanálisis de los lisados y anticuerpos específicos de fosforilación (anticuerpos anti-fosfo-Ser473 policlonales de conjero, policlonales Akt y anti-fosfo-ERKl/2 ; Cell Signaling Technology) . Un anticuerpo pan-ERK demostró iguales cargas de proteína en todos los planos (Figura 6) . El tratamiento de las células SaOS-2 con anticuerpo EM164 no inhibió la fosforilación estimulada con EGF del Erkl/2, demostrando así la especificidad de la inhbición de la trayectoria de señalización del receptor IGF- I mediante el anticuerpo EM164. E. Inhibición del crecimiento y supervivencia estimulados con IGF-I, IGF-II- y suero de las células tumorales humanas mediante el anticuerpo ??164 Varias líneas de células tumorales humanas se probaron en condiciones libres de suero por su respuesta al crecimiento y supervivencia al IGF-I. Estas líneas celulares se trataron con anticuerpo EM164 en presencia de IGF-I, IGF-II o suero y se midieron sus respuestas al crecimiento y supervivenciautilizando un ensayo MTT después de 2-4 días. Aproximadamente 1500 células se emplacaron en una placa de 96 pozos en un medio regular con suero, que se reemplazó con medio libre de suero al siguiente día (ya sea con medio RPMI libre de suero suplementado con transferrina y BSA, o con medio libre de fonol-rojo como se especifica por Dufourny, B., et al., 1997, J. Biol. Chem. , 272, 31163-31171). Después de un día de cultivo en medio libre de suero, las células se incubaron con aproximadamente 75 L de 10 g/mL de anticuerpo durante 30 min -3 h, seguido por la adición de 25 µ]1, de solución de IGF-I (o IGF-II o suero) para obtener una concentración final de 10 ng/mL de IGF-I o 20 ng/mL de IGF-II o 0.04-10% de suero. En algunos experimentos, las células se estimularon primero con IGF-I durante 15 min antes de la adición del anticuerpo EM164, o se agregaron juntos el IGF-I y el anticuerpo EM164. Las células se dejaron crecer entonces durante otros 2-3 días. Se angregó entonces una solución de bromuro de MTT (3- (4 , 5) -dimetiltiazol-2-il) -2 , 5-difeniltetrazolium; 25 i de una solución de 5 mg/mL en PBS) y las células se regresaron al incubador durante 2-3 h. El medio se removió entonces y se reemplazó por 100 µ?? de DMSO, se mezcló y la absorbencia de la placa se midió entonces a 545 nm. Varias líeas de células tumorales humanas mostraron una respuesta al crecimiento y supervivencia al agregar IGF-I o IGF- II o suero que fue significativamente inhibida por el anticuerpo EM164, sin importar si el anticuerpo se agregó antes del IGF-I o si el IGF-I se agregó antes del anticuerpo, o si ambos, el IGF-I y el anticuerpo se agregaron juntos (Tabla 1) .
TABLA 1- Inhibición del crecimiento y supervivencia estimulados con IGF-I de las células tumorales mediante el anticuerpo EM164 Tipo de célula tumoral Respuesta del % de Inhibición Inhibición del crecimiento mediante el anticuerpo EM164 duplicado al IGF-I anticuerpo EM16 del (ensayo MTT: tasa del crecimiento creeimiento/supe para IGF-I tratado estimulado con rvivencia de las vs . células no IGF-I en medio células en 1.25- tratadas en medio libre de suero 10% de suerob libre de suero)3 MCF-7 (mama) 1.7-2.8 100% 85% HT-3 (cervical) 2 70-90% ND Coló 205 (colon) 2.3 50% Si HT-29 1.5 60% Si NCI-H838 (pulmón) 3 100% 85-90% Calu-6 1.6-1.8 85% Si SK-LU-1 1.4 100% No NCI-H596 1.4 100% Débilmente A 549 1.2 80% ND A 375 (melanoma) 1.6 90% No SK-Mel-37 1.4 85% ND RD (rabdomiocarcinoma) 1.7 95-100% Si SaOS-2 (osteosarcoma) 2.5 100% Si A 431 (epidermoide) 2.2 85% Si SK-N-SH (neuroblastoma) 2 85% 30-50% a Ensayo MTT del crecimiento/supervivencia de 3- a 4- días de las células en respuesta a 10 ng/mL de IGF-I en medio libre de suero conteniendo 5-10 g/mL de anticuerpo EM164. Inhibición del crecimiento de las células en 1.25-10% de suero en presencia de 5-10 \xq/ L del anticuerpo EM164 mediante el ensayo MTT o el ensayo de formación de colonias en base a la comparación con el control (con suero pero sin anticuerpo) ; el grado de inhibición se midió cuantitativamente para células MCF-7, NCI-H838 y SK-N-SH en base a los controles (sin suero pero con anticuerpo y con suero pero sin anticueroi) para contar con la estimulación IGF autocrina/paracrina por las células. ND indica ningún dato o pocos datos debido a las dificultades de teñido.
El anticuerpo EM164 inhibió fuertemente el crecimiento y la supervivencia estimulados por IGF-I o suero de las células MCF-7 de cáncer de mama (Figuras 7 y 8) . En un experimento separado, el anticuerpo EM164 inhibió fuertemente el crecimiento y supervivencia estimulados con IGF- II de las células MCF-7. Reportes previos utilizando anticuerpos comercialmente disponibles tales como el anticuerpo IR3 mostraron solo una débil inhibición del crecimiento estimulado con suero de las células MCF-7, como se confirmó en la Figura 7 para los anticuerpos IR3 y 1H7 (Cullen, K. J. , et al., 1990, Cáncer Res., 50, 48-53). En contraste, el anticuerpo EM164 fue potente inhibidor del crecimiento estimulado con IGF de las células MCF-7. Como se mostró en la Figura 8, el anticuerpo EM164 fue igualmente efectivo para inhbir el crecimiento y la supervivencia de las células MVF-7 sobre un amplio rango de concentraciones de suero (0.04-10% de suero). La inhibición del crecimiento de las células MCF-7 mediante el anticuerpo EM164 se midió contando las células. De este modo, en una placa de 12 pozos, se emplacaron aproximadamente 7500 células en medio RPMI con 10% de FBS, en presencia o ausencia de 10 µg/mL del anticuerpo EM164. Después de 5 días de crecimiento, el conteo de las células para la muestra de control no tratada fue de 20.5 x 104 células, en contraste con un conteo de células de solo 1.7 x 104 células para la muestra tratada con anticuerpo EM164. El tratamiento con el anticuerpo EM164 inhibió el crecimiento de las células MCF-7 por aproximadamente 12 veces en 5 días. La inhibición por medio del anticuerpo EM164 fue significativamente mayor que la inhibición de 2.5 veces reportada utilizando anticuerpo I 3 en un ensayo de 6 días para las células MCF-7 (Rohlik, Q.T., et al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Coinun. , 149, 276-281) . El crecimiento y suoervivencia estimulados por IGF-I y suero de una línea celular no pequeña de cáncer pulmonar NCI-H838 se inhibieron también fuertemente por medio del anticuerpo EM164 en comparación con un anticuerpo de control anti-B4 (Figura 9) . El tratamiento con el anticuerpo EM164 en medio libre de suero produjo una señal menor que la muestra no tratada tanto para las células NCI-H838 como para las MCF-7, presumiblemente debido a que el anticuerop EM164 inhibió también la estimulación autocrina y paracrina de IGF-I e IGF-II de estas células (Figuras 7 y 9) . El tamaño de la colonia de las células HT29 de cáncer de colon también se redujo grandemente al tratamiento con el anticuerpo EM164. En consecuencia, el anticuerpo EM164 es único entre todos los anticuerpos del receptor anti-IGF-I en su efectividad para inhibir el crecimiento estimulado por suero de las células tumorales tales como las células MCF-7 y las células NCI-H838 por más del 80%.
El anticuerpo EM164 ocasionó el arresto del crecimiento de las células en la fase GO/Gl del ciclo celular y abrogó el efecto mitógeno del IGF-I. Para el análisis del ciclo celular, se trataron células MCF-7 con IGF-I (20 ng/mL) en presencia o ausencia de EM164 (20 vg/ L) durante un día y entonces se analizaron mediante teñido con yoduro de propidio y citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 25, el ciclaje de las células en respuesta a la estimulación con IGF-I en ausencia de EM164 (con 41% de las células en la fase S y 50% en la fase GO/Gl) se suprimió en las células tratadas con EM164 (solo con 9% en la fase S y 77% de las células en la fase GO/Gl) . En adición a esta inhibición de la proliferación celular, el tratamiento con anticuerpo EM164 dio como resultado la apoptosis de las células. Para la medición de la apoptosis, se midió la división de la proteína CK18 de citoqueratina por caspasa en células NCI-H838 de cáncer pulmonar incubadas con IGF-I o suero en presencia o ausencia de EM164 durante 1 día (Figura 26) . En ausencia de EM164, la adiciób del IGF-I o suero dio como resultado una señal menor de CK18 dividida por caspasa en comparación con el control IGF-I. Indicando que el IGF-I y el suero previenen la activación de la caspasa. El tratamiento con E 164 suprimió los efectos anti-apoptóticos del IGF-I y el suero, como lo indicaron los mayores niveles de CK18 dividido obtenidos en presencia de EM164 que en ausencia de EM164 (Figura 26) . F. Inhibición sinergxstica mediante el anticuerpo EM164 del crecimiento y la supervivencia de células tumorales humanas en combinaciones con otros agentes citotoxicos y citostáticos La administración combinada del anticuerpo EM164 con taxol fue significativamente más inhibidora para el crecimiento y supervivencia de células Calu6 no pequeñas de cáncer pulmonar que del taxol solo. De manera similar, la combinación del anticuerpo E 164 con captotecina fue significativamente más inhibidora que de la captotecina sola hacia el crecimiento y supervivencia de las células HT29 de cáncer de colon. Debido a que no se esperaba que el anticuerpo EM164 solo fuera tan tóxico para las células como las drogas quimiotóxicas orgánicas, el sinergismo entre el efecto predominantemente citostático del anticuerpo EM164 y el efecto citotóxico de la droga quimiotóxica puede ser altamente eficaz en la combinación de terapias de cáncer en usos clínicos. El efecto combinado del anticuerpo EM164 con un anticuerpo del receptor anti-EGF (KS77) , fue significativamente más inhibidor que ya sea con anticuerpo E 164 o anticuerpo KS77 solos en el crecimiento y supervivencia de varias líneas celulares tumorales tales como las células HT-3, células RD, células MCF-7 y células A431. En consecuencia, el efecto sinergístico de la combinación de anticuerpos de neutralización para dos receptores del factor de crecimiento tales como el receptor IGF-I y el receptor EGF puede también ser útil en el tratamiento clínico del cáncer. Los conjugados del anticuerpo EM164 con drogas citotóxicas también son valiosos en el suministro dirigido de las drogas citotóxicas a los tumores que sobreexpresan el receptor IGF-I. Los conjugados del anticuerpo EM164 con radio marcas u otras marcas pueden utilizarse en el tratamiento y visualización de tumores que sobreexpresan el receptor IGF-I.
G. Efecto del tratamiento con EM164, como agente único o en combinación con agentes anti-cáncer, en xenografos de cáncer humano en ratones inmunodeficientes Se establecieron xenografos Calu-6 de cáncer de pulmón de células humanas no-pequeñas en ratones inmunodeficientes mediante inyecciones subcutáneas de células Calu-6 1 x 107. Como se muestra en la Figura 10, estos ratones conteniendo 100 mm2 de xenografos Calu-6 establecidos se trataron con anticuerpo EM164 solo (6 inyecciones de 0.8 mg/ratón, i.v., dos por semana) o solo con taxol (cinco inyecciones de taxol, i.p., cada dos días; 15 mg/kg) , o con una combinación tratamientos de taxol y anticuerpo EM164, o PBS solo (200 µL/ratón, 6 inyecciones, dos por semana, i.v.) utilizando cinco ratones por grupo de tratamiento. El crecimiento de los tumores se retrasó significativamente mediante el tratamiento con anticuerpo EM164 en comparación con un control de PBS. No se observó toxicidad del anticuerpo EM164, en base a las mediciones de los pesos de los ratones. Aunque el tratamiento solo con taxol fue efectivo hasta el día 14, el tumor comenzó entonces a crecer de nuevo. Sin embargo, el crecimiento del tumor se retrasó significativamente en el grupo que se trató mediante una combinación de taxol y anticuerop EM164, en comparación con el grupo que se trató solo con taxol. Se establecieron xenografos de cáncer pancreático humano en ratones hembra SCID/ICR de 5 semanas de edad (Taconic) mediante inyecciones subcutáneas de células BxPC-3 107 en PBS (día 0) . Los ratones portadores de tumores establecidos de 80 mm3 se trataron entonces con EM164 solo (13 inyecciones de 0.8 mg/ratón, i.v., vena lateral del rabo, en los días 12, 16, 19, 23, 29, 36, 43, 50, 54, 58, 61 y 64), con gemcitabina solo (dos inyecciones de 150 mg/kg/ratón, i.p., en los días 12 y 19), con una combinación de gemcitabina y EM164 siguiendo los esquemas anteriores, solo PBS y un anticuerpo de control solo (siguiendo el mismo esquema que el de EM164) utilizando cinco ratones en cada uno de los cinco grupos de tratamiento. Como se muestra en la Figura 27, el tratamiento con EM164 solo, o en combinaciones con gemcitabina, dio como resultado inicialmente una regresión total de los xenografos del tumor en 4 de 5 animales en el grupo de tratamiento con EM164 y en todos los 5 animales en el grupo de tratamiento con combinación. El re-crecimiento del tumor solo se vio en más de un animal en el día 43 en el grupo con EM164 y en el día 68 en el grupo de tratamiento con combinación, dando como resultado volúmenes medios de tumor significativamente más pequeños en el día 74 en comparación con los tratamientos de control (P=0.029 y 0.002, respectivamente, prueba T de dos uniones, Figura 27). En otro estudio, el tratamiento con anticuerpo EM164 (solo o en combinación con un anticuerpo del receptor anti-EGF; inyecciones intraperitoneales) inhibió el crecimiento de xenografos BxPC-3 establecidos en ratones.
H. Clonación y secuenciado de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo EM164 Se purificó ARN total de células EM164 de hibridoma. Las reacciones de transcriptasa de reversa se llevaron a cabo utilizando 4-5 yg de ARN total y ya sea iniciadores oligo dT o de hexámero aleatorio. Las reacciones PCR se llevaron a cabo utilizando un método RACE descrito en Co. et al., (J. Immunol . , 148, 1149-1154 (1992) ) y utilizando iniciadores degenerados como se describió en Wang et al., (J. Immunol. Methods, 233, 167-177 (2000) ) . El método RACE de PCR requirió una etapa intermedia de agregar una unión poli G en los extremos 3' de los cADNs de primera cuerda. Las reacciones de RT se purificaron con columnas Qianeasy (Qiagen) y se eluyeron en 50 µ? de amortiguador 4 1 X NEB. Se llevó a cabo una reacción de unión en el eluido con 0.25 mM de CoCl2, 1 mM de dGTP y 5 unidades de transferasa terminal (NEB) en amortiguador 4 1 X NEB. La mezcla se incubó a 37°C durante 30 minutos y después se agregó 1/5 de la reacción (10 µ?) directamente a una reacción PCR para servir como el ADN de plataforma. Las reacciones RACE y PCR degeneradas fueron idénticas excepto por diferencias en los iniciadores y la plataforma. La reacción de transferasa terminal se utilizó directamente para la plataforma PCR de RACE, mientras que la mezcla de la reacción RT se utilizó directamente para las reacciones PCR degeneradas. Tanto en la reacción RACE como en la PCR degeneradas se utilizó el mismo iniciador 3' de cadena ligera : HindKL - tatagagctcaagcttggatggtgggaagatggatacagttggtge (SEQ ID NO: 14) Y el iniciador 3' de cadena pesada: Bgl2IgGl - ggaagatctatagacagatgggggtgtcgttttggc (SEQ ID NO: 15) . En la PCR de RACE, se utilizó un iniciador poli C5' tanto para la cadena pesada como para la ligera: EcoPolyC - TATATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID N0:16), mientras que los iniciadores dehenerados PCR finales 5' fueron: SaclMK - GGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEQ ID NO: 17) para la cadena ligera y una mezcla igual de: EcoRIMHl - CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEQ ID NO: 18) y EcoRlMH2 - CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG (SEQ ID NO: 19) para la cadena pesada. En las secuencias de iniciador anteriores, las bases mecladas se definen como sigue: H=A+T+C, S=g+C y=C+T, K=G+T, M=A+C, R=A+g, W=A+T, V=A+C+G. Las reacciones PCR se llevaron a cabo utilizando el siguiente programa: 1) 94°C 3 min, 2) 94°C 15 seg., 3) 45°C 1 min, 4) 72°C min, 5) ciclo de regreso a la etapa #2 29 veces, 6) final con una etapa final de extensión a 72 °C durante 10 min. Los productos de PCR se clonaron en pBluescript II SK + (Stratagene) utilizando enzimas de restricción creadas por los iniciadores PCR. Varios clones individuales de cadena ligera y pesada se secuenciaron mediante métodos convencionales para identificar y evitar posibles errores de secuencia generados por polimerasa (Figuras 12 y 13) . Al utilizar definiciones de clasificación canónicas, se identificaron las tres CDRs de cadena ligera y pesada (Figuras 12-14) .
Una investigación de la base de datos NCBI IgBlast indicó que la región variable de cadena ligera del anticuerpo del receptor anti-IGF-I probablemente derivada del gen de línea germinal IgVk Crl de ratón mientras que la región variable de cadena pesada probablemente derivada del gen de línea germinal IgVhJ558.c (Figura 15). El secuenciado de proteína del anticuerpo EM164 murino se llevó a cabo para confirmar las secuencias mostradas en las Figuras 12 y 13. Las bandas de proteína de cadena pesada y ligera del anticuerpo EM164 purificado se transfirieron a la membrana PVDF a partir de un gel (SDS-PAGE, condiciones reducidas) , extraídas de la membrana PVDF y analizadas mediane secuenciado de proteína. Se determinó, por medio del secuenciado Edman, que la secuencia N-terminal de la cadena ligera es: Se encontró que el N-terminus de la cadena pesada está bloqueado para el secuenciado de proteína Edman. Un fragmento tríptico del péptido de digestión de la cadena pesada de masa 1129.5 ( +H+, monoisotópico) se fragmentó a través de deterioro post-fuente (PSD) y se determinó que su secuencia es GRPDYYGSSK (SEQ ID NO:21) . Otro fragmento tríptico del péptido de dgestión de la cadena pesada de masa 2664.2 (M+H+, monoisotópico) también se fragmentó a través de deterioro port-fuente (PDS) y su secuencia se identificó como: SSSTAY QLSSLTSEDSAVYYFAR (SEQ ID NO: 22) . Ambas de estas secuencias se igualan perfectamente a las CDRs y la estructura 3 (FR3) del gen clonado de cadena densa obtenido del hibridoma EM164.
I. Expresión recombinante del anticuerpo EM164 Las secuencias en pares de cadena ligera y pesada se clonaron en un único vector de expresión de mamífero (Figura 16) . Los iniciadores PCR para las secuencias variables humanas crearon sitios de restricción que permitieron que la secuencia de señal humana se uniera mientras que en el vector de clonación pBluescriptII y las secuencias variables se clonaron en el plásmido de expresión de mamífero utilizando EcoRI y BsiWI o HindIII y sitios Apal para la cadena ligera o la cadena densa, respectivamente (Figura 16) . Las secuencias variables de cadena ligera se clonaron en la estructura sobre la región constante IgK humana y las secuencias variables se clonaron en la secuencia de región constante Iggammal humana. En los plásmidos de expresión final, los promotores de CMV humano condujeron la expresión de las secuencias cADN tanto de cadena ligera como pesada. La expresión y purificación del anticuerpo EM1S4 de ratón procedieron de acuerdo con métodos muy conocidos en la técnica . EJEMPLO 2 ; Versiones humanizadas del anticuerpo EM164 La restauración del anticuerpo EM164 para proporcionar versiones human zadas adecuadas como agentes terapéuticos o de diagnóstico generalmente procede de acuerdo con los principios y métodos descritos en la Patente de E.U. 5,639,641 y como sigue.
A. Predición de superficie La accesibilidad del solvente de los residuos de la región variable para un conjunto de anticuerpos con estructuras disueltas se utilizó para predecr los residuos de superficie para la región variable del anticuerpo del receptor anti-IGF-I murino (EM164) . La accesibilidad del solvente de aminoácido para un conjunto de archivos únicos de las 127 estructuras del anticuerpo (Tabla 2) se calcularon con el paquete de software MC (Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol . , 235, 959-973). Las diez secuencias de aminoácidos más similares de cadena ligera y de cadena densa de este conjunto de 127 estructuras se determinaron mediante alineación de secuencia. Se calculó la accesibilidad promedio del solvente para cada residuo de región variable y las posiciones con más de 30% de accesibilidad promedio se consideraron residuos de superficie. Las posiciones con accesibilidades promedio de entre 25% y 35% se examinaron adicionalmente calculando la accesibilidad del residuo individual solo para aquellas estructuras con dos residuos de flanqueado idénticos .
TABLA 2 - 127 Estructuras de anticuerpo de la base de datos Brookhaven utilizadas para predecir la superficie del anticuerpo anti-IGF-I-receptor (EM164) Archivos de estructura 127 Brookhaven utilizados para prediciones de superficie 2rcs 3hfl 3hf laif laa3r lbbj 43c9 4fab gfab 7fab m 2gfb 2hlp 2hf1 la6t laxt lbog 2hrp 2jel 2me 2pcp P lyuh 2bfv 2cgr 8fab lae6 lbvl 2dbl 2f19 2fb4 2fbj lsm ltet lvfa Glb2 la4j lcly lvge lyec lyed lyee 3 lnsn lopg losp laj7 layl lclz lplg lpsk lprmf lsbs lncd lnfd lngp lacy lafv lcbv lnld lnm lnm lngb a b lmc lmf lml 15c8 la5f laxs lmlb lmp lnbv lncb P b m a ljrh lkb5 lkel lap2 lb2 ladq lkip lkir Uve Imam w ligi ligm ligt ladO lbaf lcfv ligy likf ljel ljhl lgpo lhil lhyx laOq lbjm lelo liai libg ligc ligf lfpt lfrg lfvc laqk lbin ld5 lgaf iggi lghf lgig b lfai lfbi lfdl lad9 lbbd lf58 lfgv lfig lflr Ifor ldbl ldfb la3l lbfo leap ldsf ldvf B. Modelado molecular: Se generó un modelo molecular de E 164 murino utilizando el paquete de software Oxford Molecular AbM. La estructura del anticuerpo se construyó a prtir de los archivos de estructura para los anticuerpos con las secuencias de aminoácidos más similares, que fueron 2jel para la cadena ligera y lnqb para la cadena densa. Las CDRs no canónicas se construyeron investigando una base de datos de estructura C-o¡ conteniendo estructuras disueltas no redundantes. Se determinaron los residuos que se colocan dentro de 5 de una CDR. C. Selección de Ab humano Las posiciones de superficie del EM164 murino se compararon con las posiciones correspondientes en secuencias de anticuerpos humanos en la base de datos Kabat (Johnson, G. y Wu, T.T., (2001) Nucleic Acids Research, 29:205-206). El programa de manejo de la base de datos de anticuerpos SR (Searle 1998) se utilizó para extraer y alinear los residuos de superficie de anticuerpo de los pares naturales de anticuerpo humano de cadena pesada y ligera. La superficie de anticuerpo humano con los residuos de superficie más idénticos, dada una consideración especial a las posiciones que se encuentran dentro de 5 de una CDR, se seleccionó para reemplazar los residuos de superficie de anticuerpo del receptor murino anti-IGF-I.
D. Mutagénesis PCR La mutagénesis PCR se llevó a cabo en el clon de ADN de EM164 murino (anterior) para construir E 164 humano restaurado (en la presente huEM164) . Se diseñaron conjuntos de iniciador para preparar los 8 cambios de aminoácidos requeridos para todas las versiones probadas de huEM164 y se diseñaron iniciadores adicionales para preparar alternativamente los dos cambios del residuo 5 (Tabla 3) . Se llevaron a cabo reacciones PCR con el siguiente programa: 1) 94°C 1 min, 2) 94°C 15 seg., 3) 55°C 1 min, 4) 72°C 1 min, 5) ciclo de regreso a la etapa #2 29 veces, 6) final con una etapa final de extensión a 72 °C durante 4 min. Los productos de PCR se resumieron con sus enzimas de restricción correspondientes y se clonaron en los vectores de clonación pBluescript como se describió anteriormente. Los clones se secuenciaron para confirmar los cambios de aminoácidos deseados . TABLA 3 - Iniciadores PCR utilizados para construir 4 anticuerpos EM164 humanizados Iniciador Secuencia SEQ ID NO: Eml64hcw CAGGTGTACACTCCCAGGTCCAACTGGTGCAGTC 23 TGGGGCTGAAGTGGTGAAGCCTG Eml64hcqqgo11 CAATCAGAAGTTCCAGGGGAAGGCCACAC 24 Eml64hcqqgol2 CCTTCCCCTGGAACTTCTGATTGTAGTTAGTACG 25 Eml641cv3 CAGGTGTACACTCCGATGTTGTGATGACCCAAAC 26 TCC Eml64lcl3 CAGGTGTACACTCCGATGTTTTGATGACCCAAAC 27 TCC Eml641cpl8 GACTAGATCTGCAAGAGATGGAGGCTGGATCTCC 28 AAGAC Eml64lcbgl2 TTGCAGATCTAGTCAGAGCATAGTACATAGTAAA 29 TG Eml64r45 GAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAA 30 GGCTCCTGATCTAC Eml64a67oll GTGGCAGTGGAGCAGGGACAGATTTCAC 31 Eml64a67ol2 GAAAAATCTGTCCCTGCTCCACTGCCACTG 32 E. Residuos de superficie de región variable Las técnicas de restauración de antucuerpos descritas por Pedersen et al . , (J. Mol. Biol . , 235, 959-973, 1994) y Roguska et al., (Protein Eng., 9, 895-904, 1996) comienzan prediciendo - los residuos de superficie de las secuencias variables de anticuerpo murino. Un residuo de superficie se define como el aminoácido que tiene al menos 30% de su área total de superficie accesible a una molécula de agua . Se identificaron los 10 anticuerpos más homólogos en el conjunto de los 127 archivos de la estructura de anticuerpos (Figuras 17 y 18) . Se promedió la accesibilidad del solvente para cada posición Kabat para estas secuencias alineadas y la distribución de las accesibilidades relativas para cada residuo fueron como se muestra en la Figura 19. Tanto la cadena ligera como pesada tienen 26 residuos con accesibilidades promedio relativas de al menos 30% (Figura 19) : estos residuos fueron por los residuos de superficie predichos para el EM164. Varios residuos tuvieron accesibilidades promedio de entre 25% y 35% y éstos se analizaron adicionalmene para promediar solo los anticuerpos con dos residuos idénticos de flanco en cualquier lado del residuo (Tablas 4 y 5) . Después de este análisis adicional, el conjunto original de residuos de superficie que se indentificó anteriormente permaneció sin cambio. TABLA 4 - Residuos de superficie y accesibilidad promedio (ave. Acc.) para las secuencias variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo EM164 Residuos de Superficie de E 164 Cadena Ligera Cadena Pesada EM164 # Kabat Ave .Acc . EM164 # Kabat Ave .Acc .
D 1 45.80 Q 1 58.19 L 3 41.53 Q 3 34.08 T 7 31.40 Q 5 34.36 L 9 50.08 A 9 38.01 L 15 35.45 L 11 47.72 Q 18 39.79 K 13 46.51 R 24 34.36 P 14 31.49 S 26 32.63 G 15 31.42 Q 27 34.35 K 19 34.41 N 28 36.38 K 23 31.23 P 40 43.05 T 28 36.24 G 41 46.56 P 41 44.01 Q 42 34.92 G 42 42.62 K 45 30.58 Q 43 46.85 S 52 30.40 E 61 46.68 S 56 41.46 K 62 44.87 G 57 42.41 K 64 38.92 D 60 45.96 R 65 40.06 S 67 38.20 K 73 35.92 R 77 42.61 S 74 48.91 E 81 38.46 S 82B 32.72 V 95E 34.83 S 84 35.21 K 103 31.10 E 85 39.62 K 107 36.94 D 98 36.00 R 108 60.13 A 106 37.65 A 109 53.65 S 113 43.42 TABLA 5 Residuos de Superficie de Límite Cadena Ligera Cadena Pesada EM164 # Kabat Ave .Acc . EM164 # Kabat Ave .Acc .
T 5 28.68 Q 3 31.62 T 7 30.24 Q 5 36.07 P 12 26.59 P 14 29.88 G 16 25.20 G 15 30.87 D 17 25.73 S 17 25.64 S 20 25.37 K 19 35.06 R 24 36.73 K 23 31.48 S 26 31.00 G 26 30.53 Q 27 32.29 S 31 27.12 S 27A 29.78 R 56 NA V 27 29.05 T 68 27.71 V 29 NA T 70 24.65 Q 42 34.92 s 75 18.80 K 45 32.24 s 82B 32.87 s 52 30.02 P 97 NA R 54 29.50 Y 99 NA D 70 26.03 V 103 NA R 74 NA T 111 25.95 E 79 26.64 A 80 29.61 V 95E 42.12 G 100 29.82 K 103 31.10 E 105 25.78 Los residuos que tuvieron accesibilidades promedio de entre 25% y 35% se analizaron posteriormente promediando un subconjunto de anticuerpos que tuvieron dos residuos idénticos de flanco en cualquier lado del residuo en cuestión. Se proporcionan estas posiciones de superficie límite y sus nuevas accesibilidades promedio. Los NAs se refieren a los residuos con residuos de flanco no idénticos en los 10 anticuerpos más similares. F . Modelado molecular para determinar cuáles residuos caen dentro de 5 de una CDR El modelo molecular anterior, generado con el paquete de software AbM, se analizó para determinar cuáles residuos de superficie de EM164 se encontraban dentro de 5 de una CDR. A fin de restaurar el anticuerpo Eml64 murino, todos los residuos de superficie fuera de una CDR deben cambiarse a la contraparte humana, pero los residuos dentro de 5 de una CDR se tratan con especial cuidado debido a que también pueden conribuir a la especificidad del antígeno. En consecuencia, estos últimos residuos deben iddentificarse y considerarse cuidadosamente a lo largo de todo el proceso de humanización. Las definiciones de CDR utilizadas para la restauración combinan la definición de AbM para la CDR2 de cadena pesada y las definiciones Kabat para las 5 CDRs restantes (Figura 14) . La tabla 6 muestra los residuos que se encontrarin dentro de 5 de un residuo CDR en cualquiera de las secuencias de cadena ligera o pesada del modelo de EM164. TABLA 6 - Residuos de superficie de la estructura del anticuerpo EM164 dentro de 5 de una CDR Residuos de Superficie de EM164 dentro de 5Á de una CDR Cadena ligera Cadena pesada DI T28 L3 K73 T7 S74 P40 Q42 K45 G57 D60 E81 G. Identificación de las superficies humanas más homologas Las superficies humanas de anticuerpo candidato para restaurar el EM164 se identif caron dentro de la base de datos de secuencia de anticuerpos Kabat utilizando software SR, lo cual proporcionó la investigación solo de las posiciones de residuo especificadas contra la base de datos de anticuerpos. Para preservar los pares naturales, se compararon entre sí los residuos de superficie tanto de cadena ligera como pesada. Las más homologas superficies humanas a partir de la base de datos Kabat se alinearon en orden de rango de identidad de secuencia. Las 5 superficies superiores se dan en la Tabla 7. Estas superficies se compararon entonces para identificar cuáles de ellas requerirían los últimos cambios dentro de 5 de una COR. El anticuerpo de célula B Leucémica, CLL 1.69, requirió el menor número de cambios en el residuo de superficie (10 en total) y solo dos de estos residuos se encontraron dentro de 5 de una CDR. La secuencia de región variable de longitud total para EM164 se alineó también conra la base de datos de anticuerpos humanos Kabat y se identificó de nuevo la CLL 1.69 como la secuencia humana de región variable más similar. Juntas, estas comparaciones de secuencia identificaron el anticuerpo humano de célula B Leucémica CLL 1.69 como la selección preferida como superficie humana para EM16 . TABLA 7 - Las 5 secuencias humanas superiores extraídas de la base de datos Kabat Las 5 Superficies de Anticuerpo Humano Más Homologas Anticuerpo Cadena Ligera SEQ ID NO: MuEM164 DLTLLQPGQKGDSREKKRA 33 CLL1.69 DVTLLPPGQRGDAREKKR- 34 MSL5 DQSLI PPGQKGDSRDKKRA 35 CDP571 DMSSVRPGQKGSSSDKKR- 36 LC3aPB EVSGPRPGQRGDSREKKR- 37 SSbPB EVSGPRPGQRGDSREKKR- 38 Anticuerpo Cadena Pesada SEQ ID NO: MUEM164 QQQALKPGKKTPGQEKKRKSSSEAS 39 CLL1.69 QQVAVKPGKKTPGQQKQGKSSSEQS 40 MSL5 QQQPLKPGKKTPGKDDKGTSNNEQS 41 CDP571 QQVAVKPGKKTPGQQKKGKSSSEQS 42 LC3aPB -QVAVKPGKKTPGQQKQGKSSSEQS 43 SSbPB - QVAVKPGKKTPGQQKQGESSSEQS 44 Las alineaciones se generaron por SR (Pedersen 1993) . Los residuos dde superficie de EM164 que se encuentran dentro de 5 de una CDR se encuentran subrayados . H. Construcción de genes EM164 humanizados Los diez cambios de residuo de superficie para EM164 (Tabla 7) se elaboran utilizando técnicas PCR de mutagénesis como se describió anteriormente . Debido a que ocho de los residuos de superficie para CLL 1.69 no se encontraron dentro de 5 de una CDR, estos residuos se cambiaron de murinos a humanos en todas las versiones del EM164 humanizado (Tablas 8 y 9) . Los dos residuos de superficie de cadena ligera que se encontraron dentro de 5 de una CDR (posiciones Kabat 3 y 45) se cambiaron ya sea a humanos o se retuvieron como murinos . Juntas, estas opciones generaron las cuatro versiones humanizadas de EM164 que se construyeron (Figuras 22 y 23) . De las cuatro versiones humanizadas, la versión 1.0 tiene todos loas 10 residuos de superficie humanos. La versión más conservadora con respecto a los cambios en vecindad de la CDR es la versión 1.1, que retuvo ambos residuos de superficie murinos encontrados dentro de 5 de una CDR. Todos los cuatro genes del anticuerpo EM164 humanizado se clonaron en un plásmido de expresión de anticuerpo (Figura 16) para su uso en transíecciones transitorias y estables.
TABLA 8 - Cambios del residuo para las versiones 1.0-1.3 del anticuerpo EM164 humanizado I . Comparación de las afinidades de las versiones del anticuerpo EM164 humanizado con el anticuerpo E 164 murino para enlazarse al receptor IGF-I de longitud total y a la cadena alfa del receptor IGF-I truncado Las afinidades de las versiones 1.0-1.3 del anticuerpo EM164 humanizado se compararon con las del anticuerpo EM164 murino a través de ensayos de competencia de enlace utilizando receptor IGF-I humano biotinilado dde longitud total o cadena alfa del receptor IGF-I truncado marcado con epítope myc, como se describió anteriormente. Las muestras del anticuerpo EM164 humanizado se obtuvieron por transfección transitoria de los vectores de expresión apropiados en células 293T de riñon embriónico humano y se determinarin las concentraciones ded anticuerpo mediante ELISA utilizando estándares de anticuerpo humanizado purificado. Para las mediciones de competencia de enlace ELISA, se incubaron mezclas de muestras de anticuerpo humanizado y varias concentraciones de anticuerpo E 164 murino con receptor IGF-I biotinilado de longitud total indirectamente capturado o cadena alfa del receptor IGF-I truncado marcado con epítope myc . Después de la equilibración, el anticuerpo humanizado enlazado se detectó utilizando un conjugado de cabra-anti-humano-Fab' 2-anticuerpo-peroxidasa de rábano picante. Se utilizaron trazos de ( [Ab murino enlazado] / [Ab humanizado enlazado]) vs . ( [Ab murino] / [Ab humanizado]), que teóricamente produjeron una línea recta con el declive = (Kd Ab numanizado/¾ Ab murino) / para determinar las relativas afinidades de los anticuerpos humanizado y murino. Se muestra en la Figura 11 un ensayo ejemplificativo de competencia. Una placa Immulon-2HB ELISA se recubrió con 100 L de 5 g/ml de estreptavidina por pozo en amortiguador de carbonato a temperatura ambiente durante 7 h. Los pozos recubiertos con estreptavidina se bloquearon con 200 pL de amortiguador de bloqueo (10 mg/mL de BSA en amortiguador TBS-T) durante 1 h, se lavaron con amortiguador TBS-T y se incubaron con receptor IGF-I biotinilado (5 ng por pozo) durante la noche a 4°C. Los pozos conteniendo el receptor IGF-I biotinilado indirectamente capturado se lavaron entonces y se incubaron con mezclas de anticuerpo EM164 humanizado (15.5 ng) y anticuerpo murino (0 ng, o 16.35 ng, o 32.7 ng, o 65.4 ng, o 163.5 ng) en 100 de amortiguador de bloqueo durante 2 h a temperatura ambiente y después se incubaron durante la noche a 4°C. Los pozos se lavaron entonces con amortiguador TBS-T y se incubaron con conjugado de cabra-anti -humano-Fab' 2-anticuerpo-peroxidasa de rábano picante durante 1 h (100 µ??,- 1 g/mL en amortiguador de bloqueo) , seguido por lavados y detección utilizando sustrato de ABTS/H202 a 405 nm. El trazo de ( [Ab murino enlazado] / [Ab humanizado enlazado]) vs. ( [Ab murino] / [Ab humanizado]), produjo una línea recta (r2=0.996) con el declive = (Kd Ab humanizado/¾ Ab murino) de 0.52. La versión del anticuerpo humanizado 1.0 se enlazó por tanto al receptor IGF-I más estrechamente que el anticuerpo EM164 murino. Se obtuvieron valores similares para el gradiente, variando desde aproximadamente 0.5 a 0.8, para las competencias de las versiones 1.0, 1.1, 1.2 y 1.3 de los anticuerpos EM164 humanizados con el anticuerpo EM164 murino para enlazarse al receptor IGF-I de longitud total o a la cadena alfa del receptor IGF-I truncado, lo cual indicó que todas las versiones humanizadas del anticuerpo E 164 tuvieron afinidades similares, que fueron todas mejores que las del anticuerpo E 164 murino. Una versión quimérica del anticuerpo EM164 con la mutación 92F?C en la cadena pesada mostró un declive de aproximadamente 3 en una competencia similar de enlace con el anticuerpo EM164 murino, lo cual indicó que el mutante 92F-?C del EM164 tuvo una afinidad 3 veces menor que la del anticuerpo EM164 murino para enlazarse al receptor IGF-I. El anticuerpo EM164 humanizado vi .0 mostró una inhibición del crecimiento y supervivencia estimulados con IGF-I de las células MCF-7 similar a la del anticuerpo EM164 murino (Figura 24) . La inhibición del crecimiento y supervivencia estimulados con suero de las células MCF-7 mediante el anticuerpo EM164 humanizado vi .0 fue similar a la inhibición por medio del anticuerpo EM164 murino . TABLA 9 Segmento Cadena Ligera Cadena Pesada FRl 1-23 {con un residuo 1-30 (con un residuo ocasional en 0 y una ocasional en 0) supresión en 10 en las cadenas Vx) CDR1 24-34 (con posibles 31-35 (con posibles inserciones numeradas inserciones numeradas como 27A, B, C, D, E, como 35A, B) F) FR2 35-49 36-49 CDR2 50-56 50-65 (con posibles inserciones numeradas como 52A, B, C) FR3 57-88 66-94 (con posibles inserciones numeradas como 82A, B, C) CDR3 89-97 (con posibles 95-102 (con posibles inserciones numeradas inserciones numeradas como 95A, B, C, D, E, como 100A, B, C, D, E, F) F, G, H, I, J, K) FR4 98.107 (con una posible 103-113 inserción numerada como 106A) El sistema de numeración Kabat se utiliza para los polipéptidos de región variable de cadena ligera y de cadena pesada de las diferentes versiones del EM164 Ab. Los residuos de aminoácido se agrupan en las Regiones de Estructura (FR) y las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) de acuerdo con la posición en la cadena del polipéptido. Tomado de Kabat et al . , Sequences of Proteíns of I munological Interest, Quinta Edición, 1991, NIH Publicación No. 91-3242. J. Proceso para proporcionar anticuerpos mejorados del receptor anti-IGF-I partiendo de las secuencias de los anticuerpos murino y humanizado descritas en la presente Se utilizaron las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico del anticuerpo E 164 del receptor anti-IGF-I y sus variantes humanizadas para desarrollar otros anticuerpos que tienen propiedades mejoradas y que también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Tales propiedades mejoradas incluyen afinidad incrementada para el receptor IGF-I. Varios estudios han medido los efectos de la introducción de uno o más cambios de aminoácidos en varias posiciones en la secuencia de un anticuerpo, en base al conocimiento de la secuencia del anticuerpo primario, a sus propiedades tales como el enlace y el nivel de expresión (Yang, W.P., et al., 1995, J. Mol. Biol., 254, 392-403; Rader, C, et al . , 1998, Proc . Nati . Acad. Sci . EUA, 95, 8910-8915; Vaughan, T.J., et al . , 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539) . En estos estudios, se han generado variantes del anticuerpo primario cambiando las secuencias de los genes de cadena pesasda y ligera en las regiones CDR1, CDR2 , CDR3 , o de estructura utilizando métodos tales como mutagénesis dirigida al sitio mediadaa por oligonucleótido, mutagénesis de cásete, PCR de propensión al error, redistribución de ADN o cuerdas mutadoras de E. coli (Vaughan, T.J., et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, N.B., et al., 1996, Capítulo 16, pp. 277-291, en "Phage Display of Peptides and Proteins", Eds . Kay, B.K., et al., Academic Press). Estos métodos para cambiar la secuencia del anticuerpo primario han dado como resultado, a través del uso de técnicas estándar de exploración, afinidades mejoradas de tales anticuerpos secundarios (Gram, H. , et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 89, 3576-3580; Boder, E.T., et al., 2000, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 97, 10701-10705; Davies, J. y Riechmann, L. , 1996, Im unotechnology, 2, 169-179; Thompson, J. , et al., 1996, J. Mol. Biol., 256, 77-88; Short, M. K. , et al., 2002, J. Biol. Chem. , 277. 16365-16370; Furukawa, K. , et al., 2001, J". Biol. Chem., 276, 27622-27628. Mediante una estrategia dirigida similar de cambiar uno o más residuos de aminoácido del anticuerpo, las secuencias de anticuerpos descritas en esta invención pueden utilizarse para desarrollar anticuerpos del receptor anti-IGF-I con funciones mejoradas, tales como los anticuerpos que tienen grupos adecuados tales como grupos de amino libre o tioles en puntos de unión convenientes para la modificación covalente para su uso, por ejemplo, en la unión de agentes terapéuticos . K. Sistema de expresión alternativo para anticuerpos murinos, quiméricos y otros del receptor anti-IGF-I El anticuerpo murino del receptor anti-IGF-I también se expresó a partir de plásmidos de expresión de mamífero similares a los utilizados para expresar el anticuerpo humanizado (anterior) . Se conocen plásmidos de expresión que tienen regiones murinas constantes incluyendo las secuencias de cadena ligera kappa y de cadena pesada gama-1 (McLean et al., 2000, Mol. Iiwnunol. , 37, 837-845). Estos plásmidos se diseñaron para aceptar cualquier región variable, tal como por ejemplo el anticuerpo del receptor murino anti-IGF-I, mediante un simple resumen y clonación de restricción. Se requirió comúnmente la PCR adicional del anticuerpo del receptor anti-IGF-I para crear la restricción compatible con las del pl smido de expresión. Una tentativa alternativa para expresar el anticuerpo del receptor totalmente murino anti-IGF-I fue reemplazar las regiones humanas constantes en el plásmido de expresión de anticuerpo del receptor quimérico anti-IGF-I. El plásmido quimérico de expresión (Figura 16) se construyó utilizando casetes para las regiones variables y para las regiones constantes tanto de cadena ligera como pesada. Justo como se clonaron las secuencias variables de anticuerpo en este plásmido de expresión mediante resúmenes de restricción, se utilizaron resúmenes de restricción separados para clonar cualquier secuencia de región constante. Se clonaron los cADNs de cadena ligera kappa y de cadena pesada gama-1, por ejemplo, de ARN de hibridoma murino, tal como el ARN descrito en la presente para clonar las regiones variables del anticuerpo anti-IGF-I. De manera similar, se diseñaron iniciadores adecuados a partir de secuencias disponibles en la base de datos Kabat (ver Tabla 10) . Por ejemplo, se utilizó RT-PCR para clonar las secuencias de región constante y para crear los sitios de restricción necesarios para clonar estos fragmentos en el plásmido de expresión de anticuerpo del receptor quimérico anti-IGF-I. Este plásmido se utilizó entonces para expresar el anticuerpo del receptor totalmente murino anti-IGF-I en sistemas estándar de expresión de mamífero tales como la línea celular CHO. TABLA 10 - Iniciadores diseñados para clonar la región constante murina gama-1 y la región constante murina kappa, respectivamente Iniciadores de Región Constante Murina Nombre del iniciador Secuencia del Iniciador SEQ ID NO: MuIgGl C3endX TTTTGACCTCTTATTTACCAGGAGAGTGGGAGAG 45 GCTCTT MuIgGl C5endH TTTTAAGCTTGCCAAAACGACACCCCCATCTGTC 46 TAT MuIg ap C3endB TTTTGGATCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC 47 MuIgKap C5endE TTTTGAATTCGGGCTGATGCTGCACCAACTG 48 Los iniciadores se diseñaron a partir de las secuencias disponibles en la base de datos Kabat (Johnson, G y Wu, T.T., (2001) Nucleic Acids Research, 29: 205-206. Declaración de Depósito El hibridoma que hace el anticuerpo murino EM164 se depositó en la American Type Culture Collection, PO box 1549, Manassas, VA 20108, en Junio 14, 2002, bajo los Términos del Tratado de Budapest, como Número de Acceso PTA-4457. Se han referido en la presente descripción ciertas patentes y publicaciones impresas, cuyas enseñanzas se encuentran incorporadas cada una en la presente en sus respectivas totalidades mediante la referencia. Aunque la invención se ha descrito en detalle y con referencia a sus modalidades específicas, será aparente para el experto en la técnica que pueden hacerse varios cambios y modificaciones a la misma sin apartarse de su espíritu y alcance .

Claims (61)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se enlaza específicamente a un receptor del factor- I de crecimiento similar a insulina (IGF- IR) , en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un antagonista de dicho receptor y se encuentra sustancialmente exento de actividad agonista hacia dicho receptor.
  2. 2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se restaura.
  3. 3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es humano o humanizado.
  4. 4. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se enlaza específicamente a un receptor del factor-I de crecimiento similar a insulina, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de inhibir el crecimiento de una célula cancerosa por más de aproximadamente 80% en presencia de un estimulaador del crecimiento seleccionado del grupo que consiste de suero, factor-I de crecimiento similar a insulina y factor-II de crecimiento similar a insulina.
  5. 5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en donde dicha célula es una célula cancerosa humana.
  6. 6. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende al menos una región determinante de complementariedad que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 1-6: SY MH (SEQ ID N0:1) , EINPSNGRTNYNEKFKR (SEQ ID NO: 2), GRPDYYGSSKWYFDV (SEQ ID NO : 3 ) , RSSQSIVHSNVNTYLE (SEQ ID NO:4), KVSNRFS (SEQ ID NO:5), FQGSHVPPT (SEQ ID NO:6).
  7. 7. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera en donde dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS:l-3, respectivamente: SYWMH (SEQ ID NO:l), EINPSNGRTNYNEKFKR (SEQ ID NO: 2), GRPDYYGSSK YFDV (SEQ ID NO: 3), y en donde dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS.-4-6, respectivamente: RSSQSIVHSNVNTYLE (SEQ ID NO: 4), KVSNRFS (SEQ ID NO: 5), FQGSHVPPT (SEQ ID NO: 6) .
  8. 8. El anticuerpo o f agmento de anticuerpo de la reivindicación 7, en donde dicha cadena pesada tiene al menos 90% de identidad de secuencia para una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 7: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLE IGEI NPSNGRTNYNEKFKRKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDY YGSSKWYFD GAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 7) .
  9. 9. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 8, en donde dicha cadena pesada tiene al menos 95% de identidad de secuencia para dicha secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 7.
  10. 10. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 8, en donde dicha cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 7.
  11. 11. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 7, en donde dicha cadena ligera tiene al menos 90% de identidad de secuencia para una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNVNTYLE YLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTK LEIKR (SEQ ID NO: 8) .
  12. 12. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 11, en donde dicha cadena ligera tiene al menos 95% de identidad de secuencia para dicha secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8.
  13. 13. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 11 , en donde dicha cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8.
  14. 14. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende al menos una región determinante de complementarxedad que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS : 1 - 6 : SYW H (SEQ ID NO : 1 ) , EI PSNGRT YNEKFKR (SEQ ID NO: 2), GRPDYYGSSK YFDV (SEQ ID NO: 3), RSSQSIVHSNVNTYLE (SEQ ID NO: 4), KVSNRFS (SEQ ID NO: 5), FQGSHVPPT (SEQ ID NO: 6) .
  15. 15. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera en donde dicha cadena pesada comprende tres regiones determinantes de complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 1-3, respectivamente: SYWMH (SEQ ID NO:l), EINPSNGRTNYNEKFKR (SEQ ID NO: 2), GRPDYYGSSKWYFDV (SEQ ID NO: 3), y en donde dicha cadena ligera comprende tres regiones determinantes de complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NOS: 4- 6, respectivamente: RSSQSIVHSNVNTYLE (SEQ ID N0:4), KVSNRFS (SEQ ID NO: 5), FQGSHVPPT (SEQ ID NO: 6) .
  16. 16. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia para una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 7: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEI NPSNGRTNYNEKFKRKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDY YGSSK YFDV GAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 7) .
  17. 17. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 16, en donde dicha cadena pesada tiene al menos 95% de identidad de secuencia para dicha secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 7.
  18. 18. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 16, en donde dicha cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos que se representa por la SEQ ID NO: 7.
  19. 19. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende una cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia para una secuencia de aminoácidos que se representa por la SEQ ID NO: 8: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHS V TYLEWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTK LEIKR (SEQ ID NO : 8 ) .
  20. 20. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 19, en donde dicha cadena ligera tiene al menos 95% de identidad de secuencia para dicha secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 8.
  21. 21. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 19, en donde dicha cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos que se representa por la SEQ ID NO: 8.
  22. 22. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: DWMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGT KLEIKR (SEQ ID NO:9); DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGT KLEIKR (SEQ ID NO:10); DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGT KLEIKR (SEQ ID NO:ll); y DWMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGT KLEIKR (SEQ ID N0:12).
  23. 23. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia representada por SEQ ID NO: 13: QVQLVQSGAEWKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMH VKQRPGQGLEWIGEI NPSNGRTNYNQKFQGKATLTVDKSSSTAY QLSSLTSEDSAVYYFARGRPDY YGSSKWYFD GQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 13) .
  24. 24. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  25. 25. Un conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 enlazado a un agente citotóxico.
  26. 26. El conjugado de la reivindicación 25, en donde dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de un maitansinoide, una droga pequeña, una prodroga, un taxoide, CC-1065 y un análogo de CC-1065.
  27. 27. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la reivindicación 26 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  28. 28. Un reactivo de diagnóstico que comprende la composición de la reivindicación 24 o la reivindicación 27, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se encuentra marcado.
  29. 29. El reactivo de diagnóstico de la reivindicación 28, en donde dicho marcador se selecciona del grupo que consiste de un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de representación de imágenes y un ión metálico.
  30. 30. Un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa que comprende poner en contacto dicha célula con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1.
  31. 31. Un método para tratar a un paciente que tiene un cáncer que comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1.
  32. 32. El método de la reivindicación 31 que comprende además administrar a dicho paciente un agente terapéutico .
  33. 33. El método de la reivindicación 32 en donde dicho agente terapéutico es un agente citotóxico.
  34. 34. Un método para tratar a un paciente que tiene un cáncer, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva del conjugado de la reivindicación 25.
  35. 35. El método de tratamiento de la reivindicación 31, en donde dicho cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de colon, carcinoma ovárico, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer pulmonar, carcinoma sinovial y cáncer pancreático.
  36. 36. Un método para diagnosticar a un sujeto sospechoso de tener un cáncer, dicho método comprende: administrar a dicho sujeto el reactivo de diagnóstico de la reivindicación 28; y detectar la distribución de dicho reactivo dentro de dicho sujeto.
  37. 37. El método de diagnóstico de la reivindicación 36, en donde dicho cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de colon, carcinoma ovárico, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer pulmonar, carcinoma sinovial y cáncer pancreático.
  38. 38. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo mejorado que se enlaza específicamente a un receptor del factor- I de crecimiento similar a insulina, preparado por: (a) proporcionar un ADN que codifica para un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS : 1 a 8 : SYWMH (SEQ ID NO: 1) , EINPSNGRTNYNEKFKR (SEQ ID NO: 2) , GRPDYYGSSKWYFDV (SEQ ID NO: 3) , RSSQSIVHSNVNTYLE (SEQ ID NO: 4) , KVSNRFS (SEQ ID NO: 5) , FQGSHVPPT (SEQ ID NO: 6) . QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMH KQRPGQGLEWIGEI NPSNGRTNYNEKFKRKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDY YGSSK YFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:7). DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHS WTYLEWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTK LEIKR (SEQ ID NO:8) . (b) introducir al menos una mutación, supresión o inserción de nucleótidos en dicho ADN de modo tal que la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo codificado por dicho ADN se cambie: (c) expresar dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo; (d) identificar dicho anticuerpo expresado o fragmento de anticuerpo para dicha mejora, mediante lo cual se prepara dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo mejorado.
  39. 39. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 38, en donde dicha mejora es una afinidad incrementada para el receptor IGF-I.
  40. 40. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 38, en donde dicha al menos una mutación, supresión o inserción de nucleótidos se hace por medio de un método seleccionado del grupo que consiste de mutagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleotido, mutagénesis de cásete, PCR propenso a error, redistribución de ADN y el uso de cepas mutantes de E.Coli.
  41. 41. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, 8 u 11.
  42. 42. Un polinucleótido que codifica una cadena ligera o pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, 8 u 11.
  43. 43. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 41.
  44. 44. Un vector que comprende el polinucleótido de la. reivindicación 42.
  45. 45. El vector de la reivindicación 43, en donde dicho vector es un vector de expresión capaz de expresar dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
  46. 46. El vector de la reivindicación 44, en donde dicho vector es un vector de expresión capaz de expresar dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
  47. 47. Un anticuerpo murino EM164, producido por la línea celular de hibridoma en depósito con la American Type Culture Collection como Número de Acceso PTA-4457 o un fragmento de enlace de epítope del mismo que se enlaza específicamente a un receptor del factor-I de crecimiento similar a insulina, en donde dicho anticuerpo o fragmento es un antagonista de dicho receptor y se encuentra sustancialmente exento de actividad agonista hacia dicho receptor.
  48. 48. Un anticuerpo humanizado o restaurado derivado de EM164, producido por la línea celular de hibridoma en depósito con la American Type Culture Collection como Número de Acceso PTA-4457 o un fragmento de enlace de epítope del mismo que se enlaza específicamente a un receptor del factor-I de crecimiento similar a insulina, en donde dicho anticuerpo o fragmento es un antagonista de dicho receptor y se encuentra sustancialmente exento de actividad agonista hacia dicho receptor.
  49. 49. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, en donde dicho IGF-IR es IGF-IR humano.
  50. 50. Una línea celular de hibridoma EM164 en depósito con la American Type Culture Collection como Número de Acceso PTA-4457.
  51. 51. Un método para inducir la apoptosis en una célula que comprende poner en contacto dicha célula con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1.
  52. 52. Un método para inducir la apoptosis en una célula que comprende poner en contacto dicha célula con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 47.
  53. 53. Un método para inducir la apoptosis en una célula que comprende poner en contacto dicha célula con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 48.
  54. 54. El método de acuerdo con la reivindicación 51, 52 o 53 en donde dicha célula es una célula cancerosa.
  55. 55. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene al menos una propiedad seleccionada del grupo que consiste de: a) inhibe la función celular de un IGF-IR sin activar dicha IGF-IR; b) inhibe el crecimiento celular del tumor en presencia de suero por al menos 80%; c) se enlaza a IGF-IR con un KD de 0.3 x 10"9 M o menor; d) inhibe el enlace del IGF-I al IGF-IR; e) inhibe la señalización celular mediada por IGF-I mediante IGF-IR; f) inhibe la fosforilación de IGF-IR inducida por IGF-I . g) inhibe el crecimiento y supervivencia celular mediado por IGF-I e IGF-II; h) se enlaza a IGF-IR de mono verde africano, pero no IGF-IR de ratón, hámster Chino, o ganso; e i) inhibe la activación de IRS-I, Akt y Erk ½.
  56. 56. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 55, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo tiene todas dichas propiedades .
  57. 57. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es a) una molécula de inmunoglobulina (Ig) Gl-4, IgM, IgAl-2, IgD o IgE o se deriva de las mismas; o b) un anticuerpo de cadena única, un fragmento de anticuerpo de cadena única (scFvs) , un fragmento Fab, un fragmento F(ab' )2 o un fragmento que contiene al menos tres CDRs .
  58. 58. Una célula huésped que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 43.
  59. 59. Una célula huésped que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 44.
  60. 60. Un método para elaborar un anticuerpo anti-IGF-IR o fragmento de anticuerpo del mismo, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 58 bajo condiciones adecuadas para expresar dicho anticuerpo anti-IGF-IR o fragmento de anticuerpo del mismo y recolectar dicho anticuerpo anti-IGF-IR o fragmento de anticuerpo del mismo .
  61. 61. Un método para elaborar un anticuerpo anti-IGF-IR o fragmento de anticuerpo del mismo, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 59 bajo condiciones adecuadas para expresar dicho anticuerpo anti-IGF-IR o fragmento de anticuerpo del mismo y recolectar dicho anticuerpo anti-IGF-IR o fragmento de anticuerpo del mismo .
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